KR100940776B1 - 약독화된 사람-소 키메라 파라인플루엔자바이러스(ｐｉｖ) 백신 - Google Patents

Abstract

키메라 사람-소 파라인플루엔자 바이러스(PIV)는 사람 및 다른 포유류에서 감염성이며 또한 약독화되고, 개별적으로 또는 조합하여 항PIV 면역 반응을 유발하기 위함 백신 제제에서 유용하다. 또한 상이한 PIV의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)과 결합되거나 또는 통합된 일부 또는 전체 사람 또는 소 PIV '백그라운드" 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 함입하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자 및 벡터가 제공된다. 본 발명의 키메라 사람-소 PIV는 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 형성하기 위해, 상이한 PIV 바이러스의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)로 결합된 사람 또는 소 PIV로부터 유래하거나 이에 따라 패턴화된 일부 또는 전체 "백그라운드" PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함한다. 본 발명의 특정 일면에서, 키메라 PIV는 소 PIV의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)과 결합된 일부 또는 전체 사람 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈을 도입하고, 이에 의해 생성된 키메라 바이러스는 숙주 범위 제한에 의해 약독화된다. 다른 실시태양에서, 사람-소 키메라 PIV는 예를 들어, PIV HN 및(또는) F 당단백질 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)에 의해 코딩되는 사람 PIV 면역원성 단백질, 단백질 도메인 또는 에피토프를 코딩하는 사람 PIV 유전자의 1이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)과 결합된 일부 또는 전체 소 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈을 도입한다. 또한, 본 발명의 사람-소 키메라 PIV는 다른 병원체에 대한 백신을 개발하기 위한 벡터로 유용하다. 다양한 추가 돌연변이 및 뉴클레오티드 변이가 본 발명의 사람-소 키메라 PIV 내에서 제공되어 목적하는 표현형 및 구조적 효과를 만든다.

파라인플루엔자 바이러스(PIV), 키메라 바이러스, 약독화, 면역원성.

Description

약독화된 사람-소 키메라 파라인플루엔자 바이러스(ＰＩＶ) 백신 {Attenuated Human-Bovine Chimeric Parainfluenza Virus (PIV) Vaccines}

본 출원은 바이릴(Bailly) 등에 의해 출원된 미국 가특허출원 제60/143,134호의 이익을 주장한다.

사람 파라인플루엔자 바이러스 유형 3(HPIV3)은 1살 이하의 영아 및 유아에서 심각한 하부 기관지 감염의 일반적인 원인이다. 이는 이 연령군의 바이러스성 하부 기관지 질환으로 인한 입원을 유도하는 주요 원인인 호흡기성 합포체 바이러스 (RSV) 바로 다음으로 중요하다(Collins et al., B. N. Fields Virology, p.1205-1243, 3 rd ed., vol. 1., Knipe et al., eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996; Crowe et al., Vaccine 13:415-421, 1995; Marx et al., J. Infect. Dis. 176:1423-1427, 1997, 모두 본원에 인용문헌으로 삽입되었음). 이 바이러스에 의한 감염은 3살 이하의 유아들에서 상당한 사망률을 초래한다. HPIV1 및 HPIV2는 후두기관지염(크루프)의 주요 병적 원인이며 또한 심각한 폐렴 및 세기관지염(Collins et al., 1996, 상기 참조)을 일으킬 수 있다. 20년간에 걸친 장기간의 연구에서, 전체 입원의 18%를 차지하는 호흡기 질환으로 인한 입원의 각각 6.0, 3.2, 및 11.5%가 HPIV1, HPIV2, 및 HPIV3가 병인학적 원인으로 동정되었으며, 이러한 이유로 효과적인 백신이 필요하다(Murphy et al., Virus Res. 11:1-15, 1988). 또한 파라인플루엔자 바이러스는 중이염에 걸린 유아의 바이러스 유도된 중이 삼출액의 경우에서 상당한 비율로 확인되었다. 따라서, HPIV 감염에 수반하는 심각한 하부 기관지 질환 및 중이염을 방지할 수 있는 이들 바이러스에 대한 백신을 제조할 필요가 있다. HPIV1, HPIV2, 및 HPIV3는 중요한 교차 보호 면역성을 유발하지 않은 상이한 항원형이다. PIV의 주요 보호 항원은 혈구응집소(HN) 및 융합(F) 당단백질이며, 이들은 바이러스 부착, 통과 및 방출을 매개한다. 재감염에 대한 보호는 주로 바이러스 중화 항체에 의해 매개된다.

HPIV에 대한 효과적인 백신을 개발하고자 하는 상당한 노력에도 불구하고, HPIV 관련 질병을 억제하는 것으로 입증된 백신 작용 물질들은 얻어지지 않았다. 현재까지 가장 가망성 있는 후보는 생약독화된 백신 바이러스인데, 이는 이들이 모(母)로부터 획득된 항체를 갖는 매우 어린 영아에 존재하는 바이러스를 자극하는 실험적 환경인, 수동적으로 전달된 항체 존재 중에서도 사람이 아닌 영장류에서 효과적인 것으로 나타났기 때문이다(Crowe et al., 1995, 상기 참조; 및 Durbin et al., J. Infect. Dis. 179:1345-1351, 1999a; 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). 두 개의 약독화된 PIV3 백신 후보, 야생형 PIV3 IS 균주의 온도 민감성 (ts) 유도체(PIV3cp45로 표시) 및 소 PIV3(BPIV3) 균주는 임상학적 평가를 거쳤다 (Karron et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 15: 650-654,1996; Karron et al., 1995a, 상기 참조; Karron et al., 1995b, 상기 참조; 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). BPIV3 백신 후보는 약독화되었으며, 안정하며 사람 영아 및 유아에서 유전적으로 면역원성이다. 제2의 PIV3 백신 후보인 JS cp45는 HPIV3의 JS 야생 형(wt) 균주의 저온 적응된 돌연변이체이다(Karron et al., 1995b, 상기 참조; and Belshe et al., J. Med. Virol. 10: 235-242,1982a; 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). 이 생약독화된 저온 계대 배양된(cp) PIV3 백신 후보는 온도 민감성(ts), 저온 적응성(ca) 및 약독화된(att) 표현형을 나타내며, 이는 생체내에서 바이러스 복제 후 안정하다. cp45 바이러스는 실험 동물에서 사람 PIV3 감염에 대해 보호적이며, 약독화되었으며, 유전적으로 안정하며, 또한 혈청반응 음성인 사람 영아 및 유아에서 면역원성이다. (Belshe et al., 1982a, 상기 참조; Belshe et al., Infect. Immun. 37: 160-165,1982b; Clements et al., J. Clin. Microbiol. 29: 1175-1182,1991; Crookshanks et al., J. Med. Virol. 13: 243-249,1984; Hall et al., Virus Res. 22: 173-184,1992; Karron et al., 1995b, 상기 참조; 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). 이들 PIV3 후보 백신 바이러스는 생물학적으로 유도되었기 때문에, 폭넓은 임상적 응용에 필요할 것인 그 약독화 수준을 조절하기 위한 입증된 방법이 존재하지 않는다.

PIV 백신 후보의 개발을 용이하게 하기 위해, 재조합 DNA 기술은 최근 cDNA로부터 감염성 (-) 가닥 RNA를 회수하는 것을 가능하게 하였다(Conzelmann, J. Gen. Virol. 77: 381-389,1996; Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 11354-11358,1996; 각각은 본원에 인용 문헌으로 삽입되었다). 이 경우, 재조합 바이러스의 회수는 필수 바이러스 단백질 존재 중의 cDNA-코딩된 항게놈성 RNA로부터의 감염성 기관지 합포체 바이러스(RSV), 광견병 바이러스 (RaV), 시미안 바이러스 5(SV5), 우역 바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스(NDV), 소포성 구내염 바이러 스(VSV), 홍역 바이러스(MeV), 볼거리 바이러스(MuV) 및 센다이 바이러스(SeV)에 대해 보고되었다 (Garcin et al.,EMBO J. 14: 6087-6094,1995 ; Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 44774481,1995; Radecke et al., EMBO J. 14: 5773-5784,1995; Schnell et al., EMBO J.13: 4195-4203,1994; Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 8388-8392,1995; Hoffman et al., J. Virol. 71: 4272-4277,1997; Kato et al., Genes to Cells 1: 569-579,1996, Roberts et al., Virology 247 : 1-6,1998; Baron et al., J. Virol. 71: 1265-1271,1997; 국제 공개 WO 제97/06270호; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567,1995; 미국 특허 출원 제08/892,403호(1997. 7. 15. 출원) (공개된 국제 공개 WO 제98/02530호 및 우선권 미국 가특허 출원 제60/047,634호 (1997. 5. 23. 출원), 제60/046,141호, (1997. 5. 9. 출원), 및 제60/021,773호, (1996. 7. 15. 출원)); 미국 특허 출원 제09/291,894호 (1999. 4. 13. 출원); 미국 가특허 출원 제60/129,006호 (1999. 4. 13. 출원); Bucholz et al의 미국 가특허 출원 제60/143,097호 (1999. 7. 9. 출원); Juhasz et al., J. Virol. 71: 5814-5819, 1997; He et al. Virology 237: 249-260,1997; Peters et al. J. Virol. 73: 5001-5009,1999; Whitehead et al., Virologv 247: 232-239,1998a; Whitehead et al., J. Virol. 72: 4467-4471, 1998b; Jin et al. Virologv 251: 206-214,1998; Bucholz et al. J. Virol. 73: 251-259,1999; Whitehead et al., J. Virol. 73: 3438-3442,1999, 및 Clarke et al., J. Virol. 74: 4831-4838, 2000; 각각은 그 전체 내용이 본원에 인용 문헌으로 삽입되었다).

본 발명에 보다 구체적으로 관련하여, cDNA로부터의 wt 표현형을 갖는 HPIV를 제조하는 방법이 감염성, 재조합 HPIV3 JS 균주의 회수에 대해 최근 개발되었다 (Durbin et al., Virology 235: 323-332,1997a; 미국 특허 출원 제09/083,793호, (1998. 5. 22. 출원); 미국 가특허 출원 제60/047,575호(1997. 5. 23. 출원) (국제 공개 WO 제98/53078호), 미국 특허 출원 제60/059,385호(1997. 9. 19. 출원), 각각은 본원에 인용 문헌으로 삽입되었음). 아울러, 이들 개시는 생물학적 돌연변이체에서의 표현형의 변화의 유전적 기초, 예를 들어 HPIV3 cp45 중의 어떤 돌연변이가 그 ts, ca 및 att 표현형을 특정하는지, 및 BPIV3의 어떤 유전자(들) 및 게놈 세그먼트(들)이 그 약독화 표현형을 특정하는지를 결정하기 위한 바이러스 cDNA 클론의 유전적 조작을 허용한다. 추가적으로, 이들 및 관련된 개시는 폭넓은 범위의 상이한 돌연변이들을 갖는 신규 PIV 백신 후보를 구축하는 것 및 그 약독화, 면역원성 및 표현형 안정성 수준을 평가하는 것을 가능하게 만든다(Bailly et al의 미국 가특허 출원 제60/143,134호 (1999. 7. 9. 출원); 및 Durbin et al의 미국 특허 출원 제09/350, 821호(1999. 7. 9. 출원); 각각은 본원에 인용 문헌으로 삽입되었다).

따라서, 감염성 야생형 재조합 PIV3(r) PIV3는 다수의 ts 유도체들과 함께 현재 cDNA로부터 회수되었으며, 역전사 유전학 시스템은 특정된 약독화 돌연변이를 갖는 감염성 바이러스를 제조하기 위해서 및 현존하는 백신 바이러스의 약독화의 유전적 기초를 연구하기 위해서 사용되어왔다. 예를 들어, cp45의 L 유전자에서 발견되는 3개의 아미노산 치환은 단독으로 또는 함께 ts 및 약독화 표현형을 특정 하는 것으로 밝혀졌다. 추가적인 ts 및 약독화 돌연변이가 PIV3 cp45의 다른 영역에 존재한다. 키메라 PIV 외에, PIV3 cDNA 회수시스템을 사용하여 PIV34 HN 및 F 개방 판독틀(ORFs)을 L 안에 3개의 약독화 돌연변이를 포함하는 PIV3 전장 cDNA 중의 PIV1의 개방 판독틀로 치환하여 백신 후보를 생성하였다. 이 cDNA로부터 유도된 재조합 키메라 바이러스를 rPIV-31.cp45L로 명명하였다. rPIV3-1.cp45L은 햄스터에서 약독화되었으며 PIV1에 의한 감염에 대해 높은 수준의 저항성을 유도한다. 15개의 cp45 돌연변이 중 12개의 돌연변이, 즉 HN 및 F 안에 일어난 돌연변이를 제외한 돌연변이를 포함하는 rPIV3-1.cp45로 명명된 재조합 키메라 바이러스가 생성되었으며, 햄스터의 상부 및 하부 기관지에서 약독화된다 (Skiadopoulos et al.,Vaccine 18: 503-510,1999a).

HPIV3에 항원적으로 관련이 있는 BPIV3는 HPIV1, HPIV2 및 HPIV3에 대한 생약독화된 바이러스 백신 개발에 대한 별법의 접근법을 제공한다. 소로부터 기원한 것으로 여겨지는 생 백시니아 바이러스인 사람에서 사용된 최초의 백신은 천연두 통제를 위해 약 200년 전에 제너(Jenner)에 의해 개발되었다. 이후 두 세기 동안, 백시니아 바이러스는 이 질환을 통제하는 데 성공적이었으며, 천연두의 최종적인 박명에서 중요한 역할을 하였다. 백신 개발에 대한 이 '제너식' 접근법에서, 항원적으로 관련이 있는 동물 바이러스가 사람에 대한 백신으로 사용되었다. 천연의 숙주에 잘 적응된 동물 바이러스는 흔히 사람에서 효율적으로 복제할 수 없으며, 따라서 약독화된다. 현재, 이 형태의 숙주 범위 제한에 대한 유전적인 기초에 관한 철저한 이해가 결여되어 있다. 포유류 또는 조류 숙주에서의 바이러스 진화는 관계된 사람 바이러스의 상응하는 서열의 뉴클레오티드(nt) 및 아미노산 서열로부터 상당한 분기를 초래한다. 다수의 서열 차이로 이루어진 이 분기 서열은 숙주 범위의 약독화 표현형을 특정한다. 많은 서열 차이에 근거한 약독화 표현형을 갖는 것은 백신 바이러스에서 바람직한 성질로, 이는 사람에서 복제한 후 동물 바이러스의 표현형의 약독화의 안정성에 기여하기 때문이다.

최근에 인가된 사가염색체의 로타바이러스는 비사람 로타바이러스 균주, 레서스로타바이러스(RRV)가 사람에서 약독화되었으며 항원적으로 상당한 관련이 있는 사람 혈청형 3에 대해 방법적인 것으로 밝혀진 백신 개발에 대한 제너식 접근법의 예이다(Kapikian et al., Adv. Exp. Med. Biol. 327: 59-69,1992). 4개의 주요 사람 로타바이러스 혈청형 각각에 대한 내성을 유발하는 다가 백신에 대한 필요가 있었으므로, 조직 배양물에서의 유전자 재분류의 전통적인 유전학적 기술을 사용하여 3개의 재분류 바이러스를 구축하여 변형되었다. 각각의 단일 유전자 재분류 바이러스는 10개의 RRV 유전자에 더해 혈청형 1,2 또는 4의 주요 중화 항원(VP7)을 코딩하는 한 개의 사람 로타바이러스 유전자를 포함한다. 그 의도는 이 원숭이 바이러스의 약독화 특징 및 사람 로타바이러스 혈청형 1,2 또는 4의 중화 특성을 갖는 단일 유전자 치환의 RRV 재분류체를 제조하기 위한 것이다. 사람에서 원숭이 RRV의 숙주 범위 제한에 기초한 사가염색체 백신은 영아 및 어린 아이들에서 사람 로타바이러스 감염에 대한 높은 수준의 효율을 제공한다 (Perez-Schael et al., N. Panel. J. Med. 337: 1181-1187,1997). 그러나, 백신 바이러스는 모계 항체가 결여된 나이든 혈청음성 영아에서 온화한 반응원성을 가지며, 따라서 소 로타바이러스 의 UK 균주에 기초한 제너식 백신의 두번째 생성은 RRV 백신을 대체하기 위해 개발되었다(Clements-Mann et al., Vaccine 17:2715-2725, 1999).

또한 제너식 접근은 약독화된 비사람 영장류에서 면역원성인 파라인플루엔자 유형 1 바이러스 및 간염 A 바이러스에 대한 백신을 개발하기 위해 조사되고 있는 중이다(Emerson et al., J. Infect. Dis. 173: 592-597,1996; Hurwitz et al., Vaccine 15 : 533-540,1997). 제너식 접근법은 인플루엔자 A 바이러스에 대한 생약독화된 백신 개발에 사용되었으나, 사람에서 사용되기 위한 일관적으로 약독화된 백신을 생산하는 데에는 실패하였다(Steinhoff et al., J. Infect. Dis. 163: 1023-1028,1991). 다른 실시예로서, 사람 인플루엔자 A 바이러스로부터의 혈구응집소 및 뉴라미니다아제표면 당단백질을 코딩하는 두 개의 유전자 세그먼트 및 조류 인플루엔자 A 바이러스로부터의 나머지 6개의 유전자 세그먼트을 포함하는 재분류체 바이러스를 사람에서 약독화하였다(Clements et al., J. Clin. Microbiol. 27: 219-222,1989; Murphy et al., J. Infect. Dis. 152: 225-229,1985; and Snyder et al., J. Clin. Microbiol. 23: 852-857,1986). 이는 조류 바이러스의 6개의 유전자 세그먼트 중 하나 이상이 사람에 대한 조류-사람 인플루엔자 A 바이러스를 약독화하였다는 것을 나타낸다. 이 약독화의 유전적 결정 인자는 약독화하는 조류 인플루엔자 A 바이러스로부터의 단일 유전자 세그먼트 및 사람 균주로부터의 나머지 유전자들을 포함하는 재분류 바이러스를 사용하여 맵핑(mapping)되었다. 비구조적(NS), 폴리머라아제(PB1, PB2), 및 M 유전자들이 사람에서 조류 인플루엔자 A 바이러스 표현형의 약독화에 기여한다는 것이 보여졌다(Clemetns et al., J. Clin. Microbiol. 30:655-662, 1992).

다른 연구에서, 침팬지에서의 복제를 위한 소 기관지 합포체 바이러스(BRSV)의 엄격한 숙주 범위 제한은 BRSV F 및 G 당단백질을 그 HRSV 대응물로 치환하는 것에 의해서는 단지 약간만 경감시킬 뿐이었다. 이는 F 및 G가 그 숙주 범위 제한에 관려하지만, 1 이상의 추가적인 소 RSV 유전자 또한 관여한다(Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000). 이는 1 이상의 유전자가 예측할 수 없는 방식으로 영장류 중의 포유류 또는 조류 바이러스의 표현형의 숙주 범위 제한에 기여할 수 있다는 것을 예시한다.

본 발명은 키메라 바이러스의 1 이상의 주요 중화 및 방어 항원 결정인자(들)이 백신이 형성된 바이러스에 상동이지만 약독화가 전적으로 또는 부분적으로 숙주 범위 효과에 기초하는 HPIV에 대한 백신으로서 사용하기 위한 야생형 또는 돌연변이 부모형의 바이러스에 대한 새로운 기준을 제공한다. BPIV3의 HN 및 F 단백질은 각각이 그들의 상응하는 HPIV3 단백질에 대한 아미노산 서열에서 약 80% 관련되어 있고(Suzu et al., Nucleic Acids Res. 15:2945-2958, 1987; 본원에 인용문헌으로 삽입되었다), 항원성 분석에서 25% 관련되어 있다(Coelingh et al., J. Virol. 64: 3833-3843, 1990; Coelingh et al., J. Virol. 60: 90-96,1986; van Wyke Coelingh et al., J. Infect. Dis.157: 655-662,1988, 각각은 본원에 인용 문헌으로 삽입되었음). 이전의 연구는 BPIV3, 캔사스(Ka) 균주 및 수송열(SF) 프로토타입 균주가 레서스 원숭이의 상부 및 하부 호흡기도에 대해 약독화되었으며, 이들 중 하나인 Ka 균주가 침팬치 중에서 약독화되었다는 것을 보여준다(van Wyke Coelingh et al., 1988, 상기 참조, 본원에 인용문헌으로 삽입되었음). 비인간 영장류의 Ka 바이러스에 의한 면역화는 HPIV3 에 반응하는 항체를 유도하고 원숭이의 상부 빛 하부 호흡기도에서 사람 바이러스의 복제에 대한 내성을 유발한다. 사람에서 Ka 균주의 그 이후의 평가는 바이러스가 혈청음성 영아에 대해 만족스럽게 약독화되었으며, 이것은 충분히 감수성인 영아 및 유아에서 복제 후 약독화 표현형을 보유한다(Karron et al., 1996, 상기 참조; 및 Karron et al., 1995a, 상기 참조; 각각이 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). 따라서, 그 주요 장점은 이것이 충분히 감수성인 혈청음성 영아 및 유아에 대해 충분하게 약독화되었으며, 또한 그 약독화 표현형은 사람에서 복제 후 안정하였다는 것이다.

그러나, 10^5.0 조직 배양물 감염성 투여량₅₀ (TCID)₅₀의 BPIV3의 Ka균주를 받은 혈청음성 혈청 혈구응집소 억제 항체의 수준은 1:10.5로, 이는 약독화된 HPIV3 백신을 받은 유사한 백신보다 3배 정도 낮았다(Karron et al., 1995a, 상기 참조; 및 Karron et al., 1995b, 상기 참조; 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). BPIV3에 의해 유도된 사람 바이러스에 대한 이 낮은 수준의 항체는 HPIV3 및 BPIV3 상이의 항원성 분기의 큰 일부를 반영한다(Karron et al., 1996, 상기 참조; 및 Karron et al., 1995a, 상기 참조; 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). 사람에서의 HPIV3에 대한 Ka 백신 후보의 효율을 결정하기 위한 연구는 수행되지 않았지만, 이 감소된 수준의 HPIV3에 대해 반응성인 항체는 감소된 수준의 방어 효율을 반영할 것이다.

BPIV3가 레서스 원숭이, 침팬치 및 사람의 호흡기도에서의 복제를 제한하는 숙주 범위 유전자를 갖고 있는 것이 분명하지만, 소 단백질 또는 비코팅 서열 중 어는 것이 이 복제의 숙주 범위 제한에 기여하는지는 알려져 있지 않다. BPIV3 단백질 또는 비코딩 서열 중 어느 것이라도 숙주 범위 표현형을 전달할 수 있다는 것이 가능하다. 어떤 유전다 또는 유전자 세그먼트가 약독화 표현형을 전달할 것인지 미리 결정하는 것은 가능하지 않다. 이는 BPIV3 코딩 및 비코딩 서열을 이들의 HPIV3 대응물로 전체적으로 치환하고 혈청 음성인 레서스 원숭이 또는 사람에서 회수된 HPIV3/BPIV3 키메라 바이러스를 평가하여서만 달성할 수 있다.

PIV 혈청형 1,2 및 3에 대한 효과적인 백신 작용 물질의 개발을 향한 많은 발전에도 불구하고, PIV로 인한 심각한 건강 문제, 특히 HPIV 감염으로 인한 영아 및 유아에서의 질병를 경감시키기 위한 안전하고 효과적인 백신을 엔지니어링하기 위한 추가적인 도구 및 방법에 대한 명백한 요구가 당업계에 남아 있다. 이에 관련하여 남아있는 시도 중에서는 다양한 임상 상황에서의 사용을 위해 약독화되고, 면역원성이며 유전적으로 안정한 백신 후보를 생성하기 위한 추가 도구에 대한 요구이다. 이들 목적을 용이하게 하기 위해, 약독화 돌연변이를 확인하고 재조하부 백신 균주 중으로 함입하기 위한 현존하는 방법이 발전되어야 한다. 아울러, 사람 PIV에 대한 백신을 고안하기 위한 방법 및 조성물은 또한 수의학적 용도를 위한 신규한 백신 후보를 설계하기 위해서 충족될 수 있어야 한다. 놀랍게도, 본 발명은 이러한 요구를 충족시키며, 또한 하기에서 기술된 것과 같은 추가의 장점을 제공할 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 사람 및 다른 포유류에서 감염원성이며 또한 약독화된 사람-소 키메라 파라인플루엔자 바이러스 (PIV)을 제공한다. 관련된 측면에서, 본 발명은 PIV 감염에 감염되기 쉬운 숙주에서 PIV에 대한 원하는 면역 반응을 생성하기 위한 다양한 조성물에서 유용한 약독화된 사람-소 키메라 PIV를 설계하고 생산하기 위한 신규한 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면에 포함된 것은 단리된 폴리뉴클레오티드 분자 및 상이한 PIV 바이러스의 1 이상의 이형 유전자(들)또는 게놈 세그먼트(들)들과 결합된 또는 통합된 부분적인 또는 완전한 사람 또는 소 PIV "백그라운드" 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 이러한 분자를 삽입하는 벡터이다. 또한 본 발명 내에서 제공되는 것은 PIV 감염의 예방 및 치료를 위한 사람-소 키메라 PIV를 통합하는 방법 및 조성물이다.

따라서 본 발명은 HPIV들 및 BPIV3에 기초한 생약독화된 PIV 백신 후보를 개발하기 위한 방법을 포함한다. 키메라는 cDNA-기재의 바이러스 회수 시스템을 사용하여 생성된다. cDNA로부터 만들어진 재조합 바이러스는 독립적으로 복제하고 마치 이들이 생물학적으로 유래한 바이러스인 것처럼 동일한 방식으로 증식한다. 본 발명의 키메라 사람-소 PIV는 감염원성의 키메라 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 생산하기 위해 사람 및 소 PIV 균주 양쪽으로부터의 뉴클레오티드 서열을 함입하기 위해 재조합적으로 엔지니어링된다. 이러한 방식으로, 후보 백신 바이러스는 사람 및 비사람 영장류를 포함하는, PIV에 감염되기 쉬운 포유류 숙주에서 PIV에 대한 면역 반응을 이끌어 내기 위해 재조합적으로 엔지니어링된다. 본 발명 에 따른 사람-소 키메라 PIV는 특정 PIV, 예를 들어 HPIV3에 대한 면역 반응 또는 복수 개의 PIV들, 예를 들어 HPIV1 및 HPIV3에 대한 다중 특이적인 반응을 이끄어내기 위해 엔지니어링될 수 있다. 추가적인 키메라 바이러스는 비사람 PIV 병원체, 예를 들어 호흡기성 합포체 바이러스(RSV) 또는 홍역 바이러스의 항원에 대한 벡터로 작용할 수 있게 본원에서의 교시에 따라 설계될 수 있다.

본 발명의 예시적인 사람-소 키메라 PIV는 주요 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질(P), 및 거대 중합효소 단백질(L)과 아울러 사람 및 소 폴리뉴클레오티드 서열 양쪽를 포함하는 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 함입한다. 추가의 PIV 단백질들은 완전한 바이러스 입자 또는 과잉 단백질, 항원성 결정 인자 또는 다른 추가의 성분들을 포함하는 바이러스 입자에 달하는 감염성 서브바이러스 입자의 범위를 제공하기 위해 추가의 PIV 단백질들이 다양한 조합으로 포함될 수 있다.

본 발명의 키메라 사람-소 PIV는 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 형성하기 위해 상이한 PIV 균주 또는 서브바이러스의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)와 조합된 사람 또는 소 PIV 균주 또는 서브그룹 바이러스로부터 유래하거나 또는 이에 따라 패턴화된 일부 또는 전체 "백그라운드" PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함한다. 본 발명의 바람직한 일면에서, 키메라 PIV는 소 PIV로부터의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 유전자 세그먼트(들)로 조합된 일부 또는 전체 사람 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈을 함입한다.

일부 또는 전체 백그라운드 게놈 또는 안티게놈은 일반적으로 대응물인 사람 또는 소 PIV의 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트가 도입되는 수용체 골격(backbone) 또는 벡터로 작용한다. 대응물인 사람 또는 소 PIV로부터의 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트는 백그라운드 게놈 또는 안티게놈과 조합된거나 또는 그 중에서 치환되어 기여하는 PIV 중 하나 또는 둘 다에 비교하여 신규한 표현형 특성을 나타내는 사람-소 키메라 PIV를 생성하는 "공여체" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 예를 들어, 선택된 수용체 PIV 균주 중으로의 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트의 추가 또는 치환은 변형되지 않은 수용체 및(또는) 공여체의 상응하는 표현형(들)과 비교하여 약독화, 성장 변화, 변화된 면역원성, 또는 다른 원하는 표현형 변화를 증가시키거나 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명의 사람-소 키메라 PIV 중의 이형 치환 또는 첨가로 사용되기 위해 선택될 수 있는 유전자 및 게놈 세그먼트는 PIV N, P, C, D, V, M, F,SH (적절하게), HN 및 (또는) L 단백질(들) 또는 이들의 일부를 코딩하는 유전자 또는 게놈 세그먼트를 포함한다. 아울러, 비PIV 단백질, 예를 들어 볼거리 및 SV5에서 발견되는 SH 단백질을 코딩하는 유전자 및 게놈 세그먼트는 본 발명의 사람-소 PIV 중에 함입될 수 있다. 또한, 유전자외 3' 리더 또는 5' 트레일러 영역, 및 유전자-개시, 유전자-종결, 유전자간 영역, 또는 3' 또는 5' 비코딩 영역과 같은 조절 영역이 이형 치환 또는 첨가로서 유용하다.

본 발명의 바람직한 사람-소 키메라 PIV 백신 후보는 1 이상의 BPIV3 유전자 또는 게놈 세그먼트의 치환 또는 첨가에 의해 약독화된 백그라운드 중의 HPIV3의 주요 항원성 결정 인자를 가진다. 다른 단백질들 또한 방어성 면역 방어에 기여 할 수 있지만, PIV의 주요 방어성 항원은 이들의 HN 및 F 당단백질이다. 특정 실시태양에서, 백그라운드 게놈 또는 안티게놈은 HPIV 게놈 또는 안티게놈, 예를 들어, HPIV3, HPIV2, 또는 HPIV2 백그라운드 게놈 또는 안티게놈으로, 1 이상의 BPIV 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들), 바람직하게는 BPIV3 유래의 것이 이들에 첨가되거나 또는 이들 중으로 치환된다. 하기에서 기술된 한 예시적인 실시태양에서, BPIV3의 N 유전자의 ORF는 HPIV의 그것으로 치환되었다. 별법으로, 백그라운드 게놈 또는 안티게놈은 HPIV3, HPIV2, 또는 HPIV1 당단백질, 당단백질 도메인 또는 다른 항원성 결정 인자를 코딩하는 1 이상의 유전자 또는 게놈 세그먼트와 조합된 BPIV 게놈 또는 안티게놈일 수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 어떠한 BPIV 유전자 또는 게놈 세그먼트라도 단독으로 또는 1 이상의 다른 BPIV3 유전자와 조합하여 사람-소 키메라 PIV 백신 후보를 생성하기 위해 HPIV3 서열과 조합될 수 있다. 특정 HPIV 혈청형의 상이한 균주를 포함하여 어떠한 HPIV라도, 예를 들어 HPIV3가 BPIV3(들)을 약독화하기 위한 적당한 수용체가 될 수 있다. 일반적으로, 사람 PIV에 대한 백신으로 사용되기 위한 사람-소 키메라 PIV중에 함입되기 위해 선택된 HPIV3 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)은 HN 또는 F 당단백질과 같은 1 이상의 HPIV 방어성 항원을 포함할 것이다.

본 발명의 예시적인 일면에서, 1 이상의 소 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)을 갖는 사람-소 키메라 PIV는 높은 수준의 숙주 범위 제한, 예를 들어 비사람 영장류와 같은 포유류 모델의 사람 PIV 감염의 호흡기도에서의 제한을 나타낸다. 예시적인 실시태양에서, 사람 PIV는 1 이상의 소 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트( 들)을 일부 또는 전체 사람, 예를 들어 HPIV3, PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중으로 첨가하거나 또는 치환하여 약독화된다. 한 실시예에서, HPIV3 N 유전자는 BPIV3 N 유전자에 의해 치환되어 신규 사람-소 키메라 PIV 백신 후보를 생성한다.

바람직하게는, 본 발명의 사람-소 키메라 PIV 백신 후보에 의해 나타나는 숙주 범위 제한 정도는 개개의 BPIV 부모형 또는 "공여체" 균주에 의해 나타나는 숙주 범위 제한에 필적한다. 바람직하게는, 제한은 진정한 숙주 범위 표현형을 가져야 하는데, 즉, 이는 당해 숙주에 특이적이어야 하며, 또한 적합한 세포주에서의 시험관내 복제 및 백신 제조를 제한하지 않아야 한다. 아울러, 1 이상의 소 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)을 갖는 사람-소 키메라 PIV는 PIV에 감염되기 쉬운 숙주에서 높은 수준의 내성을 이끌어낸다. 따라서, 본 발명은 이형의 PIV, 예를 들어 HPIV3와 BPIV3 사이의 1 이상의 유전자(들 또는 게놈 세그먼트(들)의 함입으로 인한 숙주 범위 효과에 기초한 PIV에 대한 생바이러스 백신을 약독화하기 위한 새로운 기준을 제공한다.

본 발명의 관련된 일면에서, 사람-소 키메라 PIV는 HPIV HN 및(또는) F 당단백질(들)을 코딩하는 1 이상의 이형 유전자(들)을 함입한다. 별법으로, 키메라 PIV는 엑토도메인(ectodomain)(및 별법으로는 세포질성 도메인 및(또는) 막횡단 도메인), 또는 HPIV HN 및(또는) F 당단백질(들)의 면역원성 에피토프를 코딩하는 1 이상의 게놈 세그먼트를 함입할 수 있다. 이들 면역원성 단백질, 도메인 및 에피토프는 사람-소 키메라 PIV에서 특히 유용한데, 이는 이들이 면역화된 숙주에서 신규 면역 반응을 일으키기 때문이다. 특히, HN 및 F 당단백질, 및 이들 중 면역원 성 도메인 및 에피토프는 주요 방어성 항원을 제공한다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 사람 PIV 서브그룹 또는 균주로부터의 1 이상의 면역원성 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)의 소 백그라운드, 또는 수용체, 게놈 또는 안티게놈으로의 또는 그 중으로의 첨가 또는 치환은 1 이상의 특정 인간 PIV 서브그룹 또는 균주를 포함하여 사람 공여체 바이러스에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 재조합 키메라 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 생성하는 반면, 소 골격은 키메라를 백신 개발을 위한 유용한 후보로 만드는 약독화된 표현형을 부여한다. 한 실시태양에서, 1 이상의 사람 PIV 당단백질 유전자, 예를 들어 HN 및(또는) F는 부분 또는 전체 소 게놈 또는 안티게놈 중으로 첨가되거나 또는 치환되어 감수성인 숙주에서 항사람 PIV 면역 반응을 일으키는 약독화된 감염성 사람-소 키메라를 생성한다.

다른 실시태태양에서, 사람-소 키메라 PIV는 다양한 사람 PIV 균주로부터 유래한 면역원성 단백질, 단백질 도메인 또는 에피토프, 예를 들어 두 개의 HN 또는 F 단백질들 또는 상이한 HPIV, 예를 들어 HPIV1 또는 HPIV2로부터 그 각각이 유래한 면역원성 부분을 코딩하는 유전자 또는 게놈 세그먼트를 추가로 함입한다. 별법으로, 한 개의 당단백질 또는 면역원성 결정 인자는 제1 HPIV로부터 제공받을 수 있고, 두번째 당단백질 또는 면역원성 결정 인자는 게놈 또는 안티게놈으로의 추가의 당단백질 또는 결정인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 첨가하지 않고 치환하여 제2 HPIV로부터 제공받을 수 있다. 또한 HPIV 당단백질 및 항원성 결정 인자의 치환 또는 첨가는 예를 들어 이형의 HPIV의 세포질 도메인에 융합된 제1 HPIV의 면 역원성 에피토프, 항원성 영역 또는 전체 엑토도메인을 갖는 재조합 바이러스 또는 서브바이러스 입자 중의 키메라 당단백질을 코딩하는 게놈 또는 안티게놈을 구성하여 달성할 수 있다. 예를 들어, HPIV1 또는 HPIV2 HN 또는 F 당단백질로부터의 당단백질 엑토도메인을 코딩하는 이형의 게놈 세그먼트는 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 상응하는 HPIV3 HN 또는 F 당단백질 세포질/엔도도메인(endodomain)을 코딩하는 게놈 세그먼트와 결합될 수 있다.

