JP7020917B2 - キメラｒｓｖ／ｂｐｉｖ３ ｆタンパクを発現する組換えヒト／ウシパラインフルエンザウイルス３（ｂ／ｈｐｉｖ３）およびその使用 - Google Patents

キメラｒｓｖ／ｂｐｉｖ３ ｆタンパクを発現する組換えヒト／ウシパラインフルエンザウイルス３（ｂ／ｈｐｉｖ３）およびその使用 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２０１５年１月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／１０５，６６７号の優先権を主張する。
本開示は、異種ウイルスの抗原をコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムを含む組換えパラミクソウイルスに関する。例えば、組換えパラミクソウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質をコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）であり得る。
パラミクソウイルスは、世界中で毎年、多数の動物およびヒトの死亡の主要因であるマイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスの科である。パラミクソウイルスは、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）を含む。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス亜科の属中のエンベロープ非分割型マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。生後１年の小児の間の細気管支炎および肺炎の最もよくある原因である。ＲＳＶはまた、任意の年齢で、特に、高齢者または心臓、肺もしくは免疫系が易感染性のものの間で起こり得る重症下気道疾患を含む反復感染を引き起こす。特に、未熟児、気管支肺異形成症または先天性心疾患を有する乳児において、ＲＳＶ感染によって引き起こされる重症の疾病を防ぐために、受動免疫が現在使用されている。特定の集団におけるＲＳＶ感染の負担にもかかわらず、有効なＲＳＶワクチンの開発は、捉えどころがないままである。
パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）は、ＲＳＶ同様、パラミクソウイルス科中の別のエンベロープ非分割型マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。しかし、ＰＩＶは、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）中にある。ＰＩＶは、レスピロウイルスの属のメンバー（ＰＩＶ１、ＰＩＶ３、センダイウイルスを含む）およびルブラウイルスの属のメンバー（ＰＩＶ２、ＰＩＶ４、ＰＩＶ５を含む）を含む。さらに、アブラウイルスの属のメンバー（ニューカッスル病ウイルスＮＤＶを含む）は歴史的に、ＰＩＶと呼ばれ、操作上、同一と考えられ得る。ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ、血清型１、２および３）は、世界中で、乳児および小児における重症呼吸器感染症を引き起こすことにおいて、ＲＳＶのみに次ぐ第２のものであり、ＨＰＩＶ３は、疾患の影響の点でＨＰＩＶのうちで最も重要である。ＨＰＩＶゲノムは、３’－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｆ－ＨＮ－Ｌの遺伝子順序を含むおよそ１５．５ｋｂである。主要なタンパク質：Ｎ、核タンパク質；Ｐ、リン酸化タンパク質；Ｍ、マトリックスタンパク質；Ｆ、融合糖タンパク質；ＨＮ、血球凝集素－ノイラミニダーゼ糖タンパク質；Ｌ、大型ポリメラーゼタンパク質をコードする別個のｍＲＮＡをコードする各遺伝子。Ｐ遺伝子は、アクセサリータンパク質をコードする１つまたはそれ以上のさらなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。ＲＳＶと同様に、有効なＨＰＩＶワクチンの開発も捉えどころがないままである。
異種遺伝子をコードするウイルスゲノムを含む組換えパラミクソウイルスが提供される。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、パラミクソウイルスのＦタンパク質の細胞質尾部（ＣＴ）または膜貫通ドメイン（ＴＭ）およびＣＴと連結している組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムを含む組換えパラインフルエンザウイルスであり得る。パラミクソウイルスは、例えば、組換えヒト／ウシパラインフルエンザウイルス３（Ｂ／ＨＰＩＶ３）、組換えヒトパラインフルエンザウイルス１（ＨＰＩＶ１）、組換えヒトパラインフルエンザウイルス２（ＨＰＩＶ２）、組換えヒトパラインフルエンザウイルス３（ＨＰＩＶ３）または組換えウシパラインフルエンザウイルス３（ＢＰＩＶ３）であり得る。
驚くべきことに、異種ＲＳＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴを、パラミクソウイルスＦタンパク質の対応するＴＭおよびＣＴと交換することが、組換えパラミクソウイルスのエンベロープ中へのＲＳＶ Ｆエクトドメイン組込みの多種多様の増大を提供し、組換えパラミクソウイルスが対象に投与された場合にエクトドメインに対する免疫応答の誘発を著しく増大した。さらに、ウイルス中和血清抗体の誘導は、量および質の両方において著しく増大された。従って、いくつかの実施形態では、パラミクソウイルスおよび異種ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する二価免疫応答を誘発するために、開示された組換えパラミクソウイルスを、免疫原性組成物中に含めることができる。
異種遺伝子によってコードされるＲＳＶ Ｆエクトドメインは、ヒトＲＳＶ Ｆタンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換（「ＤＳ－Ｃａｖ１」置換、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０ＦおよびＶ２０７Ｌなど）を含んで、ＲＳＶ Ｆ融合前コンホメーションにおいてエクトドメインを安定化することができる。さらなる実施形態では、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、もう１つのアミノ酸置換を含んで、ウイルスエンベロープにおけるエクトドメイン発現または組込みを増大することができる（「ＨＥＫ」置換、Ｋ６６ＥおよびＱ１０１Ｐなど）。
限定しない一実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、組換えＢ／ＨＰＩＶ３であり得、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質由来のＴＭおよびＣＴと連結している。いくつかのこのような実施形態では、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質由来のＴＭおよびＣＴと連結しているＲＳＶ Ｆエクトドメインは、配列番号２１として示されるアミノ酸配列または配列番号２１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、上流から下流に、ＰＩＶゲノムプロモーターと、それに続く、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含むウイルスゲノムを含む組換えＰＩＶである。いくつかのこのような実施形態では、ウイルスゲノム中に含まれる異種遺伝子は、ゲノムプロモーターとＮタンパク質をコードする遺伝子との間またはＮタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し得る。
さらなる実施形態では、組換えパラミクソウイルスのウイルスゲノム中に含まれる異種遺伝子を、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化することができる。さらなる実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、弱毒化ウイルスであり得る。その他の実施形態では、追加される遺伝子およびそのコードされるタンパク質が、ワクチン候補にとって必要とされる弱毒化を提供し得る。
組換えパラミクソウイルスを含む免疫原性組成物も提供される。組成物は、アジュバントをさらに含み得る。有効量の開示された組換えパラミクソウイルスを対象に投与することによって対象において免疫応答を生じさせる方法も開示される。本明細書において開示される組換えパラミクソウイルスのいずれかのウイルスゲノムを含む単離された核酸分子もさらに提供される。
本開示の前記のおよびその他の特徴および利点は、以下の、添付の図面を参照して進行するいくつかの実施形態の詳細な説明から、より明らかとなろう。
非ＨＥＫまたはＨＥＫアミノ酸アサインメントを含むバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの構築図である。Ｆ ＯＲＦを、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＧＡ）アルゴリズムを使用してヒト発現のためにコドン最適化した。その構築物を、非ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔおよびＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔと呼んだ。ＨＥＫ（６６Ｅ、１０１Ｐ）および非ＨＥＫ（６６Ｋ、１０１Ｑ）アミノ酸アサインメントは、アスタリスクで示す。他のアノテーション：Ｓ、シグナル配列；ｐ２７、切断活性化によって遊離された２７ｋタンパク質断片；ＦＰ、融合ペプチド；ＴＭ、膜貫通；ＣＴ、細胞質尾部。ＲＳＶ Ｆ ＯＲＦを、ＢＰＩＶ３遺伝子開始および遺伝子末端転写シグナルの制御下において、Ｂ／ＨＰＩＶ３ベクターのＮ遺伝子とＰ遺伝子との間の第２ゲノム位置の中に挿入した。ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターは、Ｎ、Ｐ、Ｍ、およびＬ遺伝子（ＢＰＩＶ３由来）、ならびにＦおよびＮＨ遺伝子（ＨＰＩＶ３由来）を含む。同じベクターゲノム位置およびベクター転写シグナルを、図１～３５に記載のＲＳＶ Ｆタンパク質を発現する他のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの全てについて使用した。 図２Ａおよび２Ｂは、ＲＳＶ Ｆタンパク質中のＨＥＫアサインメントの存在によって、タンパク質発現の増大、および非ＨＥＫ Ｆタンパク質のものと比較したポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるタンパク質三量体移動度の低下が生じたことを示す図である。Ｖｅｒｏ細胞に、３２℃で１０ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩでＨＥＫまたは非ＨＥＫ ＲＳＶ Ｆを発現するベクター（ＧＡ－最適化ＯＲＦ由来、図１に示す）を感染させた。細胞溶解液を、感染４８時間後に調製した。等量の細胞溶解液を、煮沸し還元した後（Ａ）、または煮沸、還元しなかった（Ｂ）電気泳動によって解析した。変性および還元したＲＳＶ Ｆ単量体を、市販されているＲＳＶ Ｆ－特異的なマウスモノクローナル抗体（Ａ）で検出した。天然のＲＳＶ Ｆ三量体を、スクロース精製したＲＳＶ粒子（Ｂ）を使用して反復免疫することによってウサギで惹起したポリクローナル抗体で検出した。 図３Ａおよび３Ｂは、Ｖｅｒｏ細胞単層中の合胞体の形成に、非ＨＥＫまたはＨＥＫ ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターで感染させた写真である。細胞に、３２℃で１０ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで、（Ａ）非ＨＥＫまたは（Ｂ）ＨＥＫアサインメントでＧＡ－コドン最適化ＲＳＶ Ｆ（図１を参照のこと）を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３を感染させた。感染した細胞の画像を、感染後４８時間で撮影した。代表的な合胞体を、破線の輪郭線で印す。 異なるアルゴリズムによって（ヒト発現のために）コドン最適化されて、ＨＥＫアサインメントを含んだＲＳＶ Ｆ ＯＲＦを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの構築図である。ＨＥＫアサインメントを有するＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするＯＲＦを、ＧＡアルゴリズム（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ、図１に示される）、ＤＮＡ２．０アルゴリズム（ＨＥＫ／Ｄ２－ｏｐｔ）、またはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＧＳ）アルゴリズム（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ）とのヒトコドン用法のために最適化した。これらのコドン最適化されたＯＲＦを、ＲＳＶ Ｆ ＯＲＦの非最適化バージョン、非ＨＥＫと比較した（非ＨＥＫ／非ｏｐｔ）。これらのＲＳＶ Ｆ ＯＲＦを、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター中に、正確に同じ位置に、および図１と同じベクターシグナルとともに挿入した。 図５Ａおよび５Ｂは、ＨＥＫアサインメントおよびコドン最適化に起因する、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター由来のＲＳＶ Ｆタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現の増大を示す図である。（Ａ）Ｖｅｒｏおよび（Ｂ）ＬＬＣ－ＭＫ２細胞におけるＲＳＶ Ｆの発現を、ウエスタンブロット分析によって評価した。細胞を、示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを用いて３２℃で１０ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで感染して、細胞溶解液を、感染後４８時間で回収した。溶解液を、還元および変性条件下でゲル電気泳動に供して、ウエスタンブロッティングによって解析した。タンパク質を蛍光抗体との反応によって可視化し、赤外線撮像によって検出した。この実験は、ウイルスあたり全部で３つのウェルで行った。ＲＳＶ Ｆに特異的なモノクローナル抗体で、未切断のＦ０前駆体、および切断されたＦ１サブユニットを検出した。ＲＳＶ Ｆ１バンド密度を定量して、「１」として示された非ＨＥＫ／非ｏｐｔサンプルのバンド密度を正規化した。ＨＰＩＶ３ ＨＮタンパク質の発現はまた、ベクタータンパク質発現の内部制御として決定されて、等価のＭＯＩおよび複製が保証された；β－アクチンを、ローディング対照として使用した。 ベクター感染のＶｅｒｏ細胞単層中の合胞体の形成に対するＨＥＫおよびＦ ＯＲＦのコドン最適化の効果を示す写真である。