JP2003504064A - 弱毒ヒト−ウシキメラ−パラインフルエンザウイルス（ｐｉｖ）ワクチン - Google Patents

弱毒ヒト−ウシキメラ−パラインフルエンザウイルス（ｐｉｖ）ワクチン

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Abstract

(57)【要約】 本発明のキメラヒト-ウシパラインフルエンザウイルス（PIV）はヒトおよび他の哺乳動物において感染性かつ弱毒性であり、個々に、またはワクチン配合物中に組み合わせて、抗-PIV免疫応答を誘発するのに有用である。異なるPIVウイルスの1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合し、またはそれらを組み込んだ、部分または完全ヒトまたはウシPIV”バックグラウンド”ゲノムまたはアンチゲノムを含むキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムを含む単離ポリヌクレオチド分子およびベクターも提供される。本発明のキメラヒト-ウシPIVは、異なるPIVウイルスの1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合してヒト-ウシキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムを形成した、ヒトPIVまたはウシPIVウイルス由来のまたはそれらに従ってパターン化した部分または完全PIV”バックグラウンド”ゲノムまたはアンチゲノムを含む。本発明のある態様において、キメラPIVはウシPIV由来の1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合した部分または完全ヒトPIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含み、これにより得られるキメラウイルスは宿主域制限により弱毒化されている。他の態様において、ヒト-ウシキメラPIVはヒトPIV遺伝子由来の1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメント（ヒト免疫原タンパク質、タンパク質ドメインまたはエピトープ、たとえばPIV HNおよび／またはF糖タンパク質遺伝子またはゲノムセグメントによりコードされるものをコードする）と結合した部分または完全ウシPIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む。本発明のキメラヒト-ウシPIVは、他の病原体に対するワクチンを開発するためのベクターとしても有用である。目的とする表現型および構造効果を得るために、多様な追加変異およびヌクレオチド修飾が本発明のヒト-ウシキメラPIVに付与される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願の引照 本出願は、米国仮特許出願60／143,134（Baillyにより1999年7月9日出願）の
優先権を主張する。
【０００２】 発明の背景 3型ヒトパラインフルエンザウイルス（HPIV3）は、乳児および1歳未満の小児
における重篤な下気道感染症の一般的原因である。この年齢群におけるウイルス
性下気道疾患による入院の主因としては、呼吸系発疹ウイルス（RSV）を除けば
、これは第1位である（Collins et al., B.N. Fields Virology, p. 1205-1243
、第3版、vol. 1、Knipe, et al.編、Lippincott-Raven Publishers、フィラデ
ルフィア、1996；Crowe et al., Vaccine, 13：415-421, 1995；Max et al., J. Infect. Dis., 176 ：1423-1427, 1997；すべてを本明細書に援用する）。この
ウイルスに感染すると、3歳未満の小児では死亡率がかなり高い。HPIV1およびHP
IV2は喉頭気管気管支炎（喉頭炎）の主因物質であり、重篤な肺炎および細気管
支炎の原因ともなりうる（Collins et al., 1996、前掲）。20年間にわたる長期
研究で、HPIV1、HPIV2およびHPIV3はそれぞれ気道疾患による入院の6.0％、3.2
％および11.5％に対する病原体であり、合わせて入院の18％に及ぶと確認され、
このため有効なワクチンが求められている（Murphy et al., Virus Res., 11：1
-15, 1988）。パラインフルエンザウイルスは、中耳炎を伴う小児におけるウイ
ルス誘発性中耳滲出の症例にもかなりの割合で同定されている（Heikkinen et a
l., N. Engl. J. Med., 340：260-264, 1999；本明細書に援用する）。したがっ
て、これらのHPIV感染症に伴う重篤な下気道疾患および中耳炎を阻止できる、こ
れらのウイルスに対するワクチンの製造が求められている。HPIV1、HPIV2および
HPIV3は、有意の交差防御免疫を誘発しない別個の血清型である。PIVの主要防御
抗原はヘマグルチニン（HN）および融合（F）糖タンパク質であり、これらはウ
イルスの付着、透過および放出を仲介する。再感染に対する防御は、主にウイル
ス中和抗体により仲介される。
【０００３】 HPIVに対する有効なワクチン療法を開発するためにかなりの努力がなされてい
るにもかかわらず、HPIV関連疾患を阻止する承認ワクチン製剤はまだ得られてい
ない。現在最も有望な見通しは、弱毒生ワクチンウイルスである。これらは非ヒ
ト霊長類において、受動的に伝達された抗体の存在下、すなわち母体からの獲得
抗体をもつごく若い乳児にみられるものを模した実験状態下ですら、有効である
ことが示されたからである（Crowe, et al., 1995、前掲；およびDurbin et al.
, J. Infect. Dis., 179：1345-1351, 1999a；それぞれを本明細書に援用する）
。2つの弱毒生PIV3ワクチン候補、すなわち野生型PIV3 JS株の温度感受性（ts）
誘導体（PIV3cp45と表示）、およびウシPIV3（BPIV3）株について、臨床評価が
行われている（Karron et al., Pediatr. Infect. Dis. J., 15：650-654, 1996
；Karron et al., 1995a、前掲；Karronet al., 1995b、前掲；それぞれを本明
細書に援用する）。BPIV3ワクチン候補は弱毒化され、遺伝的に安定で、ヒトの
乳児および小児において免疫原性である。第2のPIV3ワクチン候補JS cp45はHPIV
3のJS野生型（wt）株の低温適応変異体である（Karronet al., 1995b、前掲；お
よびBelshe et al., J. Med., Virol., 10：235-242, 1982a；それぞれを本明細
書に援用する）。この低温継代（cp）弱毒生PIV3ワクチン候補は、温度感受性（
ts）、低温適応性（ca）および弱毒（att）表現型を示し、インビボでのウイル
ス複製後も安定である。cp45ウイルスは実験動物においてヒトPIV3攻撃に対する
防御性を示し、弱毒化されており、遺伝的に安定で、血清陰性のヒトの乳児およ
び小児において免疫原性である（Belshe et al., 1982a、前掲；Belshe et al.,
Infect. Immun., 37：160-165, 1982b；Clements et al., J. Clin. Microbiol ., 29 ：1175-1182, 1991；Crookshanks et al., J. Med., Virol., 13：243-249
, 1984；Hall et al., Virus Res., 22：173-184, 1992；Karron et al., 1995b
、前掲；それぞれを本明細書に援用する）。これらのPIV3候補ワクチンウイルス
は生物由来であるので、広範な臨床用として必要と思われるそれらの弱毒化度を
調節するための立証された方法がない。
【０００４】 PIVワクチン候補の開発を促進するために、組換えDNA法により感染性マイナス
鎖RNAウイルスをcDNAから回収することが最近可能になった（概説についてはCon
zelmann, J. Gen. Virol., 77：381-389, 1996；Palese et al., Proc. Natl. A cad. Sci. U.S.A., 93 ：11354-11358, 1996；それぞれを本明細書に援用する）
。これに関して、必須ウイルスタンパク質の存在下でcDNAコードされたアンチゲ
ノムRNAに由来する組換えウイルスのレスキューが、呼吸系発疹ウイルス（RSV）
、狂犬病ウイルス（RaV）、サルウイルス5（SV5）、牛疫ウイルス、ニューカッ
スル病ウイルス（NDV）、水疱性口炎ウイルス（VSV）、麻疹ウイルス（MeV）、
ムンプスウイルス（MuV）およびセンダイウイルス（SeV）について報告された（
たとえば下記を参照：
【０００５】
【化１】
【０００６】 WO97／06270；Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92：11563-11
567, 1995；米国特許出願08／892,403：1997年7月15日出願（WO98／02530に対応
；優先権：米国仮特許出願60／047,634：1997年5月23日出願；60／046,141：199
7年5月9日出願；および60／021,773：1996年7月15日出願）；米国特許出願09／2
91,894：1999年4月13日出願；米国仮特許出願60／129,006：1999年4月13日出願
；米国仮特許出願60／143,097：Buchholzらにより1999年7月9日出願；
【０００７】
【化２】
【０００８】 それぞれの全体を本明細書に援用する。 本発明に関してより具体的には、wt表現型をもつHPIVをcDNAから製造する方法
が、感染性組換えHPIV3 JS株の回収のために最近開発された（たとえば下記を参
照：Durbin et al., Virology, 235：323-332, 1997a；米国特許出願09／083,79
3：1998年5月22日出願；米国仮特許出願60／047,575：1997年5月23日出願（WO98
／53078に対応）；および米国仮特許出願60／059,385：1997年9月19日出願；そ
れぞれを本明細書に援用する）。さらに、これらの開示内容からウイルスcDNAク
ローンを遺伝子操作して、生物学的変異体の表現型変更の遺伝学的原理、たとえ
ばHPIV3 cp45ウイルスにおけるいずれの変異がそのts、caおよびatt表現型を特
定するか、またBPIV3のいずれの遺伝子またはゲノムセグメントがその弱毒表現
型を特定するかを判定することができる。さらに、これらおよび関連の開示内容
から、広範な異なる変異をもつ新規PIVワクチン候補を構築し、それらの弱毒レ
ベル、免疫原性および表現型の安定性を評価できる（たとえば下記も参照：米国
仮特許出願60／143,134：Baillyらにより1999年7月9日出願；および米国特許出
願09／350,821：Durbinらにより1999年7月9日出願；それぞれを本明細書に援用
する）。
【０００９】 こうして、現在では感染性の野生型組換えPIV3である（r）PIV3、および多数
のts誘導体がcDNAから回収され、復帰遺伝子系を用いて特定の弱毒変異をもつ感
染性ウイルスを作製し、既存のワクチンウイルスの弱毒化の遺伝学的原理を研究
するために用いられている。たとえばcp45のL遺伝子中に見いだされた3つのアミ
ノ酸置換を単独で、または組み合わせると、tsおよび弱毒表現型が特定されるこ
とが認められた。PIV3 cp45の他の領域には、さらに他のtsおよび弱毒変異があ
る。さらに、PIV3 cDNAレスキュー系を用い、L中に上記3つの弱毒変異を含むPIV
3全長cDNAにおいてPIV3 HNおよびFオープンリーディングフレーム（ORF）をPIV1
のものと交換することにより、キメラPIV1ワクチン候補が作製された。このcDNA
から誘導された組換えキメラウイルスは、rPIV3-1.cp45Lと表示される（Skiadop
oulos et al., J. Virol., 72：1762-1768, 1998；Tao et al., J. Virol., 72
：2955-2961, 1998；Tao et al., Vaccine., 17：1100-1108, 1999；本明細書に
援用する）。rPIV3-1.cp45Lをハムスターにおいて弱毒化し、PIV1による攻撃に
対する高度の抵抗性を誘導した。rPIV3-1.cp45と表示される組換えキメラウイル
スが作製され、これは15のcp45変異のうち12を含み、すなわちHNおよびFに起き
る変異を除いたものであり、ハムスターの上下気道において高度に弱毒化されて
いた（Skiadopoulos et al., Vaccine., 18：503-510, 1999a）。
【００１０】 抗原的にHPIV3に関連をもつBPIVは、HPIV1、HPIV2およびHPIV3に対する弱毒生
ウイルスワクチンの開発のための代替法を提供する。ヒトに用いられた最初のワ
クチンであるウシ由来と思われる生ワクシニアウイルスは、天然痘のためにほぼ
200年前にジェンナーにより開発された。その後2世紀の間、ワクシニアウイルス
はこの疾患の抑制に有効であり、最終的には天然痘撲滅に重要な役割を果たした
。ワクチン開発のためのこの”ジェンナー”法においては、抗原的に関連のある
動物ウイルスをヒトのワクチンとして用いる。天然宿主に良く適応する動物ウイ
ルスは、ヒトにおいては効率的に複製されず、したがって弱毒化することがしば
しばある。現在でも、この形の宿主域制限についての遺伝学的原理に関しては理
解が不十分である。ウイルスがその哺乳動物宿主またはトリ宿主において進化す
ると、関連のヒトウイルスにおける対応配列のものと有意に異なるヌクレオチド
（nt）配列およびアミノ酸配列が生じる。多数の配列差からなるこの多様な配列
が、宿主域弱毒表現型を特定する。多数の配列差に基づく弱毒表現型をもつこと
は、ヒトでの複製後の動物ウイルスの弱毒表現型の安定性に寄与するにちがいな
いので、ワクチンウイルスに望ましい特性である。
【００１１】 最近特許権を取得した4価ロタウイルスはジェンナー法によるワクチン開発の
一例であり、この場合、非ヒトロタウイルス株であるアカゲザルロタウイルス（
RRV）がヒトにおいて弱毒化され、抗原的に関連性の高いヒト血清型3に対して防
御性を示すことが見いだされた（Kapikian et al., Adv. Exp. Med. Biol., 327 ：59-69, 1992）。4つの主要なヒトロタウイルス血清型それぞれに対する抵抗性
を誘導する多価ワクチンが求められているので、組織培養における遺伝子リアソ
ートメント（reassortment）のための通常の遺伝学的手法を用いて3つのリアソ
ータントウイルスを構築することによりジェンナー法が改変された。それぞれの
単一遺伝子リアソータントウイルスは、10のRRV遺伝子と、血清型1、2または4の
主要中和抗原（VP7）をコードする単一ヒトロタウイルス遺伝と子を含有してい
た。その目的は、このサルウイルスの弱毒化特性とヒトロタウイルス血清型1、2
または4の中和特性を含む単一遺伝子置換RRVリアソータントを作製することであ
った。ヒトにおけるサルRRVの宿主域制限に基づく4価ワクチンは、乳児および小
児においてヒトロタウイルス感染症に対し高度の有効性を備えていた（Perez-Sc
hael et al., N. Engl. J. Med., 337：1181-1187, 1997）。しかしこのワクチ
ンウイルスは移行抗体を欠如する比較的後期の血清陰性乳児では反応原性（reac
togenicity）が弱く、したがってRRVワクチンに代わるべく、ウシロタウイルス
のUK株に基づく第2世代のジェンナー式ワクチンが開発されつつある（Clements-
Mann et al., Vaccine., 17：2715-2725, 1999）。
【００１２】 ジェンナー法は、非ヒト霊長類において弱毒性かつ免疫原性である、1型パラ
インフルエンザウイルスおよびA型肝炎ウイルスに対するワクチンの開発にも利
用されている（Emerson et al., J. Infect. Dis., 173：592-597, 1996；Hurwi
tz et al., Vaccine., 15：533-540, 1997）。ジェンナー法はA型インフルエン
ザウイルスの弱毒生ワクチンの開発に用いられたが、ヒトに使用するための一貫
した弱毒ワクチンを製造することができなかった（Steinhoff et al., J. Infec t. Dis., 163 ：1023-1028, 1991）。他の例として、ヒトA型インフルエンザウイ
ルス由来の表面糖タンパク質ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼをコードす
る2つの遺伝子セグメント、ならびにトリA型インフルエンザウイルスに由来する
残り6つの遺伝子セグメントを含むリアソータントウイルスが、ヒトにおいて弱
毒化された（Clements et al., J. Clin. Microbiol., 27：219-222, 1989；Mur
phy et al., J. Infect. Dis., 152：225-229, 1985；およびSnyder et al., J. Clin. Microbiol., 23 ：852-857, 1986）。これは、トリウイルスの6セグメン
トのうち1以上がこのトリ-ヒトA型インフルエンザウイルスをヒトに対して弱毒
化したことを示す。この弱毒化の遺伝子決定因子が、弱毒トリA型インフルエン
ザウイルス由来の単一遺伝子セグメントおよび残りのヒト株由来の遺伝子をもつ
リアソータントウイルスを用いてマッピングされた。非構造性（NS）遺伝子、ポ
リメラーゼ（PB1、PB2）遺伝子およびM遺伝子がヒトにおけるトリA型インフルエ
ンザウイルスの弱毒表現型に関与していることが示された（Clements et al., J . Clin. Microbiol., 30 ：655-662, 1992）。
【００１３】 他の研究で、チンパンジーにおける複製に対するウシ呼吸系発疹ウイルス（BR
SV）の厳しい宿主域制限は、BRSV FおよびG糖タンパク質をそれらのHRSVカウン
ターパートで交換することにより、わずかに軽減されたにすぎない。これは、F
およびGがこの宿主域制限に関与してはいるが、他の1以上のウシRSV遺伝子も関
与していることを示した（Buchholz et al., J. Virol., 74：1187-1199, 2000
）。これは、霊長類における哺乳動物またはトリウイルスの宿主域制限表現型に
、1以上の遺伝子が予測できない形で関与している可能性を示す。
【００１４】 本発明は、野生型または変異型親ウイルスをHPIVに対するワクチンとして使用
するために弱毒化する新たな基礎を提供する。この場合、弱毒化は完全に、また
は一部が宿主域効果に基づき、一方、キメラウイルスの少なくとも1つ、または
それ以上の主要中和および防御抗原決定因子は、ワクチンが目標とするウイルス
と同種である。BPIV3のHNおよびFタンパク質はそれぞれ、アミノ酸配列では約80
％がそれらに対応するHPIV3タンパク質に関連し（Suzu et al., Nucleic Acids Res., 15 ：2945-2958, 1987；本明細書に援用する）、抗原分析では約25％が関
連する（Coelingh et al., J. Virol., 64：3833-3843, 1990；Coelingh et al.
, J. Virol., 60：90-96, 1986；van Wyke Coelingh et al., J. Infect. Dis., 157 ：655-662, 1988；それぞれを本明細書に援用する）。以前の研究で、2つの
BPIV3株、カンサス（Ka）株および船積熱（SF）始原型株が、アカゲザルの上下
気道に対して弱毒化され、これらのうちの1つ、Ka株はチンパンジーにおいて弱
毒化されることが示された（van Wyke Coelingh et al., 1988、前掲；本明細書
に援用する）。非ヒト霊長類をKaウイルスで免疫化すると、HPIV3反応性の抗体
が誘導され、サルの上下気道におけるヒトウイルスの複製に対する抵抗性が誘導
された（同著）。ヒトにおけるKa株のその後の評価で、このウイルスは血清陰性
乳児に対して十分に弱毒化され、完全感受性の乳児および小児において複製後も
弱毒表現型を保持することが示された（Karron et al., 1996、前掲；Karron et
al., 1995a、前掲；それぞれを本明細書に援用する）。したがってその主な利
点は、完全感受性の乳児および小児に対して十分に弱毒化され、かつその弱毒表
現型がヒトにおける複製後も安定であることであった。
【００１５】 しかし、105.0組織培養感染量50（TCID50）のBPIV3 Ka株を接種した血清陰性
被接種者に誘導されたHPIV3反応性の血球凝集反応阻止性血清抗体レベルは1：10
.5であり、弱毒生HPIV3ワクチンを接種した同様な被接種者より3倍低かった（Ka
rron et al., 1995a、前掲；およびKarron et al., 1995b、前掲；それぞれを本
明細書に援用する）。BPIV3により誘導されたヒトウイルス抗体レベルが低いの
は、大部分がHPIV3とBPIV3の抗原の相異を反映している（Karron et al., 1996
、前掲；およびKarron et al., 1995a、前掲；それぞれを本明細書に援用する）
。HPIVに対するKaワクチン候補の有効性をヒトにおいて判定する試験は行われて
いないが、HPIV3反応性抗体のこのレベル低下は防御効果レベルの低下に反映さ
れると思われる。
【００１６】 BPIV3はアカゲザル、チンパンジーおよびヒトの気道における複製を制限する
宿主域遺伝子をもつことは明らかであるが、どのウシタンパク質またはウシ非コ
ード配列がこの複製宿主域制限に関与しているかはまだ分かっていない。いずれ
のBPIV3タンパク質または非コード配列も、宿主域表現型に関与している可能性
がある。どの遺伝子またはゲノムセグメントが弱毒表現型を与えるかを予め判定
することはできない。これは、BPIV3のコード配列および非コード配列をそれら
のHPIV3カウンターパートで系統的に置換し、回収したHPIV3／BPIV3キメラウイ
ルスを血清陰性アカゲザルまたはヒトにおいて評価することによって初めて達成
できる。
【００１７】 PIV血清型1、2および3に対する有効なワクチン製剤の開発に役立つ多くの進歩
が得られたにもかかわらず、PIVに起因する健康上重大な問題、特にHPIV感染に
よる乳児および小児の疾患を軽減するための安全かつ有効なワクチンの製造に用
いる他の手段および方法を求める明らかな要望が、当技術分野に依然としてある
。これに関して残された攻略法には、多様な臨床状況に使用するための適切に弱
毒化された免疫原性の、遺伝的に安定なワクチン候補を作製する他の手段が必要
である。これらの目標を達成するためには、弱毒変異を同定して組換えワクチン
株に組み込むための既存の方法を拡張しなければならない。さらに、動物用新規
ワクチン候補を設計することが、ヒトPIVに対するワクチンを設計するための方
法および組成物も提供すると認識される。意外にも、本発明はこれらの要望を満
たし、以下に記載する利点をさらに備えている。
【００１８】 発明の概要 本発明は、ヒトおよび他の哺乳動物において感染性かつ弱毒性であるヒト-ウ
シキメラ-パラインフルエンザ（PIV）を提供する。関連態様において本発明は、
種々の組成物としてPIV感染に対し感受性の宿主においてPIVに対する目的免疫応
答を生じるのに有用な弱毒ヒト-ウシキメラPIVを設計および作製するための新規
方法を提供する。本発明のこれらの態様には、異なるPIVウイルスの1以上のヘテ
ロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合し、またはそれらを組み込んだ、
部分または完全ヒトまたはウシPIV”バックグラウンド”ゲノムまたはアンチゲ
ノムを含有するキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムを含む、新規な単離ポリヌ
クレオチド分子、およびそれらの分子を含むベクターが含まれる。本発明によれ
ば、PIV感染症の予防および治療のための方法、ならびにヒト-ウシキメラPIVを
含む組成物も提供される。
【００１９】 本発明は、たとえばHPIVとBPIV3のキメラに基づく弱毒生PIVワクチン候補を開
発するための方法に関する。キメラは、cDNAベースのウイルス回収系を用いて作
製される。cDNAから作製した組換えウイルスは、生物由来のウイルスと同様に、
独立して複製し、増殖する。本発明のキメラヒト-ウシPIVは、感染性キメラウイ
ルスまたはサブウイルス粒子を産生するために、ヒトとウシ両方のPIVに由来す
るヌクレオチドを含むように組換え工学的に作製される。この方法で候補ワクチ
ンウイルスを組換え工学的に作製して、PIV感染に対して感受性の哺乳動物宿主
（ヒトおよびヒト以外の霊長類を含む）においてPIVに対する免疫応答を誘発す
る。本発明によるキメラヒト-ウシPIVは、特定のPIV、たとえばHPIV3に対する免
疫応答、または多重PIV、たとえばHPIV1とHPIV3に対する多価応答を誘発するよ
うに工学的に作製できる。本明細書の教示に従って、非PIV病原体、たとえば呼
吸系発疹ウイルス（RSV）または麻疹ウイルスの抗原のためのベクターとして作
用する他のキメラウイルスを設計できる。
【００２０】 本発明のキメラヒト-ウシPIVの一例は、ヒトおよびウシ両方のポリヌクレオチ
ド配列を含むキメラPIVゲノムまたはアンチゲノム、ならびに主要ヌクレオキャ
プシドタンパク質（N）、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）、およびラー
ジポリメラーゼタンパク質（L）を含有する。追加PIVタンパク質を種々の割合で
含有させて、完全ウイルス粒子、または過剰タンパク質（supernumerary protei
n）、抗原決定因子その他の追加成分を含むウイルス粒子にまで及ぶ一連の感染
性サブウイルス粒子を提供することができる。
【００２１】 本発明のキメラヒト-ウシPIVは、異なるPIVの1以上のヘテロロガス遺伝子また
はゲノムセグメントと結合してヒト-ウシキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムを
形成した、ヒトまたはウシPIV株またはサブグループウイルスに由来するか、あ
るいはそれらに従って構成された、部分または完全”バックグラウンド”PIVゲ
ノムまたはアンチゲノムを含有する。本発明の好ましい態様においてキメラPIV
は、ウシPIV由来の1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合し
た、部分または完全ヒトPIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む
。
【００２２】 部分または完全バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムは一般にレシピエ
ント主鎖またはベクターとして作用し、これにカウンターパートであるヒトまた
はウシPIVのヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントが取り込まれる。カウ
ンターパートであるヒトまたはウシPIV由来のヘテロロガス遺伝子またはゲノム
セグメントは”ドナー”遺伝子またはポリヌクレオチドであり、これはバックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノムと結合して、あるいはそれらにおいて置換し
て、関与PIVの一方または両方と比較して新規な表現型特性を示すヒト-ウシキメ
ラPIVが得られる。たとえば、選択したレシピエントPIV鎖におけるヘテロロガス
遺伝子またはゲノムセグメントの付加または置換により、修飾されていないレシ
ピエントおよび／またはドナーの対応する表現型と比較して、弱毒性の増大もし
くは低下、増殖性の変更、免疫原性の改変、または目的とする他の表現型変更を
生じることができる。
【００２３】 本発明のヒト-ウシキメラPIV中におけるヘテロロガス置換配列または付加配列
として用いる遺伝子およびゲノムセグメントには、PIV N、P、C、D、V、M、F、S
H（適切な場合）、HNおよび／またはLタンパク質またはその部分をコードする遺
伝子またはゲノムセグメントが含まれる。さらに、非PIVタンパク質、たとえば
ムンプスおよびSV5ウイルス中にみられるSHタンパク質をコードする遺伝子また
はゲノムセグメントが本発明のヒト-ウシキメラPIVに含まれてもよい。調節領域
、たとえば遺伝子外3'リーダー領域または5'トレイラー領域、ならびに遺伝子開
始領域、遺伝子終止領域、遺伝子間領域、または3'もしくは5'側非翻訳領域も、
ヘテロロガス置換配列または付加配列として有用である。
【００２４】 本発明の好ましいヒト-ウシキメラPIVワクチン候補は、1以上のBPIV3遺伝子ま
たはゲノムセグメントの置換または付加により弱毒化されたバックグラウンド中
に、HPIV3の1以上の主要抗原決定因子を保有する。PIVの主要防御抗原はそれら
のHNおよびF糖タンパク質であるが、他のタンパク質も防御免疫応答に寄与する
可能性がある。特定の態様において、バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノ
ムはHPIVゲノムまたはアンチゲノム、たとえばHPIV3、HPIV2またはHPIV1バック
グラウンドゲノムまたはアンチゲノムであり、これに1以上のBPIV遺伝子または
ゲノムセグメント、好ましくはBPIV3由来のものがこれに付加または置換挿入さ
れる。以下に示す態様例においては、BPIV3のN遺伝子のORFがHPIVのものを置換
している。あるいはバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムはBPIVゲノムま
たはアンチゲノムであって、これがHPIV3、HPIV2またはHPIV1の糖タンパク質、
糖タンパク質ドメインまたは他の抗原決定因子をコードする1以上の遺伝子また
はゲノムセグメントと結合していてもよい。
【００２５】 本発明方法によれば、任意のBPIV遺伝子またはゲノムセグメントを単独で、ま
たは1以上の他のBPIV遺伝子と組み合わせて、HPIV配列と結合させ、ヒト-ウシキ
メラPIVワクチン候補を得ることができる。特定のHPIV血清型、たとえばHPIV3の
異なる株を含めた任意のHPIVが、弱毒BPIV遺伝子の妥当な受容体であろう。一般
にヒトPIVに対するワクチンとして使用するヒト-ウシキメラPIVに挿入するため
に選択されるHPIV3遺伝子またはゲノムセグメントは、1以上のHPIV防御抗原、た
とえばHNまたはF糖タンパク質を含有する。
【００２６】 本発明の態様例において、1以上のウシ遺伝子またはゲノムセグメントを保有
するヒト-ウシキメラPIVは、たとえばヒトPIV感染症の哺乳動物モデル（たとえ
ば非ヒト霊長類）の気道において、高度の宿主域制限を示す。一例においては、
部分または完全ヒトPIV（たとえばHPIV3）バックグラウンドゲノムまたはアンチ
ゲノムに対する1以上のウシ遺伝子またはゲノムセグメントの付加または置換に
より、ヒトPIVが弱毒化される。一例においては、HPIV3 N遺伝子をBPIV3 N遺伝
子で置換すると、新規なヒト-ウシキメラPIVワクチン候補が得られる。
【００２７】 好ましくは、本発明のヒト-ウシキメラPIVワクチン候補が示す宿主域制限度は
、各BPIV親、すなわち”ドナー”株が示す宿主域制限度に匹敵する。好ましくは
、制限は真の宿主域表現型をもつべきである。すなわちそれは当該宿主に特異的
でなければならず、かつ適切な細胞系におけるインビトロでの複製およびワクチ
ン製造を制限してはならない。さらに、1以上のウシ遺伝子またはゲノムセグメ
ントを保有するヒト-ウシキメラPIVは、PIV感染に対して感染性の宿主において
高度の抵抗性を誘発する。したがって本発明はPIVに対する生ウイルスワクチン
を弱毒化するための新規な基礎を提供し、その1つはたとえばHPIV3とBPIV3の間
でヘテロロガスPIV由来の1以上の遺伝子またはゲノムセグメントを導入すること
による宿主域効果に基づく。
【００２８】 本発明の関連態様において、ヒト-ウシキメラPIVは、HPIV HNおよび／またはF
糖タンパク質をコードする1以上のヘテロロガス遺伝子を含む。あるいはこのキ
メラPIVは、HPIV HNおよび／またはF糖タンパク質のエクトドメイン（あるいは
細胞質ドメインおよび／または貫膜ドメイン）、または免疫原エピトープをコー
ドする1以上のゲノムセグメントを含むことができる。これらの免疫原タンパク
質、ドメインおよびエピトープは免疫化宿主において新規な免疫応答を生じるの
で、ヒト-ウシキメラPIV中に特に有用である。特にHNおよびFタンパク質、なら
びにその中の免疫原ドメインおよびエピトープは、主要防御抗原を提供する。
【００２９】 本発明の特定の態様において、ウシバックグラウンド（すなわちレシピエント
）ゲノムまたはアンチゲノムに対する、ヒトPIVサブグループまたは株（1以上の
特異的ヒトPIVサブグループまたは株が含まれる）に由来する1以上の免疫原遺伝
子またはゲノムセグメントの付加または置換により、ヒトドナーウイルスに向け
られた免疫応答を発生しうる組換えキメラウイルスまたはサブウイルス粒子が得
られ、一方、ウシ主鎖はキメラがワクチン開発に有用な候補となる弱毒表現型を
与える。一例においては、1以上のヒトPIV糖タンパク質遺伝子（たとえばHNおよ
び／またはF）を部分または完全ウシゲノムまたはアンチゲノムにおいて付加ま
たは置換すると、感受性宿主において抗ヒトPIV免疫応答を誘発する弱毒感染性
ヒト-ウシキメラが得られる。
【００３０】 別態様においては、ヒト-ウシキメラPIVはさらに、多重ヒトPIV株、たとえば
それぞれ異なるHPIV（たとえばHPIV1またはHPIV2）に由来する2つのHNもしくはF
タンパク質またはその免疫原部分に由来する免疫原タンパク質、タンパク質ドメ
インまたはエピトープをコードする遺伝子またはゲノムセグメントを含む。ある
いは、余分な糖タンパク質または決定因子をコードするポリヌクレオチドをゲノ
ムまたはアンチゲノムに付加することなく、置換により1つの糖タンパク質また
は免疫原決定因子を第1のHPIVから供給し、第2の糖タンパク質または免疫原決定
因子を第2のHPIVから供給してもよい。HPIV糖タンパク質および抗原決定因子の
置換または付加は、組換えウイルスまたはサブウイルス粒子においてキメラ糖タ
ンパク質をコードするゲノムまたはアンチゲノムであって、たとえば第1のHPIV
の免疫原エピトープ、抗原領域または完全エクトドメインがヘテロロガスHPIVの
細胞質ドメインに融合したものを含むものを構築することによっても達成できる
。たとえば、HPIV1またはHPIV2のHNまたはF糖タンパク質由来の糖タンパク質エ
クトドメインをコードするヘテロロガスゲノムセグメントと、対応するHPIV3 HN
またはF糖タンパク質の細胞質／エンドドメインをコードするゲノムセグメント
を、バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中で結合させることができる。
【００３１】 別態様において、ヒト-ウシキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムは、代替の、
余分な、もしくはキメラ糖タンパク質またはその抗原決定因子を組換えウイルス
またはサブウイルス粒子においてコードして、ヒトおよびウシ両方の糖タンパク
質、糖タンパク質ドメインまたは免疫原エピトープをもつウイルス組換え体を形
成することができる。たとえば、ヒトPIV HNまたはF糖タンパク質由来の糖タン
パク質エクトドメインをコードするヘテロロガスゲノムセグメントと、対応する
ウシHNまたはF糖タンパク質の細胞質／エンドドメインをコードするゲノムセグ
メントを、バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中で結合させることがで
きる。あるいはヒトPIV HNまたはF糖タンパク質由来の糖タンパク質またはその
部分を、他のPIV株または血清型に由来するHNもしくはF糖タンパク質またはその
部分をコードするゲノムセグメントと結合させることができる。
【００３２】 したがって本発明によれば、ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントで、