다른 실시태양에서, 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈은 재조합체 바이러스 또는 서브바이러스 입자 내의 치환체, 추가의 또는 이들의 키메라 당단백질 또는 항원성 결정 인자를 코딩하여 사람 및 소 당단백질, 당단백질 도메임 또는 면역원성 에피토프 양자를 갖는 바이러스성 재조합체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 사람 PIV HN 또는 F 당단백질로부터의 당단백질 엑토도메인을 코딩하는 이형의 게놈 세그먼트는 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 상응하는 소 HN 또는 F 당단백질 세포질/엔도도메인을 코딩하는 게놈 세그먼트와 결합될 수 있다. 별법으로, 사람 PIV HN 또는 F 당단백질 또는 이들의 일부는 다른 PIV 균주 또는 혈청형으로부터의 HN 또는 F 당단백질 또는 이들의 일부를 코딩하는 게놈 세그먼트와 결합될 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법에 따라, 사람-소 키메라 PIV는 부분적인 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 대응 유전자 또는 게놈 세그먼트에 대한 이형의 유전자 또는 게놈 세그먼트를 치환하여 구성될 수 있다. 별법으로, 이형의 유전자 또는 게놈 세그먼트는 전체(또는 다른 유전자 또는 게놈 세그먼트가 결실된다면, 그 일부) PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈과 조합하여 과잉의 유전자 또는 게놈 세그먼트로서 첨가될 수 있다. 예를 들어, 각각 HPIV2 및 HPIV3로부터의 두 개의 사람 PIV HN 또는 F 유전자 또는 게놈 세그먼트가 포함될 수 있다.

흔히, 이형의 유전자 또는 게놈 세그먼트는 부분 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 유전자가 위치 근처에 첨가된다. 별법으로, 유전자 또는 게놈 세그먼트는 게놈의 다른 비코딩 영역, 예를 들어, 5' 또는 3' 비코딩 영역 또는 비코딩 뉴클레오티드가 부분 또는 전체 게놈 또는 안티게놈 중에 생기는 다른 위치에 놓일 수 있다. 한 일면에서, 비코딩 조절 영역은 효율적인 복제, 전사 및 번역에 필요한 시스-작용 시그날을 포함하고, 따라서 이형의 유전자 또는 게놈 세그먼트 또는 본원에서 개시된 다른 돌연변이를 도입함으로써 이들 기능의 변형하기 위한 표적 부위를 나타낸다.

본 발명의 보다 구체적인 일면에서, 약독화 돌연변이는 시스-작용 조절 영역으로 도입되어, 예를 들어, (1) 조직 특이적인 약독화 (Gromeier et al., J. Virol. 73: 958-964,1999; Zimmermann et al., J. Virol. 71: 4145-4149, 1997), (2) 인터페론에 대한 증가된 감수성(Zimmermann et al., 1997, 상기 참조), (3) 온도 감수성 (Whitehead et al., 1998a, 상기 참조), (4) 복제 수준의 일반적인 제한 (Men et al., J. Virol. 70: 3930-3937,1996; Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5177-5181,1991), 및(또는) 복제의 숙주 특이적인 제한 (Cahour et al., Virology 207: 68-76,1995)을 일으킨다. 이들 약독화 돌연변이는 본 발명의 약독화된 사람-소 키메라 PIV를 생성하기 위한 여러가지 방식, 예를 들어 점 돌연 변이, 연관된 바이러스 사이의 서열 교환, 또는 뉴클레오티드 결실에 의해 달성될 수 있다.

본원에서 제시된 방법 외에 추가 별법에서, 이형의 유전자 또는 게놈 세그먼트는 부분 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 대응 유전자 또는 게놈 세그먼트의 야생형 유전자 순서 위치에 상응하는 위치에서 첨가되거나 또는 치환될 수 있다. 다른 실시태양에서, 이형의 유전자 또는 게놈 세그먼트는 각각 발현을 향상시키거나 또는 감소시키기 위해, 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 대응 유전자 또는 게놈 세그먼트의 야생형 유전자 순서 위치에 비교하여 프로모터에 보다 근접하거나 또는 프로모터에 대해 보다 원위의 위치에서 첨가되거나 또는 치환된다.

본 발명의 일반적인 측면에서, 소 유전자 또는 게놈 세그먼트는 약독화된 사람-소 키메라 PIV를 형성하기 위해 사람 PIV 백그라운드 중에 첨가되거나 또는 치환될 수 있다. 별법으로는, 키메라는 약독화된 PIV 백신 후보를 형성하기 위해 소 PIV 백그라운드 중에서 첨가되거나 또는 치환된 1 이상의 사람 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트로 구성될 수 있다. 이에 관련하여, 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈은 사람 PIV 유래의 이형의 유전자 또는 게놈 세그먼트와 조합된 부분 또는 전체 소 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈으로 형성된다. 바람직한 일면에서, 1 이상의 소 PIV 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)이 사람 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 대응 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)에 대해 치환된다. 다른 실시태양에서, 1 이상의 사람 PIV 당단백질 유전자, 예를 들어 HN 및(또는) F 또는 사 람 PIV 당단백질 유전자의 세포질 도메인, 막횡단 도메인, 엑토도메인 또는 면역원성 에피토프를 코딩하는 게놈 세그먼트는 소 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 세그먼트로 치환된다. 예를 들어, 사람 PIV 당단백질 유전자 HN 및 F 양자는 소 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 HN 및 F 당단백질 대응 유전자를 대신하기 위해 치환될 수 있다.

유사한 방식으로, 본 발명의 키메라 사람-소 PIV는 한 PIV 균주 또는 군(예를 들어, 사람 PIV3 및 사람 PIV1 양쪽), 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), 홍역 및 다른 병원체(예를 들어 본원에 인용문헌으로 삽입된 미국 특허출원 제60/170, 195호(1999. 12. 10 출원; Murphy et al.)를 참조)를 포함하는 상이한 병원체로부터의 항원성 결정 인자를 함입하기 위해 "벡터"로 용이하게 설계될 수 있다.

본 발명의 보다 구체적인 측면에서, 사람-소 키메라 PIV는 사람 PIV로부터의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트와 조합된 부분 또는 전체 BPIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈으로 구성된다. 이들 측면에서, 1 이상의 HPIV 당단백질 유전자 HN 및 F, 또는 HN 및(또는) F 유전자들의 세포질 도메인, 막횡단 도메인, 엑토도메인 또는 면역원성 에피토프를 코딩하는 1 이상의 게놈 세그먼트는 BPIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈에 첨가되거나 또는 BPIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 1 이상의 대응 유전자 또는 게놈 세그먼트를 치환하여 키메라 구조를 생성할 수 있다. 흔히, HPIV 당단백질 유전자 HN 및 F는 하기에서 기술된 재조합 키메라 바이러스 rBPIV3-F_HHN_H 에 의해 예시된 것과 같인 BPIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 대응 HN 및 F 당단백질을 대신하기 위해 치환된다. 이는 바람직한 구조인데, 왜냐하면 이것이 소 PIV의 숙주 범위 제한 인자와 사람 PIV의 항원성 결정인자를 결합하기 때문이다.

본 발명의 사람-소 키메라 PIV에서 제공되는 숙주 범위 표현형 효과와 함께, 키메라 바이러스의 약독화를 증가시키너가 또는 감소시키는 추가 돌연변이를 도입하여 약독화 표현형을 조정하는 것이 흔히 바람직하다. 따라서, 본 발명의 추가적인 일면에서, 약독화된 사람-소 키메라 PIV는 키메라 게놈 또는 안티게놈이 생성된 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 약독화 표현형을 특정하는 1 이상의 약독화 돌연변이를 도입하여 추가로 변형되어 생성된다. 이들은 RNA 조절 서열 또는 코딩된 단백질 내의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이들 약독화 돌연변이는 신규(de novo)로 생성되고 또한 합리적인 설계 돌연변이유도 계획에 따라 약독화 효과에 대해 시험될 수 있다. 별법으로, 약독화 돌연변이는 존재하는 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV에서 확인될 수 있으며, 이후 본 발명의 사람-소 키메라 PIV 중으로 함입될 수 있다.

본 발명의 소-사람 PIV 중으로의 약독화 및 다른 목적하는 표현형을 특정하는 돌연변이의 도입은 이형의 유전자 또는 게놈 세그먼트, 예를 들어, L 단백질 또는 그 일부를 코딩하는 유전자를 소 또는 사람 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중으로 전달하여 달성될 수 있다. 별법으로, 돌연변이는 선택된 백그라운든 게놈 또는 안티게놈 중에 존재할 수 있으며, 도입된 이형의 유전자 또는 게놈 세그먼트는 돌연변이를 갖고 있지 않거나 또는 1 이상의 상이한 돌연변이를 가질 수 있다. 일반적으로, 사람 또는 소 백그라운드 또는 "수용체" 게놈 또는 안티게놈은 공여체 바이러스에서 확인된 것과 같이 동일하거나 또는 보존적으로 연관된 돌연변이(에를 들어, 보존적인 아미노산 치환)를 함유하거나 또는 코딩하기 위해 이형의 바이러스(예를 들어, 이형의 소 또는 사람 PIV 또는 비-PIV (-) 가닥 RNA 바이러스)의 돌연변이 위치에 상응하는 1 이상의 위치에서 변형된다(본원에 인용문헌으로 삽입된 PCT/US00/09695(2000. 4. 12. 출원; 우선권, 미국 가특허출원 제60/129,006호(1999. 4. 13. 출원) 참조). 한 실시태양에서, 소 백그라운드 또는 "수용체" 게놈 또는 안티게놈은 하기에서 열거되는 것과 같이 cp45 "공여체"로 확인된 것과 같은 동일하거나 또는 보존적으로 연관된 돌연변이를 함유하거나 또는 코딩하기 위해 HPIC3 JS cp45의 돌연변이 위치에 상응하는 1 이상의 위치에서 변형된다.

약독화 돌연변이를 확인하고 본 발명의 소-사람 키메라 PIV 중으로 함입하기 위해 바람직한 돌연변이체 PIV 균주는 저온 계대배양된(cp), 저온 적응된(ca), 숙주 범위 제한된(hr), 작은 플라크(sp), 및(또는) 온도 민감성 (ts) 돌연변이, 에를 들어 JS HPIV3 cp45 돌연변이체 균주를 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 1 이상의 약독화 돌연변이는 중합효소 L 단백질, 예를 들어 JS 야생형 HPIV3의 Tyr₉₄₂, Leu₉₉₂, or Thr_l558에 상응하는 위치에서 일어난다. 별법으로, 예를 들어 JS의 Val ₉₆ 또는 Ser₃₈₉ 잔기에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(들)을 코딩하는 N 단백질 중의 약독화 돌연변이가 선택될 수 있고, 사람-소 키메라 PIV 중에 함입될 수 있다. 별법의 또는 추가의 돌연변이는 C 단백질 중의, 예를 들어 JS 및 M 단백질 중의 Il₂₉₆에 상응하는 위치, 예를 들어 Pro₁₉₉에 상응하는 위치(예를 들어 Pro₁₉₉ 의 Thr 돌연변이)에서의 아미노산 치환(들)을 코딩할 수 있다. 또한 본 발명의 사람-소 키메라 PIV의 약독화를 조절하는 추가 돌연변이가 F 단백질 중에서(예를 들어 JS의 Ile₄₂₀ 또는 Ala₄₅₀에 상응하는 위치) 및 HN 단백질 중에서(예를 들어, JS의 Val₃₈₄ 에 상응하는 위치) 발견된다.

또한 본 발명의 사람-소 키메라 PIV 중으로 함입하기 위한 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터의 약독화 돌연변이는 PIV 게놈 또는 안티게놈의 비코딩 부분 중의, 예를 들어, 3' 리더 서열 중의 돌연변이를 포함한다. 이에 관련하여 예시적인 돌연변이는 JS cp45의 뉴클레오티드 23, 24, 28 또는 45번에 상응하는 위치에서 재조합 바이러스의 3' 리더 중의 위치에서 엔지니어링될 수 있다. 또한 추가의 예시적인 돌연변이가 N 유전자 개시 서열 중에서, 예를 들어 N 유전자 개시 서열 중의 1 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 JS cp45의 뉴클레오티드 62번에 상응하는 위치에서 엔지니어링될 수 있다.

JS cp45 및 다른 생물학적으로 유도된 PIV 및 비PIV 돌연변이체로부터, 큰 "메뉴"의 약독화 돌연변이가 제공되고, 이 돌연변이들 각각은 사람 및 소 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)의 키메라인 게놈 또는 안티게놈을 갖는 재조합 PIV 중의 약독화 수준을 조정하기 위한 어떤 다른 돌연변이(들)과도 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 PIV 중의 돌연변이는 1개 이상의, 바람직하게는 2개 이상의 JS cp45 돌연변이를 포함한다. 백신 용도를 위해 선택된 본 발명의 목적하는 사람-소 키메라 PIV는 폭넓은 임상 용도를 위한 만족스러운 약독화 수준을 달성하기 위해 흔히 둘 이상, 때때로 3개 이상의 약독화 돌연변이를 갖는다. 바람직하게는, 재조합 사람-소 키메라 PIV는 돌연변이를 특정하는 한 코돈 중의 복수개의 뉴클레오티드 치환에 의해 안정화된 1개 이상의 약독화 돌연변이(들)을 함입한다.

본 발명의 사람-소 키메라 PIV에 채택될 수 있고 전달될 수 있는 추가 돌연변이는 본 발명의 비PIV 세그멘트화되지 않은 (-) 가닥 RNA 바이러스에서 확인될 수 있고, 본 발명의 PIV 돌연변이 중에 함입될 수 있다. 이는 본원에 인용문헌으로 삽입된 PCT/US00/09695 (2000. 4. 12.출원됨, 우선권은 미국 가특허출원 제60/129,006호(1999. 4. 13. 출원))에 기술된 것과 같이, 수용체 PIV 게놈 또는 안티게놈 중의 상응하는 동형 위치에 이형 (-) 가닥 RNA 바이러스에서 확인된 돌연변이를 맵핑하고, 수용체 중에 존재하는 서열을 돌연변이체 유전형으로 돌연변이시켜 용이하게 달성된다.

재조합 사람-소 키메라 PIV과 아울러, 본 발명은 각각이 HPIV 및 BPIV 서열 및, 임의로는 본원에서 기술된 1 이상의 추가의 표현형-특이적인 돌연변이를 함입하는 연관된 cDNA 클론, 벡터 및 입자를 제공한다. 이들은 선택된 조합으로, 예를 들어 재조합 cDNA 게놈 또는 안티게놈인 단리된 폴리뉴클레오티드 중으로 함입되어, 본원에서 기술된 방법에 따른 발현시 적합하게 약독화되고, 감염성인 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 생샹한다. 이 방법은 루틴산 표현형 평가와 함께. 약독화, 온도 민감성, 변형된 면역원성, 저온-적응성, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한, 유전적 안정성 등과 같은 원하는 성질을 갖는 사람-소 키메라 PIV를 제공한다. 특히, 백신 후보는 약독화되었으나 여전히 충분히 면역원성이어서 백신처리된 포유류 숙주에서 방어성 면역 반응을 일으키는 것이 선택된다.

본 발명의 추가적인 일면에서, 예를 들어, 생물학적으로 유도된 약독화된 돌연변이 바이러스로부터 채택된 추가 돌연변이를 가지거나 또는 갖지 않은 사람-소 키메라 PIV는 목적하는 표현형, 구조적 또는 기능적 변화를 생성하기 위해 추가 뉴클레오티드 변형(들)을 갖도록 구성된다. 일반적으로, 선택된 뉴클레오티드 변형은 표현형 변화, 예를 들어 성장 특정, 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성, 플라크 크기, 숙주 범위 제한, 또는 면역원성에서의 변화를 특정할 것이다. 이에 관련하여 구조적인 변화는 조작 및 확인의 편리함을 위해 PIV를 코딩하는 cDNA 중으로 제한 효소 자리를 도입하거나 또는 제거하는 것을 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 사람-소 키메라 PIV의 개놈 또는 안티게놈 중의 뉴클레오티드 변화는 유전자의 부분적인 또는 완전한 결실 또는 그 발현의 감소 또는 제거(넉아웃(knock-out))에 의한 바이러스 유전자의 변형을 포함한다. 이들 변형은 사람 또는 소의 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중에 도입될 수 있거나, 또는 이들 중에 첨가되거나 또는 치환된 이형 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들) 중애 함입하여 키메라 게놈 또는 안티게놈 중에 도입될 수 있다. 이에 관련하여 돌연변이의 표적 유전자는 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 거대 중합효소 서브유닛 L, 매트릭스 단백질 M, 혈구응집소-뉴라미니다아제 단백질 HN, 작은 소수성 SH 단백질, 가능할 경우, 융합 단백질 F, 및, C, D 및 V 개방 판독틀(ORF)의 생성물을 포함하는 PIV의 모든 유전자를 포함한다. 재조합 바이러스가 살아있고 감염성인 한, 신규한 결실 또는 넉아웃 돌연변이를 달성하기 위해, 이들 단백질 각각은 전체적으로 또는 부분적으로, 단독으로 또는 다른 목적하는 변형과 조합하여, 선택적으로 결실되거나, 치환되거나 또는 재배열될 수 있다. 예를 들어, 1 이상의 C, D, 및(또는) V 유전자는 전체적으로 또는 부분적으로 결실될 수 있거나, 또는 그 발현은 감소되거나 또는 제거될 수 있다(예를 들어, 정지 코돈의 도입에 의해, RNA 에디팅 자리에서의 돌연변이에 의해, 개시 코돈에 의해 특정되는 아미노산를 변화시키는 돌연변이에 의해, 또는 표적 ORF(들) 중의 프레임 시프트(frame shift) 돌연변이에 의해). 한 실시태양에서, 돌연변이는 에디팅을 방해하고 그 mRNA가 RNA 에디팅에 의해 생성되는 단백질의 발현을 제거하는 에디팅 자리에서 생성될 수 있다(각각이 본원에 인용문헌으로 삽입된 Kato et al., EMBO J. 16: 578-587,1997a and Schneider et al., Virologv 227: 314322,1997). 별법으로는, 1 이상의 C, D, 및(또는) V ORF(들)은 성장, 약독화, 면역원성 또는 다른 목적하는 표현형 특성을 개선하기 위해 생성된 재조합 클론의 표현형을 바꾸기 위해 전체적으로 또는 부분적으로 결실될 수 있다 (본원에 인용문헌으로 삽입된 미국 특허 출원 제09/350,821호 (1999. 7. 9.일 출원) 참조).

본 발명의 사람-소 키메라 PIV의 별법의 뉴클레오티드 변형은 재조합 게놈 또는 안티게놈 중의 선택된 유전자에 대한 시스-작용 서열의 결실, 삽입, 첨가 또는 재배열을 포함한다. 본원에서 개시된 이러한 다른 변형들처럼, 이들 변형은 사람 또는 소 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중으로 도입될 수 있거나, 또는 이들 중에서 첨가되거나 또는 치환된 이형의 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들) 중에 함입하여 키메라 게놈 또는 안티게놈 중으로 도입될 수 있다. 한 실시예에서, 한 PIV 유전자의 시스-작용 조절 서열은 이형의 조절 서열에 상응하도록 변화되고, 이는 상이한 PIV 중의 동일한 유전자의 시스-작용 조절 서열의 대응물이거나, 또는 상이한 PIV 유전자의 시스-작용 조절 서열일 수 있다. 예를 들어, 유전자 정지 시그날은 동일한 PIV 균주 내의 상이한 유전자의 유전자 정지 시그날로 전환하거나 또는 치환하여 변형될 수 있다. 다른 실시태양에서, 뉴클레오티드 변형은 예를 들어, 선택된 형태의 단백질의 선택적인 번역 개시 자리를 제거하기 위해서, 재조합 게놈 또는 안티게놈 중의 번역 개시 자리의 삽입, 결실, 치환, 또는 재배열을 포함할 수 있다.

아울러, 다양한 다른 유전적 변형이 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈 중에서, 단독으로 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV로부터 채택된 1 이상의 약독화 돌연변이와 함께 생성될 수 있다. 예를 들어, 비PIV 기원의 유전자 또는 게놈 세그먼트는 전체적으로 또는 부분적으로 삽입될 수 있다. 별법으로, 유전자의 순서가 변화될 수 있거나, 또는 PIV 게놈 프로모터가 그 안티게놈의 대응물로 교체될 수 있다. 다양한 비코딩 영역 또는 다른 곳에 독특한 제한 효소 자리의 삽입과 같은 조작을 용이하게 하기 위해, 재조합 게놈 또는 안티게놈 중에서 상이하거나 또는 추가적인 변형이 만들어질 수 있다.

또 다른 일면에서, 비PIV 서열, 예를 들어 사이토카인, T-헬퍼 에피토프, 제한효소 자리 표지, 또는 미생물 병원체(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 기생충, 또는 진균)의 단백질 또는 면역원성 에피토프를 코딩하기 위해, 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터가 변형될 수 있다. 이러한 한 실시태양에서, 사람-소 키메라 PIV는 호흡기 합포체 바이러스(RSV)로부터의 유전자 또는 게놈 세그먼트, 예를 들어, RSV의 항원성 단백질(에를 들어, F 또는 G 단백질), 면역원성 도메인 또는 에피토프를 함입하도록 구성되었다.

본 발명의 관련된 일면에서, 조성물(예를 들어,PIV를 코딩하는 cDNA를 함입하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 벡터) 및 방법은 단리된 감염성 사람-소 키메라 PIV를 생성하기 위해 제공된다. 본 발명의 이러한 일면에서 포함된 것은 신규한 단리된 폴리뉴클레오티드 분자 및 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 이러한 분자를 함입하는 벡터이다. 또한, N, P, 및 L 단백질을 코딩하는 1 이상의 단리된 폴르뉴클레오티드 분자를 포함하는 동일하거나 또는 상이한 발현 벡터가 제공된다. 또한, 이들 단백질은 게놈 또는 안티게놈 cDNA로부터 직접적으로 발현될 수 있다. 벡터(들)은 바람직하게는 세포 또는 무세포 여액에서 발현되거나 또는 공동발현되어, 감염성 사람-소 키메라 PIV 바이러스성 입자 또는 서브바이러스 입자를 생성한다.

사람-소 키메라 PIV를 제조하기 위한 상기의 방법 및 조성물은 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자, 또는 이들의 유도체를 생성한다. 재조합 감염성 바이러스는 진정한 PIV 바이러스 입자에 상당하고 그 자체로 감염성이다. 이것은 신선한 세포를 직접적으로 감염시킬 수 있다. 감염성 서브바이러스 입자는 일반적으로 적절한 조건하에서 감염을 개시할 수 있는 바이러스 입자의 서브구성요소이다. 예를 들어, 게놈 또는 안티게놈 RNA 및 N, P, 및 L 단백질을 함유하는 뉴클레오캡시드는 세포의 세포질 중으로 도입되었을 경우 감염을 시작할 수 있는 바이러스 입자의 예이다. 본 발명 내에서 제공되는 서브바이러스 입자는 1 이상의 단백질(들), 단백질 세그먼트(들), 또는 감염원성에 필수적이지 않은 다른 바이러스 성분(들)이 결여된 바이러스 입자를 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양에서는 상기에서 기술된 것과 같은 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포 또는 세포 여액, 및 PIV의 N, P, 및 L 단백질을 코딩하는 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터(동일하거나 또는 상이한 벡터)를 제공한다. 이들 단백질 중 하나 이상은 게놈 또는 안티게놈 cDNA로부터도 발현될 수 있다. 게놈 또는 안티게놈으로부터 발현될 때, N, P, 및 L은 감염성 사람-소 키메라 PIV 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 생성하기 위해 결합한다.

본 발명의 사람-소 키메라 PIV는 PIV에 감염되기 쉬운 숙주에서 PIV에 목적하는 면역 반응을 생성하기 위해 다양한 조성물에서 유용하다. 사람-소 키메라 PIV 재조합체는 감염된 포유동물 숙주에서 방어성 면역 반응을 일으킬 수 있지만, 면역화된 숙주에서 심각한 가관지 질환의 받아들일 수 없는 증상을 일으키지 않기 위해 충분히 약독화된다. 아울러, 사람-소 키메라의 PIV 재조합체는 백신 제조를 용이하게 하기 위해 시험관내에서 충분한 효율로 복제할 수 있어야 한다. 약독화된 바이러스 또는 서브바이러스 입자는 배양물로부터 단리되거나, 또는 부분적으로 또는 완전히 정제된 세포 배양물 상징액 중에 존재할 수 있다. 또한, 바이러스는 동결 건조될 수 있으며, 또한 원하는 대로 저장되거나 또는 숙주에 전달하기 위한 다양한 다른 성분들과 함께 조합될 수 있다.

아울러, 본 발명은 생리학적으로 허용되는 담체 및(또는) 애주번트 및 단리된 약독화된 사람-소 키메라 PIV 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 포함하는 신규한 백신을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 약독화와 면역원성의 적절한 균형을 달성하기 위해 상기에서 기술된 것과 같은 하나 이상, 바람직하게는 둘 이상의 추가 돌연변이 또는 다른 뉴클레오티드 변형을 갖는 사람-소 키메라 PIV로 구성된다. 백신은 10³ 내지 10⁷의 PFU의 약독화된 바이러스 투여량으로 제형화될 수 있다. 백신은 단일 PIV 균주 또는 복수개의 PIV 균주 또는 군에 대한 면역 반응을 유발하는 약독화된 사람-소 키메라 PIV를 포함할 수 있다. 이런 점에서, 사람-소 키메라 PIV는 다른 PIV 백신 균주와 함께, 또는 RSV와 같은 다른 백신 바이러스와 함께 백신 제형으로 결합될 수 있다.

관련된 일면에서, 본 발명은 포유류 피검체에서 PIV에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 면역계를 자극하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 생리학적으로 형오되는 담체 및(또는) 애주번트 중의 면역학적으로 충분한 양의 사람-소 키메라 PIV의 제형을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 면역원성 조성물은 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상의 약독화된 돌연변이 또는 상기에서 기술된 것과 같은 목적하는 표현형을 특정하는 다른 뉴클레오티드 변형을 갖는 사람-소 키메라 PIV로 이루어진 백신이다. 백신은 10³ 내지 10⁷ PFU의 약독화된 바이러스의 투여량으로 제형화될 수 있다. 백신은 단일 PIV, 복수개의 PIV, 예를 들어 HPIV1 및 HPIV3, 또는 RSV와 같은 1 이상의 PIV(들) 및 비PIV 병원체에 대한 면역 반응을 유발하는 약독화된 사람-소 키메라 PIV 바이러스를 포함할 수 있다. 이러한 상황에서, 사람-소 키메라 PIV는 단일특이적인 면역 반은 또는 복수개의 PIV들, 또는 1 이상의 PIV(들) 및 RSV와 같은 비PIV 병원체에 대한 다중특이적인 면역 반응을 유발할 수 있다. 별법으로는, 상이한 면역원성 특정을 갖는 사람-소 키메라 PIV는 하나의 PIV, 복수개의 PIV들, 또는 1 이상의 PIV(들) 및 RSV와 같은 비PIV 병원체에 대한 보다 효과적인 방어를 이끌어 내기 위해 백신 혼합물 중에서 혼합되거나 코디네이트된 처리 프로토콜에서 개별적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 면역원성 조성물은 예를 들어, 스프레이, 비말 또는 에어로졸에 의해 상부 호흡기도에 투여된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 소 PIV 균주 Ka 또는 SF의 N 코딩 영역의 HPIV3 중으로의 클로닝을 예시한다. 도 1A-C에서, BPIV 3N 개방 판독틀(ORF)는 전장 rJS 안티게놈 cDN 중의 상응하는 HPIV3 서열을 대신한다(Durbin et al., 1997a, 상기 참조). BPIV3 Ka 및 SF N 유전자는 먼저 비리온 RNA로부터 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭되고 1.9kb 단편으로 pBluescript 중으로 서브클로닝 되어 각각 pBS-KanJ 또는 pBS-SFN을 생성한다. HPIV3 rJS N 유전자는 1.9kb MluI/EcoRI 단편으로 rJS HPIV3 안티게놈의 5'절반부를 함유한 플라스미드로부터 pUC119 중으로 서브클론되어서(각각이 본원에 인용문헌으로 삽입된 Durbin et al., 1997a, 상기 참조; U. S. 특허 출원 번호 제09/083,793호, 1998. 5. 22. 출원 U. S. 가특허출원 제60/047,575,호, 1997. 5. 23. 출원 (대응 국제 특허 출원 공개 번호 WO 제98/53078호), 및 U. S. 가특허출원 제60/059,385호, 1997. 9. 19. 출원) pUC119JSN을 생성하였다. 각각의 N 유전자는 각각 번역 개시 및 종결 자리의 Ncol 및 AfiII 자리를 놓기 위해서 특정 부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)에 의해 변형되었다. Ka 및 SF N 유전자는 번역 개시 및 정지 자리 영역에서 동일하였고, 따라서, 1A에 묘사된 것과 같인 BPIV3 N 유전자 양쪽에서 동일한 돌연변이 유도 반응이 수행되었다. 도 1B-- AflII/NcOL 절단을 행한 후, BPIV3 N 코딩 영역을 나타내는 1.5kb의 단편을 pBS-KaN 또는 pBS-SFN으로부터 HPIV3 대응물의 치환체로 HPIV3 N 서브클론 pUC119JSN-Ncol/AflII의 Ncol/AflII 창(window) 중으로 도입하였다. 도 1C-- 각각의 이후 키메라 서브클론은 번역 개시 코돈 전 또는 정지 코돈 후에 HPIV3 rJS에 존재하는 서열 또는 바로 개시 코돈 다음 및 정지 코돈 전에 BPIV 코딩 서열을 회복하기 위해 자리 지정된 돌연변이 유도를 시켰다. 이는 pUC 119B/HKaN 및 pUC 119B/HSFN을 생성했으며, 이는 도 2에서 나타낸 것과 같이 BPIV3 N 유전자를 HPIV3 cDNA 클론 중으로 옮기는 데 사용되었다. 도 1, 패널 A, CAAAAATGTTG (SEQ ID NO. 10); GCAACTAATCGA (SEQ ID NO. 11); TAACCATGGTGA (SEQ ID NO. 12); GCACTTAAGCAC (SEQ ID NO. 13). 도 1, 패널 C, TAACCATGGTGA (SEQ ID NO. 12); GCACTTAAGCAC (SEQ ID NO. 13);CAAAAATGTTGA (SEQ ID NO. 14); GCAACTAGTCGA (SEQ ID NO. 15).

도 2는 HPIV3/BPIV3 (균주 Ka 또는 SF) 키메라 N 유전자의 HPIV3 안티게놈 cDNA 중으로의 삽입을 예시한다. 도 2A에서, HPIV3 서열에 의해 플랭킹(flanking)된 Ka 또는 SF의 BPIV3 N ORF는 pUC I 19B/HKaN 또는 pUC 119B/HSFN의 Mlul/EcoRI 단편으로 서브클론되고, pLeft+2G 중으로 삽입되었다(Durbin et al., 1997a, 상기 참조). pLeft+2G 플라스미드는 T7 프로모터, 쥐의 nt 1-7437(게놈 센스)로부터의 HPIV3 rJS 안티게놈의 5' 절반부를 포함한다. 전사를 향상시키기 위해 T7 프로모터와 HPIV3 서열 사이에 삽입된 두 개의 G 잔기의 위치는 별표로 나타내었다/ 도 2B--헤파타이티스 델타 바이러스 라이보자임 및 T7 터미네이터에 의해 플랭킹된 HPIV3 안티게놈의 3'말단부를 함유한 pRight의 XhoI/NgiMl 단편(각각이 본원에 인용문헌으로 삽입된 Durbin et al., 1997a, 상기 참조; 미국 특허 출원 제09/083,793호(1998.5.22. 출원), 미국 가특허 출원 제60/047,575호(1997. 5. 23. 출원 (국제 특허 출원 공개 WO 제98/53078호에 대응), 및 미국 가특허 출원 제60/059,385호(1997. 9. 19. 출원))을 변형된 pLeft 플라스미드의 XhoI/NgoMl 창에 클로닝하여 플라스미드 pB/HPIV3KaN 및 pB/HPIV3SFN을 생성하였다. 이들 키메라 구조체 각각은 BPIV3 Ka 또는 SF 대응물로 치환된 N 코딩 영역을 제외하고는 HPIV3 안티게놈 RNA의 전체 (+)센스 서열을 함유한다.

도 3은 N 번역 개시(A) 및 종결 (B) 코돈 주위의 본 발명의 HPIV3, BPIV3 및 키메라 바이러스의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 개개의 ORF들의 위치는 각각의 진벵크 리포트에서 기술되었으며(BPIV3 Ka의 경우 #AF178654, BPIV3 SF의 경우 #AF178655, 및 #Z11515), 본원에 인용문헌으로 포함되었다. N 유전자 중의 번역 개시 (A) 및 종결(B) 코돈(각각 밑줄)을 플랭킹하는 서열((+) 센스)를 부모형 재조합 HPIV2 JS(rJS), 부모형의 생물학적으로 유도된 BPIV3 Ka 및 SF 바이러스 (Ka 및 SF), 및 키메라 cKa 및 cSF 바이러스에 대해 나타내었다. cKA 및 cSF 바이러스 서열 중의 숙주 특이적인 잔기 및 rJS (개시 코돈 전 및 정지 코돈 후) 및 SF 또는 Ka (개시 코돈부터 정지 코돈까지 포함하여) 중의 이들의 대응물은 볼드체로 나타내었다. 플라크-정제된 키메라 바이러스를 비리온 RNA로부터 RT-PCR에 의해 정제하였으며, 택 다이 디옥시 터미네이터 사이클 키트(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle kit)를 사용하여 시퀀싱하였다(캘리포니아주 포스터 시티, ABI사). 이는 예상했던 서열이 각각의 키메라 바이러스에 존재한다는 것을 확인하였다. 도 3A. rJS, GGAACTCTATAATTTCAAAAATGTTGAGCCTATTTGATAC (SEQ ID NO. 16) GGAACTCTATAATTTCAAAAATGTTGAGTCTATTCGACAC (SEQ ID NO. 17).

도 3A. Ka 및 SF,

GAAATCCTAAGACTGTAATCATGTTGAGTCTATTCGACAC (SEQ ID NO. 18).

도 3B. rJS, TTAACGCATTTGGAAGCAACTAATCGAATCAACATTTTAA (SEQ ID NO. 19).

도 3B. cKa 및 cSF,

TCAGTGCATTCGGAAGCAACTAGTCGAATCAACATTTTAA (SEQ ID NO. 20).

도 3B. Ka 및 SF,

TCAGTGCATTCGGAAGCAACTAGTCACAAAGAGATGACCA (SEQ ID NO. 21).

도 4A-4C는 본 발명의 BPIV3/HPIV3 키메라 바이러스의 구조, 및 바이러스 RNA로부터의 RT-PCR 생성물의 TaqI 절단에 의한 이들의 확인을 상세히 나타낸다. 도 4A에서, 키메라 cKa 및 cSF 바이러스의 게놈은 HPIV3 및 BPIV3 부모형 바이러스의 그것에 대해 개략적으로 (정확하지 않음) 나타내었다. Ka- 및 SF-특이적인 영역은 각각 밝게 또는 어둡게 표시하였다. rJS 게놈 위의 화살표는 진단을 위한 TaqI 절단 목적을 위한 키메라 및 부모형 바이러스의 RT-PCR 증폭에 사용된 프라이머의 위치를 나타낸다. 이들 프라이머는 HPIV3, BPIV3, 및 키메라 BPIV3.HPIV3 바이러스의 증폭을 위해 사용될 수 있도록 HPIV3와 BPIV3 사이의 영역을 목표로 한다. 도 4B에서, 각각의 바이러스에 대한 TaqI 절단 생성물의 예상 크기는 도 4A에서 나타낸 프라이머를 사용하여 RNA로부터 증폭된 1898-bp의 PCR 생성물로 나타났다. 이 PCR 생성물은 도 4B 상단에 나타내었고, N ORF는 채워진 직사각형으로 나타냈다. 각각의 바이러스에서 특이적이며, 따라서 바이러스 확인에서 작용하는 것 TaqI 단편을 별표로 표시하였다. 도 4C는 HPIV3 및 BPIV3 부모형 바이러스의 그것에 의해 플랭킹된 키메라 cKa(좌측) 및 cSF(우측)의 PIV3 N 코딩 영역을 함유하는 PCR 생성물의 TaqI 프로파일을 제공한다. 바이러스 동정을 진단할 수 있고 도 4B에서 확인된 것에 상응하는 독특한 TaqI 단편을 별표로 표시하였다. DNA 겔 밴드의 계산된 길이(bp)를 나타내었다.

도 5는 MDBK (A) 또는 LLC-MK2 (B) 세포에서의 부모형 및 키메라 바이러스의 멀티사이클 성장 곡선을 제공한다. 6웰 플레이트의 웰(각각, 9.6cm²) 중의 소 MDBK (A) 또는 시미안 LLC-MK2(B) 세포의 단층을 각각 표시된 부모형 또는 키메라 바이 러스로 감염 다중도 0.01로 감염시켰다. 3개의 복제 감염을 각각의 바이러스에 대해 수행하였다. 샘플을 표시된 시간에서 회수하고, -70℃에 저장하고, TCID₅₀ 분석으로 동시에 역가를 측정하였다. 각각의 시점에서의 3개의 복제 샘플의 평균을 사용하여 성장 곡선을 만들었다. 최저 한도의 검출감도는 10^1.5RCID₅₀/ml로, 이는 점선으로 표시하였다.

도 6A-6G는 소 PIV3 Ka 균주의 전체 (+) 센스 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO.22)를 나타낸다.

도 7A-7G는 소 PIV3 SF 균주의 전체 (+) 센스 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO.23)를 나타낸다.

