KR100894849B1 - 비필수 유전자의 결실 또는 제거에 의해 약독화된 재조합파라인플루엔자 바이러스 백신 - Google Patents
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Abstract
C, D 및(또는) V 번역 개방 판독틀(ORF)의 발현이 감소 또는 제거되어 신규한 PIV 백신 후보를 수득하는 재조합 파라인플루엔자 바이러스(PIV)가 제공된다. C, D 및(또는) V ORF의 발현은 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈의 변이, 예를 들어, 정지 코돈의 도입에 의해서, RNA 에디팅 부위에서의 돌연변이에 의해서, 개시코돈을 특정하는 아미노산을 변경하는 돌연변이, 또는 표적된 ORF에서의 프레임쉬프트(frame shift) 돌연변이에 의해서, 제거 또는 삭제된다. 별법으로 C, D 및(또는) V ORF는 그것에 의해 코딩되는 단백질을 부분적 또는 전체적으로 비기능적으로 만들거나 모든 단백질 발현을 방해 함으로써 전체적 또는 부분적으로 결실된다. C, D 및(또는) V ORF 결실 또는 넉아웃 돌연변이는 백신 개발을 위해 매우 바람직한 표현형 특성을 갖는다. 이러한 제거 및 넉아웃 돌연변이 변형은 생성되는 바이러스 또는 서브바이러스 입자에서의 1 이상의 목적하는 표현형 변형을 특정한다. 다른 신규한 표현형에서 바이러스 성장 특성, 약독화, 플라크 크기 및(또는) 세포 변성에서의 변화를 나타내는 백신 후보자가 생성된다. 다양한 추가적 돌연변이 및 뉴클레오티드 변이가 목적하는 표현형적 및 구조적 효과를 수득하기 위하여 본 발명의 C, D 및(또는) V ORF 결실 또는 삭제 돌연변이 PIV 내에서 제공된다.
파라인플루엔자 바이러스(PIV), 재조합 PIV 게놈 또는 재조합 PIV 안티게놈, 약독화 돌연변이
Description
사람 파라인플루엔자 바이러스 유형 3(HPIV3)은 1 살 이하의 영아 및 유아에 심각한 하부 호흡 기도 감염의 일반적인 원인이다. 이는 연령대 군에서 바이러스성 하부 호흡 기도 질환으로 인한 입원을 유도하는 주요 원인인 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 바로 다음으로 중요하다(Collins et al., p. 1205-1243. In B.N. Fields (Knipe et al., eds), Fields Virology, 3rd ed, vol. 1. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996; Crowe et al., Vaccine 13: 415-421,1995 ; Marx et al., J. Infect. Dis.176: 1423-1427,1997). 이 바이러스에 의한 감염은 3 살 이하의 유아들에서 상당한 사망율을 가져온다. HPIV1 및 HPIV2는 후두기관지염(크루프)의 주요 병인 원인이며 또한 심각한 폐렴 및 세기관지염(Collins et al., 3rd ed. In"Fields Virology,"B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R.M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, and S. E. Straus, Eds., Vol. 1, pp.1205-1243. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)을 유발할 수 있다. 20년 간에 걸친 장기간의 연구에서, 전체 입원의 18%를 차지하는 호흡기 질환으로 인한 입원의 각각 6.0, 3.2 및 11.5%는 HPIV1, HPIV2 및 HPIV3가 병 인학적 원인으로 동정되었으며, 이러한 이유로 효과적인 백신이 필요하다(Murphy et al., Virus Res 11, 1-15,1988). 파라인플루엔자 바이러스는 또한 중이염(Heikkinen et al., N Engl J Med 340: 260-4,1999)을 앓고 있는 유아의 바이러스 유도된 중이 삼출액의 경우에 상당한 비율로 동정되었다. 따라서 이들 HPIV 감염을 수반하는 심각한 하부 호흡 기도 질환과 중이염을 방지할 수 있는 이들 바이러스에 대한 백신을 생산할 필요가 있다.
HPIV에 대한 효과적인 백신을 개발하고자 하는 상당한 노력에도 불구하고 HPIV 균주나 HPIV 관련 질병을 호전시킨 것으로 입증된 백신 약물이 얻어지지 않았다. 현재까지 단지 2 개의 생약독화 PIV 백신 후보만이 특별한 주목을 받고 있다. 이들 후보 중 하나는 HPIV3과 항원적으로 관련있는 소 PIV(BPIV3)이며 이는 HPIV3으로부터 동물을 보호하는 것으로 알려져 있다. BPIV3은 약독화되었으며, 유전적으로 안정하고 사람의 영아 및 유아에게 면역원성이 있다(Karron et al., J. Inf. Dis. 171: 1107-14 (1995a); Karron et al.,J. Inf. Dis. 172: 1445-1450, (1995b)). 두 번째 PIV3 백신 후보인 JS cp45는 HPIV3의 JS 야생형(wt) 균주의 저온 적응된 돌연변이체이다(Karron et al., (1995b), 상기참조;및 Belshe et al., J. Med. Virol. 10: 235-42 (1982)). 이 생약독화된 저온 계대 배양된(cp) PIV3 백신 후보는 온도 민감성(ts), 저온 적응성(ca), 약독화된(att) 표현형을 나타내며 이는 생체내 바이러스 복제 후 안정하다. cp45 바이러스는 실험 동물에서 사람의 PIV3 감염에 대해 방어적이고, 약독화되고, 유전적으로 안정되고, 사람 영아 및 유아에서 면역원성이 있다(Hall et al., Virus Res. 22: 173-184 (1992); Karron et al., (1995b), 상기 참조).
PIV 백신 후보의 개발을 용이하게 하기 위해, 재조합 DNA 기술은 최근 cDNA로부터 감염성 (-) 가닥 RNA를 회수하는 것을 가능하게 하였다(참고 Conzelmann, J. Gen. Virol. 77: 381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 11354-58, (1996)). 이와 관련하여, 재조합 회수는 필수 바이러스성의 단백질 존재 중의 cDNA-코딩된 항게놈성 RNA로부터의 감염성 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), 광견병 바이러스(RaV), 소포성 구내염 바이러스(VSV), 홍역 바이러스(MeV), 우역 바이러스, 시미안 바이러스5 (SV5), 뉴캐슬 질환 바이러스(NDV), 및 센다이 바이러스(SeV)에 대해 보고되었다(Garcin et al., EMBO J. 14: 6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14: 5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13: 4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 8388-92 (1995);Hoffman et al., J. Virol. 71: 4272-4277 (1997); Kato et al., Genes to Cells 1: 569-579 (1996), Roberts et al., Virology 247 (1), 1-6 (1998); Baron et al., J. Virol. 71: 1265-1271 (1997); 국제 공개 번호 WO 97/06270; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 92: 11563-11567 (1995); 1997년 7월 15일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 제08/892,403호(공표된 국제 공개 출원 제WO 98/02530호 및 우선권 미국 가출원인 1997년 5월 23일에 출원된 제60/047,634호, 1997년 5월 9일자로 출원된 제60/046,141호, 및 1996년 7월 15일자로 출원된 제60/021,773호에 대응함); Juhasz et al., J. Virol.71 (8): 5814-5819 (1997); He et al. Virology 237: 249-260 (1997); Baron et al. J. Virol.71: 1265-1271 (1997); Whitehead et al., Virology 247 (2): 232-9 (1998a); Whitehead et al.,J. Virol. 72 (5): 4467-4471 (1998b); Peeters et al. J. Virol. 73: 5001-5009,1999; Jin et al.Virology 251: 206-214 (1998); Bucholz et al. J. Virol. 73: 251-259 (1999); and Whitehead et al., J. Virol. 73: (4) 3438-3442 (1999), 각각은 모두 본원에 인용참증으로 삽입됨).
본 발명에 보다 구체적으로 관련하여, cDNA로부터 wt 표현형을 갖는 HPIV를 생산하는 방법이 감염성, 재조합 PIV3 JS 균주의 회수에 대해 최근 개발되었다( Durbin et al., Virology 235 : 323-332,1997; 1998년 5월 23일자로 출원된 미국 특허 출원 제09/083,793호; 1997년 5월 23일자로 출원된 미국 가출원 제60/047,575호 (국제 공개 번호 제WO 98/53078호에 대응함), 및 1997년 9월 19일자로 출원된 미국 가출원 제60/059,385호, 각각은 본원에 인용참증으로 삽입되었음). 또한, 이들 개시는 생물학적 돌연변이에서 표현형 변화의 유전적 기초, 예를 들어 HPIV3 cp45 중의 어떤 돌연변이가 그 ts,ca 및 att 표현형을 특정하는지, 및 BPIV의 어떤 유전자(들)가 그 약독화 표현형을 특정하는지를 결정하기 위한 cDNA 클론의 유전적 조작을 허용한다. 추가적으로, 이들의 개시는 신규 PIV 백신 후보를 구성하는 것 및 그 약독화, 면역원성 및 표현형 안정성 수준을 평가하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 다수의 ts 유도체들과 함께 현재 감염성 야생형 재조합 PIV3(r) PIV3는 cDNA로부터 회수되었으며, 또한, 역전사 유전학 시스템은 특정된 약독화 돌 연변이를 갖는 감염성 바이러스를 생산하기 위해서, 또한, 현존하는 백신 바이러스의 약독화의 유전적 기초를 연구하기 위해서 사용되어 왔다. 예를 들어, cp45의 L 유전자에서 발견된 3 개의 아미노산 치환은 ts 및 약독화 표현형을 특정하기 위한 것으로 밝혀졌다. 추가적 ts 및 약독화 돌연변이는 PIV3 cp45의 다른 영역에 존재한다. 키메라 PIV1외에, PIV3 cDNA 회수 시스템을 사용하여 PIV3 HN 및 F 개방 판독틀(ORF)을 L에서 3 개의 약독화 돌연변이를 포함하는 PIV 전장 cDNA중의 PIV1의 개방 판독틀로 치환하여 생산하였다. 이 cDNA로 부터 유도된 재조합 키메라 바이러스는 rPIV3-1.cp45L이라고 명명하였다(Skiadopoulos et al., J Virol 72: 1762-8,1998; Tao et al., J Virol 72: 2955-2961,1998; Tao et al., Vaccine 17: 1100,1108,1999, 본원에 인용참증으로 삽입되었음). rPIV3-1. cp45L은 햄스터내에서 약독화되었으며, PIV1에 의한 감염에 대한 높은 수준의 저항성을 유도한다. 15개의 cp45 돌연변이 중 13개의 돌연변이, 즉 HN 및 F내에서 일어난 돌연변이를 제외한 돌연변이를 포함하는 rPIV3-1.cp45라 명명된 재조합 키메라 바이러스가 생산되었으며, 햄스터의 상부 또는 하부 호흡 기도에서 약독화된다(Skiadopoulos et al., Vaccine In press,1999).
여러 가지의 PIV 군에 대한 효과적인 백신 작용 물질의 개발을 향한 많은 노력에도 불구하고, PIV로 인한 심각한 건강 문제, 특히 HPIV3 감염으로 인한 영아 및 유아에서의 질병을 경감하기 위한 효과적이고 안전한 백신을 엔지니어링하기 위한 추가적인 도구 및 방법에 대한 명백한 요구가 남아 있다. 이러한 상황에서, 남아있는 시도 중에서는 다양한 임상 상황에서의 사용을 위해 적절히 약독화되고 면 역원성이며 유전적으로 안정한 백신 후보를 생산하기 위한 추가적 도구에 대한 요구성이 있다. 이들 목적을 용이하게 하기 위해, 약독화된 돌연변이를 확인하고 재조합 백신 균주로 함입하기 위한 현존하는 방법이 발전되어야 한다. 놀랍게도, 본 발명은 이러한 요구를 충족시키며, 하기하는 것과 같은 추가적 장점을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 감염성 PIV 내로 특정되고 예정된 구조적 및 표현형적 변형을 도입하기 위한 신규한 도구 및 방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시태양에서, 조정가능하게 연결된 전사 프로모터, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 전사 터미네이터를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자가 제공된다. 게놈 또는 안티게놈은 1 이상의 C, D 및(또는) V 유전자의 발현을 감소 또는 제거하는 넉아웃(knock out) 돌연변이, 또는 1 이상의 C, D 및(또는) V ORF를 전부 또는 부분 삭제하는 돌연변이를 함입한다.
본 발명의 바람직한 측면에서, C ORF의 개시 코돈을 M에서 T로 변형하거나 1 이상의 정지 코돈을 변형하는 돌연변이를 함입하도록 PIV 게놈 또는 안티게놈을 변이함으로써 1 이상의 C, D 및(또는) V ORF의 발현이 감소 또는 제거된다. 별법으로, 1 이상의 C, D 및(또는) V ORF는 전체적으로 또는 부분적으로 삭제되거나, 상응 단백질이 부분적으로 또는 전체적으로 기능을 상실하게 하거나 단백질 발현을 전혀 방해하는 점 돌연변이와 같은 다른 돌연변이에 의해서 변이된다. 별법으로, 돌연변이는 에디팅을 방해하고 RNA 에디팅에 의해 접근되는 단백질의 발현을 삭제하는 에디팅 부위에서 만들어질 수 있다(Kato et al.,EMBO 16: 578-587,1997 and Schneider et al., Virologv227: 314-322,1997).
C, D 및(또는) V에서 돌연변이를 갖는 본 발명의 재조합 PIV는 백신 개발에 있어 매우 바람직한 표현형의 특성을 가지고 있다. 재조합 게놈 또는 안티게놈에서 상기 확인된 변이는 생성된 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 1 이상의 바람직한 표현형의 변형을 특정한다. 따라서, (i) 세포 배양에서의 성장 특성의 변형, (ii) 포유류 숙주의 상부 또는 하부 호흡 기도에서의 약독화, (iii) 바이러스 플라크 크기의 변형, (iv) 세포 병성 효과의 변형 및 (v) 면역원성의 변형으로 확인되는 1 이상의 특성을 나타내는 백신 후보들이 생성된다.
본원에서 기술되는 예시적 PIV 재조합체에서, 목적하는 표현형의 변형은 대응하는 야생형 또는 돌연변이체 부모형 PIV 균주의 성장과 비교되는 생체외(in vitro) 및(또는) 포유류 숙주내에서의 바이러스의 성장의 약독화를 포함한다. 더욱 상세한 측면에, 세포 배양에서의 바이러스의 성장은 넉아웃 또는 유전자(또는 게놈 세그먼트) 결실 돌연변이로 인하여 약 5-10배로 약독화될 수 있다. 포유류 숙주의 상부 및(또는) 하부 호흡 기도에서의 바이러스의 약독화는 바람직하게는 약 10-100배, 경우에 따라서는 100-1000배 이상 약독화되어 백신 개발을 촉진한다. 이와 동시에, 본 발명의 재조합 PIV는 포유류 숙주의 상부 및 하부 호흡기도 모두에서 wt PIV 감염에 대한 방어적 면역 반응을 강화하는 면역원성의 특성을 가지고 있다.
C, D 및(또는) V 넉아웃 돌연변이(들)를 포함하는 PIV 게놈 또는 안티게놈은 인간 또는 비인간의 PIV 서열 또는 그의 재조합적으로 변이된 이형일 수 있다. 한 실시태양에서는, 폴리뉴클레오티드 서열은 소 PIV(BPIV)로부터의 유전자 또는 유전자 세그먼트 같은 비인간 PIV 서열이 재조합적으로 결합된 인간 PIV서열을 포함하는 키메라 게놈 또는 안티게놈을 코딩한다(1999년 7월 9일자에 Bailey에 의해 출원되고 대리인 사건 번호 제15280-399000US호에 상응하는 '약독화 사람-소 키메라 파라인플루엔자 바이러스 백신'이라는 발멸의 명칭의 미국 가출원, 본원에 인용참증으로 삽입되었음). 추가적인 예에서, 폴리뉴클레오티드는 비인간 PIV 및 인간 또는 비인간 기원의 다른 1 이상의 PIV로부터의 키메라 서열을 코딩한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 C, D 및(또는) V 넉아웃 돌연변이(들)를 함입하는 재조합 PIV(rPIV) 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 단리된 감염성 PIV 입자를 제공한다. 단리된 감염성 PIV 입자는 바이러스 또는 서브바이러스 입자일 수 있다. 본원에서 사용되고 있듯이, 서브바이러스 입자는 구조적 성분, 예를 들어, 전체 바이러스(예를 들어, 전체 게놈 또는 안티게놈, 뉴클레오캡시드, 외피를 포함하는 어셈블된 비리온)내에 존재하는 유전자 세그먼트, 유전자, 단백질, 또는 단백질의 기능적 영역이 결실된 감염성 PIV 입자를 말한다. 따라서, 본 발명의 서브바이러스 입자의 일례는 게놈 또는 안티게놈및 N, P 및 L 유전자 생성을 포함하는 감염성 뉴클레오캡시드이다. 다른 서브바이러스 입자는 다른 비필수적 게놈적 및 구조적 성분 중에서 비필수적 유전자, 게놈 세그먼트 및(또는) 부분 또는 전체 유전자 생성물(예를들어 F, HN, M 또는 C)의 부분 또는 전부 결실 또는 치환에 의하여 생성된다.
C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이(들)를 포함하는 재조합 PIV에서 제공하는 표현형적 효과와 함께 재조합 바이러스의 약독화의 증가 또는 감소 및(또는) 면역원성 활성을 조절하는 추가적 돌연변이를 도입함으로써 약독화 및 면역원성 표현형을 조절하는 것이 경우에 따라서는 목적이 된다. 따라서, 후보 백신 균주는 1 이상, 바람직하게는 2 이상의 다른 약독화 돌연변이(예를 들어, 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체 또는 재조합 미니-레플리콘, 재조합 바이러스 또는 생물학적으로 유도된 바이러스를 실험적으로 사용하여 확인되는 돌연변이)를 함입함으로써 더욱 약독화될 수 있다. 이와 관련하여, 바람직한 돌연변이 PIV 균주는 저온 계대 배양된(cp), 저온 적응된(ca), 숙주 범위 제한된(hr), 작은 플라크의(sp), 및(또는) 온도 감수성(ts) 돌연변이체(예를 들어, JS HPIV3 cp 45 돌연변이체 균주)이다. 예시적 실시태양에서, 1 이상의 약독화 돌연변이는 중합효소 L 단백질 중의, 예를 들어 JS cp45의 Tyr942, Leu992, 또는 Thrl558에 상응하는 위치에서, 발생한다. 별법으로, N 단백질의 약독화 돌연변이가 선택되고, C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체(예를 들어 JScp45의 Val96 또는 Ser389 잔기에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 코딩하는 것)로 함입될 수도 있다. 선택적 또는 추가적 돌연변이는 C 단백질 중의, 예를 들어 JS cp45의 Ile96에 상응하는 위치에서, 아미노산 치환(들)을 코딩할 수도 있다. 그러나, 본 발명의 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체의 약독화 조절을 위한 추가적 돌연변이는 F 단백질 중의, 예를 들어 JS cp45의 Ile420 or Ala450에 상응하는 위치에서, 또는 HN 단백질 중의, 예를 들어 JS cp45의 Val384 잔기에 상응하는 위치에서 발견된다(Skiadopoulos et al., J.Virol. 73: 1374-1381,1999; Skiadopoulos et al., J Virol. 73: 1374-1381,1999, 각각은 본원에 인용참증으로 삽입되었음).
본 발명의 C,D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체로 함입되기 위한 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터의 약독화된 돌연변이는 또한 PIV 게놈또는 안티게놈의 비코딩된 부분(예를 들어, 3' 리더 서열)의 돌연변이를 포함한다. 이와 관련하여, 예시적 돌연변이는 JS cp45의 뉴클레오티드 23, 24, 28 또는 45에 상응하는 위치의 재조합 바이러스의 3' 리더의 위치에서 엔지니어링될 수 있다(Skiadopoulos et al., J. Virol. 73: 1374-1381,1999, 본원에 인용참증으로 삽입되었음). 그러나, 추가적인 예시적 돌연변이는 N 유전자 개시 서열에서 엔지니어링될 수 있다. 예를 들어, JS cp45의 N 유전자 개시 서열의 1 이상의 뉴클레오티드를, 예를 들어, 뉴클레오티드 62에 상응하는 위치에서 변형하는 것에 의해서 이다.
JS cp45 및 다른 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터 약독화된 돌연변이들의 거대 "메뉴"가 제공되고, 각각의 돌연변이는 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이를 포함하는 재조합 PIV에서의 약독화 수준을 조절하기 위한 각각의 다른 돌연변이(체)와 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 PIV 내에서의 돌연변이는 1 이상, 바람직하게는 2 이상의 JS cp45의 돌연변이를 포함한다. 예로서, 백신 용도를 위해 선택된 목적하는 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이는 광범위한 임상 용도를 위한 만족스러운 수준의 약독화를 달성 위해 대개 2 이상 및 경우에 따라서는 3 이상의 약독화된 돌연변이를 갖고 있다. 바람직하게는, C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이(들)를 갖는 재조합 PIV는 돌연변 이를 특정하는 코돈 내의 다수의 뉴클레오티드 치환에 의해 안정화된 1 이상의 약독화 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이로 채택 또는 전달될 수 있는 추가적 돌연변이는 비PIV, 비세그먼트 (-) 가닥의 RNA 바이러스로 확인되며 본 발명에서 PIV 돌연변이체로 함입된다. 이것은 수용체 PIV 게놈 또는 안티게놈의 상응하는 동형 부위에 대한 이형 (-) 가닥 RNA 바이러스에서 확인되는 돌연변이를 매핑(mapping)하고 돌연변이체 유전자형(동일 또는 보존적 돌연변이)에 대한 수용체에 존재하는 서열을 돌연변이시킴으로써 용이하게 달성된다. 이는 본원에서 인용참증으로 삽입된 1999년 4월 13일에 출원되고 대리인 사건 번호 제17643-000600호로 확인되는 '클론된 뉴클레오티드 서열로부터 약독화된 (-) 가닥 RNA 바이러스의 생산'이라는 발명의 명칭의 미국 특허 출원에 기재되어 있다.
상기 돌연변이 이외에, 바람직하게는, 감염성의 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체는 이종의 PIV 또는 PIV류의 바이러스(예를 들어, 키메라 게놈 또는 안티게놈을 형성하는 HPIV1, HPIV2, HPIV3, 소 PIV(BPIV) 또는 쥐 PIV(MPIV))로부터의 이형 코딩 또는 비코딩 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 PIV는 2 이상의 야생형 또는 돌연변이체 PIV 균주(예를 들어, HPIV1 및 HPIV3)로부터의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 C,D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이는 인간 및 비인간 PIV(예를 들어, HPIV 및 BPIV)로부터의 서열을 함입한다. 바람직하게는, "수용체" 또는 "백그라운드" 게놈 또는 안티게놈에서의 1 이상의 인간 PIV 코딩 또는 비코딩하는 폴리뉴클리오티드는, 신규한 약독화된 백신 균주를 생산하기 위하여, 이형 PIV 또는 비PIV 바이러스로부터 대응 서열로 단독 또는 1 이상의 선택된 약독화 점 돌연변이(예를 들어, cp 및(또는) ts 돌연변이)와 함께 치환된다. 단리된 감염 PIV 입자는 인간 PIV가 바람직하고, 인간 PIV3이 더욱 바람직하다(예를 들어, 1999년 7월 9일자로 Bailey에 의해 출원되고 대리인 사건 번호에 의해 제15280-399000US호로 확인되는 '약독화 사람-소 키메라 파라인플루엔자 바이러스 백신'이라는 발명의 명칭의 미국 가출원을 참조, 본원에 인용참증으로 삽입되었음).
본 발명과 관련된 측면에서, HPIV1, HPIV2, BPIV 또는 MPIV와 같은 이형 PIV로부터 1 이상의 서열에 연결된 HPIV3로부터의 뉴클레오티드 서열을 함입하는 단리된 감염성 PIV 입자가 제공된다. 예를 들어, HPIV3의 전체 유전자는 HN 및(또는) F 당단백질 유전자와 같은 PIV의 다른 형태로부터 대응 유전자에 의해 치환될 수 있다. 별법으로, 선택된 게놈 세그먼트 (예를 들어, HPIV1 또는 HPIV2의 HN 또는 F의 세포질 테일, 막횡단 도메인 또는 엑토도메인)가 키메라 단백질(예를 들어 세포질 테일 및(또는) PIV1 또는 PIV2의 엑토도메인과 혼합된 PIV3의 막횡단 도메인을 갖는 융합 단백질)를 코딩하는 구조체를 수득하기 위하여 HPIV3 대응 유전자의 대응 유전자 세그먼트 대신에 치환될 수 있다. 별법으로, 1 개의 PIV로부터의 유전자 또는 게놈 세그먼트는 생성된 클론 내의 신규한 면역원성 특성을 생성하기 위해서 이형의 PIV 백그라운드 내로 첨가(즉, 치환 없음)될 수 있다.