細胞を、モック感染させる（モック）か、または空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（空のＢ／Ｈ３）で、またはＲＳＶ Ｆ ＯＲＦを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターで感染させ、このベクターは、非ＨＥＫかつ非最適化（非ＨＥＫ／非ｏｐｔ）であるか、またはＨＥＫかつＧＡ最適化（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ）またはＨＥＫかつＤＮＡ２．０－最適化（ＨＥＫ／Ｄ２－ｏｐｔ）またはＨＥＫかつＧＳ最適化（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ）であった。感染は、３２℃で１０ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで行い、画像を感染後４８時間で獲得した。代表的な合胞体を、いくつかのパネルで破線の輪郭で示す。 図７Ａおよび７Ｂは、非最適化またはコドン最適化ＯＲＦ由来のＨＥＫまたは非ＨＥＫ ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのマルチサイクルｉｎ ｖｉｔｒｏ複製を示すグラフである。（Ａ）ＬＬＣ－ＭＫ２および（Ｂ）Ｖｅｒｏ細胞を、空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（空のＢ／Ｈ３）またはＲＳＶ Ｆ ＯＲＦを発現するベクターを使用して、０．０１のＴＣＩＤ５０というＭＯＩで、３２℃で三連で感染させ、このベクターは、非ＨＥＫ－含有かつ非最適化（非ＨＥＫ／非ｏｐｔ）、もしくは非ＨＥＫ含有かつＧＡ－最適化（非ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ）であるか、またはＨＥＫ－含有かつＧＡ－最適化（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ）であるか、またはＨＥＫ－含有かつＧＳ－最適化（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ）であった。培地上清のアリコートを、６日間２４時間間隔で回収して、ウイルス力価を、３２℃でＬＬＣ－ＭＫ２細胞上で限界希釈アッセイによって決定し、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した。３つの独立した実験からの平均力価±ＳＥＭを示す。 図８Ａおよび８Ｂは、非最適化またはコドン最適化されたＯＲＦからのＨＥＫまたは非ＨＥＫ ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのハムスターにおける複製を示すグラフである。ゴールデンシリアンハムスターに、鼻腔内（ＩＮ）で、１０５ ＴＣＩＤ５０の示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター、または１０６ ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶ（株Ａ２）が含まれる０．１ｍｌの接種物を使用して感染させた。ハムスターを、感染後３日目および５日目に屠殺して（１日あたり１ウイルスあたりｎ＝６）、（Ａ）鼻甲介および（Ｂ）肺を取り出して、ホモジナイズして、ウイルス力価を、３２℃でＬＬＣ－ＭＫ２（ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター）またはＶｅｒｏ（ＲＳＶ）細胞に対する限界希釈によって決定した：白抜きの丸および黒塗りの丸は、それぞれ３日目および５日目に屠殺された動物の力価を示す。各々の記号は、個々の動物に相当し、各々の群の平均力価は、それぞれ、３日目および５日目に関しては、破線および実線の水平線で示す。検出限界（ＬＯＤ）は、組織１ｇあたり１．５のｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０であって、これは、破線で示される。ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞において限界希釈アッセイで滴定し、ＴＣＩＤ５０／ｇとして報告し；ＲＳＶは、Ｖｅｒｏ細胞でのプラークアッセイで滴定して、ＰＦＵ／ｇとして報告した。 非最適化またはコドン最適化されたＯＲＦ由来のＨＥＫまたは非ＨＥＫ ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを感染されたハムスター由来の血清ＲＳＶ－中和抗体力価を示すグラフである。ハムスター（１ウイルスあたりｎ＝６の動物）に、示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの１０５ ＴＣＩＤ５０、または１０６ＰＦＵのｗｔのＲＳＶが含まれる０．１ｍｌの接種物を使用してＩＮ接種した。血清サンプルを、免疫２８日後収集して、ＲＳＶ－中和抗体力価を、モルモット補体の存在下で３２℃でＶｅｒｏ細胞で行った６０％のプラーク減少プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）を使用することによって決定した。各々の記号は、個々の動物に相当する。各々のバーの高さは、各々の群の平均力価に相当する。平均力価の値は、バーの上に示す。平均の標準誤差を、水平線で示す。中和アッセイの検出限界は、５．３の逆数ｌｏｇ２ ＰＲＮＴ６０であって、破線で示した。 図１０Ａおよび１０Ｂは、ＲＳＶチャレンジに対する免疫化ハムスターの防御を示すグラフである。示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを使用して、またはｗｔ ＲＳＶを使用して図９で示されたとおり免疫されたハムスター（１ウイルスあたりｎ＝６の動物）を、免疫３１日後に、１０６ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶが含まれる０．１ｍｌの接種物でＩＮでチャレンジした。チャレンジの３日後、ハムスターを安楽死させて、（Ａ）鼻甲介および（Ｂ）肺を収集した。組織ホモジネート中のＲＳＶ力価は、Ｖｅｒｏ細胞におけるプラークアッセイによって決定した。各々の記号は、個々の動物に相当し、群の平均ウイルス力価を、水平線として示す。アッセイの検出限界は、破線で示されるとおり、組織１ｇあたりｌｏｇ１０ ２．７ＰＦＵであった。 分泌された（Ｅｃｔｏ）、融合後型、および安定化された融合前型のＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの構築図である。これらの改変されたタンパク質の各々は、ＨＥＫアサインメントを含み、かつＧＡ－最適化された（ヒト発現のため）ＯＲＦから発現された。アノテーション：Ｓ，シグナル配列；ｐ２７，切断活性化によって遊離された２７ｋのタンパク質断片；ＦＰ、融合ペプチド；ＴＭ、膜貫通；ＣＴ、細胞質尾部。ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ構築物は、全長ＲＳＶ Ｆを発現する。エクトドメインまたは「エクト」型は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸１～５１３から構成され；これは、ＣＴおよびＴＭアンカーを欠き、分泌に利用可能であろう。「融合後」型は、融合ペプチドのＮ末端ドメインから最初の１０ａａ（ＦＰ；１３７－１４６ａａ）をさらに欠失することによって、エクトドメイン（１～５１３ａａ）から誘導された（ＭｃＬｅｌｌａｎら、２０１１、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５：７７８８～９６）。「ＤＳ」および「ＤＳ－Ｃａｖ１」は、Ｓ１５５Ｃ／Ｓ２９０Ｃ変異（ＤＳ）によって、またはＤＳおよびＳ１９０Ｆ／Ｖ２０７Ｌ（Ｃａｖ１）変異によって、融合前型で安定化された全長ＲＳＶ Ｆタンパク質の２つのバージョンである（ＭｃＬｅｌｌａｎら、２０１３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２：９３１）。これらの種々の形態のＲＳＶ ＦをコードするＯＲＦを、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター中に、同じ位置で、ならびに図１および４に記載の同じベクターシグナルとともに挿入した。 図１２Ａおよび１２Ｂは、分泌された融合後および安定化された融合前型のＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのマルチサイクルｉｎ ｖｉｔｒｏ複製を示すグラフである。（Ａ）ＬＬＣ－ＭＫ２および（Ｂ）Ｖｅｒｏ細胞を、０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（空のＢ／Ｈ３）を使用して、または示した構築物：ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ；Ｅｃｔｏ；融合後；およびＤＳを使用して感染させた（説明については図１１を参照のこと）。３２℃で６日間の期間の間のウイルス複製を、２４時間間隔で培地上清サンプルを収集すること、およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞での限外希釈によってウイルス滴定を行うことによって決定した。変異タンパク質の図に関しては、図１１を参照のこと。アスタリスク＊は、全てのこれらのＲＳＶ Ｆ構築物がＨＥＫかつＧＡ最適化であったことを示す。 図１３Ａおよび１３Ｂは、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター由来の分泌された（Ｅｃｔｏ）、融合後、および安定化された融合前型のＲＳＶ Ｆタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を示す図である。Ｖｅｒｏ細胞を、１０ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを使用するか、または１０ ＰＦＵというＭＯＩでｗｔ ＲＳＶを使用して感染させた。感染させた細胞を、（Ａ）３２℃または（Ｂ）３７℃で４８時間インキュベートした。（Ａ）融合後、ＥｃｔｏもしくはＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを使用して、またはｗｔ ＲＳＶを使用して感染させた細胞の培地上清および溶解液、ならびに（Ｂ）非ＨＥＫ／非ｏｐｔ、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ、ＤＳ、またはＤＳ－Ｃａｖ１型のＲＳＶ Ｆを有するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを使用して感染させた細胞の溶解液を、回収して、ウエスタンブロットによってＲＳＶ Ｆ発現について解析した。アスタリスク＊で示した構築物は、ＨＥＫアサインメントを含み、かつＧＡ－最適化されていた。 図１４Ａおよび１４Ｂは、分泌された（Ｅｃｔｏ）、融合後、および安定化された融合前型のＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのハムスターにおける複製を示すグラフである。ハムスターに、１０５ ＴＣＩＤ５０の示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを使用して、または１０６ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶが含有される０．１ｍｌの接種物を使用してＩＮで感染させた。ハムスターを、感染後３日目および５日目に安楽死させて（１日あたり１ウイルスあたりｎ＝６）、（Ａ）鼻甲介および（Ｂ）肺を取り出して、ホモジナイズして、ウイルス力価を、３２℃で、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞（ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター）またはＶｅｒｏ（ＲＳＶ）細胞で限界希釈によって決定した：白抜きの丸および黒塗りの丸は、それぞれ、３日目および５日目に屠殺した動物についての力価を示す。各々の記号は、個々の動物に相当し、各々の群の平均力価を、それぞれ３日目および５日目について、破線または実線の水平線で示す。５日目の力価の平均値を、頂部に示す。ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞での限界希釈アッセイによって滴定し、ＴＣＩＤ５０／ｇとして報告した；ＲＳＶは、Ｖｅｒｏ細胞でプラークアッセイによって滴定し、ＰＦＵ／ｇとして報告した。検出限界（ＬＯＤ）は、点線で示した、組織１ｇあたり１．５ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０である。ピーク力価の間の相違の統計学的有意差は、テューキー・クレーマー検定によって決定し、アスタリスク；＊、Ｐ≦０．０５；＊＊、Ｐ≦０．０１；または＊＊＊、Ｐ≦０．００１で示した。アスタリスク＊で示した構築物は、ＨＥＫアサインメントを含み、ヒトの発現についてＧＡ－最適化された。 図１５Ａおよび１５Ｂは、分泌された（Ｅｃｔｏ）、融合後、および安定化された融合前型のＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを感染させたハムスター由来の血清ＲＳＶ－中和抗体力価を示すグラフである。ハムスター（１ウイルスあたりｎ＝６の動物）を、１０５ ＴＣＩＤ５０の示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを使用して、または１０６ ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶが含有される０．１ｍｌの接種物を使用して、ＩＮ接種した。血清サンプルを、免疫後２８日で収集し、ＲＳＶ－中和抗体力価を、３２℃でモルモット補体の添加（Ａ）有り、および（Ｂ）無しでＶｅｒｏ細胞で行った６０％のプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）で決定した。各々のバーの高さは、平均力価を表す。平均力価の値は、バーの上に示す。平均の標準誤差を、水平線で示す。中和アッセイの検出限界を、破線で示す。ＮＤ平均中和力価は、検出限界未満である。群の間の相違の統計学的有意差は、テューキー・クレーマー検定によって決定し、アスタリスク；＊、Ｐ≦０．０５；＊＊、Ｐ≦０．０１；または＊＊＊、Ｐ≦０．００１；またはｎｓ，Ｐ＞０．０５によって示した。 図１６Ａおよび１６Ｂは、ＲＳＶチャレンジに対する免疫化ハムスターの防御を示すグラフである。図１５に示されるように免疫されたハムスター（１ウイルスあたりｎ＝６の動物）に、免疫３１日後、１０６ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶが含有される０．１ｍｌの接種物を使用してＩＮチャレンジした。チャレンジの３日後、ハムスターを安楽死させて、（Ａ）鼻甲介および（Ｂ）肺を収集した。組織ホモジネート中のＲＳＶ力価を、３２℃でＶｅｒｏ細胞においてプラークアッセイによって決定した。各々の記号は、個々の動物に相当し、その群の平均ウイルス力価を、水平線として示す。アッセイの検出限界は、点線で示されるとおり、組織１ｇあたりｌｏｇ１０２．７ＰＦＵであった。 ベクター粒子への組み込みを増大させようとして操作したバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの構築図である。（Ａ）Ｆタンパク質の構造。（Ｂ）細胞質尾部（ＣＴ）、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ならびにＲＳＶ Ｆタンパク質（アミノ酸アサインメントは黒）およびＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質（ボールド体）のエクトドメインと、示したアミノ酸配列位置との隣接領域。