도 8A는 키메라 rHPIV3-F_BHN_B 및 rBPIV3-F_HHN_H 바이러스, 및 이들의 부모형 바이러스 rHPIV3 JS 및 BPIV3 Ka의 게놈의 대략적인 묘사를 제공한다 (정확하지 않음). F 및 HN 유전자는 각각 M 및 HN 유전자 말단 서열 앞에 도입된 SgrAI 및 BsiWI 자리을 사용하여 RrHPIV3와 rBPIV3 사이의 단일 제한 단편에서 교환되었다.

도 8B는 BPIV3 Ka에 대한 안티게놈 cDNA의 어셈블리를 나타낸다. 전장 cDNA는 BPIV3 Ka의 전체 안티게놈 서열을 코딩하기 위해 구성되었다 (진뱅크 접수번호 #AF178654). cDNA는 바이러스 (v)RNA의 역전사 및 중합효소 연쇄반응 (PCR) 증폭으로부터 유도된 서브클론들로부터 어셈블된다. 안티게놈의 다수의 서브클론이 시퀀싱되었고, BPIV3 Ka의 콘센서스(consensus) 서열에 일치하는 유일한 클론을 전장 클론의 어셈블리에 사용하였다(nt21 및 nt23은 에외로, 이는 공개된 서열과 다르지 만 바이러스 집단에서는 유사한 빈도로 나타난다).

도 8C는 부모형 및 키메라 소-사람 PIV 게놈의 특징을 예시한다. 키메라 rHPIV3 F_BHN_B 및 rBPIV3 F_HHN_H 바이러스 및 이들의 부모형 바이러스 rHPIV3 JS 및 BPIV3 Ka의 게놈을 개략적으로 나타내었다(정확하지는 않음). 두 개의 독특한 제한효소 인자 자리, SrgAI 및 BsiWI이 각각 M 및 HN 유전자 말단 근처에 도입되었다. 이들 도입된 제한 효소 자리를 갖는 재조합 HPIV3 및 BPIV3 바이러스는 도 8C2에 나타낸 것과 같이 rHPIV3 및 rBPIV3로 표시하였다. 당단백질 유전자는 rHPIV3 JS와 rBPIV3 Ka 사이에서 교환되었다. 돌연변이가 일어난 뉴클레오티드 서열은 각각의 cDNA 구조체 밑에 각각의 서열의 첫번째 뉴클레오티드 위치를 표시하여 나타내었다. 도입된 SgrAI 및 BsiWI 제한 효소 자리는 밑줄을 그었으며, HPIV3와 BPIV3사이에서 서로 달라서 유전자 삽입체의 기원을 확인할 수 있는 뉴클레오티드는 볼드체로 나타내었다. 도 8C, 패널 1. rBPIV3 Ka, TCCAACATTGCA (SEQ ID NO. 2); AAGATATAAAGA (SEQ ID NO. 25). 도 8C, 패널 2 rHPIV3s, CGCACCGGTGTA (SEQ ID NO. 5); TAGACGTACGGG (SEQ ID NO. 26). 도 8C, 패널 2. rBPIV3s, TCCACCGGTGCA (SEQ ID NO. 3); AAGACGTACGGA (SEQ ID NO. 27). 도 8C, 패널 3. rHPIV3 F_BHN_B, CGCACCGGTGCA (SEQ ID NO. 28); AAGACGTACGGG (SEQ ID NO. 29). 도 8C, 패널 3. rBPIV3 F_HHN_H, AAGACGTACGGG (SEQ ID NO. 30); TAGACGTACGGA (SEQ ID NO. 31).

도 9는 바이러스 RNA의 RT-PCR 및 EcoRI 절단에 의한 재조합 바이러스 동정 의 확인을 나타낸다. 바이러스 RNA의 RT-PCR 생성물은 BPIV3 및 HPIV3 양쪽에서 F 및 HN 유전자의 양쪽 말단 중 하나의 보존 영역을 인지하는 프라이머를 사용하여 제조된다. EcoRI으로의 절단은 4개의 바이러스 각각에 대해 독특한 패턴의 제한 효소 단편을 생성한다. 좌측의 개략적인 도면에서, 수평선은 증폭된 바이러스 서열을 상징하고, 수직선은 EcoRI 자리의 위치를 나타낸다. 각각의 제한효소 단편의 예상된 크기는 선 위에 나타내었다. 각각의 선 밑에 있는 숫자는 BPIV3 Ka, HPIV3 JS(진뱅크 접수번호 #AF178654 및 Z11575), 또는 표시된 키메라 유도체의 안티게놈 RNA에서의 서열 위치에 해당한다. 우측에서 PCR 생성물의 EcoRI 절단의 1% 아가로즈 겔을 나타내었고, 이는 부모형 및 키메라 바이러스의 정체를 확인한다. 별표는 그 크기가 매우 유사하여 같이 이동하는 두 개의 제한 효소 단편을 포함하는 겔 밴드를 나타낸다.

도 10은 시미안 LLC-MK2 세포 중의 키메라 및 부모형 바이러스의 멀티사이클 복제를 서술한다. 3개의 키메라 바이러스 rHPIV3-F_BHN_B, rBPIV3-F_HHN_H 및 rHPIV3-N_B(cKa라고도 부름)의 멀티사이클 복제(투입 접종량은 0.01의 MOI를 가짐)를 이들의 부모형 바이러스 BPIV3 Ka 및 rHPIV3의 복제와 비교하였다. 바이러스 역가는 평균 로그₁₀ TCID₅₀/ml ±3개의 샘플의 표준 오차로 나타낸다. 이 분석의 최저 한도의 탐지는 수직 점선으로 나타낸 것과 같이 10 TCID₅₀이다.

도 11은 감염 경과에서 감염된 레서스 원숭이의 비인두 면봉에서의 키메라 및 부모형 바이러스의 평균 역가의 자료를 제시한다. 바이러스 역가는 동일한 바 이러스로 감염된 4 또는 6 마리의 원숭이 군에 대한 LLC-MK2 세포 중의 평균 TCID₅₀/ml ±표준 오차로 나타낸다. 패널 A에서, rHPIV3-F_BHN_B의 평균 역가를 rHPIV3 및 BPIV3의 역가와 비교하였다. 패널 B에서, rBPIV3-F_HHN_H의 평균 역가를 BPIV3 Ka 및 rHPIV3의 그것과 비교하였으며, 후자의 두 바이러스에 대해 패널 A와 동일한 값이지만, 비교를 용이하게 하기 위해 개별적으로 제시하였다. 5일째의 역가는 도면에서 배제하였는데, 왜냐하면 이들은 4일째 및 6일째 역가에 비해 매우 낮았으며, 이는 아마도 샘플 수집 중의 기술적 문제 때문일 것이기 때문이다.

본 발명은 사람-소 키메라 PIV를 생성하기 위해 사람 및 소 PIV 게놈 또는 안티게놈 서열의 키메라로 클론된 재조합 파라인플루엔자 바이러스 (PIV)를 제공한다. 사람-소 PIV의 키메라 구조는 포유류, 특히 사람에서 감염성인 바이러스 입자 또는 서브바이러스 입자를 생성하고, 임상적 또는 수의학적 용도를 위한 면역원성 조성물을 생성하는 데 유용하다. 또한, 본 발명 내에서 제공되는 것은 PIV 감염의 예방 및 치료를 위한 방법 및 조성물과 아울러, 약독화된 사람-소 키메라 PIV를 설계하고 고안하기 위한 신규한 방법 및 조성물이다.

본 발명의 키메라 사람-소 PIV는 감염성 키메라 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 생성하기 위해 사람 및 소 PIV 두 균주로부터의 뉴클레오티드 서열을 함입하기 위해 재조합적으로 엔지니어링되었다. 이 방식에서, 후보 백신 바이러스는 사람 및 비사람 영장류를 포함하는 PIV에 감염되기 쉬운 포유류 숙주에서 PIV에 대한 면역 반응을 유발하기 위해 재조합적으로 엔지니어링되었다. 본 발명에 따른 사람-소 키메라 PIV는 특정 PIV, 예를 들어, HPIV3, 또는 복수개의 본 발명에 따른 사람-소 키메라 PIV는 특정 PIV, 예를 들어 HPIV3에 대한 면역 반응 또는 복수 개의 PIV들, 예를 들어 HPIV1 및 HPIV3에 대한 다중특이적인 반응을 유발할 수 있다.

본 발명의 예시적인 사람-소 키메라 PIV는 주요 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질(P), 및 거대 중합효소 단백질(L)과 아울러 사람 및 소 폴리뉴클레오티드 서열을 둘 다 포함하는 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 함입한다. 추가의 PIV 단백질들은 완전한 바이러스 입자 또는 과잉 단백질, 항원성 결정 인자 또는 다른 추가의 성분들을 포함하는 바이러스 입자에 달하는 감염성 서브바이러스 입자의 범위를 제공하기 위해 추가의 PIV 단백질들이 다양한 조합으로 포함될 수 있다.

본 발명의 키메라 사람-소 PIV는 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 형성하기 위해 상이한 PIV 균주 또는 혈청형 바이러스의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)와 조합된 사람 또는 소 PIV 균주 또는 혈청형 바이러스로부터 유래하거나 또는 이에 따라 패턴화된 일부 또는 전체 "백그라운드" PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함한다. 본 발명의 특정 일면에서, 키메라 PIV는 소 PIV로부터의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 유전자 세그먼트(들)로 조합된 일부 또는 전체 사람 PIV(HPIV) 백그라운드 게놈 또는 안티게놈을 함입한다. 본 발명의 다른 일면에서, 키메라 PIV는 사람 PIV부터의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 유전자세그먼 트(들)로 조합된 일부 또는 전체 소 PIV(BPIV) 백그라운드 게놈 또는 안티게놈을 함입한다.

일부 또는 전체 백그라운드 게놈 또는 안티게놈은 일반적으로 대응물인 사람 또는 소 PIV의 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트가 도입되는 수용체 뼈대 또는 벡터로 작용한다. 대응물인 사람 또는 소 PIV로부터의 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트는 백그라운드 게놈 또는 안티게놈과 결합되거나 또는 그 중에서 치환되는 "공여체" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 나타내고, 기여하는 PIV 중 하나 또는 둘 다에 비교하여 신규한 표현형 특성을 나타내는 사람-소 키메라 PIV를 생성한다. 예를 들어, 선택된 수용체 PIV 균주 중으로의 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트의 추가 또는 치환은 변형되지 않은 수용체 및(또는) 공여체의 상응하는 표현형(들)과 비교하여 약독화, 성장 변화, 변화된 면역원성, 또는 다른 원하는 표현형 변화를 증가시키거나 또는 감소시킬 수 있다. 본 발명의 사람-소 키메라 PIV 중의 이형 삽입 또는 첨가로 사용되기 위해 선택될 수 있는 유전자 및 게놈 세그먼트는 PIV N, P, C, D, V, M, SH (적절하게), F, HN 및 (또는) L 단백질(들) 또는 이들의 일부를 코딩하는 유전자 또는 게놈 세그먼트를 포함한다. 또한, 유전자외 리더 또는 트레일러 또는 유전자간 영역과 같은 조절 영역이 이형 삽입 또는 첨가로서 유용하다.

이형 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)은 일부 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)의 야생형 유전자 순서 위치에 상응하는 위치에서 첨가되거나 또는 치환될 수 있으며, 이로써 이 대응 유전자 또는 게놈 세그먼트는 치환되거나 제거된다(예를 들어, 보다 프로모터에서 멀리 떨어진 위치로). 다른 추가 실시태양에서, 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트는 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 세그먼트의 야생형 유전자 순서 위치에 비교하여 보다 프로모터에 근접하거나 또는 프로모터에서 멀리 떨이진 위치에서 첨가되거나 또는 치환될 수 있으며, 이는 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트의 발현을 각각 향상시키거나 또는 감소시킨다.

사람-소 키메라 PIV를 생성하기 위한 이형의 면역원성 단백질, 도메인 및 에피토프의 도입은 면역화된 숙주에서 신규한 면역 반응을 생성하는 데 특히 유용하다. 상이한 PIV의 수용체 게놈 또는 안티게놈 내의 한 공여체 PIV로부터의 면역원성의 유전자 또는 게놈 세그먼트의 첨가 또는 치환은 공여체 부분군 또는 균주, 수용체 부분군 또는 균주에 대하여, 또는 공여체 및 수용체 부분군 또는 균주 양자에 대하여 면역 반응을 생성할 수 있다. 이 목적을 달성하기 위해, 사람-소 키메라 PIV는 예를 들어 사람-소 융합 단백질을 제공하기 위해 키메라 단백질, 예를 들어 다른 PIV의 엑토도메인에 융합된 한 PIV에 특이적인 세포질 테일 및(또는) 막횡단 도메인을 갖는 면역원성 당단백질, 또는 두 상이한 사람 PIV들로부터의 도메인을 함입한 융합 단백질을 발현하도록 구성될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈은 사람 및 소 양쪽의 당단백질 도메인 또는 면역원성 에피토프를 갖는 재조합 바이러스 또는 서브바이러스 입자 중에서 키메라 당단백질을 코딩한다. 예를 들어, 사람 PIV HN 또는 F 당단백질로부터의 당단백질 엑토도메인을 코딩하는 이형의 게놈 세그먼트는 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안 티게놈을 형성하기 위해, 상응하는 소 HN 또는 F 당단백질 세포질 및 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(즉, 게놈 세그먼트)와 결합될 수 있다.

다른 실시태양에서, 백신 제조에서 유용한 사람-소 키메라 PIV는 혈중 바이러스에서 항원 연속변이를 할 수 있도록 하기 위해 용이하게 변형될 수 있다. 일반적으로 변형은 HN 및(또는) F 단백질에 있을 것이다. 이는 1 이상의 점 돌연변이의 도입이 관여할 것이며, 또한 전체 HN 또는 F 유전자, 또는 한 PIV 균주 또는 군으로부터 다른 PIV 균주 또는 군의 수용체 클론 중의 상응하는 영역의 치환에 의해서나, 또는 유전자의 1 이상의 카피를 첨가하여 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈 중으로 함입된 이들의 특정 면역원성 영역을 코딩하는 게놈 세그먼트가 관여할 것이며, 따라서 다수의 항원형이 제공된다. 이후, 변형된 PIV 클론으로부터 생성된 자손 바이러스는 새로 나타나는 PIV 균주에 대한 백신 프로토콜에서 새용될 수 있다.

사람 PIV의 코딩 서열 또는 비코딩 서열(예를 들어, 프로모터, 유전자 말단, 유전자 개시, 유전자간 또는 다른 시스-작용 요소)를 이형의 대응물로 치환하는 것은 다양한 가능한 약독화 및 다른 표현형 효과를 갖는 키메라 PIV를 생성한다. 특히, 숙주 범위 및 다른 목적하는 효과는 사람 PIV 백그라운드 중에 들어온 소 또는 쥐 PIV(MPIV) 단백질, 단백질 도메인, 유전자 또는 게놈 세그먼트를 치환하여 나타날 수 있는데, 소 또는 쥐 유전자는 사람 세포에서 효율적으로 기능하지 못하고, 예를 들어 이형의 서열 또는 단백질과 생물학적으로 상호작용하는 사람 PIV 서열 또는 단백질(즉, 바이러스 전사, 번역, 어셈블리 등을 위해 치환된 서열 또는 단백 질과 정상적으로 협동하는 서열 또는 단백질)의 불화합성, 또는 보다 일반적으로는 숙주 범위 제한에서 세포내 단백질 또는 세포내 환경의 일부 다른 측면이 증식 허용 숙주 및 그보다 덜 증식을 허용하는 세포 사이에서 상이하기 때문이다. 예시적인 실시태양에서, 소 및 사람 PIV 구조 및 기능의 공지된 일면에 기초하여 사람 PIV 중으로 도입하기 위해 소 PIV 서열을 선택하였다.

HPIV3는 모노네가비랄레 (Mononegavirales) 목 중의 파라믹소비리데 (Paramyxoviridae)과의 레스피로비루스(Respirovirus) 속의 멤버이다(Collins et al., 1996, 상기 참조). HPIV3는 HPIV들 중에서 특정 분석이 가장 잘 되었으며, 표준 HPIV를 나타낸다. 그 게놈은 (-) 센스 RNA 15462 뉴클레오티드(nt) 길이의 단일 가닥이다(Galinski et al., Virology 165: 499-510,1988; 및 Stokes et al., Virus Res. 25: 91-103,1992; 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). PIV3 게놈에 의해 8개 이상의 단백질이 코딩된다. 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 알려지지 않은 기능의 C 및 D 단백질, 매트릭스 단백질 M, 융합 당단백질 F, 혈구응집소 뉴라미니다아제 당단백질 HN, 및 거대 중합효소 단백질 L (Collins et al., 1996, 상기 참조). P 유전자 중의 V ORF를 함유하는 단백질 또한 생성될 수 있다 (Durbin et al., Virology 261: 319-333,1999).

M, HN, 및 F 단백질들은 외피 연결되었으며, 후자 두 단백질은 각각의 PIV에서처럼 표면 당단백질로, 주요 중화 및 방어 항원이다(Collins et al., 1996, 상기 참조). PIV들 중에서 필적하는 PIV HN 또는 F 단백질 사이의 상당한 서열 분기는 방어성 면역의 유형 특이성의 기초가 되는 것으로 생각된다 (Collins et al., 1996, 상기 참조; Cook et al.,Amer. Jour. Hvg. 77: 150-159,1963; Ray et al., J. Infect. Dis. 162: 746-749,1990; 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다).

HPIV3 유전자들은 4개의 ORF들, 즉, P, C, D 및 V를 함유한 P mRNA를 제외하고는, 각각 단일 단백질을 코딩하는 단일 mRNA로 전사된다(Galinski et al., Virologv 186: 543-550,1992; and Spriggs et al., J. Gen. Virol. 67: 2705-2719,1986; 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). P 및 C 단백질은 mRNA 중의 별개의, 중첩하는 ORF들로부터 번역된다. 반면, 모든 파라믹소바이러스는 한 개의 P 단백질을 코딩하고, 레스피로바이러스 및 모르빌리바이러스 속의 멤버만이 C 단백질을 코딩한다. 개개의 바이러스는 C ORF로부터 발현되는 단백질의 수 및 시험관내 및 생체내의 바이러스 복제에서의 그 중요성에서 다르다. 센다이 바이러스(SeV)는 그 번역 개시 자리가 mRNA에서 그 순서로 나타나는, C ORF:C', C, Y1, 및 Y2로부터의 4개의 독립적으로 개시된 단백질을 발현하는 반면(Curran, et al., Enzyme 44: 244-249,1990; Lamb et al., in The Paramyxoviruses D. Kingsbury, ed., pp. 181-214,Plenum Press, New York, 1991; 본원에 인용문헌으로 삽입되었다), 홍역 바이러스(MeV)는 단일 C 단백질만을 발현한다 (Bellini et al., J. Virol. 53: 908-919, 1985; Sanchez et al., Viroloev 147: 177-86,1985; and Spriggs et al., 1986, 상기 참조; 각각이 본원에 인용문헌으로 삽입되었다).

PIV3 D 단백질은 P 및 D ORF들의 융합 단백질로, 이는 주형에 없는 두 개의 G 잔기가 RNA 에디팅 자리에서 P mRNA에 첨가되는 공동 전사의 RNA 에디팅 공정에 의해 P 유전자로부터 발현된다(Galinski et al., 1992, 상기 참조; and Pelet et al., EMBO J. 10: 443-448,1991; 각각이 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). D 단백질을 발현하는 유일한 다른 파라믹소바이러스인 BPIV3는 두번째 단백질, V 단백질과 아울러 이 단백질을 발현하기 위해 RNA 에디팅을 사용한다.

레스피로바이러스, 루불라바이러스 (Rubulavirus) 및 모르빌리바이러스과의 거의 모든 구성원은 V 단백질을 발현하다. 명백하게 발현하지 않는 유일한 멤버는 HPIV1으로, 이는 온전한 V ORF가 결여되어 있다 (Matsuoka et al., J. Virol. 65: 3406-3410,1991, 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). V ORF는 고도로 보존된 시스테인이 풍부한 도메인이 존재한다는 특징이 있다 (Cattaneo et al., Cell 56: 759-764,1989; Park et al., J. Virol. 66: 7033-7039,1992; Thomas et al., Cell 54: 891-902,1988; 및 Vidal et al., J. Virol. 64: 239-246,1990; 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). V ORF는 현재까시 시퀀싱된 HPIV3 바이러스 각가에서 유지되고 있으며, 이는 이 ORF가 발현되고 이 바이러스의 기능을 유지하고 있다는 것을 제시한다 (Galinski et al., Virology 155: 46-60,1986; Spriggs et al., 1986, 상기 참조; 및 Stokes et al., 1992, 상기 참조; 본원에 인용문헌으로 삽입되었다).

BPIV3 V 단백질은 주형에 없는 G 잔기가 RNA 에디팅 자리에 첨가될 때 발현된다 (Pelet et al., 1991, 상기 참조; 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). 그러나, HPIV3의 경우, 두 개의 번역 정지 코돈이 에디팅 자리와 V ORF 사이에 있으며, HPIV3가 ORF가 발현되지 않은 또 하나의 예를 나타내는지, 또는 다른 어떤 기작에 의해 발현되는지는 명확하지 않다. 한 가지 가능성은 비록 HPIV3가 세포 배양물 중에 나타나지는 않지만, HPIV3 에디팅이 P 유전자 중의 두번째, 하류 자리에서 일 어날 수 있다는 것이다 (Galinski et al., 1992, 상기 참조). 별법으로, 라이보좀은 라이보좀의 프레임시프팅에 의해 V ORF로 접근할 수 있을 것이다. 이는 MV의 P유전자좌(locus)에서의 상황과 유사하다. MV는 C, P, 및 V 단백질을 발현하지만, 또한 P ORF에서 V ORF로의 프레임시프팅에 의해 합성된다 (Liston et al., J. Virol. 69: 6742-6750, 1995, 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). 유전학적 증거는 HPIV3의 V ORF가 기능적이라는 것을 제시한다(Durbin et al., 1999, 상기 참조).

HPIV3가 그 V 단백질을 발현하는 방법은 분명하지 않지만, 상이한 균주에서 그 V ORF의 극도의 보존은 이것이 실제로 발현된다는 것을 제시한다. V 단백질의 기능은 잘 정의되지 않았지만, 회수된 V-마이러스 MV 및 SeV 재조합체는 시험관내에서는 효율적으로 복제되지만, 생체내에서는 감소된 복제를 나타낸다 (Delenda, et al., Virology 228: 55-62,1997; Delenda et al., Virology 242: 327-337,1998; Kato et al., 1997a, 상기 참조; Kato et al., J. Virol. 71: 7266-7272,1997b; 및 Valsamakis et al., J. Virol. 72: 7754-7761,1998; 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다).

또한 PIV의 바이러스 게놈은 바이러스 복제 및 전사에 필요한 프로모터의 전부 또는 일부를 포함하고, 비코딩 및 유전자간 영역과 아울러 유전자외 리더 및 트레일러 영역을 함유한다. 따라서, PIV 유전자 맵은 3'리더-N-P/C/D/V-M-F-L-5' 트레일러로 나타난다. 시미안 바이러스 5 및 볼거리 바이러스와 같은 일부 바이러스는 알려지지 않은 기능의 작은 소수성 (SH)단백질을 코딩하는 F와 HN 사이에 위치한 유전자를 갖는다. 전사는 3' 말단에서 시작하고, 유전자 경계에서 발견되는 짧 은 보존된 모티브에 의해 지시되는 순차적인 종결-개시 기작에 의해 진행한다. 각각의 유전자의 상부 말단은 유전자-개시 (GS) 시그날을 함유하며, 이는 각각의 mRNA의 개시를 지시한다. 각각의 유전자의 하부 말단은 폴리아데닐화 및 종결을 지시하는 유전자-말단(GE) 모티브를 함유한다. 사람 PIV3 균주 JS(진뱅크 접수 번호 Z11575, 본원에 인용문헌으로 삽입됨) 및 워싱턴((Galinski M. S., in The Paramyxoviruses, Kingsbury, D. W., ed., pp. 537-568, Plenum Press, New York, 1991, 본원에 인용문헌으로 삽입됨), 및 소 PIV3 균주 910N(진뱅크 접수 번호 D80487, 본원에 인용문헌으로 삽입됨)에 대해 기술되었다.

본원에서 사용된, "PIV 유전자"란 일반적으로 mRNA를 코딩하고 일반적으로 유전자 개시(GS) 시그날로 상류부에서 시작하고 유전자 종결(GE) 시그날로 하류부에서 종결하는 PIV 게놈의 일부를 말한다. 또한 PIV 유전자란 용어는 특히 C와 같은 단백질이 단 하나의 mRNA로부터라기 보다는 추가 ORF로부터 발현되는 경우에서 "번역 개방 판독틀", 또는 ORF로 기술된 것을 포함한다. 본 발명의 사람-소 키메라 PIV를 구성하기 위해, 1 이상의 PIV 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)이 전부 또는 일부 결실되거나, 삽입되거나 또는 치환될 수 있다. 이는 부분적인 또는 전체적인 결실, 삽입 및 치환이 1 이상의 모든 PIV 유전자들 또는 게놈 세그먼트의 개방 판독틀 및(또는) 시스-작용 조절 서열을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. "게놈 세그먼트"란 PIV 게놈으로부터의 연속적인 뉴클레오티드의 어떤 한 길이를 의미하고, 이는 ORF, 유전자 또는 유전자외 영역 또는 이들의 조합 중 일부일 수 있다.

본 발명은 HPIV와 BPIV3 사이의 키메라에 기초한 생약독화된 PIV 백신 후보를 개발하기 위한 방법을 포함한다. 키메라는 cDNA-기재의 바이러스 회수 시스템에 의해 구성된다. cDNA로부터 만들어진 재조합 바이러스는 독립적으로 복제하고, 만약 이들이 생물학적으로 유래한 바이러스라면 동일한 방식으로 증식한다. 본 발명의 바람직한 사람-소 키메라 PIV 백신 후보는 1 이상의 BPIV 유전자 또는 게놈 세그먼트의 치환 또는 첨가에 의해 약독화된 백그라운드 중의 1 이상의 사람 PIV(들), 예를 들어, HPIV1, HPIV2, 및(또는) HPIV3의 1 이상의 주요 항원성 결정 인자를 갖는다. PIV의 주요 방어성 항원은 이들의 HN 및 F 당단백질이지만, 다른 단백질들 또한 방어성 면역 반응에 기여할 수 있다.

따라서, 본 발명은 HPIV와 BPIV 사이에 1 이상의 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)의 도입에 의한 숙주 범위 효과에 기초한, PIV에 대한 백신으로 사용되기 위한 야생형 또는 돌연변이형의 부모형 바이러스를 약독화하기 위한 새로운 기초를 제공한다. BPIV와 HPIV 사이에는 매우 많은 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 차이가 있으며, 이는 숙주 범위 차이에서 나타난다. 예를 들어, HPIV와 BPIV 사이의 각각의 하기 단백질에 대한 % 아미노산 동일성은 N(86%), P(65%), M(93%), F(83%), 및 L(91%)이다. 숙주 범위 차이는 레서스 원숭이에서 두 갱의 상이한 BPIV3 균주의 제한된 복제에 비해, 동일한 동물에서의 HPIV3의 고도로 허용된 성장에 의해 예증된다(van Wyke Coelingh et al., 1988, 상기 참조). HPIV3 와 BPIV3 사이의 숙주 범위 차이의 기초는 아직 결정되지 않았지만, 이는 아마도 이들이 1 이상의 유전자 및 복수개의 아미노산 차이를 수반하기 때문일 것이다. 각각이 복수 개의 유 전자 또는 뉴클레오티드 차이를 수반하는, 복수개의 유전자 및 아마도 시스-작용 조절 서열의 관여는 약독화를 위한 매우폭넓은 기초를 주며, 이는 복귀돌연변이(reversion)에 의해 쉽게 바뀔 수 없다. 이는 한 개 또는 수개의 점 돌연변이에 의해 약독화된 다른 생약독화된 HPIV3 바이러스의 상황과는 대조적이다. 이 경우, 어느 한 개별적인 돌연변이의 복귀 돌연변이라도 상당한 독성의 재획득을 일으킬 수 있거나, 또는 단 하나의 잔기가 약독화를 특정하는 경우에는 독성의 완전한 재획득을 일으킬 수 있다.

하기에서 기술된 본 발명의 예시적인 실시태양에서, 백그라운드 게놈 또는 안티게놈은 HPIV3 게놈 또는 안티게놈이고, 이형의 유전자 또는 게놈 세그먼트는 BPIV3의 Ka 또는 SF 균주 중 하나로부터 유래한 N ORF이다(이는 아미노산 서열에서 99% 연관된다). HPIV3 백그라운드 안티게놈의 N ORF는 대응물 BPIV3 N ORF에 의해 치환되어 신규한 재조합 사람-소 키메라 PIV cDNA 클론을 생성한다. BPIV3 Ka 또는 SF의 N ORF에 의한 HPIV3의 HPIV3 N ORF의 치환은 HPIV3 N의 단백질과 약 70개의 아미노산이 다른 단백질을 생성한다(관여한 균주에 따라). N은 보다 보존된 단백질 중 하나이며, 단독으로 또는 조합하여 P와 같은 다른 단백질의 치환은 보다 많은 아미노산 차이를 일으킬 것이다. 각각이 복수 개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 차이를 전달하는 복수 개의 유전자 및 게놈 세그먼트의 관여는 복귀 돌연변이하기에는 많이 안정한 약독화를 위한 폭넓은 기초를 제공한다.

이 방식의 약독화는 1 이상의 점 졸연변이에 의해 약독화되고, 한 개개의 돌연변이의 복귀 돌연변이가 독성의 상당한 또는 완전환 재획득을 일으킬 수 있는 현 재의 HPIV 백신 후보와 뚜렷이 대조된다. 추가로, HPIV 중의 수 개의 알려진 약독화 점 돌연변이가 일반적으로 온도 민감성 표현형을 가져온다. 온도 민감성과 관련된 약독화에서 한 가지 문제점은 바이러스가 하부 호흡기도에서는 그 복제가 상당히 제한될 수 있는 반면, 상부 호흡기도에서는 덜 약독화되어 있다는 것이다. 이는 호흡기도에 온도 구배가 있기 때문인데, 하부 호흡기도에서는 온도가 높으며(도한 보다 제한적임), 상부 호흡기도에서는 낮기(덜 제한적임) 때문이다. 약독화된 바이러스가 상부 호흡기도에서 복제할 수 있는 능력은 울혈, 비염, 열 및 중이염을 초함하는 합병증을 일으킬 수 있는 반면, 하부 호흡기도에서의 과약독화는 면역원성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 온도 민감성 돌연변이만에 의해 달성된 약독화는 이상적이지 않을 수 있다. 반면, 본 발명의 사람-소 키메라 PIV 중에 존재하는 숙주 범위 돌연변이는 대부분의 경우 온도 민감성을 부여하지 않는다. 따라서, 본 발명에 의해 제공된 PIV 약독화의 신규 방법은 보다 유전적으로 및 표현형적으로 안정하며, 다른 공지의 PIV 백신 후보에 비새 상부 호흡기도에서의 잔여 독성과 보다 덜 연관되어 있을 것이다.

놀랍게도, N ORF 대체를 수반하는 Ka 및 SF HPIV3/BPIV3 키메라 재조합체 양자는 생육할 수 있었다. BPIV3의 Ka 또는 SF 균주의 N 단백질은 각각 HPIV3의 JS 균주의 N 단백질과 515개의 아미노산 잔기 중 70개가 다르다. 따라서 이 수준의 아미노산 서열 분기를 갖는 소 N 단백질은 HPIV3 RNA와, 또는 기능적인 복제효소/전사효소를 구성하는 다른 HPIV3 단백질과 효과적으로 상호작용할 수 있다. 똑같이 놀라운 것은 Ka 및 SF 키메라 바이러스가 HPIV3 또는 BPIV3 중 하나와 같이 세 포 배양물에서 효율적으로 복제할 수 있다는 것을 발견한 것으로 키메라 재조합체는 시험관내에서의 복제에 제한되는 유전자 불화합성을 나타내지 않는다. 시험관내에서의 효율적인 복제라는 이 성질은 중요한데, 이것이 이 생물학적 약제의 효율적인 제조를 허용하기 때문이다.

또한 놀라운 것은 하기의 연구에 기초하여, 단 하나의 소 유전자를 갖는 Ka 및 SF HPIV3/BPIV3 키메라 재조합체(cKa 및 cSF라 칭함)가 레서스 원숭이의 호흡기도에성의 숙주 범위 제한 정도에서 그들의 BPIV3 부모형과 거의 동일하다는 관찰이다. 특히, cKa 및 cSF 바이러스는 HPIV3의 복제와 비교하여 레서스 원숭이의 상부 호흡기도에서 각각 약 60배 또는 30배의 감소를 나타내었다. 이 발견에 기초하여, 다른 BPIV3 유전자들 또한 본 발명의 사람-소 키메라 PIV 내에서 목적하는 수준의 숙주 범위 제한을 부여할 수 있다. 따라서, 본원의 방법에 따라, 약독화 결정 인자의 리스트는 백신 용도를 위해 선택된 사람-소 키메라 PIV에 대해 적절한 조합으로 최적 수준의 숙주 범위 제한 및 면역원성을 부여하는 HPIV 및 BPIV 양자의 이형 유전자 및 게놈 세그먼트 중에서 쉽게 확인될 것이다. 바람직한 백신 재조합체에서, 사람에서의 PIV 복제에 대해 인정된 동물 모델, 예를 들어, 햄스터 또는 레서스원숭에서의 하부 및(또는) 상부 호흡기도에서의 복제로 표시된 약독화는 상응하는 야생형 또는 돌연변이 부모형 PIV 균주의 성장과 비교하여 약 2배 이상, 그보다 흔히 약 5배, 10배, 또는 20배, 바람직하게는 50-100배 및 1000배 이하로 감소될 수 있거나 또는 전체적으로 더 클 있다(에를 들어, 감염 후 3-8일 사이에 측정된 것과 같이).

본 발명의 사람-소 키메라 PIV에 의해 제공되는 예기치 못했던 성질 및 장점의 확인에서, 사람 PIV 감염 및 방어에 대한 이 모델에서의 이들 바이러스에 의해 나타나는 예외적인 복제 제한 수준에도 불구하고, cKa 및 cSF 양자는 레서스 원숭이의 호흡기도에서 HPIV3 감염에 대한 높은 수준의 방어를 유도하였다. 특히, 키메라 바이러스 중 하나에 의한 사전 감염은 상부 및 하부 호흡기도 양쪽에서 rJS 감염 바이러스의 복제에 대한 높은 수준의 내성을 유도하였다. cKa에 의한 원숭이 감염은 접종되지 않은 대조구 원숭이에 비해 상부 호흡기도에서 야생형 HPIV3(rJS)의 약 300배 감소한 복제, 및 하부 호흡기도에서 약 100배 감소한 복제로 표시되는 높은 수준의 방어를 유발한다. cSF로 감염된 원숭이는 접종되지 않은 대조구 원숭이에 비해 상부 호흡기도에서 200배 감소한 rJS 복제를 나타내고, 하부 호흡기도에서 1000배의 감소를 나타낸다. cKa 또는 cSF에 의해 유발된 방어 수준은 소 또는 사람 PIV 부모형 중 하나에 의해 사전 감염된 원숭이에서 나타난 것에 필적하였다. 따라서, 본 발명의 사람-소 키메라 PIV는 원숭이의 상부 및 하부 호흡기도에서 높은 수준의 방어를 제공하고, 두 키메라 바이러스는 가망성있는 백신 후보를 나타낸다. 다른 바람직한 백신 재조합체에서, 사람-소 키메라 PIV의 면역원성 활성은 유용한 백신 후보를 달성하기 위해 약독화 수준과 균형을 이룰 것이며, 감염원 바이러스의 복제 감소, 예를 들어, 하부 및(또는) 하부 호흡기도에서 약 50-100배, 100-500배, 바람직하게는 약 500-2,000배 및 3,000배 이하이거나 또는 그보다 크게 감소한 것으로(예를 들어, 감염후 3-8일 사이에 측정된 것) 일반적으로 표시될 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 백신 바이러스는 면역원성을 유지하는 반면, 복 제 및 성장에서 동시에 감소를 나타낸다. 이 표현형 특색의 놀라운 집한은 백신 개발을 위해 크게 요구된다.

두 개의 독립적인 BPIV3 균주로부터의 N 유전자가 레서스 원숭이의 HPIV3에 대해 약독화 표현형을 부여한다는 관찰은 이것이 다른 BPIV 균주들의 N 유전자와 공유되는 성질일 것이라는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법 내에서 어떠한 BPIV 유전자 또는 게놈 세그먼트라도, 단독으로 또는 1 이상의 다른 BPIV3 유전다(들) 또는 게놈 세그먼트(들)과 조합하여 백신 바이러스로 사용되기에 적합한 약독화된 HPIV3/BPIV3 키메라 재조합 바이러스를 제조하기 위해 HPIV 서열과 결합될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, HPIV1, HPIV2, HPIV3 및 이들의 변형 균주를 포함한 모든 HPIV들은 BPIV 유전자(들) 및(또는) 게놈 세그먼트(들)을 약독화하기 위한 유용한 수용체이다. 일반적으로 HPIV3/BPIV3 키메라 바이러스 중에 포함되기 위해 선택된 HPIV 유전자들은 HN 또는 F 당단백질과 같은 1 이상의 방어성 항원을 포함할 것이다.