C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이를 가진 재조합 PIV 이외에 본 발명은 관련된 cDNA 클론, 벡터, 입자들을 제공하고, 이들 각각은 본원에서 언급된 1 이상의 대상 표현형-특정의 돌연변이를 함입한다. 이들은 선택된 결합체로 (예를 들어, 재조합 cDNA 게놈 또는 안티게놈인 단리된 폴리뉴클레오티드내로) 도입되어서 이는 본원에 기술된 방법에 따라 적절하게 약독화된 감염성 바이러스 또는 표현상으로 서브바이러스 입자를 생산한다. 이러한 과정은 통상적인 표현형의 평가와 함께, 약독화, 온도 감수성, 변경된 면역원성, 저온 적응성, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한, 유전적 안정성 등과 같은 목적하는 특성을 가지는 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이를 제공한다. 특히, 약독화되고 예방 접종을 한 포유류 숙주의 방어적 면역 반응을 유발하는데 충분한 면역원성 없는 백신 후보가 선택된다.
본 발명의 추가적인 측면에서, 예를 들어 생물학적으로 유도된 돌연변이 바이러스로부터 채택된 추가적 약독화 돌연변이를 갖거나 갖지 않는 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이는 목적하는 표현형적, 구조적, 기능적인 변형을 수득하기 위해 추가적 뉴클레오티드 변이를 갖도록 구성된다. 전형적으로, 선택된 뉴클레오티드 변이는 표현형의 변형(예를 들어, 성장 특성, 약독화, 온도 감수성, 냉온 적응성, 플라크 사이즈, 숙주 범위 제한, 또는 면역원성에서의 변화)을 특정할 수 있다. 이와 관련하여, 구조적 변형은 조작 또는 특정의 편의를 위한 PIV 코딩 cDNA로의 제한 부위의 도입 또는 제거를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이의 게놈 또는 안티게놈내에서의 뉴클레오티드 변형은 유전자의 부분 또는 전부 제거 또는 그의 발현의 감소 또는 제거(넉아웃)에 의한 추가적 바이러스 유전자의 변형을 포 함한다. 이와 관련하여, 돌연변이의 표적 유전자는 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 거대 중합효소 서브유닛 L, 기질 단백질 M, 적혈구 뉴라미니다제 단백질 HN, 융합 단백질 F를 포함한다. 재조합 바이러스가 생존하고 감염성이 잔존할 때까지는 이들 각각의 단백질은 신규한 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체를 획득하기 위해서, 전체적 또는 부분적으로, 단독 또는 다른 목적하는 변형과 함께 선택적으로 결실,치환 또는 재정렬될 수 있다. 예를 들어, 성장, 약독화, 면역원성, 또는 다른 목적하는 표현형 특성을 개선시키는 생성된 재조합 클론의 표현형을 변경하기 위해서, 1 이상의 유전자는 전부 또는 부분적으로 제거되거나 또는 그의 발현이 감소 또는 제거될 수 있다 (예를 들어, 종결 코돈의 도입, RNA 에디팅 부분에서의 돌연변이, 개시 코돈에 의해 특정된 아미노산을 변경하는 돌연변이, 또는 프레임쉬프트 돌연변이에 의함).
본 발명의 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이의 선택적 뉴클레오티드 변이는, 재조합 게놈 또는 안티게놈에서 선택된 유전자에 대한 시스(cis)-작용 조절 서열의 결실, 삽입, 추가 또는 재정렬을 포함한다. 일례로 하나의 PIV 유전자의 시스-작용 조절 서열은 상이한 PIV에서 동일 유전자의 상응 시스-작용 조절 서열 또는 상이한 PIV 유전자의 시스-작용 조절 서열일 수 있는 이형 조절 작용 서열에 상응하도록 변형된다. 예를 들어, 유전자 종결 신호는 전환 또는 치환에 의해 동일한 PIV 균주에서 상이한 유전자의 유전자 종결 신호로 변이될 수 있다. 다른 실시태양에서, 뉴클레오티드 변이는, 예를 들어, 단백질의 선택된 형태에 대한 번역 개시 부위의 제거를 위하여, 재조합 게놈 또는 안티게놈 내에서 번역 개시 부 위의 삽입, 결실, 치환 또는 재정렬을 포함할 수 있다.
또한, 다양한 다른 유전적 변경은, 단독 또는 유전적으로 유도된 돌연변이체 PIV로부터 채택된 1 이상의 약독화 돌연변이와 함께, C, D 및(또는) V의 결실 또는 넉아웃을 갖는 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 비 PIV 근원으로부터의 유전자 또는 게놈 세그먼트는 전체적 또는 부분적으로 삽입될 수 있다. 별법으로, 유전자의 순서는 변형될 수 있고, PIV 대응 프로모터는 그의 대응하는 안티게놈으로 치환될 수 있다. 재조합 게놈 또는 안티게놈에서의 상이적 또는 추가적 변이는 다양한 유전자간 영역에서 단일 제한 부위의 삽입과 같은 조작을 촉진하도록 만들어질 수 있다. 번역되지 않은 유전자 서열은 외래 서열에 대한 용량을 증가시키기 위하여 제거될 수 있다.
또한 추가적 측면에서, 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터는 비PIV 서열(예를 들어, 의도된 숙주에서 방어적 면역 반응을 유발할 수 있는 시토킨, T 헬퍼 에피토프(epitope), 제한 부위 마커 또는 미생물의 병원체(예를 들어, 바이러스, 박테리아 또는 균류))를 코딩하도록 변이될 수 있다. 이러한 일 실시태양에서, 호흡 기도성 합포체 바이러스(RSV)로부터의 유전자 또는 게놈 세그먼트 (예를 들어, RSV의 항원 단백질(예를 들어 F 또는 G 단백질)을 코딩하는 유전자, 면역원성 도메인 또는 에피토프)를 함입하는 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체가 구성된다.
본 발명과 관련된 측면에서, C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이를 포함하는 단리된 감염성 재조합 PIV의 생산을 위한 조성을(예를들어, PIV-코딩 cDNA를 함입하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 벡터) 및 방법이 제공된다. C, D 및(또는) V ORF의 부분 또는 전부 제거 또는 그의 발현을 감소 또는 제거하는 1 이상의 뉴클레오티드 변형에 의하여 변이된 PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 이러한 분자를 함입하는 신규하고 단리된 폴리뉴클레오티드 분자 및 벡터가, 본 발명의 이러한 측면에 포함된다. 또한 N, P, L 단백질을 코딩하는 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 동일 또는 상이한 발현 벡터가 제공된다. 이들 단백질은 또한 게놈 또는 안티게놈 cDNA로부터 직접 발현될 수 있다. 벡터(들)은 바람직하게는 세포 또는 무세포 용균물(lysate)에서 발현 또는 공동발현됨으로써 감염성 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV 입자 또는 서브바이러스 입자를 생산한다.
C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV를 생산하는 상기 방법 및 조성물은 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자 또는 그의 유도체를 수득한다. 감염성 바이러스는 진정한 PIV 바이러스 입자에 필적하며, 그 정도의 감염성이 있다. 그것은 직접적으로 신선한 세포(fresh cell)를 직접 감염시킬 수 있다. 감염성 서브바이러스 입자는 전형적으로 적당한 조건하에서 감염을 개시할 수 있는 바이러스 입자의 하위 요소이다. 예를 들어, 게놈 또는 안티게놈의 RNA 및 N, P, L 단백질을 포함하는 뉴클레오캡시드는 세포의 세포질에 주입되면 감염을 개시할 수 있는 서브바이러스 입자의 예이다. 본 발명에서 제공되는 서브바이러스 입자는 1 이상의 단백질(들), 단백질 세그먼트(들), 또는 다른 바이러스 성분(들)이 결실된 바이러스 입자를 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기한 바와 같이, C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 PIV의 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터(동일 또는 상이한 벡터)를 포함하는 세포 또는 무세포 용균물(lysate)을 제공한다. 또한, 1 이상의 이들 단백질은 게놈 또는 안티게놈 cDNA으로부터 발현될 수 있다. 발현 중에, 게놈 또는 안티게놈 및 N, P 및 L은 감염성 PIV 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 생산하기 위하여 결합한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이를 갖는 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 PIV의 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터를 함입하는 세포 또는 무세포 발현 시스템(예를 들어 무세포 용균물)이 제공된다. 발현 중에, 게놈 또는 안티게놈 및 N, P, 및 L 단백질은 바이러스 또는 서브 바이러스 입자와 같은 감염성 PIV 입자를 생산하기 위해서 결합된다.
본 발명의 재조합 PIV는, PIV에 감염되기 쉬운 숙주에서 PIV에 대한 목적한 면역 반응을 발생시키기 위한 다양한 조성물로서 유용하다. 본 발명의 약독화된 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체는 감염된 포유류 숙주세포에서 방어적 면역 반응을 유발할 수 있지만, 면역화된 숙주의 심각한 호흡 기도 질환이라는 바람직하지 않은 증상을 야기하지 않기 위해서 충분히 약독화되어야 한다. 약독화 된 바이러스 또는 서브바이러스 입자는 세포 배양 청정액에서 존재하거나, 배지로부터 단리되거나, 또는 부분적 또는 전체적으로 정제될 수 있다. 바이러스는 또한 동결 건조될 수 있고, 목적하는 바와 같이 숙주로 저장 또는 전달을 위해 다양한 다른 성분과 결합할 수 있다.
본 발명은, 나아가 생리학적으로 수용되는 담체 및(또는) 애쥬번트 및 단리된 약독화 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV 입자 또는 서브바이러스 입자를 포함하는 신규한 백신을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 약독화 및 면역원성의 적절한 균형을 달성하기 위하여, 상기한 바와 같이 1 이상 및 바람직하게는 2 이상의 추가적 돌연변이 또는 다른 뉴클레오티드 변이를 갖는 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV를 포함한다. 백신은 103 내지 107PFU 양의 약독화된 바이러스로 제형화될 수 있다. 백신은 단일 PIV 균주 또는 다수의 PIV 균주에 대해 면역 반응을 유발하는 약독화된 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 바이러스를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV는 백신 제형에서 다른 PIV 백신 균주 또는 RSV와 같은 다른 바이러스 백신 균주와 결합될 수 있다.
관련 측면에서, 본 발명은 포유류 대상에서 PIV에 대한 면역반응을 유발하기 위하여 개체의 면역계를 강화하는 방법을 제공한다. 이 방법은 생리학적으로 허용되는 담체 및(또는) 애쥬번트 균주 내의 면역학적으로 충분한 양의 약독화된 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체의 제형을 투여하는 것을 포함한다. 일 실시태양에서, 상기한 바와 같은 면역원성 조성물은, 목적하는 표현형을 특정하는 1 이상, 바람직하게는 2 이상의 약독화 돌연변이 또는 다른 뉴클레오티드의 변이를 갖는 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV를 포함하는 백신이다. 백신은 103 내지 107 PFU의 양의 약독화된 바이러스로 제형화될 수 있다. 백신은 단일 PIV, 다수의 PIV, 예를 들어, HPIV1 및 HPIV3 또는 1 이상의 PIV(들) 및 RSV와 같은 비PIV 병원체에 대한 면역 반응을 유발하는 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV 바이러스를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV는 다수의 PIV, 또는 1 이상의 PIV 및 RSV와 같은 비PIV에 대한 단일 특이적 또는 다중 특이적 면역반응을 유발할 수 있다. 별법으로, 상이한 면역원성 특성을 갖는 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV는 하나의 PIV, 다수개의 PIV들, 또는 1 이상의 PIV(들) 및 RSV와 같은 비PIV 병원체에 대한 더욱 효과적인 방어를 유발하기 위하여 백신 혼합물에 혼합되거나, 코디네이트된(coordinated) 처리 프로토콜에 개별적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 면역원성 조성물은 예를 들어 분무, 소적 또는 에어로졸에 의해 상부 호흡 기도에 투여된다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 HPIV3 P/C/D/V ORF의 구성을 도시한다. P mRNA의 3 개의 판독틀은 직사각형으로 표시된 P, C, D 및 V ORF와 함께 (+1, +2 및 +3) 나타난다. 아미노산의 길이가 표시되어 있다. RNA 에디팅 부위의 위치는 수직선으로 나타나고 그 서열 모티브(motif)는 전체 HPIV3 안티게놈의 서열에서 그 뉴클레오티드 위치에 따라 나타내었고, 번호를 붙였다. 도 1-A는 에디팅되지 않은 P mRNA의 구성을 나타낸다. P 및 C ORF의 번역 개시 부위를 포함하는 서열이 보여지며 전체 안티게놈 서열에 따라 번호를 붙였다. JS 야생형 클론의 전체 안티게놈 서열 내의 P, C, D 및 V ORF의 뉴클레오티드 위치는 다음과 같다: P, 1784-3595; C, 1794-2393; D, 2442-2903; V, 2792-3066. P mRNA에 관련하여 P ORF를 개방하는 AUG는 80-82 위치에 있다. 이는 틀 +2의 P ORF의 상류 말단이 틀 +3의 D ORF와 융합되도록 개방 레지스터를 변형한다. 그 생성된 키메라 단백질은 D ORF에 의해 코딩된 C 말단 131개의 아미노산과 융합되는 N 말단 241 개의 아미노산을 포함한다. 도 1-C는 도1-B로부터 P mRNA의 에디팅된 변이에서 나타나는 C, D, V ORF를 방해하는 예시적 돌연변이의 위치를 나타낸다. 도입된 정지 코돈은 직사각형 내의 수직선으로 나타내었다. C ORF는 코돈 1의 M을 T로 변환하고 정지 코돈을 생성하는 코돈 7 및 26을 변환하도록 변이되었다. D ORF는 D의 C-말단 131 개의 아미노산과 융합되는 P의 N-말단 241 개의 아미노산을 포함하는 372 개의 아미노산 키메라 D 단백질에 따라 번호 붙여진 코돈 304, 305 및 306에서 정지 코돈을 도입하도록 변이되었다. V ORF는 코돈 17 및 20에서 정지 코돈을 도입하도록 변이되었다. 이들 나중의 2개의 돌연변이는 D ORF의 코돈 354 및 357에서 아미노산 치환을 가져온다(별표(*)).
도 2는 C 단백질의 발현이 바이러스 rC-KO에서 제거되었음을 예시하는 방사 면역 침강 분석을 제공한다. 선 (a) :35S-라벨 세포 여액은 다중 클론성 C-이적 토 끼 항혈청으로 방사 면역 침강을 시켰다. C 단백질에 상응하는 22 kD 밴드(개방화살표)는 rJS에 명백히 존재하지만, rC-KO의 선 (a)에서는 존재하지 않는다. 선 (b): 세포 여액은 HPIV3 HN 단백질에 특이적인 2 개의 단일 클론성 항체의 혼합물에 의해 방사 면역 침전시켰다. HN 단백질에 상응하는 64 kD 밴드(폐쇄 화살표)는 바이러스 여액 모두에서 존재하고 이들이 진정한 HPIV3이고 유사 수준의 단백질을 발현하는 점을 확인한다.
도 3은 부모형 바이러스 rJS와 비교되는 예시적 넉아웃 돌연변이체 rC-KO 및 rDV-KO의 여러 주기 복제의 결과를 나타낸다. 바이러스 역가는 TCID50/ml로서 나타내고 복제 샘플들의 평균값이다.
본 발명은 신규한 PIV 백신 후보의 집합을 수득하는 1 이상의 C, D 및(또는) V ORF의 발현이 감소 또는 제거되는 재조합 PIV를 제공한다. C, D 및(또는) V ORF의 발현은 C ORF의 개시 코돈 또는 C, D 및(또는) V ORF에서 1 이상 코돈을 변환시키는 돌연변이를 함입하는 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈을 변이함에 의해서 감소 또는 제거된다. C, D 및(또는) V 발현 또는 약독화된 PIV 백신 후보들을 생성하는 상응 단백질의 발현 또는 기능의 방해를 달성하려는 다른 변경은, 전체적으로 또는 부분적으로, C, D 및(또는) V 단백질을 부분 또는 전부 비기능적이 되도록 하거나 또는, 그의 발현을 종결시키도록 하는, C, D 및(또는) V 코딩 서열의 부분 또는 전부 결실을 포함한다.
HPIV3은 모노네가비랄레 (Mononegavirales) 목 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)과 레스피로비루스(Respirovirus)속의 멤버이다. 그 게놈은 (-) 센스 RNA 15462 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 단일 가닥이다 (Galinski et al., Virology 165: 499510, (1988); Stokes et al., Virus Res. 25: 91-103 (1992) 각각은 본원에 인용참증으로 삽입되었음). 8개 이상의 단백질은 PIV3에 의해 코딩된다: 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 비구조적인 단백질 C, D 단백질, 매트릭스 단백질 M , 융합 당단백질 F, 혈구 응집소 뉴라미니다아제 당단백질 HN, 거대 중합효소 단백질 L(Collins et al., p. 1205-1243. In B. N. Fields (Knipe et al., eds), Fields Virology, 3rd ed, vol. 1. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
M, HN, 및 F 단백질들은 외피-연결되었으며 나중의 2개의 단백질은 각각의 PIV의 경우와 같이, 표면 당단백질로, 주요 중화 및 방어적 항원이다(Collins et al., 3rd ed. In"Fields Virology" (B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, and S. E. Straus, Eds.), Vol. 1, pp. 1205-1243. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996). PIV들 중 필적하는 PIV HN 또는 F 단백질 간의 중요한 서열 분기는 방어적 면역의 유형 특이성의 기초가 되는 것으로 생각된다(B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R.M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, and S. E. Straus, Eds.), Vol. 1, pp.1205-1243. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996; Cook et al.,. Amer Jour Hyg 77: 150-159,1963; Ray et al., J Infect Dis 162: 746-9,1990).
HPIV3 유전자들은 4 개의 ORF들, 즉, P, C, D 및 V를 함유한 P mRNA를 제외하고는 각각 단일 단백질을 코딩하는 단일 mRNA로 전사된다(도1)(Galinski et al., Virology 186: 543-550,1992; Spriggs et al., J. Gen Virol. 67: 2705-2719,1986각각은 본원에 인용참증으로 삽입되었다). P 및 C 단백질은 mRNA 내의 별개의 중첩하는 ORF로부터 번역된다(도1). 반면, 모든 파라믹소바이러스는 1 개의 P 단백질을 코딩하고 레스피바이러스 및 모르빌리바이러스 속의 멤버만이 C 단백질을 코딩한다. 개개의 바이러스는 C ORF로부터 발현되는 단백질의 수 및 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)의 바이러스 복제에서의 그 중요성에서 다르다. 센다이 바이러스(SeV)는 그 번역 개시 부위가 mRNA에서 그 순서로 나타나는, C ORF: C',C, Y1, 및 Y2로부터의 4 개의 독립적으로 개시되는 단백질을 발현하는 반면(Curran, et al., Enzyme 44: 2449,1990; Lamb et al., p. 181-214. In D. Kingsbury (ed.), The Paramyxoviruses. Plenum Press, New York, 1991, 본원에 인용참증으로 삽입되었음), HPIV3 및 홍역 바이러스(MeV)는 단일 C 단백질만을 발현한다(Bellini et al., J Virol. 53: 908-19,1985; Sanchez et al., Virology 147: 177-86,1985; Spriggs et al., J Gen Virol. 67: 2705-2719,1986, 각각이 본원에 인용참증으로 삽입되었음).
4 개의 모든 C-유도된 단백질이 제거되는 살아 있는 재조합 SeV는 시험관내에서 비능률적으로 복제되는 반면(Kurotani et al., Genes Cells. 3: 111-124,1998), 개개의 C 단백질의 제거는 복잡한 효과를 갖는다(Cadd et al., J Virol.70: 5067-74,1996; Curran, et al., Virology 189: 647-56,1992; Latorre et al., J Virol. 72: 5984-93,1998). C 단백질의 170번 아미노산 위치에서 페닐알라닌(F)에서 세린(S)으로 치환을 가져오는 단일 점 돌연변이를 겪는 재조합 바이러스 SeV는 쥐에서 약독화되지만, 세포 배양에서의 그 복제는 약화되지 않았다(Garcin et al.,Virology 238: 424-431,1997; Itoh et al., J Gen Virol. 78: 3207-15,1997). SeV와 대조적으로 C-마이너스 홍역 바이러스(MV)는 베로(Vero) 세포에서 효율적으로 복제된다(Radecke et al., Virology 217: 418-21,1996). 사람 말초혈 세포에서 복제의 제한이 나타나고 생체내에서 어느 정도 약독화되었다고 보임에도 불구하고 그러하다(Escoffier et al., J Virol. 73: 1695-8,1999; Valsamakis et al., J Virol. 72: 7754-61, 1998).
P 및 C ORF 이외에, PIV3의 P mRNA는 2 개의 다른 ORF 즉, D 및 V 를 갖는다. P 및 D ORF의 융합 단백질인 PIV3 D 단백질은 전사적인 에디팅 또는 RNA 에디팅 과정을 거쳐 P 유전자로부터 발현된다. 그곳에서 2 개의 비주형 G 잔기가 RNA 에디팅 부위의 P mRNA에 추가된다(도1)(Galinski et al., Virology 186: 543-550,1992; Pelet et al., Embo J. 10: 443-8, 1991). BPIV3은 D 단백질을 발현하는 오직 다른 파라믹소바이러스(paramyxovirus)이고 그것도 동일한 메커니즘에 의한다.
레스피로바이러스(Respirovirus), 루불라바이러스(Rubulavirus) 및 모빌리바이러스(Morbillivirus)의 거의 모든 멤버는 V 단백질을 발현한다. 명백히 그렇지않은 하나의 멤버가 본래 V ORF가 없는 HPIV1이다(Matsuoka et al., J Virol. 65: 3406-10,1991, 본원에 인용참증으로 삽입되었음). V ORF는 매우 보존적인 시스테 인이 풍부한 도메인에 의해서 특성화된다(Cattaneo et al., Cell 56: 759-64,1989; Park et al., J Virol 66: 7033-9,1992; Thomas et al., Cell 54: 891-902,1988; Vidal et al., J Virol 64: 239-46, 1990, 각각은 본원에 인용참증으로 인용되었다.). V ORF는, 오늘날 이 ORF가 발현되고 이 바이러스에 대한 기능을 보유함을 암시하는 각각의 HPIV3 바이러스 내에서 유지된다(Galinski et al., Virology 155: 46-60,1986; Spriggs et al., J Gen Virol 67: 2705-2719,1986; Stokes et al., Virus Res 25: 91-103,1992).
BPIV3 V 단백질은 하나의 비주형 G 잔기가 RNA 에디팅 부위에 추가되었을 때 발현된다(Pelet et al., Embo J 10: 443-8,1991, 본원에 인용참증으로 삽입되었음). 그러나, HPIV3의 경우에 2 내지 4 개의 번역 정지 코돈은 에디팅 부위 및 V ORF 간에 놓여있고, HPIV3이 ORF가 발현되지 않는 다른 예에서 나타나는지 또는 어떤 다른 메커니즘을 통해 발현되는지는 확실하지 않다. 이는 세포 배양에서는 발생하는 것처럼 보이지 않는다고 하더라도 하나의 가능성은 HPIV3 에디팅도 P 유전자에 제2 하류 부위에서 일어난다는 것이다(Galinski et al., Virologv 186: 543-550,1992, 각각은 본원에 인용참증으로 삽입되었음). 별법으로, 그것은 리보좀이 리보좀의 프레임쉬프트에 의해 V ORF에 접근하는 것일 수도 있다. 이는 MV의 P 유전자좌에서의 상황과 유사할 것이다. MV는 C, P, 및 V 단백질을 발현하지만, 또한 P ORF에서 V ORF로의 프레임시프트에 의해 합성되는 신규한 R 단백질도 발현한다(Liston e tal., J. Virol. 69:6742-50, 1995, 본원에 인용문헌으로 삽입되었음).
HPIV3가 그 V 단백질을 발현하는 방법은 명확하지 않지만, 상이한 균주 중에서의 그 V ORF의 극도의 보존은 이것이 실제로 발현된다는 것을 제시한다. V 단백질의 기능은 잘 정의되지 않았으나, 회수된 V-마이너스 MV 및 SeV 재조합체는 시험관내에서는 효율적으로 복제하지만, 생체내에서는 감소된 복제를 나타낸다 (Delenda, et al., Virology 228:55-62, 1997; Delenda et al.,Virology 242:327-37, 1998; Kato et al., Embo J. 16:578-587, 1997; Kato et al., J. Virol. 71:7266-7272, 1997; Valsamakis et al., J. Virol. 72:7754-61, 1998).
또한, PIV의 바이러스 게놈은 바이러스 복제 및 전사에 필요한 프로모터를 갖는 유전자외 리더 및 트레일러 영역을 포함한다. 따라서, PIV 유전자 맵은 3'-리더-N/P/C/D/V-M-F-HN-L-5' 트레일러로 나타난다. 전사는 3' 말단에서 시작하고, 유전자 경계에서 발견되는 짧은 보존된 모티브에 의해 지시되는 순차적인 정지-개시 기작에 의해 진행한다. 각각의 유전자의 상류 말단은 유전자-개시 (GS) 시그날을 함유하며, 이는 각각의 mRNA 개시를 지시한다. 각각의 유전자의 하부 말단은 폴리아데닐화 및 종결을 지시하는 유전자-말단(GE) 모티브를 함유한다. 예시적인 서열들이 사람 PIV3 균주 JS(진뱅크 접수 번호 Z11575, 본원에 인용문헌으로 삽입됨) 및 워싱턴((Galinski M. S., The Paramyxoviruses, Kingsbury, D. W., ed., pp. 537-568, Plenum Press, New York, 1991, 본원에 인용문헌으로 삽입됨), 및 소 PIV3 균주 910N(진뱅크 접수 번호 D80487, 본원에 인용문헌으로 삽입됨)에 대해 기술되었다.