部分バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のカウンターパート遺伝子ま
たはゲノムセグメントを置換することにより、ヒト-ウシキメラPIVを構築するこ
とができる。あるいは、ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントを、完全（
または他の遺伝子またはゲノムセグメントを欠失した場合は、部分）PIVバック
グラウンドゲノムまたはアンチゲノムと組み合わせる過剰遺伝子またはゲノムセ
グメントとして付加することができる。たとえば、2つのヒトPIV HNまたはF遺伝
子またはゲノムセグメント（HPIV2とHPIV3に由来するもの各1つ）を含むことが
できる。
【００３３】 ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントを、部分または完全PIVバックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノム中の遺伝子間位置の近くに付加することがし
ばしばある。あるいは、遺伝子またはゲノムセグメントをゲノムの他の非コード
領域、たとえば部分または完全PIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム
中の5'もしくは3'側非コード領域内、または非コードヌクレオチドがある他の位
置に配置することもできる。1態様において、非コード調節領域が効率的な複製
、転写および翻訳に必要なシス作用シグナルを含み、したがってヘテロロガス遺
伝子もしくはゲノムセグメントまたは本明細書に開示する他の変異の導入により
これらの機能を修飾するためのターゲット部位となる。
【００３４】 本発明のより詳細な態様においては、シス作用調節領域に弱毒変異を導入して
、たとえば（1）組織特異的弱毒（Gromeier et al., J. Virol., 73：958-964,
1999；Zimmermann et al., J. Virol., 71：4145-4149, 1997）、（2）インター
フェロンに対する感受性の増大（Zimmermann et al., 1997；前掲）、（3）温度
感受性（Whitehead et al., 1998a；前掲）、（4）複製レベルの全般的制限（Me
n et al., J. Virol., 70：3930-3937, 1996；Muster et al., Proc. Natl. Aca d. Sci. U.S.A., 88 ：5177-5181, 1991）、および／または（5）宿主特異的な複
製制限（Cahour et al., Virology, 207：68-76, 1995）を得ることができる。
これらの弱毒変異は、本発明の弱毒ヒト-ウシキメラPIVを作製するための種々の
方法で、たとえば点変異、関連ウイルス間での配列交換、またはヌクレオチド欠
失により達成できる。
【００３５】 本明細書に提示するさらに他の方法では、ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセ
グメントを、部分または完全PIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中
のカウンターパート遺伝子もしくはゲノムセグメントの野生型遺伝子オーダー位
置に対応する位置において、付加または置換することができる。他の態様におい
ては、ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントを、バックグラウンドゲノム
またはアンチゲノム中の野生型遺伝子オーダー位置と対比して、よりプロモータ
ーに近い位置もしくはプロモーターから遠い位置において、付加または置換して
、ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントの発現をそれぞれ増大または低下
させる。
【００３６】 本発明の一般的態様においては、ウシ遺伝子またはゲノムセグメントをヒトPI
Vバックグラウンドにおいて付加または置換して、弱毒ヒト-ウシキメラPIVを形
成することができる。あるいは、本発明のキメラは、1以上のヒト遺伝子または
ゲノムセグメントをウシPIVバックグラウンドにおいて付加または置換して、弱
毒PIVワクチン候補を形成したものであってもよい。これに関して、キメラPIVゲ
ノムまたはアンチゲノムは、ヒトPIV由来のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセ
グメントと結合した部分または完全ウシPIVバックグラウンドゲノムまたはアン
チゲノムから形成される。好ましい態様においては、1以上のウシPIV遺伝子また
はゲノムセグメントで、ヒトPIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中
のカウンターパート遺伝子またはゲノムセグメントを置換する。別態様において
は、1以上のヒトPIV糖タンパク質遺伝子（たとえばHNおよび／またはF）、また
は細胞質ドメイン、貫膜ドメイン、エクトドメインもしくは免疫原エピトープを
コードするヒトPIV糖タンパク質遺伝子のゲノムセグメントで、ウシPIVバックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のカウンターパート遺伝子またはゲノムセ
グメントを置換する。たとえば、ヒトPIV糖タンパク質遺伝子HNおよびFの両方で
、ウシPIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のカウンターパートHN
およびF糖タンパク質遺伝子を置換する。
【００３７】 同様に、本発明のキメラヒト-ウシPIVは、異なる病原体［1より多いPIV株また
はグループ（たとえばヒトPIV3とヒトPIV1の両方）、呼吸系発疹ウイルス（RSV
）、麻疹ウイルス、その他の病原体を含める］に由来する抗原決定因子を取り込
むための”ベクター”として容易に設計できる（たとえば米国仮特許出願60／17
0,195：Murphyらにより1999年12月10日出願、参照；本明細書に援用する）。
【００３８】 本発明のより詳細な態様においては、ヒト-ウシキメラPIVは、ヒトPIV由来の1
以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合した部分または完全BP
IVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムから構成される。これらの態様に
おいては、1以上のHPIV糖タンパク質遺伝子HNおよびF、あるいはHNおよび／また
はF遺伝子の細胞質ドメイン、貫膜ドメイン、エクトドメインまたは免疫原エピ
トープをコードする1以上のゲノムセグメントを、BPIVバックグラウンドゲノム
またはアンチゲノムに付加し、あるいはBPIVバックグラウンドゲノムまたはアン
チゲノム中の1以上のカウンターパート遺伝子またはゲノムセグメントと置換し
て、キメラ構築体を得ることができる。たとえば後記の組換えキメラウイルスrB
PIV3-FHHNHのように、HPIV糖タンパク質遺伝子HNおよびFの両方で、BPIVバック
グラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のカウンターパートHNおよびF糖タンパ
ク質遺伝子を置換することがしばしばある。これはヒトPIVの抗原決定因子とウ
シPIVの宿主域制限要素を結合させたものであるので、望ましい構築体である。
【００３９】 本発明のヒト-ウシキメラPIVにおいて提供される宿主域表現型効果と合わせて
、キメラウイルスの弱毒性を増大または低下させる追加変異を導入することによ
り弱毒表現型を調節することがしばしば望ましい。したがって本発明の他の態様
においては、生成するウイルスまたはサブウイルス粒子における弱毒表現型を特
定する1以上の弱毒変異の導入によりキメラゲノムまたはアンチゲノムがさらに
修飾された弱毒ヒト-ウシキメラPIVが作製される。これらには、RNA調節配列ま
たはコードされるタンパク質における変異が含まれる。これらの弱毒変異をde n
ovoで形成し、合理的な設計変異誘発方式に従って弱毒効果を調べることができ
る。あるいは、既存の生物由来変異PIVにおいて弱毒変異を確認した後、本発明
のヒト-ウシキメラPIVに挿入することもできる。
【００４０】 本発明のキメラウシ-ヒトPIV中に弱毒および他の目的表現型を特定する変異を
導入することは、ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメント、たとえばそのL
タンパク質またはその部分をコードする遺伝子を、ウシまたはヒトPIVバックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノムに伝達することにより達成できる。あるいは
、選択したバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中にその変異が存在し、
導入したヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントは変異をもたないか、また
は1以上の異なる変異をもつこともできる。一般にヒトまたはウシバックグラウ
ンド、すなわち”レシピエント”ゲノムまたはアンチゲノムを、ヘテロロガスウ
イルス（たとえばヘテロロガスウシもしくはヒトPIV、または非PIVマイナス鎖RN
Aウイルス）における変異部位に対応する1以上の部位で修飾して、ドナーウイル
ス中に同定されるものと同じ変異または保存的に関連する変異を含有またはコー
ドさせる（たとえば保存的アミノ酸置換）（たとえばPCT／US00／09695：2000年
4月12日出願；およびその優先権：米国仮特許出願60／129,006：1999年4月13日
出願；本明細書に援用する）。一例においては、ウシバックグラウンド、すなわ
ち”レシピエント”ゲノムまたはアンチゲノムを、HPIV3 JScp45における変異部
位（後記に列記）に対応する1以上の部位で修飾して、cp45”ドナー”中に同定
されるものと同じ変異、または保存的に関連する変異を含有またはコードさせる
。
【００４１】 弱毒変異を同定して本発明のウシ-ヒトキメラPIVに挿入するのに好ましい変異
PIV株には、低温継代（cp）、低温適応性（ca）、宿主域制限（hr）、縮小プラ
ーク（sp）および／または温度感受性（ts）変異体、たとえばJS HPIV3 cp45変
異株が含まれる。一例においては、1以上の弱毒変異がポリメラーゼLタンパク質
において、たとえばJS野生型HPIV3のTyr942、Leu992、またはThr1558に対応する
位置において起きる。あるいはNタンパク質においてたとえばJSの残基Val96また
はSer389に対応する位置のアミノ酸置換をコードする弱毒変異を選択し、ヒト-
ウシキメラPIVに挿入することができる。その代替または追加の変異は、Cタンパ
ク質においてたとえばJSのIle96に対応する位置、およびMタンパク質においてた
とえばPro199に対応する位置（たとえばPro199からThrへの変異）におけるアミ
ノ酸置換をコードするものであってもよい。本発明のヒト-ウシキメラPIVの弱毒
性を調節するための追加変異はさらに、Fタンパク質においてたとえばJSのIle42 0 またはAla450に対応する位置、およびHNタンパク質においてたとえばJSの残基V
al384に対応する位置にみられる。
【００４２】 本発明のヒト-ウシキメラPIVに取り込ませるための生物由来PIV変異体からの
弱毒変異は、PIVゲノムまたはアンチゲノムの非コード部分、たとえば3'リーダ
ー配列における変異をも含む。これに関する変異の例は、組換えウイルスの3'リ
ーダーおいてJS cp45のヌクレオチド23、24、28もしくは45に対応する位置に工
学的に作製できる。さらに他の変異例は、N遺伝子開始配列において、たとえばN
遺伝子開始配列中の1以上のヌクレオチド、たとえばJS cp45のヌクレオチド62に
対応する位置のヌクレオチドを交換することにより工学的に作製できる。
【００４３】 JS cp45その他の生物由来PIV変異体から多くの弱毒変異”メニュー”が得られ
、その各変異を、ヒトおよびウシ遺伝子またはゲノムセグメントのキメラである
ゲノムまたはアンチゲノムを保有する組換えPIV中において、弱毒レベル調節の
ための他の任意の変異と組み合わせることができる。たとえば、本発明の組換え
PIVにおける変異には、1以上、好ましくは2以上のJS cp45変異が含まれる。ワク
チンとして使用するために選択する本発明の目的ヒト-ウシキメラPIVは、広範な
臨床用として十分なレベルの弱毒化を達成するために、しばしば少なくとも2つ
、時には3つ以上の弱毒変異をもつ。好ましくは、組換えヒト-ウシキメラPIVは
変異を特定するコドンにおける多重ヌクレオチド置換によって安定化された1以
上の弱毒変異を含む。
【００４４】 本発明の目的ヒト-ウシキメラPIVに適合または伝達しうる追加変異を非PIV非
セグメント化マイナス鎖RNAウイルスにおいて同定し、本発明のPIV変異体に挿入
することができる。これは、ヘテロロガスマイナス鎖RNAウイルスにおいて同定
した変異を、レシピエントPIVゲノムまたはアンチゲノム中の対応する相同部位
にマッピングし、そしてレシピエントにおける既存の配列を変異遺伝子型に変異
させる（同一または保存変異により）ことによって、容易に達成される；PCT／U
S00／09695：2000年4月12日出願；およびその優先権：米国仮特許出願60／129,0
06：1999年4月13日出願；本明細書に援用する。
【００４５】 組換えヒト-ウシキメラPIVのほか、本発明はそれぞれHPIVおよびBPIV配列を含
み、かつ所望により、本明細書に示す1以上の追加の表現型特異的変異を含む関
連cDNAクローン、ベクターおよび粒子を提供する。これらを、選択された組合わ
せで、本明細書に記載の方法に従ってたとえば組換えcDNAゲノムまたはアンチゲ
ノムである単離ポリヌクレオチドに導入して、発現に際し適切に弱毒化された感
染性ウイルスまたはサブウイルス粒子を生成させる。この方法をルーティンな表
現型評価法と組合わせると、弱毒性、温度感受性、免疫原性改変、低温適応性、
縮小プラークサイズ、宿主域制限、遺伝子安定性などの目的特性をもつヒト-ウ
シキメラPIVが得られる。特に、弱毒化され、なおかつ接種哺乳動物宿主におい
て防御免疫応答を誘発するのに十分なほど免疫原性であるワクチン候補が選択さ
れる。
【００４６】 本発明のさらに他の態様においては、たとえば生物由来の弱毒変異ウイルスか
ら移入した追加変異を含むかまたは含まないヒト-ウシキメラPIVが、目的とする
表現型、構造または機能の変更をもたらす追加ヌクレオチド修飾をもつように構
築される。一般に、選択されるヌクレオチド修飾は、表現型の変更、たとえば増
殖特性、弱毒性、温度感受性、低温適応性、プラークサイズ、宿主域制限または
免疫原性の変更を特定する。これに関して構造変更には、操作および同定を容易
にするためにPIVコードcDNAにおいて制限部位を導入または切除することが含ま
れる。
【００４７】 好ましい態様において、ヒト-ウシキメラPIVのゲノムまたはアンチゲノムにお
けるヌクレオチド変更には、遺伝子の部分欠失もしくは完全欠失またはその発現
の低下もしくは排除（ノックアウト）によるウイルス遺伝子修飾が含まれる。こ
れらの修飾をヒトまたはウシのバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムに導
入するか、あるいはそれらにおいて付加または置換されるヘテロロガス遺伝子ま
たはゲノムセグメントに取り込ませることによりキメラゲノムまたはアンチゲノ
ムに導入することができる。これに関する変異のためのターゲット遺伝子には任
意のPIV遺伝子が含まれ、これにはヌクレオキャプシドタンパク質N、リンタンパ
ク質P、ラージポリメラーゼサブユニットL、マトリックスタンパク質M、ヘマグ
ルチニン-ノイラミニダーゼタンパク質HN、低分子疎水性SHタンパク質（適切な
場合には）、融合タンパク質F、ならびにC、DおよびVオープンリーディングフレ
ーム（ORF）生成物が含まれる。組換えウイルスが生存性および感染性を維持す
る限り、これらの各タンパク質を全体的または部分的に、単独で、または他の目
的修飾と組合わせて、選択的に欠失、置換または再配列し、新規な欠失またはノ
ックアウト変異体を得ることができる。たとえばC、Dおよび／またはV遺伝子を
全体的または部分的に欠失させ、あるいはその発現を低下もしくは排除すること
ができる（たとえば停止コドンの導入により、RNA編集部位の変異により、開始
コドンによって特定されるアミノ酸を改変する変異により、またはターゲットOR
Fにおけるフレームシフト変異により）。1態様では、編集部位において、編集を
阻害し、そのmRNAがRNA編集により生成するタンパク質の発現を排除する変異を
起させることができる（Kato et al., EMBO J., 16：578-587, 1997a、およびSc
hneider et al., Virology, 227：314-322, 1997；それぞれを本明細書に援用す
る）。あるいは、1以上のC、Dおよび／またはV ORFを全体的または部分的に欠失
させて、得られる組換えクローンの表現型を改変し、増殖性、弱毒性、免疫原性
その他の目的表現型特性を改善することができる（米国特許出願09／350,821：1
999年7月9日出願、参照；本明細書に援用する）。
【００４８】 本発明のヒト-ウシキメラPIVにおける他のヌクレオチド修飾には、組換えゲノ
ムまたはアンチゲノム中の選択した遺伝子に対するシス作用調節配列の欠失、挿
入、付加または再配列が含まれる。本明細書に記載する他のこのような修飾に関
しては、これらの修飾をヒトまたはウシのバックグラウンドゲノムまたはアンチ
ゲノムに導入するか、あるいはそれらにおいて付加または置換されるヘテロロガ
ス遺伝子またはゲノムセグメントに取り込ませることによりキメラゲノムまたは
アンチゲノムに導入することができる。一例においては、1つのPIV遺伝子のシス
作用調節配列をヘテロロガス調節配列に対応するように変化させる。これは異な
るPIV中の同一遺伝子のカウンターパートシス作用調節配列、または異なるPIV遺
伝子のシス作用調節配列であってもよい。たとえば遺伝子終止シグナルを同一PI
V株の異なる遺伝子の遺伝子終止シグナルに変換または置換することにより修飾
できる。他の態様においてヌクレオチド修飾は、たとえば選択した形のタンパク
質に対するオータナティブ翻訳開始部位を切除するための、組換えゲノムまたは
アンチゲノムにおける翻訳開始部位の挿入、欠失、置換または再配列を含むこと
ができる。
【００４９】 さらに、他の多様な遺伝子変化を単独で、または生物由来の変異PIVから移入
した1以上の弱毒変異と共に、ヒト-ウシキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムに
導入することができる。たとえば非PIV源に由来する遺伝子またはゲノムセグメ
ントを全体的または部分的に挿入できる。あるいは、遺伝子の順序を変更し、ま
たはPIVゲノムプロモーターをそれのアンチゲノムカウンターパートと交換する
ことができる。操作を容易にするために、組換えゲノムまたはアンチゲノムにお
いて異なる修飾または追加の修飾、たとえば種々の非コード領域または他の領域
へのユニーク制限部位の挿入を行うことができる。外来配列の挿入容量を高める
ために、非翻訳遺伝子配列を除去することができる。
【００５０】 さらに他の態様においては、非PIV配列、たとえばサイトカイン、Tヘルパーエ
ピトープ、制限部位マーカー、または目的宿主において防御免疫応答を誘発する
ことができる微生物病原体（たとえばウイルス、細菌、寄生虫または真菌）のタ
ンパク質もしくは免疫原エピトープをコードするように、ヒト-ウシキメラPIVゲ
ノムまたはアンチゲノムを含むポリヌクレオチド分子またはベクターを修飾する
ことができる。そのような1態様においては、呼吸系発疹ウイルス（RSV）由来の
遺伝子またはゲノムセグメント、たとえばRSVの抗原タンパク質（たとえばFまた
はGタンパク質）、免疫原ドメインまたはエピトープをコードする遺伝子を含む
ヒト-ウシキメラPIVを構築する。
【００５１】 本発明の関連態様においては、単離した感染性ヒト-ウシキメラPIVを産生する
ための組成物（たとえば、PIVコードcDNAを含む単離ポリヌクレオチドおよびベ
クター）および方法が提供される。本発明のこれらの態様には、ヒト-ウシキメ
ラPIVゲノムまたはアンチゲノムを含む新規な単離ポリヌクレオチド分子および
ベクターが含まれる。N、PおよびLタンパク質をコードする1以上の単離ポリヌク
レオチド分子を含む、同一または異なる発現ベクターも提供される。これらのタ
ンパク質をゲノムまたはアンチゲノムcDNAから直接発現させることもできる。好
ましくは細胞または無細胞溶解物中でベクターを発現または同時発現させ、これ
により感染性ヒト-ウシキメラPIVウイルス粒子またはサブウイルス粒子を産生さ
せる。
【００５２】 ヒト-ウシキメラPIVを産生させるための前記方法および組成物により、感染性
ウイルスもしくはサブウイルス粒子またはその誘導体が得られる。組換えによる
感染性ウイルスは基準PIVウイルスに匹敵し、同様に感染性である。それを新鮮
な細胞に直接感染させることができる。感染性サブウイルス粒子は一般に、適切
な条件下で感染を開始することができるウイルス粒子副成分である。たとえば、
ゲノムまたはアンチゲノムRNA、ならびにN、PおよびLタンパク質を含有するヌク
レオキャプシドは、細胞の細胞質に導入されると感染を開始させることができる
サブウイルス粒子の一例である。本発明において提供されるサブウイルス粒子に
は、感染性に必須でない1以上のタンパク質、タンパク質セグメント、または他
のウイルス成分を欠如するウイルス粒子が含まれる。
【００５３】 本発明の他の態様においては、前記のヒト-ウシキメラPIVゲノムまたはアンチ
ゲノムを含む単離ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター、ならびにPIVのN、
PおよびLタンパク質をコードする1以上の単離ポリヌクレオチド分子を含む発現
ベクター（同一または異なるベクター）を含有する無細胞溶解物が提供される。
これらの1以上のタンパク質をゲノムまたはアンチゲノムcDNAから発現させるこ
ともできる。発現すると、ゲノムまたはアンチゲノムとN、PおよびLは結合して
、感染性ヒト-ウシキメラPIVウイルスまたはサブウイルス粒子を形成する。
【００５４】 本発明のヒト-ウシキメラPIVは、PIV感染に対して感受性の宿主においてPIVに
対し目的とする免疫応答を生じるための種々の組成物中に使用される。ヒト-ウ
シキメラPIV組換え体は感染哺乳動物において防御免疫応答を誘発することがで
き、かつ免疫化宿主に許容できない重篤な症状の呼吸系疾患を引き起さないほど
十分に弱毒化されている。さらに、ヒト-ウシキメラPIV組換え体は、ワクチン製
造を可能にするのに十分なインビトロ効率で複製しなければならない。弱毒ウイ
ルスまたはサブウイルス粒子は、細胞培養上清中、培養物から単離した状態、ま
たは部分もしくは完全精製状態で存在することができる。所望によりウイルスを
凍結乾燥し、貯蔵または宿主への送達のために多様な他の成分と組合わせること
ができる。
【００５５】 本発明はさらに、生理学的に許容できるキャリヤーおよび／またはアジュバン
ト、ならびに単離した弱毒ヒト-ウシキメラPIVウイルスまたはサブウイルス粒子
を含む、新規ワクチンを提供する。好ましい態様においてワクチンは、適切なバ
ランスの弱毒性と免疫原性を達成するために、前記のように少なくとも1つ、好
ましくは2以上の追加の変異または他のヌクレオチド修飾を含むヒト-ウシキメラ
PIVから構成される。ワクチンは弱毒ウイルス103〜107PFUの用量で配合できる。
ワクチンは、単一PIV株に対して、または複数のPIV株または群に対して免疫応答
を誘発する、弱毒ヒト-ウシキメラPIVを含むことができる。これに関して、ヒト
-ウシキメラPIVをワクチン配合物中で他のPIVワクチン株または他のウイルスワ
クチン用ウイルス（たとえばRSV）と組み合わせることができる。
【００５６】 関連態様において、本発明は対象哺乳動物において免疫系を刺激してPIVに対
する免疫応答を誘発する方法を提供する。本方法は、生理学的に許容できるキャ
リヤーおよび／またはアジュバント中における免疫学的に十分な量のヒト-ウシ
キメラPIVの配合物を投与することを含む。1態様において免疫原組成物は、弱毒
変異または前記の目的表現型を特定する他のヌクレオチド修飾を少なくとも1つ
、好ましくは2以上もつヒト-ウシキメラPIVを含むワクチンである。ワクチンは
弱毒ウイルス103〜107PFUの用量で配合できる。ワクチンは、単一PIV株に対して
、または複数のPIV（たとえばHPIV1およびHPIV3）に対して、または1以上のPIV
と非PIV病原体（たとえばRSV）に対して免疫応答を誘発する、弱毒ヒト-ウシキ
メラPIVを含むことができる。これに関して、ヒト-ウシキメラPIVは、単一特異
性免疫応答、または複数のPIVに対する、もしくは1以上のPIVと非PIV病原体（た
とえばRSV）に対する多重特異性免疫応答を誘発することができる。あるいは、
異なる免疫原特性をもつヒト-ウシキメラPIVをワクチン混合物中で組み合わせる
か、または別個に同調処置プロトコルで投与して、1つのPIVに対する、複数のPI
Vに対する、または1以上のPIVと非PIV病原体（たとえばRSV）に対する、より有
効な防御を誘発することができる。好ましくは、免疫原組成物を上気道に、たと
えばスプレー、液滴またはエーロゾルにより投与する。
【００５７】 具体的態様の記載 本発明は、ヒトおよびウシPIVゲノムまたはアンチゲノムのキメラとしてクロ
ーン化してヒト-ウシキメラPIVにした、組換えパラインフルエンザウイルス（PI
V）を提供する。ヒト-ウシPIVキメラ構築により、哺乳動物、特にヒトにおいて
感染性であり、臨床用または動物用の免疫原組成物を調製するのに有用な、ウイ
ルス粒子またはサブウイルス粒子が得られる。本発明においては、弱毒ヒト-ウ
シキメラPIVを設計および製造するための新規方法および組成物、ならびにPIV感
染症の予防および治療に用いる方法および組成物も提供される。
【００５８】 本発明のキメラヒト-ウシPIVは、ヒトおよびウシ両方のPIV株に由来するヌク
レオチド配列を含み、感染性キメラウイルスまたはサブウイルス粒子を産生する
ように工学的に組換え処理されている。この方法で候補ワクチンウイルスは、PI
V感染に対して感受性の宿主哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む）にお
いてPIVに対する免疫応答を誘発するように工学的に組換え処理される。本発明
によるヒト-ウシキメラPIVは、特定のPIV（たとえばHPIV3）に対する免疫応答、
または複数のPIV（たとえばHPIV1とHPIV3）に対する多重特異性応答を誘発する
ことができる。
【００５９】 本発明のヒト-ウシキメラPIVの一例は、ヒトおよびウシ両方のポリヌクレオチ
ド配列を含むキメラPIVゲノムまたはアンチゲノム、ならびに主要ヌクレオキャ
プシドタンパク質（N）、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）およびラージ
ポリメラーゼタンパク質（L）を含有する。追加のPIVタンパク質を種々の組合わ
せで含有させて、完全ウイルス粒子、または過剰タンパク質、抗原決定因子もし
くは他の追加成分を含有するウイルス粒子にまで及ぶ、広範な感染性サブウイル
ス粒子を得ることができる。
【００６０】 本発明のキメラヒト-ウシPIVは、異なるPIV株または血清型のウイルスの1以上
のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合してヒト-ウシキメラPIVゲ
ノムまたはアンチゲノムを形成した、ヒトまたはウシPIV株または血清型ウイル
スに由来するか、またはそれらに従って構成した部分または完全”バックグラウ
ンド”PIVゲノムまたはアンチゲノムを含む。本発明のある態様において、キメ
ラPIVはウシPIVに由来する1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメント
と結合した、部分または完全ヒトPIV（HPIV）バックグラウンドゲノムまたはア
ンチゲノムを含む。本発明の他の態様において、キメラPIVはヒトPIVに由来する
1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合した、部分または完
全ウシPIV（BPIV）バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む。
【００６１】 部分または完全バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムは、一般にカウン
ターパートであるヒトまたはウシPIVのヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメ
ントを取り込むレシピエント主鎖またはベクターとして作用する。カウンターパ
ートであるヒトまたはウシPIV由来のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメン
トは”ドナー”遺伝子またはポリヌクレオチドであり、これはバックグラウンド
ゲノムまたはアンチゲノムと結合して、あるいはその中で置換して、関与PIVの
一方または両方と比較して新規な表現型特性を示すヒト-ウシキメラPIVを生成す
る。たとえば選択したレシピエントPIV鎖におけるヘテロロガス遺伝子またはゲ
ノムセグメントの付加または置換により、修飾されていないレシピエントおよび
／またはドナーの対応する表現型と比較して、弱毒性の増大もしくは低下、増殖
性の変更、免疫原性の改変、または他の目的とする表現型変更が生じる可能性が
ある。本発明のヒト-ウシキメラPIV中におけるヘテロロガス挿入配列または付加
配列として用いるために選択できる遺伝子およびゲノムセグメントには、PIV N
、P、C、D、V、M、SH（適切な場合）、F、HNおよび／またはLタンパク質または
その部分をコードする遺伝子またはゲノムセグメントが含まれる。調節領域、た
とえば遺伝子外リーダー領域もしくはトレイラー領域、または遺伝子間領域も、
ヘテロロガス挿入配列または付加配列として有用である。
【００６２】 ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントを、部分または完全PIVバックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のカウンターパート遺伝子もしくはゲノム
セグメントの野生型遺伝子オーダー位置に対応する位置において付加または置換
し、これによりカウンターパート遺伝子もしくはゲノムセグメントを置換または
移動（たとえばよりプロモーターから遠い位置へ）させることができる。さらに
他の態様においては、ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントを、バックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノム中の野生型遺伝子オーダー位置と対比して、
よりプロモーターに近い位置もしくはプロモーターから遠い位置において付加ま
たは置換し、これによりヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントの発現をそ
れぞれ増大または低下させる。
【００６３】 ヘテロロガス免疫原タンパク質、ドメインおよびエピトープを導入してヒト-
ウシキメラPIVを作製することは、免疫化宿主において新規な免疫応答を生じる
のに特に有用である。あるドナーPIV由来の免疫原遺伝子またはゲノムセグメン
トを、異なるPIVのレシピエントゲノムまたはアンチゲノム中において付加また
は置換することにより、そのドナーサブグループもしくは株に対して、レシピエ
ントサブグループもしくは株に対して、またはドナーとレシピエントの両方のサ
ブグループもしくは株に対して向けられた免疫応答を生じることができる。この
目的を達成するために、キメラタンパク質、たとえばあるPIVに特異的な細胞質
テイルおよび／または貫膜ドメインが異なるPIVのエクトドメインに融合してた
とえばヒト-ウシ融合タンパク質を生じたもの、あるいは2つの異なるヒトPIVに
由来するドメインを含む融合タンパク質を発現する、ヒト-ウシキメラPIVを構築
することもできる。好ましい態様において、ヒト-ウシキメラPIVゲノムまたはア
ンチゲノムは、ヒトおよびウシ両方の糖タンパク質ドメインまたは免疫原エピト
ープをもつ組換えウイルスまたはサブウイルスにおいて、キメラ糖タンパク質を
コードする。たとえばヒトPIV HNまたはF糖タンパク質由来の糖タンパク質エク
トドメインをコードするヘテロロガスゲノムセグメントを、対応するウシHNまた
はF糖タンパク質の細胞質ドメインおよび貫膜ドメインをコードするポリヌクレ
オチド配列（すなわちゲノムセグメント）と結合させて、ヒト-ウシキメラPIVゲ
ノムまたはアンチゲノムを形成することができる。
【００６４】 他の態様においては、ワクチン配合に有用なヒト-ウシキメラPIVを、循環ウイ
ルスにおける抗原ドリフトに適応するように簡便に修飾することができる。一般
にこの修飾は、HNおよび／またはFタンパク質における修飾であろう。これは1以
上の点変異の導入を伴う場合がある；全HNまたはF遺伝子を伴う場合もあり、あ
るいはあるPIV株または群に由来するその遺伝子の特定の免疫原領域をコードす
るゲノムセグメントを、異なるPIV株もしくは群のレシピエントクローン中の対
応する領域の置換により、またはその遺伝子の1以上のコピーを付加することに
より、キメラPIVゲノムまたはアンチゲノムcDNAに取り込ませて、これにより多
重抗原形を提示する。次いで、この修飾PIVクローンから産生された子孫ウイル
スを、出現するPIV株に対する予防接種プロトコルに使用できる。
【００６５】 ヒトPIVコード配列または非コード配列（たとえばプロモーター、遺伝子終止
配列、遺伝子開始配列、遺伝子間要素、または他のシス作用要素）をヘテロロガ
スカウンターパートで交換すると、多様な弱毒その他の可能な表現型効果をもつ
キメラPIVが得られる。特に、ウシまたはネズミの遺伝子がヒト細胞中ではたと
えば下記の理由で効率的に機能しない場合にヒトPIVバックグラウンドに移入し
たウシまたはネズミPIV（MPIV）タンパク質、タンパク質ドメイン、遺伝子また
はゲノムセグメントの置換により、宿主域その他の目的効果が得られる：ヘテロ
ロガス配列またはタンパク質と、生物学的相互作用性ヒトPIV配列またはタンパ
ク質（すなわち、ウイルス転写、翻訳、アッセンブリーなどに関して通常は置換
配列またはタンパク質と協調する配列またはタンパク質）との不適合、あるいは
より一般的には宿主域制限において、許容宿主と許容度の低い宿主との間で異な
る細胞タンパク質または他の観点での細胞環境との不適合。一例においては、ウ
シおよびヒトPIVの構造および機能についての既知の観点に基づいて、ヒトPIVへ
の導入のためにウシPIV配列を選択する。
【００６６】 HPIV3は、Mononegavirales目、Paramyxoviridae科、Respirovirus属のメンバ
ーである（Collins et al., 1996、前掲）。HPIV3はHPIVのうちで最も良く解明
されており、始原型HPIVである。そのゲノムは、長さ15462ヌクレオチド（nt）
の一本鎖マイナスセンスRNAである（Galinski et al., Virology, 165：499-510
, 1988；およびStokes et al., Virus Res., 25：91-103, 1992；それぞれを本
明細書に援用する）。少なくとも8つのタンパク質がPIV3ゲノムによりコードさ
れる：ヌクレオキャプシドタンパク質N、リンタンパク質P、機能は未知のCおよ
びDタンパク質、マトリックスタンパク質M、融合タンパク質F、ヘマグルチニン-
ノイラミニダーゼ糖タンパク質HN、ならびにラージポリメラーゼタンパク質L（C
ollins et al., 1996、前掲）。P遺伝子中のV ORFを含有するタンパク質も産生
されることがある（Durbin et al., Virology, 126：319-333, 1999）。
【００６７】 M、HNおよびFタンパク質はエンベロープ付随性であり、後2つは表面糖タンパ
ク質であって、各PIVの場合と同様に主要中和および防御抗原である（Collins e