본 발명의 별법의 사람-소 키메라 PIV는 HPIV1 또는 HPIV2의 방어성 항원 결정 인자를 포함할 것이다. 이는 예를 들어, 약독화된 HPIV3/BPIV3 키메라 재조합체에서 별도의 유전자(들)로서 HPIV1 또는 HPIV2의 HN 및(또는) F 유전자의 발현에 의해 달성된다. 별법으로, HPIV1 또는 HPIV2 HN 및(또는) F 유전자가 이들의 PIV3 대응물(들)을 대신하는 HPIV3/HPIV1 또는 HPIV3/HPIV2 항원성 키메라 바이러스를 1 이상의 이형의 약독화 소 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들), 예를 들어 Ka 또는 SF N 유전자 또는 게놈 세그먼트를 위한 수용체 또는 백그라운드 바이러스 로 사용하는 것이 가능하다 (Skiadopoulos et al., 1999a, 상기 참조; Tao et al., 1999, 상기 참조; 및 미국 특허 출원 제09/083,793호(1998. 5. 22. 출원); 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). 이러한 항원성 키메라 바이러스는 소 N 유전자에 의해 약독화될 것이나, HPIV1 또는 HPIV2 바이러스에 대한 면역성을 유도할 것이다. 이러한 상황에서, 키메라 PIV1 백신 후보는 PIV3 HN 및 F 개방판독틀(ORF)를 L 내에 3 개의 약독화 돌연변이를 함유한 PIV3 전장 cDNA 중의 PIV1의 개방판독틀로 치환하여 PIV cDNA 구제 시스템을 사용하여 생성되었다. 이 cDNA로부터 유래한 재조합 키메라 바이러스는 rPIV3-1.cp45L(Skiadopoulos et al., 1998, 상기 참조; Tao et al., 1998, 상기 참조; Tao et al., 1999, 상기 참조)로 명명되었다. rPIV3-1.cp45은 햄스터에서 약독화되었고 PIV1에 의한 감염에 대해 높은 수준의 내성을 유도하였다. 또한, rPIV3-1 cp45로 명명된 재조합 키메라 바이러스는 15개의 cp45 돌연변이 중 12개를 함유한, 즉 HN 및 F 내의 돌연변이를 배제하여 함유하는 바이러스를 생성하고, 햄스터의 상부 및 하부 호흡기도에서 상당히 약독화되었다(Skiadopoulos et al., 1999a, 상기 참조).

또 다른 HPIV/BPIV 키메라 재조합체는 사람 HPIV1, HPIV2 또는 HPIV3 바이러스로부터 유래할 수 있는 선택된 유전자들 또는 HN 또는 F 유전자(들) 및 게놈 세그먼트(들)로부터 선택된 항원성 결정 인자 이외의 모든 BPIV 게놈을 포함하는 어떠한 조합으로도 두 개 이상의 BPIV 유전자들 또는 게놈 세그먼트를 함입할 것이다. 본 발명의 다른 추가적인 실시태양은 쥐 PIV1, 개 SV5 PIV2 바이러스, 또는 별법으로는 HPIV1, HPIV2 및(또는) HPIV3로부터의 키메라 HPIV 뼈대를 포함하는 HPIV 뼈대와 결합된 다른 조류 또는 포유류 PIV와 같은 다른 동물 PIV들로부터의 약독화 유전자들을 함입하는 사람-소 키메라 PIV에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체적인 일면에서, 사람-소 키메라 PIV는 다른 PIV들 및 비PIV 바이러스 및 비바이러스 병원체를 포함하는 이형의 병원체의 방어성 항원을 위한 벡터로 사용된다. 이러한 일면에서, 소-사람 키메라 게놈 또는 안티게놈은 1 이상의 이형의 병원체의 1 이상의 항원성 결정 인자를 코딩하는 1 이상의 이형의 유전자 또는 게놈 세그먼트와 결합된 일부 또는 전체 PIV "벡터 게놈 또는 안티게놈"을 포함한다(머피(Murphy)등에 의해 출원된 미국 가특허출원 제60/170,195호(1999. 12. 10. 출원); 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). 이에 관련하여 이형의 병원체는 이형의 PIV 및 단백질 도메인, 단편, 및 면역워성 영역 또는 에피토프와 아울러 1 이상의 PIV N, P, C, D, V, M, F, SH(해당되는 경우)를 코딩하기 위해 선택될 수 있는 이형의 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)일 수 있다. 이와 같이 구성된 PIV 벡터 백신은 다중특이적인 면역 반응을 유발할 수 있고, 또한 다른 백신 작용 물질과 동시에 또는 조정된 투여 프로토콜로 투여될 수 있다.

본 발명의 예시적인 실시태양에서, 사람-소 키메라 PIV는 일부 또는 전체의 HPIV 게놈 또는 안티게놈인 벡터 게놈 또는 안티게놈을 포함할 수 있고, 이는 HPIV1, HPIV2, 또는 HPIV3로부터 선택된 이형의 HPIV들을 포함하는 1 이상의 PIV(들)의 항원 결정 인자(들)을 코딩하는 1 이상의 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트들과 결합도히거나 또는 이들을 함입하기 위해 변형된다. 보다 구체적인 일면에서, 벡터 게놈 또는 안티게놈은 일부 또는 전체 HPIV3 게놈 또는 안티게놈이며, 항원 결정 인자(들)을 코딩하는 이형 유전자(들 ) 또는 게놈 세그먼트(들)은 1 이상의 이형 HPIV(들)이다. 일반적으로, 키메라 게놈 또는 안티게놈은 약독화를 특정하는 BPIV의 1 이상의 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)을 함입한다.

본 발명의 예시적인 일면에서, 소-사람 키메라 PIV는 1 이상의 HN 및(또는) F 당단백질 또는 이들의 항원 도메인, 단편 또는 에피토프를 코깅하는 1 이상의 HPIV1 또는 HPIV2를 일부 또는 전체 HPIV3 벡터 게놈 또는 안티게놈 내에 함입한다. 보다 구체적인 일면에서, HN 및 F 당단백질을 코딩하는 HPIV1의 두 유전자는 키메라 HPIV3-1 벡터 게놈 또는 안티게놈을 형성하기 위해 대응 HPIV3 HN 및 F 유전자를 대신한다. 이러한 재조합 구조체는 백신 바이러스를 제조하기 위해 직접적으로 사용될 수 있거나, 또는 1 이상의 항원 결정 인자를 코딩하는 1 이상의 유전자 또는 유전자 세그먼트를 첨가하거나 또는 암입하여 추가로 변형될 수 있다. 백신 바이러스 제조를 위한 이러한 구조체는 일반적으로 약독화를 특정하는 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들), 예를 들어 N과 같은 약독화 BPIV 단백질을 코딩하는 개방 판독틀(ORF)를 함입한다. 본 발명의 특정 사람-소 키메라 PIV는 HPIV2에 대한 특이적인 백신을 생성하기 위한 벡터, 예를 들어, HPIV2 HN 유전자의 개반팥독틀을 포함하는 전사 단위가 키메라 HPIV3-1 벡터 게놈 또는 안티게놈 중으로 첨가되거나 또는 함입되고, 키메라 구조가 BPIV 유전자 또는 게놈 세그먼트 함입에 의해 약독화된 벡터로 사용될 수 있다.

본 발명의 관련된 일면에서, 벡터 게놈 또는 안티게놈은 일부 또는 전체의 BPIV 게놈 또는 안티게놈이고, 항원 결정 인자(들)을 코딩하는 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트는 1 이상의 HPIV(들)의 그것이다. 일반적으로, 결정 인자(들)은 HPIV1, HPIV2 또는 HPIV3 HN 및 F 당단백질로부터 선택되지만, 이들의 항원 도메인, 단편 및 에피토프 또한 유용하다. 특정 실시태양에서, HPIV2 의 1 이상의 항원 결정 인자(들)을 코딩하는 1 이상의 유전자 또는 게놈 세그먼트가 일부 또는 전체 BPIV 벡터 게놈 또는 안티게놈 내로 첨가되거나 또는 치환된다. 별법으로, 다수의 HPIV들의 항원 결정 인자를 코딩하는 다수의 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트는 일부 또는 전체 BPIV 벡터 게놈 또는 안티게놈 내로 첨가되거나 또는 함입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일면에서, 사람-소 키메라 PIV는 비PIV 병원체 범위에 대한 벡터로 제공된다(머피 등에 의한 미국 가특허 출원 제60/170,195호를 참조(1999. 12. 10. 출원); 본원에 인용문헌으로 삽입되었다). 본 발명의 이러한 일면에서의 사용을 위한 벡터 게놈 또는 안티게놈은 일부 또는 전체의 BPIV 또는 HPIV 게놈 또는 안티게놈을 포함할 수 있고, 이형의 병원체는 홍역 바이러스 아군 A 및 아군 B의 호흡기 합표체 바이러스, 단순 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 필로바이러스, 분야바이러스, 플라비바이러스, 알파바이러스 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 소-사람 키메라 PIV를 구성하기 위한 HPIV 또는 BPIV 벡터 게놈 또는 안티게놈은 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질, 또는 이들의 항원 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택된 이형의 항원 결정 인자(들)을 함입할 것이다. 예시적인 실시태양에서, 홍역 바이러스 HA 유전자의 개방판독틀(ORF)를 포함하는 전사 단위는 BPIV 또는 HPIV3 벡터 게놈 또는 안티게놈 내에 첨가되거나 또는 함입된다.

별법으로, 본 발명의 소-사람 키메라 PIV는 예를 들어, RSV F 및(또는) G 당단백질 또는 이들의 면역원성 도메인(들) 또는 에피토프를 코딩하는 1 이상의 유전자 또는 게놈 세그먼트 함입에 의한, 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)로부터 이형의 항원 결정 인자(들)을 함입하기 위한 벡터로 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, RSV cDNA의 클로닝 및 다른 개시들은 미국 가특허 출원 제80/720,132호(1995. 9. 27. 출원), 미국 가특허 출원 제60/021,773호(1996. 7. 15. 출원), 미국 가특허 출원 제60/046,141호(1997. 5. 9. 출원), 미국 가특허 출원 제60/047,634호(1997. 5. 23. 출원), 미국 가특허 출원 제08/892,403호 (1997. 7. 15. 출원)(국제 공개 WO 제98/02530호에 대응), 미국 가특허 출원 제09/291,894호(1999. 4. 12. 출원) (Collins, et al., 1995, 상기 참조; Bukreyev, et al., J.Virol. 70: 6634-6641,1996; Juhasz et al., 1997, 상기 참조; Durbin et al., 1997a, 상기 참조; He et al., 1997, 상기 참조; Baron et al., 1997, 상기 참조; Whitehead et al., 1998a, 상기 참조; Whitehead et al., 1998b, 상기 참조; Jin et al., 1998, 상기 참조; and Whitehead et al., 1999, 상기 참조; and Bukreyev et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2367-2372,1999, 각각은 모든 목적을 위해 본원에 전체 내용이 삽입되었다).

본 발명의 이 일면에 따라, 사람-소 키메라 PIV는 이형 PIV 또는 비PIV 병원 체로부터 1 이상의 항원 결정 인자를 함입하는 것이 제공된다. 예를 들어, HPIV3의 1 이상의 개별적인 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)은 과잉 유전자로 삽입되거나 또는 첨가될 수 있는 사람 RSV, 또는 RSV 유전자 또는 게놈 세그먼트로부터의 대응 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)로 대체될 수 있다. 별법으로, RSV 당단백질의 세포질 테일, 막횡단 도메인 또는 엑토도메인을 코딩하는 선택된 이형 게놈 세그먼트는 예를 들어 HPIV3 내의 동일한 유전자, 또는 HPIV3 내의 상이한 유전자 중에 대응 게놈 세그먼트를 치환하거나 또는 HPIV3게놈 또는 안티게놈의 비코딩 서열 내에 첨가되어 키메라 PIV-RSV 당단백질을 생성한다. 한 실시태양에서, 사람 RSV의 F 유전자로부터의 게놈 세그먼트는 대응 HPIV3 게놈 세그먼트로 치환되어 키메라 단백질, 예를 들어 신규한 약독화된 바이러스 및(또는) PIV 및 RSV 양쪽에 면역원성인 다가 백신을 생성하기 위해 , RSV의 엑토도메인에 융합된 PIV의 세포질 테일 및(또는) 막횡단 도메인을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 구조체를 생성한다.

상기에서 언급한 바와 같이, 약독화를 증가시키거나 또는 감소시키거나 또는 키메라 바이러스의 표현형을 변화시키는 추가 돌연변이를 도입하녀 본 발명의 사람-소 키메라 PIV에서 약독화 표현형을 조정하는 것이 흔히 바람직하다. cDNA로부터 재조합 PIV를 제조하기 위한 물질 및 방법의 상세한 기술 및, 모든 범위의 돌연변이 및 뉴클레오티드 변형의 시험이 본 발명의 추가적인 일면으로 기술되고, 다음 문헌에서 제공된다; 미국 특허 출원 제09/083,793호(1998. 5. 22. 출원), 미국 가특허 출원 제60/047,575호 (1997. 5. 23. 출원)(국제 공개 WO 제98/53078호에 대응함), 및 미국 가특허 출원 제60/059,385호(1997. 9. 17. 출원)(각각은 본원에 인 용문헌으로 삽입되었다). 특히, 이들 문헌은 약독화된 돌연변이 균주(예를 들어, 온도 감수성(ts), 저온 계대배양된(cp), 저온 적응된(ca), 작은 플라크의(sp) 및 숙주 범위 제한된(hr) 돌연변이 균주들)을 얻기 위해서 및 약독화된 표현형을 특정하는 유전적 변화를 확인하기 위해 PIV를 돌연변이시키고, 단리하고 또한 동정하는 방법 및 과정을 기술한다. 이들 방법과 연관하여, 상기 문헌들은 공인된 모델 시스템에서 생물학적으로 유도되었고 재조합적으로 생산된 약독화된 사람 PIV의 복제, 면역원성, 유전적 안정성 및 방어 효율을 측정하기 위한 과정을 상술한다. 아울러, 이들 문헌들은 PIV의 감염 및 치료를 위한 일가 및 이가 백신을 포함한 면역원성 조성물을 개발하고 시험하기 위한 일반적인 방법을 기술한다. 주요 PIV 단백질들과 함께 발현되는 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 구성하고 발현하여 감염성 재조합 PIV를 제조하는 방법 또한 상기 문헌에 기술되어 있고, 이는 감염성 PIV 바이러스 클론을 제조하기 위해 사용될 수 있는 하기의 예시적인 플라스미드의 기술을 포함한다: p3/7(131) (ATCC 97990); p3/7(131)2G (ATCC 97889); 및 p218(131)(ATCC 97991); 각각은 부다페스트 협약 규정 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)(미국 버지니아주 20110-2209, 매나사스 소재, 유니버시키 블루바드 10801)에 기탁되었으며, 상기에서 확인된 기탁 번호를 부여받았다.

또한 상기에서 삽입된 인용문헌은 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체, 예를 들어 저온 계대 배양된(cp), 저온 적응된 (ca), 숙주 범위 제한된 (hr), 작은 플라크의(sp), 및(또는) 온도 감수성 (ts) 돌연변이체, 예를 들어 JS HPIV3 cp45 돌연변이체 균주에 표현형 특이적인 돌연변이를 도입하고 변형된 감염성 재조합 PIV를 구성하고 평가하기 위한 방법을 기술한다. 다른 돌연변이들은 보조적인 표지 표현형 없이 약독화될 수 있다. 이들 돌연변이체에서 확인된 돌연변이들은 사람-소 키메라 PIV에서 용이하게 적용될 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 1 이상의 약독화 돌연변이가 중합효소 L 단백질에서, 예를 들어 JS cp45의 Tyr₉₄₂, Leu₉₉₂, 또는 Thr₁₅₈₈ 해당 위치에서 일어난다. 바람직하게는, 이들 돌연변이는 생물학적 돌연변이체에서 확인된 것과 같은 동일한, 또는 보존적인 아미노산 치환에 의해 본 발명의 사람-소 키메라 PIV에 도입된다. 따라서, PIV 재조합체는 Tyr₉₄₂ 가 His에 의해 대체되고, Leu₉₉₂가 Phe에 의해 대체되고 (또는) Thr₁₅₅₈이 Ile에 의해 대체되는 돌연변이를 도입할 수 있다. 또한 이들 대체 아미노산에 보존적인 치환은 목적하는 돌연변이 표현형을 달성하기에 유용하다.

생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터 채택된 다른 예시적인 돌연변이는 JS cp45의 Val₉₆ 또는 Ser₃₈₉ 잔기에 상응하는 위치에서의 특이적 돌연변이를 포함하는 N 단백질 내의 1 이상의 돌연변이를 포함한다. 보다 구체적인 일면에서, 이들 돌연변이체는 Val₉₆는 Ala로 또는 Ser₃₈₉는 Ala로 또는 이들에 대해 보존적인 치환으로 나타난다. 또한, C 단백질 내의 아미노산 치환, 예를 들어 JS cp45의 Ile₉₆에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 Ile₉₆에서 Thr로의 동일하거나 또는 보존적인 치환에 의해 나타나는 아미노산 치환이 본 발명의 재조합 PIV에서 유용하다. 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터 채택된 추가의 예시적인 돌연 변이는 JS cp45의 Ile₄₂₀ 또는 Ala₄₅₀에 상응하는 위치에서 JS cp45로부터 채택된 돌연변이, 바람직하게는 Ile₄₂₀에서 Val로, 또는 Ala₄₅₀에서 Thr로 또는 이들에 대해 보존적인 치환을 포함하여 JS cp45 내의 Pro₁₉₉와 같은 M 유전자 내의 한 개의 돌연변이, 또는 F 단백질 내에서의 그 이상의 돌연변이를 포함한다. 본 발명 내의 다른 사람-소 키메라 PIV는 HN 단백질 내의 1 이상의 아미노산 치환을 매개하며, 이는 하기에서 JS의 Val₃₈₄에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 Val₃₈₄에서 Ala으로의 치환에 의해 나타나는 돌연변이를 채택한 재조합 PIV에 의해 예시된다.

본 발명의 이 측면에서의 또 다른 실시예는 PIV 게놈 또는 안티게놈의 비코딩 부분, 예를 들어 3' 리더 서열 내에 1 이상의 돌연변이를 도입한 사람-소 키메라 PIV를 포함한다. 이 경우 예시적인 돌연변이는 JS cp45의 23, 24, 28, 또는 45번 뉴클레오티드에 상응하는 위치에서 재조합 바이러스의 3' 리더 내의 위치를 엔지니어링할 수 있다. 또 다른 추가의 예시적일 돌연변이는 N 유전자의 개시 서열 내에서, 예를 들어 N 유전자 개시 서열 내의 1 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 JS cp45의 62번 뉴클레오티드를 변화시켜 엔지니어링 할 수 있다. 보다 구체적인 일면에서, 사람-소 키메라 PIV는 23번 뉴클레오티드에서의 T에서 C로의 변화, 24번 뉴클레오티드에서 C에서 T로의 변화, 28번 뉴클레오티드에서 G에서 T로의 변화, 및(또는) 45번 뉴클레오티드에서 T에서 A로의 변화를 도입한다. 유전자외 서열 내의 추가 돌연변이는 JS의 62번 뉴클레오티드에 상응하는 위치에서 N 유전자 내의 A에서 T로의 변화에 의해 예시된다.

본 발명의 사람-소 키메라 PIV에서 엔지니어링될 수 있는 이들 상기 예시적인 돌연변이는 성공적으로 엔지니어링 되었으며, rcp45, rcp45 L, rcp45 F, rcp45 M, rcp45 HN, rcp45 C, rcp45 F, rcp45 3'N, 3'NL, 및 rcp45 3'NCMFHN로 명명된 재조합 PIV 클론으로 나타난다 (Durbin et al., 1997a, 상기 참조; Skiadopolos et al., 1998, 상기 참조; Skiadopolos et al., J. Virol. 73: 미국 특허 출원 제09/083,793호 (1998. 5. 22. 출원); 미국 가특허 출원 제60/047,575호 (1997. 5. 23. 출원) (국제 공개 WO 제98/53078호에 대응함), 및 미국 가특허 출원 제60/059,385호 (1997. 9. 17. 출원), 각각은 본원에 인용문헌으로 삽입되었음). 아울러, 상기에서 삽입된 인용 문헌은 예를 들어, 일부 HPIV3 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중으로 치환된 HPIV1의 HN 및 F 유전자를 가지며, HPIV3 JS cp45에서 확인된 1 이상의 약독화 돌연변이를 갖도록 추가로 변형되는 키메라 PIV 재조합체의 구성을 기술한다. 이형의 (HPIV1)HN 및 F 유전자 외각의 cp45 돌연변이 전부는 약독화된 키메라 백신 후보를 생성하기 위해 HPIV3-1 재조합체에 함입될 수 있다는 것이 증명되었다.

JS cp45 및 다른 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터, 큰 "메뉴"의 약독화 돌연변이가 제공되며, 그 각각은 C, D, 및(또는) V 결실 또는 넉 아웃 돌연변이(들)을 갖는 재조합 PIV에서 약독화, 면역원성 및 유전적 안정성의 수준을 조정하기 위해 어떠한 다른 돌연변이(들)과도 결합할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 많은 수의 재조합 PIV들은 하나 이상, 바람직하게는 두 개 이상의 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터의 돌연변이, 예를 들어 JS cp45에서 확인된 어떠한 1 이상의 조합의 돌연변이라도 포함할 것이다. 본 발명 내에서 바람직한 piv 재조합체는 JS cp45 또는 다른 생물학적으로 유도된 돌연변이체 PIV 균주들에 존재하는 다수 및 모든 돌연변이이들을 함입할 것이다. 바람직하게는, 이들 돌연변이는 각각의 돌연변이를 특정하는 코돈 내의 다수의 뉴클레오티드 치환에 의해 사람-소 키메라 PIV 내의 복귀돌연변이에 대해 안정화할 것이다.

본 발명의 사람-소 키메라 PIV 내에 함입될 수 있는 추가 돌연변이는 돌연변이, 예를 들어 이형의 PIV 또는 보다 멀리 연관된 세그먼트화되지 않은 (-) 가닥 RNA 바이러스에서 확인된 약독화 돌연변이이다. 특히, 한 (-) 가닥 RNA 바이러스에서 확인된 약독화 및 다른 목적하는 돌연변이들은 "전달"(예를 들어 사람-소 키메라 PIV의 게놈 또는 안티게놈 내의 상응하는 위치에서의 돌연변이 유발에 의해 도입되어서) 될 수 있다. 간단하게 설명하면, 하나의 이형 (-) 가닥 RNA 바이러스 내의 목적하는 돌연변이는 POV 수용체(예를 들어, 각각, 소 또는 사람 PIV)로 전달된다. 이는 PCT/US00/09695(2000. 4. 12. 출원) 및 그 미국 우선권에 기술된 것과 같이, 이형 바이러스 내의 돌연변이의 맵핑, 따라서 수용체 RNA 내의 상응하는 자리의 서열 배열에 의한 확인, 및 PIV 수용체 내의 천연의 서열을 돌연변이 유전형으로 돌연변이시키는 것을 수반한다(동일한 또는 보존적인 돌연변이 중 하나에 의해). 이 개시가 교시하는 것과 같이, 이형의 돌연변이체 바이러스에서 확인된 변경에 보존적으로 상응하는 돌연변이의 주제 자리에서의 변경을 코딩하도록 수용체 게놈 또는 안티게놈을 변형시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 아미노산 치환이 상응하는 야생형 서열과 비교하여 돌연변이체 바이러스에서 돌연변이 자리를 표지한 면, 유사한 치환은 재조합 바이러스 중의 상응하는 잔기(들)에서 엔지니어링되어야 한다. 바람직하게는, 치환에는 돌연변이체 바이러스 단백질에 존재하는 치환 잔기에 대해 동일하거나 또는 보존적 아미노산이 관여한다. 그러나, 돌연변이체 단백질 내의 치환 잔기에 관련하여 비보존적으로 돌연변이 자리에서 천연의 아미노산 잔기를 변경하는 것이 또한 가능하다(예를 들어, 야생형 잔기의 기능을 파괴하거나 또는 손상시키기 위해 다른 아미노산을 이용함).

예시적인 돌연변이가 확인되고, 본 발명의 사람-소 키메라 PIV 내로 전달왼 (-) 가닥의 RNA 바이러스는 다른 PIV들(예를 들어, HPIV1, HPIV2, HPIV3, HPIV4A, HPIV4B 및 BPIV3), RSV, 센다이 바이러스 (SeV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 시미안 바이러스 5 (SV5), 홍역 바이러스 (MeV), 우역 바이러스, 개홍역 바이럿(CDV), 광견병 바이러스 (RaV) 및 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 등을 포함한다.

본 발명에서 사용되기 위한 다양한 예시적인 돌연변이들은 상기에 삽입된 인용문헌에 개시되어 있고, HPIV3 L 단백질의 456번 위치에서의 페닐알라닌 (또는 보존적으로 연관된 아미노산) 치환에 상응하고 따라서 전달될 수 있는 RSV L 단백질의 521번 위치에서의 페닐알라닌의 아미노산 치환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 결실 또는 삽입에 의해 표지되는 돌연변이의 경우, 이들은 상응하는 결실 또는 삽입으로, 재조합 바이러스 중으로, 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 또는 이중에 함입된 이형 유전자 또는 게놈 중 하나 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 다른 추가의 사람-소 PIV 백신 후보는 센다이 바이러스(SeV) 내에서 확인된 돌연변이를 약독화시키기 위해 유사한 돌연변이를 코딩하도록 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 변형하여 달성될 수 있다. 한 실시예에서, 약독화 돌연변이는 SeV의 C 단백질의 170번 위치에서의 페닐알라닌 아미노산 치환을 포함한다. PIV 게놈 또는 안티게놈은 이형의 SeV 돌연변이체 중의 약독화 돌연변이를 표지하는 변경에 보존적으로 상응하는 보존된 잔기의 변경을 코딩하도록 변형된다. 한 실시태양에서, 돌연변이는 재조합 HPIV3 단백질 내로 도입되고, HPIV3의 C 단백질의 164번 위치에서의 페닐알라닌의 아미노산 치환을 포함한다.

다양한 표적 단백질들이 본 발명의 키메라 사람-소 PIV 내의 상응하는 위치에서 한 (-) 가닥 RNA 바이러스로부터의 약독화 돌연변이를 도입하기 쉽다. 모노네가비랄레(Mononegavirales) 과 전체에서. 5개의 표적 달백질들이 엄격하게 보존되어 있고, 특정 영역 또는 도메인에 대해 중간부터 높은 수준까지의 서열 동일성을 나타낸다. 특히, 과의 모든 공지된 멤버들은 5개의 단백질들의 유사한 특정 위치를 공유한다; 뉴클레오캡시드 (N), 뉴클레오캡시드 인당백질 (P), 비당화된 매트릭스 (M) 단백질, 1 이상의 표면 당단백질(HN, F, H, 또는 G) 및 거대 중합 효소 (L) 단백질. 이들 단백질들은 모두 재조합 바이러스의 단백질 둥의 이형의 돌연변이체 바이러스에 확인된 약독화 돌연변이 자리에 상응하는 자리에서 1 이상의 보존된 잔기를 변경하여 약독화 돌연변이를 도입하기 위한 유용한 표적을 나타낸다.

이에 관련하여, 이형의 돌연변이를 본 발명의 사람-소 PIV 중으로 전달하기 위한 방법은 제1 (-) 가닥 RNA 바이러스 내의 약독화 돌연변이 확인에 기초한다. 돌연변이 자리를 표시하는 주제 아미노산 위치(들)에서 돌연변이체를 야생형의 서열과 비교하여 확인된 돌연변이는 재조합 약독화의 표적인 키메라 바이러스 내의 상동 단백질에 대한 서열 비교를 위한 지표를 제공한다(백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중 또는 이들 중에 첨가되거나 치환된 이형 유전자 또는 유전자 세그먼트 중 하나에서). 약독화 돌연변이는 이전에 공지되어 있을 수 있거나 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이체 바이러스를 만들고 특성분석하기 위해 적용되는 돌연변이유도 및 역유전학 기술에 의해 확인될 수 있다. 별법으로, 목적하는 약독화 돌연변이는 신규로(de novo), 예를 들어 자기 지정된 돌연변이 유발 및 통상의 스크리닝 방법에 의해 생성되고 특성분석될 수 있다.

(-) 가닥 RNA 바이러스에서 확인된 각각의 약독화 돌연변이는 1 이상의 이형의 (-) 가닥 바이러스(들)에서 상동 단백질에 대한 서열 비교를 위한 지표를 제공한다. 이에 관련하여, 약독화를 위한 표적 재조합 바이러스인 상이한 바이러스의 상동 단백질과 약독화 돌연변이를 갖는 단백질 사이의 상응하는 단백질 영역 및 아미노산 위치를 확인하기 위해, 현존하는 서열 배열이 분석될 수 있거나, 또는 분석을 위한 서열 비교를 하기 위해 통상의 서열 배열 방법이 사용될 수 있다. 약독화 돌연변이를 표지하는 1 이상의 잔기가 표적 사람-소 키메라 바이러스 단백질 내의 상응하는 아미노산 위치(들)에서 보존된 "야생형" 동일성으로부터 변경되었을 경우, 표적 바이러스의 게놈 또는 안티게놈은 표적 바이러스 단백질 내의 보존된 잔기(들)을 변경하기 위해 아미노산 결실, 치환, 또는 삽입을 코딩하도록 재조합적으로 변경되고, 이에 의해 재조합 바이러스 상의 유사한 약독화된 표현형을 전달한다.

약독화된 재조합 (-) 가닥 바이러스를 제조하기 위한 이 합리적인 설계 방법 에서, 한 (-) 가닥 RNA 바이러스 내에서 약독화 돌연변이를 표지하는 아미노산 위치의 잔기(들)의 야생형 동일성은 엄격하게 보존될 수 있거나, 또는 표적 사람-소 키메라 바이러스 단백질 내의 상응하는 아미노산 위치(들)에서 보존적으로 치환될 수 있다. 따라서, 표적 바이러스 단백질 내의 상응하는 잔기(들)은 동일할 수 있거나, 또는 이형 돌연변이체 바이러스에서 약독화 돌연변이에 의해 변경되는 것으로 밝혀진 야생형 잔기(들)에 대해 아미노산 측쇄기 구조 및 기능 면에서 보존적으로 연관될 수 있다. 어떤 경우에서든, 재조합 바이러스 내의 유사 약독화는 보존된 잔기(들)을 변경시키기 위해 아미노산 결실, 치환, 또는 삽입을 코딩하도록 표적 바이러스의 재조합 게놈 또는 안티게놈을 변형하여 본 발명의 방법에 따라 달성될 수 있다.

이에 관련하여, 이형의 돌연변이체 바이러스 내에서 약독화 돌연변이를 표지하는 변경에 보존적으로 상응하는 보존된 잔기(들)의 변경을 코딩하도록 게놈 또는 안티게놈을 변경하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 한 아미노산 치환이 상응하는 야생형 서열에 비교하여 돌연변이체 바이러스 중의 돌연변이 자리를 표지한다면, 이후 치환은 재조합 바이러스 중의 상응하는 잔기(들)에서 엔지니어링되어야 한다. 바람직하게는, 치환은 돌연변이체 바이러스 단백질 중에 존재하는 치환체 잔기에 대해 동일하거나 또는 보존적일 것이다. 그러나, 돌연변이체 단백질 중의 치환체 잔기와 관련하여 돌연변이 자리에서 천연의 아미노산 잔기를 비보존적으로 변경하는 것 또한 가능하다(예를 들어, 야생형 잔기의 동일성 및 기능을 파괴하거나 또는 손상하기 위해 어떠한 다른 아미노산을 사용해서라도). 결실 또는 삽입에 의해 표 지되는 돌연변이의 경우, 이들은 상응하는 결실 또는 삽입으로 재조합 바이러스 중에 전달될 수 있으나, 결실되거나 또는 삽입된 단백질 단편의 특정 크기 및 아미노산 서열은 변할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 이형의 돌연변이체 (-) 가닥 바이러스로부터 전달된 돌연변이는 본 발명의 사람-소 키메라 PIV 중에, 목적하는 약독화된 표현형과 아울러 또는 그와 함께 다양한 표현형을 부여할 수 있다. 다라서, 바이러스의 재조합 단백질 중에 도입된 예시적인 돌연변이는 약독화된 표현형과 아울러 또는 그와 함께 온도 감수성(ts), 저온-적응된(ca), 작은 플라크의(sp), 또는 숙주 범위 제한된 (hr) 표현형, 또는 성장 및 면역원성에서의 변화를 부여할 수 있다.

사람-소 키메라 PIV 내에 함입되기 위한, 생물학적으로 유도된 PIV 및 다른 세그먼트되지 않은 (-) 가닥 RNA 바이러스 중의 약독화 돌연변이들은 자연적으로 일어날 수 있거나 또는 잘 알려진 돌연변이 유발 방법에 의해 야생형 PIV 균주 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 상기에 삽입된 인용문헌 중에 기술된 것과 같이, 불완전하게 약독화된 부모형 PIV 균주는 화학적 돌연변이 유발물질이 첨가된 세포 배양물에서의 바이러스 성장 중 화학적 돌연변이 유발에 의해, 성장 제한 돌연변이를 도입하기 위해 부적합한 온도에서 계대 배양된 바이러스를 선택하거나, 또는 세포 배양물 중의 작은 플라크(sp)를 만드는 돌연변이화된 바이러스를 선택하여 생성될 수 있다.

"생물학적으로 유도된 PIV"란 재조합적 방법에 의해 생성된 것이 아닌 모든 PIV를 의미한다. 따라서, 생물학적으로 유도된 PIV는 예를 들어, 야생형 게놈 서 열을 갖는 자연적으로 존재하는 PIV 및 참조 야생형 RSV 서열로부터의 대립유전자 또는 돌연변이체 게놈 변형을 갖는 PIV, 예를 들어, 약독화된 표현형을 특정하는 돌연변이를 갖는 PIV를 포함하는 모든 자연적으로 존재하는 PIV를 포함한다. 유사하게, 생물학적으로 유도된 PIV는 무엇보다도 인공적 돌연변이 유도 및 선택 과정에 의한 부모형 PIV로부터 유도된 PIV 돌연변이체를 포함한다.

상기에서 언급한 것과 같이, 충분하게 약독화된 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체의 제조는 몇몇 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 한 가지 이런 방법은 부분적으로 약독화된 바이러스가 세포 배양물 중에서 진행하기에는 낮은 약독화 온도에서 계대 배양되도록 하는 것을 수반한다. 예를 들어, 부분적으로 약독화된 돌연변이체는 최적 온도 이하의 온도에서세포 배양물 중에서 계대 배양되어 생산된다. 따라서, cp 돌연변이체 또는 다른 부분적으로 약독화된 PIV균주는 배양 중 계대 배양에 의해 낮은 온도에서의 효율적인 성장에 적응한다. 저온 게대 배양 중의 돌연변이체 PIV의 선택은 부분적으로 약독화된 부모형에 비교하여 유도체 균주에서 어떠한 잔류하는 독성이라도 실질적으로 감소시킨다.

별법으로, 예를 들어, ts 돌연변이를 도입하기 위해서나, 또는 이미 바이러스가 ts인 경우, 약독화된 유도체의 ts 표현형의 증가된 약독화 및(또는) 안정성을 부여하기에 충분한 추가적인 ts 돌연변이를 도입하기 위해, 부분적으로 약독화된 부모형 바이러스를 화학적 돌연변이 유발시켜 특정 돌연변이가 생물학적으로 유도된 PIV 중으로 도입될 수 있다. PIV 중으로 ts 돌연변이를 도입하는 수단은 일반적으로 알려진 방법에 따라, 5-플루오르우리딘과 같은 돌연변이 유발 물질 존재 중 의 바이러스의 복제를 포함한다. 또한 다른 화학적 돌연변이 유발 물질이 사용될 수 있다. 거의 대부분의 PIV 유전자 중의 ts 돌연변이로부터 약독화가 일어날 수 있지만, 이 목적을 위해 특히 용이한 표적은 중합효소 (L)유전자 중에서 발견되었다.

본 발명에서 사용되기 위한 예시적인 약독화된 PIV에서의 복제의 온도 감수성 수준은 몇몇 제한 온도에서의 복제와 증식 허용 온도에서의 복제를 비교하여 결정된다. 증식 허용 온도에서의 복제와 비교하여 100배 또는 그이상 바이러스의 복제가 감소하는 가장 낮은 온도는 차단(shout off) 온도라 명명된다. 실첨 동물 및 사람에서, PIV의 복제 및 독성 양자는 돌연변이체의 차단 온도와 연관된다.