본원에서 사용된, "PIV 유전자"란 mRNA를 코딩하고 일반적으로 유전자 개시(GS) 시그날로 상류부에서 시작하고 유전자 종결(GE) 시그날로 하류부에서 종결하는 PIV 게놈의 일부를 일반적으로 말한다. 또한 PIV 유전자란 용어는 "번역 개방 판독틀", 또는 ORF란 용어와 교환될 수 있다. 유전자에 추가하여, PIV의 바이러스 게놈은 또한 비코딩, 유전자간 서열, 및 바이러스 복제 및 전사에 요구되는 프로모터를 갖는 유전자외 리더 및 트레일러 영역을 포함한다. PIV 유전자 맵은 3'-리더-N/P/C/D/V-M-F-HN-L-5' 트레일러로 나타난다. 전사는 3' 말단에서 시작하고, 유전자 경계에서 발견되는 짧은 보존된 모티브에 의해 지시되는 순차적인 정지-개시 기작에 의해 진행한다. 본 발명의 C, D, 및(또는) V 결실 돌연변이체를 구성하기 위해, 1 이상의 PIV 유전자(들)이 전체적으로 또는 부분적으로 결실될 수 있다. 이는 부분 또는 전체 결실이 모든 1 이상의 PIV 유전자의 개방 판독틀 및(또는) 시스-작용 조절 서열에서 만들어질 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 게놈 세그먼트"란 PIV 게놈으로부터의 연속적인 뉴클레오티드의 어떤 한 길이를 의미하고, 이는 ORF, 유전자 또는 유전자외 영역 또는 이들의 조합 중 일부일 수 있다.
본 발명의 C, D 및(또는) V 돌연변이체를 구성하기 위한 다른 방법은 PIV 게놈의 상당 부분을 결실시키지 않고 유전자 발현을 감소시키거나 또는 제거하기 위한 "넉아웃" 바이러스의 생산을 필요로 한다. 특히, 정지 코돈의 도입, RNA 에티딩 부위에서의 돌연변이, 개시 코돈에 의해 특정되는 아미노산을 변경하는 돌연변이, 또는 표적 ORF 중의 프레임시프트 돌연변이에 의해 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈을 변이시킴으로써 C, D 및(또는) V ORF의 발현은 바람직하게는 감소되거나 또는 제거된다. 일 실시태양에서, 에디팅을 방해하고 RNA 에디팅에 의해 mRNA가 생 성되는 단백질의 발현을 제거하는 돌연변이가 에디팅 부위에서 만들어질 수 있다(Kato et al., EMBO 16:578-587, 1997 및 Scnneider et al., Virology 227:314-322. 1997, 본원에 인용 문헌으로 삽입되었음).
본 발명의 다른 일면에서, PIV 게놈 또는 안티게놈은 C, D 및(또는) V ORF 중에 1 이상의 정지 코돈을 생성하기 위해 돌연변이 유발 처리된다. 일 실시예에서, 메티오닌 개시 코돈은 C ORF에서 트레오닌으로 변화된다. 다른 실시예에서, 두 개의 정지 코돈은 C ORF의 7번 및 26번 위치에 상응하는 정지 코돈을 도입하는 게놈 또는 안티게놈 중의 뉴클레오티드 1795번(nt) (T 에서 C로 변화함) 및 nt 1813번(C에서 A로 변화함)에서의 돌연변이에 의해 도입된다. 이는 rC-KO로 명명된 C 넉아웃 돌연변이체 바이러스를 생성한다. 본 발명을 예시하는 3개의 다른 돌연변이체 바이러스에서, D 및 V ORF들은 단독으로 또는 함께 중단되었다. rD-KO로 명명된 단일 D 넉아웃 돌연변이체에서, D ORF의 발현을 중단시키는 돌연변이가 도입되었으며, 이는 전장 안티게놈의 2692번, 2695번, 및 2698번 nt 위치에서 C에서 A로의 변화를 도입한다. 이들 점 돌연변이는 추정 D ORF 중에서 3개의 연속된 정지 코돈을 생성하고, 이는 372개 아미노산의 키메라 D 단백질 내에서 303번 코돈 다음에서 D 단백질의 조기 종결을 일으킨다. 다른 상세한 일면에서, 단일 V 넉아웃 돌연변이체, rV-KO는 전장 안티게놈의 2845번(A에서 T로) 및 2854번(C에서 T로) nt 위치에서 두 개의 점 돌연변이를 도입하여 구성되었다. 이들 돌연변이는 추정 V ORF 중에서 정지 코돈(aa 위치 17번 및 20번)을 조기에 생성하였다. rD-KO 및 rV-KO 중의 변화는 조합 DV 넉아웃 돌연변이체, rDV-KO를 생성하기 위해 단일 클론 중에 총체적으로 도입되었다.
앞서 언급한 바와 같이, C, D 및(또는) V ORF에 있어서 1 이상의 돌연변이를 갖는 본 발명의 재조합 PIV는 백신 개발을 위한 매우 바람직한 표현형적 특성을 가지고 있다. C, D 및(또는) V ORF를 전체적 또는 부분적으로 결실시키거나, 또는 C, D 및(또는) V ORF의 발현을 감소 또는 제거하는 본원에서 기술된 변형은, 생산된 바이러스 또는 서브바이러스의 입자에서 바람직한 표현형적 변형의 범위를 특정한다. 바람직한 실시태양에서, C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체는 대응하는 야생형 또는 돌연변이체의 부모형 PIV 균주에 비해 약독화된 바이러스 성장을 나타낸다. 예를 들어, 세포 배양에 있어서의 성장은 대응하는 야생형 또는 돌연변이체의 부모형 PIV 균주에 비교하여 약 2 배, 흔히 약 5 배, 바람직하게는 10 배 이상 감소된다(예를 들어, 배양 7일 경과 후 측정되었을 때). 더욱 상세한 측면에서, 본 발명의 재조합 PIV는 변경된 바이러스 성장의 키네틱을 보인다.
C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이를 포함하는 재조합 백신 바이러스는 생체내에서 약독화 표현형를 보인다. 예를 들어, 햄스터 및 아프리카 녹색 원숭이(AGM)와 같이 인간에 있어서 PIV 복제를 위해 채택된 동물 모델에서 상부 및(또는) 하부 호흡 기도에서의 복제는, 대응하는 야생형 또는 돌연변이체 부모형 PIV 균주에 비하여 약 2 배, 흔히 약 5 배, 10 배, 또는 20 배, 바람직하게는 약 100 내지 1,000 배 이상 감소된다(예를 들어, 감염 후 3일 내지 8일 동안 계속하여 측정되었을 때). 상기한 약독화 표현형에 추가 또는 결합하여, C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이를 포함하는 재조합 PIV는 또한 바이러스 플라크 크기의 변화, 세포 독성 효과의 변화 및(또는) 면역원성에 있어서의 변화를 보여줄 수 있다.
본 발명의 재조합 백신 바이러스의 특히 바람직한 특성은, 상기한 바와 같이 약독화되었음에도 여전히 감염성을 보이며, 면역 접종된 숙주에서 목적하는 수준의 항 PIV 면역 반응성을 유발한다는 점이다. 특히, 본 발명의 후보 백신 재조합체는 충분한 면역원성을 보임으로써 이후 야생형 바이러스에 의한 감염에 대해 방어적 면역 반응을 유발한다. 본원 실시예에서 설명하는 바와 같이, C, D 및(또는) V 넉아웃 돌연변이 바이러스에 의한 감염은 햄스터 및 AGM 모두에서 HPIV3에 대한 상당한 HAI 항체 반응을 유도하였으며, 이는 이러한 예시적 재조합체가 방어성이 있고, 따라서 유용한 백신 후보가 될 수 있다는 점을 나타낸다. 본 발명의 다른 바람직한 백신 재조합체 내에서, 면역원성 활성은 유용한 백신 후보를 얻기 위하여 약독화 수준과 균형을 이룰 것이고, 통상적으로 모델인 숙주 (예를 들어, 햄스터 및 비인간 영장류)의 하부 및(또는) 상부 호흡 기도에서 감염 바이러스, 예를 들어 rJS HPIV3의 복제를 약 50-100 배, 100-500 배, 바람직하게는 약 500-2,000 배 및 3000 배 이상 (예를 들어, 감염 후 3-8일 사이에 측정된 것)으로 감소한 것에 의해 표지될 것이다. 따라서, 본 발명의 재조합 백신 바이러스는 복제 및 성장에 있어서는 동시에 감소를 보이는 반면, 면역원성은 유지한다. 이러한 놀라운 표현형 특색의 집합은 백신 개발을 위하여 매우 요구된다.
본 발명은 C, D 및(또는) V ORF 결실 또는 넉아웃 돌연변이를 함입하는 약독화된 생 PIV 백신 후보의 개발을 제공한다. 이러한 재조합 바이러스들은 cDNA 중간체 및 cDNA-기초 회수 시스템을 통하여 구성된다. cDNA로부터 만들어진 재조합 바이러스들은 그것들이 생물학적으로 유도된 것처럼 개별적으로 복제하고 같은 방법으로 전파된다. C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체는 목적하는 구조적 또는 표현형적 효과를 수득하기 위하여, 다양한 다른 돌연변이 및 뉴클레오티드 변이는 물론 특이적 약독화 돌연변이를 함입하기 위하여 추가적으로 변이될 수 있다. cDNA로부터 재조합 PIV를 생산하고, 본 발명의 추가적 일면으로서 본원에 서술된, 전 범위의 돌연변이 및 뉴클레오티드 변이를 만들고 시험하기 위한 재료 및 방법에 대한 상세한 서술은, 예를 들어 Durbin et al., Virology 235: 323-332,1997; 1998년 5월 22일자로 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제09/083,793호; 1997년 5월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/047,575호 (국제 공개 번호 제 WO98/53078호에 대응함) 및 1997년 9월 19일자로 출원된 미국 가특허 출원번호 제60/059,385호에 제공되어 있고, 각각은 본원에 인용참증으로 삽입되었다. 특히, 이러한 문헌들은 약독화된 돌연변이체 균주 (예를 들어, 온도 민감성(ts), 저온 계대 배양된(cp), 저온 적응된(ca), 작은 플라크(sp) 및 숙주 범위 제한된(hr) 돌연변이체 균주)를 얻기 위하여 PIV를 돌연변이 유도, 단리 및 동정하고, 약독화된 표현형을 특정하는 유전적 변형을 확인하는 방법 및 과정을 기재한다.
이러한 방법들과 함께, 전술한 문헌들은 쥐 및 비인간 영장류 모델 시스템을 포함하는 인증된 모델 시스템에서의 생물학적으로 유도되고 재조합적으로 생산된 약독화된 사람 PIV의 복제, 면역원성, 유전적 안정성 및 방어능을 결정하는 과정을 기재한다. 또한, 이 문헌들은 PIV 감염의 예방 및 치료를 위한 일가 및 이가 백신 을 포함하는 면역원성 조성물을 개발하고 시험하는 일반적인 방법을 기재한다. 상기 삽입된 문헌들에는 또한 필수 PIV 단백질과 공동발현되는 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA의 구성 및 발현에 의해 감염성 재조합 PIV를 생산하는 방법이 기재되어 있고, 감염성 PIV 바이러스 클론을 생산하기 위하여 사용될 수 있는 다음에 예시하는 플라스미드에 관한 기재를 포함한다: p3/7 (131) (ATCC 97990); p3/7 (131) 2G (ATCC 97889); 및 p218 (131) (ATCC 97991); 각각은 부다페스트 협약 규정 하에서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 버지니아 20110-2209, 매나사스, 유니버시티 블루바드 10801)에 기탁되어 있으며 상기에서 확인된 기탁 번호가 부여되었다.
또한, 상기에 삽입된 문헌들에는 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체, 예를 들어 저온 계대 배양된(cp), 저온 적응된(ca), 숙주 범위 제한된(hr), 작은 플라크(sp), 및(또는) 온도 민감성(ts) 돌연변이체 (예를 들어 JS HPIV3 cp 45 돌연변이체 균주)에서 확인되는 표현형 특이적 돌연변이를 함입하도록 변형된 감염성 재조합 PIV를 구성 및 평가는 방법이 개시되어 있다. 이러한 돌연변이체에서 확인되는 돌연변이는 C, D, 및(또는) V 넉아웃 돌연변이(들)를 포함하는 재조합 PIV에 용이하게 채택될 수 있다. 예시적 실시태양에서, 1 이상의 약독화된 돌연변이는 중합효소 L 단백질 중의, 예를 들면 JS cp45의 Thrl558, Tyr942, Leu992에 상응하는 위치에서 발생한다. 바람직하게는, 이러한 돌연변이는 생물학적 돌연변이체에서 확인되는 것과 같은 동일 또는 보존적 아미노산 치환에 의하여 본 발명의 재조합 PIV에 함입된다. 따라서, PIV 재조합체는 Tyr942가 His로 치환되고, Leu992가 Phe로 치환되고(되거나) Thrl558이 Ile로 치환되는 돌연변이를 함입할 수 있다. 이러한 치환 아미노산에 대한 보존적 치환은 목적하는 돌연변이 표현형을 얻는 데에도 유용하다.
생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터 채택된 다른 예시적 돌연변이는 N 단백질에서의 1 이상의 돌연변이를 포함고, JS cp45의 Val96 또는 Ser389 잔기에 상응하는 위치에서의 특이적 돌연변이를 포함한다. 더욱 상세한 측면에서, 이러한 돌연변이는 Ala에 대한 Val96, 또는 Ala에 대한 Ser389, 또는 이에 대해 보존적 치환으로 표현된다. 본 발명의 재조합 PIV 중에서 또한 유용한 것은 C 단백질에서의 아미노산 치환, 예를 들어 JS cp45의 Ile96에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 Thr에 대한 Ile96의 동일 또는 보존적 치환으로 표현된다. 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변체이로부터 채택된 다른 예시적 돌연변이는 1 이상의 F 단백질에서의 돌연변이를 포함하고, JS cp45로부터 채택되고 JS cp45의 Ile420 또는 Ala450 잔기에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는 Val에 대하여 Ile420, Thr에 대하여 Ala450, 또는 그에 대한 보존적인 치환으로 표현된다. 본 발명 중에서 다른 PIV 재조합체는 HN 단백질에서의 1 이상의 아미노산 치환을 채택하는데, 이하에는 바람직하게는 Ala에 대한 Val384의 치환으로 표현되는, JS cp45의 Val384 잔기에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 채택하는 재조합 PIV가 예시된다.
본 발명의 이러한 측면에서의 또 다른 예에는 PIV 게놈 또는 안티게놈의 비코딩 부분, 예를 들어 3' 리더 서열에서의 1 이상의 돌연변이를 함입하는 재조합 PIV를 포함한다. 이와 관련된 예시적인 돌연변이는 JS cp45의 뉴클레오티드 23번, 24번, 28번 또는 45번에 상응하는 위치에서 재조합 바이러스의 3' 리더에서의 위치에서 엔지니어링될 수 있다. 또 다른 예시적인 돌연변이는 N 유전자 개시 서열에서 엔지니어링될 수 있는데, 예를 들어 N 유전자 개시 서열 중의, 예를 들어 JS cp45의 뉴클레오티드 62번에 상응하는 위치에서, 1 이상의 뉴클레오티드를 변형시켜 엔지니어링될 수 있다. 더욱 상세한 측면에서는, C, D 및(또는) V 넉아웃 돌연변이체는 뉴클레오티드 23번에서의 T에서 C로의 변형, 뉴클레오티드 24번에서의 C에서 T로의 변형, 뉴클레오티드 28번에서의 G에서 T로의 변형, 및(또는) 뉴클레오티드 45번에서의 T에서 A로의 변형을 함입한다. 유전자외 서열에서의 추가적인 돌연변이는 JS의 뉴클레오티드 62번에 상응하는 위치에서의 N 유전자 개시 서열에서 A에서 T로의 변형으로 예시될 수 있다.
C, D 및(또는) V 넉아웃 돌연변이체에서 엔지니어링될 수 있는 상기 이러한 예시적 돌연변이는 재조합 PIV - rcp45, rcp45 L, rcp45 F, rcp45 M, rcp45 HN, rcp45 C, rcp45 F, rcp45 3'N, 3'NL 및 rcp45 3'NCMFHN (Durbin et al., Virology 235: 323-332,1997; Skiadopoulos et al., J Virol 72: 1762-8; 1997년 5월 23일자로 출원된 미국 가특허출원 제60/047,575호 (국제 공개 번호 제 WO 98/53078호에 대응), 1997년 9월 19일자로 출원된 미국 가특허출원 제60/059,385호, 각각은 본원에 인용참증으로 삽입됨)로 명명된 재조합 PIV 클론에 의해 표현됨 - 에서 성공적으로 엔지니어링되고 회수되었다.
JS cp45와 다른 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터, 거대 "메뉴"의 약독화된 돌연변이체가 제공되고, 각각의 돌연변이는 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이(들)를 갖는 재조합 PIV에서의 약독화, 면역원성 및 유전적 안정성의 수준을 조절하기 위하여 다른 돌연변이(들)과 조합될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 많은 재조합 PIV는 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터의 1 이상의, 바람직하게는 2 이상의 돌연변이, 예를 들어 JS cp45에서 확인되는 단독 또는 결합된 돌연변이를 포함한다. 본 발명 중에서 바람직한 PIV 재조합체는 JS cp45 또는 다른 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV 균주에 존재하는 다수 내지 충분한 수의 돌연변이를 함입할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 돌연변이들은, 각각의 돌연변이를 특정하는 코돈에서의 다수의 뉴클레오티드 치환에 의하여, C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이(들)를 갖는 재조합 PIV에서의 복귀 돌연변이(reversion)에 대하여 안정화된다.
본 발명의 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 PIV 돌연변이체에 함입될 수 있는 추가적인 돌연변이는, 예를 들어, 이형 PIV 또는 더욱 간접적으로 관련된 비세그먼트화된 (-) 가닥 RNA 바이러스에서 확인된 약독화 돌연변이와 같은 돌연변이이다. 특히, 약독화 및 하나의 (-) 가닥 RNA 바이러스에서 확인된 다른 목적하는 돌연변이는 "전달될" 수 있다. 예를 들어 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌 연변이체의 게놈 또는 안티게놈 내의 상응하는 위치로 복사될 수 있다. 간략히 말하면, 하나의 이형 (-) 가닥 RNA 바이러스에서의 목적하는 돌연변이는 PIV 수용체에 전달된다. 이는 본원에 인용참증으로 삽입된 1999년 4월 13일자로 Murphy 등에 의해 출원되고 대리인 사건 번호 17634-000600에 의하여 확인되는 미국 특허 출원 "클론된 뉴클레오티드 서열로부터 약독화된 (-) 가닥 RNA 바이러스 백신의 생산" 에 기술되는 것처럼 이형 바이러스에서의 돌연변이를 매핑하여 서열 배열에 의하여 수용체 PIV에서 상응하는 위치를 확인하고, RSV 수용체에서 본래의 서열을 돌연변이체 유전자형으로 돌연변이시키는 것(동일 또는 보존적 돌연변이에 의함)을 포함한다. 이러한 개시가 교시하고 있는 것처럼, 이형 돌연변이체 바이러스에서 확인된 변경에 보존적으로 상응하는 돌연변이의 개체 부위에서의 변경을 코딩하는 수용체 게놈 또는 안티게놈을 변이하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 아미노산 치환이 대응하는 야생형 서열과 비교하여 돌연변이체 바이러스에서 돌연변이의 부위를 나타낸다면, 재조합 바이러스의 상응하는 잔기(들)에서 유사한 치환이 엔지니어링되어야 한다. 바람직하게는 치환이 돌연변이체 바이러스 단백질에 존재하는 치환 잔기와 동일 또는 보존적 아미노산을 포함한다. 그러나, 돌연변이체 단백질의 치환 잔기에 대하여 돌연변이 부위에서 본래의 아미노산 잔기를 비보존적으로 변경하는 것도 역시 가능하다 (예를 들어, 야생형 잔기의 기능을 파괴 또는 손상시키는 다른 아미노산을 사용하는 것에 의함). 그로부터 예시적 돌연변이가 확인되고 본 발명의 재조합 PIV로 전달되는 (-) 가닥 RNA 바이러스는 그 중에서도 다른 PIV들 (예를 들어 HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV 또는 MPIV), RSV, 센다이 바이러스(SeV), 뉴캐슬 질환 바이러스(NDV), 원숭이 바이러스5 (SV5), 홍역 바이러스(MeV), 우역 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스(CDV), 광견병 바이러스(RaV), 및 소포성 구내염 바이러스 (VSV)를 포함한다. 다양한 예시적 돌연변이가 개시되었고, 이는 HPIV3 L 단백질의 456번 위치에서 페닐알라닌(또는 보존적으로 관련된 아미노산)의 치환에 상응함으로써 이에 전달될 수 있는 RSV L 단백질의 521번 위치에서 페닐알라닌의 아미노산 치환을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 결실 또는 삽입에 의해 표시되는 돌연변이의 경우, 이들은 상응하는 결실 또는 재조합 바이러스 내로의 삽입으로써 도입될 수 있지만 결실 또는 삽입된 단백질 단편의 입자의 크기 및 아미노산 서열은 변화할 수 있다.
전술한 삽입된 인용참증에는 다양한 추가적 형태의 돌연변이들이 또한 개시되어 있고, 성장, 약독화, 면역원성, 유전적 안정성을 조절하거나 다른 유리한 구조적 및(또는) 표현형적 효과를 제공하기 위하여 본 발명의 재조합 PIV 내로 용이하게 엔지니어링될 수 있다. 예를 들어, 제한효소 부위 마커들은 cDNA 구성 및 조작을 용이하게 하기 위하여 C, D 및(또는) V ORF 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 안티게놈 또는 게놈 내로 통상적으로 도입된다.
본 발명 내에서 또한 유용한 것은 C, D 및(또는) V ORF 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV 백신 바이러스를 키메라 사람-소 PIV로서 생산하는 것을 가능하게 하는 방법 및 조성물이다. 이러한 재조합체는 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 생산하기 위하여 부분 또는 전체 백그라운드 소 또는 사람 PIV 게놈 또는 안티게놈에 대한 이형 유전자(들), 게놈 세그먼트(들), 또는 하나 또는 다수개의 사 람 또는 소 PIV의 뉴클레오티드의 치환 또는 부가에 의하여 생산된다 (본원에 인용참증으로 삽입된 1999년 7월 9일자로 Bailey 등에 의해 출원되고 대리인 사건 번호 15280-399000US에 의해 확인된 미국 가특허출원 "약독화된 사람-소 키메라 파라인플루엔자 바이러스 백신" 참조). 본 발명의 일면에서, 사람-소 키메라 PIV는 1 이상의 사람 PIV로부터 1 이상의 이형 유전자 또는 게놈 세그멘트(들)과 결합된 부분 또는 전체 소 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈을 함입한다. 별법으로, 사람-소 키메라 PIV는 1 이상의 소 PIV로부터 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트와 결합한 부분 또는 전체 사람 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈을 함입할 수 있다. 백그라운드 게놈 또는 안티게놈에 이형 삽입 또는 첨가의 용도로 선택되는 유전자 및 게놈 세그먼트는 N, P, C, D, V, M, F, HN 또는 L의 야생형 또는 돌연변이체 유전자 또는 게놈 세그먼트를 포함한다. 예시적 일 실시태양에서, HIPV3 수용체의 N 유전자의 ORF 또는 백그라운드 게놈은 BPIV3의 N 유전자 ORF에 의해 치환되는데, 이것은 부모형 BPIV 바이러스와 유사한 비인간 영장류 숙주에서 숙주 범위 제한된 표현형을 나타내는 감염성 재조합체를 수득하였다. 바람직하게는, 다른 단백질들이 방어적 면역 반응에 기여함으로써 본 발명의 용도로 사람-소 PIV 키메라 바이러스를 구성하기 위하여 선호되는 개체임에도 불구하고, 이형 사람 또는 소 유전자(들)은 1 이상의 PIV 방어적 항원을, 바람직하게는 1 이상의 HN 및(또는) F 당단백질 또는 면역원성 도메인 또는 그의 에피토프를 코딩한다.
별법으로는, C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이를 갖는 사람-소 키메라 PIV는 PIV 항원 단백질의 세포질 도메인, 막횡단 도메인, 엑토도메인 또는 면 역원성 에피토프를 코딩하는 1 이상의 게놈 세그먼트를 함입할 수 있다. 이러한 면역원성 단백질, 도메인 에피토프는 또한 면역화된 숙주에서 신규한 면역 반응을 발생시킨다. 예로써, 소 뼈대는 키메라를 백신 개발에 있어서 유용한 후보로 만드는 약독화된 표현형을 전달하는 반면 소 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내에서 사람 PIV로부터 1 이상의 면역원성 유전자(들), 또는 게놈 세그먼트(들)의 첨가 또는 치환은 1 이상의 특정한 사람 PIV "공여체" 균주에 대하여 면역 반응을 발생시킬 수 있는 재조합, 키메라 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 생산한다.