t al., 1996、前掲）。PIV類の相当するPIV HNまたはFタンパク質間の有意の配
列差が、防御免疫の型特異性の基礎であると考えられる（Collins et al., 1996
、前掲；Cook et al., Amer. Jour. Hyg., 77：150-159, 1963；Ray et al., J. Infect. Dis., 162 ：746-749, 1990；それぞれを本明細書に援用する）。
【００６８】 HPIV3遺伝子はそれぞれ単一タンパク質をコードする単一mRNAとして転写され
るが、4つのORF、すなわちP、C、DおよびVを含むP mRNAは例外である（Galinski
et al., Virology, 186：543-550, 1992；およびSpriggs et al., J. Gen. Vir ol., 67 ：2705-2719, 1986；それぞれを本明細書に援用する）。Pタンパク質とC
タンパク質はmRNA中の別個のオーバーラップORFから翻訳される。パラミクソウ
イルス科のすべてがPタンパク質をコードするが、Respirovirus属およびMorbill
ivirus属のメンバーのみがCタンパク質をコードする。各ウイルスはC ORFから発
現するタンパク質の数、ならびにインビボおよびインビトロでのウイルス複製に
おけるそれの重要性が異なる。センダイウイルス（SeV）は、独立して開始され
る4つのタンパク質C'、C、Y1およびY2をC ORFから発現し、それらの翻訳開始部
位はこの順序でmRNA中にある（Curran et al., Enzyme, 44：244-249, 1990；La
mb et al., The Paramyxoviruses, D. Kingsbury編、pp. 181-214, Plenum Pres
s, ニューヨーク、1991；本明細書に援用する）。これに対しHPIV3および麻疹ウ
イルス（MeV）は1つのCタンパク質のみを発現する（Bellini et al., J. Virol. , 53 ：908-919, 1985；Sanchez et al., Virology, 147：177-86, 1985；および
Spriggs et al., 1986、前掲；それぞれを本明細書に援用する）。
【００６９】 PIV3 Dタンパク質はP ORFとD ORFの融合タンパク質であり、P遺伝子から共転
写時RNA編集プロセスにより発現し、その際2つのノンテンプレーテッド（nontem
plated）G残基がP mRNAのRNA編集部位に付加される（Galinski et al., 1992、
前掲；およびPelet et al., EMBO J., 10：443-448, 1991；それぞれを本明細書
に援用する）。Dタンパク質を発現する他の唯一のパラミクソウイルスBPIV3は、
このタンパク質と2つ目のタンパク質であるVタンパク質の発現にRNA編集を使う
。
【００７０】 Respirovirus、RubulavirusおよびMorbillivirus属のほぼすべてのメンバーが
Vタンパク質を発現する。発現しないことが明らかなのはHPIV1であり、これは無
傷のV ORFを欠如する（Matsuoka et al., J. Virol., 65：3406-3401, 1991；本
明細書に援用する）。V ORFはシステインに富む高度に保存されたドメインをも
つことが特色である（Cattaneo et al., Cell, 56：759-764, 1989；Park et al
., J. Virol., 66：7033-7039, 1992；Thomas et al., Cell, 54：891-902, 198
8；およびVidal et al., J. Virol., 64：239-246, 1990；それぞれを本明細書
に援用する）。V ORFは現在までに配列決定された各HPIV3ウイルスに保持されて
おり、これはこのORFがこのウイルスにおいて発現し、機能をもつことを示唆す
る（Galinski et al., Virology, 155：46-60, 1986；Spriggs et al., 1986、
前掲；およびStokes et al., 1992、前掲；本明細書に援用する）。
【００７１】 BPIV3 Vタンパク質は、ノンテンプレーテッドG残基がRNA編集部位に付加され
た場合に発現する（Pelet et al., 1991、前掲；本明細書に援用する）。しかし
HPIV3の場合、編集部位とV ORFの間に2つの翻訳停止コドンがあり、HPIV3がこの
ORFを発現しない他の例であるか、あるいは他の何らかの機序で発現するかは明
らかでない。1つの可能性は、P遺伝子の下流の第2部位でHPIV3編集が同様に起き
るということであるが、細胞培養ではこれは起きないように思われた（Galinski
et al., 1992、前掲）。あるいは、リボソームがリボソームフレームシフトに
よりV ORFに到達する可能性もある。これはMVのP遺伝子座についての状況に匹敵
する。MVはC、PおよびVタンパク質を発現するが、新規Rタンパク質をも発現し、
これはP ORFからV ORFへのフレームシフトにより合成される（Liston et al., J . Virol., 69 ：6742-6750, 1995；本明細書に援用する）。遺伝学的証拠からHPI
V3のV ORFは機能していることが示唆される（Durbin et al., 1999、前掲）。
【００７２】 HPIV3がそのVタンパク質を発現する手段は明らかではないが、そのV ORFが極
度に保存されていることは、それが実際に発現していることを示唆する。Vタン
パク質の機能は十分には確定していないけれども、インビトロでは効率的に複製
するがインビボでは複製低下を示すV-マイナスMVおよびSeV組換え体が回収され
た（Delenda et al., Virology, 228：55-62, 1997；Delenda et al., Virology , 242：327-337, 1998；Kato et al., 1997a、前掲；Kato et al., J. Virol., 71 ：7266-7272, 1997b；Valsamakis et al., J. Virol., 72：7754-7761, 1998
；それぞれを本明細書に援用する）。
【００７３】 PIVのウイルスゲノムは、ウイルスの複製および転写に必要なプロモーターの
全体または一部をもつ遺伝子外リーダー領域およびトレイラー領域、ならびに非
コード領域および遺伝子間領域をも含む。PIV遺伝子地図は、3'リーダー-N-P／C
／D／V-M-F-HN-L-5'トレイラーと表される。あるウイルス、たとえばサルウイル
ス5およびムンプスウイルスには、FとHNの間に未知の機能をもつ低分子疎水性（
SH）タンパク質をコードする遺伝子がある。転写は3'末端で開始し、遺伝子境界
にみられる短い保存モチーフにより案内される逐次停止-開始機序により進行す
る。各遺伝子の上流末端は遺伝子開始（GS）シグナルを含み、これはその各mRNA
の開始を指令する。各遺伝子の下流末端は遺伝子終止（GE）モチーフを含み、こ
れはポリアデニル化および終止を指令する。ヒトPIV3のJS株（GenBank寄託番号Z
11575；本明細書に援用する）およびワシントン（Washington）株について（Gal
inski M.S., The Paramyxovirusas, Kingsbury, D.W.編、pp. 537-568、Plenum
Press, ニューヨーク、1991；本明細書に援用する）、ならびにウシPIV3 910N株
（GenBank寄託番号D80487；本明細書に援用する）について配列例が記載されて
いる。
【００７４】 本明細書中で用いる”PIV遺伝子”は、一般にmRNAをコードするPIVゲノムの部
分を表し、一般に上流末端において遺伝子開始（GS）シグナルで始まり、下流末
端において遺伝子終止（GE）シグナルで終わる。特にタンパク質（たとえばC）
がユニークmRNAからではなく付加ORFから発現する場合、PIV遺伝子という用語に
は、”転写オープンリーディングフレーム”またはORFと記載されるものが含ま
れる。本発明のヒト-ウシキメラPIVを構築するためには、1以上のPIV遺伝子また
はゲノムセグメントが全体的または部分的に欠失、挿入または置換されてもよい
。これは、部分的または完全な欠失、挿入または置換には、1以上のPIV遺伝子ま
たはゲノムセグメントのいずれかのオープンリーディングフレームおよび／また
はシス作用調節配列も含みうることを意味する。”ゲノムセグメント”は、PIV
ゲノム由来の任意長さの連続ヌクレオチドを意味し、これはORF、遺伝子もしく
は遺伝子外領域の部分、またはその組合わせであってもよい。
【００７５】 本発明は、HPIVとBPIV3のキメラに基づく弱毒生PIVワクチン候補の開発方法に
関する。キメラはcDNAベースのウイルス回収システムにより構築される。cDNAか
ら作製した組換えウイルスは、生物由来のウイルスと同様に独立して複製し、増
殖する。本発明の好ましいヒト-ウシキメラPIVワクチン候補は、1以上のBPIV遺
伝子またはゲノムセグメントの置換または付加により弱毒化したバックグラウン
ド中に、1以上のヒトPIV（たとえばHPIV1、HPIV2および／またはHPIV3）の1以上
の主要抗原決定因子をもつ。PIVの主要防御抗原はそれらのHNおよびF糖タンパク
質であるが、他のタンパク質が防御免疫応答に寄与する可能性もある。
【００７６】 したがって本発明は、PIVに対するワクチンとして使用するために野生型また
は変異型の親ウイルスを弱毒化する新規な基礎を提供する。その1つは、HPIVとB
PIVの間で1以上の遺伝子またはゲノムセグメントを導入することによる宿主域効
果に基づく。BPIVとHPIVの間には多数のヌクレオチドおよびアミノ酸配列差があ
り、これらが宿主域の差に反映される。たとえばHPIVとBPIVの間で各タンパク質
についてのアミノ酸同一性％は下記のとおりである：N（86％）、P（65％）、M
（93％）、F（83％）、HN（77％）およびL（91％）。宿主域差の例は、アカゲザ
ルにおけるHPIV3の許容増殖性が、同動物における2つの異なるBPIV株の制限複製
と比較して高いことである（van Wyke Coelingh et al., 1988、前掲）。HPIVと
BPIVの宿主域差の原理については調べるべきことが残されてはいるが、それらは
1より多い遺伝子および複数のアミノ酸の差異を伴うと思われる。複数の遺伝子
およびおそらくシス作用調節配列が関与し、それぞれが複数のアミノ酸差を伴う
ことは、復帰によって容易に変化し得ないきわめて広範な弱毒化の基礎となる。
これは、1個または数個の点変異により弱毒化される他の弱毒生HPIV3ウイルスに
ついての状況と対照的である。この場合、各変異のいずれかの復帰によって有意
の毒性（virulence）再獲得が起きる可能性があり、あるいは単一残基のみが弱
毒化を特定する場合は完全な毒性再獲得が起きる。
【００７７】 以下に記載する本発明の態様例においては、バックグラウンドゲノムまたはア
ンチゲノムはHPIV3ゲノムまたはアンチゲノムであり、ヘテロロガス遺伝子また
はゲノムセグメントはBPIV3のKaまたはSF株に由来するN ORFである（アミノ酸配
列において99％の関連）。HPIV3バックグラウンドアンチゲノムのN ORFをカウン
ターパートBPIV3 N ORFで置換することにより、新規な組換えヒト-ウシキメラPI
V cDNAクローンが得られる。HPIV3のHPIV3 N ORFをBPIV3 KaまたはSFのもので置
換すると、HPIV3 Nのものと約70アミノ酸差（用いる株による）をもつタンパク
質が得られる。Nは比較的保存されているタンパク質の1つであり、他のタンパク
質、たとえばPを単独で、または組合わせて置換すると、より多数のアミノ酸差
が生じるであろう。それぞれが複数のアミノ酸またはヌクレオチドの差異をもた
らす複数の遺伝子およびゲノムセグメントの関与は、復帰に対する安定性の高い
弱毒化の基礎を提供する。
【００７８】 この弱毒化様式は、1以上の点変異により弱毒化する現在のHPIVワクチン候補
と著しく対照的である。この場合は各変異の復帰により有意または完全な毒性再
獲得を生じる可能性がある。さらに、HPIV中の幾つかの既知の弱毒化点変異によ
り、一般に温度感受性表現型が得られる。温度感受性を伴う弱毒化の問題の1つ
は、そのウイルスは下気道での複製が過度に制限され、一方、上気道では低い弱
毒化状態にあることである。これは、気道内に温度勾配があり、下気道では温度
が高く（制限度が高い）、上気道では低い（制限度が低い）ためである。弱毒ウ
イルスは上気道で複製できるためうっ血、鼻炎、発熱および中耳炎などの合併症
が起き、一方、下気道での過度の弱毒化により免疫原性が低下する可能性がある
。このように、温度感受性変異のみにより達成された弱毒化は理想的でない可能
性がある。これに対し、本発明のヒト-ウシキメラPIVにある宿主域変異は、大部
分の場合、温度感受性をもたらさない。したがって本発明により提供される新規
なPIV弱毒化法は、他の既知PIVワクチン候補と比較して遺伝的に安定であり、上
気道での残留毒性を伴う可能性が少ない。
【００７９】 意外にも、N ORF置換を伴うKaおよびSF両方のHPIV3／BPIV3キメラ組換え体が
生存可能であった。KaまたはF株BPIVのNタンパク質は、HPIVのJS株とそれぞれ51
5アミノ酸中70の差をもつ。したがって、このレベルのアミノ酸配列の相異をも
つウシNタンパク質がHPIV3 RNAと、または機能性レプリカーゼ／トランスクリプ
ターゼを構成する他のHPIV3タンパク質と効率的に相互作用しうることは、予想
外であった。同様に予想外の知見は、KaおよびSFキメラウイルスが細胞培養にお
いてHPIV3またはBPIV3親と同様に効率的に複製したことである。これは、キメラ
組換え体がインビトロでの複製を制限する遺伝子不適合を示さなかったことを表
す。インビトロでのこの効率的複製という特性は、これによりこの生物体を効率
的に作製できるので重要である。
【００８０】 同様に意外なのは、以下の研究に基づけば、1つのウシ遺伝子のみをもつKaお
よびSF HPIV3／BPIV3キメラ組換え体（cKaおよびcSFと呼ぶ）が、アカゲザル気
道における宿主域制限度においてそれらのBPIV3親とほぼ均等であるという所見
である。特に、cKaおよびcSFウイルスはアカゲザル気道における宿主域制限度に
おいてHPIV3の複製と比較してそれぞれ約60倍または30倍の複製低下を示した。
この所見に基づけば、他のBPIV3遺伝子も本発明のヒト-ウシキメラPIVにおいて
目的レベルの宿主域制限をもたらす可能性がある。したがって本発明方法によれ
ば、ワクチン用として選択したヒト-ウシキメラPIVにおいて適切な組合わせで最
適レベルの宿主域制限および免疫原性をもたらす一連の弱毒化決定因子が、HPIV
およびBPIV両方のヘテロロガス遺伝子およびゲノムセグメント中に容易に同定さ
れる。好ましいワクチンの組合わせにおいては、ヒトにおけるPIV複製のために
受け入れられている動物モデル（たとえばハムスターまたはアカゲザル）の下お
よび／または上気道での複製により表される弱毒性を、対応する野生型または変
異型の親PIV株の増殖と比較して、全体として少なくとも約2倍、より多くの場合
約5倍、10倍または20倍、好ましくは50〜100倍、最高1000倍、またはそれ以上（
たとえば感染後3〜8日目に測定）低下させることができる。
【００８１】 本発明のヒト-ウシキメラPIVによりもたらされる予想外の性質および利点を確
認すると、cKaおよびcSFが両方とも、アカゲザル気道におけるHPIV3攻撃に対し
て、ヒトPIVの感染および防御に関するこのモデルにおいてこれらのウイルスが
示す著しい複製制限度にもかかわらず、高度の防御を誘導した。特に、いずれか
のキメラウイルスを予め感染させておくと、上下両方の気道においてrJS攻撃ウ
イルスの複製に対する高度の抵抗性が誘導された。サルにcKaを感染させると、
非接種対照サルと比較して、上気道において約300倍、下気道において約1000倍
の野生型HPIV3（rJS）の複製低下により示されるように、高度の防御が誘発され
た。cSFを感染させたサルは、非接種対照サルと比較して、上気道において約200
0倍、下気道において約1000倍の複製低下を示した。cKaまたはcSFが誘発する防
御のレベルは、ウシまたはヒトPIV親を予め感染させたサルにみられたものに匹
敵した。このように、本発明のヒト-ウシキメラPIV感染によりサルの上および下
気道において高度の防御が得られ、両キメラウイルスとも有望なワクチン候補で
ある。他の好ましいワクチン組換え体においては、有用なワクチン候補を得るた
めに、ヒト-ウシキメラPIVの弱毒レベルに対する免疫原活性のバランスをとる。
これは一般に、下および／または上気道における攻撃ウイルス（たとえばrJS）
の複製が全体として約50〜100倍、100〜500倍、好ましくは約500〜2000倍、最高
3000倍またはそれ以上、低下することにより表される。このように、本発明の組
換えワクチンウイルスは免疫原性を保持しつつ、同時に複製および増殖の低下を
示す。この意外な組合わせの表現型特色は、ワクチン開発にきわめて望ましい。
【００８２】 2つの独立したBPIV3株に由来するN遺伝子がアカゲザルに対する弱毒表現型を
もたらすという所見は、これが他のBPIV株のN遺伝子の共有する特性であること
を示唆する。したがって本発明方法においては、任意のBPIV遺伝子またはゲノム
セグメントを単独で、または1以上の他のBPIV遺伝子またはゲノムセグメントと
組み合わせて、HPIV配列と結合させ、ワクチンとして使用するのに適した弱毒HP
IV3／BPIV3キメラ組換え体を作製することができる。好ましい態様においては、
HPIV1、HPIV2およびHPIV3ならびにその変異株を含めたすべてのHPIVが、BPIV遺
伝子および／またはゲノムセグメントの弱毒化に有用なレシピエントである。一
般に、HPIV3／BPIV3キメラウイルスに含有させるために選択するHPIV遺伝子は、
1以上の防御抗原、たとえばHNまたはF糖タンパク質を含む。
【００８３】 本発明の他のヒト-ウシキメラPIVは、HPIV1またはHPIV2の防御抗原決定因子を
含む。これは、たとえばHPIV1またはHPIV2のHNおよび／またはF遺伝子を余分な
遺伝子として弱毒HPIV3／BPIV3キメラ組換え体において発現させることにより達
成できる。あるいは、HPIV1またはHPIV2のHNおよび／またはF遺伝子がPIV3中の
それらのカウンターパートと置換したHPIV3／HPIV1またはHPIV3／HPIV2抗原性キ
メラウイルス（Skiadopoulos et al., 1999a、前掲；Tao et al., 1999、前掲；
および米国特許出願09／083,793：1998年5月22日出願；それぞれを本明細書に援
用する）を、1以上のヘテロロガス弱毒ウシ遺伝子またはゲノムセグメント（た
とえばKaまたはSFのN遺伝子またはゲノムセグメント）に対するレシピエントま
たはバックグラウンドウイルスとして使用できる。そのような抗原性キメラウイ
ルスはウシN遺伝子で弱毒化されるが、HPIV1またはHPIV2ウイルスに対する免疫
を誘導する。これに関して、PIV3 cDNAレスキュー系を用い、L中に3つの弱毒変
異を含むPIV3全長cDNA中のPIV3 HNおよびFオープンリーディングフレーム（ORF
）をPIV1のものと交換することにより、キメラPIV1ワクチン候補を作製した。こ
のcDNAから誘導された組換えキメラウイルスをrPIV3-1.cp45Lと表示する（Skiad
opoulos et al., 1998、前掲；Tao et al., 1998、前掲；Tao et al., 1999、前
掲）。rPIV3-1.cp45Lは、ハムスターにおいて弱毒化され、PIV1攻撃に対して高
度の抵抗性を誘導した。15のcp45変異中12を含み（すなわちHNおよびFにおける
変異を除く）、ハムスターの上および下気道で高度に弱毒化されるrPIV3-1cp45
と表示される組換えキメラウイルスも作製された（Skiadopoulos et al., 1999a
、前掲）。
【００８４】 さらに他のHPIV／BPIVキメラ組換え体は、任意の組合わせの2以上のBPIV遺伝
子またはゲノムセグメント（選択した遺伝子以外のすべてのBPIVゲノムに及び、
それらを含む）、またはヒトHPIV1、HPIV2もしくはHPIV3ウイルスに由来するHN
またはFゲノムセグメントから選択される抗原決定因子を含む。本発明のさらに
他の態様は、他の動物のPIV（たとえばネズミPIV1、イヌSV5 PIV2ウイルス、ま
たは他のトリもしくは哺乳動物PIV）に由来する弱毒遺伝子をHPIV主鎖と組み合
わせて含むか、あるいはヒトHPIV1、HPIV2および／またはHPIV3に由来するキメ
ラHPIV主鎖を含む、ヒト-ウシキメラPIVに関する。
【００８５】 本発明の他の詳細な態様においては、ヒト-ウシキメラPIVをヘテロロガス病原
体（他のPIVおよび非PIVウイルスならびに非ウイルス病原体を含む）の防御抗原
として使用する。これらの態様において、ウシ-ヒトキメラゲノムまたはアンチ
ゲノムは、1以上のヘテロロガス病原体の1以上の抗原決定因子をコードする1以
上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合した、部分または完全PI
V”ベクターゲノムまたはアンチゲノム”を含む（たとえば米国仮特許出願60／1
70,195：Murphyらにより1999年12月10日出願、参照；本明細書に援用する）。こ
れに関してヘテロロガス病原体はヘテロロガスPIVであってよく、ヘテロロガス
遺伝子またはゲノムセグメントは、1以上のPIV N、P、C、D、V、M、F、SH（適切
な場合）、HNおよび／またはLタンパク質、ならびにタンパク質ドメイン、フラ
グメント、および免疫原領域またはエピトープをコードするように選択できる。
こうして構築したPIVベクターワクチンは多重特異的免疫応答を誘発することが
でき、他のワクチン製剤と同時に、または協調投与プロトコルで投与できる。
【００８６】 本発明の態様例において、ヒト-ウシキメラPIVは部分または完全HPIVゲノムま
たはアンチゲノムであるベクターゲノムまたはアンチゲノムを含むことができ、
これを1以上のヘテロロガスPIV（HPIV1、HPIV2またはHPIV3から選択されるヘテ
ロロガスHPIVが含まれる）の抗原決定因子をコードする1以上のヘテロロガス遺
伝子またはゲノムセグメントと結合させるか、あるいはそれらを含むように修飾
する。より詳細な態様において、ベクターゲノムまたはアンチゲノムはHPIV3ゲ
ノムまたはアンチゲノムであり、抗原決定因子をコードするヘテロロガス遺伝子
またはゲノムセグメントは1以上のヘテロロガスHPIVのものである。一般にキメ
ラゲノムまたはアンチゲノムは、弱毒化を特定するBPIVの1以上の遺伝子または
ゲノムセグメントを含む。
【００８７】 本発明の態様例において、ヒト-ウシキメラPIVは、1以上のHNおよび／またはF
糖タンパク質、または抗原性ドメイン、フラグメントもしくはエピトープをコー
ドする1以上のHPIV1またはHPIV2遺伝子またはゲノムセグメントを、部分または
完全HPIV3ベクターゲノムまたはアンチゲノム中に含む。より詳細な態様におい
ては、HNおよびF糖タンパク質をコードする両HPIV1遺伝子がカウンターパートHP
IV3 HNおよびF遺伝子を置換して、キメラHPIV3-1ベクターゲノムまたはアンチゲ
ノムを形成する。そのような組換え構築体を用いて、ワクチンウイルスを直接に
作製するか、あるいはさらに1以上の抗原決定因子をコードする1以上の遺伝子ま
たは遺伝子セグメントの付加または取込みにより修飾することができる。ワクチ
ンウイルス作製のためのそのような構築体は一般に、弱毒化を特定するBPIVの1
以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメント、たとえば弱毒BPIVタンパク
質（たとえばN）をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。本
発明のあるヒト-ウシキメラPIVは、HPIV2に特異的なワクチンを製造するための
ベクターとして使用できる。これは、たとえばHPIV2 HN遺伝子のオープンリーデ
ィングフレーム（ORF）を含む転写ユニットが、キメラHPIV3-1ベクターゲノムま
たはアンチゲノムに付加され、または取り込まれ、この構築体がBPIV遺伝子また
はゲノムセグメントの取込みにより弱毒化されたものである。
【００８８】 関連する本発明の態様において、ベクターゲノムまたはアンチゲノムは部分ま
たは完全BPIVゲノムまたはアンチゲノムであり、抗原決定因子をコードするヘテ
ロロガス遺伝子またはゲノムセグメントは1以上のHPIVである。一般に決定因子
はHPIV1、HPIV2またはHPIV3のHNおよびF糖タンパク質から選択されるが、これら
および他の抗原性タンパク質の抗原性ドメイン、フラグメントおよびエピトープ
も有用である。特定の態様においては、HPIV2の1以上の抗原決定因子をコードす
る1以上の遺伝子または遺伝子セグメントを、部分または完全BPIVベクターゲノ
ムまたはアンチゲノム中において付加または置換する。あるいは、複数のHPIVの
抗原決定因子をコードする複数のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントを
、部分または完全BPIVベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加し、または取り
込ませることができる。
【００８９】 本発明のさらに他の態様においては、一連の非PIV病原体に対するベクターと
してのヒト-ウシキメラPIVが提供される（たとえば米国仮特許出願60／170,195
：Murphyらにより1999年12月10日出願、参照；本明細書に援用する）。本発明の
これらの態様に使用するためのベクターゲノムまたはアンチゲノムは、部分また
は完全BPIVまたはHPIVゲノムまたはアンチゲノムであり、ヘテロロガス病原体は
麻疹ウイルス、サブグループAおよびサブグループB呼吸系発疹ウイルス、ムンプ
スウイルス、ヒトパピローマウイルス、1型および2型ヒト免疫不全ウイルス、単
純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・
バーウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、フラビウイルス、アルファウ
イルスおよびインフルエンザウイルスから選択できる。
【００９０】 たとえば、本発明のヒト-ウシキメラPIVの構築のためのHPIVまたはBPIVベクタ
ーゲノムまたはアンチゲノムは、麻疹ウイルスHAおよびFタンパク質、またはそ
の抗原性ドメイン、フラグメントおよびエピトープから選択されるヘテロロガス
抗原決定因子を取り込むことができる。一例においては、麻疹ウイルスHA遺伝子
のオープンリーディングフレーム（ORF）を含む転写ユニットを、BPIVまたはHPI
V3ベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加し、または取り込ませる。
【００９１】 あるいは本発明のウシ-ヒトキメラPIVは、呼吸系発疹ウイルス（RSV）Fおよび
／またはG糖タンパク質、またはその抗原性ドメインもしくはエピトープをコー
ドする1以上の遺伝子またはゲノムフラグメントの取込みにより、RSV由来のヘテ
ロロガス抗原決定因子取込みのためのベクターとして使用できる。これに関して
、RSV cDNAのクローニングその他の記載は下記に示されている：米国仮特許出願
60／007,083：1995年9月27日出願；米国特許出願08／720,132：1996年9月27日出
願；米国仮特許出願60／021,773：1996年7月15日出願；米国仮特許出願60／046,
141：1997年5月9日出願；米国仮特許出願60／047,634：1997年5月23日出願；米
国特許出願08／892,403：1997年7月15日出願（WO98／02530に対応）；米国特許
出願09／291,894：1999年4月13日出願；米国仮特許出願60／129,006：1999年4月
13日出願；Collins et al., 1995、前掲；Bukreyev et al., J. Virol., 70：66
34-6641, 1996；Juhasz et al., 1997、前掲；Durbin et al., 1997a、前掲；He
et al., 1997、前掲；Baron et al., 1997、前掲；Whitehead et al., 1998a、
前掲；Whitehead et al., 1998b、前掲；Jin et al., 1998、前掲；およびWhite
head et al., 1999、前掲；ならびにBukreyev et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96 ：2367-2372, 1999；それぞれを本明細書に援用する。
【００９２】 本発明のこの態様によれば、ヘテロロガスPIVまたは非PIV病原体に由来する少
なくとも1つの抗原決定因子を含むヒト-ウシキメラPIVが提供される。たとえばH
PIV3の1以上の各遺伝子またはゲノムセグメントをヒトRSV由来のカウンターパー
ト遺伝子またはゲノムセグメントで置換するか、あるいはRSV遺伝子またはゲノ
ムセグメントを過剰遺伝子として挿入または付加できる。あるいは選択したヘテ
ロロガスゲノムセグメント（たとえばRSV糖タンパク質の細胞質テイル、貫膜ド
メインまたはエクトドメインをコードするもの）でHPIV3中の同一遺伝子またはH
PIV3中の異なる遺伝子のカウンターパートゲノムセグメントを置換するか、ある
いはこれをHPIV3ゲノムまたはアンチゲノムの非コード配列中に付加して、キメ
ラPIV-RSV糖タンパク質を得る。1態様においては、ヒトRSVのF遺伝子に由来する
ゲノムセグメントでカウンターパートHPIVゲノムセグメントを置換して、キメラ
タンパク質（たとえばPIVの細胞質テイルおよび／または貫膜ドメインがRSVのエ
クトドメインに融合したもの）をコードする構築体にすると、新規な弱毒ウイル
ス、および／またはPIVとRSVの両方に対して免疫原性である多価ワクチンが得ら
れる。
【００９３】 前記のように、本発明のヒト-ウシキメラPIVにおいて、キメラウイルスの弱毒
性を増大または低下させ、あるいは他の形で表現型を変化させる追加変異を導入
することにより、弱毒表現型を調節することが望ましい場合がしばしばある。cD
NAから組換えPIVを作製するための、また本発明の補足態様として本明細書に示
す全範囲の変異およびヌクレオチド修飾体を作製および試験するための材料およ
び方法の詳細な説明は、たとえば下記に示される：Durbin et al., 1997a、前掲
；米国特許出願09／083,793：1998年5月22日出願；米国仮特許出願60／047,575
：1997年5月23日出願（WO98／53078に対応）；および米国仮特許出願60／059,38
5：1997年9月19日出願；それぞれを本明細書に援用する。特に、これらの文献に
はPIVを変異、単離および解明して弱毒変異株（たとえば温度感受性（ts）、低
温継代（cp）、低温適応性（ca）、縮小プラーク（sp）および宿主域制限（hr）
変異株）を得るための、また弱毒表現型を特定する遺伝子変化を確認するための
方法および手順が記載されている。これらの方法に関して、前記文献には生物由
来および組換え作製による弱毒ヒトPIVの複製、免疫原性、遺伝子の安定性およ
び防御効率を、受け入れられているモデル系（ネズミおよび非ヒト霊長類モデル
系を含む）において判定するための方法が詳述されている。さらにこれらの文献
には、PIV感染症の予防および治療のための一価および二価ワクチンを含めた免
疫原組成物を開発および試験するための一般法が記載されている。PIVゲノムま
たはアンチゲノムをコードするcDNAを構築し、必須PIVタンパク質と同時発現さ
せることにより、感染性組換えPIVを作製する方法も前記文献に記載されている
。これには、下記の感染症PIVウイルスクローンの作製のために利用できるプラ
スミド例の記載が含まれる：p3／7（131）（ATCC97990）；p3／7（131）2G（ATC
C97889）；およびp218（131）（ATCC97991）；それぞれブダペスト条約の規定の
下でAmerican Type Culture Collection（ATCC）（10801 University Boulevard
, Manassas, Verginia 20110-2209, U.S.A.）に寄託され、前記寄託番号を得た
。
【００９４】 前記に引用した文献には、生物由来PIV変異体、たとえば低温継代（cp）、低
温適応性（ca）、宿主域制限（hr）、縮小プラーク（sp）および／または温度感
受性（ts）変異体（たとえばJS HPIV3 cp45変異株）に同定された表現型特異的
変異を含むように修飾された感染性組換えPIVの構築および評価方法が示されて
いる。補助マーカー表現型のない他の変異を減衰させることができる。これらの
変異体に同定される変異を容易にヒト-ウシキメラPIVに移入することができる。
一例においては、1以上の弱毒変異がポリメラーゼLタンパク質において、たとえ
ばJS cp45のTyr942、Leu992、またはThr1558に対応する位置において起きる。好
ましくは、これらの変異を本発明のヒト-ウシキメラPIV中に、生物変異体に同定
された同一または保存アミノ酸置換により取り込ませる。たとえば、PIV組換え
体はTyr942がHisにより置換され、Leu992がPheにより置換され、および／または
Thr1558がIleにより置換された変異を取り込むことができる。これらの置換アミ
ノ酸に対する保存的な置換も、目的とする変異表現型の達成に有用である。
【００９５】 生物由来PIV変異体から移入した他の変異例には、Nタンパク質における1以上
の変異が含まれ、これにはJS cp45の残基Val96またはSer389に対応する位置にお
ける特異的変異が含まれる。より詳細な態様においては、これらの変異はVal96
からAlaへ、もしくはSer389からAlaへ、またはこれらに対する保存的な置換とし
て表される。本発明の組換えPIVにおいては、Cタンパク質におけるアミノ酸置換
、たとえばJS cp45のIle96に対応する位置の変異、好ましくはIle96からThrへの
同一または保存的置換も有用である。生物由来PIV変異体から移入した他の変異
例には、M遺伝子における1つの変異、たとえばJS cp45のPro199における変異が
含まれ、あるいはさらにFタンパク質における変異、たとえばJS cp45から移入し
た、残基Ile420またはAla450に対応する位置の変異、好ましくはIle420からVal
もしくはAla450からThrへのアミノ酸置換またはそれに対する保存的な置換が含
まれる。本発明に含まれる他のヒト-ウシキメラPIVは、HNタンパク質における1
以上のアミノ酸置換により移入され、これはたとえば後記において、JSの残基Va
l384に対応する位置における変異、好ましくはVal384からAlaへの置換により表
される変異を移入する組換えPIVにより例示される。
【００９６】 本発明のこの態様におけるさらに他の例には、PIVゲノムまたはアンチゲノム
の非コード部分、たとえば3'リーダー配列に1以上の変異を取り込んだヒト-ウシ
キメラPIVが含まれる。これに関する変異の例は、組換えウイルスの3'リーダー
おいてJS cp45のヌクレオチド23、24、28もしくは45に対応する位置に工学的に
作製できる。さらに他の変異例は、N遺伝子開始配列において、たとえばN遺伝子
開始配列中の1以上のヌクレオチド、たとえばJS cp45のヌクレオチド62に対応す
る位置のヌクレオチドを交換することにより工学的に作製できる。より詳細な態
様において、ヒト-ウシキメラPIVはヌクレオチド23においてTがCに、ヌクレオチ
ド24においてCがTに、ヌクレオチド28においてGがTに、および／またはヌクレオ
チド45においてTがAに交換される。遺伝子外配列におけるさらに他の変異は、た
とえばN遺伝子開始配列中のJSのヌクレオチド62に対応する位置におけるAからT
への交換である。
【００９７】 本発明のヒト-ウシキメラPIVにおいて工学的に作製できるこれらの変異例は、
rcp45、rcp45 L、rcp45 F、rcp45 M、rcp45 HN、rcp45 C、rcp45 F、rcp45 3'N
、3'NL、およびrcp45 3'NCMFHNと表示される組換えPIVクローンにより表される
ように、組換えPIVにおいて工学的に作製および回収に成功した（Durbin et al.