これらの改変タンパク質の各々は、ＨＥＫアサインメントを含み、ＧＡ－最適化ＯＲＦから発現された。ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ構築物は、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現した。「Ｂ３ＣＴ」は、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴ（位置５１５～５４０，ボールド体）で置き換えられたＲＳＶ Ｆタンパク質のＣＴ（アミノ酸配列位置５５１～５７４）を有する。「Ｂ３ＴＭＣＴ」は、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴ（位置４９４～５４０、ボールド体）で置き換えられたＲＳＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴ（位置５３０～５７４）の両方を有する。「ＤＳ／Ｂ３ＣＴ」、「ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ」、「ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＣＴ」、および「ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ」は、融合前コンフォメーションを安定化するために設計されたＤＳまたはＤＳ－Ｃａｖ１変異を含むＢ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴのバージョンである。これらの種々の形態のＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするＯＲＦを、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター中に同じ位置で、ならびに図１、４および１１に記載したのと同じベクターシグナルとともに挿入した。 ベクター粒子への組み込みを増大させようとして操作したバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの構築図である。（Ａ）Ｆタンパク質の構造。（Ｂ）細胞質尾部（ＣＴ）、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ならびにＲＳＶ Ｆタンパク質（アミノ酸アサインメントは黒）およびＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質（ボールド体）のエクトドメインと、示したアミノ酸配列位置との隣接領域。これらの改変タンパク質の各々は、ＨＥＫアサインメントを含み、ＧＡ－最適化ＯＲＦから発現された。ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ構築物は、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現した。「Ｂ３ＣＴ」は、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴ（位置５１５～５４０，ボールド体）で置き換えられたＲＳＶ Ｆタンパク質のＣＴ（アミノ酸配列位置５５１～５７４）を有する。「Ｂ３ＴＭＣＴ」は、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴ（位置４９４～５４０、ボールド体）で置き換えられたＲＳＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴ（位置５３０～５７４）の両方を有する。「ＤＳ／Ｂ３ＣＴ」、「ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ」、「ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＣＴ」、および「ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ」は、融合前コンフォメーションを安定化するために設計されたＤＳまたはＤＳ－Ｃａｖ１変異を含むＢ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴのバージョンである。これらの種々の形態のＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするＯＲＦを、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター中に同じ位置で、ならびに図１、４および１１に記載したのと同じベクターシグナルとともに挿入した。 図１８Ａおよび１８Ｂは、ＲＳＶ Ｆタンパク質のＢ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴバージョンのｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター粒子への組み込みを示す図である。ＬＬＣ－ＭＫ２細胞に、示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを、３２℃で０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで感染させた。培地上清を感染の６～７日後に回収して、低速の遠心分離によって明確にし、１０％～３０％のスクロース勾配での遠心分離に供して、部分的に精製されたベクター粒子を得た。追加のＶｅｒｏ細胞に、０．０１ＰＦＵというＭＯＩでｗｔ ＲＳＶを感染させ、同じ方法で処理した。スクロース－精製した調製物のタンパク質濃度を、標準的な市販のキットで決定した。（Ａ）ｒＢ／ＨＰＩＶ３粒子へのＲＳＶ Ｆタンパク質のパッケージング有効性のウエスタンブロット評価。粒子中のＲＳＶ Ｆの相対量を比較するために、０．５μｇのスクロース－精製した粒子を溶解し、変性し、還元して、ウエスタンブロット解析に供した。ベクター粒子のＨＰＩＶ３ ＨＮおよびＢＰＩＶ３ Ｎタンパク質を、比較のために定量した。（Ｂ）そのそれぞれのベクター粒子へのＲＳＶ Ｆの各々の形態のパッケージング効率を、ＢＰＩＶ３ Ｎタンパク質のバンド密度に対してそのバンド密度を標準化することによって算出した。レーンの順序は、Ａパートと同じである。種々の形態のＲＳＶ Ｆのパッケージング効率を、「１」に設定された天然のＦタンパク質に対して示す。ベクター粒子へのＲＳＶ ＦのＢ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴ形態のパッケージング効率は、ＲＳＶ粒子へのＲＳＶ Ｆの効率と同様であると判定された。なぜなら、０．５μｇのベクター粒子あたりの改変されたＲＳＶ Ｆタンパク質の量（レーン３、４、６、７）は、ＲＳＶ粒子の０．５μｇ（レーン５）あたりの天然のＲＳＶ Ｆタンパク質の量と同様であったからである。アスタリスク＊で示される構築物は、ＨＥＫアサインメントを含み、ヒト発現のためにＧＡ－コドン－最適化された。 図１９Ａ～１９Ｆは、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるｒＢ／ＨＰＩＶ３粒子へのＢ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質の組み込みを可視図である。スクロース精製したウイルスを、ＲＳＶ Ｆ－特異的なマウスモノクローナル抗体およびマウス－ＩｇＧ－特異的な二次抗体（６ｎｍの金粒子で標識した）で標識した。ビリオンおよび金粒子を、ＴＥＭで可視化した。（Ａ）ＲＳＶ、（Ｂ）空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（空のＢ／Ｈ３）、（Ｃ）ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔを発現するベクター、（Ｄ）Ｂ３ＣＴを発現するベクター、（Ｅ）Ｂ３ＴＭＣＴを発現するベクター、および（Ｆ）ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴを発現するベクターの代表的な画像を示す。矢印は、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔビリオン（Ｃ）中の散在性の金粒子を指す。ベクター粒子と会合した金粒子の量が実質的に多いことが、Ｄ、Ｅ、およびＦで明白となる。 図１９－１の続き。 図２０Ａおよび２０Ｂは、Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのマルチサイクルｉｎ ｖｉｔｒｏ複製を示すグラフである。（Ａ）ＬＬＣ－ＭＫ２および（Ｂ）Ｖｅｒｏ細胞を、３２℃で、０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで、空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（空のＢ／Ｈ３）またはＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ、もしくはＢ３ＣＴ（上側パネル）、もしくはＢ３ＴＭＣＴ（上側パネル）、もしくはＤＳ／Ｂ３ＣＴ（下側パネル）、もしくはＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ（下側パネル）を発現するベクターを使用して感染させた。培地上清のアリコートを、２４時間間隔で６日間収集し、ウイルス力価は、３２℃でＬＬＣ－ＭＫ２細胞で限界希釈アッセイによって決定し、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した。アスタリスク＊で示す構築物は、ＨＥＫアサインメントを含み、ヒト発現のためにＧＡ－コドン－最適化した。アッセイにおける感染の多重度は、０．０１であった。 図２１Ａおよび２１Ｂは、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前型を安定化するＤＳまたはＤＳ－Ｃａｖ１変異の有りまたは無しのＲＳＶ Ｆタンパク質のＢ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴバージョンのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を示す図である。（Ａ）Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴ；ならびに（Ｂ）ＤＳおよびＤＳ－Ｃａｖ１（Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴと組み合わせた）の発現。Ｖｅｒｏ細胞に、示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを１０ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで使用して、またはＲＳＶを１０ ＰＦＵというＭＯＩで使用して感染させた。感染させた細胞を、（Ａ）３２℃または（Ｂ）３７℃で、４８時間インキュベートした。細胞溶解液を、ウエスタンブロットによってＲＳＶ Ｆ発現について解析した。ＨＰＩＶ３ ＨＮタンパク質を、等価のベクター複製を示す対照として使用した；ＧＡＰＤＨをローディングの対照として使用した。アスタリスク＊によって示される構築物は、ＨＥＫアサインメントを含み、ヒト発現のためにＧＡ－コドン－最適化した。 ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前型を安定化するＤＳ変異の有りまたは無しのＲＳＶ Ｆタンパク質のＢ３ＣＴまたはＢ３ＴＭＣＴバージョンを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを感染させたＶｅｒｏ細胞単層における合胞体の形成を示す図である。Ｖｅｒｏ細胞を、ＲＳＶ Ｆタンパク質の示したバージョンを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを１０ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで使用して感染させ、３２℃でインキュベートした。画像を、感染後４８時間で獲得した。アスタリスク＊によって示される構築物は、ＨＥＫアサインメントを含み、ヒト発現のためにＧＡ－コドン－最適化した。 図２３Ａおよび２３Ｂは、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前型を安定化するＤＳ変異の有りまたは無しの、Ｂ３ＣＴまたはＢ３ＴＭＣＴバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのハムスターにおける複製を示す図である。ハムスターを、１０５ ＴＣＩＤ５０のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター、または１０６ ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶが含有される０．１ｍｌの接種物中で使用してＩＮ感染した。ハムスターを、感染後３日目および５日目に安楽死させて（１日あたり１ウイルスあたり６）、（Ａ）鼻甲介および（Ｂ）肺を取り出して、ホモジナイズして、ウイルス力価を、３２℃でＬＬＣ－ＭＫ２（ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター）またはＶｅｒｏ（ＲＳＶ）細胞での限界希釈によって決定した：白抜きの丸および黒塗りの丸は、それぞれ、３日目および５日目に屠殺された動物の力価を示す。各々の記号は、個々の動物に相当し、各々の群の平均力価は、それぞれ、３日目および５日目について、破線または実線の水平線で示す。５日目の力価の平均値を、頂部で示す。ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞で、限界希釈アッセイによって滴定して、ＴＣＩＤ５０／ｇとして報告した；ＲＳＶは、Ｖｅｒｏ細胞でプラークアッセイによって滴定し、ＰＦＵ／ｇとして報告した。検出限界（ＬＯＤ）は、点線で示され、組織１ｇあたり１．５ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０である。ピーク力価の間の相違の統計学的有意差を、テューキー・クレーマー検定によって決定し、アスタリスクで示した（＊、Ｐ≦０．０５；＊＊、Ｐ≦０．０１；または＊＊＊、Ｐ≦０．００１）。ｘ軸にそってアスタリスク＊で示される構築物は、ＨＥＫアサインメントを含み、ヒト発現のためにＧＡ－コドン－最適化された。ＤＳ－Ｃａｖ１改変を含む構築物は、この実験の時点では利用可能ではなかったので、試験されなかった。 図２４Ａおよび２４Ｂは、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前型を安定化するＤＳ変異の有りまたは無しの、Ｂ３ＣＴまたはＢ３ＴＭＣＴバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを感染させたハムスター由来の血清ＲＳＶ－中和抗体力価を示すグラフである。ハムスター（１ウイルスあたりｎ＝６の動物）に、１０５ ＴＣＩＤ５０の示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター、または１０６ ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶが含有される０．１ｍｌの接種物を使用してＩＮ接種した。血清サンプルを、免疫後２８日で収集し、抗体力価を、モルモット補体の添加が有り（Ａ）、または無し（Ｂ）で、６０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）によって決定した。