C, D 및(또는) V ORF 내에서 돌연변이를 갖는 사람-소 키메라 PIV는 부분적 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내에서 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트를 대응 유전자 또는 게놈 세그먼트로 치환함으로써 구성할 수 있다. 별법으로는, 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트가, 예를 들어 유전자의 3' 또는 5' 비코딩 부위에서, 전체적 (또는 또 다른 유전자 또는 게놈 세그먼트가 결실되었다면 부분적) PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내에서 과잉 유전자 또는 게놈 세그먼트로서, 첨가될 수 있다. 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트는 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내에서 개방 판독틀을 파괴하지 않기 위하여 부분 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내에서 유전자간 위치에 첨가될 수 있다. 별법으로는, 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트는 부분 또는 전체 PIV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내에서 대응 유전자 또는 게놈 세그먼트의 야생형 유전자 순서 위치에 상응하는 위치에 첨가 또는 치환될 수 있는데, 이로써 이 대응 유전자나 게놈 세그먼트는 치환 또는 제거된다 (예를 들어, 프로모터에서 더욱 멀리 떨어진 위치로). 다른 추가적 실시태양에 서, 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트는 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응하는 유전자 또는 게놈 세그먼트의 야생형 유전자 순서 위치와 비교하여 보다 프로모터에 근접하거나 또는 프로모터에서 멀리 떨어진 위치에서 첨가 또는 치환될 수 있으며, 이는 이형 유전자 또는 게놈 세그먼트의 발현을 각각 증가 또는 감소시킨다. 인용참증에 개시되어 있는 것과 동일 또는 상이한 변형들은 본 발명의 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 내로의 함입이 용이하다.
키메라 PIV를 생산하기 위한 이형 면역원성 단백질, 도메인, 에피토프의 도입은 면역화된 숙주에 새로운 면역 반응을 발생시키는데 있어서 특히 유용하다. 상이한 PIV의 수용체 게놈 또는 안티게놈 중에서, 하나의 공여체 PIV로부터 면역원성 유전자 또는 게놈 세그먼트의 첨가 또는 치환은, 공여체 서브그룹 또는 균주, 수용체 서브그룹 또는 균주에 대하여, 또는 공여체와 수용체 서브그룹 또는 균주 모두에 대하여 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 이 목적을 달성하기 위하여 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 PIV는 키메라 단백질, 예를 들어 제공하는 다른 PIV의 엑토도메인에 융합된 하나의 PIV에 특이적인 세포질 테일 및(또는) 막횡단 도메인을 갖는 면역원성 당단백질, 예를 들어 사람-소 융합 단백질, 또는 2 개의 다른 사람 PIV들로부터의 도메인을 함입한 융합 단백질을 발현하도록 구성될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, C, D, 및(또는) V ORF 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV 게놈 또는 안티게놈은 키메라 당단백질 도메인 또는 면역원성 에피토프를 코딩한다. 예를 들어, 사람 PIV HN 또는 F 당단백질으로부터 당단백질 엑토도메인을 코딩하는 이형 게놈 세그먼트는 사람-소 키메라 PIV 게놈 또는 안티게 놈을 형성하기 위해, 상응하는 소 HN 또는 F 당단백질 세포질 및(또는) 막횡단 도메인를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(즉, 게놈 세그먼트)에 결합될 수 있다.
다른 실시태양에서, 백신 생산에 있어서 유용한 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체는 혈중 바이러스에서 항원 연속변이를 할 수 있도록 용이하게 변형될 수 있다. 일반적으로 변이는 HN 및(또는) F 단백질에 있을 것이다. 하나의 PIV 균주로부터의 전체 HN 또는 F 유전자, 또는 그것의 특별한 면역원성 영역을 코딩하는 게놈 세그먼트는 다른 PIV 균주 또는 서브그룹의 수용체 클론에서 상응하는 영역의 치환에 의해, 또는 유전자의 1 이상의 카피를 첨가하는 것에 의해, 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈 cDNA에 함입되며, 따라서 다수의 항원형이 제공된다. 이후 변형된 PIV 클론으로부터 생성된 자손 바이러스는 새로 나타나는 PIV 균주에 대한 백신 프로토콜로서 사용될 수 있다.
사람 PIV 코딩 서열 또는 비코딩 서열 (예를 들어 프로모터, 유전자 말단, 유전자 개시, 유전자간 또는 다른 시스-작용 성분)을 이형의 대응물, 예를 들어 다른 사람 PIV 또는 쥐 PIV 서열로 치환하는 것은 다양한 종류의 가능한 약독화 및 다른 표현형적 효과를 갖는 키메라 PIV를 생성한다. 특히, 숙주 범위 및 다른 목적하는 효과는 사람 PIV 백그라운드 내로 들어온 소 또는 쥐 PIV 유전자를 치환하여 나타날 수 있는데, 이것은 소 또는 쥐의 유전자는 사람 세포 내에서 효율적으로 기능하지 못하고, 예를 들어 이형의 서열 또는 단백질과 생물학적으로 상호작용하는 사람 PIV 서열 또는 단백질 (즉, 바이러스 전사, 번역, 어셈블리 등을 위해 치환된 서열 또는 단백질과 정상적으로 협동하는 서열 또는 단백질)의 불화합성, 또 는 보다 일반적으로는 숙주 범위 제한에서 세포내 단백질 또는 세포내 환경의 일부 다른 측면이 증식 허용 숙주 및 그보다 덜 증식을 허용하는 세포에서 상이하기 때문이다. 예시적 실시태양에서, 소 및 사람 PIV 구조와 기능의 공지된 측면에 기초하여, 사람 PIV 중으로 도입하기 위한 소 PIV 서열을 선택하였다.
본 발명의 추가적인 측면에서, C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체는 키메라 게놈 또는 안티게놈이 생성된 키메라 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 약독화 또는 다른 바람직한 표현형을 특정하는 1 이상의 돌연변이를 도입함으로써 추가로 변형되어 생성된다. 이러한 돌연변이는 신규(de novo)로 생성되고 합리적인 돌연변이 유도 계획에 따라 약독화 효과에 대하여 시험될 수 있다. 별법으로, 약독화 돌연변이는 존재하는 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV에서 확인될 수 있으며, 이 후 본 발명의 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 PIV 중으로 함입될 수 있다. 이러한 재조합 PIV는 상기한 바와 같이 백신 제제로 사용하는데 있어서 향상된 약독화 및 면역원성의 특성을 제공한다. 이 경우 상기에 삽입된 인용참증은 일부 HPIV3 백그라운드 안티게놈 중으로 치환된 HPIV1의 HN 및 F 유전자를 가지며, HPIV3 JS cp45에서 확인된 약독화 돌연변이의 1 이상을 갖도록 추가적으로 변형된 키메라 PIV 재조합체의 구성에 대해 기술한다. 하나의 이러한 키메라 재조합체는 cp45의 L 유전자 중에서 확인된 약독화 돌연변이 전체를 함입한다. 이형의 (HPIV1) HN 및 F 유전자의 외부의 모든 cp45 돌연변이가 약독화된 키메라 백신 후보를 수득하기 위하여 HPIV-3 재조합체 내로 함입될 수 있다는 것이 증명되었다.
C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 내에 함입하기 위하여 생물학적으로 유도된 PIV 약독화 돌연변이는 자연적으로 발생할 수 있거나 또는 잘 알려진 돌연변이 유도 과정에 의해 야생형 PIV 균주 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 상기에 삽입된 인용문헌에 기술된 바와 같이 불완전하게 약독화된 부모형 PIV 균주는 화학적 돌연변이 유발 물질이 첨가된 세포 배양물에서의 바이러스 성장 중 화학적 돌연변이에 의해, 성장 제한 돌연변이를 도입하기 위하여 부적합한 온도에서 계대 배양된 바이러스를 선택하거나, 또는 세포 배양 내의 작은 프라크(sp)를 만드는 돌연변이화된 바이러스를 선택하여 생산될 수 있다.
"생물학적으로 유도된 PIV"란 재조합적 방법에 의해 생성된 것이 아닌 PIV를 의미한다. 따라서, 생물학적으로 유도된 PIV는, 예를 들어, 야생형 게놈 서열을 갖는 자연적으로 존재하는 PIV 및 참조 야생형 PIV 서열로부터의 대립 유전자 또는 돌연변이체 게놈 변형을 갖는 PIV, 예를 들어 약독화된 표현형을 특정하는 돌연변이를 갖는 PIV를 포함하는 모든 자연적으로 존재하는 PIV를 포함한다. 유사하게, 생물학적으로 유도된 PIV는 무엇보다도 인공적 돌연변이 유도 및 선택 과정에 의한 부모형 PIV로부터 유도된 PIV 돌연변이체를 포함한다.
상기에서 언급한 바와 같이, 충분하게 약독화된 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체의 생산은 몇몇 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 한가지 방법은 부분적으로 약독화된 바이러스가 세포 배양물 중에서 진행하기에는 낮은 약독화 온도에서 계대 배양되도록 하는 것을 수반한다. 예를 들어, 부분적으로 약독화된 돌연변이체는 최적 온도 이하의 온도에서 세포 배양물 중에서 계대 배양되어 생산 된다. 따라서, cp 돌연변이체 또는 다른 부분적으로 약독화된 PIV 균주는 계대 배양에 의해 낮은 온도에서의 효율적인 성장에 적응한다. 저온 계대 배양 중의 이러한 돌연변이체 PIV의 선택은 부분적으로 약독화된 부모형에 비교하여 유도체 균주에서 어떠한 잔류하는 독성이라도 실질적으로 감소시킨다.
별법으로, 예를 들어 ts 돌연변이를 도입하기 위해서, 또는 이미 바이러스가 ts인 경우 약독화된 유도체의 ts 표현형의 증가된 약독화 및(또는) 안정성을 부여하기에 충분한 추가적인 ts 돌연변이를 도입하기 위해서, 부분적으로 약독화된 부모형 바이러스를 화학적으로 돌연변이를 유도시켜 특정 돌연변이가 생물학적으로 유도된 PIV 중으로 도입될 수 있다. PIV 중으로 ts 돌연변이를 도입하는 수단은 일반적으로 알려진 방법에 따라, 5-플루오르유리딘 같은 돌연변이 유발 물질의 존재 하에서의 바이러스의 복제를 포함한다. 다른 화학적 돌연변이 유발 물질도 또한 사용될 수 있다. 거의 대부분의 PIV 유전자 중의 ts 돌연변이로부터 약독화가 일어날 수 있지만, 이 목적을 위해 특히 용이한 표적은 중합효소 (L) 유전자인 것으로 밝혀졌다.
본 발명에서 사용되기 위한 예시적 약독화된 PIV에서의 복제의 온도 감수성 수준은 몇몇 제한 온도에서의 복제와 증식 허용온도에서의 복제를 비교하여 결정된다. 증식 허용 온도에서의 복제와 비교하여 바이러스의 복제가 100배 이상 감소하는 최저 온도는 차단(shutoff) 온도라 명명된다. 실험 동물 및 사람에서, PIV의 복제 및 독성 모두는 돌연변이체의 차단 온도와 연관된다.
JS cp45 HPIV3 돌연변이체는 비교적 유전적으로 안정하며, 상당히 면역원성 이며 또한 만족할 만하게 약독화된 것으로 밝혀졌다. 바이러스에서 발견되는 다양한 개별적 돌연변이 및 조합된 돌연변이를 함입하는 이러한 생물학적으로 유도된 바이러스 및 재조합 바이러스의 뉴클레오티드 서열 분석은 각각의 증가된 약독화 수준이 특정 뉴클레오티드 및 아미노산 치환과 연관되어 있다는 것을 암시한다. 또한, 상기에 삽입된 인용문헌들은 잠재적인 추가적 돌연변이와 개별적으로 또는 다양한 조합으로 돌연변이를 감염성 PIV 클론의 게놈 또는 안티게놈 중으로 도입함으로써 표현형 차이에 관여하는 돌연변이들을 어떻게 통상적으로 구별하는지를 개시한다. 부모형 및 유도체 바이러스의 표현형 특성의 평가와 결합된 이 방법은 약독화, 온도 감수성, 저온 적응성, 작은 프라크 크기, 숙주 범위 제한 등과 같은 목적하는 특성에 관여하는 돌연변이를 확인한다. 이렇게 확인된 돌연변이는 C, D 및(또는) V ORF 결실 또는 넉아웃 돌연변이체를 적절한 수준의 약독화, 면역원성, 약독화된 표현형으로부터의 복귀 돌연변이에 대한 유전적 저항성 등으로 조정하기 위하여 "메뉴" 내에 축적되고 그 후 원하는 대로 축적된다. 상기 기재와 같이, cDNA로부터 감염성 PIV를 생산하는 능력은 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 내에서 특정적으로 엔지니어링된 변이의 도입을 가능하게 한다. 특히, 감염성의 재조합 PIV는 생물학적으로 유도되고, 약독화된 PIV 균주 내에서의 특정적인 돌연변이, 예를 들어 ts, ca, att 및 다른 표현형을 특정하는 돌연변이와 동일한 돌연변이의 확인에 사용될 수 있다. 따라서, 목적하는 돌연변이는 확인되고, 재조합된 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 PIV 백신 균주 중으로 도입될 수 있다. cDNA로부터 바이러스를 생성하는 능력은 이러한 돌연변이를 개별적으 로 또는 선택된 조합으로, 전장 cDNA 클론 중으로 통상적인 함입시키는 것을 가능하게 하고, 그 후 도입된 돌연변이를 함유하는 회수된 재조합 바이러스의 표현형을 쉽게 결정할 수 있게 한다.
cp 또는 ts 표현형과 같은 목적하는 표현형과 관련된 특정적이고 생물학적으로 유도된 돌연변이를 감염성 PIV 클론 중으로 함입하고 확인하는 것에 의하여 본 발명은 그 확인된 돌연변이에, 또는 가까운 위치 내의 돌연변이에, 다른 부위 특이적 변이를 제공한다. 생물학적으로 유도된 PIV에서 생성되는 대부분의 약독화 돌연변이가 단일 뉴클레오티드 변형인데 비하여, 다른 "부위 특이적" 돌연변이는 재조합 기술에 의해 생물학적으로 유도되거나 재조합된 PIV에 또한 함입될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 부위 특이적 돌연변이는 1 내지 3에서 5 내지 15 또는 그 이상 까지의 변경된 뉴클레오티드 (예를 들어, 야생형 PIV 서열, 선택된 돌연변이 PIV 균주의 서열, 또는 돌연변이 유도된 부모형 재조합 PIV 클론으로부터 변경된 것)의 삽입, 치환, 결실 또는 재배치를 포함한다. 이러한 부위 특이적 돌연변이는 선택된, 생물학적으로 유도된 점 돌연변이에, 또는 그 영역 내로 함입될 수 있다. 별법으로, 돌연변이는 PIV 클론 내로 다양한 다른 상황, 예를 들어 시스-작용 조절 서열 또는 단백질 활성 부위, 결합 부위, 면역원성 에피토프 등을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 또는 그 근처에 함입될 수 있다. 부위 특이적 PIV 돌연변이체는 일반적으로 바람직한 약독화 표현형을 보유하지만, 추가적으로 약독화와 관계 없는 변형된 표현형적 특성, 예를 들어 강화되거나 넓어진 면역원성 및(또는) 향상된 성장을 나타낼 수 있다. 바람직한 추가적 실시예에서, 부위 선택적인 돌연 변이체는 약독화 점 돌연변이를 특정하는 코돈 내에 추가적으로 안정화된 뉴클레오티드 돌연변이를 함입하도록 디자인된 재조합 PIV를 포함한다. 가능한 경우, 부모형 돌연변이체 또는 재조합 PIV 클론 내에서의 약독화 아미노산 변화를 특정하는 코돈에 2 이상의 뉴클레오티드 치환이 도입되어, 약독화된 표현형으로부터의 복귀 돌연변이에 대한 유전적 저항성을 갖는 생물학적으로 유도되거나 재조합된 PIV가 생산된다. 다른 실시태양에서, 표적이된 뉴클레오티드 위치에 대하여 상류 (N-말단 방향) 또는 하류 (C-말단 방향), 예를 들어 1 내지 3, 5 내지 10, 및 15 뉴클레오티드까지 또는 더 많은 5' 또는 3' 위치에 부위 선택적 뉴클레오티드의 치환, 첨가, 결실, 또는 재배치가 도입되었는데, 예를 들어, 존재하는 시스-작용 조절 구성성분을 구성하거나 제거하기 위한 것이다.
단일 및 다중 점 돌연변이와 부위 선택적 돌연변이 이외에, 본원에 개시된 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 PIV에 대한 변형은 결실 또는 제거된 C, D 및(또는) V ORF 또는 게놈 세그먼트 외부의 전체 유전자, 게놈 세그먼트의 결실, 삽입, 치환 또는 재배치를 포함한다. 이러한 돌연변이는 적은 수의 염기 (예를 들어, 50-100, 100-300, 300-500, 500-1,000 염기), 큰 덩어리의 뉴클레오티드 (예를 들어, 1,000-1,500 뉴클레오티드, 1,500-2,500 뉴클레오티드, 2,500-5,000 뉴클레오티드, 5,00-6,5000 뉴클레오티드 또는 그 이상)를 공여체 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈 내에서, 변형의 성질에 따라 변형시킬 수 있다 (즉, 적은 수의 염기는 면역원성 에피토프를 삽입 또는 제거하기 위하여 또는 작은 게놈 세그먼트를 변형시키기 위하여 변형될 수 있는 반면, 큰 덩어리의 염기는 유전자나 큰 게놈 세그먼트가 첨가, 치환, 결실, 또는 재배치될 때 관여한다).
추가적 측면에서, 본 발명은 생물학적으로 유도된 PIV로부터 재조합된 PIV 클론 중으로 채택된 돌연변이, 예를 들어 cp 및 ts 돌연변이의 보충에 대해 추가적으로 변형된 PIV 클론 내에서 동일 또는 상이한 유전자를 도입하는 추가적 형태의 돌연변이를 제공한다. 각각의 PIV 유전자는 새로운 백신 특성을 나타내는 C, D, 및(또는) V ORF 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV룰 생산하기 위하여 발현 수준에서 선택적으로 변형되거나, 전체적으로 또는 부분적으로, 단독으로 또는 다른 바람직한 변형과 결합하여, 첨가, 결실, 치환 또는 재배치될 수 있다. 따라서, 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이로부터 채택된 약독화 돌연변이에 첨가하거나 또는 이와 함께 결합하여, 본 발명은 또한 감염성 PIV 클론의 재조합 엔지니어링에 기초하여 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 PIV의 표현형을 약독화하거나 또는 변형시키기 위하여 일정 범위의 추가적인 방법을 제공한다. 감염성 클론 내로 함입하기 위한 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈 내의 공여체 또는 수용체 유전자 또는 게놈 세그먼트를 포함하여, 표적 유전자 또는 게놈 세그먼트를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열 내에서는 다양한 변형이 생성될 수 있다. 더욱 상세하게는, 재조합 PIV 내에서 바람직한 구조적, 표현형적 변화를 얻기 위하여, 본 발명은 C, D 및(또는) V ORF 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV 클론 내에서, 전체 유전자(들) 또는 게놈 세그먼트(들)을 결실, 치환, 도입, 또는 재배치 하는 돌연변이는 물론이고, 부모형 게놈 또는 안티게놈으로부터 선택된 뉴클레오티드 또는 다수의 뉴클레티드를 결실, 치환, 도입, 또는 재배치하는 변이의 도입을 가능하게 한다.
따라서, 결실 또는 제거된 C, D 및(또는) V ORF 또는 게놈 세그먼트(들)에 더하여 선택된 유전자의 발현을 단순히 변경 또는 제거하는 것이 아닌 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 PIV 내에서의 변이가 제공되는데, 이는 예를 들어 선택된 PIV 코딩 서열 내에 종결 코돈을 도입하고, 조정가능하게 연결된 프로모터에 대한 PIV 유전자의 위치를 변화시키고, 발현율을 조절하기 위하여 상류 개시 코돈을 도입하고, 표현형 (예를 들어, 전사에 있어서 성장, 온도 제한 등)을 변형시키기 위하여 GS 및(또는) GE 전사 신호를 변이시키고 (예를 들어, 위치를 변화시키거나, 존재하는 서열을 변경시키거나, 존재하는 서열을 이형 서열로 치환하는 것에 의해) 및 바이러스 복제, 선택된 유전자(들)의 전사, 또는 선택된 단백질(들)의 번역에 있어서 양적 또는 질적 변화를 특정하는 여러 다른 결실, 치환, 첨가 및 재배치에 의하여 된다. 이와 관련하여, 성장에 있어서 비필수적인 어떠한 PIV 유전자라도 독성, 병원성, 면역원성 및 다른 표현형적 특성에 있어서 목적하는 효과를 얻기 위하여 재조합 PIV 내에서 제거되거나 변이될 수 있다.
또한, 사람-소 키메라 PIV 중으로 함입하기 위한 다양한 다른 유전적 변형이 단독으로, 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이체 PIV로부터 채택된 1 이상의 약독화 돌연변이와 함께, 예를 들어 성장, 약독화, 면역원성, 유전적 안정성을 조정하거나 또는 다른 유리한 구조적 및(또는) 표현형적 효과를 제공하기 위하여 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에서 생성될 수 있다. 이러한 추가적 형태의 돌연변이는 상기 삽입한 인용참증에서 또한 개시되었고 본 발명의 사람-소 키메라 PIV 내로 쉽게 엔지니어링 될 수 있다. 예를 들어, 제한 부위 마커는 cDNA 구성과 조작을 용이하 게 하기 위하여 사람-소 키메라 PIV 안티게놈 또는 게놈 중으로 통상적으로 도입될 수 있다.
본 발명에 또한 제공된 것은 C, D 및(또는) V ORF 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV 내에서의 유전적 변이인데 이는 표적이 된 C, D 및(또는) V ORF의 외부의 선택된 유전자 또는 게놈 세그먼트의 발현을 유전자 또는 게놈 세그먼트를 PIV 클론으로부터 제거함 없이 변경하거나 제거한다. 예를 들어, 이는 개시 코돈의 코딩 배치를 변경하거나 선택된 코딩 서열 중으로 정지 코돈을 도입하는 돌연변이를 도입하거나, 유전자의 위치를 변경하거나 발현율을 변경하기 위하여 상류 개시코돈을 도입하거나, 표현형 (예를 들어, 성장, 전사에 있어서 온도 제한 등)을 변형하기 위하여 GS 및(또는) GE 전사 신호를 변경함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 더욱 상세한 측면에서, 예를 들어 복수 개의 번역 종결 코돈을 번역 개방 판독틀(ORF) 중으로 도입함에 의하여, 유전자나 그의 세그먼트의 결실 없이 C, D 및(또는) V ORF의 발현이 전사 수준에서 제거되어 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이 PIV가 제공된다. 이는 유전자의 결실 없이 선택된 유전자가 번역 수준에서 발현되지 않는 살아있는 바이러스를 생산한다. 다른 실시태양에서는, 표적 ORF 내로 다수의 종결 코돈이 도입된다. 별법으로는, RNA 에디팅 부위에 돌연변이가 도입되거나 개시 코돈에 의하여 특정된 아미노산을 변형시키는 돌연변이가 도입된다. 이러한 형태의 넉아웃 바이러스는 종종 조직 배양에서 감소된 성장률과 작은 플라크 크기를 나타낸다. 따라서, 이러한 방법은 주요한 바이러스 방어성 항원 중의 하나가 아닌 바이러스 유전자의 발현을 제거하는 추가적이고 새로운 형태 의 약독화 돌연변이를 제공한다. 이 경우, 표적 단백질의 합성을 회복할 수 있는 수정 돌연변이 (correcting mutation)를 효과적으로 배제하기 위하여, 유전자나 게놈 세그먼트의 결실 없이 생산된 넉아웃 바이러스 표현형은 본원에서 기술한 바와 같이, 결실 돌연변이 유도에 의해 선택적으로 생성될 수 있다. 몇몇 다른 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이를 위한 유전자 넉아웃은 이 기술분야에서 널리 알려진 추가적인 고안과 방법에 의해 만들어질 수 있다 (예를 들어, Kretschmer et al., Virolosy 216: 309-316,1996; Radicle et al., Virology 217: 418-412,1996; 및 Kato et al., EMBOSS J. 16: 178-587,1987; and Schneider et al., Virology 277: 314-322, 1996 에 기술된 바와 같고, 각각은 본원에서 인용참증으로 삽입되었음).