, 1997a、前掲；Skiadopoulos et al., J. Virol., 73：1374-381, 1999b；米国
特許出願09／083,793：1998年5月22日出願；米国仮特許出願60／047,575：1997
年5月23日出願（WO98／53078に対応）；および米国仮特許出願60／059,385：199
7年9月19日出願；それぞれを本明細書に援用する）。さらに前記文献には、たと
えば部分HPIV3バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中へ置換したHPIV1の
HNおよびF遺伝子をもち、これがさらにHPIV3 JS cp45中に同定される1以上の弱
毒変異をもつように修飾されたキメラPIVの構築が記載されている。そのような
キメラ組換え体の1つには、cp45のL遺伝子中に同定されるすべての弱毒変異が取
り込まれている。それ以来、ヘテロロガス（HPIV）HNおよびF遺伝子以外のcp45
変異すべてをHPIV3-1組換え体に取り込ませて弱毒キメラワクチン候補を作製し
うることが示された。
【００９８】 JS cp45その他の生物由来PIV変異体から多数の弱毒変異の”メニュー”が得ら
れ、そのそれぞれを、C、Dおよび／またはVの欠失またはノックアウト変異をも
つ組換えPIV中において、弱毒、免疫原性および遺伝子安定性のレベルの調節の
ための他の任意の変異と組み合わせることができる。これに関して、本発明の多
くの組換えPIVが1以上、好ましくは2以上の生物由来PIV変異体からの変異、たと
えばJS cp45中に同定される1つの変異または組み合わせ変異を含む。本発明の好
ましいPIV組換え体は、JS cp45その他の生物由来変異体PIV株にある複数（最高
ではすべての）の変異をもつ。好ましくは、これらの変異は各変異を特定するコ
ドン中の多重ヌクレオチド置換により、ヒト-ウシキメラPIVにおける復帰に対し
て安定化される。
【００９９】 本発明のヒト-ウシキメラPIVに取り込ませることができる他の変異は、ヘテロ
ロガスPIV中またはより関連性の低い非セグメント化マイナス鎖RNAウイルス中に
同定される変異、たとえば弱毒変異である。特に、あるマイナス鎖RNAウイルス
に同定される弱毒その他の目的変異を、ヒト-ウシキメラPIVのゲノムまたはアン
チゲノム中の対応する位置に”伝達”すること、たとえば変異誘発により導入す
ることができる。すなわち、あるヘテロロガスマイナス鎖RNAウイルス中の目的
変異を、PIVレシピエント（たとえばそれぞれウシまたはヒトPIV）に”伝達”す
る。これは、ヘテロロガスウイルス中の変異をマッピングし、こうして配列アラ
インメントによりレシピエントRSV中の対応する部位を同定し、PIV中の天然配列
を変異表現型に変異させる（同一または保存的変異により）ことによる；PCT／U
S00／09695：2000年4月12日出願；およびその優先権：米国仮特許出願60／129,0
06：1999年4月13日出願；本明細書に援用する。この開示内容が教示するように
、対象変異部位においてヘテロロガス変異ウイルス中に同定される変化に保存的
に対応する改変をコードするように、レシピエントゲノムまたはアンチゲノムを
修飾することが好ましい。たとえばあるアミノ酸置換が変異ウイルスにおいて対
応する野生型配列と比較して変異部位を示す場合、組換えウイルス中の対応する
残基において類似の置換を工学的に行う。好ましくは、この置換は変異ウイルス
タンパク質中にある置換残基と同一または保存的アミノ酸による。しかし、変異
部位の天然アミノ酸残基を変異タンパク質中の置換残基に対して非保存的に変化
させることもできる（たとえば野生型残基の機能に妨害または損傷を与える他の
任意のアミノ酸の使用による）。
【０１００】 変異例を同定して本発明のヒト-ウシキメラPIVに伝達することができるマイナ
ス鎖RNAウイルスには、特に他のPIV（たとえばHPIV1、HPIV2、HPIV3、HPIV4A、H
PIV4BおよびBPIV3）、RSV、センダイウイルス（SeV）、ニューカッスル病ウイル
ス（NDV）、サルウイルス5（SV5）、麻疹ウイルス（MeV）、牛疫ウイルス、イヌ
ジステンパーウイルス（CDV）、狂犬病ウイルス（RaV）および水疱性口炎ウイル
ス（VSV）が含まれる。
【０１０１】 本発明に使用するための多様な変異例が前記文献に開示されている。これには
、RSV Lタンパク質の521位におけるフェニルアラニンのアミノ酸置換が含まれる
が、これに限定されない。これは、HPIV3 Lタンパク質の456位におけるフェニル
アラニン置換に対応し、したがってこれ（または保存的に関連するアミノ酸）に
伝達できる。欠失または挿入を表す変異の場合、これらを対応する欠失または挿
入として、組換えウイルスのバックグラウンドゲノムもしくはアンチゲノム中、
またはそれに取り込まれたヘテロロガス遺伝子もしくはゲノムセグメント中へ導
入できる。ただし、欠失または挿入されるタンパク質の個々のサイズおよびアミ
ノ酸配列は異なる可能性がある。
【０１０２】 本発明に含まれるさらに他のヒト-ウシキメラPIVワクチン候補は、センダイウ
イルス（SeV）中に同定される弱毒変異に類似の変異をコードするようにキメラP
IVゲノムまたはアンチゲノムを修飾することにより得られる。一例において、弱
毒変異はSeVのCタンパク質の170位におけるフェニルアラニンのアミノ酸置換を
含む。ヘテロロガスSeV変異体の弱毒変異を表す変化に保存的に対応する保存残
基の改変をコードするように、PIVゲノムまたはアンチゲノムを修飾する。1態様
においては、変異は組換えHPIV3タンパク質内に取り込まれ、HPIV3の164位にお
けるフェニルアラニンのアミノ酸置換を含む。
【０１０３】 本発明のキメラヒト-ウシPIVの対応する部位において種々のターゲットタンパ
ク質に、あるマイナス鎖RNAウイルスからの弱毒変異を導入することができる。M
ononegavirales目全体をとおして5つのターゲットタンパク質が厳密に保存され
ており、特異的領域またはドメインに関して中ないし高度の配列同一性を示す。
特に、この目のすべての既知メンバーが5つのタンパク質の相同コンステレーシ
ョンを共有する：ヌクレオキャプシドタンパク質（N）、ヌクレオキャプシドリ
ンタンパク質（P）、非グリコシル化マトリックス（M）タンパク質、少なくとも
1つの表面糖タンパク質（HN、F、HまたはG）およびラージポリメラーゼタンパク
質（L）。これらのタンパク質はすべて、ヘテロロガスネズミウイルスにおいて
同定された弱毒変異部位に対応する部位において組換えウイルスの部分に保存さ
れている1以上の残基を改変することにより、弱毒変異を取り込ませるのに有用
なターゲットとなる。
【０１０４】 これに関して、ヘテロロガス変異を本発明のキメラヒト-ウシPIVに伝達する方
法は、第1のマイナス鎖ウイルス中の弱毒変異を同定することに基づく。変異部
位を表す対象アミノ酸位置における変異配列と野生型配列の対比により同定した
この変異は、キメラウイルス中（バックグラウンドゲノムもしくはアンチゲノム
中、またはそれにおいて付加もしくは置換したヘテロロガス遺伝子もしくは遺伝
子セグメント中）の組換え弱毒化のターゲットである相同タンパク質に対して配
列比較するための指標となる。弱毒変異はこれまでに既知であるか、あるいは生
物由来の変異ウイルスを作製および解明するために適用される変異誘発法および
復帰遺伝学的方法により同定できる。あるいは目的とする弱毒変異をde novoで
、たとえば部位特異的方法および通常のスクリーニング法により作製および解明
することができる。
【０１０５】 マイナス鎖RNA中に同定されるそれぞれの弱毒変異は、1以上のヘテロロガスマ
イナス鎖ウイルス中の相同タンパク質に対する配列比較のための指標となる。こ
れに関して、既存の配列アラインメントを分析するか、あるいは通常の配列アラ
インメント法を利用して、弱毒変異をもつタンパク質と弱毒化のためのターゲッ
ト組換えウイルスである異なるウイルスの相同タンパク質との間で分析のための
配列比較を行い、対応するタンパク質領域およびアミノ酸位置を同定することが
できる。弱毒変異を表す1以上の残基がターゲットヒト-ウシキメラウイルスタン
パク質中の対応するアミノ酸位置で保存されている”野生型”同一残基から変化
したものである場合、ターゲットウイルスタンパク質中の保存残基のアミノ酸欠
失、置換または挿入をコードするようにターゲットウイルスのゲノムまたはアン
チゲノムを組換え修飾し、これにより組換えウイルスにおける類似の弱毒表現型
をもたらすことができる。
【０１０６】 弱毒組換えマイナス鎖ウイルスを構築するためのこの合理的な設計方法におい
ては、あるマイナス鎖RNAウイルスにおける弱毒変異を表すアミノ酸位置の野生
型同一残基を、ターゲットであるヒト-ウシキメラウイルスタンパク質中の対応
するアミノ酸位置において厳密に（または保存的置換により）保存することがで
きる。たとえばターゲットウイルスタンパク質中の対応する残基は、ヘテロロガ
ス変異ウイルスにおける弱毒変異により変化していることが認められた野生型残
基と同一であってもよく、あるいはアミノ酸側鎖基の構造および機能に関して保
存的に関連をもつものであってもよい。いずれの場合も、本発明方法に従ってア
ミノ酸欠失、置換または挿入をコードするようにターゲットウイルスのゲノムま
たはアンチゲノムを組換え修飾して保存残基を改変することにより、組換えウイ
ルスにおいて類似の弱毒化を達成できる。
【０１０７】 これに関して、ヘテロロガス変異ウイルスにおける弱毒変異を表す変化に保存
的に対応する保存残基改変をコードするように、ゲノムまたはアンチゲノムを修
飾することが好ましい。たとえば、あるアミノ酸置換が、対応する野生型配列と
比較して変異ウイルス中の変異部位を表す場合、組換えウイルス中の対応する残
基において工学的に置換処理する。好ましくは、この置換は変異ウイルスタンパ
ク質中に存在する置換残基と同一または保存的である。しかし、変異部位の天然
アミノ酸残基を、変異タンパク質中の置換残基に関して非保存的に改変してもよ
い（たとえば野生型残基の同一性および機能を撹乱または妨害する他のアミノ酸
の使用による）。欠失または挿入により表される変異の場合、これらを対応する
欠失または挿入として組換えウイルスに伝達することができ、ただし欠失または
挿入タンパク質フラグメントの個々のサイズおよびアミノ酸配列は異なってもよ
い。
【０１０８】 本発明の別態様においては、こうしてヘテロロガス変異マイナス鎖ウイルスか
ら伝達した変異が、目的とする弱毒表現型に追加または付随して、本発明のヒト
-ウシキメラPIVの表現型の多様性をもたらすことができる。たとえば、ウイルス
の組換えタンパク質に取り込ませる変異の例は、弱毒表現型に追加または付随し
て、温度感受性（ts）、低温適応性（ca）、縮小プラーク（sp）もしくは宿主域
制限（hr）表現型、または増殖性もしくは免疫原性の変更をもたらすことができ
る。
【０１０９】 ヒト-ウシキメラPIVに取り込ませる生物由来PIVおよび他の非セグメント化マ
イナス鎖RNAウイルスの弱毒変異は自然に起きるものでもよく、あるいは周知の
変異誘発法により野生型PIV株に導入されてたものでもよい。たとえば、化学的
変異誘発法により不完全弱毒PIV株を作製することができ、この場合、前記に援
用した各文献に記載されるように、化学的変異誘発物質を添加した細胞培養物中
でウイルスを増殖させ、増殖制限変異を導入するために最適温度以下で継代させ
たウイルスを選択するか、あるいは細胞培養に際して縮小プラーク（sp）を形成
する変異ウイルスを選択する。
【０１１０】 ”生物由来PIV”とは、組換え手段で作製したものでないいかなるPIVをも意味
する。生物由来PIVには、たとえばすべての天然PIVが含まれ、これにはたとえば
野生型ゲノム配列をもつPIV、および参照野生型配列由来の対立遺伝子または変
異ゲノム形態をもつPIV、たとえば弱毒表現型を特定する変異をもつPIVが含まれ
る。同様に生物由来PIVには、親PIVから特に人為的変異誘発および選択法により
誘導したPIV変異体が含まれる。
【０１１１】 前記のように、十分に弱毒化した生物由来PIVの作製は幾つかの既知方法で達
成できる。そのような方法の1つは、部分弱毒化ウイルスを細胞培養に際して漸
次低下する温度で継代するものである。たとえば、最適温度以下での継代により
部分弱毒変異体を作製する。こうしてcp変異体または他の部分弱毒PIV株を低温
での継代培養において効率的に増殖するように適応させる。低温継代におけるこ
の変異PIV選択により、部分弱毒化した親と比較して誘導株における残留ウイル
ス毒性が実質的に低下する。
【０１１２】 あるいは、部分弱毒化した親ウイルスを化学的変異誘発処理して、たとえばts
変異を導入するか、または既にtsであるウイルスの場合は弱毒誘発体のts表現型
の弱毒性および／または安定性を高めるのに十分な追加ts変異を導入することに
より、生物由来PIVに特異的変異を導入できる。ts変異をPIVに導入する手段には
、一般に既知の方法で変異誘発物質、たとえば5-フルオロウラシルの存在下にウ
イルスを複製させることが含まれる。他の変異誘発性化学物質も使用できる。弱
毒化はほぼすべてのPIV遺伝子におけるts変異により得られるが、この目的に特
に適したものはポリメラーゼ（L）遺伝子であることが認められた。
【０１１３】 本発明に用いる弱毒PIV例における温度感受性のレベルは、許容温度における
その複製を幾つかの制限温度における複製と比較することにより測定される。ウ
イルス複製が許容温度におけるその複製と比較して100倍以上低下する最低温度
をシャットオフ温度と呼ぶ。実験動物およびヒトにおいて、PIVの複製と毒性の
両方が変異体のシャットオフ温度と相関する。
【０１１４】 JS cp45 HPIV3変異体は、遺伝学的に比較的安定で、免疫原性が高く、かつ十
分に弱毒化されていることが認められた。それらにみられる種々の変異を個々に
、または組み合わせて含むこの生物由来および組換えウイルスのヌクレオチド分
析により、各レベルの弱毒増大が特定のヌクレオチドおよびアミノ酸置換を伴う
ことが示された。前記の各文献には、サイレント偶発変異（silent incidental
mutation）と、感染性PIVクローンのゲノムまたはアンチゲノムに変異を個々に
、または種々の組合わせで導入することによる表現型差に関与する変異とを、ル
ーティンに識別する方法も示されている。この方法と、親ウイルスおよび誘導ウ
イルスの表現型特色の評価法とを組み合わせて、弱毒性、温度感受性、低温適応
性、縮小プラークサイズ、宿主域制限などの目的特性に関与する変異を同定でき
る。
【０１１５】 こうして同定した変異を編集して”メニュー”にし、次いで目的に応じて単独
で、または組み合わせて導入し、ヒト-ウシキメラPIVを目的に応じた適切なレベ
ルの弱毒性、免疫原性、弱毒表現型からの復帰などに対する遺伝的抵抗性に調節
できる。以上の記載に従って、cDNAから感染性PIVを作製できるので、ヒト-ウシ
キメラPIV中へ工学的な特異的変更を導入することができる。特に、感染性組換
えPIVを、生物由来の弱毒PIV株における特異的変異、たとえばts、ca、attその
他の表現型を特定する変異の同定に使用できる。こうして目的変異を同定し、組
換えヒト-ウシキメラPIVワクチン株に導入する。cDNAからウイルスを作製できる
ので、これらの変異を個々に、または選択した種々の組合わせで全長cDNAクロー
ンに取り込ませ、次いで導入した変異を含むレスキュー組換えウイルスの表現型
を容易に判定することができる。
【０１１６】 本発明は、目的表現型に関連する特異的な生物由来変異（たとえばcpまたはts
表現型）を同定し、感染性PIVクローンに取り込ませることにより、同定した変
異の部位またはそれに近接した部位における他の部位特異的修飾体を提供する。
生物由来PIV中に形成される大部分の弱毒変異は単一ヌクレオチド変化であるが
、他の”部位特異的修飾”を組換え法により生物由来または組換えPIVに取り込
ませることもできる。本明細書中で用いる部位特異的変異には、1〜3、最高で約
5〜15個またはそれ以上の改変ヌクレオチド（たとえば野生型PIV、選択した変異
PIV株、または変異誘発した組換え親PIVクローンに由来する改変ヌクレオチド）
の挿入、置換、欠失または再配列が含まれる。そのような部位特異的変異を、選
択した生物由来点変異の部位またはその領域内に取り込ませることができる。あ
るいはPIVクローン内に他の種々の関係で、たとえばシス作用調節配列、または
タンパク質の活性部位、結合部位、免疫原エピトープなどをコードするヌクレオ
チド配列の位置またはその付近に、これらの変異を導入できる。部位特異的PIV
変異体は一般に目的とする弱毒表現型を保持し、さらに弱毒化に無関係な改変表
現型特性、たとえば免疫原性の増強もしくは拡大および／または増殖性の改善を
示すことができる。目的とする部位特異的変異体の他の例には、弱毒点変異を特
定するコドン中に追加の安定化ヌクレオチド変異を含むように設計した組換えPI
Vが含まれる。可能ならば、親変異体または組換えPIVクローン中の弱毒アミノ酸
変更を特定する2以上のヌクレオチド置換をコドンに導入し、これにより弱毒表
現型からの復帰に対する遺伝的抵抗性をもつ生物由来または組換えPIVを得る。
他の態様においては、たとえばシス作用調節要素の構築または既存のシス作用調
節要素の切除のために、部位特異的ヌクレオチド置換、付加、欠失または再配列
を、ターゲットヌクレオチド位置に対して上流または下流に、たとえば1〜3、5
〜10、最高15ヌクレオチドまたはそれ以上5'側または3'側に導入する。
【０１１７】 単一および多重点変異ならびに部位特異的変異のほかに、本明細書に開示する
ヒト-ウシキメラPIVに対する変更には、1以上の遺伝子またはゲノムセグメント
の欠失、挿入、置換または再配列が含まれる。特に有用なものは1以上の遺伝子
またはゲノムセグメントの欠失であり、これらの欠失は本発明のヒト-ウシキメ
ラPIVの特性を調節するための目的とする追加表現型効果を与えることが示され
た。たとえば米国特許出願09／350,821（Durbinらにより1999年7月9日出願）に
は、開始コドンのコーディング帰属を改変する変異または1以上の停止コドンを
導入する変異を取り込ませるようにPIVゲノムまたはアンチゲノムを修飾するこ
とにより、1以上のHPIV遺伝子（たとえばC、Dおよび／またはV ORF）の発現を低
下または排除するための方法および組成物が記載されている。あるいは、C、Dお
よび／またはV ORFのうち1以上を全体的または部分的に欠失させて、対応するタ
ンパク質を部分的もしくは全体的に非機能性にし、またはタンパク質発現全体を
撹乱することができる。そのようなC、Dおよび／またはVあるいは他の非必須遺
伝子の変異をもつ組換えPIVは、ワクチン開発にきわめて望ましい表現型特性を
備えている。たとえばこれらの修飾は下記を含めた1以上の目的表現型変更を特
定することができる（i）細胞培養における増殖特性の改変、（ii）哺乳動物の
上および／または下気道における弱毒化、（iii）ウイルスプラークサイズの変
更、（iv）細胞変性効果の変更、ならびに（v）免疫原性の変更。C ORF発現を欠
如するそのような一例である”ノックアウト”変異体は、非ヒト霊長類モデルに
おいて、その有益な弱毒表現型をもち、なおかつ野生型HPIV3攻撃に対する防御
免疫応答を誘発することができた。
【０１１８】 したがって、より詳細な本発明の態様においては、ヒト-ウシキメラPIVのC、D
および／またはV ORFに、選択した遺伝子またはゲノムセグメントの発現を改変
または排除する欠失またはノックアウトを取り込ませる。これはたとえば、選択
したコード配列中にフレームシフト変異または終止コドンを導入し、翻訳開始部
位を改変し、遺伝子の位置を変更し、またはその発現速度を改変するために上流
開始コドンを導入し、表現型を改変するためにGSおよび／またはGE転写シグナル
を変更し、あるいはRNA編集部位を修飾することにより達成できる（たとえば増
殖性、転写に際しての温度制限など）。より詳細な本発明の態様においては、遺
伝子またはそのセグメントを欠失させずに、たとえば複数の翻訳終止コドンを翻
訳オープンリーディングフレーム（ORF）に導入し、開始コドンを改変し、また
は編集部位を修飾することにより、1以上の遺伝子（たとえばC、Dおよび／また
はV ORF）の発現を翻訳または転写レベルで排除したヒト-ウシキメラPIVが提供
される。これらの形のノックアウトウイルスは、組織培養において増殖速度低下
およびプラークサイズ縮小を示す場合がしばしばある。したがってこれらの方法
は、主要ウイルス防御抗原の1つではないウイルス遺伝子の発現を排除する、さ
らに他の新規タイプの弱毒変異体を提供する。あるいはこれに関して、前記に従
って欠失変異誘発させてターゲットタンパク質の合成を再生しうる修復変異を効
率的に除くことにより、遺伝子またはゲノムセグメントを欠失させずに形成した
ノックアウトウイルス表現型を作製することができる。C、Dおよび／またはV OR
Fの欠失およびノックアウト変異体を得るための他の幾つかの遺伝子ノックアウ
ト体を、当技術分野で周知の他の設計および方法により作製することができる（
Kretschmer et al., Virology, 216：309-316, 1996；Radecke et al., Virolog y , 217：418-421, 1996；ならびにKato et al., 1987a、前掲；およびSchneider
et al., 1997、前掲；それぞれを本明細書に援用する）。
【０１１９】 変更の性質に応じて、ヒト-ウシキメラPIVにおけるこれらおよび他のヌクレオ
チド修飾により、ドナーまたはレシピエントゲノムまたはアンチゲノム中の少数
の塩基（たとえば15〜30塩基、最高35〜50塩基、またはそれ以上）、大ブロック
のヌクレオチド（たとえば50〜100、100〜300、300〜500、500〜1000塩基）、ま
たはほぼ完全な遺伝子もしくは完全な遺伝子（たとえば1000〜1500ヌクレオチド
、1500〜2500ヌクレオチド、2500〜5000ヌクレオチド、5000〜6500ヌクレオチド
、またはそれ以上）を改変することができる（すなわち、少数の塩基を変更して
免疫原エピトープを挿入または切除し、あるいは小さいゲノムセグメントを変更
することができ、一方、遺伝子または大きなゲノムセグメントを付加、置換、欠
失または再配列する場合には大ブロックの塩基が関与してもよい）。
【０１２０】 関連態様において本発明は、生物由来のPIVから組換えPIVクローン中へ移入し
た補足変異（たとえばcpおよびts変異）を提供し、追加タイプの変異はさらに修
飾したPIVクローン中の同一または異なる遺伝子に関連する。PIV遺伝子それぞれ
を発現レベルに関して選択的に改変し、あるいはその全体または部分において、
単独で、または他の目的修飾と組み合わせて、付加、欠失、置換または再配列し
て、新規ワクチン特性を示すヒト-ウシキメラPIVを得ることができる。したがっ
て、生物由来PIV変異体から移入した弱毒変異のほかに、またはそれと組み合わ
せて、本発明は感染性PIVクローンの組換え工学的方法に基づいてヒト-ウシキメ
ラPIVを弱毒化または他の形で表現型修飾するための他の一連の方法をも提供す
る。ターゲット遺伝子またはゲノムセグメント（感染性クローンに取り込ませる
ためのキメラPIVゲノムまたはアンチゲノム中のドナーまたはレシピエント遺伝
子またはゲノム配列を含める）をコードする単離ポリヌクレオチド配列において
多様な改変を行うことができる。より具体的には、組換えPIVにおいて目的とす
る構造および表現型の変更を達成するために、本発明は親ゲノムまたはアンチゲ
ノム由来の選択した1つのヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを欠失、置換
、導入または再配列する修飾、および全遺伝子またはゲノムセグメントを欠失、
置換、導入または再配列する変異を、ヒト-ウシキメラPIVクローンに導入できる
。
【０１２１】 したがって、ヒト-ウシキメラPIVにおいて、選択した遺伝子の発現を、たとえ
ば下記により単に改変または排除する修飾が提供される：選択したPIVコード配
列への終止コドン導入、あるいはその翻訳開始部位またはRNA編集部位の改変、
作動可能な状態で結合したプロモーターに対するPIV遺伝子の位置の変更、発現
速度を改変するための上流開始コドン導入、表現型（たとえば増殖性、転写に際
しての温度制限など）改変のためのGSおよび／またはGE転写シグナルの修飾（た
とえば位置を変更し、既存の配列を改変し、または既存の配列をヘテロロガス配
列で置換することにより）、ならびにウイルス複製、選択した遺伝子の転写、ま
たは選択したRNAの翻訳における量的および質的変更を特定する他の種々の欠失
、置換、付加または再配列。これに関して、組換えPIVにおいて増殖に必須でな
い任意のPIV遺伝子またはゲノムセグメントを切除その他の形で修飾して、毒性
、病原性、免疫原性その他の表現型特性に対する目的効果を得ることができる。
コード配列と同様に、非コード、リーダー、トレイラーおよび遺伝子間領域を単
に欠失、置換または修飾し、それらの表現型効果をたとえばミニレプリコンおよ
び組換えPIVによって容易に分析できる。
【０１２２】 さらに、PIVゲノムまたはアンチゲノムに、ヒト-ウシキメラPIVに導入するた
めの他の多様な遺伝子改変を、単独で、または生物由来の変異PIVから移入した1
以上の弱毒変異と一緒に行って、たとえば増殖性、弱毒性、免疫原性、遺伝子安
定性を調節し、あるいは他の有利な構造および／または表現型効果を得ることが
できる。これらの追加タイプの変異も前記に引用した文献に示されており、本発
明のヒト-ウシキメラPIVの容易に工学的に導入できる。
【０１２３】 これらの変更のほかに、ヒト-ウシキメラPIVにおける遺伝子の順序を変更し、
PIVゲノムプロモーターをそれのアンチゲノムカウンターパートで交換し、遺伝
子の部分を除去または置換し、全体を欠失させることすらできる。配列の異なる
修飾または追加修飾は、種々の遺伝子間領域などへのユニーク制限部位挿入など
の操作を容易にするために行うことができる。外来配列挿入のための容量を高め
るために、非翻訳遺伝子配列を除去することができる。
【０１２４】 本発明のヒト-ウシキメラPIVに取り込ませる他の変異には、シス作用シグナル
に対する変異が含まれ、これはたとえばPIVミニゲノムの変異分析により同定で
きる。たとえばリーダー、トレイラーおよびフランキング配列の挿入および欠失
分析により、ウイルスプロモーターおよび転写シグナルが同定され、種々の程度
のRNA複製または転写低下に関連する一連の変異が得られる。これらのシス作用
シグナルの飽和変異誘発（これにより各位置を修飾してそれぞれの改変ヌクレオ
チドにする）によっても、RNAの複製または転写に影響する多くの変異が同定さ
れた。これらの変異はいずれも、本発明のヒト-ウシキメラPIVアンチゲノムまた
はゲノムに挿入できる。完全アンチゲノムcDNAを用いるトランス作用タンパク質
およびシス作用RNA配列の評価および操作は、前記に引用した文献の記載に従っ
てPIVミニゲノムの使用により補助される。
【０１２５】 ヒト-ウシキメラPIVにおける追加変異は、ゲノムの3'末端をそれのアンチゲノ
ム由来のカウンターパートで交換するものであり、これに伴ってRNAの複製およ
び転写が変化する。一例においては、特異的PIVタンパク質、たとえば防御HNお
よび／またはF抗原の発現レベルは、効率的翻訳と適合するように設計および合
成された配列で天然配列を置換することによって高めることができる。これに関
して、哺乳動物ウイルスタンパク質の翻訳レベルにおいてはコドン使用が主要因
となりうることが示された（Hans et al., Current Biol., 6：315-324, 1996；
本明細書に援用する）。主要防御抗原であるPIV HNおよび／またはFタンパク質
をコードするmRNAのコドン使用を組換え法により最適化すると、これらの遺伝子
の発現が改善される。
【０１２６】 他の態様例においては、選択したPIV遺伝子の翻訳開始部位を囲む配列（好ま
しくは-3位のヌクレオチドを含む）を、単独で、または上流開始コドンの導入と
組み合わせて修飾して、翻訳のアップレギュレーションまたはダウンレギュレー
ションを特定することにより、PIV遺伝子発現を調節する（Kozak et al., J. Mo l. Biol., 196 ：947-950, 1987）。その代わりに、または本明細書に開示する他
のPIV修飾と組み合わせて、選択したいずれかのウイルス遺伝子の転写GSまたはG
Eシグナルを改変することにより、ヒト-ウシキメラPIVの遺伝子発現を調節でき
る。他の態様においては、ヒト-ウシキメラPIVの遺伝子発現レベルを転写レベル
で修飾する。1態様においては、選択した遺伝子のPIV遺伝子地図中における位置
を、よりプロモーターに近い位置またはプロモーターから遠い位置へ変更するこ
とができ、これにより遺伝子はそれぞれ、より高い効率または低い効率で発現す
るであろう。この態様によれば、特定の遺伝子の発現を調節することができ、そ
の結果、相互ポジショナル置換した遺伝子の同等の発現レベル低下により弱毒化
される場合が多い野生型レベルと比較して、遺伝子発現が2倍、より一般的には4
倍から、最高10倍またはそれ以上にまで低下または増大する。これらおよび他の
転位による変更により、たとえばRNA複製に関与する選択したウイルスタンパク
質の発現低下による弱毒表現型をもつか、あるいは抗原発現増大など他の望まし
い特性をもつ、新規ヒト-ウシキメラPIVが得られる。
【０１２７】 本発明の感染性ヒト-ウシキメラPIVクローンは、本明細書に開示する方法およ
び組成物に従って工学的に処理して、免疫原性を高め、野生型PIVまたは親PIVに
よる感染で得られるより高いレベルの防御を誘導することもできる。たとえば、
ゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列における適切なヌ
クレオチド交換により、ヘテロロガスPIV株もしくはタイプまたは非PIV源（たと
えばRSV）に由来する免疫原エピトープを組換えクローンに付加することができ
る。あるいは本発明の変異PIVを工学的に処理して、免疫原タンパク質、タンパ
ク質ドメイン、または目的もしくは目的外の免疫反応に関連する特異的タンパク
質形態を付加または切除できる（たとえばアミノ酸の挿入、置換または欠失によ
る）。
【０１２８】 本発明方法において、追加遺伝子またはゲノムセグメントをヒト-ウシキメラP
IVゲノムまたはアンチゲノム中またはその近くに挿入することができる。これら
の遺伝子はレシピエントと共通の制御下にあってもよく、あるいは独立した一組
の転写シグナルの制御下にあってもよい。当該遺伝子には、前記で同定したPIV
遺伝子、および非PIV遺伝子が含まれる。当該非PIV遺伝子には、サイトカイン（
たとえばIL-2〜IL-18、特にIL-2、IL-6、IL-12、IL-18など）、γ-インターフェ
ロン、およびTヘルパー細胞エピトープに富むタンパク質が含まれる。これらの
追加タンパク質は、別個のタンパク質として、または既存のPIVタンパク質（た
とえばHNまたはF）の過剰コピーとして発現できる。これにより、PIVに対する免
疫応答を量的および質的に修飾および改善することができる。
【０１２９】 ヒト-ウシキメラPIV中のウイルス遺伝子またはゲノムセグメント全体の変更を
伴う欠失、挿入、置換その他の変異により、高度に安定なワクチン候補が得られ
、これらは免疫抑制された個体の場合、特に重要である。これらの変更の多くは
得られるワクチン株を弱毒化し、他は異なるタイプの目的表現型変更を特定する
。たとえばアクセサリー（すなわち、インビトロ増殖に必須でない）遺伝子は、
宿主免疫と特異的に相互作用するタンパク質をコードするための優れた候補であ
る（たとえばKato et al., 1997a、前掲、参照）。ワクチンウイルス中のそのよ
うな遺伝子を切除すると、毒性および病原性が低下し、および／または免疫原性
が改善されると期待される。
【０１３０】 本発明の他の態様においては、単離した感染性PIVを作製するための組成物（
たとえば単離ポリヌクレオチド、およびヒト-ウシキメラPIVコードcDNAを取り込
ませたベクター）が提供される。これらの組成物および方法を用いて、PIVゲノ
ムまたはアンチゲノム、ヌクレオキャプシド（N）タンパク質、ヌクレオキャプ
シドリンタンパク質（P）、およびラージ（L）ポリメラーゼタンパク質から、感
染性PIVが形成される。本発明の関連態様においては、前記の構造および表現型
の変更を組換えPIVに導入して感染性弱毒ワクチンウイルスを得るための組成物
および方法が提供される。
【０１３１】 感染性ヒト-ウシキメラPIVクローン中への前記変異の導入は、多様な周知方法
により達成できる。DNAに関して”感染性クローン”とは、感染性ウイルスまた
はサブウイルス粒子のゲノムを生成するための鋳型として作用しうるゲノムまた
はアンチゲノムRNAに転写できる、合成その他のcDNAまたはその生成物を意味す
る。たとえば、特定の変異を常法（たとえば部位特異的変異誘発）によりゲノム
またはアンチゲノムのcDNAコピーに導入できる。本明細書に記載する完全アンチ
ゲノムまたはゲノムcDNAの組立てにアンチゲノムまたはゲノムcDNAサブフラグメ
ントを使用することは、各領域を別個に操作でき（小さいcDNAは大きいものより
操作しやすい）、次いで容易に組み立てて完全cDNAにすることができるという利
点をもつ。このように、完全アンチゲノムもしくはゲノムcDNAまたはそのサブフ
ラグメントを、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発のための鋳型として使用でき
る。これは、一本鎖ファージミド形の中間体を経る方法、たとえばBio-Rad Labo
ratories（カリフォルニア州リッチモンド）のMuta-gene（登録商標）キットを
用いる方法、または二本鎖プラスミド、たとえばStratagene（カリフォルニア州
ラヨラ）のChameleon変異誘発キットを直接に鋳型として用いる方法、あるいは
オリゴヌクレオチドプライマーまたは目的変異を含む鋳型を用いるポリメラーゼ
連鎖反応による方法であってもよい。次いで変異サブフラグメントを組み立てて
、完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNAにすることができる。PIVアンチゲノム
またはゲノムcDNAにおける目的変異の形成に使用できる他の多様な変異誘発方法
が知られており、採用できる。変異は、単一ヌクレオチド変更から、1以上の遺
伝子またはゲノム領域を含む大きなcDNA片の交換にまで及びうる。
【０１３２】 たとえばある態様においては、Bio-Radから入手できるMuta-geneファージミド
インビトロ変異誘発キットを用いて変異を導入する。すなわち、PIVゲノムまた