各々のバーの高さは、ＳＥＭにそって示される平均力価に相当する。平均力価の値は、バーの上に示す。中和アッセイの検出限界は、点線で示される。平均力価の相違の統計学的有意差は、テューキー・クレーマー検定によって決定され、アスタリスクによって示した（＊、Ｐ≦０．０５；＊＊、Ｐ≦０．０１；ｎｓ，Ｐ≧０．０５）。ＮＤ、中和力価は、検出限界未満であった。ｘ軸にそってアスタリスク＊によって示される構築物は、ＨＥＫアサインメントを含み、ヒト発現のためにＧＡ－コドン－最適化された。 図２５Ａおよび２５Ｂは、ＲＳＶチャレンジに対する免疫したハムスターの防御を示すグラフである。図２４に示すように免疫したハムスター（１ウイルスあたりｎ＝６の動物）に、１０６ ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶが含有される０．１ｍｌの接種物を使用して免疫後３１日でＩＮチャレンジした。チャレンジの３日後、ハムスターを安楽死させて、（Ａ）鼻甲介および（Ｂ）肺を収集した。組織ホモジネート中のＲＳＶ力価を、３２℃のＶｅｒｏ細胞中でプラークアッセイによって決定した。各々の記号は、個々の動物に相当し、群の平均ウイルス力価は、水平線として示される。アッセイの検出限界は、点線で示される、組織１ｇあたりｌｏｇ１０２．７ＰＦＵであった。 ハムスターでの複製の間のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによるＲＳＶ Ｆの発現の安定性を示す表である。免疫後３日目および５日目に鼻甲介および肺のＲＳＶ Ｆを発現する回収されたベクターのパーセンテージを、組織ホモジネートから直接回収したベクターの二重染色プラークアッセイによって決定した。その結果を個々の動物について表す。試験された検体中でＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３のパーセンテージを示す。ＲＳＶ Ｆタンパク質を１００％発現する検体を黄色に色付けし；ＲＳＶ Ｆを９０～９９％発現する検体を緑に色付けした。ＲＳＶ Ｆの発現が８０～８９％である検体を、オレンジに色付けした；ＲＳＶ Ｆの発現が７９％未満である検体を赤に色付けした。力価が低いせいでプラークを生成しなかった検体は、「ＮＡ」と記した。サンプルで生じたプラークの総数が１０未満であった場合、プラークの数は、「ｐ＝Ｘ」としてカッコ内に記録した（Ｘはプラークの数に等しい）。 Ｂ／ＨＰＩＶ３ベクターの温度感受性表現型を示す表である。示したベクターを、示した温度でＬＬＣ－ＭＫ２細胞でプラークを形成する能力について評価した。≧１００倍のプラーク形成における低下は、温度感度の指標である。各々のウイルスについての最低のこのような制限温度をボールド体で、下線で示しており、シャットオフ（ｓｈｕｔ－ｏｆｆ）温度と呼ぶ。 非ヒト霊長類（アカゲザル）における弱毒化および免疫原性について評価したｒＢ／ＨＰＩＶ３構築物を示す図である。アカゲザルを、１部位あたり１０６ ＴＣＩＤ５０の以下の構築物：非ＨＥＫ／非ｏｐｔ；ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ；およびＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴを使用して、それぞれ５匹、５匹および４匹の動物の群で、組み合わせたＩＮおよび気管内経路によって感染させた。 図２９Ａおよび２９Ｂは、アカゲザルにおけるｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの複製を示すグラフである。アカゲザルに、図２８に記載のような示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを感染させた。呼吸器官中のベクター複製を、示した日に（Ａ）鼻咽頭のスワブおよび（Ｂ）気管洗浄液を収集すること、ならびに限界希釈アッセイによってウイルス力価を決定することによって評価した。検出限界は、点線として示される１．２ ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬである。 ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによって誘導される血清ＨＰＩＶ３－中和抗体力価を示すグラフである。サル血清は、免疫後０、１４、２１、２８、３５および５６日で収集して、ＨＰＩＶ３－中和抗体力価を、追加したモルモット補体の存在下で、６０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）で決定した。中和アッセイの検出限界は、点線で示す。ＲＳＶチャレンジの日を示す。 ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによって誘導される血清ＲＳＶ－中和抗体力価を示すグラフである。サル血清を、免疫後０、１４、２１、２８、３５および５６日で収集した（図３１）。ＲＳＶ中和抗体力価は全ての時点で、６０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）によって、追加したモルモット補体の存在下で決定した。（図３２）ＲＳＶ中和抗体力価は、免疫後２８日で、添加した補体の非存在下で６０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）によって決定した。中和アッセイの検出限界は、点線で示す。平均力価の統計学的な有意差は、テューキー・クレーマー検定によって決定して、アスタリスクによって示した（＊＊、Ｐ≦０．０１；＊＊＊、Ｐ≦０．００１）。ＲＳＶチャレンジの日を示す。 ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによって誘導される血清ＲＳＶ－中和抗体力価を示すグラフである。サル血清を、免疫後０、１４、２１、２８、３５および５６日で収集した（図３１）。ＲＳＶ中和抗体力価は全ての時点で、６０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）によって、追加したモルモット補体の存在下で決定した。（図３２）ＲＳＶ中和抗体力価は、免疫後２８日で、添加した補体の非存在下で６０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）によって決定した。中和アッセイの検出限界は、点線で示す。平均力価の統計学的な有意差は、テューキー・クレーマー検定によって決定して、アスタリスクによって示した（＊＊、Ｐ≦０．０１；＊＊＊、Ｐ≦０．００１）。ＲＳＶチャレンジの日を示す。 アカゲザルにおける複製の間のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによるＲＳＶ Ｆの発現の安定性を示す表である。免疫後４、５および６日から鼻咽頭スワブ中のＲＳＶ Ｆを発現する回収されたベクターのパーセンテージを、二重染色プラークアッセイによって決定した。試験した検体中のＲＳＶ Ｆを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３のパーセンテージを示す。ＲＳＶ Ｆを発現するウイルスが１００％である検体を黄色に色付けした；ウイルスのうち９９～９０％がＲＳＶ Ｆを発現する検体を、緑に色付けした；低い力価のせいでプラークを生成しなかった検体を「ＮＡ」と印した。 Ｃ末端「フォールドオン（ｆｏｌｄｏｎ）」配列を含むＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１ ＲＳＶ Ｆタンパク質の分泌バージョンを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの構築図である。ＨＥＫアサインメントを含んでおり、かつＧＳ－コドン－最適化（ヒト発現のため）ＯＲＦ（ＤＳ－Ｃａｖ１変異を有する）から発現されたＲＳＶ Ｆタンパク質を遺伝子操作して、Ｔ４ファージ由来の示された４アミノ酸リンカーおよび示された２７アミノ酸フォールドオン配列に融合された、Ｆタンパク質のＮ末端の５１３アミノ酸（すなわち、ＴＭドメインおよびＣＴドメインを欠いている）を含むようにした（配列番号１３２，Ｅｆｉｍｏｖら．１９９４，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４２：４７０～４８６；Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖら １９９８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１：３２９～３３２を参照のこと）。ＯＲＦは、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター中に、同じ位置で、ならびに図１、４、１１および１７に記載の同じベクターシグナルとともに挿入した。 ハムスターにおける２つの異なる研究、および実施例１のアカゲザルの２つの異なる研究で評価した構築物を示すために注釈をつけた、ＲＳＶ Ｆを発現する例示的なｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのまとめを示す表である。 第１（Ｆ１）、第２（Ｆ２）または第３（Ｆ３）ゲノム位置でＲＳＶ Ｆ遺伝子インサートを含むＨＰＩＶ１ ＣＤ１７０およびＬＹ９４２Ａ変異のアンチゲノムｃＤＮＡの構築図である。ＲＳＶ Ｆ発現に使用されるｒＨＰＩＶ１骨格は、２つの弱毒化変異：すなわち、Ｐ／Ｃ遺伝子におけるＣＤ１７０変異（＊で示す）、またはＬ遺伝子におけるＬＹ９４２Ａ変異（・で示す）のいずれかを含んだ。ＨＰＩＶ１－Ｆ１構築物のために、ＲＳＶ Ｆ遺伝子を、Ｎ遺伝子の上流の非翻訳領域中に位置するＭｌｕＩ部位でＨＰＩＶ１ Ｎ遺伝子の前の第１ゲノム位置に挿入した。ＨＰＩＶ１－Ｆ２の場合、ＲＳＶ Ｆ遺伝子を、Ｐ遺伝子の上流の非翻訳領域中に位置するＡｓｃＩ部位のＨＰＩＶ１ ＮとＰ遺伝子との間に挿入した。ＨＰＩＶ１－Ｆ３に関しては、ＲＳＶ Ｆ遺伝子を、Ｐ遺伝子の下流の非翻訳領域中に位置するＮｏｔＩ部位でＨＰＩＶ１ ＰとＭ遺伝子との間でクローニングした。全ての構築物について、ＲＳＶ Ｆ ＯＲＦを、ヒト発現のためにコドン最適化し、ＨＥＫアミノ酸アサインメントを含んだ。Ｎ遺伝子末端（ＧＥ）、遺伝子間（ＩＧ）ＣＴＴ三つ組み、およびＰ遺伝子開始（ＧＳ）配列のコピーを、これが、ＨＰＩＶ１転写シグナルの設定の制御下になるように、ＲＳＶ Ｆインサートの後に（Ｆ１，Ｆ２）、または前に（Ｆ３）追加した。配列番号１３８～１４０の配列を、ＨＰＩＶ１－Ｆ１の下でＲＳＶ Ｆインサートに隣接して示し；配列番号１４１～１４３の配列は、ＨＰＩＶ１－Ｆ２のもとでＲＳＶ Ｆインサートに隣接して示し、配列番号１４４～１４５の配列は、ＨＰＩＶ１－Ｆ３のもとでＲＳＶ Ｆインサートに隣接して示される。 図３７Ａ～３７Ｄは、Ｖｅｒｏ（３７Ａおよび３７Ｃ）ならびにＬＬＣ－ＭＫ２（３７Ｂおよび３７Ｄ）細胞における、ＨＰＩＶ１／ＲＳＶ－Ｆウイルスの多段階の複製を示すグラフである。６ウェルプレート中の細胞単層の三連のウェルを、ｗｔ ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ、およびＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０と並行して、ＲＳＶ Ｆ（Ｆ１、Ｆ２またはＦ３）を発現するＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０（ＡおよびＢ）またはＬＹ９４２Ａ（ＣおよびＤ）ウイルスを、０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで感染させた。培養物を、３２℃でインキュベートした。細胞培養培地のアリコートを、２４時間間隔で収集し、ウイルス力価（ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞での連続希釈および赤血球吸着アッセイによって３２℃で決定した。平均力価と平均の標準誤差（ＳＥＭ）とを示す。感染後２日間、ｗｔ ＨＰＩＶ１に対する各々のウイルスの力価の間の統計学的な有意差を、テューキーの多重比較検定による一元ＡＮＯＶＡを使用して決定し、以下のとおりアスタリスクで示す：＊、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；＊＊＊、ｐ≦０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。 図３７－１の続き。 図３８Ａ～３８Ｃは、ウエスタンブロットによるＲＳＶ ＦおよびＨＰＩＶ１ベクタータンパク質発現の解析図である。Ｖｅｒｏ細胞は、５のＭＯＩで示したウイルスで感染させた。感染後４８時間で、細胞をＳＤＳサンプル緩衝液で溶解した。全てのサンプルを変性して、還元して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットに供した。タンパク質を、ＰＶＤＦ膜にトランスファーして、ＲＳＶ Ｆ－特異的なマウスモノクローナル抗体、またはＨＰＩＶ１ Ｎ－、Ｐ－、ＨＮ－、もしくはＦ－特異的なポリクローナル抗体（それぞれのタンパク質に相当する合成ペプチドで別々にウサギを免疫することによって惹起された）のいずれかでプローブした。結合した抗体を、赤外の色素とコンジュゲートした、対応する抗マウス（ＩＲＤｙｅ ６８０ＬＴ）および抗ウサギ（ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ）抗体を使用して可視化した。画像は、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像化システムを使用してブロットを走査することによって得た。示される画像は、３つの独立した実験の代表である単一の実験からである。（ＢおよびＣ）。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０（Ｂ）およびｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ（Ｃ）構築物についてのタンパク質バンドの強度を、３つの独立した実験について定量し、発現は、１．０で設定したＦ３ウイルスに対して示す。プロットは、９５％信頼区間を使用するダネット多重比較検定で一元ＡＮＯＶＡによって解析した３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとしてデータを示す。Ｆ１、Ｆ２およびＦ３ウイルスによるＨＰＩＶ１タンパク質の発現を、それらの対応する空ベクター骨格の発現と統計学的に比較した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。 図３８－１の続き。 図３９Ａ～３９Ｉは、ＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１ベクターを感染させたＬＬＣ－ＭＫ２細胞単層での細胞変性効果および合胞体の形成を示す写真である。ＭＫ２細胞に、０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで感染させ、５日間インキュベートして、画像を、光学顕微鏡による位相差を使用して４０×の倍率で得た。（Ａ）ｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０－Ｆ１；（Ｂ）ｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０－Ｆ２；（Ｃ）ｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０－Ｆ３；（Ｄ）ｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０；（Ｅ）ｒＨＰＩＶ１ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１；（Ｆ）ｒＨＰＩＶ１ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２；（Ｇ）ｒＨＰＩＶ１ＬＹ９４２Ａ－Ｆ３；（Ｈ）ｒＨＰＩＶ１ＬＹ９４２Ａ；および（Ｉ）ｗｔ ＨＰＩＶ１の顕微鏡写真を示す。 