본 발명의 C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 PIV 중으로 도입하기 위한 다른 돌연변이는 시스-작용 시그날에 대한 돌연변이를 포함하고, 이는 예를 들어, PIV 미니게놈의 돌연변이 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 리더 및 트레일러 및 플랭킹 서열의 삽입 및 결실 분석은 바이러스 프로모터 및 전사 시그날을 확인하고, RNA 복제 또는 전사의 다양한 수준의 감소와 연관된 일련의 돌연변이를 제공한다. 또한 이들 시스 작용 시그날의 포화 돌연변이 유발(이에 의해 각각의 위치가 차례로 각각의 대체 뉴클레오티드로 차례로 변이됨)은 RNA 복제 또는 전사에 영향을 주는 많은 돌연변이를 확인하였다. 이들 돌연변이 중 어떤 것이라도 본원에서 기술한 것과 같이 C, D 및(또는) V ORF 결실 또는 넉아웃 돌연변이체 PIV 게놈 또는 안티게놈 중으로 삽입될 수 있다. 전체 안티게놈 cDNA를 사용 한 트랜스-작용 단백질 및 시스-작용 RNA 서열의 평가 및 조작은 상기에 삽입된 인용 문헌에서 기술한 대로 PIV 미니게놈 사용에 의해 보조된다.
C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 PIV 내의 추가 돌연변이는 게놈의 3' 말단을 안티게놈의 그 대응물로 치환하는 것을 수반하며, 이는 RNA 복제 및 전사 중 변화와 연관된다. 한 실시 태양에서, 방어성 HN 및(또는) F 항원과 같은 특정 PIV 단백질의 발현 수준은 천연의 서열을 인공적으로 생산되고 효율적인 번역과 일관되도록 설계된 서열로 치환하여 증가될 수 있다. 이 상황에서, 코돈 사용은 포유류 바이러스 단백질의 번역 수준에서 주요 인자가 될 수 있다 (Hans et al., Current Biol. 6:315-324, 1996, 본원에 인용문헌으로 삽입됨). 주요 방어 항원인 PIV의 HN 및 F 단백질을 코딩하는 mRNA의 코돈 사용의 재조합적 방법에 의한 최적화는 이들 유전자의 향상된 발현을 제공할 것이다.
다른 예시적인 실시태양에서, 선택된 PIV 유전자의 번역 개시 부위를 둘러싼 서열(바람직하게는 3-위치 중의 뉴클레오티드를 포함)은 단독으로 또는 상류 개시 코돈 도입과 함께 변이되어 번역의 상승 또는 하강 조절을 특정하여 PIV 유전자 발현을 조절한다. 별법으로, 또는 본원에서 개시된 다른 PIV 변이들과 함께, C, D 및(또는) V ORF 및 넉아웃 돌연변이체 PIV 유전자 발현은 바이러스 중 어느 한 선택된 유전자(들)의 전사 GS 또는 GE 시그날을 변경하여 조절될 수 있다. 다른실시 태양에서, C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 중의 유전자 발현 수준은 전사 수준에서 변이된다. 일면에서, PIV 유전자 맵 중의 선택된 유전자의 위치는 보다 프로모터 근위의 또는 프로모터 원위의 위치로 변화될 수 있고, 이로 써 유전자는 보다 효율적으로 또는 덜 효율적으로 발현될 것이다. 이 일면에 따라, 특정 유전자의 발현 조절은 흔히 상호적, 위치적으로 치환된 유전자 때문에 발현 수준에서 균등한 감소가 따르는, 야생형 수준에 비교하여 2 배, 보다 일반적으로는 4 배, 10 배 이하 또는 그 이상의 유전자 발현 감소 또는 증가를 일으켜 달성될 수 있다. 이들 및 다른 전좌 (traspositioning) 변화는 예를 들어, RNA 복제에 관여하는 선택된 바이러스 단백질의 감소된 발현으로 인해 약독화된 표현형을 갖는, 또는 증가된 항원 발현과 같은 다른 바람직한 성질을 갖는 신규한 C, D 및(또는) V ORF 및 넉아웃 돌연변이체 PIV를 생성한다.
또한 본 발명의 감염성 C, D 및(또는) V ORF 및 넉아웃 돌연변이체 PIV 클론은 면역원성을 강화하고 또한 야생형 PIV 또는 부모형 PIV에 의한 감염으로 제공되는 것보다 큰 방어 수준을 유도하기 위해 본원에서 개시된 방법 및 조성물에 따라 엔지니어링될 수 있다. 예를 들어, 이형 PIV 균주 또는 유형의, 또는 RSV와 같은 비PIV 기원의 면역원성 에피토프는 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적절한 뉴클레오티드 변화에 의해 재조합 클론에 첨가될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 돌연변이체 PIV는 목적하거나 또는 목적하지 않은 면역학적 반응과 관련된 면역원성 단백질, 단백질 도메인, 또는 특정 단백질 유형을 첨가하거나 또는 제거하기 위해 (예를 들어, 아미노산 삽입, 치환 또는 결실에 의해) 엔지니어링될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 추가 유전자 또는 게놈 세그먼트는 C, D 및(또는) V ORF 및 넉아웃 돌연변이체 PIV 게놈 또는 안티게놈 중으로 또는 이에 근접하여 삽 입될 것이다. 이들 유전자는 수용체 유전자에 의한 통상의 조절 하에 있을 수 있거나, 또는 독립적인 세트의 전사 시그날의 조절 하에 있을 수 있다. 목적하는 유전자는 상기에서 확인된 PIV 유전자들과 아울러 비PIV 유전자들을 포함한다. 목적하는 비PIV 유전자는 사이토카인(예를 들어, IL-2부터 IL-18까지, 특히 IL-2, IL-6 및 IL-12, IL-18 등), 감마 인터페론, 및 T 헬퍼 세포 에피토프에 풍부한 단백질들을 코딩하는 것들을 포함한다. 이들 추가 단백질들은 별개 단백질로, 또는 HN 또는 F와 같은 현존하는 PIV 단백질의 여분의 카피로 발현될 수 있다. 이는 정량적으로 또한 정성적으로, 양쪽으로 PIV에 대한 면역 반응을 변이시키고 또한 향상시키는 능력을 제공한다.
결실, 삽입, 치환 및 C, D 및(또는) V ORF 및 넉아웃 돌연변이체 내의 전체 바이러스 유전자 또는 게놈의 변화를 포함하는 다른 돌연변이는 상당히 안정한 백신 후보를 만들고, 이는 면역 억제된 개체의 경우 특히 중요하다. 이들 변화 중 많은 수는 생성된 백신 균주의 약독화를 초래하는 반면, 다른 것들은 목적하는 표현형 변화의 상이한 유형을 특정할 것이다. 예를 들어, 보조적인(즉, 시험관내 성장에 필수적이지 않은) 유전자들은 숙주 면역성을 특이적으로 방해하는 단백질을 코딩하기 위한 우수한 후보이다(예를 들어, 본원에 인용참증으로 삽입된 Kato et al., EMBO. J. 16:578-87, 1997, 참조). 백신 바이러스 중의 이러한 유전자의 제거는 독성 및 병원성을 감소시키고(또한) 면역원성을 향상시킨다.
본 발명의 더욱 세부적인 측면에서, C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이는 다른 병원균, 특히 RSV 같은 호흡 기도 병원균의 방어성 항원을 위한 벡 터 사용되었다. 예로서, 재조합 PIV는 감염성, 약독화 백신 바이러스를 생산하기 위해 RSV로부터 방어성 항원을 코딩하는 서열을 함입하도록 엔지니어링될 수 있다. RSV cDNA의 클로닝과 다른 개시는 1995년 9월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/007,083호; 1996년 9월 27일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 제 08/720,132호; 1996년 7월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제 60/021,773호; 1997년 5월 9일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/046,141호; 1997년 5월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/047,634호; 1997년 7월 15일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 제08/892,403호 (국제 공개 번호 제WO 98/02530호에 대응함); 1999년 4월 13일자로 출원되고 대리인 사건 번호 17634-000520에 의해 확인되는 미국 특허 출원 "클론된 뉴클레오티드 서열로부터 약독화된 키메라 호흡기 합포제 바이러스 백신의 생산"; Murphy 등에 의해 1999년 4월 13일자로 출원되고 대리인 사건 번호 17634-000600에 의해 확인된 미국 특허 출원 "클론된 뉴클레오티드 서열로부터 약독화된 (-) 가닥 RNA 바이러스 백신의 생산; Collins, et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567,1995; Bukreyev, et al., J Virol 70: 6634-41,1996, Juhasz et al., J. Virol. 71 (8): 5814-5819,1997; Durbin et al., Viroloey 235: 323-332,1997; He et al., Virology 237: 249-260,1997; Baron et al., J. Virol. 71: 1265-1271,1997; Whitehead et al., Virolosy 247 (2): 232-9,1998a; Whitehead et al., J. Virol. 72 (5): 4467-4471,1998b; Jin et al., Virolosy 251: 206-214,1998; 및 Whitehead et al., J. Virol. 73: (4) 3438-3442,1999, 및 Bukreyev, et al., Proc Nat Acad Sci USA 96: 2367-72,1999, 각각 은 모든 목적을 위해 본원에 인용참증으로 삽입되었음).
본 발명의 이러한 측면에 따라, C, D 및(또는) V ORF 결실 및 넉아웃 돌연변이체 PIV는 1 이상의 RSV 서열에 함입되어 제공된다. 예로서, 각각의 HPIV3 유전자는 사람 RSV로부터의 대응 유전자로 치환될 수 있다. 별법으로, 예를 들어 RSV 당단백질의 세포질 테일, 막횡단 도메인 또는 엑토도메인을 코딩하는 선택된 이형 게놈 세그먼트는, 예를 들어 HPIV3 내의 같은 유전자 내 또는 HPIV3 내의 다른 유전자 내에서 대응 게놈 세그먼트로 치환거나, 또는 키메라 PIV-RSV 당단백질을 생산하기 위하여 HPIV3 게놈 또는 안티게놈의 비코딩 서열 중으로 첨가된다. 일 실시태양에서 사람 RSV의 F 유전자로부터의 게놈 세그먼트는 키메라 단백질을 코딩하는 구성체 (예를 들어, 신규한 약독화된 바이러스 및(또는) PIV 및 RSV 양자에 대해 면역원성을 갖는 다가 백신을 생산하기 위하여 RSV의 엑토도메인에 융합되는 PIV의 세포질 테일 및(또는) 막횡단 도메인을 갖는 융합 단백질)를 생산하기 위하여 대응 HPIV3 게놈 세그먼트로 치환된다.
상기한 C, D 및(또는) V 결실 또는 넉아웃 돌연변이체에 대한 변이 이외에, 다양한 유전자간 영역 또는 다른 영역에서 독특한 제한 영역 (예를 들어, G 와 F 유전자 사이의 독특한 StuI 부위)의 삽입과 같은 조작을 용이하게 하기 위하여 PIV 클론 내에서의 다른 또는 추가적인 변형이 만들어질 수 있다. 번역되지 않는 유전자 서열은 외래 서열의 삽입 용량을 증가시키기 위하여 제거될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 조성물(예를 들어, 사람-소 키메라 PIV를 코딩하는 cDNA를 함입하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 벡터)은 단리된 감염성 PIV를 생 산하기 위해 제공된다. 이들 조성물 및 방법을 사용하여, 감염성 PIV는 PIV 게놈 또는 안티게놈으로부터 생성되고, 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 및 거대(L) 중합효소 단백질로부터 생성된다. 본 발명의 관련된 일면에서, 조성물 및 방법은 감염성의 약독화된 백신 바이러스를 생성하기 위해 재조합 PIV 중으로 상기에서 언급한 구조적 및 표현형적 변화를 도입하기 위해 제공된다.
상기에서 정의된 돌연변이의 감염성, C, D 및(또는) V 결실 및 넉아웃 돌연변이체 클론 중으로의 도입은 다양한 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. DNA와 관련하여 "감염성 클론"이란 합성의 또는 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 게놈을 생산하기 위한 주형으로 작용할 수 있는 게놈 또는 안티게놈 RNA 중으로 전사될 수 있는 cDNA 또는 그 생성물을 의미한다. 따라서, 정의된 돌연변이는 통상의 기술(예를 들어, 특정 부분 돌연변이 유발)에 의해 게놈 또는 안티게놈의 cDNA 카피 중으로 도입될 수 있다. 본원에서 기술된 것과 같은 전체 안티게놈 또는 게놈 cDNA를 어셈블하기 위한 안티게놈 또는 게놈 cDNA 서브단편의 사용은 각각의 영역이 개별적으로 조작될 수 있다는 장점을 가지며(작은 cDNA가 큰 것보다 조작하기 용이하다), 이후 전체 cDNA 중으로 용이하게 어셈블될 수 있다. 따라서, 전체 안티게놈 또는 게놈 cDNA, 또는 이들의 어떤 한 서브단편이라도 올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이 유발을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 이는 단일 가닥 파지미드 형태의 중간체를 통해, 예를 들어, 바이오-래드 래버러토리(Bio-Rad Laboratory)의 뮤타-진
(Muta-gene
) 키트(캘리포니아, 리치몬드 소재)를 사용하여 또는 스트라타진 (Stratagene)의 차멜른 (Chameleon) 돌연변이 유발 키트(캘리 포니아 라 졸라 소재)의 방법을 사용하여, 또는 목적하는 돌연변이(들)을 포함한 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 주형 중 하나를 사용한 중합효소 연쇄 반응에 의해 가능하다. 이후 돌연변이된 서브단편은 전체 안티게놈 또는 게놈 cDNA 중으로 어셈블될 수 있다. 다양한 다른 돌연변이 유발 기술이 일려졌으며 PIV 안티게놈 또는 게놈 cDNA 중의 목적하는 돌연변이를 생산하기 위한 용도로 사용할 수 있다. 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 변화로부터 1 이상의 유전자 또는 게놈 영역을 함유한 거대 cDNA 조각의 대체에 이르기까지 변화할 수 있다.
따라서, 예시적 일 실시태양에서는 바이오-래드사로부터 구입할 수 있는 뮤타-진 파지미드(phagemid) 시험관내 돌연변이유발 키트를 사용하여 돌연변이를 도입하였다. 간략히 말하면, PIV 게놈 또는 안티게놈의 일 부분을 코딩하는 cDNA를, 플라스미드 pTZ18U 중으로 클론하였고, CJ236 세포 (라이프 테크놀로지스)의 형질전환을 위하여 사용하였다. 파지미드 생산물은 제조자의 권고에 의해 준비하였다. 돌연변이 유발을 위한 올리고뉴클레오티드는 게놈 또는 안티게놈의 목적하는 위치에 변형된 뉴클레오티드를 도입하여 디자인하였다. 유전적으로 변형된 게놈 또는 안티게놈 조각을 함유하는 플라스미드를 증폭하였고, 돌연변이된 조각을 전장 게놈 또는 안티게놈 클론 중으로 재도입하였다.
본 발명은 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 1 이상의 cDNA로부터 감염성 사람-소 키메라 PIV를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명을 따라서, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA는, 감염성 PIV를 형성하기 위해 필수적인 바이러스 단백질과 세포내 또는 시험관내 공동발현을 위하여 구성된다. "PIV 안티 게놈"은 자손 PIV 게놈의 합성을 위한 틀로서의 기능을 하는 단리된 (+) 센스 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 바람직하게는, 전사, 복제 뉴클레오캡시드를 생성하기 위하여 필요한 단백질을 코딩하는 상보적인 서열, 즉 N, P, 및 L 단백질을 코딩하는 서열의 (+) 센스 전사체와의 혼성 가능성을 최소화하기 위하여, 복제 가능한 중간체 RNA에 상응하는 PIV 게놈 또는 안티게놈의 (+) 센스 버젼인 cDNA가 구성된다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 재조합 PIV의 게놈 또는 안티게놈은 코딩된 바이러스 또는 서브바이러스 입자가 감염성이 되도록 하기 위하여 필수적인 그러한 유전자 또는 그의 부분을 포함하기만 하면 된다. 나아가, 유전자 또는 그의 부분은 1 이상의 폴리뉴클레오티드 분자에 의해서 제공될 수 있다. 즉, 유전자는 단리된 뉴클레오티드 분자로부터 상보관계 등에 의해 제공될 수 있거나, cDNA 게놈 또는 안티게놈으로부터 직접 발현될 수 있다.
재조합 PIV는 재조합체 발현 시스템으로부터 직접적 또는 간접적으로 유도되거나 그로부터 생산된 바이러스 또는 서브바이러스 분자로부터 전파된 PIV 또는 PIV 유사 바이러스 또는 서브바이러스 분자를 의미한다. 재조합체 발현 시스템은 PIV 유전자 발현에 있어서 조절적 역할을 갖는 1 이상의 유전적 성분, 또는 성분들의 어셈블리(예를 들어 프로모터, 구조적 또는 PIV RNA 내로 전사되는 코딩 서열, 및 적절한 전사 개시 및 종결 서열)를 포함하는 조정가능하게 연결된 전사 단위를 포함하는 재조합체 발현 벡터를 사용할 수 있다.
c-DNA 발현된 게놈 또는 안티게놈으로부터 감염성 PIV를 생산하기 위하여, 게놈 또는 안티게놈은 (i) RNA 복제를 할 수 있는 뉴클레오캡시드를 생산하게 하고, (ii) 자손 뉴클레오캡시드가 RNA 복제 및 전사 모두를 할 수 있도록 하기 위하여 필수적인 PIV 단백질과 함께 공동발현된다. 게놈 뉴클레오캡시드에 의한 전사는 다른 PIV 단백질을 제공하고 생산적(productive) 감염을 개시한다. 별법으로, 생산적 감염을 위해 요구되는 추가적 PIV 단백질은 공동발현에 의하여 공급될 수 있다.
본 발명의 감염성 PIV는 PIV 게놈 또는 안티게놈 RNA를 코딩하는 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드와 전사하고 복제하는 뉴클레오캡시드를 생성하기 위해 필요한 바이러스 단백질을 코딩하는 1 이상의 폴리뉴클레오티드와 함께, 세포내 또는 무세포 공동 발현에 의해 생산된다. 바이러스 단백질 중, 감염성 PIV를 생산하기 위해 공동 발현에 유용한 것은 주뉴클레오캡시드 단백질(N), 뉴클레오캡시드 인 단백질(P), 거대(L) 중합효소 단백질, 융합 단백질(F), 혈구응집-뉴라미니다아제 당단백질(HN), 및 매트릭스(M) 단백질이다. 이에 관련하여 또한 유용한 것은 PIV의 C, D, 및 V ORF들이다.
PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA는 감염성 PIV를 형성하기 위해 필요한 바이러스 단백질과 함께 세포내 또는 시험관내의 공동발현을 위해 구성된다. "PIV 안티게놈"이란 자손형 PIV 게놈의 합성을 위한 주형으로 사용되는 단리된 (+) 센스 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 바람직하게는, 전사하고 복제하는 뉴클레오캡시드를 생성하기 위해 필요한 단백질을 코딩하는 상보적인 서열의 (+) 전사체와 혼성화할 가능성을 최소화하기 위해, 복제 중간체 RNA, 또는 안티게놈에 상응 하는 PIV 게놈의 (+) 센스 버젼의 PIV게놈인 cDNA가 구성된다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 재조합 PIV(rPIV)의 게놈 또는 안티게놈은 단지 이들에 의해 코딩되는 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 감염성으로 만드는 데 필요한 이들 유전자 또는 유전자의 일부를 함유하는 것을 필요로 한다. 아울러, 유전자 또는 이들의 일부는 1 이상의 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 제공될 수 있으며, 즉, 유전자는 상보체 또는 별개의 뉴클레오티드 분자의 유사체에 의해 제공될 수 있다. 다른 실시태양에서, PIV 게놈 또는 안티게놈은 플라스미드 또는 헬퍼 세포주에 의해 제공되는 헬퍼 바이러스 또는 바이러스 기능의 관여 없이, 바이러스 성장, 복제, 및 감염에 필요한 모든 기능을 코딩한다.
"재조합 PIV"란 재조합 발현 시스템으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래하거나, 또는 이들로부터 생성된 바이러스 또는 서브바이러스 입자로부터 증식된 PIV 또는 PIV 유사 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 의미한다. 재조합 발현 시스템은 PIV 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 1 이상의 유전 성분 또는 성분들, 예를 들어, 프로모터, PIV RNA로 전사되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 적절한 전사 개시 및 종결 서열의 어셈블리를 포함하는 작동할 수 있게 연결된 전사 단위를 포함한다.
cDNA 발현된 PIV 게놈 또는 안티게놈으로부터 감염성 PIV를 생성하기 위해, 게놈 또는 안티게놈은 (i) RNA 복제를 할 수 있는 뉴클레오캡시드를 생성하기 위해서, 및 (ii) RNA 복제 및 전사 양자를 위한 뉴클레오캡시드 성분을 만들기 위해 필요한 PIV N, P 및 L과 공동발현된다. 게놈 뉴클레오캡시드에 의한 전사는 다른 PIV 단백질을 제공하고, 생산적 감염을 시작한다. 별법으로, 생산적 감염에 필요한 추가 PIV 단백질은 공동발현으로 공급될 수 있다.
또한 상기에서 언급된 바이러스 단백질과 함께 PIV 게놈 또는 안티게놈의 합성은 시험관내(무세포)에서, 예를 들어 결합된 전사-번역 반응 이후 세포 중으로 트랜스팩션하여 달성될 수 있다. 별법으로, 안티게놈 또는 게놈 RNA는 시험관내에서 합성되고, 세포 중으로 트랜스팩션되어 PIV 단백질을 발현한다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 전사하고 복제하는 PIV 뉴클레오캡시드를 생성하기 위해 필요한 단백질을 코딩하는 상보 서열은 1 이상의 헬퍼 바이러스에 의해 제공되나. 이러한 헬퍼 바이러스는 야생형 또는 돌연변이체일 수 있다. 바람직하게는, 헬퍼 바이러스는 PIV cDNA에 의해 코딩되는 바이러스와 표현형적으로 구분될 수 있다. 예를 들어, 헬퍼 바이러스와는 면역적으로 반응하나, PIV cNDA에 의해 코딩되는 바이러스와는 반응하지 않는 모노클론 항체를 제공하는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서, 헬퍼 바이러스를 재조합 바이러스와 분리하기 위해 친화성 크로마토그래피에서 항체가 사용될 수 있다. 이러한 항체의 획득을 보조하기 위해, 돌연변이가 PIV cDNA 중으로 도입될 수 있고, HN 또는 F 당단백질 유전자와 같은 헬퍼 바이러스로부터의 항원 다양성을 제공한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, N, P, L 및 다른 목적하는 PIV 단백질들은 1 이상의 비바이러스 발현 벡터에 의해 코딩되고, 이는 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것들과 동일하거나 상이할 수 있다. 추가 단백질은 바라는 대로 포함될 것이며, 각각은 그 자체 벡터 또는 1 이상의 N, P, L 및 다른 목적하는 PIV 단백질들을 코딩하는 벡터, 또는 전체 게놈 또는 안티게놈에 의해 코딩된다. 게놈 또는 안티게놈 및 트랜스펙트된 플라스미드로부터의 단백질의 발현은, 예를 들어, T7 RNA 중합효소에 대한 프로모터의 조절 하에 있는 각각의 cDNA에 의해 달성될 수 있고, 이어서 감염, T7 RNA 중합효소에 대한 발현 시스템, 예를 들어, T7 RNA 중합효소를 발현하는 우두 바이러스 MVA 균주로 트랜스팩션 또는 트랜스덕션(transduction)하여 제공된다(Wyatt et al., Virology 210:202-205, (1995), 본원에 그 전체 내용이 인용문헌으로 삽입되었음). 또한, 바이러스 단백질 및(또는) T7 RNA 중합효소는 형질전환된 포유류 세포 또는 사전에 형성된 mRNA 또는 단백질의 트랜스펙션에 의해 제공될 수 있다.
PIV 안티게놈은 본 발명의 용도를 위해, 예를 들어, PIV mRNA 또는 게놈 RNA의 역전사된 카피의 중합효소 연쇄 반응 등에 의해 집합체에서 전체 안티게놈을 나타내는 클론된 cDNA 세그먼트를 어셈블리함으로써 구성할 수 있다 (PCR; 예를 들어 미국 특허 번호 제4,683,195 및 4,683,202 및 PCR Protocols: A Guide to Mehods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego (1990)에 기술된 바와 같이, 각각은 본원에 문헌 전체가 인용참증으로 삽입되었음). 예를 들어, 적절한 프로모터 (예를 들어, T7 RNA 중합효소 프로모터)로부터 걸쳐 있고 안티게놈의 좌측 말단을 갖는 cDNA를 포함하는 제 1 구성체가 생성되고, 플라스미드, 코스미드, 파지, 또는 DNA 바이러스 벡터와 같이 적절한 발현 벡터 내에 조합된다. 벡터는 돌연변이 유도, 및(또는) 어셈블리를 용이하게 하기 위하여 디자인된 독특한 제한 부위를 갖는 합성 폴리 링커의 삽입에 의해 변이될 수 있다. 생산을 용이 하게 하기 위하여 N, P, L 및 다른 바람직한 PIV 단백질이 1 이상의 별개의 벡터 내에서 조합될 수 있다. 안티게놈 플라스미드의 우측 말단은 플랭킹 리보좀 및 탠덤 T7 전사 종결자와 같은 추가적 서열을 갖을 수 있다. 리보좀은 해머헤드형 (예를 들어, Grosfeld et al., (1995), 상기 참조)일 수 있는데, 이는 단일 비바이러스 뉴클레오티드를 갖는 3' 말단을 생산할 것이고, 또는, 간염 델타 바이러스 (Perrotta et al., Nature 350:434-436 (1991), 이는 본원에 문헌 전체로서 인용참증으로 삽입되었음)와 같은 다른 적당한 리보좀일 수 있는데, 이는 비-PIV 뉴클레오티드가 없는 3' 말단을 생산할 것이다. 좌측 및 우측 말단은 공통의 제한 부위를 경유하여 연결된다.