はアンチゲノムの部分をコードするcDNAをプラスミドpTZ18U中へクローニングし
、CJ236細胞（Life Technologies）の形質転換に用いる。製造業者の推奨に従っ
てファージミド調製物を調製する。ゲノムまたはアンチゲノムの目的位置に改変
ヌクレオチドを導入することにより、変異誘発用オリゴヌクレオチドを設計する
。遺伝子改変したゲノムまたはアンチゲノムフラグメントを含むこのプラスミド
を、次いで増幅させ、次いで変異片を全長ゲノムまたはアンチゲノムクローン中
へ再導入する。
【０１３３】 本発明の感染性PIVは、PIVゲノムまたはアンチゲノムRNAをコードする1以上の
単離ポリヌクレオチド分子を、転写性複製性ヌクレオキャプシドの形成に必要な
ウイルスタンパク質をコードする1以上のポリヌクレオチドと、細胞内または無
細胞系で同時発現させることにより作製される。同時発現させて感染性PIVを得
るのに有用なウイルスタンパク質には、主要ヌクレオキャプシドタンパク質（N
）、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）、ラージ（L）ポリメラーゼタンパ
ク質、融合タンパク質（F）、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ糖タンパク質（
HN）およびマトリックスタンパク質（M）が含まれる。これに関して有用なもの
は、PIVのC、DおよびV ORFの生成物である。
【０１３４】 PIVゲノムまたはアンチゲノムをコードするcDNAを、感染性PIVの形成に必要な
ウイルスタンパク質との細胞内またはインビトロ同時発現用に構築する。”PIV
アンチゲノム”とは、子孫PIVゲノムの合成用鋳型として作用する単離したプラ
ス-センスポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくは、複製性中間体RNAに対
応するPIVゲノムまたはアンチゲノムのプラス-センス形態であるcDNAを構築し、
これにより転写性複製性ヌクレオキャプシドの形成に必要なタンパク質をコード
する相補配列のプラス-センス転写配列とハイブリダイズする可能性を最小限に
する。
【０１３５】 本発明のある態様において、組換えPIV（rPIV）のゲノムまたはアンチゲノム
は、それによりコードされるウイルスまたはサブウイルス粒子を感染性にするの
に必要な遺伝子またはその部分を含有しさえすればよい。さらに、これらの遺伝
子またはその部分を、1より多いポリヌクレオチド分子により供給することがで
きる。すなわち、別個のヌクレオチド分子からの相補性などにより遺伝子を供給
してもよい。他の態様において、PIVゲノムまたはアンチゲノムは、プラスミド
またはヘルパー細胞系により供給されるヘルパーウイルスまたはウイルス機能の
関与なしに、ウイルスの増殖、複製および感染に必要なすべての機能をコードす
る。
【０１３６】 ”組換えPIV”とは、組換え発現系から直接的または間接的に誘導された、あ
るいはそれから産生したウイルスまたはサブウイルス粒子から増殖した、PIVま
たはPIV様のウイルスまたはサブウイルス粒子を意味する。組換え発現系は、下
記のものを含む組換え発現ベクターを用いる：少なくともPIV遺伝子発現におい
て調節の役割をもつ1以上の遺伝子要素（たとえばプロモーター）のアセンブリ
ーを含む作動可能な状態で結合した転写ユニット、転写されてPIV RNAになる構
造またはコード配列、ならびに適切な転写開始および終止配列。
【０１３７】 cDNA発現したPIVゲノムまたはアンチゲノムから感染性PIVを作製するためには
、ゲノムまたはアンチゲノムを、（i）RNA複製可能なヌクレオキャプシドが形成
されるのに必要な、かつ（ii）子孫のヌクレオキャプシドがRNA複製および転写
両方の能力をもつのに必要な、PIV N、PおよびLタンパク質と同時発現させる。
ゲノムヌクレオキャプシドによる転写は、他のPIVタンパク質を供給し、生産的
感染を開始する。あるいは、生産的感染に必要な追加PIVタンパク質を同時発現
により供給できる。
【０１３８】 PIVアンチゲノムまたはゲノムと前記ウイルスタンパク質との同時合成は、イ
ンビトロ（無細胞）でたとえば組合わせ転写-翻訳反応させ、次いで細胞中へト
ランスフェクションすることによっても達成できる。あるいは、アンチゲノムま
たはゲノムRNAをインビトロで合成し、そしてPIVタンパク質発現細胞中へトラン
スフェクションすることもできる。
【０１３９】 本発明のある態様においては、転写性複製性PIVヌクレオキャプシドの形成に
必要なタンパク質をコードする相補配列を1以上のヘルパーウイルスにより供給
する。そのようなヘルパーウイルスは野生型または変異体であってよい。好まし
くは、ヘルパーウイルスはPIV cDNAによりコードされるウイルスと表現型におい
て区別できる。たとえば、ヘルパーウイルスと免疫反応するが、PIV cDNAにより
コードされるウイルスとは反応しないモノクローナル抗体を供給することが望ま
しい。そのような抗体は中和抗体であってもよい。ある態様においては、抗体を
アフィニティークロマトグラフィーに用いてヘルパーウイルスを組換えウイルス
から分離できる。そのような抗体の獲得を補助するために、ヘルパーウイルスか
らの抗原差を与える変異をPIV cDNAの、たとえばHNまたはF糖タンパク質遺伝子
に導入してもよい。
【０１４０】 本発明の他の態様においては、N、P、Lその他の目的とするPIVタンパク質が1
以上の非ウイルス性発現ベクターによりコードされる。これはゲノムまたはアン
チゲノムをコードするものと同一でも別個でもよい。所望により追加タンパク質
を含有させてもよく、これらはそれぞれ、それ自身のベクターによりコードされ
るか、あるいはN、P、Lその他のPIVタンパク質のうち1以上をコードするベクタ
ーまたは完全ゲノムもしくはアンチゲノムによりコードされる。トランスフェク
ションしたプラスミドからのゲノムまたはアンチゲノムおよびタンパク質の発現
は、T7 RNAポリメラーゼに対するプロモーターの制御下にある各cDNAにより達成
でき、T7 RNAポリメラーゼはそれに対する発現系、たとえばT7 RNAポリメラーゼ
を発現するワクシニアウイルスMVA株の感染、トランスフェクションまたはトラ
ンスダクションにより供給される（Wyatt et al., Virology, 210：202-205, 19
95；その全体を本明細書に援用する）。ウイルスタンパク質および／またはT7 R
NAポリメラーゼは、形質転換した哺乳動物細胞により、または予め形成したmRNA
もしくはタンパク質のトランスフェクションにより供給することもできる。
【０１４１】 本発明に使用するPIVアンチゲノムは、たとえば集合すると完全アンチゲノム
となるクローン化cDNAセグメントを、PIV mRNAまたはゲノムRNAの逆転写コピー
のポリメラーゼ連鎖反応（PCR；たとえばUSP4,683,195および4,683,202；ならび
にPCR Protocols：A Guide to Methods and Applications, Innis et al., 編、
Academic Press, サンディエゴ、1990；それぞれの全体を本明細書に援用する）
などにより組み立てることによって構築できる。たとえば、適切なプロモーター
（たとえばT7 RNAポリメラーゼプロモーター）からアンチゲノムの左手側末端を
含有するcDNAを含む第1構築体を形成し、適切な発現ベクター、たとえばプラス
ミド、コスミド、ファージまたはDNAウイルスベクター中に組み立てる。変異誘
発により、および／または組み立てを容易にするように設計したユニーク制限部
位を含む合成ポリリンカーの挿入により、ベクターを修飾してもよい。調製を容
易にするために、N、P、Lその他の目的PIVタンパク質を1以上の別個のベクター
中に組み立てることもできる。アンチゲノムプラスミドの右手側末端に、所望に
より追加配列、たとえばフランキングリボザイムおよび縦列T7転写ターミネータ
ーが含まれてもよい。リボザイムはハンマーヘッドタイプのものであってもよく
（たとえばGrosfeld et al., J. Virol., 69：5677-5686, 1995）、これにより
単一の非ウイルスヌクレオチドを含む3'末端が得られる。あるいはリボザイムは
他の適切な任意のリボザイム、たとえば肝炎デルタウイルスのものであってもよ
く（Perrotta et al., Nature, 350：434-436, 1991；その全体を本明細書に援
用する）、これにより非PIVヌクレオチドを含まない3'末端が得られる。次いで
左手側末端と右手側末端を共通の制限部位により結合させる。
【０１４２】 cDNA構築の途中または後で、PIVゲノムまたはアンチゲノム中において多様な
ヌクレオチド挿入、欠失および再配列を行うことができる。たとえば特定の目的
ヌクレオチド配列を合成し、好都合な制限酵素部位を利用してcDNA中の適切な領
域に挿入することができる。あるいは、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニ
ング、PCR変異誘発などの技術、または当技術分野で周知の他の技術を用いて、c
DNAに変異を導入することができる。
【０１４３】 ゲノムまたはアンチゲノムをコードするcDNAを構築するための他の手段には、
改良PCR条件を用いる逆転写PCR（たとえばCheng et al., Proc. Natl. Acad. Sc i. U.S.A., 91 ：5695-5699, 1994に記載；本明細書に援用する）が含まれ、これ
によりサブユニットcDNA成分の数は1または2片程度に減る。他の態様においては
、異なるプロモーター（たとえばT3、SP6）または異なるリボザイム（たとえば
肝炎デルタウイルス）を使用できる。大サイズのゲノムまたはアンチゲノムをよ
り良く収容するために、異なるDNAベクター（たとえばコスミド）を増殖に使用
できる。
【０１４４】 生産的PIV感染を支持しうる細胞、たとえばHEp-2、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-
5およびVero細胞中へのトランスフェクション、エレクトロポレーション、機械
的挿入、トランスダクションなどにより、ゲノムまたはアンチゲノムをコードす
る単離ポリヌクレオチド（たとえばcDNA）を適切な宿主細胞に挿入できる。たと
えば下記の方法で、培養細胞中への単離ポリヌクレオチド配列のトランスフェク
ションを行うことができる：リン酸カルシウム仲介トランスフェクション（Wigl
er et al., Cell, 14：725, 1978；Corsaro and Pearson, Somatic Cell Geneti cs , 7：603, 1981；Graham and Van der Eb, Virology, 52：456, 1973）、エレ
クトロポレーション（Neumann et al., EMBO J., 1：841-845, 1982）、DEAE-デ
キストラン仲介トランスフェクション（Ausubel et al.編、Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley and Sons社、ニューヨーク、1987）、カチ
オン脂質仲介トランスフェクション（Hawley-Nelson et al., Focus, 15：73-79
, 1993）または市販のトランスフェクション試薬、たとえばLipofectACE（登録
商標）（Life Technologies、メリーランド州ガイザースバーグ）など（以上の
各文献の全体を本明細書に援用する）。
【０１４５】 前記のように、本発明のある態様においては、N、P、Lその他の目的PIVタンパ
ク質が、ゲノムまたはアンチゲノムをコードするものと表現型の識別可能な1以
上のヘルパーウイルスによりコードされる。N、P、Lその他の目的PIVタンパク質
が1以上の発現ベクターによりコードされてもよく、これらはゲノムまたはアン
チゲノムをコードするものと同一または別個のもの、およびその種々の組合わせ
であってもよい。所望により、それぞれがそれ自身のベクターによりコードされ
るか、あるいは1以上のN、P、Lその他の目的PIVタンパク質をコードするベクタ
ー、または完全ゲノムもしくはアンチゲノムによりコードされる追加タンパク質
を含有させてもよい。
【０１４６】 感染性PIVクローンの提供により、本発明はPIVゲノム（またはアンチゲノム）
に広範な改変を組換え形成して、目的とする表現型変更を特定する一定の変異体
を得ることができる。”感染性クローン”とは、感染性ウイルスまたはサブウイ
ルス粒子のゲノムを生成するための鋳型として作用しうるゲノムまたはアンチゲ
ノムRNAに転写できる、感染性ウイルス粒子に直接に取り込まれうるcDNA、また
はその生成物である合成その他のRNAを意味する。前記のように、多様な常法（
たとえば部位特異的変異誘発）によりゲノムまたはアンチゲノムのcDNAコピーに
一定の変異を導入できる。前記のように、完全なゲノムまたはアンチゲノムcDNA
の組立てにゲノムまたはアンチゲノムcDNAのサブフラグメントを使用することは
、各領域を別個に操作でき（小さいcDNAは大きいものより操作しやすい）、次い
で容易に組み立てて完全cDNAにすることができるという利点をもつ。このように
、完全アンチゲノムもしくはゲノムcDNAまたはそのサブフラグメントを、オリゴ
ヌクレオチド指向性変異誘発のための鋳型として使用できる。これは、一本鎖フ
ァージミド形の中間体を経る方法、たとえばBio-Rad Laboratories（カリフォル
ニア州リッチモンド）のMUTA-gen（登録商標）キットを用いる方法、または二本
鎖プラスミド、たとえばStratagene（カリフォルニア州ラヨラ）のChameleon（
登録商標）変異誘発キットを直接に鋳型として用いる方法、あるいはオリゴヌク
レオチドプライマーまたは目的変異を含む鋳型を用いるポリメラーゼ連鎖反応に
よる方法であってもよい。次いで変異サブフラグメントを組み立てて、完全アン
チゲノムまたはゲノムcDNAにすることができる。本発明のPIVアンチゲノムまた
はゲノムcDNAにおける目的変異の形成に使用できる他の多様な変異誘発方法が知
られており、ルーティンに適用できる。
【０１４７】 たとえばある態様においては、Bio-Rad Laboratoriesから入手できるMUTA-gen
eファージミドインビトロ変異誘発キットを用いて変異を導入する。すなわち、P
IVゲノムまたはアンチゲノムの部分をコードするcDNAをプラスミドpTZ18U中へク
ローニングし、CJ236細胞（Life Technologies）の形質転換に用いる。製造業者
の推奨に従ってファージミド調製物を調製する。ゲノムまたはアンチゲノムの目
的位置に改変ヌクレオチドを導入することにより、変異誘発用オリゴヌクレオチ
ドを設計する。遺伝子改変したゲノムまたはアンチゲノムフラグメントを含むこ
のプラスミドを、次いで増幅させる。
【０１４８】 変異は、単一ヌクレオチド変更から、1以上の遺伝子またはゲノムセグメント
を含有する大きなcDNAセグメントの導入、欠失または置換にまで及びうる。ゲノ
ムセグメントは、構造ドメインおよび／または機能ドメイン、たとえばタンパク
質の細胞質、貫膜またはエクトドメイン、活性部位、たとえば種々のタンパク質
との結合その他の生化学的相互作用を仲介する部位、エピトープ部位、たとえば
抗体結合および／または体液性もしくは細胞性免疫応答を刺激する部位などに対
応するものであってよい。これに関して有用なゲノムセグメントは、タンパク質
の小さな機能性ドメインをコードするゲノムセグメント（たとえばエピトープ部
位）の場合の約15〜35ヌクレオチドから、約50、75、100、200〜500および500〜
1500またはそれ以上のヌクレオチドに及ぶ。
【０１４９】 特定の変異を感染性PIVに導入できることは、PIV病原性および免疫原性機序の
操作を含めた多くの用途をもつ。たとえば、タンパク質発現を排除し、もしくは
発現レベルを低下させる変異、または変異タンパク質を生成する変異の導入によ
り、N、P、M、F、HNおよびLタンパク質ならびにC、DおよびV ORF生成物を含めた
PIVタンパク質の機能を操作できる。種々のゲノムRNA構造要素、たとえばプロモ
ーター、遺伝子間領域および転写シグナルも、本発明の方法および組成物におい
てルーティンに操作できる。たとえば、PIVミニゲノムを用いる並行アッセイ（D
imock et al., J. Virol., 67：2722-778, 1993；その全体を本明細書に援用す
る）に完全アンチゲノムcDNAを使用して、トランス作用タンパク質およびシス作
用RNA配列の効果を容易に判定でき、そのレスキュー依存状態は複製-非依存ウイ
ルスとして回復させるには有害すぎる変異体を解明するのに有用である。
【０１５０】 本発明の組換えPIVにおいて、遺伝子またはゲノムセグメントのある種の置換
、挿入、欠失または再配列（たとえば選択したタンパク質またはタンパク質領域
、たとえば細胞質テイル、貫膜ドメインまたはエクトドメイン、エピトープ部位
または領域、結合部位または領域、活性部位または活性部位を含む領域をコード
するゲノムセグメントの置換）を、既存の”カウンターパート”遺伝子またはゲ
ノムセグメントに対して構造または機能関係で同一もしくは異なるPIVまたは他
の供給源から行う。そのような修飾により、野生型もしくは親PIVまたは他のウ
イルス株と比較して新規な目的表現型変更をもつ組換え体が得られる。たとえば
このタイプの組換え体は、あるPIVの細胞質テイルおよび／または貫膜ドメイン
が他のPIVのエクトドメインに融合したキメラタンパク質を発現できる。このタ
イプの組換え体の他の列は、二重タンパク質領域、たとえば二重免疫原領域を発
現する。
【０１５１】 本明細書中で用いる”カウンターパート”遺伝子、ゲノムセグメント、タンパ
ク質またはタンパク質領域は、一般にヘテロロガス供給源に由来する（たとえば
異なるPIV遺伝子に由来するか、あるいは異なるPIVタイプまたは株の同一（すな
わち相同または対立）遺伝子またはゲノムセグメントである）。これに関して選
択した一般的なカウンターパートは、おおまかな構造特色が共通する。たとえば
、各カウンターパートは対比しうるタンパク質またはタンパク質構造ドメイン、
たとえば細胞質ドメイン、貫膜ドメイン、エクトドメイン、結合部位または領域
、エピトープ部位または領域などをコードすることができる。カウンターパート
ドメインおよびそれらのコードゲノムセグメントは、それらのドメインまたはゲ
ノムセグメント変異体に共通の生物学的活性により定められる広範なサイズおよ
び配列多様性をもつ種のアセンブラージを含む。
【０１５２】 本発明の組換えPIVを作製するための、本明細書に開示したカウンターパート
遺伝子およびゲノムセグメントならびに他のポリヌクレオチドは、選択した”参
照配列”、たとえば他の選択したカウンターパート配列と実質的な配列同一性を
もつ場合がしばしばある。本明細書中で用いる”参照配列”は、配列比較の基礎
として用いられる特定の配列、たとえば全長cDNAもしくは遺伝子のセグメント、
または完全cDNAまたは遺伝子配列である。一般に参照配列は少なくとも20ヌクレ
オチドの長さ、多くの場合少なくとも25ヌクレオチドの長さ、しばしば少なくと
も50ヌクレオチドの長さである。2つのポリヌクレオチドはそれぞれ（1）それら
2つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち完全ポリヌクレオチド配列
の部分）を含む可能性があり、（2）さらにそれら2つのポリヌクレオチド間で異
なる配列を含む可能性があるので、2つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド
の配列比較は一般に、2つのポリヌクレオチドの配列を配列類似性の局所領域を
同定および比較するための”比較ウインドウ”で比較することにより行われる。
本明細書中で用いる”比較ウインドウ”は、少なくとも20の連続ヌクレオチド位
置の概念上のセグメントを表し、これらの位置でポリヌクレオチド配列を少なく
とも20の連続ヌクレオチド参照配列と比較し、比較ウインドウ中のポリヌクレオ
チド配列の部分は2配列の最適アラインメントのために参照配列（これは付加ま
たは欠失を含まない）と比較して20％以下の付加または欠失（すなわちギャップ
）を含むことができる。
【０１５３】 比較ウインドウのアラインメントに最適な配列アラインメントは、SmithとWat
ermanの局所相同アルゴリズム（Adv. Appl. Math., 2：482, 1981；本明細書に
援用する）により、NeedlemanとWunschの相同アラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol., 48 , 443, 1970；本明細書に援用する）により、PearsonとLipmanの
類似性検索法（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85：2444, 1988；本明細書に
援用する）により、これらのアルゴリズムの電子化処理系（GAP、BESTFIT、FAST
AおよびTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0、Genetics
Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI；本明細書に援用する）によ
り、または検索により実施され、各方法で得られた最良のアラインメント（すな
わち比較ウインドウにおいて最高％の配列類似性が得られたもの）を選択する。
”配列同一性”という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較ウインドウに
おいて同一である（すなわちヌクレオチド-対-ヌクレオチド基準で）ことを意味
する。”配列同一性％”は、比較ウインドウにおいて最適アラインメントを示す
2配列を比較し、2配列中に同一核酸塩基（たとえばA、T、C、G、UまたはI）が現
われる位置の数を判定して整合位置の数を求め、整合位置の数をその比較ウイン
ドウ中の全位置数（すなわちウインドウサイズ）で割り、この商を100倍して配
列同一性％を得ることにより計算される。本明細書中で用いる”実質的に同一”
という用語は、ポリヌクレオチドが少なくとも20ヌクレオチド位置の比較ウイン
ドウ、多くの場合少なくとも25〜50ヌクレオチドのウインドウの参照配列と対比
して少なくとも85％の配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95％の配列同一性
、より普通には少なくとも99％の配列同一性をもつ配列を含むポリヌクレオチド
配列の特性を表すために用いられる。その際、配列同一性％は参照配列をポリヌ
クレオチド配列と比較することにより計算され、これは合計して比較ウインドウ
の参照配列の20％以下の付加または欠失を含むことができる。参照配列はより大
きな配列のサブセットであってもよい。
【０１５４】 これらのポリヌクレオチド配列関係のほかに、本発明の組換えPIVによりコー
ドされるタンパク質またはタンパク質領域は、一般に保存関係をもつように、す
なわち選択した参照ポリヌクレオチドと実質的な配列同一性または配列類似性を
もつように選択される。ポリヌクレオチドに適用される”配列同一性”という用
語は、ペプチドが対応する位置において同一アミノ酸を共有することを意味する
。”配列類似性”という用語は、ペプチドが対応する位置において同一または類
似のアミノ酸をもつ（すなわち保存的置換）ことを意味する。”実質的な配列同
一性”という用語は、2つのペプチド配列を適切にアラインメントした場合（た
とえばプログラムGAPまたはBESTFITによりデフォルトギャップを用いて）、少な
くとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、より好まし
くは少なくとも95％の配列同一性（たとえば99％の配列同一性）をもつことを意
味する。”実質的な類似性”という用語は、2つのペプチド配列が対応する％の
配列類似性をもつことを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は保存的ア
ミノ酸置換による違いである。保存的アミノ酸置換とは、類似側鎖をもつ残基の
互換性を表す。たとえば脂肪族側鎖をもつアミノ酸群はグリシン、アラニン、バ
リン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族-ヒドロキシ側鎖をもつアミ
ノ酸群はセリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖をもつアミノ酸群はア
スパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖をもつアミノ酸群はフェニルア
ラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖をもつアミノ酸群は
リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖をもつアミノ酸群は
システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群はバリン-
ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、ア
ラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミンである。本明細書中で用いる20
の天然アミノ酸についての略号は一般的な使用に従う（Immunology-A Synthesis 、第2版、E.S. Gloub ＆ D.R. Gren編、Sinauer Associates、メリーランド州サ
ンダーランド、1991；本明細書に援用する）。一般的な20のアミノ酸立体異性体
（たとえばD-アミノ酸）、非天然アミノ酸、たとえばα,α-ジ置換アミノ酸、N-
アルキルアミノ酸、乳酸、および他の一般的でないアミノ酸も、本発明のポリペ
プチドに適した成分となりうる。一般的でないアミノ酸の例には、4-ヒドロキシ
プロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-ア
セチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-
メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、ω-N-メチルアルギニン、ならびに他
の類似のアミノ酸およびイミノ酸（たとえば4-ヒドロキシプロリン）が含まれる
。さらに、アミノ酸をグリコシル化、リン酸エステル化などにより修飾してもよ
い。
【０１５５】 本発明による候補ワクチンウイルスを選択するには、周知の方法に従って生存
性、弱毒性および免疫原性の基準を決定する。本発明のワクチンに最も望ましい
ウイルスは、生存性を維持し、安定な弱毒表現型をもち、免疫化宿主において複
製を示し（比較的低いレベルではあるが）、かつその後の野生型ウイルス感染に
より起きる重篤な疾患に対して防御するのに十分な免疫応答をワクチンにおいて
効率的に誘発しなければならない。本発明の組換えPIVは生存性であり、かつ従
来のワクチン候補より適切に弱毒化されているだけでなく、インビボで遺伝学的
にいっそう安定である--防御免疫応答を刺激する能力および場合により多重修飾
により与えられた防御を拡張する能力を維持し、たとえば異なるウイルス株もし
くはサブグループに対する防御または異なる免疫原理（たとえば血清免疫グロブ
リンに対する分泌型免疫グロブリン、細胞性免疫など）に対する防御を誘発する
。
【０１５６】 本発明の組換えPIVは、一般的に受け入れられている周知のインビトロおよび
インビボモデルにおいて試験して、ワクチン使用について適切な弱毒性、表現型
復帰に対する抵抗性および免疫原性を確認できる。インビトロアッセイ法におい
ては、修飾ウイルス（たとえば多重弱毒化した生物由来または組換えPIV）を、
たとえば複製レベル、ウイルス複製の温度感受性（すなわちts表現型）、および
縮小プラークその他の表現型について試験する。修飾ウイルスをさらにPIV感染
の動物モデルにおいて試験する。多様な動物モデルが、本明細書に引用した各種
文献に記載および概説されている。PIVワクチン候補の弱毒性および免疫原性を
評価するための、げっ歯類および非ヒト霊長類を含めたPIVモデル系が当技術分
野で広く受け入れられており、それらから得られるデータはヒトにおけるPIV感
染性、弱毒性および免疫原性と良好に相関する。
【０１５７】 以上の記載に従って、本発明はワクチンとして使用するための単離した感染性
組換えPIVウイルス組成物をも提供する。ワクチン成分である弱毒ウイルスは、
単離された、一般に精製した形のものである。単離とは、野生型ウイルスの天然
以外の環境、たとえば感染個体の鼻咽頭内にあるPIVを表すものとする。より一
般的には単離は、細胞培養物、または制御された状態で増殖および解明できる他
の人工培地の成分として弱毒ウイルスを含むものとする。たとえば、本発明の弱
毒PIVは感染細胞培養により産生され、細胞培養物から分離され、安定剤に添加
される。
【０１５８】 ワクチンとして使用するためには、本発明により作製した組換えPIVをそのま
まワクチン配合物中に使用し、あるいは所望により当業者に周知の凍結乾燥プロ
トコルを用いて凍結乾燥することができる。凍結乾燥ウイルスは一般に約4℃に
保持される。使用に際して、凍結乾燥ウイルスを安定化溶液、たとえば塩類溶液
またはSPG、Mg++およびHEPESを含む溶液（後記に詳述するアジュバントを含むも
の、または含まないもの）中に再生する。
【０１５９】 本発明のPIVワクチンは、活性成分として本明細書の記載に従って作製した免
疫学的有効量のPIVを含有する。この修飾ウイルスを生理学的に許容できるキャ
リヤーおよび／またはアジュバント、たとえば水、緩衝水、0.4％塩類溶液、0.3
％グリシン、ヒアルロン酸などと共に宿主に導入することができる。得られた水
溶液をそのまま包装し、または凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は、前
記のように投与前に無菌溶液と組み合わせる。組成物は、所望により生理学的状
態に近似させる医薬的に許容できる助剤、たとえばpH調節剤および緩衝剤、張力
調節剤、湿潤剤など（たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノオレイン酸ソルビタン、オレイン酸ト
リエタノールアミンなど）を含有してもよい。許容できるアジュバントには、不
完全フロイントアジュバント、MPL（商標）（3-o-脱アシル化モノホスホリル脂
質A；RIBI ImmunoChem Research社、モンタナ州ハミルトン）およびIL-12（Gene
tics Institute、メリーランド州ケンブリッジ）ならびに当技術分野で周知の他
のアジュバントが含まれる。
【０１６０】 本明細書に記載するPIV組成物によりエアゾール、経口、局所その他の経路で
免疫化すると、宿主の免疫系がPIVウイルスタンパク質、たとえばFおよびHN糖タ
ンパク質に特異的な抗体の産生により応答する。本明細書の記載に従って作製し
た免疫学的有効量のPIVを接種した結果、宿主はPIV感染に対して少なくとも部分
的または完全に免疫になり、または中程度もしくは重症のPIV感染症、特に下気
道感染症の発症に対して抵抗性になる。
【０１６１】 ワクチンを投与される宿主は、PIVまたは近縁ウイルス感染に対して感受性の
いかなる哺乳動物であってもよく、宿主は接種株の抗原に対して防御免疫を生じ
ることができる。したがって本発明は、多様なヒトおよび動物用のワクチン調製
のための方法を提供する。
【０１６２】 本発明のPIVを含有するワクチン組成物を、PIV感染に対して感受性できるか、
または他のリスクをもつ宿主に投与して、宿主自身の免疫応答能を高める。その
ような量を”免疫学的有効量”と定義する。この使用に際して、有効量内での厳
密なPIV投与量は、宿主の健康状態および体重、投与様式、配合物の性質などに
依存するであろうが、一般に宿主当たり約103〜約107プラーク形成単位（PFU）
またはそれ以上のウイルス、より一般的には宿主当たり約104〜約106PFUのウイ
ルスであろう。いずれにしろ、ワクチン配合物は重篤なまたは致命的なPFU感染
症に対して宿主を効果的に防御するのに十分な量の修飾PIVを供給しなければな
らない。
【０１６３】 本発明に従って作製したPIVを他のPIV血清型または株のウイルスと組み合わせ
て、多重のPIV血清型または株に対する防御を達成することができる。あるいは
、本明細書に記載するように、1ウイルス中に多重の血清型または株の防御エピ
トープを工学的に組み合わせることにより、多重のPIV血清型または株に対する
防御を達成することができる。一般にこの異なるウイルスを投与する場合、それ
らを混合して同時に投与するか、あるいは別個に投与してもよい。1株による免
疫化で、同一または異なる血清型の異なる株に対して防御できる。
【０１６４】 場合により、本発明のPIVワクチンと、他の病原性、特に小児ウイルスに対す
る防御応答を誘発するワクチンと組み合わせることが望ましいであろう。本発明
の他の態様においては、PIVを他の病原体たとえば呼吸系発疹ウイルス（RSV）ま
たは麻疹ウイルスの防御抗原のためのベクターとして、これらの防御抗原をコー
ドする配列を本明細書に記載する感染性PIVの作製に用いるPIVゲノムまたはアン
チゲノム中へ取り込ませることにより使用できる（米国仮特許出願60／170,195
：Murphyらにより1999年12月10日出願；本明細書に援用する）。
【０１６５】 すべての対象において、組換えPIVワクチンの厳密な投与量、ならびに投与の
時期および回数は、患者の健康状態および体重、投与様式、配合物の性質などに
依存するであろう。投与量は一般に、患者当たり約103〜約107プラーク形成単位
（PFU）またはそれ以上のウイルス、より一般的には患者当たり約104〜約106PFU
のウイルスであろう。いずれにしろ、ワクチン配合物は抗PIV免疫応答を効果的
に刺激または誘発するのに十分な量の弱毒PIVを供給しなければならない。これ
はたとえば補体結合、プラーク中和、および／または酵素結合イムノソルベント
アッセイならびに他の方法により測定できる。これに関して、個体の上気道疾患
の徴候および症状についても監視する。アカゲザルへの投与について、本発明ワ
クチンの弱毒ウイルスは被接種体の鼻咽頭内で野生型ウイルスより約10倍以上低
い、または不完全弱毒PIVのレベルと比較して約10倍以上低いレベルで増殖する
。
【０１６６】 新生児および乳児においては、十分なレベルの免疫を誘発するために多数回投