JS cp44 HPIV3 돌연변이체는 비교적 유전적으로 안정하며, 상당히 면역원성이며 또한 만족할 만할 정도로 약독화된 것으로 밝혀졌다. 바이러스에서 발견되는 다양한 개별적인 돌연변이 및 조합된 돌연변이를 도입하는 생물학적으로 유도된 바이러스 및 재조합 바이러스의 뉴클레오티드 서열 분석은 각각의 증가된 약독화 수준이 특정 뉴클레오티드 및 아미노산 치환과 연관되어 있다는 것을 암시한다. 도한 상기에 삽입된 인용문헌들은 잠재적인 부수적인 돌연변이와 개별적으로 또는 다양한 조합으로 돌연변이를 감염성 PIV 클론의 게놈 또는 안티게놈 중으로 도입함으로써 표현형 차이에 관여하는 돌연변이들을 어떻게 통상적으로 구별하는지를 개시한다. 부모형 및 유도체 바이러스의 표현형 특성의 평가와 결합된 이 방법은 약독화, 온도 감수성, 저온 적응성, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한 등과 같은 목적하는 특성에 관여하는 돌연변이를 확인한다.

이렇게 확인된 돌연변이는 "메뉴" 중에 포함되고 이후 목적하는 대로, 단독으로 또는 함께 사람-소 키메라 PIV를 약독화, 면역원성, 약독화된 표현형으로부터의 복귀돌연변이에 대한 유전적 내성 등을 목적하는 대로 적절한 수준으로 조정하기 위해 함입된다. 상기 기술과 일치하여, cDNA로부터 감염성 PIV를 생성하는 능력은 사람-소 키메라 PIV 내에서 특정 엔지니어링된 변화의 도입을 허용한다. 특히, 감염성 재조합 PIV들은 생물학적으로 유도된, 약독화된 PIV 균주 내의 특정 돌연변이(들), 예를 들어 ts, ca, att 및 다른 표현형을 특정하는 돌연변이의 확인을 위해 사용된다. 따라서, 목적하는 돌연변이는 확인되고 재조합 사람-소 키메라 PIV 백신 균주 내로 도입된다. cDNA로부터 바이러스를 생성하는 능력은 개별적으로 또는 다양한 조합의 이들 돌연변이들의 전장 cDNA 클론 중으로의 통상적인 도입을 허용하며, 이후 도입된 돌연변이들을 함유한 구제된 재조합 바이러스의 표현형은 용이하게 측정될 수 있다.

목적하는 표현형, 예를 들어, cp 또는 tsd 표현형과 연관된 특정 생물학적으로 유도된 돌연변이들의 확인 및 감염성 PIV 클론으로의 도입에 의해, 본 발명은 확인된 돌연변이 위치 또는 매우 근접한 위치에 다른 부위 특이적인 변이를 제공한다. 반면에, 생물학적으로 유도된 PIV 중에서 생산된 대부분의 약독화 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 변화로, 다른 "부위 특이적인" 돌연변이 또한 생물학적으로 유도된 PIV 또는 재조합 PIV 중에 재조합 기술에 의해 함입될 수 있다. 본원에서 사용된, 부위 특이적 돌연변이는 1 내지 3개, 약 5-15개 이하 또는 그 이상의 변경된 뉴클레오티드(예를 들어, 야생형 PIV 서열, 선택된 돌연변이체 PIV 균주, 또는 돌 연변이 유발 처리된 부모형 재조합 PIV 클론)의 삽입, 치환, 결실, 또는 재배열을 포함한다. 이와 같은 부위-특이적 돌연변이는 선택된 생물학적으로 유도된 점 졸연변이 위치 또는 그 영역 중에 함입될 수 있다. 별법으로, 돌연변이는 PIV 클론 중의 다양한 다른 배경, 예를 들어, 시스-작용 조절 서열, 또는 단백질 활성 부위, 결합 부위, 면역원성 에피토프 등을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 위치 또는 근방에 함입될 수 있다. 부위 특이적 PIV 돌연변이체는 일반적으로 목적하는 약독화 표현형을 유지하나, 약독화와는 무관한 변경된 표현형 특성 (예를 들어, 향상되거나 또는 확장된 면역원성, 및(또는) 개선된 성장)을 추가적으로 나타낼 수 있다. 목적하는 부위 특이적 돌연변이체의 추가적인 예는 약독화 점 돌연변이를 특정하는 코돈 내의 추가적인 안정화 뉴클레오티드 돌연변이를 함입하도록 설계된 재조합 PIV를 포함한다. 가능한 경우, 2 이상의 뉴클레오티드 치환이 부모형 돌연변이체 또는 재조합 PIV 클론에서의 약독화 아미노산 변화를 특정하는 코돈에 함입되고, 약독화된 표현형으로부터의 복귀 돌연변이에 대해 유전저 내성을 갖는 생물학적으로 유도된 또는 재조합 PIV를 만든다. 다른 실시태양에서, 부위 특이적 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결실 또는 재배열은 예를 들어, 1 내지 3개, 5-10개 및 15개 이항의 뉴클레오티드 또는 그 이상으로, 예를 들어, 현존하는 시스 작용 조절 요소를 구성하거나 또는 제거하기 위해, 표적 뉴클레오티드 위치에 대해 상대적으로 5' 또는 3' 상류 또는 하류에 도입된다.

단일 및 다중 점 돌연변이 및 부위 특이적 돌연변이 외에, 본원에서 개시된 사람-소 키메라 PIV에서의 변화는 1 이상의 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)의 결실, 삽입, 치환 또는 재배열을 포함한다. 특히 유용한 것은 1 이상의 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)을 포함하는 결실로, 이 결실은 본 발명 내의 사람-소 키메라 PIV의 특성을 조정하기 위한 추가의 목적하는 표현형 효과를 생성하는 것으로 나타났다. 따라서, 미국 특허 출원 제09/350,821호(1999. 7. 9. 출원, 더빈 등)은 개시 코돈의 코돈 부여를 변경하는 돌연변이 또는 1 이상의 정지 코돈(들)을 도입하는 돌연변이(들)을 도입하도록 PIV 게놈 또는 안티게놈을 변이시킴으로써 C, D, 및(또는) V ORF들에 의해 예시되는 1 이상의 HPIV 유전자들의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 방법 및 조성물을 기술한다.

별법으로, 1 이상의 C, D, 및(또는) V ORF들은 대응하는 단백질(들)이 부분적으로 또는 완전히 비기능적이 되도록 만들거나 또는 단백질 발현을 모두 파괴하도록 전체적으로 또는 부분적으로 결실될 수 있다. C, D 및(또는) V, 또는 다른 비필수적 유전자(들) 중에 이 같은 돌연변이를 갖는 재조합 PIV는 백신 개발에 매우 바람직한 표현형 특정을 갖는다. 예를 들어, 이들 변이는 (i) 세포 배양물 중에서 변경된 성장 특성, (ii) 포유류의 상부 및(또는) 하부 호흡 기도에서의 약독화, (iii) 바이러스 플라크 크기의 변화, (iv) 세포 독성에서의 변화, 및 (v) 면역원성에서의 변화를 포함하는 1 이상의 목적하는 표현형 변화를 특정할 수 있다. c C ORF 발현이 결여된, rC-KO로 명명된 이 같은 예시적인 "넉 아웃" 한 돌연변이체는 그 유익한 약독화 표현형에도 불구하고, 비사람 영장류에서 야생형 HPIV3 감염에 대해 방어적 면역 반응을 유도할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 보다 구체적인 일면에서, 사람-소 키메라 PIV는 선택된 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)의 발현을 변경하거나 또는 제거하는, C, D, 및(또는) V ORF(들) 중의 결실 또는 넉 아웃 돌연변이를 함입한다. 이는 예를 들어, 선택된 코딩 서열 내에 프레임 시프트 돌연변이 또는 정지 코돈을 도입하거나, 번역 개시 부위를 변경하거나, 그 발현율을 변경하기 위해 유전자 위치를 변화시키거나 또는 상류 개시 코돈을 도입하거나, 표현형을 변경시키기 위해 GS 및(또는) GE 전사 시그날을 변화시키거나, 또는 RNA 에디팅 부위를 변이시킴으로써 달성될 수 있다(예를 들어, 전사에 대한 성장, 온도 제한 등). 본 발명의 보다 구체적인 일면에서, 사람-소 키메라 PIV는 1 이상의 유전자(들), 예를 들어, C, D, 및(또는) V ORF(들)의 발현이 이들의 유전자 또는 세그먼트의 결실없이 예를 들어, 번역 정지 코돈을 번역 개방 판독틀(ORF) 중으로 도입하거나, 개시 코돈을 변경하거나, 또는 에디팅 부위를 변이시킴으로써, 번역 또는 전사 수준에서 제거되는 경우에 제공된다. 이들 형태의 넉 아웃 바이러스는 흔히 조직 배양물 중에서 감소된 성장률 및 작은 플라크 크기를 나타낸다. 따라서, 이들 방법은 주요 바이러스 방어 항원 중의 하나가 아닌 바이러스 유전자의 발현을 제거하는 추가적인 신규한 유형의 약독화 돌연변이를 또한 제공한다. 이 상황에서, 유전자 또는 게놈 세그먼트 결실 없이 제조된 넉 아웃 바이러스 표현형은 기술한 것과 같이 표적 단백질의 합성을 회복시킬 수 있는 교정 돌연변이를 효과적으로 배제하기 위해 결실 돌연변이 유발에 의해 별법으로 제조될 수 있다. C, D, 및(또는) V ORF(들에 대한 수 개의 다른 유전자 넉 아웃 및 넉 아웃 돌연변이체는 당업계에서 잘 알려진 다른 설계 및 방법을 사용하여 제조될 수 있다(상기에서 기술한 것과 같이, 예를 들어, (Kretscmer et al., Virology 216:309-316, 1996; Radecke et al., Virology, 217:418-421, 1996, 및 Kato et al., 1987a, 상기 참조; 및 Schneider et al., 1997, 상기 참조, 각각은 본원에 인용 문헌으로 삽입되었음).

사람-소 키메라 PIV 중의 이들 및 다른 뉴클레오티드 변이는 공여체 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈 중에서 변화의 성질에 따라 (즉, 적은 수의 염기는 면역원성 에피토포를 삽입하거나 또는 제거하기 위해 변화되거나, 또는 작은 게놈 세그먼트를 변화시킬 수 있는 반면, 큰 블록(들)의 염기는 유전자 또는 큰 게놈 세그먼트가 첨가, 치환, 결실 또는 재배열되는 경우에 관여한다) 적은 수의 염기(예를 들어, 15-30개 염기, 35-50개 이하의 염기 또는 그 이상), 큰 불록의 뉴클레오티드(예를 들어, 50-100개, 100-300개, 300-500개, 500-1,000개 뉴클레오티드), 또는 거의 전체의 또는 전체 유전자(예를 들어, 1,000-1,500개 뉴클레오티드, 1,500-2,500개 뉴클레오티드, 2,500-5,000개 뉴클레오티드, 5,000-6,500개 뉴클레오티드 또는 그 이상)를 변경할 수 있다.

관련된 일면에서, 본 발명은 생물학적으로 유도된 PIV로부터의 재조합 PIV 클론 중으로 채택된 돌연변이, 예를 들어 cp 및 ts 돌연변이와 추가로 변이된 PIV 크론 중의 동일하거나 또는 상이한 유전자를 수반하는 추가 유형의 돌여변이의 보충물을 제공한다. 신규한 백신 특성을 나타내는 사람-소 키메라 PIV를 생성하기 위해, 각각의 PIV 유전자는 전체적으로 또는 부분적으로, 단독으로 또는 다른 목적하는 변이와 함께, 발현 수준 측면에서 선택적으로 변경될 수 있거나, 또는 첨가되거나, 결실되거나, 치환되거나 또는 재배열될 수 있다. 따라서, 생물학적으로 유 도된 PIV 돌연변이체로부터 채택된 약독화 돌연변이와 함께 또는 이에 추가하여, 본 발명은 또한 약독화시키거나 감염성 PIV 클론의 재조합 엔지니어링에 기재한 사라-소 키메라 PIV의 표현형을 달리 변형시키기 위한 범위의 추가 방법들을 제공한다. 감염성 클론 중으로 함입하기 위한 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈 중의 공여체 또는 수용체 유전자 또는 게놈 세그먼트를 포함하는 표적 유전자 또는 게놈 세그먼트를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열 중에서 다양한 변경이 만들어질 수 있다. 보다 구체적으로, 재조합 PIV 중에서 목적하는 구조적 및 표현형 변화를 달성하기 위해, 본 발명은 부모형 게놈 또는 안티게놈으로부터의 선택된 뉴클레오티드 또는 다수의 뉴클레오티드를 결실시키거나, 치환시키거나, 도입하거나, 또는 재배열시키는 변이와 아울러 사람-소 키메라 PIV 클론 중의 전체 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)을 결실시키거나, 치환시키거나, 도입하거나 또는 재배열시키는 돌연변이의 도입을 허용한다.

따라서 예를 들어, 선택된 PIV 코딩 서열 내에 정지 코돈을 도입하거나, 또는 그 번역 개시 또는 RNA 에디팅 부위를 변경시키거나, 작동할 수 있게 연결된 프로모터에 대해 상대적인 PIV 유전자 위치를 변화시키거나, 발현을 변경시키기 위해 상류 개시 코돈을 도입하거나, 표현형(예를 들어, 전사에 대한 성장, 온도 제한 등)을 변경하기 위해 GS 및(또는) GE 전사 시그날을 변이시킴(예를 들어, 위치의 변화, 현존하는 서열의 변경, 또는 현존 서열을 이형 서열로 치환함) 및 바이러스 복제, 선택된 유전자(들)의 저나, 또는 선택된 RNA(들)의 번역에서의 정량정 또는 정성적 변화를 특정하는 다양한 다른 결실, 치환, 삽입 및 재배열 선택된 유전자의 발현을 단순히 변경하거나 또는 제거하는 사람-소 키메라 PIV에성의 변이가 제공된다. 이 상황에서, 독성, 병원성, 면역원성 및 다른 표현형 특성에 대한 목적하는 효과를 만들기 위해, 성장에 필수적이지 않은 어떠한 PIV 유전자 또는 게놈 세그먼트라도 재조합 PIV 중에서 제거되거나 또는 변이될 수 있다. 코딩 서열에 대해서는, 비코딩, 리더, 트레일러 및 유전자간 여역이 유사하게 결실, 치환 또는 변이될 수 있고, 이들 표현형 효과는 예를 들어, 미니복제체(minireplicon) 및 재조합 piv를 사용하여 용이하게 분석될 수 있다.

아울러, 사람-소 키메라 PIV 중으로 도입되기 위한 PIV 게놈 또는 안티게놈 중에서, 성장, 약독화, 면역원성, 유전적 안정성을 조정하기 위해, 또는 다른 유리한 구조적 및(또는) 표현형 효과를 제공하기 위해 다양한 다른 유전적 변경이 단독으로 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이체 PIV로부터 채택된 1 이상의 약독화 돌연변이와 함께, 생성될 수 있다.

이들 변화와 아울러, 사람-소 키메라 PIV의 유전자 순서는 변화할 수 있으며, PIV 게놈 프로모터는 그 안티게놈 대응물로 대체될 수 있고, 유전자 일부가 제거되거나 또는 치환될 수 있으며, 심지어 전체 유전자가 결실될 수 있다. 조작을 용이하게 하기 위해, 다양한 유전자간 영역 또는 다른 곳 중의 독특한 제한 효소 부위 삽입과 같은 서열 중의 상이하거나 또는 추가적인 변이가 만들어질 수 있다. 외래 서열의 수용능력을 증가시키기 위해, 비번역된 유전자 서열이 제거될 수 있다.

본 발명의 사람-소 키메라 PIV 중으로 함입하기 위한 다른 돌연변이는 시스- 작용 시그날에 대한 돌연변이를 포함하고, 이는 예를 들어, PIV 미니게놈의 돌연변이 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 리더 및 트레일러 및 플랭킹 서열의 삽입 및 결실 분석은 바이러스 프로모터 및 전사 시그날을 확인하고, RNA 복제 또는 전사의 다양한 수준의 감소와 연관된 일련의 돌연변이를 제공한다. 또한 이들 시스 작용 시그날의 포화 돌연변이 유발(이에 의해 각각의 위치가 차례로 각각의 대체 뉴클레오티드로 차례로 변이됨)은 RNA 복제 또는 전사에 영향을 주는 많은 돌연변이를 확인하였다. 이들 돌연변이 중 어떤 것이라도 사람-소 키메라 PIV 안티게놈 또는 게놈 중으로 본원에서 기술한 것과 같이 삽입될 수 있다. 전체 안티게놈 cDNA를 사용한 트랜스-작용 단백질 및 시스-작용 RNA 서열의 평가 및 조작은 상기에 삽입된 인용 문헌에서 기술한 대로 PIV 미니게놈 사용에 의해 보조된다.

사람-소 키메라 PIV 내의 추가 돌연변이는 게놈의 3' 말단을 안티게놈의 그 대응물로 치환하는 것을 수반하며, 이는 RNA 복제 및 전사 중 변화와 연관된다. 한 실시 태양에서, 방어성 HN 및(또는) F 항원과 같은 특정 PIV 단백질의 발현 수준은 천연의 서열을 인공적으로 제조되고 효율적인 번역과 일관되도록 설계된 서열로 치환하여 증가될 수 있다. 이 상황에서, 코돈 사용은 포유류 바이러스 단백질의 번역 수준에서 주요 인자가 될 수 있다 (Hans et al., Current Biol. 6:315-324, 1996, 본원에 인용문헌으로 삽입됨). 주요 방어 항원인 PIV의 HN 및 F 단백질을 코딩하는 mRNA의 코돈 사용의 재조합적 방법에 의한 최적화는 이들 유전자의 향상된 발현을 제공할 것이다.

다른 예시적인 실시 태양에서, 선택된 PIV 유전자의 번역 개시 부위를 둘러 싼 서열은 단독으로 또는 상류 개시 코돈 도입과 함께 변이되어 번역의 상승 또는 하강 조절을 특정하여 PIV 유전자 발현을 조절한다 (Kozak et al., J. Mol. Biol. 196:947-950, 1987). 별법으로, 또는 본원에서 개시된 다른 PIV 변이들과 함께, 사람-소 키메라 PIV의 유전자 발현은 바이러스 중 어느 한 선택된 유전자(들)의 전사 GS 또는 GE 시그날을 변경하여 조절될 수 있다. 다른 실시 태양에서, 사람-소 키메라 PIV 중의 유전자 발현 수준은 전사 수준에서 변이된다. 한 일면에서, PIV 유전자 맵 중의 선택된 유전자의 위치는 보다 프로모터 근위의 또는 프로모터 원위의 위치로 변화될 수 있고, 이로써 유전자는 보다 효율적으로 또는 덜 효율적으로 발현될 것이다. 이 일면에 따라, 특정 유전자의 발현 조절은 흔히 상호적, 위치적으로 치환된 유전자 때문에 발현 수준에서 균등한 감소가 따르는, 야생형 수준에 비교하여 2배, 보다 일반적으로는 4배, 10배 이항 또는 그 이상의 유전자 발현 감소 또는 증가를 일으켜 달성될 수 있다. 이들 및 다른 전좌 (traspositioning) 변화는 예를 들어, RNA 복제에 관여하는 선택된 바이러스 단백질의 감소된 발현으로 인해 약독화된 표현형을 갖는, 또는 증가된 항원 발현과 같은 다른 바람직한 성질을 갖는 신규한 사람-소 키메라 PIV를 생성한다.

또한 본 발명의 사람-소 키메라 PIV 클론은 면역원성을 강화하고 또한 야생형 PIV 또는 부모형 PIV에 의한 감염으로 제공되는 것보다 큰 방어 수준을 유도하기 위해 본원에서 개시된 방법 및 조성물에 따라 엔지니어링될 수 있다. 예를 들어, 이형 PIV 균주 또는 유형의, 또는 RSV와 같은 비PIV 기원의 면역원성 에피토프는 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적절한 뉴클레오티 드 변화에 의해 재조합 클론에 첨가될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 돌연변이체 PIV는 바람직하거나 또는 바람직하지 않은 면역학적 반응과 관련된 면역원성 단백질, 단백질 도메인, 또는 특정 단백질 유형을 첨가하거나 또는 제거하기 위해 (예를 들어, 아미노산 삽입, 치환 또는 결실에 의해) 엔지니어링될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 추가 유전자 또는 게놈 세그먼트는 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈 중으로 또는 이에 근접하여 삽입될 것이다. 이들 유전자는 수용체 유전자에 의한 통상의 조절 하에 있을 수 있거나, 또는 독립적인 세트의 전사 시그날의 조절 하에 있을 수 있다. 목적하는 유전자는 상기에서 확인된 PIV 유전자들과 아울러 비PIV 유전자들을 포함한다. 목적하는 비PIV 유전자는 사이토카인(예를 들어, IL-2부터 IL-18까지, 특히 IL-2, IL-6 및 IL-12, IL-18 등), 감마 인터페론, 및 T 헬퍼 세포 에피토프에 풍부한 단백질들을 코딩하는 것들을 포함한다. 이들 추가 단백질들은 별개 단백질로, 또는 HN 또는 F와 같은 현존하는 PIV 단백질의 여분의 카피로 발현될 수 있다. 이는 정량적으로 또한 정성적으로, 양쪽으로 PIV에 대한 면역 반응을 변이시키고 또한 향상시키는 능력을 제공한다.

결실, 삽입, 치환 및 사람-소 키메라 PIV 내의 전체 바이러스 유전자 또는 게놈의 변화를 포함하는 다른 돌연변이는 상당히 안정한 백신 후보를 만들고, 이는 면역억제된 개체의 경우 특히 중요하다. 이들 변화 중 많은 수는 생성된 백신 균주의 약독화를 초래하는 반면, 다른 것들은 목적하는 표현형 변화의 상이한 유형을 특정할 것이다. 예를 들어, 보조적인(즉, 시험관내 성장에 필수적이지 않은) 유전자들은 숙주 면역성을 특이적으로 방해하는 단백질을 코딩하기 위한 우수한 후보이 다(예를 들어, Kato et al., 1997a, 상기 참조). 맥신 바이러스 중의 이러한 유전자의 제거는 독성 및 변원성을 감소시키고(또한) 면역원성을 향상시킨다.

본 발명의 다른 일면에서, 조성물(예를 들어, 사람-소 키메라 PIV를 코딩하는 cDNA를 함입하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 벡터)은 단리된 감염성 PIV를 제조하기 위해 제공된다, 이들 조성물 및 방법을 사용하여, 감염성 PIV는 PIV 게놈 또는 안티게놈으로부터 생성되고, 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 및 거대(L) 중합효소 단백질로부터 생성된다. 본 발명의 관련된 일면에서, 조성물 및 방법은 감염성의 약독화된 백신 바이러스를 생성하기 위해 재조합 PIV 중으로 상기에서 언급한 구조적 및 표현형적 변화를 도입하기 위해 제공된다.

상기에서 정의된 돌연변이의 감염성, 사람-소 키메라 PIV 클론 중으로의 도입은 다양한 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. DNA와 관련하여 "감염성 클론"이란 합성의 또는 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 게놈을 제조하기 위한 주형으로 작용할 수 있는 게놈 또는 안티게놈 RNA 중으로 전사될 수 있는 cDNA 또는 그 생성물을 의미한다. 따라서, 정의된 돌연변이는 통상의 기술(예를 들어, 특정 부분 돌연변이 유발)에 의해 게놈 또는 안티게놈의 cDNA 카피 중으로 도입될 수 있다. 본원에서 기술된 것과 같은 전체 안티게놈 또는 게놈 cDNA를 어셈블하기 위한 안티게놈 또는 게놈 cDNA 서브단편의 사용은 각각의 영역이 개별적으로 조작될 수 있다는 장점을 가지며(작은 cDNA가 큰 것보다 조작하기 용이하다), 이후 전체 cDNA 중으로 용이하게 어셈블될 수 있다. 따라서, 전체 안티게놈 또는 게놈 cDNA, 또는 이들의 어떤 한 서브단편이라도 올리고뉴클레오티드 지시된 돌연 변이 유발을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 이는 단일 가닥 파지미드 형태의 중간체를 통해, 예를 들어, 바이오-래드 래버러토리(Bio-Rad Laboratory)의 뮤타-진

(Muta-gene

) 키트(캘리포니아, 리치몬드 소재)를 사용하여 또는 스트라타진 (Stratagene)의 차멜른 (Chameleon) 돌연변이 유발 키트(캘리포니아 라 졸라 소재)의 방법을 사용하여, 또는 목적하는 돌연변이(들)을 포함한 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 주형 중 하나를 사용한 중합 효소 연쇄 반응에 의해 가능하다. 이후 돌연변이된 서브단편은 전체 안티게놈 또는 게놈 cDNA 중으로 어셈블될 수 있다. 다양한 다른 돌연변이 유발 기술이 일려졌으며 PIV 안티게놈 또는 게놈 cDNA 중의 목적하는 돌연변이를 제조하기 위한 용도로 사용할 수 있다. 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 변화로부터 1 이상의 유전자 또는 게놈 영역을 함유한 거대 cDNA 조각의 대체에 이르기까지 변화할 수 있다.

따라서, 한 예시적인 실시태양에서, 돌연변이는 바이로-래드로부터 구입할 수 있는 뮤타-진 파지미드 돌연변이 유발 키드를 사용하여 도입되나, 간단하게 설명하면, PIV 게놈 또는 안티게놈의 일부를 코딩하는 cDNA는 플라스미드 pTZ18U 중으로 클로닝될 수 있고, CJ236 세포를 형질전화하기 위해 사용된다(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)). 파지미드 제조는 제조자에 의해 추천된 방식으로 제조된다. 올리고뉴클레오티드는 게놈 또는 안티게놈의 목적하는 위치에서 변경된 뉴클레오티드 도입에 의한 돌연변이 유발을 위해 설계된다. 이후, 유전적으로 변경된 게놈 또는 안티게놈 단편을 함유하는 플라스미드는 증폭되고, 돌연변이된 조각은 이후 전장 게놈 또는 안티게놈 클론 중으로 재도입된다.

본 발명의 감염성 PIV는 PIV 게놈 또는 안티게놈 RNA를 코딩하는 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드와 전사하고 복제하는 뉴클레오캡시드를 생성하기 위해 필요한 바이러스 단백질을 코딩하는 1 이상의 폴리뉴클레오티드와 함께, 세포내 또는 무세포 공동 발현에 의해 생산된다. 바이러스 단백질 중, 감염성 PIV를 생산하기 위해 공동 발현에 유용한 것은 주뉴클레오캡시드 단백질(N), 뉴클레오캡시드 인 단백질(P), 거대(L) 중합효소 단백질, 융합 단백질(F), 혈구응집-뉴라미니다아제 당단백질(HN), 및 매트릭스(M) 단백질이다. 이에 관련하여 또한 유용한 것은 PIV의 C, D, 및 V ORF들이다.

PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA는 감염성 PIV를 형성하기 위해 필요한 바이러스 단백질과 함께 세포내 또는 시험관내의 공동발현을 위해 구성된다. "PIV 게놈"란 자손형 PIV 게놈의 합성을 위한 주형으로 사용되는 단리된 (+) 센스 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 바람직하게는, 전사하고 복제하는 뉴클레오캡시드를 생성하기 위해 필요한 단백질을 코딩하는 상보적인 서열의 (+) 전사체와 혼성화할 가능성을 최소화하기 위해, 복제 중간체 RNA, 또는 안티게놈에 상응하는 PIV 게놈의 (+) 센스 버젼의 PIV게놈인 cDNA가 구성된다.

본 발명의 일부 실시태양에서, 재조합 PIV(rPIV)의 게놈 또는 안티게놈은 단지 이들에 의해 코딩되는 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 감염성으로 만드는 데 필요한 이들 유전자 또는 유전자의 일부를 함유하는 것을 필요로 한다. 아울러, 유전자 또는 이들의 일부는 1 이상의 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 제공될 수 있으며, 즉, 유전자는 상보체 또는 별개의 뉴클레오티드 분자의 유사체에 의해 제 공될 수 있다. 다른 실시태양에서, PIV 게놈 또는 안티게놈은 플라스미드 또는 헬퍼 세포주에 의해 제공되는 헬퍼 바이러스 또는 바이러스 기능의 관여 없이, 바이러스 성장, 복제, 및 감염에 필요한 모든 기능을 코딩한다.

"재조합 PIV"란 재조합 발현 시스템으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래하거나, 또는 이들로부터 생성된 바이러스 또는 서브바이러스 입자로부터 증식된 PIV 또는 PIV 유사 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 의미한다. 재조합 발현 시스템은 PIV 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 1 이상의 유전 요소 또는 요소들, 예를 들어, 프로모터, PIV RNA로 전사되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 적절한 전사 개시 및 종결 서열의 어셈블리를 포함하는 작동할 수 있게 연결된 전사 단위를 포함한다.

cDNA 발현된 PIV 게놈 또는 안티게놈으로부터 감염성 PIV를 생성하기 위해, 게놈 또는 안티게놈은 (i) RNA 복제를 할 수 있는 뉴클레오캡시드를 생성하기 위해서, 및 (ii) RNA 복제 및 전사 양자를 위한 뉴클레오캡시드 성분을 만들기 위해 필요한 PIV N, P 및 L과 공동발현된다. 게놈 뉴클레오캡시드에 의한 전사는 다른 PIV 단백질을 제공하고, 생산적 감염을 시작한다. 별법으로, 생산적 감염에 필요한 추가 PIV 단백질은 공동발현으로 공급될 수 있다.

또한 상기에서 언급된 바이러스 단백질과 함께 PIV 게놈 또는 안티게놈의 합성은 시험관내(무세포)에서, 예를 들어 결합된 전사-번역 반응 이후 세포 중으로 트랜스팩션하여 달성될 수 있다. 별법으로, 안티게놈 또는 게놈 RNA는 시험관내에서 합성되고, 세포 중으로 트랜스팩션되어 PIV 단백질을 발현한다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 전사하고 복제하는 PIV 뉴클레오캡시드를 생성하기 위해 필요한 단백질을 코딩하는 상보 서열은 1 이상의 헬퍼 바이러스에 의해 제공되나. 이러한 헬퍼 바이러스는 야생형 또는 돌연변이체일 수 있다. 바람직하게는, 헬퍼 바이러스는 PIV cDNA에 의해 코딩되는 바이러스와 표현형적으로 구분될 수 있다. 예를 들어, 헬퍼 바이러스와는 면역적으로 반응하나, PIV cNDA에 의해 코딩되는 바이러스와는 반응하지 않는 모노클론 항체를 제공하는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서, 헬퍼 바이러스를 재조합 바이러스와 분리하기 위해 친화성 크로마토그래피에서 항체가 사용될 수 있다. 이러한 항체의 획득을 보조하기 위해, 돌연변이가 PIV cDNA 중으로 도입될 수 있고, HN 또는 F 당단백질 유전자와 같은 헬퍼 바이러스로부터의 항원 다양성을 제공한다.

본 발명의 다른 실시태양에서, N, P, L 및 다른 목적하는 PIV 단백질들은 1 이상의 비바이러스 발현 벡터에 의해 코딩되고, 이는 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것들과 동일하거나 상이할 수 있다. 추가 단백질은 바라는 대로 포함될 것이며, 각각은 그 자체 벡터 또는 1 이상의 N, P, L 및 다른 목적하는 PIV 단백질들을 코딩하는 벡터, 또는 전체 게놈 또는 안티게놈에 의해 코딩된다. 게놈 또는 안티게놈 및 트랜스펙트된 플라스미드로부터의 단백질의 발현은, 예를 들어, T7 RNA 중합효소에 대한 프로모터의 조절 하에 있는 각각의 cDNA에 의해 달성될 수 있고, 이어서 감염, T7 RNA 중합효소에 대한 발현 시스템, 예를 들어, T7 RNA 중합효소를 발현하는 우두 바이러스 MVA 균주로 트랜스팩션 또는 트랜스덕션(transduction)하여 제공된다(Wyatt et al., Virology 210:202-205, 1995, 본원에 그 전체 내용이 인용문헌으로 삽입되었다). 또한, 바이러스 단백질 및(또는) T7 RNA 중합효소는 형질전환된 포유류 세포 또는 사전에 형성된 mRNA 또는 단백질의 트랜스펙션에 의해 제공될 수 있다.

PIV 안티게놈은 예를 들어, 전체적으로 전체 안티게놈을 나타내는 클론된 cDNA 세그먼트들을 어셈블링하여, 또는 PIV mRNA 또는 게놈 RNA의 역전사된 카피의 중합효소 연쇄 반응(PCR; 예를 들어, 미국 특허 출원 제4,683,195호 및 4,683,202호 및 PCR 프로토콜: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, SanDiego, 1990; 각각은 본원에 그 전체 내용이 인용문헌으로 삽입되었다) 등에 의해 본 발명에서 사용되기 위해 구성될 수 있다. 예를 들어, 적절한 프로모터로부터 걸쳐 안티게놈의 좌측 말단을 포함하는 cDNA를 포함하는 제1 구조체가 생성되고, 플라스미드, 코스미드, 파지 또는 DNA 바이러스 벡터와 같은 적절한 발현 벡터에 어셈블된다. 벡터는 돌연변이 및(또는) 어셈블리를 용이하게 하기 위해 설계된 독특한 제한 효소 부위를 포함하는 합성 폴리링커의 삽입에 의해 변이될 수 있다. N, P, L 및 다른 바람직한 PIV 단백질 각각의 제조의 용이함을 위해 1 이상의 별개의 벡터로 어셈블될 수 있다. 안티게놈 플라스미드의 우측 말단은 목적하는 대로, 플랭킹 라이보자임 및 탠덤(tandem) T7 전사 터미네이터와 같은 추가 서열을 포함할 것이다. 라이보자임은 해머헤드(hammerhead) 유형일 수 있으며 (예를 들어, Grosfeld et al., J. Virol. 69:5677-5686, 1995), 이는 단일 비바이러스 뉴클레오티드를 포함하는 3' 말단을 생성하거나, 또는 비PIV 뉴클레오티드가 없는 3; 말단을 생성하는 헤파타이티스 델타 바이러스 라이보자임 같은 다른 적합한 라이보자임 중 하나일 수 있고(Perrotta et al., Nature 350:434-436, 1991; 본원은 그 전체 내용이 인용문헌으로 삽입되었다). 이후, 좌측 말단 및 우측 말단은 공통된 제한 효소 부위에 의해 연결된다.

다양한 뉴클레오티드 삽입, 결실, 및 재배열이 cDNA의 구성 중 또는 그 후에 PIV 게놈 또는 안티게놈 중에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 특정 목적하는 뉴클레오티드 서열이 합성될 수 있고, 알맞은 제한 효소 부위를 사용하여 cDNA 중의 적절한 영역에 삽입될 수 있다. 별법으로, 돌연변이를 cDNA 중에 도입하기 위해, 특정 부분 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝, PCR 돌연변이 유발과 같은 기술, 또는 당업계에서 잘 알려진 이러한 다른 기술들이 사용될 수 있다.

게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 구성하기 위해 사용된 다른 방법은 서브유닛 cDNA 구성 성분의 수를 하나 또는 두 조각과 같이 적은 수로 감소시키기 위한 개선된 PCR 조건을 사용한 역전사 PCR(예를 들어, Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994, 본원에 인용문헌으로 삽입됨)을 포함한다. 다른 실시태양에서는 다른 프로모터(예를 들어, T3, SP6)가 사용될 수 있거나, 또는 라이보자임(예를 들어, 헤파타이티스 델타 바이러스)가 사용될 수 있다. 더 큰 크기의 게놈 또는 안티게놈을 더 잘 수용하기 위해 다른 DNA 벡터(예를 들어, 코스미드)가 증식을 위해 사용될 수 있다.

게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, cDNA)는 생산적 PIV 감염을 지지할 수 있는 세포, 예를 들어, HEp-2, FRhL0DBS2, LLC-MK2, MRC-5 및 Vero 세포 중으로 트랜스팩션, 전기침공, 기계적 삽입, 트랜스덕션 등에 의해 적절한 숙주 세포 중으로 삽입될 수 있다. 단리된 폴리뉴크레오티드 서열의 트랜스펙션은 예를 들어, 인산칼륨 매개된 트랜스펙션 (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: Graham and Van der Eb,Virologv 52: 456,1973), 전기침공 (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845,1982), DEAE-덱스트란 매개된 트랜스펙션 (Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1987), 양이온성 지질 매개된 트랜스펙션 (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73-79,1993) 또는 상업적으로 구입할 수 있는 트랜스펙션 시약, 예를 들어, 리포펙트ACE

(LipofectACE

); (매릴랜드주 게티스버그 소재 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies)사) 또는 기타 (상기 문헌 각각은 그 전체 내용이 본원에 인용 문헌으로 삽입되었다).

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 일부 실시태양에서는 N, P, L 및 다른 목적하는 PIV 단백질이 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것들과 표현형적으로 구분되는 1 이상의 헬퍼 바이러스에 의해 코딩된다. 또한, N, P, L 및 다른 목적하는 PIV 단백질은 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것들과 동일하거나 별개일 수 있는 1 이상의 발현 벡터, 및 이들의 다양한 조합에 의해 코딩될 수 있다. 추가 단백질은 원하는 대로 포함될 수 있으며, 자체 벡터 또는 1 이상의 N, P, L 및 다른 목적하는 PIV 단백질 또는 전체 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 벡터에 의해 코딩될 수 있다.