다양한 뉴클레오티드 삽입, 결실 및 재배치가 cDNA를 구성하는 동안 또는 그 이후에 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 특정의 목적하는 뉴클레오티드 서열은 적절한 제한 효소 부위를 이용하여 합성되고 cDNA 내의 적절한 영역에 삽입될 수 있다. 별법으로, 부위 특이적 돌연변이 유도, 알라닌 스캐닝, PCR 돌연변이 유도와 같은 기술, 또는 당 기술분야에 잘 알려진 다른 기술들은 cDNA 중으로 돌연변이를 도입하기 위하여 이용될 수 있다.
게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 구성하기 위해 사용된 다른 방법은 서브유닛 cDNA 구성 성분의 수를 하나 또는 두 조각과 같이 적은 수로 감소시키기 위한 개선된 PCR 조건을 사용한 역전사 PCR(예를 들어, Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994, 본원에 인용문헌으로 삽입됨)을 포함한다. 다른 실시태양에서는 다른 프로모터(예를 들어, T3, SP6)가 사용될 수 있거나, 또 는 라이보자임(예를 들어, 헤파타이티스 델타 바이러스)이 사용될 수 있다. 더 큰 크기의 게놈 또는 안티게놈을 더 잘 수용하기 위해 다른 DNA 벡터(예를 들어, 코스미드)가 증식을 위해 사용될 수 있다.
게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, cDNA)는 생산적 PIV 감염을 지지할 수 있는 세포, 예를 들어, HEp-2, FRhL-DBS2, LLC-MK2, MRC-5 및 Vero 세포 중으로 트랜스팩션, 전기침공, 기계적 삽입, 트랜스덕션 등에 의해 적절한 숙주 세포 중으로 삽입될 수 있다. 단리된 폴리뉴크레오티드 서열의 트랜스펙션은 예를 들어, 인산칼륨 매개된 트랜스펙션 (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: Graham and Van der Eb,Virologv 52: 456,1973), 전기침공 (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845,1982), DEAE-덱스트란 매개된 트랜스펙션 (Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1987), 양이온성 지질 매개된 트랜스펙션 (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73-79,1993) 또는 상업적으로 구입할 수 있는 트랜스펙션 시약, 예를 들어, 리포펙트ACE
(LipofectACE
); (매릴랜드주 게티스버그 소재 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies)사) 또는 기타 (상기 문헌 각각은 그 전체 내용이 본원에 인용 문헌으로 삽입되었다)에 의해 배양 세포 중으로 도입될 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 일부 실시태양에서는 N, P, L 및 다른 목적하는 PIV 단백질이 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것들과 표현형적으로 구분되는 1 이상의 헬퍼 바이러스에 의해 코딩된다. 또한, N, P, L 및 다른 목적하 는 PIV 단백질은 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것들과 동일하거나 별개일 수 있는 1 이상의 발현 벡터, 및 이들의 다양한 조합에 의해 코딩될 수 있다. 추가 단백질은 원하는 대로 포함될 수 있으며, 자체 벡터 또는 1 이상의 N, P, L 및 다른 목적하는 PIV 단백질 또는 전체 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 벡터에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 감염성 클론의 PIV를 제공함으로써 PIV 게놈(또는 안티게놈) 내에서 재조합적으로 생산되는 폭넓은 범위의 변경을 허용하고, 목적하는 표현형 변화를 특정하는 확정된 돌연변이를 만든다. "감염성 클론"이란 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 게놈을 생산하기 위한 주형으로 기능할 수 있는 게놈 또는 안티게놈 RNA 중으로 전사될 수 있는 감염성 비리온 중으로 직접적으로 도입될 수 있는 합성 또는 다른 방식의 cDNA 또는 그 생산물, RNA를 의미한다. 상기에서 언급한 바와 같이, 확정된 돌연변이는 다양한 통상적인 기술(예를 들어, 특정 부위 돌연변이 유발)에 의해 게놈 또는 안티게놈의 cDNA 카피 중으로 도입될 수 있다. 본원 상기에서 기술된 것과 같은, 전체 게놈 또는 안티게놈을 어셈블하기 위한 게놈 또는 안티게놈 cDNA 서브단편의 용도는 각각의 영역이 개별적으로 조작될 수 있다는 장점을 가지며, 작은 cDNA 재료는 큰 cDNA 재료보다 보다 용이한 조작을 제공하며, 이후 전체 cDNA로 용이하게 어셈블될 수 있다. 따라서, 전체 안티게놈 또는 게놈 cDNA, 또는 이들의 선택된 서브단편은 올리고뉴크레오티드 지시된 돌연변이 유발을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 이는 단일 가닥 파지미드 형태의 중간체를 통해, 예를 들어 바이오-래드 래버러토리 (캘리포니아주 리치몬드 소재)의 뮤타-진
키트를 사용하여, 또는 스트라타진(캘리포니아주 라 졸라 소재) 채멜리언
돌연변이 유발 키트와 같은 이중 가닥 플라스미드를 직접 주형으로 사용한 방법, 또는 목적하는 돌연변이(들)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 주형 중 하나를 사용한 중합 효소 연쇄 반응에 의해 가능하다. 이후, 돌연변이화된 서브단편은 전체 안티게놈 또는 게놈 cDNA 중으로 어셈블될 수 있다. 다양한 다른 돌연변이 유발 기술이 공지되어 있고, 본 발명의 PIV 안티게놈 또는 게놈 중의 목적하는 돌연변이를 생산하기 위한 용도로 통상적으로 채택될 수 있다.
따라서, 한 예시적 실시태양에서, 돌연변이는 바이로-래드 래버러토리로부터 구입할 수 있는 뮤타-진
파지미드 시험관내 돌연변이 유발 키트를 사용하여 도입된다. 간단하게 말하자면, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA가 플라스미드 pTZ18U 중으로 클로닝되고, CJ236 세포를 형질전화시키기 위해 사용된다(라이프 테크놀로지스). 파지미드 생산물은 제조자가 권고한 대로 생산된다. 올리고뉴클레오티드는 게놈 또는 안티게놈의 목적하는 위치에의 변경된 뉴클레오티드 도입에 의한 돌연변이 유발을 위해 설계된다. 이후, 유전적으로 변경된 게놈 또는 안티게놈을 함유한 플라스미드가 증폭된다.
돌연변이는 단일 뉴클레오티드 변화에서부터 1 이상의 유전자 또는 게놈 세그먼트를 함유한 큰 cDNA 세그먼트의 도입, 결실 또는 대체까지 변화할 수 있다. 게놈 세그먼트는 구조적 및(또는) 기능적 도메인, 예를 들어 단백질의 세포질성, 막횡단 또는 엑토도메인, 결합 또는 다른 단백질과의 다른 생화학적 상호작용을 매 개하는 부위와 같은 활성 분위, 에피토프 부위, 예를 들어, 항체 결합 및(또는) 호르몬성 또는 세포 매개된 면역 반응을 자극하는 부위 등에 상응할 수 있다. 이러한 점에서 유용한 게놈 세그먼트는 단백질의 작은 기능적 도메인 (예를 들어 약 50, 75, 100, 200-500 및 500-1,500개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 에피토프 부위를 코딩하는 게놈 세그먼트의 경우) 약 15-35개의 뉴클레오티드 범위이다.
감염성 PIV 중으로 확정된 돌연변이를 도입할 수 있는 능력은 면원성 및 면역원성 기작의 PIV 조작을 포함하는 많은 응용을 갖는다. 예를 들어, N, P, M, F, HN, 및 L 단백질 및 C, D 및 V ORF 생성물을 포함하는 PIV 단백질의 기능은 단백질 발현 수준을 제거하거나 또는 감소시키거나, 또는 돌연변이체 단백질을 만드는 돌연변이 도입에 의해 조작될 수 있다. 또한, 프로모터, 유전자간 영역, 및 전사 시그날과 같은 다양한 게놈 RNA의 구조적 특성은 본 발명의 방법 및 조성물 내에서 일상적으로 조작될 수 있다. 트랜스-작용 단백질 및 시스-작용 RNA 서열의 영향은 예를 들어, PIV 미니게놈을 사용한 병행 분석에서 전체 안티게놈 cDNA를 사용하여, 용이하게 측정될 수 있으며(Dimock et al., J. Virol. 67:2722-2778, 1993, 본원에 그 전체 내용이 인용문헌으로 삽입되었다), 그 구제 의존적 현상은 복제 독립적 감염성 바이러스에서 회수되기에는 지나치게 억제적일 수 있는 이러한 돌연변이체의 특성 분석에서 유용하다.
본 발명의 재조합 PIV 내의 유전자 또는 게놈 세그먼트의 특정 치환, 삽입, 결실 또는 재배열(예를 들어, 선택된 단백질 또는 단백질 영역, 예를 들어 세포질성 테일, 막횡단 도메인 또는 엑토도메인, 에피토프 부위 또는 영역, 결합 부위 또 는 영역, 활성 부위를 포함하는 활성 부위 또는 영역 등을 코딩하는 게놈 세그먼트의 치환)은 동일하거나 또는 상이한 PIV 또는 다른 기원의 현존하는 "대응" 유전자 또는 게놈 세그먼트와 관련하여 구조적으로 또는 기능적으로 만들어진다. 이러한 변이는 야생형 또는 부모형 PIV 또는 다른 바이러스 균주와 비교하여 목적하는 표현형 변화를 갖는 신규한 재조합체를 생성한다. 예를 들어, 이 유형의 재조합체는 다른 PIV의 엑토도메인에 융합된 한 PIV의 세포질성 테일 및(또는) 막횡단 도메인을 갖는 키메라 단백질을 발현할 수 있다. 이 유형의 다른 예시적인 재조합체는 복제본(duplicate) 면역원성 영역과 같은 복제본 단백질을 발현한다.
본원에서 사용된 것과 같이, "대응" 유전자, 게놈 세그먼트, 단백질 또는 단백질 영역은 일반적으로 상이한 PIV 유형 또는 균주 내의 동일한(즉, 상동이거나 또는 대립유전자형의) 유전자 또는 게놈을 나타내는 이형 기원(예를 들어, 상이한 PIV 유전자, 또는 PIV 유형 또는 균주)의 것이다. 이에 관련하여 선택된 대표적인 대응물은 전체적인 구조적 특성을 공유하는데, 예를 들어 각각의 대응물은 유사한 단백질 또는 단백질의 구조적 도메인 (세포질성 도메인, 막횡단 도메인, 엑토도메인, 결합 부위 또는 영역, 에피토프 부위 또는 영역 등과 같은 것)을 코딩할 수 있다. 대응 도메인 및 다른 코딩 게놈 세그먼트는 도메인 또는 게놈 세그먼트 변이체 중에서 공통적인 생물학적 활성에 의해 확정된 일정 범위의 크기 및 서열 변형을 갖는 종의 집합을 포함한다.
본원에서 개시된 다른 폴리뉴클레오티드와 아울러 본 발명의 재조합 PIV를 생산하기 위한 대응 유전자 또는 게놈 세그먼트는 선택된 폴리뉴클레오티드 "참조 서열 (reference sequence)", 예를 들어 다른 선택된 대응 서열과 흔히 상당한 서열 동일성을 공유한다. 본원에서 사용된 것과 같이 "참조 서열"은 서열 비교의 근거로서 사용되는 확정된 서열, 예를 들어 전장 cDNA 또는 유전자의 세그먼트, 또는 전체 cDNA 또는 유전자 서열이다. 일반적으로, 참조 서열은 20개 뉴클레오티드 이상의 길이, 흔히 25개 이상의 뉴클레오티드 길이이고, 종종 50개 뉴클레오티드 이상의 길이이다. 두 개의 폴리뉴클레오티드가 각각 (1)두 폴리뉴클레오티드 사이에 유사한 서열(즉, 전체 폴리뉴클레오티드 서열의 일부)을 포함하고, (2) 추가로, 두 폴리뉴클레오티드 사이에서 분기하는 서열을 포함하므로, 두 개의(또는 그 이상의_ 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 비교는 일반적으로 서열 유사성을 확인하고 국부적 영역을 비교하기 위해 "비교창(comparison window)"에 걸쳐 두 폴리뉴클레오티드를 비교하여 수행된다. 본원에서 사용된 것과 같은 "비교창"은 폴리뉴클레오티드 서열이 20개 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 참조 서열과 비교될 수 있고, 또한 두 서열의 최적의 배열을 위해 비교창 중의 폴리뉴크레오티드 서열의 일부가 참조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않은 것)과 비교하여 20% 이하의 첨가 또는 결실을 포함할 수 있는, 20개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 위치의 개념적 세그먼트를 말한다. 비교창을 정렬시키기 위한 최적의 서열 배열은 스미스&워터맨 (Smith&Wterman) (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981l 본원에 인용문헌으로 삽입되었음)의 국부적 상동 연산, 니들맨&운쉬(Needlman&Wunsch)(J.Mol.Biol. 48:443, 1970l 본원에 인용문헌으로 삽입되었음), 피어슨&립맨 (Pearson&Lipman)의 유사성 조사 방법 (Proc.Natl.Sci.USA 85:2444, 1988; 본원에 인용문헌으로 삽입되었음), 이들 연산의 컴퓨터처리된 구현(위스콘신 매디슨 소재의 Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. 중 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 정밀 검사에 의해 수행될 수 있고, 다양한 방법에 의해 생성된 최상의 배열(즉, 비교창에서 가장 높은%의 서열 유사성을 만드는)이 선택된다. "서열 동일성"이란 용어는 비교창에서 두 뉴클레오티드 서열이 동일하다(즉, 뉴클레오티드-대 뉴클레오티드 기준으로)는 것을 의미한다. "서열 동일성의 %"는 비교창에서 최적으로 배열된 두 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, U, 또는 I)가 두 서열에서 나타나서 매칭된 위치 수효를 만드는 위치 수를 결정하고, 매칭된 위치 수를 비교창 내의 총 위치 수(즉, 창 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 생성하여 게산한다. 본원에서 사용된 "상당한 동일성"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 서열의 특성을 나타내고, 여기서 20개 이상의 뉴클레오티드 위치의, 흔히 25-50개 이상의 뉴클레오티드의 비교창에서 참조 서열과 비교하여, 폴리뉴클레오티드가 85%이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90 내지 95%의 서열 동일성, 보다 일반적으로는 99%의 서열 동일성을 가지며, 여기서 서열 동일성의 %는 비교창에서 그 합계가 참조 서열의 20% 이하가 되는 결실 또는 첨가를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 참조 서열과 비교하여 계산된다.
이들 폴리뉴클레오티드 서열의 연관성과 아울러, 본 발명의 재조합 PIV에 의해 코딩되는 단백질 및 단백질 영역은 또한 일반적으로 보존적 연관성을 갖도록, 즉, 선택된 참조 폴리뉴클레오티드와 상당한 서열 동일성 또는 서열 유사성을 갖도 록 선택된다. 폴리펩티드에 적용되는 것처럼, "서열 동일성"이란 용어는 펩티드가 상응하는 위치에서 동일한 아미노산을 공유한다는 것을 의미한다. "서열 유사성"이란 용어는 펩티드가 상응하는 위치에서 동일 또는 유사한 아미노산(즉, 보존적 치환)을 갖는다는 것을 의미한다. "상당한 서열 동일성"이란 용어는 디폴트 갭 가중치를 사용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT와 같은 것에 의해 최적으로 배열되었을 때, 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성 또는 그 이상(예를 들어, 99%의 서열 동일성)을 공유한다. "상당한 유사성"이란 용어는 두 펩티드 서열이 유사한%의 서열 유사성을 공유한다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에서 다르다. 보존적 아미노산 치환이란 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 교환가능성을 말한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산군은 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신이고, 지방족-히드록시 측쇄를 갖는 아미노산군은 세린 및 트레오닌이고, 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산군은 아르파라긴 및 글루타민이고, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산군은 아스파라긴 및 글루타민이고, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판이고, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산군은 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이고, 황 함유기를 함유하는 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환군은 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에서 사용된 20개의 천연에 존재하는 아미노산에 대한 약자는 통상의 관습을 따랐다(Immunol-A Synthesis, 2nd ed., E. S. Golub & D.R. Gren, eds, Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991, 본원에 인용문헌으로 삽입되었음). 또한, 20개의 통상의 아미노산, α,α-이치환된 아미노산과 같은 비자연적인 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산, 및 다른 통상적이지 않은 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산)이 본 발명의 폴리펩티드의 적합한 성분일 수 있다. 통상적이지 않은 아미노산의 예는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N, N, N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시라이신, ω-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-히드록시프롤린)을 포함한다. 아울러, 아미노산은 당화, 인산화 등에 의해 변이될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 후보를 선택하기 위해, 생육성, 약독화, 및 면역원성 표준이 잘 알려진 방법에 따라 결정된다. 본 발명의 백신에서 가장 요구되는 바이러스는 생육성을 유지해야 하고, 안정한 약독화 표현형을 가져야 하며, 면역화된 숙주에서 복제를 나타내야하고(비록 낮은 수준이라도), 또한 야생형 바이러스로부터의 후속 감염에 의해 발생되는 심각한 질환에 대한 방어를 부여하기에 충분한 백신에서의 면역 반응의 생성을 효과적으로 유발할 수 있어야 한다. 본 발명의 재조합 PIV는 생육성일뿐 아니라 종전의 백신 후보보다 보다 적절하게 약독화되었으나, 생체내에서 보다 유전적으로 안정하다(방어성 면역 반응을 자극할 수 있는 능력을 유지하고, 또한 어떤 경우에는 다수의 변이에 의해 제공된 방어를 확장할 수 있고, (예를 들어 상이한 바이러스 균주 또는 아군에 대한 방어를 유도함), 또는 상이한 면역학적 기초에 의한 방어를 확장할 수 있다(예를 들어, 분비성 면역글로빈 대 혈 청 면역글로빈, 세포성 면역 등).
본 발명의 재조합 PIV는 백신 사용을 위해 적절한 약독화, 표현형 복귀 돌연변이에 대한 내성, 및 면역원성을 확인하기 위해 일반적으로 채택되고 잘 알려진 시험관내 및 생체내 모델에서 시험될 수 있다. 시험관내 분석에서, 변이된 바이러스(예를 들어, 여러번 약독화되고, 생물학적으로 유도된 또는 재조합 PIV)가 예를 들어, 복제 수준, 바이러스 복제의 온도 감수성, 즉 ts 표현형, 및 작은 플라크 또는 다른 목적하는 표현형에 대해 시험된다. 변이된 바이러스는 PIV 감염의 동물 모델에서 추가로 시험된다. 다양한 동물 모델이 기술되었고, 본원에 삽입된 다양한 인용 문헌에서 요약된다. 설치류 및 비사람 영장류를 포함하는, PIV 백신 후보의 약독화 및 면역원 활성을 평가하기 위한 PIV 모델 시스템은 당업계에서 널리 채택되었고, 이들로부터 얻은 데이타는 사람에서의 PIV 감염, 약독화 및 면역원성과 잘 일치한다.
상기 기술과 일치하여, 본 발명은 또한 백신 용도를 위한 단리된 감염성 재조합 PIV 바이러스 조성물을 제공한다. 백신 성분인 약독화된 바이러스는 단리되었으며, 또한 일반적으로 정제된 형태이다. "단리된"이란 감염된 개체의 비인강과 같은 야생형 바이러스의 천연 환경이 아닌 상태의 PIV를 의미한다. 보다 일반적으로, 단리된이란 조절된 설정으로 증식할 수 있고 특성 분석될 수 있는 세포 배양물 또는 다른 인공적 배지의 성분으로서 약독화된 바이러스를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 약독화된 PIV는 감염된 세포 배양물에 의해 생산되고, 세포 배양물로부터 단리되고, 안정화제에 첨가될 수 있다.
백신 용도를 위해, 본 발명에 따라 생산된 재조합 PIV는 백신 제제 중에서 직접적으로 사용될 수 있거나, 바란다면, 당업자에게 잘 알려진 동결 건조 프로토콜을 사용하여 동결 건조될 수 있다. 동결 건조된 바이러스는 일반적으로 약 4℃에서 유지될 것이다. 사용할 준비가 되었을 때, 동결 건조된 바이러스는 하기에서 더 기술되는 것과 같이, 애주번트와 함께 또는 애주번트 없이, 안정화제 용액, 예를 들어 식염수 또는 SPG, Mg++ 및 HEPES 중에서 재구성된다.
본 발명의 PIV 백신은 본원에서 기술된 대로 생산된 면역원적으로 효과적인 양의 PIV를 활성 성분으로 함유한다. 변형된 바이러스는 생리학적으로 허용되는 담체 및(또는) 애주번트와 함께 숙주 중으로 도입될 수 있다. 유용한 담체는 당업계에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, 물, 완충된 물, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 하알루론 산 등을 포함한다. 생성된 수용액은 그 용도를 위해 패키지되거나, 동결건조될 수 있고, 동결 건조된 생산물은 상기에서 언급한 것과 같이, 투여 전에 멸균된 용액과 합쳐질 수 있다. 조성물은 pH 조정 및 완충제, 삼투성 조정제, 습윤제 등, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 젖산 나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등과 같은, 적절한 생리적 조건에 요구되는 제약학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 허용되는 애주번트는 당업계에서 잘 알려진 많은 다른 애주번트 중에서 불완전 프로인트 애주번트, MRL TM(3-o-디아실화된 모노포스포릴 리미드 A; 몬타나주 해밀튼 소재의 RIBI 이뮤노켐 리서치, 인크(RIBI ImmunoChem Researhc, Inc.) 및 IL-12(매사츄세츠주 캠브리지 소재, 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)를 포함한다.
본원에서 기술된 대로 PVI 조성물로 면역화한 후, 에어로졸, 비말, 경구, 국부적 또는 다른 경로로 숙주의 면역 시스템이 PIV 바이러스 단백질, 예를 들어, F 및 HN 당단백질에 특이적인 항체를 생산함으로써 백신에 반응한다. 본원에서 기술한 대로 생산된 PIV의 면역원적으로 효과적인 양으로 백신 접종한 결과, 숙주는 PIV 감염에 대해 최소한 부분적으로 또는 완전히 면역이 되었거나, 또는 심하지 않은 또는 심각한 PIV 감염의 발현에 내성이 된다.
백신이 투여되는 숙주는 PIV 또는 밀접한 관련이 있는 바이러스에 감염되기 쉬운 모든 포유류일 수 있으며, 이 숙주는 백신 균주의 항원에 대해 방어성 면역 반응을 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 사람 및 수의학적 용도를 위한 백신을 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 PIV를 함유하는 백신 조성물은 숙주 자체의 면역 반응 능력을 상승시키기 위해 PIV에 감염되기 쉽거나 또는 감염될 위험이 있는 숙주에 투여된다. 이 같은 양은 "면역원적으로 효과적인 양"으로 정의된다. 이 용도에서, 효과적인 양 내에서 투여되어야 하는 정확한 PIV 양은 숙주의 건강 상태 및 체중, 투여 방식, 제제의 성질 등에 의존할 것이나, 일반적으로 숙주 당 약 103 내지 107 플라크 형성 단위(PFU) 또는 그 이상의 바이러스, 보다 흔히 숙주 당 104 내지 106 PFU의 범위일 것이다. 어떠한 경우에서든, 백신 제제는 심각하거나 또는 생명을 위협하는 PIV 감염에 대해 숙주 환자를 효과적으로 방어하기에 충분한 본 발명의 변이된 PIV 의 양을 제공해야 한다.
본 발명에 따라 생산된 PIV는 다수의 PIV 혈청형 또는 균주에 대한 방어를 달성하기 위해 다른 PIV 혈청형의 바이러스와 함께 결합될 수 있다. 별법으로, 다수의 PIV 혈청형 또는 균주에 대한 방어는 본원에서 기술된 대로 한 바이러스 중으로 엔지니어링된 다수의 혈청형 또는 균주의 방어성 에피토프를 결합하여 달성될 수 있다. 일반적으로, 상이한 바이러스가 투여되었을 때, 이들은 혼합물일 수 있으며, 동시에 투여될 수 있으나, 또한 이들은 개별적으로 투여될 수도 있다. 한 균주에 의한 면역화는 동일하거나 또는 상이한 혈청형의 상이한 균주를 방어할 수 있다.
어떤 경우, 본 발명의 PIV 백신을 다른 병인, 특히 다른 유아기 바이러스에 대해 방어성 반응을 유도하는 백신과 함께 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 다른 일면에서, 본원에서 기술한 것과 같이, 감염성 PIV를 생산하기 위해 사용되는 PIV 게놈 또는 안티게놈 중으로 이들 방어성 항원을 코딩하는 서열을 도입함으로써, PIV는 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 또는 홍역 바이러스와 같은 다른 병원체의 방어성 항원에 대한 벡터로 사용될 수 있다.