図４０Ａおよび４０Ｂは、ハムスターの鼻甲介（４０Ａ）および肺（４０Ｂ）におけるＲＳＶ Ｆ発現ＨＰＩＶ１ベクターの複製を示すグラフである。ハムスターの鼻腔内に１０５ ＴＣＩＤ５０のｗｔ ＨＰＩＶ１、ｒＨＰＩＶ１ ＣＤ１７０またはｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ空ベクター、ｒＨＰＩＶ１ ＣＤ１７０または３つのゲノム位置（Ｆ１、Ｆ２、またはＦ３）由来のＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ、ｒＨＰＩＶ１－ＣＲ８４ＧＣＤ１７０ＨＮ５５３ＡＬＹ９４２Ａ（前に記載のＨＰＩＶ１ワクチン候補（Ｂａｒｔｌｅｔｔら ２００７ Ｖｉｒｏｌ Ｊ ４：６））、またはｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２、第２位置からＲＳＶ Ｆを発現するキメラのウシ／ヒトＰＩＶ３（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔとしても公知、図１を参照のこと）を接種した。ウイルス力価は、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞において、赤血球吸着アッセイで決定し、組織１ｇあたりＬｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｇとして報告した。個々の動物（１群あたり６匹）の力価を、３日目（Δ）および５日目（・）について示し、各々の記号は個々の動物に相当する。平均値は、各々の群について、３日目に関してはボールド体で、５日目に関してはイタリック体で示す。検出限界（ＬＯＤ）は、１．５ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌであって、各々のグラフの底にまたがる点線で示した。各々のウイルス対ｗｔ ＨＰＩＶ１（赤のアスタリスク）または対ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２（頂部のバー）との間の相違の統計学的有意差を、感染後（ｐ．ｉ．）３日目および５日目について、テューキーの多重比較検定を使用して９５％信頼区間で一元ＡＮＯＶＡによって確認した。＊、ｐ≦０．０５；＊＊＊、ｐ≦０．００１；＊＊＊＊、ｐ≦０．０００１；またはｎｓ、有意差なし。 図４１Ａおよび４１Ｂは、免疫したハムスターの鼻甲介（４１Ａ）および肺（４１Ｂ）におけるｗｔ ＲＳＶチャレンジウイルス複製に対する防御を示すグラフである。各々の群におけるハムスター（ｎ＝６）に、免疫後３０日で、１０６ ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶ Ａ２を鼻腔内にチャレンジした。鼻甲介および肺を、チャレンジ３日後に安楽死させた動物から収集し、ウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞上でＲＳＶ特異的なプラークアッセイによって各サンプルについて決定して、組織１ｇあたりＬｏｇ１０ ＰＦＵとして報告した。各々の群の平均値を、ボールド体の数字で、および水平のバーで示す。ウイルスの間の相違の統計学的有意差は、テューキーの多重比較検定を使用して９５％信頼区間で一元ＡＮＯＶＡによって決定し、＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；またはｎｓ、有意差なし、によって示す。 Ｐ／ＣまたはＬ ＯＲＦにおけるＨＰＩＶ１骨格中で誘導された弱毒化変異を図示する表である。ｗｔ配列におけるヌクレオチド変化（欠失または置換）には、下線を付した。 ＬＬＣ－ＭＫ２細胞単層に対する組み換えウイルスの温度感受性を図示する表である。温度感受性に関しては、ボールド体の下線の値は、ウイルスシャットオフ温度を示し、最低の制限温度として規定された温度感受性表現型を示し、ここで、所定の温度対３２℃でのウイルス力価における平均ｌｏｇ１０低下は、同じ２つの温度でのｗｔ ｒＨＰＩＶ１のものよりも２．０ ｌｏｇ１０以上であった。単層について、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞に対する示した各々のウイルスの連続希釈物を、種々の温度で７日間インキュベートした。ウイルス力価は、モルモットの赤血球を使用した赤血球吸着によって決定し、１．２という検出限界でＬｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した。 ｉｎ ｖｉｖｏ複製後のＲＳＶ Ｆを発現するウイルス集団のパーセンテージを示す表である。ｉｎ ｖｉｖｏ複製の後のＲＳＶ Ｆを発現するウイルス集団のパーセンテージ（安定性）を、免疫蛍光二重染色プラークアッセイによって決定した。Ｖｅｒｏ細胞に、感染後（ｐ．ｉ．）３日目および５日目に収集した、感染したハムスター（ウイルスあたりｎ＝６）の鼻甲介または肺の連続希釈組織ホモジネート（全部で１４４サンプル）を感染させて、メチルセルロース重層のもとで６日間インキュベートした。ウイルスプラークを、マウスモノクローナル抗ＲＳＶ Ｆおよびヤギポリクローナル抗ＨＰＩＶ１特異的抗体を使用して染色し、続いて、対応する赤外線色素コンジュゲート二次抗体で検出した。ＲＳＶ ＦおよびＨＰＩＶ１抗原の両方を発現するプラークのパーセンテージを示す。肺サンプルのＨＰＩＶ１ ＣＤ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、およびＦ３の安定性、ならびにＵＲＴおよび肺におけるＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、－Ｆ２、およびＦ３についての安定性は、これらの組織中にそれらの複製がないせいで試験できなかった。カッコ内の数は、ウイルスあたり全部で６匹のハムスターの数についてＲＳＶ Ｆ発現の状況を示す。ＮＤ、プラークは検出されなかった。 ＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１を使用したハムスターの免疫がＲＳＶに対する血清中和抗体を誘導することを示す結果を列挙する表である。６週齢のハムスターの群（ｎ＝６）を、０．１ｍｌの接種物中に含有される各々の示したウイルスの１０５ ＴＣＩＤ５０を使用して鼻腔内免疫した。血清サンプルは免疫の前に、および免疫後２８日で収集した。ＲＳＶおよびＨＰＩＶ１に対する抗体力価は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または増強されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）発現性ウイルス（ｒＲＳＶ－ｅＧＦＰＭまたはＨＰＩＶ１－ＧＦＰ）を使用する６０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）を使用することによって決定し、中和抗体力価は、平均逆数ｌｏｇ２±ＳＥとして表した。このアッセイで使用される最初の血清希釈に基づいて、ＰＲＮＴ６０アッセイは、それぞれＲＳＶおよびＨＰＩＶ１について３．３および１．０逆数 ｌｏｇ２ ＰＲＮＴ６０という力価検出限界を有する。ＲＳＶ抗体力価について群の間の相違の統計学的有意差は、テューキーの多重比較検定を使用する一元ＡＮＯＶＡによって決定し（ｐ＜０．０５）、ＨＰＩＶ１抗体力価についての有意差は、対応のないｔ検定によって決定した。平均の中和抗体力価を群に分類した（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤとしてカッコ内に示す）。異なる文字の処置群の平均抗体力価は、お互いに統計学的に異なる；２つの文字で示される力価は、いずれの文字で示される力価とも統計学的に異なることはない。 ＤＳ－Ｃａｖ１変異を有するＧＡ最適化（ＧＡ－ｏｐｔ）融合前型のＲＳＶ Ｆを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのマルチサイクルｉｎ ｖｉｔｒｏ複製を示すグラフである。（図４６）Ｖｅｒｏおよび（図４７）ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を、３２℃で三連で、０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで、空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（空のＢ／Ｈ３）またはＲＳＶ Ｆ ＯＲＦを発現するベクターを使用して感染させ、このＲＳＶ ＦのＯＲＦは、ＨＥＫ－含有、ＧＡ－ｏｐｔであって、ＤＳ－Ｃａｖ１融合前安定化変異（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１）を含むか、または、ＨＥＫ－含有、ＧＡ－ｏｐｔであり、ＤＳ－Ｃａｖ１変異およびＢＰＩＶ３－特異的なＴＭおよびＣＴドメインを、潜在的なパッケージングシグナル（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ）として含む。培地上清のアリコートを、６日間２４時間間隔で収集し、ウイルス力価は、３２℃でＬＬＣ－ＭＫ２細胞で限界希釈アッセイによって決定し、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した。３つの独立した実験由来の平均力価±ＳＥＭを示す。 ＤＳ－Ｃａｖ１変異を有するＧＡ最適化（ＧＡ－ｏｐｔ）融合前型のＲＳＶ Ｆを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのマルチサイクルｉｎ ｖｉｔｒｏ複製を示すグラフである。（図４６）Ｖｅｒｏおよび（図４７）ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を、３２℃で三連で、０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで、空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（空のＢ／Ｈ３）またはＲＳＶ Ｆ ＯＲＦを発現するベクターを使用して感染させ、このＲＳＶ ＦのＯＲＦは、ＨＥＫ－含有、ＧＡ－ｏｐｔであって、ＤＳ－Ｃａｖ１融合前安定化変異（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１）を含むか、または、ＨＥＫ－含有、ＧＡ－ｏｐｔであり、ＤＳ－Ｃａｖ１変異およびＢＰＩＶ３－特異的なＴＭおよびＣＴドメインを、潜在的なパッケージングシグナル（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ）として含む。培地上清のアリコートを、６日間２４時間間隔で収集し、ウイルス力価は、３２℃でＬＬＣ－ＭＫ２細胞で限界希釈アッセイによって決定し、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した。３つの独立した実験由来の平均力価±ＳＥＭを示す。 図４８Ａおよび４８Ｂは、異なる改変を有するＧＳ－最適化（ＧＳ－ｏｐｔ）ＲＳＶ Ｆを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのマルチサイクルｉｎ ｖｉｔｒｏ複製を示すグラフである。（Ａ）Ｖｅｒｏおよび（Ｂ）ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を、３２℃で三連で、０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで、空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（空のＢ／Ｈ３）またはＲＳＶ Ｆ ＯＲＦを発現するベクターを使用して感染させ、このＲＳＶ Ｆ ＯＲＦは、ＨＥＫ－含有およびＧＳ－ｏｐｔ ＲＳＶ Ｆ（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ）であるか、またはＨＥＫ－含有、ＧＳ－ｏｐｔであり、かつＤＳ－Ｃａｖ１融合前安定化変異（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１）を保有しているか、またはＨＥＫ－含有、ＧＳ－ｏｐｔであり、かつＤＳ－Ｃａｖ１変異およびＢＰＩＶ３－特異的なＴＭおよびＣＴドメイン（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ）を保有しているか、またはＴ４ファージ由来の４アミノ酸リンカーおよび２７アミノ酸オリゴマー化配列に融合された１～５１３のアミノ酸の短縮されたＲＳＶ Ｆであり、これは、ＨＥＫ－含有、ＧＳ－ｏｐｔであり、ＤＳ－Ｃａｖ１変異（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／（１－５１３）Ｆｏｌｄｏｎ）を保有している。培地上清のアリコートを、２４時間間隔で６日間収集し、ウイルス力価を、３２℃でＬＬＣ－ＭＫ２細胞における限界希釈アッセイによって決定して、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した。３つの独立した実験からの平均力価±ＳＥＭを示す。 図４９Ａ～４９Ｄは、ＧＳ－ｏｐｔおよびＧＡ－ｏｐｔ ＲＳＶ Ｆを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのマルチサイクルｉｎ ｖｉｔｒｏ複製の比較を示すグラフである。図４９Ａおよび図４９Ｂ：（Ａ）Ｖｅｒｏおよび（Ｂ）ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を、３２℃で三連で、０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで、空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（空のＢ／Ｈ３）またはＲＳＶ ＦのＯＲＦを発現するベクターを使用して感染させ、このＲＳＶ ＦのＯＲＦは、ＨＥＫ－含有、ＧＳ－ｏｐｔであって、ＤＳ－Ｃａｖ１変異（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１）を保有しているか、またはＨＥＫ－含有、ＧＡ－ｏｐｔであって、ＤＳ－Ｃａｖ１変異（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１）を保有している。図４９Ｃおよび図４９Ｄ：（Ｃ）Ｖｅｒｏおよび（Ｄ）ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を、３２℃で、０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで、空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（空のＢ／Ｈ３）またはＲＳＶ ＦのＯＲＦを発現するベクターを使用して感染させ、このＲＳＶ ＦのＯＲＦは、ＨＥＫ－含有、ＧＳ－ｏｐｔであり、かつＤＳ－Ｃａｖ１およびＢ３ＴＭＣＴ改変（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ）を保有するか、またはＨＥＫ－含有、ＧＡ－ｏｐｔであって、かつＤＳ－Ｃａｖ１およびＢ３ＴＭＣＴ改変（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ）を含んだ。