본 발명의 감염성 클론의 PIV를 제공함으로써 PIV 게놈(또는 안티게놈) 내에 서 재조합적으로 생산되는 폭넓은 범위의 변경을 허용하고, 목적하는 표현형 변화를 특정하는 확정된 돌연변이를 만든다. "감염성 클론"이란 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 게놈을 제조하기 위한 주형으로 기능할 수 있는 게놈 또는 안티게놈 RNA 중으로 전사될 수 있는 감염성 비리온 중으로 직접적으로 도입될 수 있는 합성 또는 다른 방식의 cDNA 또는 그 생산물, RNA를 의미한다. 상기에서 언급한 바와 같이, 확정된 돌연변이는 다양한 통상적인 기술(예를 들어, 자리 지시된 돌연변이 유발)에 의해 게놈 또는 안티게놈의 cDNA 카피 중으로 도입될 수 있다. 본원 상기에서 기술된 것과 같은, 전체 게놈 또는 안티게놈을 어셈블하기 위한 게놈 또는 안티게놈 cDNA 서브단편의 용도는 각각의 영역이 개별적으로 조작될 수 있다는 장점을 가지며, 작은 cDNA 재료는 큰 cDNA 재료보다 보다 용이한 조작을 제공하며, 이후 전체 cDNA로 용이하게 어셈블될 수 있다. 따라서, 전체 안티게놈 또는 게놈 cDNA, 또는 이들의 선택된 서브단편은 올리고뉴크레오티드 지시된 돌연변이 유발을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 이는 단일 가닥 파지미드 형태의 중간체를 통해, 예를 들어 바이오-래드 래버러토리 (캘리포니아주 리치몬드 소재)의 뮤타-진

키트를 사용하여, 또는 스트라타진(캘리포니아주 라 졸라 소재) 채멜리언

돌연변이 유발 키트와 같은 이중 가닥 플라스미드를 직접 주형으로 사용한 방법, 또는 목적하는 돌연변이(들)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 주형 중 하나를 사용한 중합 효소 연쇄 반응에 의해 가능하다. 이후, 돌연변이화된 서브단편은 전체 안티게놈 또는 게놈 cDNA 중으로 어셈블될 수 있다. 다양한 다른 돌연변이 유발 기술이 공지되어 있고, 본 발명의 PIV 안티게놈 또는 게놈 중의 목 적하는 돌연변이를 생산하기 위한 용도로 통상적으로 채택될 수 있다.

따라서, 한 예시적인 실시태양에서 돌연변이는 바이로-래드 래버러토리로부터 구입할 수 있는 뮤타-진

파지미드 시험관내 돌연변이 유발 키트를 사용하여 도입된다. 간단하게 말하자면, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA가 플라스미드 pTZ18U 중으로 콜로닝되고, CJ236 세포를 형질전화시키기 위해 사용된다(라이프 테크놀로지스). 파지미드 제조물은 제조자가 추천한 대로 제조된다. 올리고뉴클레오티드는 게놈 또는 안티게놈의 목적하는 위치에의 변경된 뉴클레오티드 도입에 의한 돌연변이 유발을 위해 설계된다. 이후, 유전적으로 변경된 게놈 또는 안티게놈을 함유한 플라스미드가 증폭된다.

돌연변이는 단일 뉴클레오티드 변화에서부터 1 이상의 유전자 또는 게놈 세그먼트를 함유한 큰 cDNA 세그먼트의 도입, 결실 또는 대체까지 변화할 수 있다. 게놈 세그먼트는 구조적 및(또는) 기능적 도메인, 예를 들어 단백질의 세포질성, 막횡단 또는 엑토도메인, 결합 또는 다른 단백질과의 다른 생화학적 상호작용을 매개하는 부위와 같은 활성 분위, 에피토프 부위, 예를 들어, 항체 결합 및(또는) 호르몬성 또는 세포 매개된 면역 반응을 자극하는 부위 등에 상응할 수 있다. 이러한 점에서 유용한 게놈 세그먼트는 단백질의 작은 기능적 도메인 (예를 들어 약 50, 75, 100, 200-500 및 500-1,500개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 에피토프 부위를 코딩하는 게놈 세그먼트의 경우) 약 15-35개의 뉴클레오티드 범위이다.

감염성 PIV 중으로 확정된 돌연변이를 도입할 수 있는 능력은 면원성 및 면역원성 기작의 PIV 조작을 포함하는 많은 응용을 갖는다. 예를 들어, N, P, M, F, HN, 및 L 단백질 및 C, D 및 V ORF 생성물을 포함하는 PIV 단백질의 기능은 단백질 발현 수준을 제거하거나 또는 감소시키거나, 또는 돌연변이체 단백질을 만드는 돌연변이 도입에 의해 조작될 수 있다. 또한, 프로모터, 유전자간 영역, 및 전사 시그날과 같은 다양한 게놈 RNA의 구조적 특징은 본 발명의 방법 및 조성물 내에서 일상적으로 조작될 수 있다. 트랜스-작용 단백질 및 시스-작용 RNA 서열의 영향은 예를 들어, PIV 미니게놈을 사용한 병행 분석에서 전체 안티게놈 cDNA를 사용하여, 용이하게 측정될 수 있으며(Dimock et al., J. Virol. 67:2722-2778, 1993, 본원에 그 전체 내용이 인용문헌으로 삽입되었다), 그 구제 의존적 현상은 복제 독립적 감염성 바이러스에서 회수되기에는 지나치게 억제적일 수 있는 이러한 돌연변이체의 특성 분석에서 유용하다.

본 발명의 재조합 PIV 내의 유전자 또는 게놈 세그먼트의 특정 치환, 삽입, 결실 또는 재배열(예를 들어, 선택된 단백질 또는 단백질 영역, 예를 들어 세포질성 테일, 막횡단 도메인 또는 엑토도메인, 에피토프 부위 또는 영역, 결합 부위 또는 영역, 활성 부위를 포함하는 활성 부위 또는 영역 등을 코딩하는 게놈 세그먼트의 치환)은 동일하거나 또는 상이한 PIV 또는 다른 기원의 현존하는 "대응" 유전자 또는 게놈 세그먼트와 관련하여 구조적으로 또는 기능적으로 만들어진다. 이러한 변이는 야생형 또는 부모형 PIV 또는 다른 바이러스 균주와 비교하여 목적하는 표현형 변화를 갖는 신규한 재조합체를 생성한다. 예를 들어, 이 유형의 재조합체는 다른 PIV의 엑토도메인에 융합된 한 PIV의 세포질성 테일 및(또는) 막횡단 도메인을 갖는 키메라 단백질을 발현할 수 있다. 이 유형의 다른 예시적인 재조합체는 복제본(duplicate) 면역원성 영역과 같은 복제본 단백질을 발현한다.

본원에서 사용된 것과 같이, "대응" 유전자, 게놈 세그먼트, 단백질 또는 단백질 영역은 일반적으로 상이한 PIV 유형 또는 균주 내의 동일한(즉, 상동이거나 또는 대립유전자형의) 유전자 또는 게놈을 나타내는 이형 기원(예를 들어, 상이한 PIV 유전자, 또는 PIV 유형 또는 균주)의 것이다. 이에 관련하여 선택된 대표적인 대응물은 전체적인 구조적 특징을 공유하는데, 예를 들어 각각의 대응물은 유사한 단백질 또는 단백질의 구조적 도메인 (세포질성 도메인, 막횡단 도메인, 엑토도메인, 결합 부위 또는 영역, 에피토프 부위 또는 영역 등과 같은 것)을 코딩할 수 있다. 대응 도메인 및 다른 코딩 게놈 세그먼트는 도메인 또는 게놈 세그먼트 변이체 중에서 공통적인 생물학적 활성에 의해 확정된 일정 범위의 크기 및 서열 변형을 갖는 종의 집합을 포함한다.

본원에서 개시된 다른 폴리뉴클레오티드와 아울러 본 발명의 재조합 PIV를 제조하기 위한 대응 유전자 또는 게놈 세그먼트는 선택된 폴리뉴클레오티드 "참조 서열 (reference sequence)", 예를 들어 다른 선택된 대응 서열과 흔히 상당한 서열 동일성을 공유한다. 본원에서 사용된 것과 같이 "참조 서열"은 서열 비교의 근거로서 사용되는 확정된 서열, 예를 들어 전장 cDNA 또는 유전자의 세그먼트, 또는 전체 cDNA 또는 유전자 서열이다. 일반적으로, 참조 서열은 20개 뉴클레오티드 이상의 길이, 흔히 25개 이상의 뉴클레오티드 길이이고, 종종 50개 뉴클레오티드 이상의 길이이다. 두 개의 폴리뉴클레오티드가 각각 (1)두 폴리뉴클레오티드 사이에 유사한 서열(즉, 전체 폴리뉴클레오티드 서열의 일부)을 포함하고, (2) 추가로, 두 폴리뉴클레오티드 사이에서 분기하는 서열을 포함하므로, 두 개의(또는 그 이상의_ 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 비교는 일반적으로 서열 유사성을 확인하고 국부적 영역을 비교하기 위해 "비교창(comparison window)"에 걸쳐 두 폴리뉴클레오티드를 비교하여 수행된다. 본원에서 사용된 것과 같은 "비교창"은 폴리뉴클레오티드 서열이 20개 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 참조 서열과 비교될 수 있고, 또한 두 서열의 최적의 배열을 위해 비교창 중의 폴리뉴크레오티드 서열의 일부가 참조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않은 것)과 비교하여 20% 이하의 첨가 또는 결실을 포함할 수 있는, 20개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 위치의 개념적 세그먼트를 말한다.

비교창을 정렬시키기 위한 최적의 서열 배열은 스미스&워터맨 (Smith&Wterman) (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981l 본원에 인용문헌으로 삽입되었음)의 국부적 상동 연산, 니들맨&운쉬(Needlman&Wunsch)(J.Mol.Biol. 48:443, 1970l 본원에 인용문헌으로 삽입되었음), 피어슨&립맨 (Pearson&Lipman)의 유사성 조사 방법 (Proc.Natl.Sci.USA 85:2444, 1988; 본원에 인용문헌으로 삽입되었음), 이들 연산의 컴퓨터처리된 구현(위스콘신 매디슨 소재의 Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. 중 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 정밀 검사에 의해 수행될 수 있고, 다양한 방법에 의해 생성된 최상의 배열(즉, 비교창에서 가장 높은%의 서열 유사성을 만드는)이 선택된다. "서열 동일성"이란 용어는 비교창에서 두 뉴클레오티드 서열이 동일하다(즉, 뉴클레오티드-대 뉴클레오티드 기준으로)는 것을 의미한다. "서열 동일성의 %"는 비교창에서 최적으로 배열된 두 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, U, 또는 I)가 두 서열에서 나타나서 매칭된 위치 수효를 만드는 위치 수를 결정하고, 매칭된 위치 수를 비교창 내의 총 위치 수(즉, 창 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 생성하여 게산한다. 본원에서 사용된 "상당한 동일성"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 서열의 특성을 나타내고, 여기서 20개 이상의 뉴클레오티드 위치의, 흔히 25-50개 이상의 뉴클레오티드의 비교창에서 참조 서열과 비교하여, 폴리뉴클레오티드가 85%이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90 내지 95%의 서열 동일성, 보다 일반적으로는 99%의 서열 동일성 가지며, 여기서 서열 동일성의 %는 비교창에서 그 합계가 참조 서열의 20% 이하가 되는 결실 또는 첨가를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 참조 서열과 비교하여 게산된다.

이들 폴리뉴클레오티드 서열의 연관성과 아울러, 본 발명의 재조합 PIV에 의해 코딩되는 단백질 및 단백질 영역은 또한 일반적으로 보존적 연관성을 갖도록, 즉, 선택된 참조 폴리뉴클레오티드와 상당한 서열 동일성 또는 서열 유사성을 갖도록 선택된다. 폴리펩티드에 적용되는 것처럼, "서열 동일성"이란 용어는 펩티드가 상응하는 위치에서 동일한 아미노산을 공유한다는 것을 의미한다. "서열 유사성"이란 용어는 펩티드가 상응하는 위치에서 동일 또는 유사한 아미노산(즉, 보존적 치환)을 갖는다는 것을 의미한다. "상당한 서열 동일성"이란 용어는 디폴트 갭 가중치를 사용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT와 같은 것에 의해 최적으로 배열되었을 때, 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직 하게는 95% 이상의 서열 동일성 또는 그 이상(예를 들어, 99%의 서열 동일성)을 공유한다. "상당한 유사성"이란 용어는 두 펩티드 서열이 유사한%의 서열 유사성을 공유한다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에서 다르다. 보존적 아미노산 치환이란 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 교환가능성을 말한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신이고, 지방족-히드록시 측쇄를 갖는 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이고, 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산군은 아르파라긴 및 글루타민이고, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산군은 아스파라긴 및 글루타민이고, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판이고, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산군은 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이고, 황 함유기를 함유하는 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환군은 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에서 사용된 20개의 천연에 존재하는 아미노산에 대한 약자는 통상의 관습을 따랐다(Immunol-A Synthesis, 2nd ed., E. S. Golub & D.R. Gren, eds, Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991, 본원에 인용문헌으로 삽입되었음). 또한, 20개의 통상의 아미노산, α,α-이치환된 아미노산과 같은 비자연적인 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산, 및 다른 통상적이지 않은 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산)이 본 발명의 폴리펩티드의 적합한 성분일 수 있다. 통상적이지 않은 아미노산의 예는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N, N, N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시라이신, ω-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-히드록시프롤린)을 포함한다. 아울러, 아미노산은 당화, 인산화 등에 의해 변이될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 후보를 선택하기 위해, 생육성, 약독화, 및 면역원성 표준이 잘 알려진 방법에 따라 결정된다. 본 발명의 백신에서 가장 요구되는 바이러스는 생육성을 유지해야 하고, 안정한 약독화 표현형을 가져야 하며, 면역화된 숙주에서 복제를 나타내야하고(비록 낮은 수준이라도), 또한 야생형 바이러스로부터의 후속 감염에 의해 발생되는 심각한 질환에 대한 방어를 부여하기에 충분한 백신에서의 면역 반응의 생성을 효과적으로 유발할 수 있어야 한다. 본 발명의 재조합 PIV는 생육성일뿐 아니라 종전의 백신 후보보다 보다 적절하게 약독화되었으나, 생체내에서 보다 유전적으로 안정하다(방어성 면역 반응을 자극할 수 있는 능력을 유지하고, 또한 어떤 경우에는 다수의 변이에 의해 제공된 방어를 확장할 수 있고, (예를 들어 상이한 바이러스 균주 또는 아군에 대한 방어를 유도함), 또는 상이한 면역학적 기초에 의한 방어를 확장할 수 있다(예를 들어, 분비성 면역글로빈 대 혈청 면역글로빈, 세포성 면역 등)

본 발명의 재조합 PIV는 백신 사용을 위해 적절한 약독화, 표현형 복귀 돌연변이에 대한 내성, 및 면역원성을 확인하기 위해 일반적으로 채택되고 잘 알려진 시험관내 및 생체내 모델에서 시험될 수 있다. 시험관내 분석에서, 변이된 바이러스(예를 들어, 여러번 약독화되고, 생물학적으로 유도된 또는 재조합 PIV)가 예를 들어, 복제 수준, 바이러스 복제의 온도 감수성, 즉 ts 표현형, 및 작은 플라크 또 는 다른 목적하는 표현형에 대해 시험된다. 변이된 바이러스는 PIV 감염의 동물 모델에서 추가로 시험된다. 다양한 동물 모델이 기술되었고, 본원에 삽입된 다양한 인용 문헌에서 요약된다. 설치류 및 비사람 영장류를 포함하는, PIV 백신 후보의 약독화 및 면역원 활성을 평가하기 위한 PIV 모델 시스템은 당업계에서 널리 채택되었고, 이들로부터 얻은 데이타는 사람에서의 PIV 감염, 약독화 및 면역원성과 잘 일치한다.

상기 기술과 일치하여, 본 발명은 또한 백신 용도를 위한 단리된 감염성 재조합 PIV 바이러스 조성물을 제공한다. 백신 성분인 약독화된 바이러스는 단리되었으며, 또한 일반적으로 정제된 형태이다. "단리된"이란 감염된 개체의 비인강과 같은 야생형 바이러스의 천연 환경이 아닌 상태의 PIV를 의미한다. 보다 일반적으로, 단리된이란 조절된 설정으로 증식할 수 있고 특성 분석될 수 있는 세포 배양물 또는 다른 인공적 배지의 성분으로서 약독화된 바이러스를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 약독화된 PIV는 감염된 세포 배양물에 의해 생산되고, 세포 배양물로부터 분리되고, 안정화제에 첨가될 수 있다.

백신 용도를 위해, 본 발명에 따라 제조된 재조합 PIV는 백신 제제 중에서 직접적으로 사용될 수 있거나, 바란다면, 당업자에게 잘 알려진 동결 건조 프로토콜을 사용하여 동결 건조될 수 있다. 동결 건조된 바이러스는 일반적으로 약 4℃에서 유지될 것이다. 사용할 준비가 되었을 때, 동결 건조된 바이러스는 하기에서 더 기술되는 것과 같이, 애주번트와 함께 또는 애주번트 없이, 안정화제 용액, 예 를 들어 식염수 또는 SPG, Mg⁺⁺ 및 HEPES 중에서 재구성된다.

본 발명의 PIV 백신은 본원에서 기술된 대로 제조된 면역원적으로 효과적인 양의 PIV를 활성 성분으로 함유한다. 변형된 바이러스는 생리학적으로 허용되는 담체 및(또는) 애주번트와 함께 숙주 중으로 도입될 수 있다. 유용한 담체는 당업계에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, 물, 완충된 물, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 하알루론 산 등을 포함한다. 생성된 수용액은 그 용도를 위해 패키지되거나, 동결건조될 수 있고, 동결 건조된 제조물은 상기에서 언급한 것과 같이, 투여 전에 멸균된 용액과 합쳐질 수 있다. 조성물은 pH 조정 및 완충제, 삼투성 조정제, 습윤제 등, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 젖산 나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등과 같은, 적절한 생리적 조건에 요구되는 제약학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 허용되는 애주번트는 당업계에서 잘 알려진 많은 다른 애주번트 중에서 불완전 프로인트 애주번트, MRL TM(3-o-디아실화된 모노포스포릴 리미드 A; 몬타나주 해밀튼 소재의 RIBI 이뮤노켐 리서치, 인크(RIBI ImmunoChem Researhc, Inc.) 및 IL-12(매사츄세츠주 캠브리지 소재, 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute))를 포함한다. 본원에서 기술된 대로 PVI 조성물로 면역화한 후, 에어로졸, 비말, 경구, 국부적 또는 다른 경로로 숙주의 면역 시스템이 PIV 바이러스 단백질, 예를 들어, F 및 HN 당단백질에 특이적인 항체를 제조함으로써 백신에 반응한다. 본원에서 기술한 대로 제조된 PIV의 면역원적으로 효과적인 양으로 백신 접종한 결과, 숙주는 PIV 감염에 대해 최소한 부분적으로 또는 완전히 면역이 되었거나, 또는 심하지 않은 또는 심각한 PIV 감염의 발현에 내성이 된다.

백신이 투여되는 숙주는 PIV 또는 밀접한 관련이 있는 바이러스에 감염되기 쉬운 모든 포유류일 수 있으며, 이 숙주는 백신 균주의 항원에 대해 방어성 면역 반응을 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 사람 및 수의학적 용도를 위한 백신을 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 PIV를 함유하는 백신 조성물은 숙주 자체의 면역 반응 능력을 상승시키기 위해 PIV에 감염되기 쉽거나 또는 감염될 위험이 있는 숙주에 투여된다. 이 같은 양은 "면역원적으로 효과적인 양"으로 정의된다. 이 용도에서, 효과적인 양 내에서 투여되어야 하는 정확한 PIV 양은 숙주의 건강 상태 및 체중, 투여 방식, 제제의 성질 등에 의존할 것이나, 일반적으로 숙주 당 약 10³ 내지 10⁷ 플라크 형성 단위(PFU) 또는 그 이상의 바이러스, 보다 흔히 숙주 당 10⁴ 내지 10⁶ PFU의 범위일 것이다. 어떠한 경우에서든, 백신 제제는 심각하거나 또는 생명을 위협하는 PIV 감염에 대해 숙주 환자를 효과적으로 방어하기에 충분한 본 발명의 변이된 PIV의 양을 제공해야 한다.

본 발명에 따라 제조된 PIV는 다수의 PIV 혈청형 또는 균주에 대한 방어를 달성하기 위해 다른 PIV 혈청형의 바이러스와 함께 결합될 수 있다. 별법으로, 다수의 PIV 혈청형 또는 균주에 대한 방어는 본원에서 기술된 대로 한 바이러스 중으로 엔지니어링된 다수의 혈청형 또는 균주의 방어성 에피토프를 결합하여 달성될 수 있다. 일반적으로, 상이한 바이러스가 투여되었을 때, 이들은 혼합물일 수 있으며, 동시에 투여될 수 있으나, 또한 이들은 개별적으로 투여될 수도 있다. 한 균주에 의한 면역화는 동일하거나 또는 상이한 혈청형의 상이한 균주를 방어할 수 있다. 어떤 경우, 본 발명의 PIV 백신을 다른 병인, 특히 다른 유아기 바이러스에 대해 방어성 반응을 유도하는 백신과 함께 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 다른 일면에서, 본원에서 기술한 것과 같이, 감염성 PIV를 제조하기 위해 사용되는 PIV 게놈 또는 안티게놈 중으로 이들 방어성 항원을 코딩하는 서열을 도입하함으로써, PIV는 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 또는 홍역 바이러스와 같은 다른 병원체의 방어성 항원에 대한 벡터로 사용될 수 있다(예를 들어, 머피 등의 미국 가특허출원 제60/170,195호(1999. 12. 10. 출원) 참조; 본원에 인용문헌으로 삽입되었음).

모든 피검체에서, 정확한 양의 재조합 PIV 백신이 투여되고, 투여 시간 및 반복은 환자의 건강 상태 및 체중, 투여 방식, 제제의 성질 등에 기초하여 결정될 것이다. 투여량은 일반적으로 숙주 당 약 10³ 내지 10⁷ 플라크 형성 단위(PFU) 또는 그 이상의 바이러스, 보다 흔히 숙주 당 10⁴ 내지 10⁶ PFU의 범위일 것이다. 어떤 경우에도, 다른 방법들 중에서 보체 고정, 플라크 중성화 및(또는) 효소 연결된 면역흡착 분석에 의해 측정될 수 있는 것과 같이, 면역 제제는 항 PIV 면역 반응을 효과적으로 자극하거나 또는 유도하기에 충분한 약독화된 PIV 양을 제공해야 한다. 이러한 점에서, 개체는 또한 상부 호흡기 질환의 신호 및 증상이 모니터링된다. 레서스 원숭이에 대한 투여와 같이, 백신의 약독화된 바이러스는 야생형 바이러스 보다 약 10배 또는 그 보다 낮은 수준으로, 또는 불완전하게 약독화된 PIV 수준에 비교하였을 때 10배 또는 그 보다 낮은 수준으로 백신 투여체의 비인강에서 성장한다.

신생아 및 영아에서, 충분한 수준의 면역을 유발하기 위해 다수의 투여가 요구될 수 있다. 투여는 출생 후 첫달 내에 시작되야 하고, 천연(야생형) PIV 감염에 대해 충분한 수준의 방어를 유지하기 위해 필요한 대로, 2달, 6달, 1년 및 2년과 같은 간격으로 투여된다. 유사하게, 건강 간호 종사자, 일일 간호 종사자, 어린 아이가 있는 가족의 구성원, 노인, 손상된 심폐(心肺) 기능을 갖는 개체와 같이 반족된 또는 심각한 PIV 감염에 특히 감염되기 쉬운 성인은 방어성 면역 반응을 확립하고(또한) 유지하기 위해 다수의 예방접종을 요구할 수 있다. 유도된 면역 수준은 중화 분비성 및 혈청 항체, 및 조정된 투여량의 양 또는 목적하는 방어 수준을 유지하기 위해 필요한 반복된 백신 접종를 측정하여 모니터링될 수 있다. 아울러, 상이한 백신 바이러스가 상이한 수용체 군에 대해 투여하기 위해 필요할 수 있다. 예를 들어, 사이토카인 또는 T 세포 에피토즈 중에 풍부한 추가 단백질을 발현하는 엔지니어링된 PIV 균주는 특이 아동보다는 성인에게 특히 유리할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 PIV 백신은 다수의 PIV 아군 또는 균주에 대한 방어를 달성하기 위해서 PIV의 다른 아군 또는 균주의 항원을 발현하는 바이러스와 결합될 수 있다. 별법으로, 백신 바이러스는 본원에서 기술된 대로, 한 PIV 클론 중으로 엔지니어링된 다수의 PIV 균주 또는 아군의 방어성 에피토프를 함입할 수 있 다.

본 발명의 PIV 백신은 개체가 이후 야생형 PIV에 의해 감염되었을 때, 폐렴 및 세기관지염과 같은 심각한 하부 호흡기도 질환에 대해 방어적인 면역 반응의 생성을 유발한다. 자연적으로 순환하는 바이러스가 특히 상부 호흡 기도에서 감염을 일으킬 수 있지만, 추후 야생형 바이러스에 의함 감염에 의한 백신 접종 및 가능한 내성 부스팅의 결과로 비염 가능성이 상당히 감소된다. 백신 접종 후, 시험관내 및 생체내에서 상동 (동일한 아군의) 야생형 바이러스를 중성화시킬 수 있는 탐지될 정도의 수준의 숙주에 의해 생성된 혈청 및 분비 항체가 있다. 많은 경우, 숙주 항체는 또한 상이한 비백신 아군의 야생형 바이러스를 중헝화시킬 것이다.

본 발명의 바람직한 PIV 백신 후보는 사람에서 자연적으로 순환하는 야생형 바이러스와 비교했을 때, 독성의 상당한 감소를 나타낸다. 가장 면역화된 개체에서 감염 증상이 일어나지 않도록, 바이러스는 충분히 약독화된다. 어떤 경우, 약독화된 바이러스는 예방 접종되지 않은 개체 중으로 여젼히 감염될 수 있다. 그러나, 예방 접종되거나 또는 우발적인 숙주에서 심각한 하부 호흡 기도 감염이 일어나지 않도록 그 독성은 충분히 제거된다.

PIV 백신 후보의 약독화 수준은 예를 들어, 면역화된 숙주의 호흡기도에 존재하는 바이러스의 양을 정량하고, 그 양을 야생형 PIV 또는 후보 백신 균주로 평가된 다른 약독화된 PIV에 의해 생성된 양과 비교함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약독화된 바이러스는 침팬치, 또는 레서스 원숭이와 같은 매우 감염되기 쉬운 숙주의 상부 호흡기도에서 야생형 바이러서의 복제 수준과 비교하여, 예를 들어, 10 내지 1,000배 미만의 매우 큰 수준의 복제 제한을 가질 것이다. 상부 호흡기도에서의 바이러스 복제와 연관된 콧물이 나타나는 현상을 더 감소시키기 위해, 이상적인 백신 후보 바이러스는 상부 및 하부 호흡기도 양쪽에서 제한된 수준의 복제를 나타내야 한다. 그러가, 본 발명의 약독화된 바이러스는 백신 접종된 개체에서 방어를 부여하기 위해, 충분히 감염성이어야 하며 또한 면역원성이어햐 한다. 감염된 숙주의 비인강 중의 PIV 수준을 측정하기 위한 방법은 문헌 중에 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명의 백신에 의해 제공되는 유도된 면역성 수준은 중하성 분비 및 혈청 항체의 양을 측정하여 모니터링될 수 있다. 이들 측정에 기초하여, 목적하는 방어 수준을 유지하기 위해 백신 투여량이 조정될 수 있거나, 또는 필요한 만큼 백신 접종이 반복될 수 있다. 아울러, 상이한 백신 바이러스는 상이한 수용체 군에 대해 유익할 수 있다. 예를 들어, T 세포 에피토프에 풍부한 추가 단백질을 발현하는 엔지니어링된 PIV 균주는 특히 영아보다는 성인에게 유익할 수 있다.

본 발명의 다른 일면에서, PIV는 호흡기도의 일시적인 유전자 치료를 위한 벡터로 사용된다. 이 실시태양에 따라, 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈은 목적하는 유전자 생성물을 코딩할 수 있는 서열을 도입한다. 목적하는 유전자 생성물은 PIV 발현을 조절하는 동일하거나 또는 상이한 프로모터 조절 하에 있다. PIV 게놈 또는 안티게놈과 N, P, L 및 다른 목적하는 PIV 단백질을 공동발현시켜 제조되었으며, 목적하는 유전자 생성물을 코딩하는 서열을 함유하는 감염성 PIV 생성물이 환자에 투여된다. 투여는 일반적으로 에어로졸, 분무기, 또는 치료 중의 환자의 호흡 기도에 대한 다른 국부적인 도포이다. 재조합 PIV는 목적하는 유전자 생성물의 치료적 또는 예방적 수준의 발현을 일으키기에 충분한 양으로 투여된다. 이 방법으로 투여될 수 있는 대표적인 유전자 생성물은 바람직하게는 일시적 발현에 충분한 것으로, 예를 들어 인터루틴-2, 인터루킨-4, 감마-인터페론, GM-CSF, G-CSF, 에리트로포이에틴, 및 다른 사이토카인, 글루코세레브로사이드, 페닐알라닌 수산화효소, 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절제(CFTR), 하이포잔틴-구아닌 포스포라이보실 전달효소, 세포독소, 종양 억제 유전자, 안티센스 RNA들, 및 백신 항원들을 포함한다.

하기 실시예들은 제한이 아니라, 예시로 주어진 것이다.

실시예 I

키메라 HPIV3/BPIV3 안티게놈을 코딩하는 cDNA의 제조 및 감염성 바이러스의 회수

하기 세 실시예는 BPIV3의 단백질 중 어느 것이 영장류에서 그 숙주 범위 제한에 기여하는지 확인하는 연구를 증거로 입증한다. 이들 방법을 설명하기 위해, 야생형 HPIV3의 N 단백질은 BPIV3의 그 대응물로 대체되었다. 이 교환은 상기에서 기술된 것과 같은 cDNA로부터 감염성 PIV의 회수를 위한 역유전학 (reverse genetics) 시스템을 사용하여 달성되었다. 이 연구는 BPIV3의 N 유전자로부터 개시되었는데, 이는 이 단백질이 다른 HPIV3 및 BPIV3 단백질들에 비교하여 HPIV3의 그 대응물과 중간 정도 수준의 아미노산 서열 차이를 가지기 때문이다 (실시예 1 참조).

키메라 재조합 바이러스는 HPIV3의 JS 균주의 N ORF가 BPIV3의 Ka 또는 SF 균주의 N ORF로 대체되어 제조된다 (도 1). 이들 키메라 바이러스는 HPIV3 부모형의 HN 및 F 당단백질을 보유하며, 영장류에서 HPIV3에 대한 높은 수준의 면역을 유도한다. 두 키메라 바이러스는 성공적으로 회수되었다. 양자는 세포 배양물에서 높은 역가로 성장하고, 또한 양자는 레서스 원숭에서 약독화된 것으로 밝혀졌다. 따라서, N 단백질은 BPIV3의 숙주 범위 표현형에 기여하는 예시적인 단백질로 확인되었다. Ka 또는 SF 키메라 재조합 바이러스 중 하나에 의한 레서스 원숭이의 면역화는 야생형 감염으로 사용된 HPIV3의 복제에 대한 높은 수준의 내성을 유도한다.

따라서, 본 발명은 BPIV3의 숙주 범위 약독화 성질 및 HPIV3 HN 및 F 방어성 작용 물질의 면역원성을 결합한 키메라 사람-소 PIV 바이러스을 생성하기 위한 역유전학 방법의 유용성을 확립한다. 이러한 키메라 재조합체으로 사람을 면역화하는 것은 종전에 사람에서 관찰된 BPIV3 백신의 부적절한 면역원성의 문제를 감소시킬 것이다.

BPIV3의 Ka 또는 SF 균주 각각에 대한 전체 콘센서스(consensus) 뉴클레오티트 서열은 비리온 RNA로부터 생성된 RT-PCR 생성물로부터 결정되었다. 이들 서열은 도 6A-6G 및 도 7A-7G에 나타나 있다. 총 15456개 뉴클레오티드(nt)의 BPIV3 Ka의 안티게놈 RNA를 코딩하는 cDNA가 도 6A-6G에 나타나있다. (진뱅크 접수 번호 #AF 178654 참조). BPIV3 캔사스(kansas) 균주에 대한 진뱅크 서열은 전형적인 cDNA의 서열과 뉴클레오티드 21 번과 23번에 있어서 다르다. 공개된 서열과 전형적 인 cDNA의 서열 양자는 캔사스 바이러스 균주에서 비슷한 빈도로 자연적으로 나타난다. 이 예에서 사용한 cDNA는 뉴클레오티드 18번에서 시작되는 ACTGGTT 서열(SEQ ID NO. 1)을 포함하고 있으나, 이에 대응되는 공개된 서열(진뱅크 접수 번호 #AF178654; 도 6A-6G, SEQ ID NO. 22)은 ACTTGCT로 읽힌다(21번과 23번의 다른 염기들은 밑줄로 표시되어있다.).

Ka 및 SF BPIV3 균주에 대한 콘센서스 서열을 구성하기 위해 비리온 RNA를 슈퍼스크립트 II 프리앰플리피케이션 시스템 (Superscript II Preamplification System) (매릴랜드주 개티스버그 소재 라이프 테크놀로지스사)과 200 ng의 랜덤 헥사머 프라이머(6개 뉴크레오티드로 이루어진 무작위적인 서열을 가진 프라이머)를 이용해 역전사 반응을 수행하였다. 얻어진 염기사슬 상에서 어드밴티지 cDNA PCR 키트 (캘리포니아주 팔로 알토 소재 클론테크 래버러토리)을 이용해 PCR을 실행하였다. Ka 및 SF의 게놈은 각각 3개 내지 4개의 겹치는 단편들로부터, 이전에 공표된 파라믹소바이러스의 서열들 간에 보존되어 있는 RNA 부분에 상동인 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 각각의 프라이머 쌍은 증폭의 대상이 되는 서열에 없고 매칭하는 제한효소 부위를 포함하도록 제조하였다.

각각의 앰플리콘(amplicon)을 위한 별개의 랜덤 라이브러리는 PCR 산물들을 적절한 제한효소로 절단한 후 겔로부터 정제하고 탠덤 배열이 되도록 연결 시킨후, 초음파를 처리하여 제조하였다. 랜덤 라이브러리는 이렇게 얻어진 잘라진 cDNA 풀에서 약 500 염기쌍 정도 크기의 일부를 M 13에 클로닝하여 제조하였다. 삽입된 cDNA의 서열은 택 다이 디옥시 터미네이터 사이클 키트(Taq DYE Deoxy Terminator cycle sequencing kit) (캘리포니아주 포스터 시티 소재 ABI)를 이용한 자동화 DNA 시퀀싱을 통해 결정하였다. 각각의 본래의 큰 RT-PCR 단편에 대해 연속 서열(인접)을 어셈블하고, 각각의 뉴클레오티드 위치를 최소 3개의 독립적인 M13 클론으로 확인하였다. Ka 및 SF의 5' 및 3'말단 게놈 서열은 래피드 앰플리피케이션 오프 cDNA 엔드 (Rapid Amplification of cDNA Ends) (매릴랜드주 게티스버그 소재 라이프 테크놀로지스사)을 이용해 cDNA로 전환하였고 자동화 시퀀싱으로 그 서열을 분석하였다.

이들 서열은 Ka의 경우 도 6A-6G에, SF의 경우 도 7A-7G에 각각 나타나 있다. 이 서열의 분석은 다음과 같은 각각의 단백질에 대해서 HPIV3 와 BPIV3의 사이의 % 아미노산성을 밝혔다.: N (86%), P (65%), M (93%), F (83%), HN (77%), 그리고 L (91%). 따라서 서열 분기는 많은 유전자에 걸쳐 분포되어 있음이 밝혀졌다. 두 바이러스의 N 유전자의 추정된 아미노산 서열은 Ka의 경우 진뱅크 #Afl 78654 에, SF의 경우 #AF178655에 나타나다(포함되어 있지 않다). BPIV3 게놈에서 N ORF 위치는 각각의 진뱅크 보고들에 표시되어 있으며 인용 문헌에 포함되어 있다. 하기 예에서 Ka 와 SF 바이러스의 N ORF는 HPIV3 바이러스의 상응하는 유전자를 대체하기 위해 초기에 선택되었다. 이는 N 유전자가 HPIV3 와 BPIV3의 6개 단백질중에 중간정도의 서열 분기를 보이기 때문이다. 이 연구에서는 3' 또는 5' 비코딩 N 유전자 서열이 아니라 N ORF가 교환되었고, 이는 cKa 및 cSF의 약독화형 표현형이 N 유전자에 의해 코딩된 단백질에 의해 나타나는 것임을 확증할 수 있도록 하였다.