모든 개체에서, 정확한 양의 재조합 PIV 백신이 투여되고, 투여 시간 및 반복은 환자의 건강 상태 및 체중, 투여 방식, 제제의 성질 등에 기초하여 결정될 것이다. 투여량은 일반적으로 환자 당 약 103 내지 107 플라크 형성 단위(PFU) 또는 그 이상의 바이러스, 보다 흔히 환자 당 104 내지 106 PFU의 범위일 것이다. 어떤 경우에도, 다른 방법들 중에서 보체 고정, 플라크 중성화 및(또는) 효소 연결된 면역흡착 분석에 의해 측정될 수 있는 것과 같이, 면역 제제는 항 PIV 면역 반응을 효과적으로 자극하거나 또는 유도하기에 충분한 약독화된 PIV 양을 제공해야 한다. 이러한 점에서, 개체는 또한 상부 호흡기 질환의 신호 및 증상이 모니터링된다. 침팬지에 대한 투여와 같이, 백신의 약독화된 바이러스는 야생형 바이러스 보다 약 10배 또는 그 보다 낮은 수준으로, 또는 불완전하게 약독화된 PIV 수준에 비교하였을 때 10배 또는 그 보다 낮은 수준으로 백신 투여체의 비인강에서 성장한다.
신생아 및 유아에 있어서, 충분한 수준의 면역성을 유발시키기 위해서는 다중의 접종이 요구될 것이다. 접종은 생후 1 개월 이내에 시작되어서 소년기 전반에 걸쳐 2 개월, 6 개월, 1 년 및 2 년 간격으로 이루어져야 하며, 이렇게 하면 자연(야생형) PIV 감염으로부터 충분한 정도의 방어가 될 것이다. 유사하게, 반복되거나 심각한 PIV 감염이 쉬운 성인(예를 들어 보건관련 종사자, 보육원 종사자, 어린아이의 가족, 노인들, 손상된 심폐 기능을 가진 개인)도 면역 반응을 유발하고 유지시키기 위하여 다중 접종이 요구된다. 유발된 면역성의 수준은 중화 분비 및 혈청 항체,및 조절량 또는 바람직한 수준의 방어를 유지하기 위해서 필수적인 예방접종의 양을 측정함으로써 모니터링할 수 있다. 더 나아가, 상이한 백신 바이러스는 상이한 수용군에 대한 접종으로 나타날 수 있다. 예를 들어, 사이토카인 또는 T 세포 에피토프에 풍부한 추가적 단백질을 발현하는 PIV 균주는 유아 보다는 성인에게 특히 유리할 것이다.
본 발명에 따라 생산된 PIV 백신은 다수의 PIV 서브그룹 또는 균주에 대하여 방어성을 획득하기 위하여 다른 PIV의 서브그룹 또는 균주의 항원을 발현하는 바이러스와 결합될 수 있다. 별법으로, 본원에서 기재된 바와 같이 백신 바이러스는 하나의 PIV 균주 내로 엔지니어링된 다수 PIV 균주 또는 서브그룹의 방어적 에피토프를 함입할 수 있다.
본 발명의 PIV 백신은 개체가 순차적으로 야생형 PIV에 감염되었을 때 폐렴, 기관지염과 같은 심각한 하부 호흡기 질환에 대하여 면역 반응의 방어성을 유발시킨다. 자연적으로 순환하는 바이러스는 특히 상부 호흡 기도에서 감염을 일으킬 수 있지만, 예방 접종 및 야생형 바이러스의 순차적 감염에 의한 저항성의 증폭의 결과로 비염의 가능성은 매우 크게 감소된다. 예방 접종 후, 시험관내 및 생체내에서 (동일한 서브그룹의) 동종의 야생형 바이러스를 중화시킬 수 있는 혈청 및 분비 항체가 생성된 숙주를 감지할 수 있었다. 많은 경우에서 숙주 항체는 또한 상이한 비-백신 서브그룹의 야생형 바이러스를 중화시킬 수 있을 것이다.
본 발명의 바람직한 PIV 백신 후보는 인체에서 자연적으로 순환하는 야생형 바이러스와 비교하여 상당한 독성의 감소를 보여준다. 바이러스는 충분히 약독화 되어서 감염 증상이 대부분의 면역 접종된 개체에서 나타나지 않을 것이다. 경우에 따라서는 약독화된 바이러스가 면역 접종되지 않은 사람에게 전파될 수도 있다. 그러나, 그 독성은 충분히 제거되어서 예방 접종된 또는 우연히 감염된 숙주에서는 심각한 하부 호흡 기도 감염이 발생하지 않는다.
PIV 백신 후보의 약독화 수준은, 예를 들어 면역화된 숙주의 호흡 기도에 존재하는 바이러스의 양을 정량화하여 그것을 야생형 PIV 또는 후보 백신 균주로 평 가되어지는 다른 약독화된 PIV의 양과 비교함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약독화된 바이러스는 침팬치와 같이 매우 감염되기 쉬운 숙주의 상부 호흡 기도 내에의 복제의 제한 정도가 야생형 바이러스의 복제의 수준과 비교할 때 약 10 내지 1000배나 크다. 상부 호흡 기도에서의 바이러스 복제와 관련되어 있는 비루 발생을 더욱 감소시키기 위해서는, 이상적인 백신 후보 바이러스가 상부 및 하부 호흡 기도 모두에서 제한된 수준의 복제를 나타내어야 할 것이다. 그러나, 본 발명의 약독화된 바이러스는 예방 접종된 개체에서의 방어성을 부여하기 위하여 사람에게 충분한 감염성 및 면역원성이 있어야 한다. 감염된 숙주의 비인강에서의 PIV 수준을 측정하는 방법은 문헌상으로 잘 알려져 있다.
본 발명의 백신에 의해 유발된 면역성의 수준은 중화 분비 및 혈청 항체의 양을 측정함으로써 모니터링할 수 있다. 이러한 측정을 기초로 하여, 백신의 용량을 조절하거나 백신 접종을 목적하는 수준의 방어성를 유지하기 위해 필요한 만큼 반복할 수 있다. 나아가, 상이한 백신 바이러스는 상이한 수용 그룹에 유리할 수 있다. 예를 들면, T 세포 에피토프가 풍부한 추가적 단백질을 발현하도록 엔지니어링된 PIV 균주는 유아 보다는 성인에게 특히 유리할 것이다.
본 발명의 다른 측면에서, PIV는 호흡 기도의 일시적인 유전자 치료를 위한 벡터로서 사용될 수 있다. 이러한 실시태양에 따라서, 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈은 원하는 유전자 생성물을 코딩할 수 있는 서열을 함입한다. 원하는 유전자 생성물은 PIV 발현을 조절하는 프로모터와 동일 또는 상이한 프로모터의 조절하에 있다. 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈과 N, P, L 및 다른 목적하는 PIV 단백질을 함께 공동발현 시키고, 목적하는 유전자 생성물을 코딩하는 서열을 포함하는 것에 의하여 생산된 감염성 PIV를 환자에게 투여한다. 투여는 전형적으로 치료받는 환자의 호흡 기도에 에어로졸, 네뷸라이저, 또는 다른 국소 처리 방법에 의한다. 재조합 PIV는 치료적 또는 예방적 수준의 목적하는 유전자 생성물의 발현을 가져오는 충분한 양으로 투여된다. 이 방법으로 투여될 수 있는 대표적인 유전자 생성물은 일시적 발현에 적합한 것이 바람직하다. 예를 들어 인터루킨-2, 인터루킨-4, 감마-인터페론, GN-CSF, G-CSF, 에리트로포이에틴, 및 다른 사이토카인, 글루코세레브로시다제, 페닐알라닌 히드록실라제, 낭성 섬유증 횡단막 전도 조절자(CFTR), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 사이토톡신, 암억제 유전자, 안티센스 RNA, 및 백신 항원을 포함한다.
하기 실시예는 예시로 제공되며, 제한은 없다. 본 실시예들은 유전자 발현을 완전히 제거하는 C ORF에로 대표적인 돌연변이를 도입하는 재조합 cDNA 시스템의 이용을 기술한다. 또한, 본 발명의 대표적인 것으로 상응하는 단백질 발현을 잠재화하기 위하여 D 및 V ORF 내로의 정지 코돈의 도입을 포함하는 돌연변이가 구성되고 평가되었다. 이러한 돌연변이의 바이러스 복제 및 병원성에 대한 효과가 기술되며, 이로써 PIV에 대한 생약독화된 백신을 개발함에 있어서 이러한 돌연변이의 유용성이 확증된다.
하기하는 rC-KO라고 명명된 돌연변이 바이러스에서, C 개시 코돈을 메티오닌에서 트레오닌으로 변화시키고 C-ORF의 7번 및 26번 아미노산 위치에 2 개의 정지 코돈을 도입함으로써 C 단백질의 발현은 제거되었다. 제2 돌연변이체 바이러스에 서, rC-KO 돌연변이체는 쥐 및 영장류 모델을 모두 사용하여 예시된 바와 같이 시험관내 및 생체내에서 매우 약독화 되었다. 또한, rC-KO는 야생형 HPIV3의 감염에 대하여 실질적인 방어성을 제공하였다.
개별적인 D 및 V ORF의 방해는 시험관내 및 생체내에서 바이러스 복제에 상당한 영향을 주지는 못하였지만, 양자 공동의 방해는 생체내에서의 복제를 약독화 시켰다. 이러한 결과는 HPIV3의 C, D 및 V 단백질은 각각 바이러스 복제에 기여하고, 예시적 돌연변이가 재조합 PIV 백신 후보를 개발하는데 강력한 수단임을 나타낸다.
[실시예1]
HPIV3 C, D, 및 V ORF에서 넉아웃 돌연변이의 구성
세포 및 바이러스
사람 HEp-2 및 원숭이 LLC-MK2 단층 세포 배양을 2% 우태아 혈청, 젠타마이신 설페이트(50ug/mL), 및 4mM 글루타민이 부가된 OptiMEM1 (라이프 테크놀로지, Gaithersburg, MD)에 유지한다. 박테리오파지 T7 RNA 중합효소를 발현하는 MVA(modified vaccinia strain Ankara) 재조합 바이러스는 엘. 와이어트 박사와 비. 모스 박사로부터 제공받는다(Wyatt et al., Virology 210: 202-205, 1995). PIV3의 JS 야생타입(wt) 균주 및 그 약독화된 ts 유도체 JS cp45는 상기한 바와 같이 LLC-MK2세포에서 번식하였다(Hall et al., Virus Res. 22: 173-184, 1992).
cDNAs
JS wt 바이러스 및 전체 15462 nt 안티게놈{p3/7(131)2G}을 코딩하는 전장 cDNA 클론은 앞서 기재하였다(Genebank accession #Z11575)[Durbin et al., Virology 235: 323-332,1997; 참조, 1998년 5월 22일자로 출원된 미국 특허 출원 일련번호 09/083,793; 1997년 5월 23일 출원된 미국 가출원 번호 60/047,575 (국제공개번호 WO 98/53078에 대응) 및 1997년 9월 19일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/059, 각각 본원에서 인용참증으로 삽입됨]. 이 클론은, 하나는 C ORF의 발현이 완전히 제거되었고 두번 째와 세번 째는 D 및 V 판독틀이 각각 제거되었으며 네번 째는 D 및 V 판독틀 돌연변이가 결합된 4 개의 돌연변이된 cDNA의 생산을 위한 주형으로 사용된다(표1, 도1).
p3/7(131)2G (안티게놈의 nt 1215-3903)의 PmlI 내지 BamHI 단편을 다중 클로닝 영역내 PmlI 부위를 포함하도록 변이된 플라스미드 pUCl19{pUCl19 (PmlI-BamHI)} 벡터 내로 서브클론하였다. 이어서 쿤켈의 방법(Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382,1987)을 사용하여 하기하는 C, D, V ORF로 돌연변이를 도입하는 특정 부분 돌연변이 유발을 pUC119(PmlI-BamHI)에 행하였다.
C 넉아웃 돌연변이 (rC-KO)를 코딩하는 antigenomic cDNA의 구성.
C ORF의 발현을 제거하는 돌연변이를 도입할 2 개의 프라이머를 사용하였다(표1, 도1C). 제 1 돌연변이 유발성 프라이머는 전장 안티게놈의 1795번 위치의 뉴클레오티드를 변경함으로써(T→C) C ORF의 개시 코돈을 ATG에서 ACG로 변형하였다(메티오닌에서 트레오닌). 제 2 돌연변이 유발성 프라이머는 뉴클레오티드 1869번 위치를 C에서 A로 변형함으로써 C ORF의 아미노산 26번 위치의 세린을 정지 코돈으 로 교체하였다. C ORF에 도입된 이러한 돌연변이들은 P ORF에서 잠재적이다.
D, V 및 DV 넉아웃 돌연변이 (rD-KO, rV-KO, rDV-KO)를 코딩하는 안티게놈 cDNA의 구성
개별적인 D 및 V ORF의 발현을 방해하는 돌연변이를 도입하였다. D 넉아웃 프라이머는 전장 안티게놈의 2692번, 2695번, 2698번의 뉴클레오티드 위치에서 C에서 A로의 변형을 도입하였다(표1, 도1). 도 1C에 나타나는 D 단백질의 372개의 아미노산의 키메라 D 단백질 내 코돈 303번 이후의 D 단백질의 조기 종결을 초래하는 이러한 점 돌연변이들은 추정적 D ORF 내의 3 개의 연속적인 정지 코돈을 생성한다. D ORF의 동시 코딩 변환을 야기함 없이, 이러한 정지코돈들을 D ORF에서 먼저 도입할 수는 없었다. 따라서, 돌연변이된 ORF의 발현은 완전히 제거되지 않았지만, P의 N-말단 241 개의 아미노산에 D 도메인의 62 개의 아미노산(131 개가 아님)이 융합된, 절단된 D 단백질을 생성할 수 있었다. V 넉아웃 돌연변이 유발성 프라이머는 전장 안티게놈(표 1)의 뉴클레오티드 위치 2845번(A를 T로) 및 2854번(C를 T로)에서 2 개의 점 돌연변이를 도입하였다. 이 돌연변이들은 초기에 추정적 V ORF에서 정지 코돈(17번 및 20번 아미노산 위치)을 생성하였다. 이러한 돌연변이들은 P ORF에서는 잠재적이나, D 단백질에서는 2 개의 아미노산 치환, 즉 Q354L 및 A357V를 유도한다. 프라이머 모두는 결합된 DV 넉아웃 돌연변이를 생성하기 위해 단일 돌연변이 유발 반응에서 함께 사용되었다.
각각의 전장 클론의 Pm1I 내지 BamHI 단편은 도입된 돌연변이의 존재 및 다른 돌연변이가 우연하게 도입되지 않았다는 점을 확인하기 위하여 전체적으로 시퀀 싱되었다. 이어서 이러한 단편들은 상기된 바와 같이 전장 클론 p3/7(131)2G 내로 각각 다시 클론되어서(Durbin et al., Virology 235: 323-332,1997) 4 개의 상이한 안티게놈 cDNA 클론을 생성하였다.
[실시예2]
재조합 C 넉아웃(rC-KO), D 넉아웃(rD-KO), V 넉아웃(rV-KO), 및 DV 넉아웃(rDV-KO) 돌연변이의 회수 및 특성화
C, D, V, 또는 DV 넉아웃 돌연변이를 갖는 전장 안티게놈 cDNA를 LipofectACE(라이프 테크놀로지)를 사용하는 지지 플라스미드{pTM(N), pTM(P no C), pTM(L)}와 함께 6-웰 플레이트(Costar, Cambridge, MA) 상의 HEp-2 세포에 트렌스펙트 시켰고, 문헌[Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997]이 전술한 바와 같이 세포들을 MVA-T7으로 동시에 감염시켰다(또한, 1998년 5월 22일자로 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제09/083,793호,; 1997년 5월 23일자로 출원된 미국 가출원번호 제60/047,575호,(국제공개번호 WO 98/53078에 대응) 및 1997년 9월19일자로 출원된 미국 가특허출원번호 제60/059,385호를 참조, 각각 본원에 인용참증으로 삽입됨). pTM(P no C)는, C 번역 개시 부위가 ATG에서 ACG로 돌연변이되었다는 점(C ORF의 제 1 아미노산을 메티오닌에서 트레오닌으로 변형함)을 제외하고는 전술한 pTM(P)과 동일하다(상동). 32℃에서 3일 동안 배양한 후, 형질 도입 수확물은 T25 플라스크내의 신선한 LLC-MK2 세포 단층으로 계대 배양하였다(계대 배양 1이라고 함). 전술한 바와 같은(상동), PIV3 HN 특이적 단일 항체로 염색하는 면역 과산화 효소에 의해 가시화되는 플라크를 갖는 LLC-MK2 단층 배양체 상의, D, V, DV 넉아웃 계대 배양 1 수확물에 존재하는 바이러스의 양은, 플라크 역가 측정법에 의하여 측정되었다. C 넉아웃 바이러스는 성장이 약한 것으로 나타났으므로, 계대 배양 1 수확물을 T75 플라스크 내의 LLC-MK2 세포 단층에서 제 2 계대 배양하여 증식시켰다. 계대 배양 2 수확물에 존재하는 바이러스의 양은 상술한 바와 같이 측정하였다.
이어서 계대 배양 1 수확물의 상층액에 존재하는 D, V, DV 넉아웃 바이러스를 상술한 바와 같이 LLC-MK2 세포 상에서 3 회 플라크 정제하였다(Hall et. al., Virus Res. 22: 173-184, 1992, 본원에서 인용참증으로 삽입되었음). C 넉아웃 바이러스는, 용이하게 확인할 수 있는 플라크를 형성할 수 없으므로, 플라크 정제에 의해 생물학적으로 클론될 수 없었다. 따라서, LLC-MK2 세포의 96-웰 플레이트(매 희석 당 12-웰) 상에서 2 배 희석하여 최종적으로 희석하였다. 플라크 정제 또는 최종 희석의 3 회차부터 얻어진 생물학적으로 클론된 재조합 바이러스를 이어서 32℃에서 LLC-MK2 세포에서 2 배로 증식하여 바이러스에 추가적 특성을 제공하였다.
회수된 재조합 바이러스의 서열 분석
전술한 바와 같이 바이러스를 폴리에틸렌 글리콜 침전에 정제된 배지의 감염 세포 단층으로부터 응축하였다(Durbin et al., Virology 235: 323-332,1997). RNA는 트리졸(TRIzol) 시약(라이프 테크놀로지)으로 제조사의 권고 방법에 따라 정제하였다. RT-PCR을 어드밴티지(Advantage) RT-for-PCR 키트(Clontech, Palo Alto, CA)를 가지고 권고 프로토콜에 따라 수행하였다. 조절 반응은, PCR 생성물이 바이러스 RNA로부터만 유도되었고, 혹시 모를 오염된 cDNA로부터 유도되지 않았 음을 확인하기 위하여 본 반응으로부터 역전사 효소가 제외된 것을 제외하고는 동일하다. 전장 안티게놈의 1595번-3104번의 뉴클레오티드에 걸쳐 있는 PCR 단편을 생성하기 위하여 프라이머를 사용하였다. 이 단편은 재조합 바이러스의 전체 C, D 및 V ORF를 포함한다. 생성된 PCR 생성물은 디데옥시뉴클레오티드 서열분석법을 사용하여 시퀀싱하였다(New England Biolabs, Beverly, MA).
면역 침강법에 의한 단백질 분석
2 개의 상이한 C 펩티드(Research Genetics, Huntsville, AL)에 대한 다수 항원 펩티드(MAP) 기술에 의해 토끼에서 2 개의 PIV3 C-특이적 항혈청을 생성하였다. 2 개의 펩티드는 C 단백질의 아미노산 30-44 및 60-74 영역을 걸쳐 있었다. 각 C 펩티드의 8개의 카피를 분기된 담체 코어 상에 놓고, 프로인드(Freund) 애주번트로 토끼에 각각 주입하였다(펩티드 당 2 마리의 토끼). 토끼를 2 주 및 4 주에 지정 MAP 으로 추가 주사하고, 4, 8 및 10 주에 채혈하였다. 각 항혈청은 고 역가로 면역원으로 사용되는 C 펩티드를 인식하였고, 방사면역침강 측정법(RIPA)에서 HPIV3 감염 세포로부터 C 단백질을 침전시켰다. 이와 유사하게, 본원 발명자들은 D 및 V 단백질에 대한 항혈청을 생산하려고 노력하였으나, 성공하지 못하였다. 생성된 항혈청은 펩티드 자체에 대해 낮은 역가를 가졌으며, 본원 발명자들은 야생형 바이러스로 감염된 세포에 의해 생성되는 것으로 추정된 D 또는 V 단백질을 검출할 수 없었다.
LLC-MK2 세포의 T25 세포 단층을 감염 다중도(MOI) 5로 rC-KO 또는 재조합 JS 야생형 바이러스(rJS)로 감염시키거나, 모의 감염시키고, 32 ℃에서 배양하였 다. 감염 24 시간 후에, 단층을 메티오닌-마이너스 DMEM (라이프 테크놀로지)으로 세척하고, 메티오닌-마이너스 DMEM 내의 10 uCi/u의 35S 메티오닌이 존재 하에서 6 시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 수확하고, 3 회 세척하고, 1 ml의 RIPA 완충액{1% (w/v) 나트륨 데옥시콜레이트, 1% (v/v) 트리톤 X-100, 0.2% (w/v) SDS, 150 mM NaCl, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4}에서 재현탁시키고, 해동시키고, 6500 x g 으로 펠렛화하였다. 세포 추출물을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기고, 2 개의 C 항혈청 혼합물(각 5 ㎕)을 각 샘플에 첨가하고, 일정한 속도로 혼합하면서 4 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 회수된 바이러스가 과연 HPIV3인지 확인하기 위해, HPIV3의 HN 당단백질을 인식하는 mAb 454/11 및 101/1의 혼합물(van Wyke Coelingh 등, J. Virol. 61:1473-1477, 1987) 10 ㎕를 각각의 샘플에 첨가하였다. 단백질 A 세파로스 비드(Sigma, St. Louis, MO)의 10% 현탁액 200 ㎕를 각 샘플에 첨가한 다음, 4 ℃에서 밤새 일정한 속도로 혼합하여 면역 복합체를 침전시켰다. 각 샘플을 변성시키고, 환원하고, 제조자의 추천에 따라 4-12% 폴리아크릴아미드 겔(NuPAGE, Novex, San Diego, CA)로 분석하였다. 겔을 건조시키고, 자가방사기록법에 의해 분석하였다.
rPIV3s의 여러 주기 복제
T25 플라스크 중의 LLC-MK2의 단층을 0.01의 MOI에서 rCKO, rDV-KO 또는 rJS로 이중 감염시키고, 5% CO2 중에서 32 ℃에서 배양하였다. 7 일 연속하여 24 시간 간격으로 각 플라스크로부터 샘플 250 ㎕를 회수하고, 플래시 동결하였다. 동량의 신선한 배양액을 각 시점에서 교체하였다. 각 샘플을 32 ℃에서 7 일 동안 배양된 96-웰 플레이트 중의 LLC-MK2 세포 단층에서 역가 측정하였다. 혈구 흡착에 의해 바이러스를 검출하고, log10TCID50/ml로서 보고하였다.
동물 시험
21 마리로 된 군의 4-6 주령 골든 시리안(golden Syrian) 햄스터를 105 PFU의 rC-KO, rDV-KO, rJS, CP45(JS 야생형 바이러스의 생물학적으로 유래된 생 약독화 유도체), 또는 호흡기 신시티움 바이러스(RSV)를 함유하는 EMEM (라이프 테크놀로지)으로 동물 당 0.1 ml씩 비강내로 접종하였다. 접종 3, 4 및 5 일 후에, RSV를 받은 것을 제외한, 각 군으로부터 5 마리의 햄스터를 죽이고, 폐 및 비갑개를 얻었다. 비갑개 및 폐를 균질화하여 각각 L-15 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) 중의 10% 또는 20% w/v 현탁액을 생산하였고, 샘플을 신속히 동결시켰다. 샘플에 존재하는 바이러스를 32 ℃에서 7 일 동안 배양된 96-웰 플레이트 중의 LLC-MK2 세포 단층에서 역가 측정하였다. 혈구 흡착에 의해 바이러스를 검출하고, 매일 5 마리로 된 각 군에 대하여 평균 log10TCID50/g을 계산하였다. 접종 0 일 및 28 일 후에 각 군 중에서 남은 6 마리의 햄스터로부터 혈청을 수집하였다. 상술한 바와 같은 혈구응집 억제 측정법(HAI)에 의해 각 바이러스에 대한 혈청 항체 반응을 평가하였다 (van Wyke Coelingh et al., Virology 143: 569-582, 1985). 28 일에, RSV로 면역화된 것을 포함하여, 각 군에서 남아있는 햄스터를 생 물학적으로 유래된 106 PFU의 PIV3 JS 야생형 바이러스로 비강내로 감염시켰다. 감염 후 제4 일에 동물을 죽이고, 폐 및 비갑개를 얻고, 상술한 바와 같이 처리하였다. 감염 샘플에 존재하는 바이러스의 양을 상술한 바와 같이 결정하였다. 동물을 감염시키지 않는다는 것을 제외하고는, rD-KO 및 rV-KO를 상술한 바와 같이 햄스터에 투여한 별도의 시험을 수행하였다.