与が必要であろう。投与は生後1カ月以内に開始し、野生型PIV感染症に対して十
分なレベルの防御を維持するために、必要に応じて2カ月、6カ月、1年および2年
の間隔で行うべきである。同様に、再発性または重篤なPIV感染症に対して、特
に感受性の成人、たとえばヘルスケアワーカー、デイケアワーカー、幼児の家族
、高齢者、免疫不全心肺機能個体は、防御免疫応答を樹立および／または維持す
るために多数回免疫化が必要であろう。誘導免疫のレベルは分泌型および血清型
の中和抗体の量を測定することにより監視でき、目的レベルの防御を維持するの
に必要に応じて、投与量を調節し、または接種を反復する。さらに、異なるレシ
ピエント群に対しては異なるワクチンウイルスの投与を指示することができる。
たとえばサイトカイン、またはT細胞エピトープに富む追加タンパク質を発現す
る工学的に作製したPIV株は、乳児より成人に対して特に有利であろう。
【０１６７】 本発明に従って作製したPIVワクチンを、他のサブグループまたは株のPIVの抗
原を発現するウイルスと組み合わせて、多重PIVサブグループまたは株に対する
防御を達成することができる。あるいはワクチンウイルスは、本明細書に記載す
るように1つのPIVクローン中に工学的に挿入した多重PIVサブグループまたは株
の防御エピトープを取り込むことができる。
【０１６８】 本発明のPIVワクチンは、重篤な下気道疾患、たとえば肺炎および気管支炎に
対して、その後個体が野生型PIVに感染した際に防御する免疫応答を誘発する。
天然の循環性ウイルスは特に上気道においてなお感染症を引き起す可能性がある
が、鼻炎は接種の結果大幅に低下する可能性があり、かつその後の野生型ウイル
ス感染により抵抗性が増強される可能性がある。接種後、宿主産生による血清抗
体および分泌型抗体が検出可能なレベルで産生され、これらはインビトロおよび
インビボで相同（同一サブグループの）野生型ウイルスを中和することができる
。多くの場合、宿主抗体は異なる非ワクチンサブグループの野生型ウイルスをも
中和するであろう。
【０１６９】 本発明の好ましいPIVワクチン候補は、ヒトにおいて自然状態で循環している
野生型ウイルスと比較すると、実質的に著しい毒性低下を示す。このウイルスは
、大部分の免疫化個体において感染症が起きないほど十分に弱毒化している。場
合により、この弱毒ウイルスはワクチン接種していない個体に対してはなお播種
性の可能性がある。しかしその毒性は、接種した宿主または発症宿主において重
篤な下気道感染症が起きないほど十分に低下している。
【０１７０】 PIVワクチン候補の弱毒化レベルは、たとえば免疫化宿主の気道に存在するウ
イルスの量を測定し、この量と野生型PIVまたは候補ワクチン株として評価され
たことがある他の弱毒PIVが産生するウイルス量を比較することにより判定でき
る。たとえば、本発明の弱毒ウイルスは高感受性宿主（たとえばチンパンジーま
たはアカゲザル）の上気道における複製制限度が、野生型ウイルスの複製度と比
較してたとえば10〜1000倍低い。上気道におけるウイルス複製に伴う鼻漏の進行
をさらに低下させるために、理想的な候補ワクチンは上および下気道の両方にお
ける複製度制限を示すべきである。ただし本発明の弱毒ウイルスは接種個体を防
御するのに十分なほど感染性かつ免疫原性でなければならない。感染宿主の鼻咽
喉におけるPIVレベルの測定方法は文献中に周知である。
【０１７１】 本発明のワクチンにより得られる誘導免疫のレベルは、分泌型および血清型の
中和抗体の量を測定することによっても監視できる。これらの測定に基づいて、
ワクチン投与量を調節し、あるいは目的の防御レベルを維持するために必要に応
じて接種を反復することができる。さらに、異なるレシピエント群には異なるワ
クチンウイルスが有利であるかもしれない。たとえばT細胞エピトープに富む追
加タンパク質を発現する工学的に作製したPIV株は、乳児より成人に対して特に
有利であろう。
【０１７２】 本発明のさらに他の態様においては、PIVを気道の一時遺伝子療法のためのベ
クターとして使用する。この態様によれば、組換えPIVゲノムまたはアンチゲノ
ムに当該遺伝子生成物をコードしうる配列を取り込ませる。当該遺伝子生成物は
、PIV発現を制御するものと同一または異なるプロモーターの制御下にある。N、
PおよびLその他の目的PIVを含み、かつ当該遺伝子生成物をコードする配列を含
む組換えPIVゲノムまたはアンチゲノムの同時発現により形成された感染性PIVが
患者に投与される。投与は一般に、処置される患者の気道へのエアゾール、ネブ
ライザーその他の局所適用による。組換えPIVは、治療または予防レベルの目的
遺伝子生成物を発現するのに十分な量で投与される。この方法で投与できる代表
的な遺伝子生成物は、好ましくはたとえばインターロイキン-2、インターロイキ
ン-4、γ-インターフェロン、GM-CSF、G-CSF、エリスロポエチンおよび他のサイ
トカイン、グルコセレブロシゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、嚢胞性線
維症膜貫通調節タンパク質（CFTR）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ、細胞毒素、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスRNA、およびワ
クチン抗原の一時発現に適したものである。
【０１７３】 以下の実施例は説明のために提示するものであり、限定のためのものではない
。 実施例I キメラHPIV3/BPIV3アンチゲノムをコードするcDNAの構築および感染性ウィル
スの回復 以下の3つの実施例は、BPIV3のいずれが霊長類におけるその宿主の範囲の制限
に寄与するかを同定するための研究を詳細に記録する。これらの方法を説明する
ために、野生型HPIV3ウィルスのNタンパク質を、BPIV3由来のその対応物により
置換した。この置換は、上述したようなcDNAからの感染性PIVの回復のための、
リバースジェネティクス（reverse genetics）システムを使用して行った。この
研究は、このタンパク質が、他のHPIV3およびBPIV3タンパク質と比較して、その
HPIV3対応物と中程度のアミノ酸配列変異を有するため、BPIV3のN遺伝子により
開始した（実施例Iを参照）。
【０１７４】 HPIV3のJS系統のN ORFを、BPIV3のKa系統またはSF系統のものにより置換した
、キメラ組換えウィルスを構築した（図1）。これらのキメラウィルスは、HPIV3
親株のHNおよびF糖タンパク質を有し、そして霊長類におけるHPIV3に対する高レ
ベルの免疫を誘導するであろう。両方のキメラウィルスが、うまく回収された。
両方ともが細胞培養中で高力価に増殖し、そして両方ともがアカゲザルにおいて
弱毒化されたことが示された。このように、Nタンパク質は、BPIV3の宿主範囲表
現型に寄与する典型的なタンパク質として同定された。KaまたはSFキメラ組換え
ウィルスによるアカゲザルの免疫化により、野生型チャレンジとして用いられた
HPIV3の複製に対して、高レベルの抵抗性が誘導された。
【０１７５】 したがって、本発明は、BPIV3の宿主範囲弱毒化特性とHPIV3 HNおよびF防御性
抗原の免疫原性とを組み合わせるキメラヒト-ウシPIVウィルスを生成するための
、リバースジェネティクス（reverse genetics）法の有用性を確立する。そのよ
うなキメラ組換え体によるヒトの免疫化により、以前にヒトにおいて見られた、
BPIV3ワクチンの免疫原性が最適以下であるという問題が是正されるであろう。
【０１７６】 Ka BPIV3系統またはSF BPIV3系統のそれぞれに対して完全にコンセンサスなヌ
クレオチド配列を、ビリオンRNAから生成したRT-PCR産物から決定した。これら
の配列は、図6A-6Gおよび図7A-7Gにそれぞれ示す。BPIV3 Kaの完全な15456ヌク
レオチド（nt）アンチゲノムRNAをコードする完全長cDNAは、本明細書中の図6A-
6Gに示す（GenBank受託番号#AF 178654も参照）。BPIV3カンザス系統についての
GenBank配列は、典型的なcDNAの配列とは、ヌクレオチド21および23の2個所で異
なる。公開された配列および典型的なcDNA中の配列の両方とも、カンザス系統ウ
ィルス集団中で同程度の頻度で天然に生じる。本実施例において使用したcDNAに
は、ヌクレオチド18で始まる配列、ACTGGTT（SEQ ID NO. 1）が含まれ、その一
方で対応する公開された配列（GenBank受託番号#AF 178654；図6A-6G、SEQ ID N
O. 22）はACTTGCTと読まれている（位置21および23での異なるヌクレオチドを下
線で示す）。
【０１７７】 KaおよびSF BPIV3系統に対するコンセンサスヌクレオチド配列を構築するため
、ビリオンRNAを、Superscript II Preamplification System（Life Technologi
es, Gaithersburg, MD）および200 ngのランダムヘキサマープライマーを使用す
る逆転写に供した。PCRは、Advantage cDNA PCRキット（Clontech Laboratories
, Palo Alto, CA）を使用して、ファーストストランド産物に対して行った。Ka
およびSFゲノムを、3または4つのオーバーラップする断片中でのPCRにより、以
前に公開されたパラミクソウィルス（paramyxovirus）の配列の間で保存されて
いるRNAの領域と相同なプライマーを使用して、増幅した。それぞれのプライマ
ー対を、適合する制限酵素部位（増幅の標的とされる配列中には示されていない
）を含むように構築した。
【０１７８】 1セットのPCR産物を適切な制限酵素で消化し、その後ゲル精製し、タンデムア
レイ（tandem arrays）および超音波処理中でライゲーションすることにより、
それぞれのアンプリコン（amplicon）について別個のランダムライブラリーを生
成した。剪断されたcDNA配列のこのプールから、サブセット（約500 bpの断片）
をM 13中にクローニングすることにより、ランダムライブラリーを生成した。cD
NA挿入物のヌクレオチド配列を、Taq DYE Deoxy ターミネーターサイクルシーク
エンシングキット（ABI, Foster City, CA）を使用する自動化DNAシークエンシ
ングにより決定した。それぞれのヌクレオチド位置を最小で3つの別個のM13クロ
ーンにより確認した、十分なリダンダンシーを有するもとの大型RT-PCR断片のそ
れぞれについて、連続配列（contig）を組み立てた。KaおよびSFの5'および3'末
端ゲノム配列は、Rapid Amplification of cDNA Ends（Life Technologies, Gai
thersburg, MD）のためのシステムを使用して、cDNAに変換し、そして自動化シ
ークエンシングにより配列を決定した。
【０１７９】 これらの配列は、図6A-6G（Ka）および図7A-7G（SF）にそれぞれ示す。これら
の配列の解析から、HPIV3およびBPIV3の以下のタンパク質のそれぞれについて、
％アミノ酸同一性は：N（86％）、P（65％）、M（93％）、F（83％）、HN（77％
）、そしてL（91％）であることが示された。このように、配列相違（divergenc
e）が多くの遺伝子にわたって分布したものであることがわかった。これらの2種
のウィルスのN遺伝子の推定アミノ酸配列は、GenBank #Af178654（Ka）および#A
F178655（SF）中に示されるが、含まれない。BPIV3ゲノム中のN ORFの位置は、
それぞれのGenBank報告中に示され、そして本明細書中に参考文献として含まれ
る。以下の実施例において、N遺伝子が6種のHPIV3タンパク質およびBPIV3タンパ
ク質の中で中レベルの配列変異を有する遺伝子に相当するため、HPIV3ウィルス
中の対応する遺伝子の置換のために、KaまたはSFウィルスのN ORFをはじめに選
択した。この研究において、3'または5'の非コードN遺伝子配列ではなく、観察
されたcKaおよびcSFの弱毒表現型をN遺伝子によりコードされるタンパク質に対
して割り当てることを可能にするN ORFを置換した。
【０１８０】 そのHPIV3対応物について置換するものとして、HPIV3（+）センス（positive-
sense）アンチゲノムRNAの完全なコピーをコードするrJS cDNA p3/7（131）2G中
に、BPIV3 KaまたはSF Nコード領域を導入することにより、ヒト-ウシキメラ完
全長PIV3ゲノムを構築した（たとえば、Durbin et al., 1997a、上述；Hoffman
et al., 1997、上述；Skiadopoulos et al., 1998、上述；1998年5月22日出願の
米国特許出願シリアル番号No. 09/083,793；1997年5月23日に出願の米国仮出願N
o. 60/047,575（国際出願No. WO 98/53078に対応）；そして1997年9月19日に出
願の米国仮出願No. 60/059,385を参照；それぞれは参考文献として本明細書中に
援用される）。隣接する配列を有するBPIV3およびHPIV3 Nコード領域は、まずサ
ブクローニングされそしてさらに修飾されて、ちょうどN ORFの置換を可能にし
た。HPIV3 N遺伝子を有するpUC119JSN、およびBPIV3 N KaまたはSF遺伝子を有す
るプラスミド（pBSKaNおよびpBSSFN）を、Kunkel（Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:488-492, 1985、本明細書中に参考文献として援用する）の方法を使用して
変異生成に供し、NcolおよびAflII制限酵素認識部位を翻訳開始部位および翻訳
停止部位にそれぞれ導入した（図1A）。pUC119KaN-Ncol/AflIIのNcol/AflII消化
の後、HPIV3 Nコード領域を置換するものとして、BPIV3 Nコード領域をpUC119JS
N-Ncol/AflII中にNcol/AflIII断片として導入した（図1B）。HPIV3 3'および5'
非コード配列およびBPIV3 ORFを含有するキメラN遺伝子を、部位特異的変異生成
により修飾し、もとのHPIV3非コード配列およびBPIV3コード配列を回復させた。
ついで、このキメラN遺伝子を、その対応する配列、HPIV3配列を置換する際に、
ヒト配列中に存在する現存するMIulおよびEcoRI部位を使用して、rJSアンチゲノ
ムの5'側半分、pLeft中に導入した（図2Aおよび2B）。それぞれの場合において
、SF N ORFについて、同時に並行して反応を行った。キメラpLeftプラスミドを
、その3'末端にデルタリボザイムとT7ターミネーターとが隣接するrJSアンチゲ
ノムの3'側半分を含有するpRightに由来するXhol/NgoMl断片と組み合わせた（図
2）。pB/HPIV3NKaまたはpB/HPIV3NSFと命名された得られたキメラPIV3プラスミ
ドには、N ORFがBPIV3 KaまたはSF Nタンパク質をコードする、完全長rJSアンチ
ゲノムが含まれた。
【０１８１】 2種の以前に記載されたサポートプラスミド、pTM（P no C）およびpTM（L）、
Lipofectace（Life Technologies, Gaithersburg, MD）とともに6-ウェルプレー
ト中でほぼコンフルエントまで増殖させ、そして以前に記載されたように（Durb
in et al., Virology 234:74-83, 1997b）バクテリオファージT7 RNAポリメラー
ゼ（MVA-T7）を発現する修飾ワクシニアウィルス組換え体に感染させたHEp-2細
胞中に、キメラアンチゲノムHPIV3/BPIV3 cDNAsをトランスフェクトした。アン
チゲノムプラスミドが十分なレベルのNタンパク質を発現したため、以前の研究
で使用されたNサポートプラスミドは排除した。培養物を、32℃で3.5日間維持し
、その後上清を回収し、LLC-MK2細胞中で継代（passage）し、そしてLLC-MK2細
胞中で3回プラーク精製した。トランスフェクションの結果得られたヒトPIV 3バ
ックグラウンドのゲノムまたはアンチゲノムおよびBPIV3 Nタンパク質を組み込
むキメラウィルス（rHPIV3-NBキメラ組換え体と命名、またはより具体的には、
“cKa”および“cSF”キメラウィルスと命名）の独自性を、3回プラーク精製し
たウィルスの増幅後に単離されたビリオンRNA由来のN ORF開始コドンおよび停止
コドンの領域を含有するRT-PCR産物をシークエンシングすることにより確認した
（図3）。この増幅産物および対応する増幅HPIV3 rJSおよびBPIV3 KaまたはSF配
列もまた、TaqI消化に供し、cKaおよびcSFウィルスのキメラ特性を確認した（図
4）。TaqI消化プロファイルは、3種の親ウィルスおよび2種のキメラウィルスに
独特のものであり、そしてそれぞれの親プロファイルには独自サイズのTaqI断片
が含まれ、分類すべきキメラウィルスに対して、rJS、KaおよびSF親ウィルスの
配列が寄与することを可能にする。回収されたcKaおよびcSFキメラ組換え体はそ
れぞれ、設計されたように予想された配列を含有した。
【０１８２】 実施例II 細胞培養中でのHPIV3/BPIV3キメラウィルスの複製 生弱毒ウィルスワクチンの組織培養細胞中での効率的な複製は、組換えワクチ
ン材料を効率的に製造することを可能にする、本発明のヒト-ウシキメラPIVの特
徴である。以前に記載されているように（Tao et al., 1998、上述、本明細書中
に参考文献として援用する）、ウィルスを感染多重度0.01で細胞に感染させ、そ
してサンプルを5日間の期間後に（トリプリケートで）回収することにより、ウ
シ細胞株（MDBK）中およびサル細胞株（LLC-MK2）中でのrJS親、cKa、Ka親、cSF
、およびSF親の複数サイクルの複製を調べた（図5）。複製がそれほど遅れるこ
となく、あるいは得られたウィルス力価がそれほど減少することなく、それらの
ヒトまたはウシ親ウィルスと同様に両方の細胞株中で、キメラウィルスは効率的
に複製した。それぞれのケースにおいて、キメラウィルスは107.0 TCID50/ml以
上で複製し、これはヒトの臨床試験で現在使用されている生弱毒ヒトあるいはウ
シPIVワクチンの用量である104.0あるいは105.0を十分に上回っている（Karron
et al., 1996、上述；Karron et al., 1995a、上述；およびKarron et al., 199
5b、上述）。
【０１８３】 実施例III アカゲザルにおけるHPIV3/BPIV3キメラウィルスの弱毒化および保護効率の評
価 SFおよびKa BPIV3の両方を、アカゲザルの上部および下部気道に対して弱毒化
する（van Wyke Coelingh et al., 1988、上述）。完全に感受性の血清反応陰性
の幼児および子供の上部気道において、Kaの複製が非常に制限されるという事実
により示されるように、この弱毒表現型は、ヒトにおける弱毒化と相関する（Ka
rron et al., 1995a、上述）。BPIV3-感染ワクチンにおいて、咳、クルップ（cr
oup）、細気管支炎、または肺炎がないことから、Ka BPIV3ウィルスは下部気道
についても弱毒化されることが示唆される。したがって、アカゲザルは、候補PI
Vワクチンウィルスの弱毒化および野生型PIVによるチャレンジに対するその効率
を評価するための合理的な相関モデルとして広く受け入れられている。
【０１８４】 rJS、cKa、Ka親、cSF、およびSF親を、アカゲザルに対して部位あたり105.0 T
CID50の用量で、鼻内および気管内に投与した。上部気道（鼻咽頭スワブ検体）
および下部気道（気管洗浄検体）からサンプルを得るために、そしてLLC-MK2細
胞中でのウィルスの力価を測定するために、以前に記載された方法を使用して複
製をモニターした（Hall et al., 1992、上述）。cKaおよびcSF組換え体は、上
部気道について顕著に弱毒化され（表1）、平均ピークウィルス力価が、rJS HPI
V3親のそれと比較して、それぞれ63倍または32倍減少したことを示している。cK
aおよびcSFの両方とも、下部気道についても弱毒化されたが、この差は、cSFに
ついてのみ統計的に有意であった。この部位での弱毒表現型により、下部気道に
おける低レベルのrJSの複製は、統計的に有意な様式で、さらに複製が制限され
ることを示すことは困難であった。
【０１８５】 表1： cKaおよびcSFの複製は、HPIV3と比較して、アカゲザルの上部気道およ
び下部気道において制限される
【０１８６】
【表１】
【０１８７】1 各部位につき、サルに鼻内および気管内で1 ml中105.0TCID50を予防接種した。 2 それぞれのカラムの平均ウィルス力価は、Duncanの複数範囲試験（α＝0.05）
を使用して、統計的に同様の群（文字で示した）に割り振った。別々の文字を当
てたそれぞれのカラムの平均力価は、統計的に異なっている。
【０１８８】 それぞれのキメラウィルス、cKaおよびcSFの複製のレベルは、キメラウィルス
のそれぞれが上部気道においてそれらのBPIV3親よりもいくらかよく複製したが
、上部気道または下部気道におけるそのウシ親とはそれほど異ならなかった。こ
のように、rJS HPIV3によるKaまたはSF BPIV3のいずれかのN遺伝子の獲得は、ア
カゲザルに対するヒトウィルスを、ほぼBPIV親のレベルと同等のレベルまで弱毒
化した。HPIV3/BPIV3キメラ組換え体がin vitroの組織培養細胞において効率的
に複製したため、2種のウシ親ウィルスにより証明された宿主範囲限定的複製の
表現型が、N ORFによりHPIV3に対して移植されたことは明らかである。rJSにお
いて、そのHPIV3対応物の代わりにその他のBPIV3遺伝子、たとえばM、P、または
Lを用いることにより、HPIV3 N遺伝子の代わりにBPIV3 N遺伝子を用いた場合に
観察されたように、同様のまたはそれ以上のレベルの弱毒化が得られるであろう
ということは、可能であるが、しかし知られておらずそして予測できないことで
ある。上部気道において、cKaおよびcSFの複製レベルがそれらのBPIV3親の複製
レベルよりも若干上であるという観察から、この部位において、さらなるウシ遺
伝子がBPIV3親ウィルスの宿主範囲弱毒表現型に寄与していることが示唆される
。
【０１８９】 予防接種していないサルおよび以前にヒトまたはウシPIV3親ウィルスに感染し
た、またはcKaまたはcSFキメラウィルスに感染したサルを、それぞれの部位につ
き1 mlの接種物で、rJSの106.0 TCID50を鼻内および気管内により初回接種した
後、42日間チャレンジした。表2に示した日数で、鼻咽腔および気管を以前に記
載したようにサンプリングした。それぞれの部位に存在するウィルス力価を、そ
れぞれのサルにつきLLC-MK2細胞単層培養物上で測定し、そして示された力価が
平均ピーク力価である（Hall et al., 1992、上述）。いずれかのキメラウィル
スにより以前の感染により、rJSチャレンジウィルスの複製に対する高レベルの
抵抗性が、上部気道および下部気道の両方において誘導された。cKaを以前に感
染させたサルでは、予防接種していない対照サルと比較して、上部気道において
野生型HPIV3（rJS）の複製が300倍減少しおよび下部気道において1000倍減少す
ることが証明された。cSFを以前に感染させたサルでは、予防接種していない対
照サルと比較して、上部気道においてrJSの複製が2000倍減少し、そして下部気
道において1000倍減少することが証明された。以前にcKaまたはcSFを接種したサ
ルにおける、rJSチャレンジウィルスの複製の減少レベルは、以前にウシまたは
ヒトPIV親のいずれかに感染させたサルのレベルと匹敵した。このように、HPIV3
/BPIV3キメラウィルスのいずれかによる感染により、サルの上部気道および下部
気道において高レベルの防御が提供され、そして両方のキメラウィルス有望なワ
クチン候補であることが示される。
【０１９０】 第0日および第28日にサルから回収された血清を、HPIV3（JS系統）およびBPIV
3（Ka系統）を以前に記載されたように抗原として使用する（Coelingh et al.,
J. Infect. Dis. 157:655-662, 1988）、HAIアッセイにより試験した。cKa-Nお
よびcSF-Nは、アカゲザルの上部気道および下部気道において、rJSに比べて高度
に弱毒化されたが、それぞれのキメラウィルスは、そのそれぞれのBPIV3親によ
り免疫化することにより誘導されるものよりも、2.5〜5倍高い、HPIV3に対する
血球凝集-阻害（HAI）抗体反応を引き起こした。このことは、HPIV3 HNタンパク
質がキメラウィルス中に存在することによる様である。さらに、キメラウィルス
により誘導されるHPIV3特異的HAI反応は、rjSによる免疫化により誘導されるも
のと、統計的に区別することができた。本明細書ch宇電子召されるさらなる予期
せぬ結果は、HPIV3によるサルのチャレンジの後、cKa-NまたはcSF-Nにより最初
に免疫化されたサルにおけるHAI抗体のレベルは、rJS、KaまたはSFにより免疫化
された動物において観察されるレベルよりも顕著に高かった。
【０１９１】 実施例IV 異種融合糖タンパク質および血球凝集素-ノイラミニダーゼ糖タンパク質を有
するキメラHPIV3BPIV3ワクチン候補物の構築および特性決定 前述の実施例において、Nオープンリーディングフレーム（ORF）をそのBPIV3
対応物のものにより置換した組換えヒトPIV3（rHPIV3）を生成しそして特性決定
することにより、霊長類の気道に対するBPIV3の複製の宿主範囲制限の基礎を調
べた。得られたキメラウィルス、rHPIV3-NB、は、cKaまたはcSFとも呼ばれるが
、in vitroで効率よく複製するものの、しかしアカゲザルの上部気道において複
製が制限され、アカゲザルにおけるBPIV3の宿主範囲制限の重要な決定因子とし
てのNタンパク質が同定された（Bailly et al., J. Virol. 74:3188-3195, 2000
）。
【０１９２】 本実施例において、ウシパラインフルエンザウィルス3型（BPIV3）の融合（F
）および血球凝集素-ノイラミニダーゼ（HN）糖タンパク質遺伝子の、非ヒト霊
長類の気道におけるその限定的な複製に対する寄与を、2種の相反する（recipro
cal）キメラBPIV3/HPIV3ウィルスを生成しそして特性決定することにより調べた
。異種BPIV3 FおよびHN糖タンパク質遺伝子を、それら自体の代わりに含有する
キメラHPIV3、およびHPIV3 FおよびHN遺伝子を保持するBPIV3“バックボーン”
を含む相反する（reciprocal）組換え体を、対応物BPIV3糖タンパク質遺伝子と
置換したものを生成して、糖タンパク質置換の、アカゲザルの上部気道および下
部気道におけるHPIV3およびBPIV3の複製に対する作用を評価した。このように、
一つのキメラウィルスにおいて、HPIV3のFおよびHN遺伝子を、そのBPIV3対応物
により置換し、結果としてrHPIV3-FBHNBキメラ組換え体を得た。相反するキメラ
組換えPIV3（rBPIV3-FHHNH）を、組換えBPIV3（rBPIV3）のFおよびHN遺伝子を、
それらのHPIV3対応物により置換することにより構築した。後者のウィルスにお
いて、BPIV3バックボーン中へのHPIV3 FおよびHN ORFの導入は、HPIV3の抗原認
識部位とBPIV3のバックボーンとを組み合わせ、そしてそれにより親BPIV3と比較
して改良したワクチン候補物を提供する。完全な機能的活性のための、パライン
フルエンザウィルスに対する相同なHNおよびFタンパク質の提示された要求性の
観点において、FおよびHN遺伝子をついにして交換した（Deng et al., Virology
209:457-469, 1995；およびTanabayashi et al., J. Virol. 70:6112-6118, 19
96；それぞれを、本明細書中に参考文献として援用する）。
【０１９３】 前述したキメラウィルスが、サルLLC-MK2細胞において、それらの親ウィルス
のものと匹敵する複製の動態が容易に得られそして示されたことから、異種糖タ
ンパク質がPIV3内部タンパク質と両立することが示唆された。BPIV3対HPIV3の細
胞病理学の特有の特徴は、それらのそれぞれのFおよびHN遺伝子とともに共分離
された。BPIV3 FおよびHN遺伝子を保持するHPIV3は、アカゲザルにおける複製に
ついてそのBPIV3親ウィルスのレベルと同様のレベルまで弱毒化され、これによ
りBPIV3の糖タンパク質遺伝子がアカゲザルにおける複製のその宿主範囲制限の
主要な決定因子であることが示される。HPIV3 FおよびHN遺伝子を保持するBPIV3
（rBPIV3-FHHNH）は、アカゲザルにおいてHPIV3およびBPIV3のレベルの中間レベ
ルで複製された。
【０１９４】 これらの結果から、FおよびHN遺伝子がBPIV3の全体的な弱毒化に対して重要な
寄与をすることが示される。さらに、これらの結果から、FおよびHN領域の外側
のBPIV3配列もまた、霊長類における弱毒表現型に寄与していることが示される
。この後者の知見は、BPIV3の核タンパク質コード配列が霊長類に対するその弱
毒化の決定因子であるという前述の実施例における知見と一致している。アカゲ
ザルの気道におけるその限定的な複製にもかかわらず、rBPIV3-FHHNHは、野生型
HPIV3によるチャレンジに対するあるレベルの防御を付与し、これは野生型HPIV3
による以前の感染により付与された防御と区別することができた。これらのそし
て関連する知見から、rBPIV3-FHHNHのHPIV3に対するワクチン候補物としての有
用性は、すぐに明らかなものである。
【０１９５】 ウィルスおよび細胞 HEp-2およびサルLLC-MK2単層細胞培養を、5％ウシ胎児血清（Summit Biotechn
ology, Ft. Collins, CO）、50 ug/mlの硫酸ゲンタマイシン、および4 mMグルタ
ミン（Life Technologies, Gaithersburg, MD）を添加したMEM培地（Life Techn
ologies, Gaithersburg, MD）中で維持した。
【０１９６】 野生型BPIV3系統カンザス/15626/84（クローン5-2-4, Lot BPI3-1）（BPIV3 K
a）、HPIV3 JS野生型、その組換え版（rHPIV3）、そしてBPIV3 Ka N ORFをHPIV3
-N ORFの代わりに含有するrHPIV3ウィルス（rHPIV3-NB）はそれぞれ、上述され
ている（Clements et al., 1991、上述；Karron et al., 1995a、上述；Bailly
et al., 2000、上述；そしてDurbin et al., 1997、上述；も参照）。PIVは、LL
C-MK2細胞（ATCC CCL-7）中32℃で、以前に記載された様に（Hall et al., 1992
、上述）増殖させた。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを発現する修飾し
たワクシニア系統アンカラ（MVA）組換えウィルスは、Wyattら（1995、上述）に
より記載されている。
【０１９７】 組換えBPIV3/HPIV3ウィルスをコードするアンチゲノムcDNAの構築 a）rBPIV3を回収するためのcDNAの構築 BPIV3 Kaの完全な15456ヌクレオチド（nt）アンチゲノムRNAをコードする完全
長cDNAを、上述したように構築した。Superscript II Pre-amplification Syste
m（Life Technologies, Gaithersburg, MD）を使用するウィルスRNAの逆転写（R
T）、およびHigh Fidelity PCRキット（Clontech Laboratories, Palo Alto, CA
）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅に由来する4つのサブクローンか
ら、cDNAを組み立てた。RT-PCR産物を、修飾pUC 19プラスミド（New England Bi
olabs, Beverly, MA）中に、以下の天然内部制限酵素認識部位を使用して、クロ
ーニングした：Sma I（BPIV3 Ka配列位置nt186）、Pst I（nt 2896）、Mlu I（n
t 6192）、Sac II（nt 10452）およびBsp LUI I（nt 15412）。Multiple subclo
nes of the アンチゲノムcDNAの複数のサブクローンを、dRhodamine Terminator
Cycle Sequencing（Perkin Elmer Applied Biosystems, Warrington, UK）によ
るPerkin Elmer ABI 310シークエンサーを使用してシークエンシングし、そして
BPIV3 Kaのコンセンサス配列とマッチするもののみを、完全長クローンを組み立
てるために使用した。BPIV3 Kaの3'および5'末端をクローニングし、そして完全
長cDNAの組み立てを前述したp（Right）ベクター中で行い（Durbin et al., 199
7、上述）、Xho I、Sma I、Mdu I、Sac II、Eco RI、Hind IIIおよびRsrIIに対
する制限酵素認識部位を有する新規ポリリンカーを含有する様にこれを修飾した
。完全長cDNAクローンpBPIV3（184）は、以下の要素を3'から5'へ順番に含有す
る：T7プロモーター、2つの非ウィルス性グアノシン残基、BPIV3 Kaの完全なア
ンチゲノム配列、肝炎デルタウィルスリボザイム、そしてT7ポリメラーゼ転写タ
ーミネーター（Bailly et al., 2000、上述；そしてDurbin et al., 1997a、上
述）。
【０１９８】 b）rHPIV3-FBHNBおよびrBPIV3-FHHNHの構築 独自の制限酵素認識部位をBPIV3アンチゲノムcDNA中および以前に記載したHPI
V3アンチゲノムcDNA p3/7（131）2G（Durbin et al., 1997a、上述）中に導入し
て、BPIV3およびHPIV3 cDNAの間で、FおよびHN遺伝子野置換を容易にした。Clon
tech（Clontech Laboratories, Palo Alto, CA）から入手したトランスフォーマ
ー部位特異的変異生成プロトコルを使用して、SgrAI制限酵素部位をM遺伝子の非
コード領域の下流、rBPIV3配列の位置4811とrHPIV3 JS配列の位置4835（GenBank
受託# Z11575）に導入した。制限酵素認識部位の位置に付与されたヌクレオチド