사람-소 키메라 PIV3의 게놈은 BPIV3 Ka SF N 코딩 영역을 HPIV3의 대응 물의 대체물로 HPIV3의 (+) 센스 안티게놈 RNA의 전체 카피를 코딩하는 rJS cDNA p3/7 (131) 2G 에 도입하여 제조하였다 (인용 문헌 Durbin et al., 1997a, 상기 참조; Hoffman et al., 1997, 상기 참조; Skiadopoulos et al., 1998, 상기 참조; 미국 특허출원 제09/083,793호, 1998. 5. 22. 출원; 미국 가특허 출원 제 60/047,575호, 1997. 5. 23. 출원 (국제 공개 WO 제98/53078호에 대응), 및 미국 가특허 출원 제60/059,385호, 1997. 9. 19. 출원; 각각은 본원에 인용 문헌으로 포함되었다.).

플랭킹 서열과 함께 BPIV3 및 HPIV3 N 유전자 코딩 영역은 먼저 서브클로닝 된 후 N ORF만을 교환하기 위해 추가로 변이시켰다. HPIV3 의 N 유전자를 가지고 있는 pUC 119JSN 및 BPIV3 N Ka 또는 SF 유전자를 가지고 있는 플라스미드(pBSKaN 및 pBSSFN)들을 쿤켈(Kunkel)에 의한 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492,1985, 인용 문헌에 포함)으로 돌연변이 유발 처리하여 Ncol 및 AflII 제한효소 인지 부위를 각각 전사 시작부위와 정지 부위에 삽입하였다(도 1A). 19KaN-Ncol/AflII을 Ncol 및 AflII로 절단한 후, Ncol/AflII 단편으로 BPIV3 의 N 단백질 코딩 영역을 pUCI119JSN-Ncol/AflII 중으로 HPIV3의 N 코딩 영역에 대한 대체물로 도입하였다(도 1B). HPIV3 의 3'및 5' 비코딩 서열들 및 BPIV3 ORF 함유하는 키메라 N 유전자를 특정 부분 돌연변이 유도를 통해 본래의 HPIV3 유전자 비코딩 서열과 BPIV3 코딩 서열을 회복하도록 변형하였다. 이 키메라 N 유전자는 pLeft - rJS 안티게놈의 5'쪽 절반 중으로 HPIV3 서열에 상응하는 부위(도 2A 및 2B)에 사람의 서열에 존재하는 MIul 및 EcoRI 부위를 이용해 치환 삽입하였다. 각각의 경우에 동 일한 방법으로 SF N ORF에 대해 수행하였다. 키메라 pLeft 플라스미드는 3' 말단에서 델타 라이보자임 및 T7 전사 터미네이터로 플랭킹된 rJS 안티게놈의 3'쪽 절반을 가지고 있는 pRight의 Xhol/NgoMl 단편과 조합되었다(도 2). 생성된 키메라 PIV3 플라스미드는 pB/HPIV3NKa 또는 pB/HPIV3NSF라고 명명되었으며 N ORF가 BPIV3 Ka 또는 SF N 단백질을 코딩하는 전장 rJS 안티게놈을 함유한다.

키메라 안티게놈 HPIV3/BPIV3 cDNA 는 개별적으로 6-웰 플레이트에서 충분히 자란, 앞서 기술된 두 개의 지지 플라스미드-pTM (P no C) 및 pTM (L), 리포펙테이스 (Lipofectace) (매릴랜드주 게티스버그 소재 라이프 테크놀로지스사)를 가지고 있는 HEp-2 세포 중으로 트랜스펙트시켰다. 앞서 기술한 바와 같이, 박테리오파지 T7 RNA 중합효소(MVA-T7)를 발현하는 변이된 백시니아 바이러스 재조합체를 감염시켰다(Durbin et al., Virology 234: 74-83,1997b). 안티게놈 플라스미드가 충분한 양의 N 단백질을 발현하므로 이전의 실험에 사용된 N 지지 플라스미드는 사용하지 않았다. 배양을 32 ℃에서 3.5일간 LLC-MK2 세포에서 유지하였으며, 그 후 상등액을 수집하고, LLC-MK2 세포 중에 계대 배양하고, 플라크를 3차례에 걸쳐 정제하였다.

트랜스펙션에서 회수된 사람 PIV3 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 및 BIPV3 의 N 단백질을 도입시키는 키메라 바이러스(rHPIV3-N_B 키메라 재조합체라고 명명된, 보다 구체적으로는 "cKa" 및 "cSF" 키메라 바이러스라고 명명됨)의 정체는, 세 번 플라크로부터 정제한 바이러스를 증폭시킨 후, 단리된 비리온 RNA로부터 시작 및 정지 코돈의 영역을 함유한 RT-PCR 산물을 시퀀싱해서 확인하였다(도 3).

이 증폭된 생성물 및 이에 상응하는 증폭된 HPIV3 rJS 와 BPIV3 Ka 또는 SF의 서열을 TaqI으로 절단 처리하여 cKa 및 cSF 바이러스의 키메라 정체를 확인하였다(도 4). TaqI 절단 프로파일은 3 개의 부모형 및 2개의 키메라 바이러스에 대해 전혀 다르며, 각각의 부모형 프로파일은 특징적인 크기의 TaqI 단편을 포함하며, 키메라 바이러스에 대한 rJS, Ka 및 SF 부모형 서열의 기여도를 확인할 수 있게 한다. 회수된 cKa 및 cSF 키메라 재조합체 각각은 설계된 대로 예상 서열을 함유하였다.

실시예 2

세포 배양에서의 HPIV3/BPIV3 키메라 바이러스의 복제

조직 배양 세포 중에서 생약독화된 생 바이러스 백신의 효과적인 복제는 본 발명의 사람-소 키메라 바이러스의 특징이며, 이는 재조합 백신 물질의 효율적인 제조를 허용한다. 소 세포주(MDBK) 및 시미안 세포주(LLC-MK2)에서의 rJS 부모형및 cKa, Ka 부모형, cSF, SF 부모형의 여러주기 복제는 앞서 기술한 대로, 세포를 감염다중도 (multiplicity of infection) 0.01로 세포를 감염시키고 5일에 걸쳐서 (Tao et al., 1998, 상기 참조, 본원에 인용문헌으로 포함됨) 샘플을 수집하여 (3번 반복) 결정하였다(도 5).

키메라 바이러스는 양쪽 세포주에서 이들 사람 또는 소 부모형 바이러스와 같이 현저한 복제 지연이나 획득된 바이러스 역가의 현저한 감소 없이 효과적으로 복제하였다. 각각의 경우에, 키메라 바이러스는 현재 사람 임상 시험에서 사용되고 있는 사람 또는 소의 PIV 생약독화 백신 10^4.0 또는 10^5.0 투여량을 상회하는 10^7.0TCID₅₀/ml 이상으로 복제한다(Karron et al., 1996, 상기 참조; Karron et al., 1995a, 상기 참조; 및 Karron et al., 1995b, 상기 참조).

실시예3

레서스 원숭이에서 HPIV3/BPIV3 키메라 바이러스의 약독화 및 방어 효율의평가

SF 와 Ka BPIV3 양자 모두 레서스 원숭이의 상부 및 하부 호흡 기도에서 약독화된다(van Wyke Coelingh et al., 1988, 상기 참조). 매우 감염되기 쉬운 혈청 음성인 영아 또는 아이들의 상부 호흡 기도에서 Ka가 매우 제한적으로 복제하는 것에서 볼 수 있듯이 약독화 표현형은 사람에서의 약독화와 관련이 있다(Karron et al., 1995a, 상기 참조). BPIV3에 감염된 백신 처리군에서 기침, 위막성 후두염, 세기관지염 또는 폐렴 등이 없다는 것은 Ka BPIV3가 하부 호흡 기도에서도 역시 약독화되었음을 보여준다. 따라서 PIV 백신 바이러스 후보의 약독화 및 야생형 PIV감염에 대한 방어력을 평가하기 위해서, 레서스 원숭이는 합리적으로 상관성이 있는 모델로 인정된다.

rJS, cKa, Ka 부모형, cSF, 및 SF 부모형은 비강내 또는 기관내로, 부위 당 10^5.0TCID₅₀ 투여양으로 레서스 원숭이에 투여하였다. 이전에 기술된 방법을 사용하여, 상부 호흡 기도(비인두의 면봉 표본) 및 하부 호흡 기도(기관 세척 표본)을 얻고 LLC-MK2 세포에서 바이러스 역가를 결정하여 복제를 모니터링하였다(Hall et al., 1992, 상기 참조).

cKa 및 cSF 재조합체는 상부 호흡 기도에서 현저히 약독화되어(표 1) rJS HPIV3 부모형에 비해 평균 최고 바이러스 역가에서 각각, 63배 또는 32 배의 감소를 나타냈다. cKa 및 cSF는 모두 하부 호흡 기도에서도 약독화되었지만, 이 수준의 차이는 cSF에 대해서만 통계적으로 중요하다. 하부 호흡 기도에서 rJS의 낮은 복제는 이 부위에서의 약독화 표현형으로 인해 보다 제한적으로 일어나는 복제를 통계적으로 의미있는 형태로 보여주기 힘들게 한다.

<표 1>레서스 원숭이의 상부 및 하부 호흡 기도에서 cKa 및 cSF의 복제는 HPIV3에 비해 제한된다.

바이러스 복제
면역화 바이러스	동물의 수	평균 역가 Log10TCID50/ml ±표준 오차 [던칸(Duncan) 그룹화]2				평균 피크 역가 Log10TCID50/ml ±표준 오차[던칸 그룹화]
		비인강		기관		비인강	기관
		6일	7일	4일	6일
		rJS	4	5.3±0.59[A]	3.9±0.36[A]	1.7±0.45[A]	1.7±0.29[A]	5.3±0.59[A]	2.5±0.51[A]
cKa	4	3.0±0.58[B]	2.9±0.42[AB]	1.5±0.40[A]	1.0±0.19[A]	3.5±0.54[B]	1.5±0.18[AB]
Ka	4	2.0±0.27[B]	2.4±0.30[B]	1.3±0.26[A]1.3	1.3±0.21[A]	2.5±0.30[B]	1.6±0.15[AB]
cSF	4	3.3±0.40[B]	3.7±0.57[A]	1.1±0.25[A]	1.1±0.2 [A]	3.8±0.46[B]	1.4±0.26[B]
SF	4	2.8±0.48[B]	2.6±0.40[AB]	1.6±0.46[A]	1.5±0.40[A]	3.3±0.28[B]	1.8±0.41[AB]

¹ 원숭이는 비강내로 및 기관내로 각각의 부위에서 10^5.0TCID₅₀/1ml을 접종받았다.

² 각각의 열에서, 평균 바이러스 역가는 던칸 다중 범위 시험을 사용하여 통계적으로 유사한 군(문자로 나타냄)에 할당되었다 (α=0.05). 상이한 문자를 갖는 각각의 열에서 평균 역가는 통계적으로 상이하다.

각각의 키메라 바이러스 cKa 및 cSF의 복제 수준은 키메라 바이러스 각각이 상부 호흡 기도에서 BPIV3 부모형보다 다소 잘 복제하기는 했지만, 소 바이러스 부모형에 비해 상부 및 하부 호흡 기도에서 크게 다르지 않았다. 따라서, rJS HPIV3 에 의한 Ka 또는 SF BPIV3 중 어느 하나의 N 유전자의 획득은 사람 바이러스를 BPIV3 부모형과 유사한 수준으로 레서스 원숭이에 대해 약독화시킨다. HPIV3/BPIV3 키메라 재조합체는 시험관내 조직 배양 세포에서는 효과적으로 복제하므로, 두 소 부모형 바이러스에 의해 나타나는 숙주 범위 제한적인 복제 형질은 N ORF에 의해 HPIV3로 옮겨졌다는 것이 분명하다. 그러나 알지 못하는 또는 예상할 수 없는 M, P, 또는 L과 같은 다른 BPIV3 유전자의 rJS 중 그 HPIV3의 대응물에 대한 치환이 HPIV3의 N 유전자를 BPIV3의 N 유전자로 치환시켰을 때 관찰되는 약독화보다 비슷한, 또는 더 큰 수준의 약독화를 나타낼 가능성도 있다. 상부 호흡 기도에서 cKa 및 cSF의 복제 수준이 상부 호흡 기도에서 BPIV3 부모형에 비해 약간 크다는 관찰은 다른 소 바이러스 유전자가 이 부위에서 BPIV 부모형 바이러스 숙주 범위 약독 화 형질에 기여한다는 것을 제세한다.

접종되지 않은 원숭이 및 사람 또는 소의 PIV3 부모형 바이러스 또는 cKa 또는 cSF 키메라 바이러스로 미리 감염된 원숭이를 10⁶ TCID₅₀으로 비강내로 또는 기관내로 각각의 부위에 1ml씩 최초 접종한 후 42일 후 감염시켰다. 비인두 또는 기관 을 앞서 기술한 바와 같이 표 2 에 나타나 있는 날짜에 채취하였다. 각 부위에 존재하는 바이러스의 역가는 LLC-MK2 세포 단층에서 결정되었으며, 제시된 역가는 평균 최고 역가이다(Hall et al., 1992, 상기 참조). 두 키메라 바이러스 중 하나에 의한 사전 감염은 상부 및 하부 기도 모두에서 rJS 감염 바이러스 복제에 대한 높은 수준의 내성을 유도하였다. cKa로 사전 감염된 원숭이는 접종되지 않은 원숭이에 비해, HPIV3(rJS)의 상부 호흡 기도에서의 야생형 HPIV3(rJS) 복제의 300배 감소 및 하부 기도에서 1000배 감소를 나타내었다. cSF로 사전 감염된 원숭이는 접종하지 않은 대조구 원숭이에 비해 상부 호흡 기도에서 rJS의 복제의 2000배 감소및 하부 호흡 기도에서 1000배 감소를 나타내었다. cKa 또는 cSF로 사전감염된 원숭이에서 rJS 감염 바이러스의 복제 감소수준은 사람 또는 소 PIV 부모형으로 사전 감염시킨 원숭이의 경우에 필적하였다. 따라서, HPIV3/BPIV3 키메라 바이러스 중 하나에 의한 감염은 원숭이의 상부 및 하부 기도에서 높은 수준의 내성을 제공하며 두 키메라 바이러스는 유망한 백신 후보를 나타낸다.

0일째와 28일째에 원숭이에서 수집한 혈청은 앞서 기술한 바와 같이, JS 균주의 경우 HPIV3를, Ka 균주의 경우 BPIV3를 항원으로 사용하여 HAI 분석으로 시험 하였다(Coelingh et al., J. Infect. Dis. 157: 655-662,1988). 비록 cKa-N 및 cSF-N이 레서스 원숭이의 상부 및 하부 호흡 기도에서 rJS에 비해 상당히 약독화 되었지만 각각의 키메라 바이러스는 HPIV3에 대해 혈구 응집 저해(HAI) 항체를 각각의 부모형으로 면역시킨 것 보다 2.5 내지 5배양으로 증가시켰다.

실시예 4

이형 융합 및 혈구-뉴라미니다아제 당단백질을 갖는 키메라 HPIV3/BPIV3 백신 후보의 구성화 및 특성분석

상기 예에서 영장류의 기간에 대한 HPIV3 복제의 숙주 범위 제한의 원리는 N ORF 가 BPIV3의 상응부로 치환된 재조합체 사람 PIV3 (rHPIV3)의 제조와 분석을 통해 확인하였다. 이 결과, 형성된 키메라 바이러스인 rHPIV3-NB - cKa 또는 cSF 라고도 언급된 -는 시험관 내에서 효율 적으로 복제하였으나 레서스의 상부 기관에서 제한적인 복제를 하였으며 따라서 N 단백질이 레서스 원숭이에서 숙주 범위 제한을 결정하는 독립적인 인자임을 확인하였다(Bailly et al., J. Virol. 74: 3188-3195,2000).

본 실시예에서는 소 인플루엔자 바이러스 유형 3(BPIV3)의 융합(F) 및 혈구-뉴라미니다아제 (HN) 당단백질 유전자가 인간이 아닌 영장류의 기도에서 제한적 복제를 하는데 미치는 영향을 2개의 상호교환적 키메라 BPIV3/HPIV3 바이러스를 제조하고 분석함으로써 조사하였다. 자신의 유전자 대신 이형 BPIV3의 F 와 HN 당단백질 유전자를 가지고 있는 키메라 HPIV3와, 이와 상대적으로, BPIV3를 "골격(backbone)"으로 하고 HPIV3의 F와 NH 유전자로 상응하는 BPIV3 당단백질의 상응부위가 치환된 상호교환적 재조합체를 제조하여 당단백질 치환이 레서스 원숭이의 상부 및 하부 호흡 기도에서 HPIV3 및 BPIV3의 복제에 미치는 영향을 조사하였다. 따라서 한 키메라 바이러스에서는 HPIV3의 F 및 HN 유전자가 이에 상응하는 BPIV3의 유전자와 치환되어 rHPIV3-F_BHN_B라고 명명된 키메라 재조합체를 만들고, 이의 상호교환적 재조합체 키메라 바이러스 PIV3(rBPIV3-F_HHN_H)는 재조합 BPIV3 (rBPIV3)의 F 및 NH 유전자를 이에 상응하는 HPIV3의 유전자로 치환하여 제조하였다. 후자는 HPIV3의 F와 HN의 ORF들을 BPIV3 골격에 넣어 HPIV3의 항원 결정부위를 BPIV3의 골격과 조합하여 부모형 BPIV3에 비해 개선된 백신 후보백신을 제조하였다. F 및 HN 유전자는 동종 HN 및 F 단백질이 파라인플루엔자 바이러스의 완전한 기능적 활성에 필요하다는 제안을 기반으로 하여(Deng et al., Virology 209: 457-469,1995; 및 Tanabayashi et al., J. Virol. 70: 6112-6118,1996; 각각 인용 문헌으로 포함됨) 쌍으로 치환하였다.

전술한 키메라 바이러스들은 유인원 LLC-MK2 세포주에서 쉽게 얻을 수 있고 이들의 부모형 바이러스와 비견될 만한 복제 동역학이 나타나는 것으로 볼 때 이형 당단백질이 PIV3의 내부 단백질과 양립할 수 있음을 암시한다.

BPIV3의 HPIV3에 대한 세포병리적 특성들은 각각의 F 및 HN 유전자와 함께 분리된다. BPIV3의 F 및 HN유전자를 가지고 있는 HPIV3는 레서스 원숭이에서의 복제가 부모형 BPIV3와 유사한 수준으로 약화되고 이것은 BPIV3의 당단백질 유전자가 레서스 원숭이에서 복제의 숙주 범위를 제한하는 주요한 결정부위임을 나타낸다. HPIV3의 F 및 HN 유전자를 가지고 있는 BPIV3 (rBPIV3-F_HHN_H)는 레서스 원숭이에서 HPIV3와 BPIV3의 중간정도 수준으로 복제한다.

이러한 결과는 F 및 HN 유전자가 BPIV3의 전반적인 약독화에 있어서 중요한 기여를 하고 있음을 나타낸다. 더구나 이것은 BPIV3 서열의 F 및 HN의 바깥 부위가 또한 영장류에 있어서 역시 약독화에 기여함을 보여준다. 후자의 발견은 선행한 예에서 BPIV3의 핵 단백질 코딩 서열이 영장류에 있어서 약독화의 결정부위임을 보여준 것과 일치한다. 그러나 레서스 원숭이의 기도에서 복제가 제한적으로 일어남에도 rBPIV3-F_HHN_H는 야생형 HPIV3에 대해 어느 정도의 내성을 부여하며 그 정도는 야생형 HPIV3에 의한 사전 감염으로 얻어지는 정도와 유사하다. 이러한 결과들로부터 rBPIV3F_HHN_H의 HPIV3에 대한 백신 후보로서의 유용성은 쉽게 명확해진다.

바이러스 및 세포주

HEp-2 및 유인원 LLC-MK2 단층세포 배양은 5% 우태아 혈청 (콜로라도주 콜리스 소재 서미트 바이오테크놀로지, 파운데이션), 50ug/ml 젠타마이신 설페이트, 및 4mM 글루타민 (메릴랜드주 게티스버그 라이프 테크놀로지스) 등이 첨가된 MEM 배지 (메릴랜드주 게티스버그 라이프 테크놀로지스)에서 수행하였다.

야생형 BPIV3 균주 캔사스/15626/84 (클론 5-2-4, 로트 BPI3-1) (BPIV3 Ka), 야생형 HPIV3 JS 균주 및 그 재조합체 버전 (rHPIV3), 및 HPIV3-N ORF 대신 BPIV3 Ka N ORF를 함유하는 rHPIV3 바이러스 (rHPIV3-NB) 각각 상기에서 기술되었다( Clements et al., 1991, 상기 참조; Karron et al., 1995a, 상기 참조; Bailly et al., 2000, 상기 참조; 및 Durbin et al., 1997, 상기 참조). PIV는 LLC-MK2 세포 (ATCC CCL-7)에서 32℃에서 증식시켰으며 그 방법은 앞서 기술된 바와 같다(Hall et al., 1992, 상기 참조).

박테리오파아지 T7 RNA 중합효소를 발현하는 변형된 백시니아 균주 앤카라 (Ankara) (MVA) 재조합 바이러스는 와트(Wyatt) 등(1995, 상기 참조)에 의해 기술되었다.

재조합체 BPIV3/HPIV3 바이러스를 코딩하는 안티게놈 cDNA의 구성화

a) rBPIV3를 얻기 위한 cDNA 구성

15456개의 뉴클레오티드로 이루어진 BPIV3 Ka의 전체 안티게놈 RNA를 코딩하는 전장 cDNA를 앞서 기술한 바와 같이 구성하였다. cDNA는 바이러스 RNA로부터 슈퍼스크립트 II 프리-앰플리피케이션 시스템 (메릴랜드주 게티스버그 라이프 테크놀로지스사) 및 하이 피델리티 PCR 키트(High Fidelity PCR kit) (캘리포니아주 팔로 알토 소재, 클론테크 래버러토리즈)을 사용한 중합연쇄반응(PCR) 증폭을 통해서 역전사반응으로 만들어진 4개의 서브클론들을 조합하여 만들었다. RT-PCR 생성물은 변형된 pUC 19 플라스미드 (매사츄세츠주 베벌리 소재 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))에 하기의 자연적으로 내부에 존재하는 제한효소 인지 부위를 이용해 클로닝하였다: Sma I (BPIV3 Ka 서열 위치 ntl86), Pst I (nt 2896), Mu I (nt 6192), Sac II (nt 10452), Bsp LU11 (nt 15412). 안티게놈의 다양한 서브클론들을 디로다민 터미네이터 사이클 시퀀싱 (dRhodamine Terminator Cycle Sequencing) (영국 월링튼 소재, 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템즈(Perkin Elmer Applied Biosystems))를 이용한 퍼킨 엘머 ABI 310 서열 분석기를 통해 서열을 분석하였으며 BPIV3의 보존된 서열과 일치하는 것들만 선택하여 전장 클론의 어셈블리에 사용하였다. BPIV3의 3' 및 5' 말단 부분을 클로닝하였으며 전장 cDNA 어셈블리는 앞서 기술한 Xho I, Sma I, Mu I, Sac II, Eco RI, Hind III, RsrII 등의 제한효소 인지부위를 가지는 새로운 폴리링커를 가지도록 변형한 p(Right) 벡터 (Durbin et al., 1997, 상기 참조)상에서 이루어졌다. 전장 pBPIV3 (184) cDNA 클론은 다음과 같은 요소를 3'에서 5' 순서로 가지고 있다: 2 개의 바이러스에서 기원하지 않은 구아노신 잔기가 뒤에 있는 T7 프로모터, BPIV3 Ka의 전체 안티게놈 서열, 헤파타이티스 델타 라이보자임, T7 중합효소 전사 터미네이터 (Bailly et al., 2000, 상기 참조; 및 Durbin et al., 1997a, 상기 참조).

b)rHPIV3-FBHNn와 rBPIV3-F _H HN _H 의 구성

앞서 기술한 바와 같이 특이적인 제한 효소 인지 부위를 BPIV3 및 HPIV3의 안티게놈 cDNA 에 삽입하여 p3/7 (131) 2G (Durbin et al., 1997a, 상기 참조) 각 바이러스 간에 F와 HN 유전자의 교환을 용이하게 하였다. 클론테크(Clonetech)의 형질전환세포 특정 부위 돌연변이 유도 방법을 이용해 (캘리포니아주 팔로 알토 소재 클론테크 래버러토리즈), SgrAI 제한 효소 부위를 M 유전자의 아래쪽 비코딩 부위에 삽입하였다. 그 위치는 rBPIV3 서열의 4811번이며 rHPIV3 JS 서열의 4835번이다(진뱅크 접수 번호 #Z11575). 제한효소 인지 부위를 표시한 염기 번호는 효소 가 자르는 부위의 다음 뉴클레오티드를 의미하며 제한 효소 인지부위의 첫번째 뉴클레오티드가 아니다. 서열은 rBPIV3의 경우 TCCAACATTGCA (SEQ. ID. NO. 2) 에서 TCCACCGGTGCA (SEQ. ID. NO. 3) 로 바뀌었고 rHPIV3의 경우 CGGACGTATCTA (SEQ. ID. NO. 4)에서 CGCACCGGTGTA (SEQ. ID. NO. 5)로 바꾸었다 (인지부위는 밑줄로 표시). BsiWI 제한효소 부위는 HN 유전자의 아래쪽 비코딩 부위 (rBPIV3 서열에서 염기번호 8595번, HPIV3 JS 서열에서 8601번 염기)에 삽입하였다. 서열은 rBPIV3의 경우 GATATAAAGA (SEQ. ID. NO. 6) 에서 GACGTACGGA (SEQ. ID. NO. 7)로 바뀌어 pBPIV(107)을 만들었으며, rHPIV3의 경우 GACAAAAGGG (SEQ. ID. NO. 8)에서 GACGTACGGG (SEQ. ID. NO. 9)로 바뀌어 pHPIV(106)를 만들었다. pBPIV(107) 및 pHPIV3 (106)를 각각 SgrAI 및 BsiWI로 절단하고, 겔에서 정제하고, 적당한 단편을 전장 cDNA 중으로 어셈블하여 둘 간에 F 및 HN 유전자를 교환하였다. BPIV3의 F 및 HN 유전자를 갖고 있는 HPIV3 백본을 pHPIV(215)라 명명하였고, 이는 15480개 염기로 구성된 바이러스 서열을 코딩하고 4835에서 8619번은 BPIV3에서 기원하였으며, rHPIV3-F_BHN_B를 유도하는데 사용하였다(도 8A-8C). HPIV3의 F 및 HN 유전자를 갖고 있는 BPIV3 백본을 pBPIV(215)라 명명하였고, 이는 15438개 염기로 구성된 바이러스 서열을 코딩하고 4811에서 8577번은 HPIV3에서 기원하였으며, rBPIV3-F_HHN_H를 유도하는데 사용하였다(도 8A-8C).

cDNA로부터 바이러스를 회수하기 위한 BPIV3 지지 플라스미드.

BPIV3의 Ka N, P, L 유전자를 코딩하는 보조 플라스미드는 변형된 pUC 19 벡 터에서 어셈블되어 앞서 기술한 pTM-1 벡터 중에 클로닝되었다(Durbin et al., 1997a, 상기 참조). 각각의 유전자를 pTM 벡터의 T7 프로모터 바로 아래에 위치시키기 위해 N, P, L의 ORF에 특정 부위 돌연변이 유발을 통해 NcoI 부위를 전사 개시 코돈에 도입하였다. NcoI 부위 및 각각의 ORF의 아래쪽에 자연적으로 존재하는 제한효소 부위(Spe I : N, HincII : P 및 Bsp LU 111 : L)를 이용해 pTM 중으로 클로닝하였다. 클로닝 후 pTM(N)의 NcoI 부위는 돌연변이 유발을 통해 두번째 코돈으로 지정되는 아미노산이 본래의 것으로 회복되도록 하였다. pTM (P) 와 pTM (L)의 경우 NcoI 부위의 삽입에 의해 ORF에 의해 코딩되는 아미노산 배열이 변하지 않았다.

형질도입

HEp-2 세포를 (6 웰 플레이트에 웰당 약 1.5 x 10⁶ 세포) 약 90 %로 가득 키운 후 BPIV3 지지 플라스미드 pTM (N), pTM (P) 각각 0.2 ㎍ 및 pTM (L) 0.1 ㎍을 5 pg의 각 전장 안티게놈 cDNA, 12㎕의 리포펙트에이씨이(LipofectACE) (메릴랜드주 게티스버그 소재 라이프 테크놀로지스)와 함께 트랜스펙트하였다. 각각의 트랜스펙션 혼합물 또한 앞서 기술한 바와 같이 MVA-T7 1.5 x 10⁷ 플라크 형성 단위(PFU)를 포함하고 있다(Durbin et al., 1997, 상기 참조). 세포 배양은 10%의 우태아 혈청을 가진 MEM(메릴랜드주 게티스버그 소재 라이프 테크놀로지스)으로 바꾸기 전에 32℃에서 12시간 동안 배양하였다. 상층액을 32℃에서 3일 더 배양한 후 수확하여 얻었으며, 25cm² 자란 LLC-MK2 단층세포를 통해 32℃에서 5일간 배양하 였다. 증폭과 특성분석에 앞서 상층액에 있는 바이러스를 세 번, 플라크로부터 정제하였다.

회수한 키메라 재조합체의 분자적 특성분석

플라크에서 정제한 재조합체 바이러스가 소 또는 사람 PIV3 골격에 이형 F 및 HN 유전자를 가지고 있는지를, 감염된 세포나 그 상층액에서 분리한 RNA를 역전사 중합연쇄반응을 통해 검사함으로써 확인하였다. 중합연쇄반응은 rBPIV3 및 rHPIV3의 보존된 서열을 인지하는 프라이머 쌍을 이용해 수행하였다. 이 결과 비슷한 크기의 단편들이 만들어지며(염기번호 4206-9035 : rBPIV3, 염기번호 4224-9041 : rHPIV3, 염기번호 42069017 : rBPIV3-F_HHN_H, 염기번호 4224-9059 : rHPIV3-F_BHN_B), 이들을 EcoRI으로 절단하여 1% 한천 겔 상에서 전기영동하여 분석하였다. 각각의 바이러스에서 삽입된 SgrAI 및 BsiWI 제한효소 부위 플랭킹 서열은 각각의 역전사 중합효소 연쇄반응 산물의 시퀀싱에 의해 확인하였다.

세포배양에서 HPIV3/BPIV3 키메라 바이러스의 복제.

BPIV3 Ka, rHPIV3-F_BHN_B, rBPIV3F_HHN_H, rHPIV3-N_B 및 rHPIV3의 LLC-MK2 세포에서의 여러주기 증식 동력학은 전술한 바와 같이 세 조의 세포를 감염다중도(MOI)가 0.01이 되도록 감염시킨 후 24시간 간격으로 6일간 표본을 수확하여 결정하였다(Tao et al., 1998, 상기 참조). 상기에서 기술한 바와 같이, 표본을 급속 냉동시키고, 96 웰 플레이트 중 LLC-MK2 세포 단층 상에서 단일 분석에서 역가를 측정하였다(Durbin et al., Virologv 261: 319-330,1999b, 본원에 인용 문헌 으로 포함되었음).

영장류 모델 연구

PIV3에 대해 혈구 응집 저해 분석(HAI assay)의 결과 혈청학적으로 음성인 레서스 원숭이에 ml 당 10⁵ 세포 배양 감염성 단위(TCID₅₀)로 BPIV3 Ka, rHPIV3-F_BHN_B, rBPIV3-F_HHN_H, rHPIV3-N_B 또는 rHPIV3를 비강내 또는 기관내에 2마리 또는 4마리 동물군에 접종하였다. 비인두 면봉 표본은 1 일부터 11 일까지 및 13 일째에 매일 수집하였다. 기관 세척 표본은 감염 후 2,4,6,8,10일에 수집하였다. 각각의 표본은 급속 냉동 후 모든 표본의 역가 측정험이 가능해질 때까지 -70℃에 보관하였다. 표본 중의 바이러스를 24웰 및 96웰 LLC-MK2 세포 단층배양에서 앞서 기술한 바와 같이 역가 측정하였다(Durbin et al., 1999b, 상기 참조). 원숭이에서 0일째 그리고 28일째에 수집한 혈청은 HPIV3 JS 및 BPIV3 Ka를 항원으로 사용해 앞서 기술된 바와 같이 혈구 응집 저해 분석을 수행하였다 (van Wyke Coelingh et al., 1988, 상기 참조). 접종 후 28일 째에 원숭이는 비강내 또는 기관 내로 HPIV3 JS 부위당 10⁶ TCID₅₀ 투여양으로 감염시켰다. 비인두 면봉 표본은 3,4,5,6,7,8 일째에 수집하였고, 기관 세척 표본은 감염 후 4,6,8일 째에 수집하였다. 상기에서 기술한 바와 같이 표본을 한 번의 분석에서 역가 측정하였다. 감염 후 28일째에 혈청을 수집하였다.

rBPIV3 및 BPIV3/HPIV3 키메라 바이러스(rHPIV3-F _B HN _B 및 rBPIV3-F _H HN _H )의 cDNA로부터의 회수.

pBPIV3라고 명명된 BPIV3의 전체 안티게놈은 BPIV3 Ka의 콘센서스 서열을 코딩하도록 구성되었다. 독특한 SgrAI 및 BsiWI 부위를 M 및 NH 유전자의 하류 비코딩 영역에 각각 넣어 이 BPIV3 안티게놈 cDNA는 추가로 변이시켰다(도 8C). 동일한 제한효소 인지 부위를 앞서 기술된 전체 HPIV3의 안티게놈 cDNA p3/7 (131) 2G (Durbin et al., 1997a, 상기 참조)의 M 및 NH 유전자 하류의 비코딩 부위에 각각 넣었다. HPIV3 및 BPIV3의 F 및 HN 당단백질 유전자는 이 SgrAI-BsiWI 제한효소 단편을 서로 바꾸어 넣어 교환하였다. BPIV3 및 HPIV3의 시스 작용 시그날이 높은 정도의 염기 서열 보존성을 지니기 때문에 이 전체 유전자의 직접적인 교환이 잘 허용될 수 있을 것이라 예상되었다. BPIV3의 F 및 HN 유전자를 가지고 있는 HPIV3의 안티게놈 cDNA를 pHPIV (215)라 명명하였으며 HPIV3의 F 및 HN 유전자를 가지고 있는 BPIV3의 안티게놈 cDNA를 pBPIV (215)라 명명하였다.

pBPIV (184), pHPIV (215), pBPIV (215) 와 p3/7 (131) 2G의 안티게놈 cDNA를 각각 독립적으로 BPIV3 보조 플라스미드들인 pTM (N), pTM (P), pTM (L)과 함께 HEp-2 세포에 트랜스펙트시켰다. 세포들을 동시에 T7 RNA 중합효소를 발현하는 재조합체 MVA에 감염시켰다. 회수된 바이러스가 실제로 예상한 rBPIV3, rHPIV3-F_BHN_B, rBPIV3-F_HHN_H 와 HPIV3 바이러스인지를 확인하기 위해 각각 클로닝된 바이러스의 세포내 RNA 또는 상층액 RNA를 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용해 분석하였다. 사용한 프라이머 쌍은 HPIV3 JS 및 BPIV3 Ka의 동일한 염기배열을 인지한다. 프라이 머 염기쌍은 M 유전자의 하류, F 및 HN 유전자, 그리고 L 유전자의 상류와 상응하는 부위(rBPIV3의 염기번호 4206-9035 rHPIV3의 염기번호 4224-9041, rBPIV3-F_HHN_H의 염기번호 4206-9017, rHPIV3-F_BHN_B 의 염기번호 4224-9059)를 증폭한다. 각각의 중합효소 연쇄반응 생성물의 형성은 역전사효소의 포함여부에 의존적이며 이는 이들 각각이 바이러스 RNA로부터 유도되었으며 오염된 cDNA로부터 만들어지지 않았음을 나타낸다(데이타 보이지 않음). 중합효소 연쇄반응의 생성물은 각각의 네 바이러스에 대해 상이하고 특이적인 절단 패턴을 나타낼 것이라 예상되는 EcoRI으로 절단하였다. 각각의 경우에 예상된 형태가 관찰되었으며(도 9) 이는 골격 및 삽입된 F 및 HN 유전자의 정체를 확인할 수 있게 해준다. 삽입한 제한 효소 부위 및 플랭킹 서열의 존재를 확인하기 위해 RT-PCR 생성물에 대해 뉴클레오티드 시퀀싱을 행하였다.

rBPIV3-F_HHN_H에 의해 LLC-MK2 세포에서 나타나는 세포병리적 효과(CPE)(응축된 둥근 세포, 및 작은 합포체)는 HPIV3 JS 의 경우와 구분할 수 없었으나, BPIV3(큰 다세포 합포체)와는 상이하였다. 그러나 rHPIV3-F_BHN_B에 의해 나타나는 세포병리적 효과는 BPIV3와 동일하였다. 이는 키메라 PIV의 세포 병리적 특성이 F 및 NH 유전자의 부모형 기원에 따름을 나타낸다.