培地上清のアリコートは、２４時間間隔で６日間収集し、ウイルス力価は、３２℃でＬＬＣ－ＭＫ２細胞における限界希釈アッセイによって決定して、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した。３つの独立した実験由来の平均力価±ＳＥＭを示す。 図５０Ａ～５０Ｃは、細胞培養中のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによるＲＳＶ Ｆの種々の改変型の発現を示す図である。（Ａ）Ｖｅｒｏおよび（Ｂ，Ｃ）ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を、空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（レーン１）、または示した改変型のＲＳＶ Ｆ（レーン２～５および８）、またはｗｔ ＲＳＶ（ｗｔ ＲＳＶ、レーン６）を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを、３ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで使用して感染させるか、または感染させなかった（モック、レーン７）。感染させたＶｅｒｏ（Ａ）およびＬＬＣ－ＭＫ２（Ｂ）細胞を、３２℃でインキュベートして、ＬＬＣ－ＭＫ２（Ｃ）細胞を、３７℃でインキュベートした。Ｖｅｒｏ細胞の細胞溶解液および培地上清を、４８ｈｐｉで収集し、ＲＳＶ Ｆの発現についてウエスタンブロット解析に供し、ＲＳＶ Ｆは、切断されたＦ１および／または未切断のＦ０型として検出された。ＢＰＩＶ３ Ｎは、ベクタータンパク質の発現のための内部対照として使用した；ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として使用した。 図５１Ａおよび５１Ｂは、ハムスターの上下の気道におけるｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの複製を示す図である。ハムスターに、１０５ ＴＣＩＤ５０の示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター、または１０６ ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶが含有される０．１ｍｌの接種物を使用してＩＮ感染させた。ハムスターを、感染後４日目および５日目に安楽死させて（１日あたり１ウイルスあたりｎ＝６）、（Ａ）鼻甲介および（Ｂ）肺を取り出して、ホモジナイズして、ウイルス力価を、３２℃でＬＬＣ－ＭＫ２細胞での限界希釈によって決定し、ＴＣＩＤ５０／ｇ（ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター）として報告するか、または３２℃でＶｅｒｏ細胞でのプラークアッセイによって決定して、ＰＦＵ／ｇ（ｗｔ ＲＳＶ）として報告した。検出限界（ＬＯＤ）は、点線で示される、組織１ｇあたり１．５ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０である。白抜きの丸および黒塗りの丸は、それぞれ４日目および５日目に屠殺された個々の動物の力価を示す。各々の群の平均力価は、それぞれ、４日目および５日目について、破線および実線の水平線で示す。４日目および５日目の平均力価の値を頂部に示す。５日目の平均ウイルス力価は、テューキー・クレーマー検定を使用して異なる群に割り当てた：異なる文字の平均力価は統計学的に異なる（ｐ＜０．０５）が、２つの文字で示される力価は、いずれかの文字で示される力価と有意に異なることはない。 ＤＳまたはＤＳ－Ｃａｖ１またはＢ３ＴＭＣＴ改変の有りまたは無しの、ＧＡ－ｏｐｔまたはＧＳ－ｏｐｔ ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現する示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターで感染させたハムスターからの血清ＲＳＶ－中和抗体力価を示すグラフである。ハムスター（１ウイルスあたりｎ＝６の動物）に、１０５ ＴＣＩＤ５０の示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター、または１０６ ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶが含有される０．１ｍｌの接種物を使用してＩＮ接種した。血清サンプルを、免疫後２８日で収集し、抗体力価は、モルモット補体の添加の有り（図５２）および無し（図５３）で６０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）によって決定した。各々のバーの高さは、ＳＥＭにそって示される平均力価に相当する。平均力価の値は、バーの上に示す。ペアワイズスチューデントｔ検定を使用して、値の間の統計学的な有意差を評価した：平均力価を超える３つの水平線の各々で、垂直のバーで示される値は、お互いに対してペアワイズで比較されて、有意差がある（＊、ｐ＜０．０５）か、または有意差がない（ｎｓ）として記録された。中和アッセイの検出限界は、点線で示す。ＮＤ、中和力価は、検出限界未満であった。 ＤＳまたはＤＳ－Ｃａｖ１またはＢ３ＴＭＣＴ改変の有りまたは無しの、ＧＡ－ｏｐｔまたはＧＳ－ｏｐｔ ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現する示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターで感染させたハムスターからの血清ＲＳＶ－中和抗体力価を示すグラフである。ハムスター（１ウイルスあたりｎ＝６の動物）に、１０５ ＴＣＩＤ５０の示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター、または１０６ ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶが含有される０．１ｍｌの接種物を使用してＩＮ接種した。血清サンプルを、免疫後２８日で収集し、抗体力価は、モルモット補体の添加の有り（図５２）および無し（図５３）で６０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）によって決定した。各々のバーの高さは、ＳＥＭにそって示される平均力価に相当する。平均力価の値は、バーの上に示す。ペアワイズスチューデントｔ検定を使用して、値の間の統計学的な有意差を評価した：平均力価を超える３つの水平線の各々で、垂直のバーで示される値は、お互いに対してペアワイズで比較されて、有意差がある（＊、ｐ＜０．０５）か、または有意差がない（ｎｓ）として記録された。中和アッセイの検出限界は、点線で示す。ＮＤ、中和力価は、検出限界未満であった。 図５４Ａおよび５４Ｂは、示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターで免疫したハムスターのＲＳＶチャレンジに対する防御を示すグラフである。図５３に示されるように免疫されたハムスター（１免疫群あたりｎ＝６動物）に、免疫後３０日で、１０６ ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶが含有される０．１ｍｌの接種物を使用してＩＮチャレンジした。チャレンジの３日後、ハムスターを安楽死させて、（Ａ）鼻甲介および（Ｂ）肺を収集した。組織ホモジネート中のＲＳＶ力価を、３７℃でＶｅｒｏ細胞中でプラークアッセイによって決定した。各々の記号は、個々の動物に相当し、群のウイルス力価の平均値は、記号の上に示し、短い水平線として示す。ペアワイズスチューデントｔ検定を使用して、値の間の統計学的な有意差を評価した：平均力価の上の水平線の各々では、垂直のバーで示された値を、お互いに対してペアワイズ比較し、有意である（＊、ｐ＜０．０５）または有意に異なることはない（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ：ｎｓ）として記録した。アッセイの検出限界は、点線として示した、組織１ｇあたりｌｏｇ１０１．７ＰＦＵであった。 非ヒト霊長類（アカゲザル）において弱毒化および免疫原性について評価したｒＢ／ＨＰＩＶ３構築物を示す図である。アカゲザルを、それぞれ４、６および６匹の動物の群で、以下の構築物の１部位について１０６ ＴＣＩＤ５０を使用して、併用ＩＮおよび気管内経路によって感染させた：ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ；ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ；およびＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ。 図５６Ａおよび５６Ｂは、アカゲザルにおけるｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの複製を示すグラフである。アカゲザルに、図５５で示したｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを感染させた。呼吸器管のベクター複製は、（Ａ）鼻咽頭のスワブおよび（Ｂ）気管洗浄液を、示した日に収集すること、ならびにウイルス力価を限界希釈アッセイによって決定することによって評価した。検出限界は、点線として示される、１．２ ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬである。 図５７Ａおよび５７Ｂは、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによって誘導される血清ＲＳＶ－中和抗体力価を示すグラフである。図５５および５６に示される実験から、血清を、免疫後０、１４、２１、および２８日で収集した。図５７Ａ：示した時点のＲＳＶ中和抗体力価は、追加したモルモット補体の存在下での６０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）によって決定した。各々の時点の平均力価の統計学的な有意差を、ペアワイズスチューデント－ｔ検定によって決定した（ｎｓ，Ｐ＞０．０５）。図５７Ａ：免疫の２８日後のＲＳＶ中和抗体力価を、添加された補体の非存在下でＰＲＮＴ６０によって決定した。中和アッセイについての検出限界は、点線で示す。各時点の平均力価の統計学的な有意差は、ペアワイズスチューデント－ｔ検定によって決定した（ｎｓ，Ｐ＞０．０５）。 図５８Ａおよび５８Ｂは、プレ－Ｎ位置からＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの構築物、ならびにベクターの表現型安定性の増大を達成するためのＨＰＩＶ３ ＨＮタンパク質のアミノ酸配列の改変を示す図である。図５８Ａ：ｒＢ／ＨＰＩＶ３の第１の遺伝子位置へのＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴインサートの挿入。図５８Ａ：表現型安定性の増大を付与したＨＰＩＶ３ ＨＮ遺伝子の修正。逆遺伝学によって作られたもとの組み換えＨＰＩＶ３中のＨＮ遺伝子（Ｄｕｒｂｉｎら Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３～３３２ １９９７）は、アンチゲノム位置７９１３および７９１５のＨＮ遺伝子中の２つの遺伝子操作されたヌクレオチド置換（アミノ酸置換Ｐ３７０Ｔを生じた）、およびアンチゲノム位置７５９３での偶発性変異（アミノ酸置換Ｔ２６３Ｉを生じた）を有した。ここで、これらの変異は、「野性型」アサインメント、すなわち、生物学的に誘導されるＨＰＩＶ３株ＪＳで見出されるものに戻された（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｚ１１５７５．１；Ｓｔｏｋｅｓら Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ２５：９１～１０３．１９９２）。 図５９Ａおよび５９Ｂは、第１遺伝子位置（プレ－Ｎ）における、または第２遺伝子位置（Ｎ－Ｐ）における、種々のバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するベクターによるＲＳＶ Ｆおよびベクタータンパク質の細胞内発現を示す図である。ｒＢ／ＨＰＩＶ３－ｗｔ ＨＮ－ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ／プレ－Ｎの解析、図５８Ａで図示した構築物。Ｖｅｒｏ（図５９Ａ）およびＬＬＣ－ＭＫ２（図５９Ｂ）細胞に、空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（空のＢ／Ｈ３、レーン１）、またはｗｔＨＮ／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ／プレ－Ｎ構築物（プールＣＬ２０ａ、ＣＬ２４ａ、レーン３および４）、または第２の（Ｎ－Ｐ）位置に挿入された同じバージョンのＲＳＶ Ｆを有するベクター（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ／Ｎ－Ｐ、レーン５）、またはプレ－Ｎ位置に挿入された非ＨＥＫ／非ｏｐｔバージョンのＲＳＶ Ｆを有するベクター（レーン６）、またはＲＳＶ（レーン２）を感染させるか、またはモック感染させた（レーン７）。そのベクターを、１０ ＴＣＩＤ５０／細胞というＭＯＩで感染させ、およびｗｔ ＲＳＶは３ＰＦＵ／細胞というＭＯＩで感染させた。感染させた単層を、３２℃でインキュベートした。細胞溶解液を、４８ｈｐｉで収集し、ウエスタンブロット解析に供した。ＲＳＶ Ｆは、切断されたＦ１および／または未切断のＦ０の形態で検出された。ＢＰＩＶ３ ＮおよびＰタンパク質を使用して、ベクタータンパク質発現に対する効果を評価した。ＧＡＰＤＨを、ローディング対照として使用した。 ＨＰＩＶ１ベクター：細胞質尾部（ＣＴ）、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、およびＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインの隣接領域（株Ａ２、アミノ酸アサインメント）およびＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質（ボールド体）という配列で、アミノ酸配列位置を示した図である。ＲＳＶ－Ｆ－ＴＭＣＴは、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴドメインに結合されたＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインからなるキメラタンパク質である。 融合前コンホメーションにおいて安定化されるように（ＤＳ－Ｃａｖ１）、かつＨＰＩＶ１ベクター粒子への組み込みの増大を有するように、設計されたバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ベクターの構築図である。これらの改変されたＲＳＶ Ｆインサートの各々は、ＨＥＫアサインメント（ＨＥＫ）を含み、かつヒト発現のためにＧＳによってコドン最適化された（ＧＳ－ｏｐｔ）。ＲＳＶ Ｆインサートを遺伝子操作して、ＤＳおよびＣａｖ１変異（ＤＳ－Ｃａｖ１）単独（図６１および図６２中の上側の構築物）、またはＨＰＩＶ１ Ｆ由来のドメインでの（ＴＭＣＴ、図６１および図６２の下側の構築物）そのＴＭＣＴドメインの置き換えによるさらなる改変で、融合前コンホメーションで安定化させた。得られたＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１およびＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／ＴＭＣＴバージョンのＲＳＶ Ｆを、隣接配列によって改変して、ＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ベクター（ＨＰＩＶ１ベクターおよびＣΔ１７０変異の説明については実施例２を参照のこと）に、（図６１）第１遺伝子位置（ＭｌｕＩ部位）、または（図６２）第２遺伝子位置（ＡｓｃＩ部位）で挿入した。各々の場合に、ＲＳＶ Ｆは、別のｍＲＮＡとしての発現のためにＨＰＩＶ１転写シグナルの制御下であった。ヌクレオチド番号付けは、最終構築物の完全なアンチゲノムＲＮＡ配列に対する。配列番号１４６および１４７の配列を、Ｆ１／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１、Ｆ１／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／ＴＭＣＴ、Ｆ２／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１、およびＦ２／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／ＴＭＣＴについて図の下のＲＳＶ Ｆインサートに隣接して示す。 融合前コンホメーションにおいて安定化されるように（ＤＳ－Ｃａｖ１）、かつＨＰＩＶ１ベクター粒子への組み込みの増大を有するように、設計されたバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ベクターの構築図である。これらの改変されたＲＳＶ Ｆインサートの各々は、ＨＥＫアサインメント（ＨＥＫ）を含み、かつヒト発現のためにＧＳによってコドン最適化された（ＧＳ－ｏｐｔ）。ＲＳＶ Ｆインサートを遺伝子操作して、ＤＳおよびＣａｖ１変異（ＤＳ－Ｃａｖ１）単独（図６１および図６２中の上側の構築物）、またはＨＰＩＶ１ Ｆ由来のドメインでの（ＴＭＣＴ、図６１および図６２の下側の構築物）そのＴＭＣＴドメインの置き換えによるさらなる改変で、融合前コンホメーションで安定化させた。得られたＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１およびＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／ＴＭＣＴバージョンのＲＳＶ Ｆを、隣接配列によって改変して、ＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ベクター（ＨＰＩＶ１ベクターおよびＣΔ１７０変異の説明については実施例２を参照のこと）に、（図６１）第１遺伝子位置（ＭｌｕＩ部位）、または（図６２）第２遺伝子位置（ＡｓｃＩ部位）で挿入した。各々の場合に、ＲＳＶ Ｆは、別のｍＲＮＡとしての発現のためにＨＰＩＶ１転写シグナルの制御下であった。ヌクレオチド番号付けは、最終構築物の完全なアンチゲノムＲＮＡ配列に対する。配列番号１４６および１４７の配列を、Ｆ１／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１、Ｆ１／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／ＴＭＣＴ、Ｆ２／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１、およびＦ２／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／ＴＭＣＴについて図の下のＲＳＶ Ｆインサートに隣接して示す。 ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質由来のＴＭＣＴが無しまたは有りの、融合前コンホメーション（ＤＳ－Ｃａｖ１）において安定化されたＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ベクターのＶｅｒｏ細胞中でのマルチサイクル増殖の反応速度論を示すグラフである。Ｖｅｒｏ細胞に、三連で構築物を使用して、０．０１のＭＯＩで感染させ、３２℃で７日間インキュベートした。２４時間間隔で、０．５ｍＬの全部で３ｍＬの培養上清を、７日間にわたって収集した。サンプル収集後、０．５ｍＬ新鮮な培地を各々の培養物に添加して、もとの容積を回復した。収集したサンプルのウイルス滴定は、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞で、赤血球吸着アッセイによって行い、値は、平均±ＳＥＭとしてプロットする。 ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質由来のＴＭＣＴの無しまたは有りで、融合前コンホメーション（ＤＳ－Ｃａｖ１）で安定化されたＲＳＶ Ｆタンパク質のＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ビリオン粒子への組み込みを示す図である。示したウイルス構築物（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔの名称は、簡略のため省略した）は、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞中で増殖し、ビリオンは、スクロース勾配遠心分離によって精製した。精製したウイルスのタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイで決定した。各々の精製されたウイルス由来の全部で１μｇのタンパク質を、ＲＩＰＡ溶解緩衝液中に溶解し、還元し、変性し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析に供した。ＲＳＶ Ｆ（頂部パネル）およびＨＰＩＶ１タンパク質（第２、第３および第４パネル）を、それぞれマウスモノクローナルおよびウサギポリクローナルのＨＰＩＶ１－ペプチド－特異的な（Ｎ、Ｆ、およびＨＮ）抗体で検出した。赤外標識二次抗体を使用して、結合した一次抗体を検出した。レーン２および４（第４パネル）中のキメラＲＳＶ－Ｆ－ＤＳ－Ｃａｖ１／ＴＭＣＴタンパク質は可視である。なぜならＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質に対して特異的な抗ペプチド血清は、ＣＴドメインのＣ末端１８アミノ酸を含む合成ペプチドを使用して惹起され、従って、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質ＴＭＣＴドメインを保有するＲＳＶ Ｆタンパク質と反応する。 ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質由来のＴＭＣＴの無しおよび有りの、融合前コンホメーション（ＤＳ－Ｃａｖ１）で安定化されたＲＳＶ Ｆタンパク質の感染されたＶｅｒｏ細胞中の発現を示す図である。６ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞単層に、ｗｔ ＨＰＩＶ１およびｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０空ベクター対照を含む示したウイルス（命名ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔは、短くするために省いた）を、５というＭＯＩで接種し、３２℃で４８時間インキュベートした。細胞溶解液は、２００μＬのＬＤＳサンプル緩衝液中で単層を溶解することによって調製した。タンパク質サンプルを還元して変性し、４５μＬの各々のサンプルを電気泳動し、続いてＰＶＤＦ膜にタンパク質トランスファーした。ＲＳＶ ＦおよびＨＰＩＶ１タンパク質を、図６４に記載したのと同じ一次抗体および二次抗体を使用して検出した。 細胞質尾部（ＣＴ）、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ならびにＲＳＶ Ｆタンパク質（アミノ酸アサインメント）およびＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質（ボールド体）のエクトドメインの隣接領域の配列図であって、示したアミノ酸配列位置を伴う。ＲＳＶ－Ｆ－Ｈ３ＴＭＣＴは、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴドメインに結合されたＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインからなるキメラタンパク質である。 融合前コンホメーション（ＤＳ－Ｃａｖ１）で安定化されるように、およびｒＨＰＩＶ３ベクター粒子への組み込みの増大を有するように設計されたバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＨＰＩＶ３ベクターの構築図である。このベクターは、野性型ｒＨＰＩＶ３株ＪＳであって、これは、ベクターに対して表現型安定性を付与することが見出された、ＨＮタンパク質中で、２６３Ｔおよび３７０Ｐのアミノ酸アサインメントを含むように改変されていた（図５８Ｂを参照のこと）。さらに、ｒＨＰＩＶ３ベクターは、遺伝子位置１におけるＲＳＶ Ｆの挿入（または潜在的には任意の他のインサート）のための、１０３～１１９位置のＢｌｐＩ部位の作製（Ａ、上部の構築物）、または遺伝子位置２におけるＲＳＶ Ｆの挿入のための、１６７５～１６８２位置のＡｓｃＩ部位の作製（Ｂ、上部の構築物）によって改変された。各々の改変されたＲＳＶ Ｆインサートは、ＨＥＫアサインメント（ＨＥＫ）を含み、かつヒト発現のためにＧＳによってコドン最適化した（ＧＳ－ｏｐｔ）。さらに、ＲＳＶ Ｆインサートを遺伝子操作して、ＤＳおよびＣａｖ１変異（ＤＳ Ｃａｖ１）単独（ＡおよびＢ、第２構築物）によって、またはそのＴＭＣＴドメインのｒＨＰＩＶ３ Ｆ（Ｈ３ＴＭＣＴ、ＡおよびＢ、第３構築物）由来のドメインでの置き換えによるさらなる改変で、融合前コンホメーションにおいて安定化した。ＲＳＶ Ｆの得られたＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１およびＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ３ＴＭＣＴバージョンを、隣接する配列によって改変し、ｗｔ ｒＨＰＩＶ３ ＪＳの（Ａ）第１遺伝子位置（ＢｌｐＩ部位）、または（Ｂ）第２遺伝子位置（ＡｓｃＩ部位）に挿入した。各々の場合に、ＲＳＶ Ｆは、別々のｍＲＮＡとしての発現のためにＨＰＩＶ３転写シグナルの制御下であった。ヌクレオチド番号付けは、最終構築物の完全なアンチゲノムＲＮＡ配列に対する。配列番号１４８の配列は、ｒＨＰＩＶ３ ｗｔ－ＪＳの略図の下に示す。配列番号１４９および１５０の配列は、Ｆ１／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１、Ｆ１／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ３ＴＭＣＴ、Ｆ２／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１、およびＦ２／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ３ＴＭＣＴの略図の下のＲＳＶ Ｆインサートに隣接して示される。 融合前コンホメーション（ＤＳ－Ｃａｖ１）で安定化されるように、およびｒＨＰＩＶ３ベクター粒子への組み込みの増大を有するように設計されたバージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＨＰＩＶ３ベクターの構築図である。このベクターは、野性型ｒＨＰＩＶ３株ＪＳであって、これは、ベクターに対して表現型安定性を付与することが見出された、ＨＮタンパク質中で、２６３Ｔおよび３７０Ｐのアミノ酸アサインメントを含むように改変されていた（図５８Ｂを参照のこと）。さらに、ｒＨＰＩＶ３ベクターは、遺伝子位置１におけるＲＳＶ Ｆの挿入（または潜在的には任意の他のインサート）のための、１０３～１１９位置のＢｌｐＩ部位の作製（Ａ、上部の構築物）、または遺伝子位置２におけるＲＳＶ Ｆの挿入のための、１６７５～１６８２位置のＡｓｃＩ部位の作製（Ｂ、上部の構築物）によって改変された。各々の改変されたＲＳＶ Ｆインサートは、ＨＥＫアサインメント（ＨＥＫ）を含み、かつヒト発現のためにＧＳによってコドン最適化した（ＧＳ－ｏｐｔ）。さらに、ＲＳＶ Ｆインサートを遺伝子操作して、ＤＳおよびＣａｖ１変異（ＤＳ Ｃａｖ１）単独（ＡおよびＢ、第２構築物）によって、またはそのＴＭＣＴドメインのｒＨＰＩＶ３ Ｆ（Ｈ３ＴＭＣＴ、ＡおよびＢ、第３構築物）由来のドメインでの置き換えによるさらなる改変で、融合前コンホメーションにおいて安定化した。ＲＳＶ Ｆの得られたＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１およびＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ３ＴＭＣＴバージョンを、隣接する配列によって改変し、ｗｔ ｒＨＰＩＶ３ ＪＳの（Ａ）第１遺伝子位置（ＢｌｐＩ部位）、または（Ｂ）第２遺伝子位置（ＡｓｃＩ部位）に挿入した。各々の場合に、ＲＳＶ Ｆは、別々のｍＲＮＡとしての発現のためにＨＰＩＶ３転写シグナルの制御下であった。ヌクレオチド番号付けは、最終構築物の完全なアンチゲノムＲＮＡ配列に対する。配列番号１４８の配列は、ｒＨＰＩＶ３ ｗｔ－ＪＳの略図の下に示す。配列番号１４９および１５０の配列は、Ｆ１／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１、Ｆ１／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ３ＴＭＣＴ、Ｆ２／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１、およびＦ２／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ３ＴＭＣＴの略図の下のＲＳＶ Ｆインサートに隣接して示される。
配列表
添付の配列表に列挙される核酸およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるようなヌクレオチド塩基の標準文字略語およびアミノ酸の３文字表記を使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。配列表は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年１月１９日に作成された「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」（約３４４ｋｂ）と名付けられたファイルの形態でＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されている。
これまでの研究（Ｚｉｍｍｅｒら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００５ ７９：１０４６７～７７）によって、ＨＰＩＶ１のマウス相対物であり、また、ＨＰＩＶ３と密接に関連している、センダイウイルスにおける異種遺伝子からのＲＳＶ Ｆタンパク質の発現が評価された。その研究によって、極めてわずかなＲＳＶ Ｆタンパク質しか、センダイウイルスベクター粒子中に組み込まれないと示された。研究者らは、ＲＳＶ Ｆタンパク質のＣＴまたはＣＴおよびＴＭを、センダイＦタンパク質由来の対応する配列と、これが外来ＲＳＶ Ｆタンパク質のベクター粒子との相互作用の効率を改善するであろうということを前提として置換した。これらの修飾は、遺伝子操作されたＲＳＶ Ｆのセンダイ粒子への組込みを実際に増大したが、センダイＦタンパク質遺伝子も欠失された場合のみであった。ベクターＦタンパク質を欠失する必要は、ワクチン接種のための感染性弱毒化ウイルスの作製とは適合せず、また、二価ワクチンを作製するために必要とされると考えられるベクター保護抗原の１種も除去する。