番号は、制限酵素認識部位の最初のヌクレオチドではなく、酵素が切断した後の
ヌクレオチドを示す。配列を、rBPIV3においてはTCCAACATTGCA（SEQ. ID. NO. 2
）からTCCACCGGTGCA（SEQ. ID. NO. 3）へ、rHPIV3においてはCGGACGTATCTA（SE
Q. ID. NO. 4）からCGCACCGGTGTA（SEQ. ID. NO. 5）へ置換した（認識部位には
下線を引いた）。BsiWI制限酵素部位を、HN遺伝子の非コード領域の下流、rBPIV
3配列のnt 8595およびrHPIV3 JS配列のnt 8601に導入した。配列を、rBPIV3にお
いてはGATATAAAGA（SEQ. ID. NO. 6）からGACGTACGGA（SEQ. ID. NO. 7）へと置
換してpBPIVs（107）を得て、そしてrHPIV3においてはGACAAAAGGG（SEQ. ID. NO
. 8）からGACGTACGGG（SEQ. ID. NO. 9）へと置換してpHPIVs（l06）を得た。F
およびHN遺伝子を、それぞれをSgrAIおよびBsiWIにより消化し、断片をゲル精製
し、そして適切な断片を2種の完全長cDNAに組み立てることにより、pBPIVs（107
）およびpHPIV3s（106）との間で置換した。BPIV3 FおよびHN遺伝子を保持するH
PIV3バックボーン、pHPIV（215）と呼ばれる、は、ウィルス配列の15480 ntをコ
ードし、そのnt 4835〜nt 8619はBPIV3に由来し、そしてそれはrHPIV3-FBHNBを
導くために使用された（図8A-8C）。HPIV3 FおよびHN遺伝子を保持するBPIV3バ
ックボーン、pBPIV（215）と呼ばれる、は、ウィルス配列の15438 ntをコードし
、そのnt 4811〜nt 8577はHPIV3に由来し、そしてそれはrBPIV3-FHHNHを導くた
めに使用された（図8A-8C）。
【０１９９】 cDNA由来のウィルスの回収のためのBPIV3サポートプラスミド BPIV3 Ka N、PおよびL遺伝子をコードするサポートプラスミドを、修飾pUC 19
ベクター中に組み込み、ついで以前に記載したpTM-1ベクター中にクローニング
した（Durbin et al., 1997a、上述）。個々の遺伝子をpTMベクター中のT7プロ
モーターのすぐ下流に位置づけるため、部位特異的変異生成を用いて、N、Pおよ
びLオープンリーディングフレーム（ORFs）の開始コドンにNco I部位を導入した
。Nco I制限酵素部位およびそれぞれのORFの下流の天然に存在する制限酵素部位
（NについてのSpe I、PについてのHinclI、そしてLについてのBsp LUI II）を、
pTM中へのクローニングのために使用した。クローニングの後、pTM（N）中のNco
I部位に変異生成させて、もとの配列に戻し、2番目のコドンにおける正確なア
ミノ酸の割り当てを回復した。pTM（P）およびpTM（L）において、ORFによりコ
ードされるアミノ酸配列は、Nco I部位の導入により変化しなかった。
【０２００】 トランスフェクション HEp-2細胞（6ウェルプレートのウェル当たり、約1.5×106細胞）を、90％コン
フルエントになるまで増殖させ、そしてそれぞれ0.2μgのBPIV3サポートプラス
ミドpTM（N）およびpTM（P）、および0.1μgのpTM（L）により、5μgの完全長ア
ンチゲノムcDNAおよび12μl LipofectACE（Life Technologies, Gaithersburg,
MD）とともにトランスフェクトした。それぞれのトランスフェクション混合物も
また、以前に記載したように、1.5×107プラーク形成単位（PFU）のMVA-T7を含
有した（Durbin et al., 1997、上述）。培養液を10％ウシ胎児血清を含有するM
EM（Life Technologies, Gaithersburg, MD）により置換するまで、培養物を32
℃にて12時間、インキュベートした。32℃でさらに3日間インキュベートした後
上清を回収し、そして25 cm2フラスコ中LLC-MK2細胞単層上で継代しし、そして3
2℃で5日間インキュベートした。上清中に存在するウィルスを3回プラーク精製
した後増幅しそして特性決定した。
【０２０１】 回収されたキメラ組換え体の分子的特性決定 rBPIV3およびrHPIV3中で保存された配列を認識するプライマー対を使用して行
った感染細胞または上清から単離したウィルスRNAのRT-PCRにより、ウシまたは
ヒトPIV3バックボーン中の異種FおよびHN遺伝子の存在を、プラーク精製された
組換えウィルスにおいて確認した。この結果、同様のサイズの断片（rBPIV3にお
いてはnt 4206-9035、rHPIV3においてはnt 4224-9041、rBPIV3-FHHNHにおいては
nt 4206-9017、そしてrHPIV3-FBHNBにおいてはnt 4224-9059）が得られ、これら
を次いでEco RIにより消化して、そして1％アガロースゲル状での電気泳動によ
り解析した（図9）。それぞれのウィルス中の導入されたSgrAIおよびBsiWI制限
酵素部位に隣接するヌクレオチド配列を、それぞれのRT-PCR産物をシークエンシ
ングすることにより確認した。
【０２０２】 細胞培養におけるHPIV3/BPIV3キメラウィルスの複製 感染多重度（MOI）0.01でトリプリケートで感染させ、そして24時間ごとに6日
間、以前に記載されたようにサンプルを回収することにより（Tao et al., 1998
、上述）、LLC-MK2細胞におけるBPIV3 Ka、rHPIV3-FBHNB、rBPIV3-FHHNH、rHPIV
3-NBおよびrHPIV3の複数サイクルの増殖動態を調べた。サンプルを瞬間冷凍し、
そして96ウェルプレート中LLC-MK2細胞単層上での、32℃での1回のアッセイにお
いて、以前に記載したように力価を測定した（Durbin et al.,Virology 261:319
-330, 1999b、本明細書中に参考文献として援用する）。
【０２０３】 霊長類モデル研究 血球凝集-阻害（HAI）アッセイ（van Wyke Coelingh et al., 1988、上述）に
より測定した場合にPIV3に対して血清反応陰性であるアカゲザルに、2または4匹
の動物の群で、BPIV3 Ka、rHPIV3-FBHNB、rBPIV3-FHHNH、rHPIV3-NBまたはrHPIV
3のmlあたり105の組織培養感染性用量50（TCID50）で、鼻内および気管内の予防
接種をした。鼻咽頭スワブを第1〜11日および第13日に毎日回収した。気管洗浄
サンプルを、感染後第2、4、6、8、および10日に回収した。個々のサンプルを瞬
間冷凍し、そして全てのサンプルが力価測定に利用可能になるまで-70℃で保存
した。検体中のウィルスを、24および96ウェルプレート中LLC-MK2細胞単層上で
、以前に記載されたように、力価測定した（Durbin et al., 1999b、上述）。第
0日および第28日にサルから回収された血清を、HPIV3 JSおよびBPIV3 Kaを抗原
として使用するHAIアッセイにより、以前に記載されたように試験した（van Wyk
e Coelingh et al., 1988、上述）。接種後第28日目に、サルに、部位あたり106 TCID50のHPIV3 JSにより、鼻内および気管内をチャレンジした。鼻咽頭スワブ
サンプルを第3、4、5、6、7および8日に回収し、そして気管洗浄サンプルをチャ
レンジ後第4、6および8日に回収した。上述したように、1回のアッセイにおいて
サンプルの力価を測定した。血清をチャレンジ後第28日に回収した。
【０２０４】 cDNAからのrBPIV3およびBPIV3/HPIV3キメラウィルス（rHPIV3-FBHNBおよびrBP
IV3-FHHNH）の回復 完全なBPIV3アンチゲノムcDNA、pBPIV（184）と呼ばれる、を、BPIV3 Kaのコ
ンセンサス配列をコードする様に構築した。このBPIV3アンチゲノムcDNAを、独
自のSgrAIおよびBsiWI部位を、それぞれMおよびHN遺伝子の非コード領域の下流
中に導入することにより、さらに修飾した（図8C）。同一の制限酵素部位を、以
前に記載した完全なHPIV3アンチゲノムcDNA、p3/7（131）2G（Durbin et al., 1
997a、上述）のMおよびHN遺伝子の非コード領域の下流に導入した。HPIV3および
BPIV3のFおよびHN糖タンパク質遺伝子を、このSgrAI-BsiWI制限酵素断片を置換
することにより交換した。遺伝子全体の直接的な交換は、BPIV3およびHPIV3のシ
ス-活性化シグナル間での高レベルの配列保存性のために、十分に許容されるも
のと予想された。BPIV3 FおよびHN遺伝子を保持するHPIV3アンチゲノムcDNAは、
pHPIV（215）と呼ばれ、そしてHPIV3 FおよびHN遺伝子を保持するBPIV3アンチゲ
ノムcDNAはpBPIV（215）と呼ばれる。
【０２０５】 アンチゲノムcDNA、pBPIV（184）、pHPIV（215）、pBPIV（215）およびp3/7（
131）2Gを、HEp-2細胞中に、3種のBPIV3サポートプラスミド、pTM（N）、pTM（P
）およびpTM（L）とともに別々にトランスフェクトし、そして細胞をT7 RNAポリ
メラーゼを発現する組換えMVAにより同時に感染させた。回収されたウィルスが
実際に予想されたrBPIV3、rHPIV3-FBHNB、rBPIV3-FHHNHおよびrHPIV3ウィルスで
あることを確認するため、HPIV3 JSおよびBPIV3 Kaにおける同一の配列を認識す
るプライマー対を使用するRT-PCRにより、細胞内RNAまたはそれぞれのクローン
化ウィルス由来の上清から得たRNAを解析した。プライマー対は、M遺伝子、Fお
よびHN遺伝子の下流末端、およびL遺伝子の上流末端に対応するDNAの4.8 kbの断
片（rBPIV3においてはnt 4206-9035、rHPIV3においてはnt 4224-9041、rBPIV3-F H HNHにおいてはnt 4206-9017、そしてrHPIV3-FBHNBにおいてはnt 4224-9059）を
増幅した。それぞれのPCR産物の精製は、逆転写酵素の含有量に依存し、このこ
とから、それぞれはウィルスRNAに由来し、コンタミネーションしたcDNAに由来
するものではないことが示される（データは示していない）。PCR産物をEco RI
により消化し、それにより4種のウィルスのそれぞれについて、別個の、独自の
制限酵素消化パターンを得られることが予想された（図9）。それぞれのケース
において、予想されるパターンを観察し、バックボーンの同一性および挿入され
たFおよびHN遺伝子の同一性を確認した。さらに、ヌクレオチドシークエンシン
グをRT-PCR産物に対して行い、導入された制限酵素部位および隣接する配列の存
在を確認した。
【０２０６】 LLC-MK2細胞においてrBPIV3-FHHNHにより引き起こされた細胞変性作用（cytop
athic effect；CPE）は、HPIV3 JSのもの（凝縮し、球状化した細胞および小型
のシンシチウム）とは区別することができないが、しかしBPIV3のもの（大型の
多核シンシチウム）とは異なっており、一方でrHPIV3-FBHNBにより引き起こされ
たCPEは、BPIV3により引き起こされたものと同一である。このことは、キメラPI
Vの細胞病理が、FおよびHN遺伝子の起源である親により共分離されることを示す
。
【０２０７】 BPIV3/HPIV3キメラウィルス細胞培養において効率的に複製する rHPIV3-FBHNBおよびrBPIV3-FHHNHの増殖動態を、LLC-MK2単層に0.01のMOIで感
染させ、そして感染性ウィルスの産生をモニターすることにより、それらの親ウ
ィルスの動態と比較した。2種のキメラウィルスの複製の動態および程度は、そ
れらのHPIV3またはBPIV3親ウィルスのものと匹敵した（図10）。このことは、BP
IV3およびHPIV3糖タンパク質が、異種PIV3内部タンパク質と矛盾しないことを示
唆している。これは、効率的にワクチンウィルスを産生することを可能にしうる
ため、重要な特性である。
【０２０８】 BPIV3/HPIV3キメラウィルスのFおよびHN遺伝子は、アカゲザルの気道における
BPIV3 Kaの複製の宿主範囲制限の決定因子である rHPIV3-FBHNBおよびrBPIV3-FHHNHを、それらのアカゲザルの上部気道および下
部気道における複製能力について評価した。特に、BPIV3 Nタンパク質に対して
上述したように、HPIV3中へのBPIV3 FおよびHN遺伝子の導入の、アカゲザルにお
ける複製の弱毒化に対する効果を示した（Bailly et al., 2000、上述も参照）
。さらに、BPIV3中へのHPIV3 FおよびHN遺伝子の導入の、アカゲザルにおける複
製に対する効果を測定した。BPIV3の優勢な弱毒変異がFおよびHNではなくHN遺伝
子である場合、HPIV3-BPIV3糖タンパク質置換の、アカゲザルにおけるBPIV3の複
製に対する全体的な効果を多少予想することができる。
【０２０９】 それぞれのキメラウィルスを、部位あたり105 TCID50の用量で、アカゲザルに
対して鼻内および気管内に投与した。キメラウィルスの複製のレベルは、rHPIV3
およびBPIV3親ウィルスのレベルおよびrHPIV3-NBのレベルと比較した（表3）。r
HPIV3親ウィルスは、下部気道においては低いレベルから適度なレベルで複製す
るため、群どうしの意味のある比較は、上部気道における複製についてのみ行う
ことができる。rHPIV3-FBHNBの複製のレベルは、そのBPIV3親のレベルと同様で
あり、そしてそのHPIV3親のレベルよりは実質的に低い（表3；図11、パネルA）
。このことから、BPIV3糖タンパク質遺伝子には、アカゲザルに対するBPIV3の宿
主範囲弱毒表現型の、1またはそれ以上の主要な決定因子が含まれることが示さ
れた。rHPIV3-FBHNBおよびrHPIV3-NBの複製の程度およびパターンは非常に類似
しており、このことから2種のウシ遺伝的要素、すなわちN遺伝子対FおよびHN遺
伝子、のぞれぞれが同様な程度でHPIV3を弱毒化することが示される。
【０２１０】 表3：BPIV3のFおよびHN糖タンパク質遺伝子は、アカゲザルの呼吸気道におい
てその制限的な複製に寄与する
【０２１１】
【表２】
【０２１２】1 各部位につき、サルに鼻内および気管内で1 mlの接種物中105.0TCID50を予防接
種した。2 6匹の動物を含む群は、以前のアカゲザルの研究に由来する4匹の動物を含む（B
ailly et al., 2000、上述）。3 そのグループ内のそれぞれの動物に対する平均ウィルス力価の平均は、サンプ
リング日によらない。S.E.＝標準誤差4 ウィルス力価測定は、32℃にてLLC-MK2細胞上で行った。ウィルス力価の検出限
界は、10 TCID50/mlであった。平均ウィルス力価は、Duncanの複数範囲試験（α
＝0.05）を使用して、比較した。それぞれのカラム中において、別の文字を当て
た平均力価は、統計的に異なっている。2文字により示した力価は、それぞれの
文字により示した力価と有意には異ならない。5 鼻咽腔スワブサンプルは、day 1〜11およびday 13に回収した。6 気管洗浄サンプルは、感染後day 2、4、6、8、および10に回収した。7 day 0における力価は、＜2.0であった。day 28は、野生型HPIV3によるチャレン
ジの日である。 ** fHPIV3群の2匹の動物は、糖タンパク質交換のための2種の制限酵素認識部位
を含有するウィルスである、rHPIV3sにより感染させた。
【０２１３】 rBPIV3-FHHNHキメラウィルスは、rHPIV3よりも有意に低い程度で複製し（表3
）、そしてDuncanのマルチレンジ試験においてBPIV3と一緒にグループ化された
。しかしながら、図11Bにおけるその複製パターンを調べると、rBPIV3-FHHNHは
、そのHPIV3親およびBPIV3親のレベルの中間のレベルで複製することが示唆され
た。rBPIV3-FHHNHがその親のレベルの中間のレベルで複製するという説明は、ラ
ンクの一貫性（consistency of ranks）のFriedmanの試験によりサポートされ（
Sprent, P., “A Generalization Of The Sign Test,” Applied Nonparametric
Statistical Methods, pp. 123-126, Chapman and Hall, London, 1989, incor
porated herein by reference）、それにより感染後第3日および第8日の間のHPI
V3、rBPIV3-FHHNH、およびBPIV3の中央値力価が顕著に異なることを示した（d.f
.2,8；p<0.05）。HPIV3 FおよびHNタンパク質の導入の結果、アカゲザルにおい
てBPIV3の複製が増加した、という知見から、（i）FおよびHNが 宿主範囲制限の
1またはそれ以上の決定因子を含有すること、そして（ii）FおよびHN遺伝子の外
側に位置するBPIV3の1またはそれ以上の遺伝的要素、たとえばNタンパク質、が
アカゲザルに対するウィルスを弱毒化すること、が示される。このことは、宿主
範囲制限に対する遺伝的基礎には、複数の遺伝子が関与しうることを追認してい
る。
【０２１４】 HPIV3糖タンパク質遺伝子を保持するキメラBPIV3は、HPIV3に対する血清HAI抗
体を誘導し、そしてwt HPIV3チャレンジに対する高レベルの抵抗性を誘導する rBPIV3-FHHNHは、それをHPIV3に対する候補生弱毒ウィルスワクチンとする、B
PIV3由来の弱毒化遺伝子およびHPIV3の抗原特異性、すなわち、主要な防御抗原
であるFおよびHN糖タンパク質を含む、重要な特徴を有する。したがって、HPIV3
によるチャレンジに対するその免疫原性および防御効率を詳細に報告した。BPIV
3 Ka、rHPIV3-FBHNB、rBPIV3-FHHNH、rHPIV3-NB、またはrHPIV3による感染によ
り、アカゲザルを免疫化した。アカゲザルには28日後にHPIV3 JS野生型ウィルス
をチャレンジした。血清サンプルを採取し、その後第0日に最初の感染を行い、
そしてその後チャレンジを行った。BPIV3およびrHPIV3-FBHNBは、BPIV3とHPIV3
よりも効率的に反応する血清HAI抗体を誘導し、一方HPIV3およびrBPIV3-FHHNHの
場合には逆のことが起こった。このように、それぞれのウィルスにおける糖タン
パク質遺伝子の起源が、HAI抗体反応がHPIV3に対してあるいはBPIV3に対して優
性であるかを指向するかどうかを決定した。チャレンジしたHPIV3ウィルスの複
製は、以前に免疫化したサルの上部気道および下部気道において顕著に減少した
（表4）。HPIV3に対する防御的効率のレベルは、様々なウィルスの間でそれほど
異ならなかったが、HPIV3 FおよびHNを保持するウィルスは、BPIV3 FおよびHNを
保持するウィルスの場合よりも、上部気道において一貫してより防御的であった
。このことは、HPIV3 FおよびHNを保持するウィルスにより誘導されるより高レ
ベルのHPIV3-特異的血清HAI抗体にしたがっている。
【０２１５】 表4：BPIV3/HPIV3キメラ組換えウィルスによるアカゲザルの免疫化により、野
生型HPIV3によるチャレンジに対する抵抗性が誘導される
【０２１６】
【表３】
【０２１７】1 各部位につき、サルに鼻内および気管内で1 mlの接種物中105.0TCID50を予防接
種した。2 6匹の動物を含む群は、以前のアカゲザルの研究に由来する4匹の動物を含む（B
ailly et al., 2000、上述）。3 そのグループ内のそれぞれの動物に対する平均ウィルス力価の平均は、サンプ
リング日によらない。4 ウィルス力価測定は、LLC-MK2細胞上で行った。ウィルス力価の検出限界は、10
TCID50/mlであった。平均ウィルス力価は、Duncanの複数範囲試験（α＝0.05）
を使用して、比較した。それぞれのカラム中において、別の文字を当てた平均力
価は、統計的に異なっている。2文字により示した力価は、それぞれの文字によ
り示した力価と有意には異ならない。免疫化していない動物群は、チャレンジの
日においてDuncanの解析に含まれなかった。5 鼻咽腔スワブサンプルは、チャレンジ後day 3〜8に回収した。6 気管洗浄サンプルは、チャレンジ後day 4、6、および8に回収した。 ** rHPIV3群の2匹の動物は、rHPIV3sにより感染させた。
【０２１８】 前述した実施例に基づいて、本発明は、BPIV遺伝子の外来のものを毒性のHPIV
バックボーン中に提供し、そして逆に（visa versa）新規の、ヒト-ウシキメラP
IVワクチン候補物を得た。本実施例において検討される典型的なキメラ組換え体
の中で、rBPIV3-FHHNHおよびそのrHPIV3-FBHNB対応物およびそれぞれの親ウィル
スは、in vitroで複製した。かなり互いに異なるHPIV 1 FおよびHNタンパク質が
HPIV3バックグラウンドにおいて非常に機能的であり（Tao et al., J. Virol. 7
2:2955-2961, 1998）、in vitroでの複製についての弱毒化されていないキメラ
ウィルスの能力により証明されたため、BPIV3およびHPIV3の間でのFおよびHNの
置換は融和性のものであることも確認された。rBPIV3-FHHNHが、アカゲザルの上
部気道において、そのHPIV3およびBPIV3親の中間のレベルで複製したことから、
霊長類に対するBPIV3の全体的な弱毒化に対して、BPIV3 FおよびHN遺伝子は独立
した寄与をすることが示される。このように、BPIV3ウィルスの全体的な弱毒化
は、2またはそれ以上の遺伝的要素の合計であり、そのうちの一つはFおよびHN遺
伝子のセットであり、そして別の一つはNであることが示される。
【０２１９】 BPIV3それ自体はHPIV3に対するワクチンウィルスとして評価されているが（Ka
rron et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 15:650-654, 1996；そしてKarron et
al., J. Infect. Dis. 171:1107-1114, 1995）、it is only HPIV3に対する抗原
性にすれば25％しか関連していない（Coelingh et al., J. Infect. Dis. 157:6
55-662, 1988）。このように、BPIV3のHPIV3に対する抗原性は、HPIV3の防御的
なFおよびHN抗原を発現する様に本発明にしたがって修飾すれば、改善されるで
あろう。rBPIV3-FHHNHはそのようなウィルスを示し、そして本実施例において、
rBPIV3-FHHNHによるアカゲザルの免疫化により、BPIV3により免疫化した場合よ
りもHPIV3に対するより高レベルの抗体が誘導された。さらに、rBPIV3-FHHNHは
上部気道および下部気道におけるHPIV3チャレンジの複製に対して、一定レベル
の防御を付与したが、これはrHPIV3による以前の感染により付与されたものと統
計的には区別することができなかった。同様に、BPIV3 Nタンパク質により弱毒
化されるが、しかしHPIV3防御的抗原を有するrHPIV3-NBは、HPIV3チャレンジに
対する高レベルの抵抗性も誘導した。アカゲザルにおいて同様のレベルで複製す
るにもかかわらず、rHPIV3-NBは、rBPIV3-FHHNHよりもHPIV3に対してより高レベ
ルの抗体を誘導した。
【０２２０】 rBPIV3-FHHNHは、HPIV3と比較して顕著に弱毒化されるにもかかわらず、アカ
ゲザルにおいて、BPIV3よりも高レベルで複製する。ヒトにおけるBPIV3の複製の
レベルは低いため（Karron et al., J. Infect. Dis. 171:1107-1114, 1995）、
この上昇はワクチンの間で十分に許容されるものと予想される。あるいは、本発
明のヒト-ウシキメラウィルスを弱毒化する追加の方法を本明細書中に開示し、
たとえばヒト幼児において、ワクチンウィルスが適度なレベルでのみ複製し、ワ
クチンの中で許容できない気道疾患を防止することを確保する。本発明のその他
の観点において、霊長類におけるrBPIV3-FHHNHの複製の若干の増加により、異種
ウィルス抗原、たとえば他のPIV（たとえばHPIV 1およびHPIV2）の糖タンパク質
、RSV FおよびG糖タンパク質、そして麻疹HA糖タンパク質など、のためのベクタ
ーとして、rBPIV3-FHHNHを使用する機会が提供され、それを弱毒HPIV3ワクチン
候補物中に添加されたかまたは置換された1または複数の遺伝子または1または複
数のゲノム断片として組み込むことができる。本明細書中に開示される様々な別
の態様において、サルにおけるrBPIV3-FHHNHの複製の、BPIV3の複製に対する若
干の増加は、外来のウィルス防御的抗原、たとえばRSV糖タンパク質、の添加に
より相殺することができ、そのような追加により選択したレベルの弱毒化が提供
される。ここで示されたデータは、霊長類に対するBPIV3の宿主範囲制限のため
の基礎をさらに明らかにし、そしてrBPIV3-FHHNHを、HPIV3に対する潜在的なワ
クチン候補物としてそして異種ウィルス抗原に対するベクターとして、みなして
いる。
【０２２１】 微生物寄託情報 以下の材料は、ブダペスト条約の条件下でAmerican Type Culture Collection
（10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209）に寄託され
ており、そして以下の通り命名されている： プラスミド 受託番号 寄託日 p3/7（131） （ATCC 97990） 1997年4月18日 p3/7（131）2G （ATCC 97989） 1997年4月18日 p218（131） （ATCC 97991） 1997年4月18日。
【０２２２】 前述の発明は、理解を明確にする目的で実施例により詳細に記載したが、これ
らは説明のために提示したものであって限定的なものではなく、当業者であれば
一定の変更および修正が記載に含まれ、そして過度の実験を行うことなく、添附
の請求の範囲に記載の範囲内でそのような一定の変更および修正を実施すること
ができることは明らかであろう。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、HPIV3中へのウシPIV株KaまたはSFのNコード領域のクローニングを示す
。図1A〜Cでは、BPIV3 Nオープンリーディングフレーム（ORF）がそれに対応す
る全長rJSアンチゲノムcDNA中のHPIV3配列を置換する（Durbin et al., 1997a、
前掲）。BPIV3 KaおよびSF N遺伝子を、まず標準的分子生物学的手法を用いるTR
-PCRによりウイルス粒子RNAから増幅し、1.9kbフラグメントとしてpBluescript
中へサブクローニングして、それぞれpBS-KaNまたはpBS-SFNを得た。HPIV3 rJS
N遺伝子を1.9kb Mlul／EcoRIフラグメントとして、rJS HPIV3アンチゲノムの5'
側半分を含むプラスミドからpUC119中へサブクローニングして（Durbin et al.,
1997a、前掲；米国特許出願09／083,793：1998年5月22日出願；米国仮特許出願
60／047,575：1997年5月23日出願（WO98／53078に対応）；および米国仮特許出
願60／059,385：1997年9月19日出願；それぞれを本明細書に援用する）、pUC119
JSNを得た。各N遺伝子を部位特異的変異誘発により修飾して、それぞれ翻訳開始
部位および停止部位にNcolおよびAflII部位を挿入した。KaおよびSF N遺伝子は
、翻訳開始および停止部位領域が同一であり、従って図1Aに示すように両BPIV3
N遺伝子において同一の変異誘発反応が行われた。図1B--AflII／Ncol消化後、BP
IV3 Nコード領域を提示するpBS-KaNまたはpBS-SFN由来の1.5kbフラグメントを、
それのHPIV3カウンターパートに対する置換配列として、HPIV3 NサブクローンpU
C119JSN-Ncol／AflIIのNcol／AflIIウインドウに導入した。図1C--次いで各キメ
ラサブクローンを部位特異的変異誘発して、翻訳開始コドンの前または翻訳停止
コドンの後のHPIV3 rJS中に存在する配列、および翻訳開始コドンの直後かつ翻
訳停止コドンの前のBPIV3コード配列を再生した。これによりpUC119B／HKaNおよ
びpUC119B／HSFNが得られ、これらを用いて図2に示すようにBPIV3 N遺伝子をHPI
V3 cDNAクローンに移入した。 図1、パネルA
【化３】 図1、パネルC
【化４】
【図２】 図2は、HPIV3アンチゲノムcDNA中へのHPIV3／BPIV3（株KaまたはSF）キメラN
遺伝子の挿入を示す。図2Aにおいては、HPIV配列によりフランキングされたKaま
たはSFのBPIV3 N ORFをMlul／EcoRIフラグメントとして、pUC119B／HKaNまたはp
UC119B／HSFNからサブクローニングし、pLeft＋2Gに挿入した（Durbin et al.,
1997a、前掲）。pLeft＋2Gプラスミドは、HPIV3 rJSアンチゲノムのnt2〜7437（
ゲノムセンス）由来の5'側半分をT7プロモーターの後方に含む。T7プロモーター
とHPIV3配列の間に転写改善のために挿入した2つのG残基の位置を星印で示した
。図2B--肝炎デルタウイルスリボザイムおよびT7ターミネーターによりフランキ
ングされたHPIV3アンチゲノムの3'末端を含むpRightのXhoI／NgoMIフラグメント
（Durbin et al., 1997a、前掲；米国特許出願09／083,793：1998年5月22日出願
；米国仮特許出願60／047,575：1997年5月23日出願（WO98／53078に対応）；お
よび米国仮特許出願60／059,385：1997年9月19日出願；それぞれを本明細書に援
用する）を、修飾されたpLeftプラスミドのXhoI／NgoMIウインドウ中へクローニ
ングして、プラスミドpB／HPIV3KaNおよびpB／HPIV3SFNを得た。これらの各キメ
ラプラスミド構築体は、それのBPIV3 KaまたはSFカウンターパートで交換された
Nコード領域以外は、HPIV3アンチゲノムRNAの完全プラスセンス配列を含む。
【図３】 図3は、HPIV3、BPIV3および本発明のキメラウイルスの、N翻訳開始（A）およ
び停止（B）コドンの周囲のヌクレオチド配列を示す。各ORFの位置は各GenBank
レポート（BPIV3 Kaについては＃AF178654、BPIV3 SFについては＃AF178655、お
よび＃Z11515）に記載されており、これを本明細書に援用する。N遺伝子中の翻
訳開始（A）および停止（B）コドン（それぞれ下線）をフランキングする配列（
プラス-センス）を、親組換えHPIV3 JS（rJS）、生物由来の親BPIV3 KaおよびSF
ウイルス（KaおよびSF）、ならびにキメラcKaおよびcSFウイルスについて示す。
cKaおよびcSFウイルス配列中の宿主特異的残基、ならびにrJS中のそれらのカウ
ンターパート（開始コドンの前および翻訳停止コドンの後）およびSFまたはKa中
のそれらのカウンターパート（開始コドンから停止コドンまで、それらを含めて
）を太字で示す。プラーク精製したキメラウイルスをRT-PCRによりウイルス粒子
RNAから増幅させ、Taq Dye Deoxy Terminator Cycleキット（ABI、カリフォルニ
ア州フォスターシティー）により配列決定した。これにより、推定配列が各キメ
ラウイルス中に存在することが確認された。 図3A：rJS
【化５】 図3A：cKaおよびcSF
【化６】 図3A：KaおよびSF
【化７】 図3B：rJS
【化８】 図3B：cKaおよびcSF
【化９】 図3B：KaおよびSF
【化１０】
【図４】 図4は、本発明のBPIV3／HPIV3キメラウイルスの構造、およびウイルスRNAから
生成したRT-PCR生成物のTaqI消化による確認を詳細に示す。図4Aには、キメラcK
aおよびcSFウイルスのゲノムをHPIV3およびBPIV3親ウイルスのゲノムと対比して
模式的に（正確な縮尺率ではない）示す。KaおよびSF特異的領域を、それぞれ淡
い陰影と濃い陰影で示す。rJSゲノム上の矢印は、診断TaqI消化のためにキメラ
および親ウイルスのRT-PCR増幅に用いたプライマーの位置を表す。これらのプラ
イマーはHPIV3とBPIV3の間で保存された領域に対するものであり、したがってHP
IV3、BPIV3およびキメラBPIV3／HPIV3ウイルスの増幅に使用できる。図4Bには、
図4Aに示したプライマー対を用いてRNAから増幅した1898-bpのPCR生成物につい
て、TaqI消化の予想サイズを各ウイルスにつき示す。このPCR生成物を図4Bの最
上部に示し、N ORFを黒い四角で示す。各ウイルスにユニークであり、したがっ
てウイルス同定に役立つTaqIフラグメントを星印で示す。図4Cには、キメラcKa
（左）またはcSF（右）のPIV3 Nコード領域を含むPCR生成物のTaqIプロフィルを
示す。HPIV3およびBPIV3親ウイルスのプロフィルを両側に示す。ウイルス同一性
の診断となる特異なTaqIフラグメント、およびこれらに対応する（4B）で同定さ
れたものを星印で示す。DNAゲルバンドの長さの計算値（bp）を示した。
【図５】 図5は、MDBK（A）細胞またはLLC-MK2（B）細胞中における親およびキメラウイ
ルスの多サイクル増殖曲線を示す。6ウェルプレートのウェル（それぞれ9.6cm2
）内のウシMDBK（A）細胞またはサルLLC-MK2（B）細胞の単層に、それぞれ感染
多重度0.01で指示した親またはキメラウイルスを感染させた。各ウイルスについ
て3回の反復感染を行った。指示した時点で試料を採取し、-70℃に保存し、TCID 50 アッセイにより並行して力価測定した。各時点で3試料の平均値を用いて増殖
曲線を作成した。検出下限は101.5TCID50／mlであり、これを点線で示した。
【図６】 図6A〜6Gは、ウシPIV3 Ka株の完全プラスセンスヌクレオチド配列（SEQ ID NO
. 22）を示す。
【図７】 図7A〜7Gは、ウシPIV3 SF株の完全プラスセンスヌクレオチド配列（SEQ ID NO
. 23）を示す。
【図８】 図8Aは、キメラrHPIV3-FBHNBおよびrBPIV3-FHHNHウイルス、ならびにそれらの
親ウイルスrHPIV3 JSおよびBPIV3 Kaのゲノムを模式的に示す（正確な縮尺率で
はない）。rHPIV3とrBPIV3の間で、それぞれM遺伝子およびHN遺伝子末端配列の
前に導入したSgrAIおよびBsiWI部位を用いて単一制限フラグメント中においてF