레서스(rhesus) 원숭이에서의 이전 시험에 이미 기술된 바와 같이 (Durbin et al., Vaccine 16:1324--30, 1998), 각각 4 마리의 동물로 된 군의 아프리카 그린 원숭이(AGMs)를 106 PFU의 rC-KO, rDV-KO, JS 야생형 또는 cp45로 비강내 및 기관지내 접종하였다. 접종 후 12일 동안 계속하여 매일 비인두 스와브 샘플을 수집하고, 기관지 세척 샘플을 접종 2, 4, 6, 8 및 10 일 후에 수집하였다. 표본을 플래시 동결하고, 모든 표본이 수집될 때까지 -70 ℃에서 저장하였다. 샘플에 존재하는 바이러스를 32 ℃에서 7 일 동안 배양된 96-웰 플레이트 중의 LLC-MK2 세포 단층에서 역가 측정하였다. 혈구 흡착에 의해 바이러스를 검출하고, 매일 평균 log10TCID50/ml를 계산하였다. 제 0 일 및 제 28 일에 각 원숭이로부터 혈청을 수집하고, 다양한 돌연변이체 및 PIV3 야생형 (JS)으로의 실험적 감염에 대한 PIV3 HAI 항체 반응을 결정하였다. 접종 후 제28 일에, AGMs를 1 ml 접종물로 경비 및 기관지내 투여된 106 PFU의 생물학적으로 유도된 PIV3 야생형 바이러스로 감염시켰다. 접종 1, 2, 4, 6, 8, 10 및 12 일 후에 비인두 스와브 샘플을 수집하고, 접종 2, 4, 6, 8 및 10 일 후에 기관지 세척 샘플을 수집하였다. 표본을 플래시 동결하고, 저장하고, 존재하는 바이러스를 상술한 바와 같이 역가 측정하였다.
재조합 돌연변이체 rC-KO, rD-KO, rV-KO 및 rDV-KO의 회수
HPIV3 안티게놈 cDNAs를 생산하여 다음 4 개의 돌연변이 바이러스를 코딩하였다: (i) C ORF가 시작 코돈을 M에서 T로 변경하고, 코돈 7 및 26에 번역 정지를 도입하도록 변경된 rC-KO, (ii) 372-아미노산 키메릭 D 단백질 중의 코돈 304, 305 및 306에 번역 정지가 도입된 rD-KO; (iii) V ORF 중의 17번 및 20번 위치에 정지 코돈이 도입된, rV-KO; 및 (iv) ii 및 iii의 돌연변이가 결합된 rDV-KO. 각 돌연변이는 겹친 ORF에서 면역적으로 잠재되었으나, 2 개의 정지 코돈이 V ORF에 도입된 (iii)의 경우에는, 회피될 수 없는 D에서의 2 개의 아미노산 치환, 즉, Q354L 및 A357V를 초래하였다. 또한, D의 정지 코돈은 이들이 P를 변화시키기 때문에 ORF에서 더 빨리 도입되지 못하였다. 각 돌연변이는 번역적으로 잠재되는 제한 부위 마커와 함께 도입되었다 (표 1).
안티게놈 cDNAs를 3 개의 PIV3 지지 플라스미드{pTM(P no C), pTM(N), pTM(L)}와 함께 HEp-2 세포 내로 형질 감염시키고, 동시에 세포를 T7 RNA 중합효소를 발현하는 MVA로 감염시켰다. C, D 또는 V ORF에 돌연변이를 함유하는 rPIV3의 회수 효율을 재조합 JSwt PIV3(rJS)가 이전에 회수되었던 총 길이 PIV3 안티게놈을 발현하는 플라스미드인 p3/7(131)2G를 사용하여 유사하게 형질감염-감염된 HEp-2 세포 배양과 비교하였다 (Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997). 32 ℃에서 3일 동안 배양 후, 형질감염된 세포를 얻고, 각 상층액을 T25 플라스크 중의 LLC-MK2 세포의 신선한 단층 상으로 계대 배양하였다 (계대 배양 1). 32 ℃에서 5 일 후, rJS, rD-KO, rV-KO 및 rDV-KO의 LLC-MK2 세포 단층은 3-4+ 세포 변성 효과(CPE)를 나타내었다. rC-KO의 상응 계대 배양 1은 존재한다 하더라도 최소한의 CPE를 나타내었다. rC-KO 샘플에서 CPE의 결핍이 돌연변이 바이러스의 높은 수준의 성장 제한에 기인한 것인지 또는 단지 바이러스의 매우 낮은 초기 회수에 기인한 것인지가 불명확했으므로, 계대 배양 1을 얻고, 상층액을 T75 플라스크 중의 LLC-MK2 세포의 신선한 단층 상으로 계대 배양하고, 32 ℃에서 7 일 동안 배양하였다 (계대 배양 2). LLC-MK2 세포의 T75 단층은 배양 7 일 후에 단지 1-2+ CPE를 나타내었으나, 혈구 흡착에 의해 HPIV3의 존재가 확인되었다. 플라크 단리 또는 말단 희석(terminal dilution)에 의한 3 라운드의 생물학적 클로닝 후, 각 재조합 돌연변이체를 LLC-MK2 세포에서 2 회 증폭시켜 추가의 특성화를 위한 바이러스 현탁액을 생성하였다.
과연 회수된 바이러스가 기대했던 rC-KO, rD-KO, rV-KO 및 rDV-KO 돌연변이 체인지 확인하기 위해, 각 클로닝된 바이러스를 C, D 및 V ORF를 함유하는 P 유전자의 일부를 포함하는 HPIV3 안티게놈의 nt 1595-3104를 걸쳐있는 DNA 단편을 증폭시킨 한 쌍의 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 분석하였다. 각각 PCR 생성물의 생산은 RT의 삽입에 의존하였고, 이것은 각각이 RNA로부터 유래되었고, 오염 cDNA로부터 유래되지 않았다는 것을 나타낸다. 이어서, rC-KO, rD-KO, rV-KO 및 rDV-KO의 PCR 생성물을 마커로서 도입된 제한 효소로 소화하고 (표 1), 제한 효소 부위의 존재를 확인하였다. 또한, 도입된 돌연변이의 존재를 확인하기 위해, RT-PCR 생성물 상에서 뉴클레오티드 서열화를 행하였다. 도입된 돌연변이 모두 각 클로닝된 재조합체로부터 증폭된 nt 1595-3104를 관통하는 RT-PCR 단편에 존재하는 것으로 확인되었고, 다른 우발적인 돌연변이는 이 단편에서 발견되지 않았다.
C ORF가 과연 잠재되었는지 확인하기 위해, 방사면역침강 분석법(RIPA)를 수행하여 rC-KO 돌연변이 바이러스를 rJS wt 바이러스와 비교하였다. 세포를 감염시키고, 감염 후 24 내지 30 시간 동안 35S 메티오닌의 존재 하에서 배양하고, 세포 용균물을 생산하였다. 동량의 총 단백질을 안티-C 및 안티-HN 항체와 배양하고, 항체를 단백질 A 세파로스 비드에 결합시켰다. rJS wt는 HN 및 C 단백질 모두를 코딩한 반면, rC-KO는 C 단백질을 발현하지 못했다 (도 3).
세포 배양에서 rC-KO 및 rDV-KO의 복제
LLC-MK2 세포 단층의 이중 배양물을 0.01의 MOI에서 rC-KO, rDV-KO 또는 rJS로 감염시키고, 32 ℃에서 7 일 동안 배양하였다. 24 시간 간격으로 각 배양물로 부터의 배지를 샘플로 채취하고, 이어서 이 물질을 역가 측정하여 세포 배양에서 각 바이러스의 복제를 평가하였다. rDV-KO의 복제는 바이러스 생성 속도, 피크 역가 (도 3) 및 승온에서의 복제 능력(데이타는 나타내지 않음)에 있어서 본질적으로 부모 rJS wt와 구별이 불가능하였다. 이와 반대로, rC-KO 바이러스는 더 서서히 복제하였고, 6 일에 rJS 보다 100 배 내지 1,000 배 더 낮은 피크 역가에 도달하였다. 따라서, C 단백질 발현의 결핍은 세포 배양에서 바이러스 복제에 상당한 영향을 미쳤다.
햄스터에서 rC-KO, rD-KO, rV-KO 및 rDV-KO의 복제
본원 발명자들은 햄스터의 상하부 기도에서의 복제 능력에 대하여 돌연변이 바이러스와 rJS wt 부모를 비교하였다. 예비 시험은 이 측정법에서 rD-KO 및 rV-KO 바이러스가 rJS 바이러스와 구별이 불가능하다는 것을 나타내었고(데이타는 나타내지 않음), 이들을 추가의 평가에서 제외하였다. 2차 시험에서, 햄스터 군을 동물 당 105 PFU의 rC-KO, rDV-KO, rJS 또는 생물학적으로 유래된 백신 후보 cp45로 경비내 접종하였다. rJS와 비교하여, rC-KO의 복제는 시험한 각 날에 햄스터의 상하부 기도 모두에서 1,000 배 이상 감소되었고 (표 2), cp45 백신 후보 바이러스만큼 약독화되었다. rDV-KO의 복제는 햄스터의 상부 기도에서 감소되지 않았으나, 시험한 3일 동안 하부 기도에서 20 배 이상 감소되었다 (표 2). rC-KO, rDV-KO, cp45 또는 rJS로 감염된 햄스터는 HPIV3에 대해 상당한 항체 반응을 가졌고, 높은 수준의 PIV3 감염 바이러스 복제의 제한을 나타내었다 (표 3). 상부 기도에서 rC- KO에 의해 제공된 방어는 불완전하였으나, 여전히 효과적이었다.
영장류에서 rC-KO 및 rDV-KO의 복제
rC-KO 및 rDV-KO의 약독화 표현형 및 방어 효율을 더 평가하기 위해, 이들 돌연변이체를 각각 4 마리의 AGMs의 군에 투여하고, 상하부 기도에서 이들의 복제를 cp45 및 JSwt와 비교하였다. rC-KO의 복제는 AGMs의 상부 기도에서 100 배 이상 감소된 반면, rDV-KO는 이 부위에서 10 배 감소되었다. 상부 기도에서 이 2 개의 바이러스에 대해 관찰된 약독화는 cp45에 필적하였다 (표 4). rC-KO는 AGMs의 하부 기도에서 매우 약독화되었으나 (105 배 이상), rDV-KO는 이 부위에서 단지 완만하게 제한되었다 (<10 배). 두 바이러스 모두 HPIV3에 대한 HAI 항체 반응을 유도하였으나, 햄스터와 마찬가지로, rC-KO에 대한 AGMs의 HAI 반응은 다른 바이러스보다 상당히 더 적었다 (표 4). 면역화된 AGMs를 28 일에 IN 및 IT 투여된 106 PFU의 생물학적으로 유래된 JS wt 바이러스로 감염시켰다. rJS, rDV-KO 또는 cp45 백신 후보 바이러스를 받은 동물들은 AGMs의 상하부 기도 모두에서 감염 바이러스의 복제로부터 완전히 보호되었다. 감염 바이러스의 복제에 대한 rC-KO에 의해 부여된 보호는 완전하지는 않지만, 효과적이었다. 감염 바이러스의 피크 역가는 이 군의 동물의 상하부 기도 모두에서 크게 감소되었으며, 상하부 기도로부터 바이러스의 박리 기간이 각각 10 일에서 4 일, 및 8 일에서 6 일로 감소되었다.
상기 기재들을 요약하면, 본원의 결과는 cDNA로부터 감염성 HPIV3가 성공적으로 회수되어 C, D 또는 V ORF의 발현이 시작 코돈 및(또는) 번역 정지 코돈의 도입을 한정하는 아미노산을 변경하는 돌연변이를 포함하는 예시적 결실 기술에 의해 개별적으로 단속된 신규 재조합 바이러스를 구성할 수 있다는 것을 입증한다. 또다른 예시적 바이러스 코돈에서는, D 및 V ORF가 함께 단속되었다. 이 예들은 시험관내 및 생체내 바이러스 복제에 대한 HPIV3의 보조 C, D 및 V ORF의 중요성을 나타내며, PIV의 예방 및 치료에 유용한 백신 후보를 제공한다. 특히, AGMs의 상하부 기도에서 rC-KO의 복제 수준은 가장 유망한 PIV3 백신 후보 바이러스인 cp45보다 다소 낮았다. wt 바이러스의 높은 수준의 복제 제한을 달성하기 위해 107.0 TCID 또는 복수 투여와 같은 고 용량으로 제공될 필요가 있을 수 있기는 하지만, 생체내에서 이의 감소된 복제에도 불구하고, rC-KO는 HPIV3 감염 바이러스의 복제를 제한하기에 충분한 면역 반응을 유도할 수 있었고, 이는 이 재조합체를 유용한 백신 후보로서 적합하게 한다.
재조합 DNA 기술을 사용하여, HPIV3 돌연변이체 cp45에서 동정된 돌연변이를 단일로 및 조합하여 JS wt 서열에 도입하였다 (Skiadopoulos et al, J. Virol. 73: 1374-1381, 1999; 1998. 5. 22일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 09/083,793 ; 1997. 5. 23일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/047,575 (국제 공개 번호 WO 98/53078에 대응함); 및 1997. 9. 19일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/059,385 , 각각 본원에 참고로 인용됨). 이것은 이 백신 후보의 약독화, 온도-감수성 (ts) 및(또는) 저온 적응된 표현형에 기여하는 돌연변이의 동정을 허용하였다. 이들 돌연변이, 및 본원에 기술된 재조합 PIV의 다른 변경은 C, D 및(또는) V ORF 넉아웃 돌연변이를 갖는 본 발명의 재조합 PIV의 면역원성 및 다른 목적하는 표현형적 특성 뿐만 아니라, 약독화 수준을 조절하는데 유용한 보조 돌연변이이다. P 유전자좌 내에서 잠재적으로 코딩된 다른 2 개의 단백질은 V 및 D 단백질이다. HPIV-1을 제외하고, 모든 레스피로바이러스(Respiroviruses), 모르빌리바이러스 (Mobilliviruses) 및 루불라바이러스 (Rubulaviruses)는 원래의 V ORF를 함유한다. V ORF의 시스테인이 풍부한 C 말단부는 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae)에서 P 유전자의 가장 보존된 ORF이고, HPIV1 및 HPIV3를 제외한 모든 바이러스에 의해 발현되는 것으로 보인다. HPIV3는 V ORF를 함유함에도 불구하고, 이것이 어떻게 접근되는지가 불명확하나, 이것이 원래대로 남아있다는 사실은 이것이 이용된다는 것을 암시한다. 파라믹소비리다에의 C 시스트론과 달리, D 단백질은 인간 및 소 PIV3에 유일하다. D 단백질은 P mRNA의 에디팅 부위에 2 개의 비주형화 G 잔기를 삽입함으로써 접근되고, 이는 P의 N-말단 241 개의 아미노산이 D ORF의 C-말단 131 개의 아미노산과 융합된 융합 단백질을 생성한다. D 단백질의 기능에 관해 어떠한 것도 알려져 있지 않고, D를 코딩할 수 있는 에디팅된 mRNA가 검출되었으나(Galinski et al., Virology 186: 543-550, 1992), HPIV3 감염된 세포 또는 비리온에서는 아직 동정되지 않았다. 이 문제에 착수하고자 하는 시도에서, 본원 발명자들은 D ORF에 3 개의 연속하는 정지 코돈을 함유하고, D ORF에 의해 코딩된 61 개의 아미노산을 함유하는 절단된 융합 단백질을 발현할 재조합 HPIV3 돌 연변이체를 만들었다. 단일 D 또는 V ORF 넉아웃 돌연변이를 갖는 재조합체 어느 것도 생체내 또는 시험관내 복제가 크게 제한되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 이들 돌연변이는 PIV 백신 후보의 개발에 매우 유용하다. 이것은 두 세트의 돌연변이를 조합하여 V 및 D ORF 모두에서 다수의 정지 코돈을 생성함으로서 생산된 조합형 V 및 D 넉아웃 돌연변이체의 성공적인 생산에 의해 입증되었다. 이 돌연변이체, rDV-KO는 AGMS의 상하부 기도 모두에서 뿐만 아니라, 햄스터의 하부 기도에서 복제가 제한되었다. P ORF는 돌연변이의 도입에 의해 영향을 받지 않았으므로, 본원 발명자들에 의해 관찰된 표현형이 V 및 D 활성의 손실을 반영하는 것이라고 추정하는 것이 합리적이다. rDV-KO의 복제가 생체내에서 약독화되었지만, 세포 배양에서의 복제는 본질적으로 변화되지 않았다. 이들 결과는 야생형 HPIV3의 D 및 V 단백질이 발현되고, 모두의 기능이 함께 손실되는 것이 rDV-KO에 의해 입증된 생체내 약독화 표현형을 담당한다고 할 수 밖에 없는 증거를 제공한다. 이들 단백질이 분자 수준에서 서로 상호작용하여 생체내 복제에 영향을 미친다고 할 수 있다.
상기 발명이 이해의 명확성을 위해 실시예에 의해 상세하게 기술되었으나, 제한이 아닌 설명에 의해 제공된 첨부된 청구범위 내에서 일정한 변화 및 변경이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
미생물 기탁 정보
다음 물질이 부다페스트 조약의 조건 하에, 버지니아주 20110-2209, 마나사스, 10801 유니버시티 불레바드, 아메리칸 타입 컬쳐 콜레션(American Type Culture Collection)에 기탁되었으며, 하기와 같이 지정되었다:
플라스미드
엑세스 번호
기탁일
p3/7(131) (ATCC 97990) 1997. 4. 18
p3/7(131)2G (ATCC 97989) 1997. 4. 18
p218(131) (ATCC 97991) 1997. 4. 18
Claims (95)
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- 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 게놈 또는 안티게놈, 뉴클레오캡시드 단백질(N), 인단백질(P), 및 거대 중합효소 단백질(L)을 포함하고,상기 게놈 또는 안티게놈에 1 이상의 C, D 또는 V ORF의 부분 또는 전부 결실, 또는 (ⅰ) 1 이상의 정지 코돈의 도입, (ⅱ) RNA 에디팅 부위에서의 돌연변이, (ⅲ) 개시 코돈에 의하여 특정되는 아미노산을 변경하는 돌연변이 및 (ⅳ) 프레임쉬프트(frame shift) 돌연변이의 도입 중에서 선택된 1 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함하는 변이가 도입되어 상기 1 이상의 C, D 또는 V ORF의 발현이 감소 또는 제거되고,상기 게놈 또는 안티게놈내 변이가 재조합 PIV에 (ⅰ) 세포 배양에서의 약독화 및 (ⅱ) 포유류 숙주의 상부 및 하부 호흡 기도에서의 약독화 중에서 선택된 1 이상의 표현형 변화를 특정하는, 감염성 재조합 PIV.
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- 제54항에 있어서, 게놈 또는 안티게놈에 도입된 변이가 C, D 또는 V ORF 중 2 이상의 부분 또는 전부 결실, 또는 상기 C, D 또는 V ORF 중 2 이상의 발현을 감소 또는 제거하는 1 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함하는 재조합 PIV.
- 제56항에 있어서, D 및 V ORF 모두가 부분 또는 전부 결실, 또는 그들의 발현을 감소 또는 제거하는 1 이상의 뉴클레오티드 변화에 의하여 변이된 재조합 PIV.
- 제54항에 있어서, 3개의 정지 코돈이 D ORF 안티게놈의 2692번, 2695번 및 2698번 위치의 뉴클레오티드 변화에 의하여 도입된 재조합 PIV.
- 제54항에 있어서, 2개의 정지 코돈이 V ORF 안티게놈의 2845번 및 2854번 위치의 뉴클레오티드 변화에 의하여 도입된 재조합 PIV.
- 제54항에 있어서, C ORF 개시 코돈이 상기 게놈 또는 안티게놈의 1795번 위치의 뉴클레오티드 변화에 의하여 트레오닌 코돈으로 변화되고, 2개의 정지 코돈이 뉴클레오티드 1813번 및 1869번을 변경함으로써 도입된 재조합 PIV.
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- 제54항에 있어서, 세포 배양에서의 바이러스 성장이 대응 야생형 또는 돌연변이 부모형 PIV 균주의 성장과 비교하여 5-10배 약독화된 재조합 PIV.
- 제54항에 있어서, 상부 및 하부 호흡 기도에서의 바이러스 성장이 대응 야생형 또는 돌연변이 부모형 PIV 균주의 성장과 비교하여 10-100배 약독화된 재조합 PIV.
- 제54항에 있어서, 상부 및 하부 호흡 기도에서의 바이러스 성장이 대응 야생형 또는 돌연변이 부모형 PIV 균주의 성장과 비교하여 100-1000배 약독화된 재조합 PIV.
- 제54항에 있어서, 게놈 또는 안티게놈이 생물학적으로 유도된 돌연변이 인간 PIV에서 동정되는 1 이상의 약독화 돌연변이의 도입에 의하여 추가로 변이된 재조합 PIV.
- 제65항에 있어서, 게놈 또는 안티게놈이 2 이상의 약독화 돌연변이를 함입하는 재조합 PIV.
- 제65항에 있어서, 게놈 또는 안티게놈이 약독화 돌연변이를 특정하는 코돈내의 다수의 뉴클레오티드 변화에 의하여 안정화된 1 이상의 약독화 돌연변이를 포함하는 재조합 PIV.
- 제65항에 있어서, 게놈 또는 안티게놈이 PIV3 JS cp45 내에 존재하는 1 이상의 약독화 돌연변이를 함입하는 재조합 PIV.
- 제65항에 있어서, 게놈 또는 안티게놈이 PIV3 L 내의 Tyr 942, Leu 992 또는 Thr 1558; N 내의 Val 96 또는 Ser 389; C 내의 Ile 96; F 내의 Ile 420 또는 Ala 550; HN 내의 Val 384에서의 아미노산 치환, 또는 N의 유전자 개시 서열내의 23번, 24번, 28번, 또는 45번 위치, 또는 62번 위치의 3' 리더에서의 뉴클레오티드 치환을 특정하는 1 이상의 약독화 돌연변이를 함입하는 재조합 PIV.
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- 생리학적으로 허용되는 담체 내에 제54항, 제56항 내지 제60항 및 제62항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 재조합 PIV를 포함하는, PIV에 대해 면역 반응을 유발하기 위한 면역원성 조성물.
- 제71항에 있어서, 103 내지 107 PFU의 투여량으로 제형화된 면역원성 조성물.
- 제71항에 있어서, 분무, 소적 또는 에어로졸에 의해 상부 호흡 기도 투여용으로 제형화된 면역원성 조성물.
- 제71항에 있어서, 재조합 PIV가 HPIV1, HPIV2 및 HPIV3로부터 선택된 1 이상의 바이러스에 대해 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
- 제74항에 있어서, 재조합 PIV가 HIPV3, 및 HPIV1 및 HPIV2로부터 선택된 다른 바이러스에 대해 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
- 1 이상의 C, D 또는 V ORF의 부분 또는 전부 결실, 또는 상기 1 이상의 C, D 또는 V ORF의 발현을 감소 또는 제거하는 (ⅰ) 1 이상의 정지 코돈의 도입, (ⅱ) RNA 에디팅 부위에서의 돌연변이, (ⅲ) 개시 코돈에 의하여 특정되는 아미노산을 변경하는 돌연변이 및 (ⅳ) 프레임쉬프트(frame shift) 돌연변이의 도입 중에서 선택된 1 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함하는 변이가 도입된 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함하고,상기 게놈 또는 안티게놈내 변이가 재조합 PIV에 (ⅰ) 세포 배양에서의 약독화 및 (ⅱ) 포유류 숙주의 상부 및 하부 호흡 기도에서의 약독화 중에서 선택된 1 이상의 표현형 변화를 특정하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
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- 제76항에 있어서, 게놈 또는 안티게놈에 도입된 변이가 C, D 또는 V ORF 중 2 이상의 부분 또는 전부 결실, 또는 상기 C, D 또는 V ORF 중 2 이상의 발현을 감소 또는 제거하는 1 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
- 제78항에 있어서, D 및 V ORF 모두가 부분 또는 전부 결실, 또는 그들의 발현을 감소 또는 제거하는 1 이상의 뉴클레오티드 변화에 의하여 변이된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
- 제76항에 있어서, 재조합 게놈 또는 안티게놈이 1 이상의 약독화 돌연변이에 의하여 추가로 변이된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
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- 제76항 및 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 PIV N, P 및 L 단백질을 세포 또는 무세포 용균물(lysate)에서 발현하는 것을 포함하는, 약독화된 감염성 재조합 PIV를 코딩하는 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 상기 PIV 입자를 생산하는 방법.
- 제82항에 있어서, PIV 게놈 또는 안티게놈, 및 N, P 및 L 단백질이 2 이상의 상이한 발현 벡터에 의하여 발현되는 방법.
- 작동가능하게 연결된 전사 프로모터, 제76항 및 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열, 및 전사 터미네이터를 포함하는 발현 벡터.
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