BPIV3/HPIV3 키메라 바이러스는 세포 배양에서 효과적으로 복제한다.

rHPIV3-F_BHN_B 및 rBPIV3-F_HHN_H의 복제 동력학을 그들의 부모형 바이러스와 LLC-MK2 세포의 단층 배양에 감염다중도가 0.01 정도가 되도록 감염시키고 감염성 바이러스의 생성을 측정함으로써 비교하였다. 두 키메라 바이러스의 복제 동력학과 그 규모는 그들의 HPIV3 또는 BPIV3 부모형 바이러스와 비슷하였다(도 10). 이것은 BPIV3 및 HPIV3의 당단백질이 PIV3 내부의 이형 단백질과 호환성이 있음을 암시한다. 이러한 특성은 백신 바이러스의 효율적인 제조를 가능하게 하므로 중요하다.

BPIV3/HPIV3 키메라 바이러스의 F 및 HN 유전자는 BPIV3 Ka의 레서스 원숭이 상부 호흡 기도에서의 복제의 숙주 범위제한의 결정 인자이다.

rHPIV3-F_BHN_B 및 rBPIV3-F_HHN_H의 레서스 원숭이 상부 및 하부 호흡 기도에서의 복제능력을 평가하였다. 특히 BPIV3 F 및 HN 유전자의 HPIV3로의 삽입이 레서스 원숭이에서 복제의 약화에 미치는 영향을 앞서 BPIV3 N 단백질의 경우 기술한 바와 같이 증명하였다(Bailly et al., 2000, 상기 참조). 또한, HPIV3 F 및 HN 유전자의 BPIV3로의 삽입이 레서스 원숭이에서의 복제에 미치는 영향을 시험하였다. 만약 BPIV3의 유력한 약독화 돌연변이가 F 및 HN이 아닌 다른 곳에 있다면 BPIV3의 레서스 원숭이에서의 복제에 HPIV3와 BPIV3 간의 당단백질 교환이 미치는 전체적인 효과가 적을 것이다.

각각의 키메라 바이러스를 레서스 원숭이의 비강내와 기관내에 부위당 10⁵ TCID₅₀ 투여양으로 투여하였다. 키메라 바이러스의 복제 정도를 rHPIV3 및 BPIV3 부모형 바이러스, rHPIV3-N_B와 비교하였다(표 3). rHPIV3 부모형 바이러스가 하부 호 흡 기도에서 낮은 정도에서 중간 정도 수준으로 복제하므로 각 군간의 의미있는 비교는 상부 호흡 기도에서의 복제에 대해서만 가능하다. rHPIV3-F_BHN_B의 복제 수준은 그의 BPIV3 부모형 바이러스와 유사하였으며 대체로 그의 HPIV3 부모형보다 낮았다(표 3; 도 11, 패널 A). 이는 BPIV3의 당단백질 유전자가 레서스 원숭이에 대한 BPIV3의 1 이상의 숙주 범위 약독화 형질 결정 인자를 함유함을 보여준다. rHPIV3-F_BHN_B 및 rHPIV3-N_B의 복제는 그 크기 및 패턴에서 매우 유사하며 이는 두 개의 소의 유전적 인자, 즉 N 유전자 대 F 및 HN 유전자가 HPIV3를 비슷한 정도로 약독화시킨다는 것을 나타낸다.

<표 3>BPIV3의 F 및 HN 당단백질 유전자는 레서스 원숭이의 호흡기도에서의 그 제한된 복제에 기여한다.

면역화 바이러스1	동물의 수2	평균 피크 바이러스 역가3 (log10TCID50/ml ±S.E.) [던칸 그룹화]4		28일째의 HPIV3에 대한 혈청 HAI 항체 역가7(평균 수용체 log2±S.E.)	28일째의 BPIV3에 대한 혈청 HAI 항체 역가7(평균 수용체 log2±S.E.)
		NP 면봉5	기관 세척6
rHPIV3	6	4.7±0.54[A]	2.4±0.37[A]	9.5±0.72[A]	6.8±1.03[B]
rBPIV3±FHHNH	4	3.1±0.58[B]	1.6±0.05[A]	6.8±0.63[BC]	3.8±0.63[C]
rHPIV3-NB	6	3.0±0.60[B]	1.4±0.19[A]	8.2±0.48[AB]	6.5±0.62[B]
rHPIV3-FBHNB	4	2.9±0.28[B]	2.0±0.24[A]	4.5±0.29[D]	9.5±0.65[A]
BPIV3Ka	6	2.6±0.26[B]	1.6±0.10[A]	5.5±0.62[CD]	9.2±0.60[A]

¹ 원숭이는 비강내로 및 기관내로 각각의 부위에서 10^5.0TCID₅₀/1ml을 접종받았다.

² 6마리 동물을 갖는 군은 이전의 레서스 연구로부터의 각각 4마리 동물을 포함한다(Bailly et al., 2000, 상기 참조)

³ 샘플링 일자와 무관한 각각의 동물에 대한 평균 최고 바이러스 역가. S.E.=평균 오차

⁴ 바이러스 역가측정은 LLC-MK2 세포 중에서 32℃에서 수행되었다. 바이러스 역가의 탐지 한도는 10 TCID₅₀/ml이다. 평균 바이러스 역가는 던칸 다중 범위 시험을 사용하여 비교되었다 (α=0.05). 각각의 열에서, 상이한 문자의 평균 역가는 통계적으로 상이하다. 두 알파벳로 나타난 역가는 각각의 문자로 표시된 것과 많이 다르지 않다.

⁵ 비인두 면봉 샘플은 1 내지 11일 및 13일째에 채취되었다.

⁶ 기관 세척 샘플은 감염 후 2, 4, 6, 8, 및 10일째에 채취되었다.

⁷ 0일째의 역가는 <2.0이었다. 28일은 야생형 HPIV3로 감염시킨 날이다.

^** fHPIV3 중의 두 마리 동물은 당단백질 교체를 위한 두 개의 제한 효소 부위를 함유하는 바이러스인, rHPIV3들로 감염시켰다.

rBPIV3-F_HHN_H 키메라 바이러스는 의미있을 만큼 복제를 잘 하지 못했으며, 던칸 다중 범위 시험 결과 BPIV3와 같은 군에 포함되었다. 그러나 도 11B에서 복제 양상을 조사해 보면 rBPIV3-F_HHN_H는 HPIV3 와 BPIV3 부모형의 중간정도 수준으로 복제한다. 이에 대한 해석은 HPIV3, rBPIV3-FHHNH, BPIV3의 감염 후 3일 째와 8 일째 사이의 중앙 역가가 의미 있는 수준으로 다르다(d. f. 2,8; p < 0.05)는 프리드 만(Friedman)의 열 일관성 검사(test of consistency of ranks)(Sprent, P.,"A Generalization Of The Sign Test,"Applied Nonparametric Statistical Methods, pp. 123126, Chapman and Hall, London, 1989, 본원에 인용 문헌으로 포함됨)에 의해 지지된다. HPIV3의 F 및 HN 단백질의 삽입이 레서스 원숭이에서 BPIV3의 복제 증가를 가져온다는 관찰은 (i) F와 HN 이 하나 또는 그 이상의 숙주 범위 제한 결정인자를 가지고 있다; (ii) F 와 HN 유전자 바깥에 있는 N 단백질과 같은 BPIV3의 유전 인자가 레서스 원숭이에 대해 바이러스를 약독화시킨다는 것을 나타낸다. 이는 숙주 범위 제한의 유전적 근거에 여러 유전자가 관련될 수 있음을 확인한다.

HPIV3 당단백질을 가지고 있는 키메라 BPIV3 는 HPIV3에 대해 혈구응집저해 (HAI) 항체를 유도하며 야생형 HPIV3 감염에 대해 높은 저항성을 유도한다.

rBPIV3-F_HHN_H 는 HPIV3에 비해 생약독화 백신 후보가 될 중요한 특성을 지니며 이는 BPIV3로부터의 약독화 유전자의 도입과 HPIV3에 대한 항원 특이성, 즉 주방어 항원인 F 및 HN 당단백질을 포함한다. 따라서 이것의 HPIV3 감염에 대한 면역유도능력과 방어 효율을 증명하였다. 레서스 원숭이는 BPIV3 Ka, rHPIV3-F_BHN_B, rBPIV3-F_HHN_H, rHPIV3-N_B, 또는 rHPIV3의 감염으로 면역화되었다. 이들을 28일 후 야생형 HPIV3 JS 바이러스로 감염시켰다. 혈청 표본은 최초 감염전 0 일째와 시험감염전에 채취하였다. BPIV3 및 rHPIV3-F_BHN_B는 HPIV3보다 BPIV3에 대해 좀 더 효율적으로 반응하는 HAI 항체를 유도하였으나, HPIV3 와 rBPIV3-F_HHN_H의 경우 반대였 다. 따라서 각각의 바이러스에서 당단백질의 기원이 HAI 항체반응이 HPIV3 와 BPIV3 중 어느 것에 대해 주로 유도되는가를 결정한다. 감염된 HPIV3의 복제는 사전에 면역화 된 원숭이에서 상부 및 하부 기도에서 현저히 감소했다(표 4). HPIV3에 대한 방어 효율은 바이러스 간에 크게 다르지 않지만, HPIV3의 F 및 HN을 가지고 있는 바이러스가 일관성 있게 더 방어력이 높았다. 이는 HPIV3 특이적인 혈청 HAI 항체가 HPIV3의 F 및 HN을 가진 바이러스에 의해 더 많이 형성되는 결과와 일치한다.

<표 4>BPIV3/HPIV3 키메라 재조합 바이러스에 의한 레서스 원숭이의 면역화는 야생형 HPIV3에 의한 감염에 대해 내성을 유도한다.

면역화 바이러스1	동물의 수2	평균 피크 바이러스 역가3 (log10TCID50/ml ±S.E.) [던칸 그룹화]4		감염일에서 HPIV3에 대한 혈청 HAI 항체 역가(평균 수용체 log2±S.E.)	감염 후 28일째의 BPIV3에 대한 혈청 HAI 항체 역가(평균 수용체 log2±S.E.)
		NP 면봉5	기관 세척6
없음	4	4.5±0.33[A]	4.5±0.19[A]	<2	12.0±0.58[A]
rHPIV3	6	2.3±0.14[B]	1.2±0.20[B]	9.5±0.72[A]	11.7±0.21[A]
rBPIV3±FHHNH	4	2.5±0.25[B]	1.0±0.48[B	6.8±0.63[BC]	10.5±0.29[AB]
rHPIV3-NB	6	2.3±0.41[B]	1.4±0.08[B]	8.2±0.48[AB]	11.5±0.22[A]
rHPIV3-FBHNB	4	3.0±0.14[B]	1.0±0.0[B]	4.5±0.29[D]	9.5±0.87[B]
BPIV3Ka	6	2.9±0.26[B]	1.3±0.20[B]	5.5±0.62[CD]	9.3±0.76[B]

¹앞서 면역화된 원숭이 및 비면역화된 대조구 각각을 면역화 후28일째에 10⁶ TCID5₀의 HPIV3 JS/1ml로 감염시켰다.

² 6마리 동물을 갖는 군은 이전의 레서스 연구로부터의 각각 4마리 동물을 포함한다(Bailly et al., 2000, 상기 참조)

³ 샘플링 일자와 무관한 각각의 동물에 대한 평균 피크 바이러스 역가.

⁴ 바이러스 역가측정은 LLC-MK2 세포 중에서 32℃에서 수행되었다. 바이러스 역가의 탐지 한도는 10 TCID₅₀/ml이다. 평균 바이러스 역가는 던칸 다중 범위 시험을 사용하여 비교되었다 (α=0.05). 각각의 열에서, 상이한 문자의 평균 역가는 통계적으로 상이하다. 두 문자로 나타난 역가는 각각의 문자로 표시된 것과 많이 다르지 않다. 면역화되지 않은 동물의 군은 감염일의 던칸 분석에 포함되지 않았다.

⁵ 비인두 면봉 샘플은 1 내지 11일 및 13일째에 채취되었다.

⁶ 기관 세척 샘플은 감염 후 2, 4, 6, 8, 및 10일째에 채취되었다.

^** rHPIV3 중의 두 마리 동물은 rHPIV3들로 감염시켰다.

상기 예들에 기초해서 본 발명은 신규한 사람-소 키메라 PIV 백신 후보를 생성하기 위해 독성이 있는 HPIV 골격 중에 BPIV 유전자를 도입하거나 그 반대로 하는 것을 제공한다. 본 실시예에서 기술된 전형적인 키메라 재조합체 중에서, rBPIV3-F_HHN_H 및 그 대응물 rHPIV3-F_BHN_B은 시험관 내에서 각각의 부모형 바이러스와 마찬가지로 잘 복제하였다. 또한 상당하게 보다 분기된 HPIV1 F 및 N 유전자도 HPIV3 백그라운드에서 매우 기능성이 있음에 비추어 볼 때(Tao et al., J. Virol. 72: 2955-2961,1998) BPIV3와 HPIV3간의 F 및 HN의 교환이 호환성이 있음을 확인하였다. 이는 키메라 바이러스가 시험관내의 증식에 있어서 저하되지 않은 능력을 가지는 것으로 증명된다. rBPIV3-F_HHN_H는 레서스 원숭이의 상부 호흡 기도에서 HPIV3와 BPIV3 부모형의 중간 정도로 복제하며 이것은 BPIV3의 F 및 NH 유전자가 영장류에 대한 PBIV3의 전체적인 약독화에 독립적으로 기여함을 나타낸다. 따라서, BPIV3의 전체적인 약독화는 2 이상의 유전 인자의 합이며, 이 중 하나는 F 및 HN 유전자의 세트 중 하나이며, 다른 하나는 N으로 나타난다.

BPIV3 자체가 HPIV3에 대한 백신 바이러스로 현재 평가되고 있지만(Karron et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 15:650-654, 1996; 및 Karron et al., J. Infect. Dis. 171:1107-1114, 1995), 이는 HPIV3에 대해 25%만이 항원적으로 관련있다(Coelingh et al., J. Infect. Dis. 157:655-662, 1988). 따라서, HPIV3의 방어성 F 및 HN 항원을 발현하도록 본 발명에 따라 면이된다면, HPIV3에 대한 BPIV3의 면역원성은 개선될 것이다. rBPIV3-F_HHN_H가 이 같은 바이러스를 나타내고, 본 실시예에서, 레서서 원숭이의 rBPIV3-F_HHN_H에 의한 면역화는 BPIV3에 의한 면역화보다 HPIV3에 대해 더 높은 수준의 항체를 유도한다. 아울러, rBPIV3-F_HHN_H는 rHPIV3에 의한 사전 감염에 의해 부여되는 것과 통계적으로 비교할 수 없는, 상부 및 하부 호흡 기도에서의 HPIV3 감염의 복제에 대한 보호 수준을 부여한다. 유사하게, rHPIV3-N_B는 BPIV3 N 단백질에 의해 약독화되지만, HPIV3 방어성 항원을 보유하고, 또한 HPIV3 감염에 대한 높은 수준의 내성을 유도한다. 레서스 원숭이에서 유사한 수준으로 복제함에도 불구하고, rHPIV3-N_B는 rBPIV3-F_HHN_H보다 HPIV3에 대한 높은 수 준의 항체를 유도한다.

HPIV3에 비해 상당히 약독화되었지만, rBPIV3-F_HHN_H는 레서스 원숭이에서 BPIV3보다 높은 수준으로 복제한다. 사람에서 BPIV3의 복제 수준이 낮기 때문에(Karron et al., J. Infect. Dis. 171:1107-1114, 1995), 이 증가는 백신 중에서 잘 허용되는 것으로 예상된다. 별법으로, 예를 들어 사람 영아에서, 백신 투여자들 중에서 허용될 수 없는 호흡 기도 질환을 예방하기 위해 백신 바이러스가 중간 정도의 수준으로만 복제한다는 것을 확실하게 하기 위해, 본 발명의 사람-소 키메라 바이러스를 약독화하기 위한 추가 방법이 본원에 기술되었다. 본 발명의 다른 면들 중에서, 영장류에서 rBPIV3-F_HHN_H의 복제의 약간의 증가는 다른 PIV들의 당단백질(예를 들어, HPIV1 및 HPIV2), RSV의 F 및 G 당단백질, 홍역 HA 당단백질등과 같은 이형 바이러스 항체에 대한 벡터로 rBPIV3-F_HHN_H을 사용할 기회를 부여하고, 이는 약독화된 HPIV3 백신 후보 중으로 첨가된 또는 치환된 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)로 삽입될 수 있다. 본원에서 개시된 다양한 별법의 실시태양 중에서, 원숭이에서 BPIV3에 비한 rBPIV3-F_HHN_H의 복제의 약한 증가는 외래 바이러스 방어 항원의 첨가에 의해 상쇄될 수 있다. 예를 들어 RSV의 당단백질의 경우,그 첨가는 선택된 수준의 약독화를 제공한다. 본원에서 제시된 데이타는 BPIV3의 영장류에 대한 숙주 범위 제한의 근거를 추가로 한정하고, rBPIV3-F_HHN_H를 HPIV3에 대한 잠재적인 백신 후보 및 이형 바이러스 항원의 벡터로 동정하였다.

* 미생물 기탁 정보

다음의 물질들은 부다페스트 조약의 조항에 따라 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 버지니아주 20110-2209, 매나사스 유니버시키 블루바드 10801 소재),으로 보관하고 있으며 아래와 같이 명명되어 있다.

플라스미드 접수 번호 기탁일

p3/7 (131) (ATCC 97990) 1997. 4. 18.

p3/7 (131) (ATCC 97989) 1997. 4. 18.

p218 (131) (ATCC 97991) 1997. 4. 18.

선행한 발명이 이해의 명확성을 위해 실시예를 통해 자세히 기술되어 있으나 숙련자에 있어서 어떤 변화와 변형은 명세서에 의해 이해되는 것이 명확할 것이며, 첨부된 청구의 범위안에서 부당한 실험없이 첨부된 청구범위 내에서 실시될 수 있을 것이며, 이는 제한으로가 아니라 예시로 주어졌다.

<서열목록>

Claims (149)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 삭제
37. 삭제
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제
41. 삭제
42. 삭제
43. 삭제
44. 삭제
45. 삭제
46. 삭제
47. 삭제
48. 삭제
49. 삭제
50. 삭제
51. 삭제
52. 삭제
53. 삭제
54. 삭제
55. 삭제
56. 삭제
57. 삭제
58. 삭제
59. 삭제
60. 삭제
61. 삭제
62. 삭제
63. 삭제
64. 삭제
65. 삭제
66. 삭제
67. 삭제
68. 삭제
69. 삭제
70. 삭제
71. 삭제
72. 삭제
73. 삭제
74. 삭제
75. 삭제
76. 삭제
77. 삭제
78. 삭제
79. 삭제
80. 삭제
81. 삭제
82. 삭제
83. 삭제
84. 주요 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질(P), 거대 중합효소 단백질(L), 및 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV)의 일부 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈에 소 PIV(BPIV)의 1 이상의 이종(heterologous) 유전자 또는 게놈 단편이 결합되어 형성된 인간-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함하고, 상기 이종 유전자 또는 게놈 단편의 적어도 하나가 소 PIV N 단백질을 코딩하는, 감염성 인간-소 키메라 PIV.
85. 제84항에 있어서, 야생형 HPIV와 비교하여 영장류 숙주의 호흡 기도에서 30배 이상 약독화된 키메라 PIV.
86. 제84항에 있어서, 1 이상의 PIV C, D, V, M, F, HN 및/또는 L 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 1 이상의 추가의 이종 유전자 또는 게놈 단편을 추가로 포함하는 키메라 PIV.
87. 제84항에 있어서, 1 이상의 이종 유전자 또는 게놈 단편이 1 이상의 PIV C, D, V, M, F, HN 및/또는 L 단백질의 완전한 오픈 리딩 프레임(ORF)을 코딩하는 키메라 PIV.
88. 제84항에 있어서, 1 이상의 이종 유전자 또는 게놈 단편이 유전자외 3' 리더 또는 5' 트레일러(trailer) 영역, 유전자-개시 시그날, 유전자-종결 시그날, RNA 에디팅 부위, 캡시드화(encapsidation) 시그날, 유전자간 영역, 또는 3' 또는 5' 비코딩 영역을 포함하는 이종 조절 인자를 포함하는 키메라 PIV.
89. 제84항에 있어서, 이종 유전자 또는 게놈 단편이 일부 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하거나;

    일부 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈의 비코딩 영역내에 또는 그에 인접하여 첨가되거나;

    일부 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 단편의 야생형 유전자 순서 위치에 상응하는 위치에서 첨가 또는 치환되거나;

    일부 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 단편의 야생형 유전자 순서 위치와 비교하여 보다 프로모터에 근접한 위치(promoter-proximal) 또는 프로모터에서 먼 위치(promoter-distal)에서 첨가 또는 치환된 키메라 PIV.
90. 제86항에 있어서, 키메라 게놈 또는 안티게놈이 키메라 당단백질을 코딩하는 키메라 PIV.
91. 제86항에 있어서, HN 및 F로부터 선택된 1 이상의 HPIV 당단백질 유전자, 또는 이들의 세포질 도메인, 막횡단 도메인, 엑토도메인(ectodomain) 또는 면역원성 에피토프를 코딩하는 1 이상의 게놈 단편이 상기 키메라 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 상이한 HPIV의 1 이상의 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하거나, 키메라 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내에 첨가된 키메라 PIV.
92. 제91항에 있어서, HPIV 당단백질 유전자 HN 및 F 양자가 키메라 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 HN 및 F 당단백질 유전자를 대체하기 위해 치환된 키메라 PIV.
93. 제91항에 있어서, 인간-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이 HPIV 당단백질 엑토도메인, 항원 결정인자 또는 면역원성 에피토프를 갖는 키메라 당단백질을 코딩하는 키메라 PIV.
94. 제84항에 있어서, 게놈 또는 안티게놈이 1 이상의 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV 또는 다른 돌연변이 비세그먼트화된 (-) 가닥 RNA 바이러스에서 동정된 1 이상의 약독화 돌연변이의 도입에 의해 추가로 변형된 키메라 PIV.
95. 제94항에 있어서, 추가의 약독화 돌연변이의 적어도 하나가 아미노산 점 돌연변이를 특정하는 코돈내의 다수의 뉴클레오티드 변화에 의해 안정화된 돌연변이인 키메라 PIV.
96. 제94항에 있어서, 게놈 또는 안티게놈이

    JS의 Tyr₉₄₂, Leu₉₉₂ 또는 Thr₁₅₅₈에 상응하는 위치에서 L 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

    JS의 Val₉₆ 또는 Ser₃₈₉ 잔기에 상응하는 위치에서 N 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

    JS의 Ile₉₆에 상응하는 위치에서 C 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

    JS의 Pro₁₉₉에 상응하는 위치에서 M 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

    JS의 Ile₄₂₀ 또는 Ala₄₅₀ 잔기에 상응하는 위치에서 F 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

    JS의 Val₃₈₄ 잔기에 상응하는 위치에서 HN 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

    JS cp45의 23번, 24번, 28번, 또는 45번 뉴클레오티드에 상응하는 위치에서 키메라 바이러스의 3' 리더 서열 내 뉴클레오티드 치환을 특정하는 돌연변이; 및

    JS cp45의 62번 뉴클레오티드에 상응하는 위치에서 N 유전자 개시 서열 내의 돌연변이로 구성된 그룹 중에서 선택된 1 이상의 약독화 돌연변이를 함입하는 키메라 PIV.
97. 제94항에 있어서, 추가의 돌연변이가

    N 유전자 내 점 돌연변이; P 유전자 내 점 돌연변이; C 유전자 내 점 돌연변이; D 유전자 내 점 돌연변이; V 유전자 내 점 돌연변이; M 유전자 내 점 돌연변이; F 유전자 내 점 돌연변이; HN 유전자 내 점 돌연변이; L 유전자 내 점 돌연변이; 3' 리더 내 점 돌연변이; 5' 트레일러 내 점 돌연변이; RNA 에디팅 부위 내 점 돌연변이; 캡시드화 시그날 내 점 돌연변이; 및 유전자간 영역 내 점 돌연변이로 구성된 그룹 중에서 선택된 1 이상의 점 돌연변이인 키메라 PIV.
98. 제84항에 있어서, 키메라 게놈 또는 안티게놈의 1 이상의 유전자가 전체적 또는 부분적으로 결실되거나, RNA 에티딩 부위에서의 돌연변이, 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이, 개시 코돈에 의해 특정되는 아미노산을 변경하는 돌연변이 또는 상기 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF) 내의 1 이상의 정지 코돈의 도입에 의해 상기 유전자의 발현이 감소 또는 제거된 키메라 PIV.
99. 제98항에 있어서, 키메라 게놈 또는 안티게놈에 1 이상의 C, D 및/또는 V ORF의 일부 또는 전체 결실, 또는 상기 1 이상의 C, D 및/또는 V ORF의 발현을 감소 또는 제거하는 1 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함하는 변이가 도입된 키메라 PIV.
100. 제84항에 있어서, 키메라 게놈 또는 안티게놈이 사이토카인, T-림프구 헬퍼 에피토프, 제한효소 인지부위 표지, 또는 포유류 숙주에서 방어성 면역 반응을 유발할 수 있는 미생물 병원체의 단백질을 코딩하도록 추가로 변형된 키메라 PIV.
101. 제84항에 있어서, 키메라 게놈 또는 안티게놈이 1 이상의 이종 병원체의 1 이상의 항원 결정인자를 코딩하는 1 이상의 이종 유전자 또는 게놈 단편을 추가로 포함하는 키메라 PIV.
102. 제101항에 있어서, 백그라운드 게놈 또는 안티게놈이 일부 또는 전체 HPIV3 게놈 또는 안티게놈이고, 항원 결정인자를 코딩하는 이종 유전자 또는 게놈 단편이 1 이상의 이종 HPIV의 것인 키메라 PIV.
103. 제101항에 있어서, 이종 병원체가 홍역 바이러스, 아군 A 및 아군 B 호흡기 합포체 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 유형 1 및 유형 2 인간 면역결핍증 바이러스, 단순 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스, 필로바이러스, 분야바이러스, 플라비바이러스, 알파바이러스 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택된 것인 키메라 PIV.
104. 제103항에 있어서, 1 이상의 이종 항원 결정인자가 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질, 아군 A 또는 아군 B 호흡기 합포체 바이러스 F, G, SH 및 M2 단백질, 볼거리 바이러스 HN 및 F 단백질, 인간 파필로마 바이러스 L1 단백질, 유형 1 또는 유형 2 인간 면역결핍증 바이러스 gp160 단백질, 단순 포진 바이러스 및 사이토메갈로바이러스 gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL 및 gM 단백질, 광견병 바이러스 G 단백질, 엡스타인 바 바이러스 gp350 단백질, 필로바이러스 G 단백질, 분야바이러스 G 단백질, 플라비바이러스 E 및 NS1 단백질, 및 알파바이러스 E 단백질, 및 이들의 항원 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택된 것인 키메라 PIV.
105. 제101항에 있어서, 이종 병원체가 홍역 바이러스이고, 이종 항원 결정인자가 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질 및 이들의 항원 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택된 것인 키메라 PIV.
106. 제105항에 있어서, 홍역 바이러스 HA 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 전사 단위가 HPIV3 백그라운드 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 키메라 게놈 또는 안티게놈에 첨가된 키메라 PIV.
107. 제101항에 있어서, 호흡기 합포체 바이러스(RSV)의 유전자 또는 게놈 단편을 함입하는 키메라 PIV.
108. 제107항에 있어서, RSV의 유전자 또는 게놈 단편이 RSV F 및/또는 G 당단백질, 또는 이들의 면역원성 도메인 또는 에피토프를 코딩하는 키메라 PIV.
109. 주요 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질(P), 거대 중합효소 단백질(L), 및 소 파라인플루엔자 바이러스(BPIV)의 일부 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈에 인간 PIV(HPIV)의 1 이상의 이종 유전자 또는 게놈 단편이 결합되어 형성된 인간-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함하고, 상기 이종 유전자 또는 게놈 단편의 적어도 두 개가 인간 PIV HN 및 F 당단백질을 코딩하는, 감염성 인간-소 키메라 PIV.
110. 제109항에 있어서, 야생형 HPIV와 비교하여 영장류 숙주의 호흡 기도에서 30배 이상 약독화된 키메라 PIV.
111. 제109항에 있어서, 1 이상의 PIV C, D, V, M, F, HN 및/또는 L 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 1 이상의 추가의 이종 유전자 또는 게놈 단편을 추가로 포함하는 키메라 PIV.
112. 제109항에 있어서, 1 이상의 이종 유전자 또는 게놈 단편이 1 이상의 PIV C, D, V, M, F, HN 및/또는 L 단백질의 완전한 오픈 리딩 프레임(ORF)을 코딩하는 키메라 PIV.
113. 제109항에 있어서, 1 이상의 이종 유전자 또는 게놈 단편이 유전자외 3' 리더 또는 5' 트레일러(trailer) 영역, 유전자-개시 시그날, 유전자-종결 시그날, RNA 에디팅 부위, 캡시드화(encapsidation) 시그날, 유전자간 영역, 또는 3' 또는 5' 비코딩 영역을 포함하는 이종 조절 인자를 포함하는 키메라 PIV.
114. 제109항에 있어서, 이종 유전자 또는 게놈 단편이 일부 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하거나;

     일부 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈의 비코딩 영역내에 또는 그에 인접하여 첨가되거나;

     일부 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 단편의 야생형 유전자 순서 위치에 상응하는 위치에서 첨가 또는 치환되거나;

     일부 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 단편의 야생형 유전자 순서 위치와 비교하여 보다 프로모터에 근접한 위치(promoter-proximal) 또는 프로모터에서 먼 위치(promoter-distal)에서 첨가 또는 치환된 키메라 PIV.
115. 제109항에 있어서, 게놈 또는 안티게놈이 1 이상의 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV 또는 다른 돌연변이 비세그먼트화된 (-) 가닥 RNA 바이러스에서 동정된 1 이상의 약독화 돌연변이의 도입에 의해 추가로 변형된 키메라 PIV.
116. 제115항에 있어서, 추가의 약독화 돌연변이의 적어도 하나가 아미노산 점 돌연변이를 특정하는 코돈내의 다수의 뉴클레오티드 변화에 의해 안정화된 돌연변이인 키메라 PIV.
117. 제115항에 있어서, 게놈 또는 안티게놈이

     JS의 Tyr₉₄₂, Leu₉₉₂ 또는 Thr₁₅₅₈에 상응하는 위치에서 L 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

     JS의 Val₉₆ 또는 Ser₃₈₉ 잔기에 상응하는 위치에서 N 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

     JS의 Ile₉₆에 상응하는 위치에서 C 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

     JS의 Pro₁₉₉에 상응하는 위치에서 M 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

     JS의 Ile₄₂₀ 또는 Ala₄₅₀ 잔기에 상응하는 위치에서 F 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

     JS의 Val₃₈₄ 잔기에 상응하는 위치에서 HN 단백질 내 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이;

     JS cp45의 23번, 24번, 28번, 또는 45번 뉴클레오티드에 상응하는 위치에서 키메라 바이러스의 3' 리더 서열 내 뉴클레오티드 치환을 특정하는 돌연변이; 및

     JS cp45의 62번 뉴클레오티드에 상응하는 위치에서 N 유전자 개시 서열 내의 돌연변이로 구성된 그룹 중에서 선택된 1 이상의 약독화 돌연변이를 함입하는 키메라 PIV.
118. 제115항에 있어서, 추가의 돌연변이가

     N 유전자 내 점 돌연변이; P 유전자 내 점 돌연변이; C 유전자 내 점 돌연변이; D 유전자 내 점 돌연변이; V 유전자 내 점 돌연변이; M 유전자 내 점 돌연변이; F 유전자 내 점 돌연변이; HN 유전자 내 점 돌연변이; L 유전자 내 점 돌연변이; 3' 리더 내 점 돌연변이; 5' 트레일러 내 점 돌연변이; RNA 에디팅 부위 내 점 돌연변이; 캡시드화 시그날 내 점 돌연변이; 및 유전자간 영역 내 점 돌연변이로 구성된 그룹 중에서 선택된 1 이상의 점 돌연변이인 키메라 PIV.
119. 제109항에 있어서, 키메라 게놈 또는 안티게놈의 1 이상의 유전자가 전체적 또는 부분적으로 결실되거나, RNA 에티딩 부위에서의 돌연변이, 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이, 개시 코돈에 의해 특정되는 아미노산을 변경하는 돌연변이 또는 상기 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF) 내의 1 이상의 정지 코돈의 도입에 의해 상기 유전자의 발현이 감소 또는 제거된 키메라 PIV.
120. 제119항에 있어서, 키메라 게놈 또는 안티게놈에 1 이상의 C, D 및/또는 V ORF의 일부 또는 전체 결실, 또는 상기 1 이상의 C, D 및/또는 V ORF의 발현을 감소 또는 제거하는 1 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함하는 변이가 도입된 키메라 PIV.
121. 제109항에 있어서, 키메라 게놈 또는 안티게놈이 사이토카인, T-림프구 헬퍼 에피토프, 제한효소 인지부위 표지, 또는 포유류 숙주에서 방어성 면역 반응을 유발할 수 있는 미생물 병원체의 단백질을 코딩하도록 추가로 변형된 키메라 PIV.
122. 제109항에 있어서, 키메라 게놈 또는 안티게놈이 1 이상의 이종 병원체의 1 이상의 항원 결정인자를 코딩하는 1 이상의 이종 유전자 또는 게놈 단편을 추가로 포함하는 키메라 PIV.
123. 제122항에 있어서, HN 및 F 유전자가 HPIV3의 것이고, 항원 결정인자를 코딩하는 이종 유전자 또는 게놈 단편이 HPIV1 및 HPIV2의 어느 하나 또는 양자 모두의 것인 키메라 PIV.
124. 제122항에 있어서, 이종 병원체가 홍역 바이러스, 아군 A 및 아군 B 호흡기 합포체 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 유형 1 및 유형 2 인간 면역결핍증 바이러스, 단순 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스, 필로바이러스, 분야바이러스, 플라비바이러스, 알파바이러스 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택된 것인 키메라 PIV.
125. 제124항에 있어서, 1 이상의 이종 항원 결정인자가 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질, 아군 A 또는 아군 B 호흡기 합포체 바이러스 F, G, SH 및 M2 단백질, 볼거리 바이러스 HN 및 F 단백질, 인간 파필로마 바이러스 L1 단백질, 유형 1 또는 유형 2 인간 면역결핍증 바이러스 gp160 단백질, 단순 포진 바이러스 및 사이토메갈로바이러스 gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL 및 gM 단백질, 광견병 바이러스 G 단백질, 엡스타인 바 바이러스 gp350 단백질, 필로바이러스 G 단백질, 분야바이러스 G 단백질, 플라비바이러스 E 및 NS1 단백질, 및 알파바이러스 E 단백질, 및 이들의 항원 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택된 것인 키메라 PIV.
126. 제122항에 있어서, 이종 병원체가 홍역 바이러스이고, 이종 항원 결정인자가 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질 및 이들의 항원 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택된 것인 키메라 PIV.
127. 제126항에 있어서, 홍역 바이러스 HA 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 전사 단위가 BPIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 키메라 게놈 또는 안티게놈에 첨가된 키메라 PIV.
128. 제122항에 있어서, 호흡기 합포체 바이러스(RSV)의 유전자 또는 게놈 단편을 함입하는 키메라 PIV.
129. 제128항에 있어서, RSV의 유전자 또는 게놈 단편이 RSV F 및/또는 G 당단백질, 또는 이들의 면역원성 도메인 또는 에피토프를 코딩하는 키메라 PIV.
130. 제84항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 서브바이러스 입자인 키메라 PIV.
131. 생리학적으로 허용되는 담체 중에 면역원적으로 충분한 양의 제84항 내지 제129항 중 어느 한 항에 따른 키메라 PIV를 포함하는, PIV에 대해 면역 반응을 유발하기 위한 면역원성 조성물.
132. 제131항에 있어서, 10³ 내지 10⁷ PFU의 투여량으로 제형화된 면역원성 조성물.
133. 제131항에 있어서, 스프레이, 소적 또는 에어로졸에 의해 상부 호흡 기도 투여용으로 제형화된 면역원성 조성물.
134. 제131항에 있어서, 키메라 PIV가 HPIV1, HPIV2 및 HPIV3로부터 선택된 2 이상의 바이러스에 대해 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
135. 제84항 내지 제129항 중 어느 한 항에 따른 키메라 PIV의 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
136. 제135항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 PIV N, P 및 L 단백질을 세포 또는 무세포 용균물(lysate)에서 발현시키는 것을 포함하는, 감염성의 약독화된 키메라 PIV를 코딩하는 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 상기 PIV 입자를 생산하는 방법.
137. 제136항에 있어서, 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈 및 N, P 및 L 단백질이 2 이상의 상이한 발현 벡터에 의해 발현되는 방법.
138. 작동가능하게 연결된 전사 프로모터, 제135항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열, 및 전사 터미네이터를 포함하는 발현 벡터.
139. 삭제
140. 삭제
141. 삭제
142. 삭제
143. 삭제
144. 삭제
145. 삭제
146. 삭제
147. 삭제
148. 삭제
149. 삭제

Images