およびHN遺伝子を交換した。 図8Bは、BPIV3 KaについてアンチゲノムcDNAの組立てを示す。BPIV3 Kaの完全
アンチゲノム配列（GenBank寄託番号AF178754）をコードする全長cDNAを構築し
た。このcDNAは、ウイルス（v）RNAの逆転写（RT）およびポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）増幅で得たサブクローンから組み立てられた。アンチゲノムの複数のサ
ブクローンを配列決定し、BPIV3 Kaのコンセンサス配列に適合するクローンのみ
を全長クローンの組立てに用いた。nt21および23は例外であり、公表された配列
とは異なるがウイルス集団に類似の頻度で現われた。 図8Cは、親およびキメラウシ-ヒトPIVゲノムの特色を説明する。キメラrHPIV3
-FBHNBおよびrBPIV3-FHHNHウイルス、ならびにそれらの親ウイルスrHPIV3 JSお
よびBPIV3 Kaのゲノムを模式的に示す（正確な縮尺率ではない）。2つのユニー
ク制限酵素認識部位SgrAIおよびBsiWIをそれぞれM遺伝子およびHN遺伝子の末端
付近に導入した。導入したこれらの制限部位をもつ組換えHPIV3およびBPIV3ウイ
ルスを、図8C2に示すようにrHPIV3sおよびrBPIV3sと表示した。rHPIV3 JSとrBPI
V3 Kaの間で糖タンパク質遺伝子を交換した。変異誘発したヌクレオチドを各cDN
A構築体の下に示し、各配列の第1ヌクレオチドの位置を記載した。導入したSgrA
IおよびBsiWI制限部位に下線を施し、HPIV3とBPIV3の間で異なり、したがって挿
入遺伝子の起源を同定するヌクレオチドを太字で表した。 図8C、パネル1
【化１１】 図8C、パネル1
【化１２】 図8C、パネル2
【化１３】 図8C、パネル2
【化１４】 図8C、パネル3
【化１５】 図8C、パネル3
【化１６】
【図９】 図9は、ウイルスRNAのRT-PCRおよびEcoRI消化による組換えウイルス同一性の
確認を示す。ウイルスRNAのRT-PCR生成物は、BPIV3およびHPIV3の両方のFおよび
HN遺伝子のいずれかの側の保存領域を認識するプライマー対を用いて調製された
。EcoRIで消化すると4ウイルスそれぞれに特異なパターンの制限フラグメントが
得られた。左側の模式図において、水平の線は増幅ウイルス配列を表し、垂直の
線はEcoRI部位を示す。各制限フラグメントの予想サイズを線の上方に示した。
各線の下方の数値は、BPIV3 Ka、HPIV JS（GenBank寄託番号＃AF178654およびZ1
1575）、または記載したキメラ誘導体のアンチゲノムRNA中におけるその配列の
位置に対応する。右側にはPCR生成物のEcoRI消化物の1％アガロースゲルを示し
、これにより親ウイルスとキメラウイルスの同一性が確認される。星印はサイズ
が類似するため同時に移動する2つの制限フラグメントを含有するゲルバンドを
表す。
【図１０】 図10は、サルLLC-MK2細胞におけるキメラおよび親ウイルスの多サイクル複製
を示す。3つのキメラウイルスrHPIV3-FBHNB、rBPIV3-FHHNHおよびrHPIV3-NB（cK
aとも呼ぶ）の多サイクル複製（装入接種物のMOIは0.01）を、それらの親BPIV3
KaおよびrHPIV3の複製と比較する。ウイルス力価を3試料の平均log10TCID50／ml
±標準誤差として示す。このアッセイの検出下限は10 TCID50であり、これを水
平の点線で示した。
【図１１】 図11は、感染したアカゲザルの鼻咽頭スワブ中のキメラおよび親ウイルスの平
均力価を感染期間にわたって表す。同一ウイルスに感染した4または6匹のサルの
群について、ウイルス力価をLLC-MK2細胞における3試料の平均TCID50／ml±標準
誤差として示す。これは表3に示したものと同一実験を説明する。パネルAではrH
PIV3-FBHNBの平均力価をrHPIV3およびBPIV3 Kaの力価と比較する。パネルBではr
BPIV3-FHHNHの平均力価をBPIV3 KaおよびrHPIV3の力価と比較する；後2ウイルス
については力価はパネルAのものと同一であるが、比較しやすくするために別個
に提示した。5日目の力価を図から除いたのは、それらが4および6日目の力価よ
りはるかに低かったからである。これは試料採取に際しての技術的問題によると
思われる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 スキアドポウロス，マリオ・エイチ アメリカ合衆国メリーランド州20854，ポ トマック，アクダクト・ロード 8303 (72)発明者 コリンズ，ピーター・エル アメリカ合衆国メリーランド州20852，ロ ックビル，ビレッジ・スクウェア 12304， アパートメント ナンバー401 (72)発明者 マーフィー，ブライアン・アール アメリカ合衆国メリーランド州20861，ベ セスダ，テュスカラワス・ロード 5410 (72)発明者 ベイリー，ジーン・イー カナダ国ケベック エイチ９アール・１ブ イ９，ポイント・クレアー，ブリーブルッ ク・アベニュー 248 (72)発明者 ダービン，アナ・ピー アメリカ合衆国メリーランド州20912，タ コマ・パーク，ハドソン・アベニュー 806 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA01 4B065 AA90X AA95Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA45 4C076 AA24 BB01 BB25 BB27 CC06 FF68 4C085 AA03 BA55 CC03 CC04 EE01 EE05 GG08 GG10

Claims (83)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 主要ヌクレオキャプシド（N）タンパク質、ヌクレオキャプシ
    ドリンタンパク質（P）、ラージポリメラーゼタンパク質（L）、および異なるPI
    Vの1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合してヒト-ウシキ
    メラPIVゲノムまたはアンチゲノムを形成した、ヒトPIV（HPIV）またはウシPIV
    （BPIV）の部分または完全PIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含
    む、単離した感染性ヒト-ウシキメラ-パラインフルエンザウイルス（PIV）。
  2. 【請求項２】 1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントが、1以上
    のPIV N、P、C、D、V、M、F、HNおよび／またはLタンパク質またはそのフラグメ
    ントをコードする、請求項1に記載のキメラPIV。
  3. 【請求項３】 1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントが、1以上
    のPIV N、P、C、D、V、M、F、HNおよび／またはLタンパク質の完全オープンリー
    ディングフレーム（ORF）をコードする、請求項1に記載のキメラPIV。
  4. 【請求項４】 1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントに、遺伝
    子外3'リーダー領域もしくは5'トレイラー領域、遺伝子開始シグナル、遺伝子終
    止シグナル、RNA編集部位、キャプシド化シグナル、遺伝子間領域、または3'も
    しくは5'側非翻訳領域を含むヘテロロガス調節要素が含まれる、請求項1に記載
    のキメラPIV。
  5. 【請求項５】 バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムが、バックグラウ
    ンドゲノムまたはアンチゲノムに組み込まれたヘテロロガスゲノムセグメントを
    取り込んでキメラ遺伝子を形成した、請求項1に記載のキメラPIV。
  6. 【請求項６】 キメラゲノムまたはアンチゲノムがキメラ糖タンパク質をコー
    ドする、請求項5に記載のキメラPIV。
  7. 【請求項７】 ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントが、部分PIVバッ
    クグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のカウンターパート遺伝子またはゲノ
    ムセグメントを置換した、請求項1に記載のキメラPIV。
  8. 【請求項８】 ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントが、部分または完
    全PIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムの非コード領域に隣接して、
    または非コード領域内に、付加された、請求項1に記載のキメラPIV。
  9. 【請求項９】 ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントが、部分または完
    全PIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のカウンターパート遺伝子
    もしくはゲノムセグメントの野生型遺伝子オーダー位置に対応する位置において
    、付加または置換した、請求項1に記載のキメラPIV。
  10. 【請求項１０】 ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントが、部分または
    完全PIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のカウンターパート遺伝
    子もしくはゲノムセグメントの野生型遺伝子オーダー位置に対比して、よりプロ
    モーターに近い位置またはプロモーターから遠い位置において、付加または置換
    した、請求項1に記載のキメラPIV。
  11. 【請求項１１】 キメラゲノムまたはアンチゲノムが、ヒトPIV由来の1以上の
    ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合した部分または完全BPIVバッ
    クグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む、請求項1に記載のキメラPIV。
  12. 【請求項１２】 HNおよびFから選択される1以上のHPIV糖タンパク質遺伝子、
    またはその細胞質ドメイン、貫膜ドメイン、エクトドメインもしくは免疫原エピ
    トープをコードする1以上のゲノムセグメントが、BPIVバックグラウンドゲノム
    またはアンチゲノム中の1以上のカウンターパート遺伝子またはゲノムセグメン
    トを置換した、請求項11に記載のキメラPIV。
  13. 【請求項１３】 HNおよびFから選択される1以上のHPIV糖タンパク質遺伝子が
    、BPIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中の1以上のカウンターパー
    ト糖タンパク質遺伝子を置換した、請求項11に記載のキメラPIV。
  14. 【請求項１４】 HPIV糖タンパク質遺伝子HNおよびFの両方が、BPIVバックグ
    ラウンドゲノムまたはアンチゲノム中の1以上のカウンターパートHNおよびF糖タ
    ンパク質遺伝子を置換した、請求項13に記載のキメラPIV。
  15. 【請求項１５】 rBPIV3-FHHNHである、請求項13に記載のキメラPIV。
  16. 【請求項１６】 ヒト-ウシキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムが、HPIV糖タ
    ンパク質エクトドメイン、抗原決定因子または免疫原エピトープを有するキメラ
    糖タンパク質をコードする、請求項11に記載のキメラPIV。
  17. 【請求項１７】 ヘテロロガスゲノムセグメントが糖タンパク質エクトドメイ
    ンをコードする、請求項16に記載のキメラPIV。
  18. 【請求項１８】 1以上のHPIV糖タンパク質遺伝子HNおよびF、またはその細胞
    質ドメイン、貫膜ドメイン、エクトドメインもしくは免疫原エピトープをコード
    するゲノムセグメントが、BPIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムに付
    加され、または取り込まれた、請求項11に記載のキメラPIV。
  19. 【請求項１９】 キメラゲノムまたはアンチゲノムがさらに、キメラウイルス
    の遺伝子安定性を高めるために、または弱毒性、反応原性もしくは培養における
    増殖性を変化させるために、部分または完全ウシバックグラウンドゲノムまたは
    アンチゲノム中においてヒトPIV由来の1以上の追加ヘテロロガス遺伝子またはゲ
    ノムセグメントの付加または置換により修飾された、請求項11に記載のキメラPI
    V。
  20. 【請求項２０】 キメラゲノムまたはアンチゲノムが、ウシPIV由来の1以上の
    ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合した部分または完全ヒトPIV
    バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む、請求項1に記載のキメラPIV
    。
  21. 【請求項２１】 ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントがウシPIV3 Nタ
    ンパク質をコードする、請求項20に記載のキメラPIV。
  22. 【請求項２２】 ウシPIV3 Nオープンリーディングフレーム（ORF）が、キメ
    ラゲノムまたはアンチゲノム中においてヒトPIV3 N ORFを置換した、請求項20に
    記載のキメラPIV。
  23. 【請求項２３】 rHPIV3-NBである、請求項22に記載のキメラPIV。
  24. 【請求項２４】 ゲノムまたはアンチゲノムがさらに、生物由来の変異PIVま
    たは他の変異した非セグメント化マイナス鎖RNAウイルス中に同定される1以上の
    弱毒変異の導入により修飾された、請求項1に記載のキメラPIV。
  25. 【請求項２５】 ゲノムまたはアンチゲノムが、HPIV3 JS cp45中に存在する
    弱毒変異のうちの少なくとも1つの相補体から完全な相補体までを取り込んだ、
    請求項24に記載のキメラPIV。
  26. 【請求項２６】 ゲノムまたはアンチゲノムが、Lタンパク質においてJSのTyr 942 、Leu992、もしくはThr1558に対応する位置、Nタンパク質においてJSの残基V
    al96もしくはSer389に対応する位置、Cタンパク質においてJSのIle96に対応する
    位置、Mタンパク質においてJSのPro199に対応する位置、Fタンパク質においてJS
    の残基Ile420もしくはAla450に対応する位置、HNタンパク質においてJSの残基Va
    l384に対応する位置のアミノ酸置換；キメラウイルスの3'リーダー配列において
    JS cp45のヌクレオチド23、24、28もしくは45に対応する位置のヌクレオチド置
    換；および／またはN遺伝子開始配列においてJS cp45のヌクレオチド62に対応す
    る位置の変異を特定する弱毒変異のうち少なくとも1つの相補体から完全な相補
    体までを取り込んだ、請求項24に記載のキメラPIV。
  27. 【請求項２７】 ゲノムまたはアンチゲノムが、生物に由来する異なる変異PI
    Vからの弱毒変異を取り込んだ、請求項24に記載のキメラPIV。
  28. 【請求項２８】 ゲノムまたはアンチゲノムが、ヘテロロガス変異マイナス鎖
    RNAウイルス中に同定された弱毒変異のアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置に
    弱毒変異を取り込んだ、請求項24に記載のキメラPIV。
  29. 【請求項２９】 ゲノムまたはアンチゲノムが、変異を特定するコドンにおけ
    る多重ヌクレオチド変更により安定化された少なくとも1つの弱毒変異を含む、
    請求項24に記載のキメラPIV。
  30. 【請求項３０】 ゲノムまたはアンチゲノムが、増殖特性、弱毒性、温度感受
    性、低温適応性、プラークサイズ、宿主域制限の変更、または免疫原性変更から
    選択される表現型変更を特定する追加のヌクレオチド修飾を含む、請求項1に記
    載のキメラPIV。
  31. 【請求項３１】 追加のヌクレオチド修飾が、PIV N、P、C、D、V、M、F、HN
    および／またはL遺伝子、および／または3'リーダー、5'トレイラー、RNA編集部
    位、キャプシド化シグナル、および／または遺伝子間領域のうち1以上を改変す
    るものである、請求項30に記載のキメラPIV。
  32. 【請求項３２】 RNA編集部位の変異により、フレームシフト変異により、開
    始コドンによって特定されるアミノ酸を改変する変異により、または1以上の停
    止コドンを遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）中に導入することに
    より、キメラウイルスの1以上の遺伝子の全体または一部を欠失させ、あるいは
    遺伝子の発現を低下または排除させた、請求項30に記載のキメラPIV。
  33. 【請求項３３】 1以上のC、Dおよび／またはV ORFの部分または完全欠失、あ
    るいは1以上のC、Dおよび／またはV ORFの発現を低下または排除させる1以上の
    ヌクレオチド変化を含む修飾を、キメラゲノムまたはアンチゲノムに導入した、
    請求項30に記載のキメラPIV。
  34. 【請求項３４】 サイトカイン、Tリンパ球ヘルパーエピトープ、制限部位マ
    ーカー、または哺乳動物宿主において防御免疫応答を誘発することができる微生
    物病原体タンパク質から選択される非PIV分子をコードするように、キメラゲノ
    ムまたはアンチゲノムが修飾された、請求項30に記載のキメラPIV。
  35. 【請求項３５】 ウシ-ヒトキメラゲノムまたはアンチゲノムが、1以上のヘテ
    ロロガス病原体の1以上の抗原決定因子をコードする1以上のヘテロロガス遺伝子
    またはゲノムセグメントと結合した部分または完全PIVベクターゲノムまたはア
    ンチゲノムを含む、請求項1に記載のキメラPIV。
  36. 【請求項３６】 1以上のヘテロロガス病原体がヘテロロガスPIVであり、ヘテ
    ロロガス遺伝子またはゲノムセグメントが1以上のPIV N、P、C、D、V、M、F、HN
    および／またはLタンパク質あるいはそのフラグメントをコードする、請求項35
    に記載のキメラPIV。
  37. 【請求項３７】 ベクターゲノムまたはアンチゲノムが部分または完全HPIVゲ
    ノムまたはアンチゲノムであり、抗原決定因子をコードするヘテロロガス遺伝子
    またはゲノムセグメントが1以上のヘテロロガスPIVである、請求項35に記載のキ
    メラPIV。
  38. 【請求項３８】 1以上のヘテロロガスPIVが、HPIV1、HPIV2またはHPIV3から
    選択される、請求項37に記載のキメラPIV。
  39. 【請求項３９】 ベクターゲノムまたはアンチゲノムが部分または完全HPIVゲ
    ノムまたはアンチゲノムであり、抗原決定因子をコードするヘテロロガス遺伝子
    またはゲノムセグメントが1以上のヘテロロガスHPIVである、請求項37に記載の
    キメラPIV。
  40. 【請求項４０】 ベクターゲノムまたはアンチゲノムが部分または完全HPIV3
    ゲノムまたはアンチゲノムであり、抗原決定因子をコードするヘテロロガス遺伝
    子またはゲノムセグメントが1以上のヘテロロガスHPIVである、請求項39に記載
    のキメラPIV。
  41. 【請求項４１】 キメラゲノムまたはアンチゲノムが、弱毒性を特定する1以
    上のBPIV遺伝子またはゲノムセグメントを取り込んだ、請求項40に記載のキメラ
    PIV。
  42. 【請求項４２】 1以上のHNおよび／またはF糖タンパク質あるいはその抗原性
    ドメイン、フラグメントまたはエピトープをコードする1以上のHPIV1またはHPIV
    2遺伝子またはゲノムセグメントが、部分または完全HPIV3ベクターゲノムまたは
    アンチゲノムに付加され、あるいは取り込まれた、請求項35に記載のキメラPIV
    。
  43. 【請求項４３】 HNおよびF糖タンパク質をコードする両方のHPIV1遺伝子が、
    カウンターパートHPIV3 HNおよびF遺伝子を置換してキメラHPIV3-1ベクターゲノ
    ムまたはアンチゲノムを形成し、これがさらに、HPIV2の1以上の抗原決定因子を
    コードする1以上の遺伝子または遺伝子セグメントおよび弱毒性を特定するBPIV
    の1以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントの付加または取込みによ
    り修飾された、請求項35に記載のキメラPIV。
  44. 【請求項４４】 HPIV2 HNまたはF遺伝子のオープンリーディングフレーム（O
    RF）を含む転写ユニットが、キメラHPIV3-1ベクターゲノムまたはアンチゲノム
    に付加され、あるいは取り込まれた、請求項43に記載のキメラPIV。
  45. 【請求項４５】 ベクターゲノムまたはアンチゲノムが部分または完全BPIVゲ
    ノムまたはアンチゲノムであり、抗原決定因子をコードするヘテロロガス遺伝子
    またはゲノムセグメントが1以上のHPIVである、請求項35に記載のキメラPIV。
  46. 【請求項４６】 1以上の抗原決定因子が、HPIV1、HPIV2またはHPIV3 HNおよ
    びF糖タンパク質、ならびにその抗原性ドメイン、フラグメントおよびエピトー
    プから選択される、請求項45に記載のキメラPIV。
  47. 【請求項４７】 HPIV2の1以上の抗原決定因子をコードする1以上の遺伝子ま
    たはゲノムセグメントが、部分または完全BPIVベクターゲノムまたはアンチゲノ
    ム中において付加または置換した、請求項45に記載のキメラPIV。
  48. 【請求項４８】 複数のHPIVの抗原決定因子をコードする複数のヘテロロガス
    遺伝子またはゲノムセグメントが、部分または完全BPIVベクターゲノムまたはア
    ンチゲノムに付加され、あるいは取り込まれた、請求項45に記載のキメラPIV。
  49. 【請求項４９】 ベクターゲノムまたはアンチゲノムが部分または完全HPIVゲ
    ノムまたはアンチゲノムであり、ヘテロロガス病原体が麻疹ウイルス、サブグル
    ープAおよびサブグループB呼吸系発疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピロ
    ーマウイルス、1型および2型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サ
    イトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、フィロウ
    イルス、ブニヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルスおよびインフルエ
    ンザウイルスから選択される、請求項35に記載のキメラPIV。
  50. 【請求項５０】 ベクターゲノムまたはアンチゲノムが部分または完全BPIVゲ
    ノムまたはアンチゲノムであり、ヘテロロガス病原体が麻疹ウイルス、サブグル
    ープAおよびサブグループB呼吸系発疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピロ
    ーマウイルス、1型および2型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サ
    イトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、フィロウ
    イルス、ブニヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルスおよびインフルエ
    ンザウイルスから選択される、請求項35に記載のキメラPIV。
  51. 【請求項５１】 1以上のヘテロロガス抗原決定因子が、麻疹ウイルスHAおよ
    びFタンパク質、サブグループAおよびサブグループB呼吸系発疹ウイルスF、G、S
    HおよびM2タンパク質、ムンプスウイルスHNおよびFタンパク質、ヒトパピローマ
    ウイルスL1タンパク質、1型および2型ヒト免疫不全ウイルスgp160タンパク質、
    単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスgB、gC、gD、gE、gG、gH、gI
    、gJ、gK、gLおよびgMタンパク質、狂犬病ウイルスGタンパク質、エプスタイン
    ・バーウイルスgp350タンパク質、フィロウイルスGタンパク質、ブニヤウイルス
    Gタンパク質、フラビウイルスEおよびNSIタンパク質、ならびにアルファウイル
    スEタンパク質、ならびにその抗原性ドメイン、フラグメントおよびエピトープ
    から選択される、請求項50に記載のキメラPIV。
  52. 【請求項５２】 ヘテロロガス病原体が麻疹ウイルスであり、ヘテロロガス抗
    原決定因子が麻疹ウイルスHAおよびFタンパク質、ならびにその抗原性ドメイン
    、フラグメントおよびエピトープから選択される、請求項51に記載のキメラPIV
    。
  53. 【請求項５３】 麻疹ウイルスHA遺伝子のオープンリーディングフレーム（OR
    F）を含む転写ユニットがHPIV3ベクターゲノムまたはアンチゲノム中に付加され
    、あるいは取り込まれた、請求項52に記載のキメラPIV。
  54. 【請求項５４】 呼吸系発疹ウイルス（RSV）由来の遺伝子またはゲノムセグ
    メントを取り込んだ、請求項51に記載のキメラPIV。
  55. 【請求項５５】 遺伝子またはゲノムセグメントがRSV Fおよび／またはG糖タ
    ンパク質、あるいはその抗原性ドメインまたはエピトープをコードする、請求項
    54に記載のキメラPIV。
  56. 【請求項５６】 ウイルスである、請求項1に記載のキメラPIV。
  57. 【請求項５７】 サブウイルス粒子である、請求項1に記載のキメラPIV。
  58. 【請求項５８】 個体の免疫系を刺激してPIVに対する防御を誘導する方法で
    あって、免疫学的に十分な量の請求項1に記載のキメラPIVを生理学的に許容でき
    るキャリヤーと組み合わせて投与することを含む方法。
  59. 【請求項５９】 キメラPIVを103〜107PFUの用量で投与する、請求項58に記載
    の方法。
  60. 【請求項６０】 キメラPIVを上気道に投与する、請求項58に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 キメラPIVをスプレー、液滴またはエーロゾルにより投与す
    る、請求項58に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 キメラPIVおよび第2弱毒PIVを混合物として同時に投与する
    、請求項58に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 PIVに対する免疫応答を誘発するための免疫原組成物であっ
    て、免疫学的に十分な量の請求項1に記載のキメラPIVを生理学的に許容できるキ
    ャリヤー中に含む組成物。
  64. 【請求項６４】 103〜107PFUの用量で配合された、請求項63に記載の免疫原
    組成物。
  65. 【請求項６５】 上気道にスプレー、液滴またはエーロゾルにより投与するた
    めに配合された、請求項63に記載の免疫原組成物。
  66. 【請求項６６】 キメラPIVがHPIV1、HPIV2およびHPIV3から選択される1以上
    のウイルスに対する免疫応答を誘発する、請求項63に記載の免疫原組成物。
  67. 【請求項６７】 キメラPIVがHPIV3、ならびにHPIV1、HPIV2およびHPIV3から
    選択される他のウイルスに対する免疫応答を誘発する、請求項66に記載の免疫原
    組成物。
  68. 【請求項６８】 異なるPIVのヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと
    結合してヒト-ウシキメラPIVゲノムまたはアンチゲノムを形成した、ヒトまたは
    ウシPIVの部分または完全PIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む
    単離ポリヌクレオチド分子。
  69. 【請求項６９】 キメラゲノムまたはアンチゲノムが、ヒトPIVに由来する1以
    上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合した部分または完全BPIV
    バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む、請求項68に記載の単離ポリ
    ヌクレオチド。
  70. 【請求項７０】 HNおよびF、またはその細胞質ドメイン、貫膜ドメイン、エ
    クトドメインもしくは免疫原エピトープをコードする1以上のゲノムセグメント
    から選択される1以上のHPIV糖タンパク質遺伝子が、BPIVバックグラウンドゲノ
    ムまたはアンチゲノム中の1以上のカウンターパート遺伝子またはゲノムセグメ
    ントを置換した、請求項69に記載の単離ポリヌクレオチド。
  71. 【請求項７１】 HNおよびFから選択される1以上のHPIV糖タンパク質遺伝子が
    、BPIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中の1以上のカウンターパー
    ト糖タンパク質遺伝子を置換した、請求項69に記載の単離ポリヌクレオチド。
  72. 【請求項７２】 HPIV糖タンパク質遺伝子HNおよびFの両方が、BPIVバックグ
    ラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のカウンターパートHNおよびF糖タンパク
    質遺伝子を置換した、請求項71に記載の単離ポリヌクレオチド。
  73. 【請求項７３】 プラスミドpBPIV（215）を含む、請求項71に記載の単離ポリ
    ヌクレオチド。
  74. 【請求項７４】 キメラゲノムまたはアンチゲノムが、ウシPIVに由来する1以
    上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合した部分または完全ヒト
    PIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む、請求項68に記載の単離
    ポリヌクレオチド。
  75. 【請求項７５】 HNおよびFから選択される1以上のBPIV糖タンパク質遺伝子が
    、HPIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中の1以上のカウンターパー
    ト糖タンパク質遺伝子を置換した、請求項74に記載の単離ポリヌクレオチド。
  76. 【請求項７６】 BPIV糖タンパク質遺伝子HNおよびFの両方が、HPIVバックグ
    ラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のカウンターパートHNおよびF糖タンパク
    質遺伝子を置換した、請求項75に記載の単離ポリヌクレオチド。
  77. 【請求項７７】 プラスミドpHPIV（215）を含む、請求項76に記載の単離ポリ
    ヌクレオチド。
  78. 【請求項７８】 ウシN遺伝子が、ヒトPIVバックグラウンドゲノムまたはアン
    チゲノム中のN遺伝子を置換した、請求項74に記載の単離ポリヌクレオチド。
  79. 【請求項７９】 キメラゲノムまたはアンチゲノムがさらに、1以上の弱毒変
    異により修飾された、請求項68に記載の単離ポリヌクレオチド。
  80. 【請求項８０】 さらに、増殖特性、弱毒性、温度感受性、低温適応性、プラ
    ークサイズ、宿主域制限の変更、または免疫原性の変更から選択される表現型変
    更を特定するヌクレオチド修飾を含む、請求項68に記載の単離ポリヌクレオチド
    。
  81. 【請求項８１】 感染性弱毒キメラPIVをコードする1以上の単離ポリヌクレオ
    チド分子から感染性弱毒キメラPIV粒子を製造する方法であって、 異なるPIVのヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合してヒト-ウシ
    キメラPIVゲノムまたはアンチゲノムを形成した、ヒトまたはウシPIVの部分また
    は完全PIVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む単離ポリヌクレオ
    チドを含む発現ベクター、ならびにPIV N、PおよびLタンパク質を、無細胞溶解
    物中において発現させる ことを含む方法。
  82. 【請求項８２】 キメラPIVゲノムまたはアンチゲノムと、PIV N、PおよびLタ
    ンパク質が、2以上の異なる発現ベクターにより発現する、請求項81に記載の方
    法。
  83. 【請求項８３】 作動可能な状態で結合した転写プロモーター、異なるPIVの1
    以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと結合してヒト-ウシキメラP
    IVゲノムまたはアンチゲノムを形成した、ヒトまたはウシPIVの部分または完全P
    IVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含むポリヌクレオチド配列、お
    よび転写ターミネーターを含む発現ベクター。
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