本明細書に開示されるように、ＲＳＶ Ｆ ＴＭおよびＣＴを含むＲＳＶ Ｆタンパク質は、ｒＢ／ＨＰＩＶ３、ＨＰＩＶ３またはＨＰＩＶ１によって発現される場合には、微量でのみベクター粒子中に組み込まれる。しかし、異種ＲＳＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴを、パラミクソウイルス Ｆタンパク質の対応するＴＭおよびＣＴと交換することが、組換えパラミクソウイルスのエンベロープへのＲＳＶ Ｆエクトドメイン組込みの多種多様の増大を提供し、その結果、ベクターへのＲＳＶ Ｆのパッケージングは、精製ビリオン１μｇあたり、ＲＳＶ自体のものと同等に効率的（例えば、Ｂ／ＨＰＩＶ３）またはより効率的（例えば、ＨＰＩＶ１）であった。これは、ＴＭおよびＣＴが一緒に交換される場合には、またはＣＴが単独で交換される場合には有効であった。しかし、ＣＴ単独に特異的なキメラＲＳＶ Ｆの融合性の増大の予期しない効果は、ＴＭＣＴが好ましいという指針を提供する。
ＲＳＶ Ｆのベクター粒子への効率的なパッケージングは、組換えパラミクソウイルスが対象に投与された場合に、エクトドメイン（中和エピトープのすべてを有する）に対する免疫応答の誘発を著しく増大した。予期しないことに、ウイルス中和血清抗体反応は、質的に著しく増大し、これは、ＲＳＶ中和活性を補体の不在下で（強中和抗体を測定する）またはその存在下で（弱中和または非中和抗体による中和を増強する）ｉｎ ｖｉｔｒｏで比較することによって評価された。この予期しない抗体の質的な増大は、不完全な免疫保護を誘導すると名高いＲＳＶにとって特に重要である。ベクター糖タンパク質のＴＭＣＴドメインを有する外来糖タンパク質の発現および有効なパッケージングは、明らかにベクター複製および形態形成を破壊する可能性を有していた：しかし、この効果が最小であった構築物が提供される。
免疫原性をさらに増大するために、融合前コンホメーションにおけるＲＳＶ Ｆタンパク質の安定化を評価した。融合前安定化はまた、自然に、中和エピトープの安定化を示唆する強中和抗体の増大ももたらした。ハムスターモデルでは、免疫原性および保護の増大に対する融合前安定化の効果は、ＴＭＣＴによって付与される有効なパッケージングのものに付加的であると思われた。しかし、非ヒト霊長類において評価された場合には、パッケージングの効果は、融合前安定化のものよりも大きいと思われた。
ＲＳＶに対する保護を達成するという課題を考えると、最大免疫原性が望ましい。広範な実験方法によって、ベクターおよびインサート構築物のその他の態様（例えば、種々の挿入部位の使用、コドン最適化の使用および初期継代ＲＳＶ Ｆタンパク質配列の使用）が見出され、ＲＳＶ Ｆの発現の増大および高度膜融合性ＲＳＶ Ｆタンパク質によって媒介される合胞体形成の細胞変性効果の低減を提供した。
臨床治験において、期待外れのＲＳＶ免疫原性しか有していなかった（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら ２０１２．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ３１：１０９～１１４）、非修飾ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３をベースとするプロトタイプワクチンウイルスは、本開示の方法によって、質の低い、追加される補体の存在下でのみｉｎ ｖｉｔｒｏで中和活性を有するＲＳＶ中和血清抗体を誘導すると確認されたことは注目すべきである。対照的に、開示された構築物は、アフリカミドリザルにおいて、補体の不在下でｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＲＳＶを効果的に中和可能な高い力価の血清抗体を誘導した。
Ｉ．用語のまとめ
特に断りのない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｘ、Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版、２００９；およびＭｅｙｅｒｓら（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ出版、１６巻、２００８；およびその他の同様の参考文献に見出すことができる。
本明細書において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」とは、文脈が明確に別に示さない限り、単数および複数の両方を指す。例えば、用語「抗原（ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ）」は、単数または複数の抗原を含み、語句「少なくとも１種の抗原」と同等と考えることができる。本明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられる、ありとあらゆる塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさおよびすべての分子量または分子質量値は、特に断りのない限り、近似であり、便宜的に提供されるということは、さらに理解されるべきである。本明細書において記載されるものと同様または同等の多数の方法および材料が使用されるが、特定の適した方法および材料が本明細書において記載される。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が管理する。さらに、材料、方法および実施例は、単に例示的なものであって、制限であるよう意図されない。種々の実施形態の概説を容易にするために、以下の用語の説明を提供する：
アジュバント：抗原性を増強するために使用される媒体。アジュバントとして、抗原が吸着されるミネラル（ミョウバン、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム）の懸濁液；または油中水エマルジョン、例えば、抗原溶液が鉱油中に乳化される（フロイントの不完全アジュバント）、抗原性をさらに増強する（抗原の分解を阻害し、および／またはマクロファージの流入を引き起こす）ために死滅したマイコバクテリアを含めることもある（フロイントの完全アジュバント）が挙げられる。免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むものなど）も、アジュバントとして使用できる。アジュバントは、共刺激分子などの生体分子（「生物学的アジュバント」）を含む。例示的アジュバントとして、ＩＬ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＯＸ－４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）マトリックスおよびＴＬＲ－９アゴニストなどのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、ポリＩ：ＣまたはポリＩＣＬＣが挙げられる。当業者は、アジュバントに精通している（例えば、Ｓｉｎｇｈ（編）Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００７を参照のこと）。アジュバントは、開示された組換え体と組み合わせて使用できる。
投与：選択された経路による組成物の対象への導入。投与は、局所であっても全身であってもよい。例えば、選択された経路が鼻腔内である場合には、組成物（開示された組換えパラミクソウイルスを含む組成物など）は、対象の鼻腔経路中に組成物を導入することによって投与される。例示的投与経路として、それだけには限らないが、経口、注射（皮下、筋肉内の、皮内、腹腔内および静脈内など）、舌下 、直腸、経皮（例えば、局所）、鼻腔内、経膣および吸入経路が挙げられる。
アミノ酸置換：ポリペプチド中のあるアミノ酸の、異なるアミノ酸との、またはゼロのアミノ酸との置き換え（すなわち、欠失）。いくつかの例では、ポリペプチド中のアミノ酸は、相同ポリペプチド由来のアミノ酸で置換される。例えば、組換え群Ａ ＲＳＶ Ｆポリペプチド中のアミノ酸は、群Ｂ ＲＳＶ Ｆポリペプチド由来の対応するアミノ酸で置換される。ＲＳＶ Ｆタンパク質中の「６６Ｅ」アミノ酸への言及は、位置６６のグルタミン酸残基を含むＲＳＶ Ｆタンパク質を指す。アミノ酸は、参照配列からの置換によって存在する場合もある。ＲＳＶ Ｆタンパク質中の「Ｋ６６Ｅ」置換への言及は、参照（例えば、天然）配列中のリシン残基と置換された位置６６のグルタミン酸残基を含むＲＳＶ Ｆタンパク質を指す。
減弱された：「減弱された」または「減弱された表現型」を有するパラミクソウイルスは、同様の感染条件下で、参照野生型パラミクソウイルスと比較したビルレンスが低減したパラミクソウイルスを指す。減弱は、通常、同様の感染条件下で、参照野生型パラミクソウイルスの複製と比較したウイルス複製の低下と関連しており、従って、「減弱」および「制限された複製」は、同意語として使用されることが多い。いくつかの宿主（通常、実験動物を含む非天然宿主）において、疾患は、問題の参照パラミクソウイルスの感染の間は明らかではなく、ウイルス複製の制限を、減弱の代理マーカーとして使用できる。いくつかの実施形態では、減弱される組換えパラミクソウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＰＩＶ３）は、同一感染条件下で、同一種の哺乳類の、それぞれ、上気道または下気道における減弱されていない野生型ウイルス力価と比較した、哺乳類の上気道または下気道におけるウイルス力価の少なくとも約１００倍またはそれ以上の減少などの少なくとも約１０倍またはそれ以上の減少を示す。哺乳類の例として、それだけには限らないが、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ハムスター、例えば、ゴールデンハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）などおよび非ヒト霊長類、例えば、サバンナモンキー（Ｃｅｒｏｐｔｉｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）などが挙げられる。減弱されたパラミクソウイルスは、制限するものではないが、成長の変更、温度感受性成長、宿主域によって制限される成長またはプラークサイズの変更を含む異なる表現型を示し得る。
細胞質尾部（ＣＴ）：タンパク質の末端（ＮまたはＣ末端のいずれか）を含み、細胞膜の細胞質表面またはウイルスのエンベロープから、細胞の細胞質またはエンベロープウイルス中に伸びる膜貫通タンパク質の連続領域。Ｉ型膜貫通タンパク質の場合には、ＣＴは、タンパク質のＣ末端を含む。ＩＩ型膜貫通タンパク質の場合には、ＣＴは、タンパク質のＮ末端を含む。
縮重変異体：本開示との関連で、「縮重変異体」とは、遺伝暗号の結果として縮重である配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。２０種の天然アミノ酸があり、そのほとんどは、２種以上のコドンによって指定される。従って、ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドのアミノ酸配列が変更されない限り、ペプチドをコードするすべての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。
遺伝子：核酸配列、通常、ｍＲＮＡであろうとなかろうとＲＮＡの転写に必要な制御配列およびコード配列を含むＤＮＡ配列。例えば、遺伝子は、プロモーター、１種またはそれ以上のエンハンサーまたはサイレンサー、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドをコードする核酸配列、下流調節配列ならびに場合により、ｍＲＮＡの発現の調節に関与するその他の核酸配列を含み得る。
異種：異なる遺伝子供給源に起因する。組換えウイルスゲノム中に含まれる異種遺伝子は、そのウイルスゲノムに起因しない遺伝子である。１つの特定の限定されない例では、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインをコードする異種遺伝子は、組換えＰＩＶベクターのゲノム中に含まれる。異種遺伝子をウイルスベクター中に導入するための方法は、当技術分野で周知であり、また、本明細書において記載されている。
宿主細胞：ベクターが増殖されることができ、その核酸が発現される細胞。細胞は、原核生物である場合も、真核生物である場合もある。この用語はまた、対象宿主細胞の任意の後代も含む。すべての後代は、複製の際に突然変異が生じ得るので、親の細胞と同一ではないこともあるということは理解される。しかし、用語「宿主細胞」が使用される場合には、このような後代が含まれる。
免疫応答：刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞または単球などの免疫系の細胞の応答。一実施形態では、応答は、特定の抗原に対して特異的である（「抗原特異的応答」）。一実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。別の実施形態では、応答は、Ｂ細胞応答であり、特異的抗体の製造をもたらす。
免疫原：動物中に注射または吸収される組成物を含む、動物において抗体の製造またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物または物質。免疫原は、開示された組換えパラミクソウイルスなどの異種抗原によって誘導されるものを含む、特異的体液性または細胞性免疫の産物と反応する。対象への免疫原の投与は、目的の病原体に対する感染防御免疫につながり得る。
免疫原性組成物：免疫原上に含まれる、または免疫原中に含まれる核酸分子によってコードされる、抗原に対する測定可能なＴ細胞応答を誘導する、または抗原に対する測定可能なＢ細胞応答（抗体の製造など）を誘導する免疫原を含む組成物。一例では、免疫原性組成物は、対象に投与された場合に、ＲＳＶおよび／もしくはＰＩＶに対する測定可能なＣＴＬ応答を誘導する、またはＲＳＶおよび／もしくはＰＩＶに対する測定可能なＢ細胞応答（抗体の製造など）を誘導する開示された組換えパラミクソウイルスを含む組成物である。免疫原性組成物は、本明細書に開示されるような単離された組換えパラミクソウイルスを含み得る。ｉｎ ｖｉｖｏ使用のために、免疫原性組成物は、通常、医薬上許容される担体中に組換えパラミクソウイルスを含み、アジュバントなどのその他の薬剤も含み得る。
単離された：「単離された」生物学的成分は、その他の染色体および染色体外ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質などの成分が天然に生じるその他の生物学的成分などのその他の生物学的成分から実質的に分離または精製されている。「単離」されているタンパク質、ペプチド、核酸およびウイルスとして、標準精製法によって精製されたものが挙げられる。単離は、絶対的な純度を必要とせず、少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはさらに９９．９％単離されているなど、少なくとも５０％単離されているタンパク質、ペプチド、核酸またはウイルス分子を含み得る。
連結している：用語「連結された」、「連結」および「連結している」とは、２つの分子を１つの連続分子にすること、例えば、組換え手段によって２つのポリペプチドを１つの連続するポリペプチドに連結することを指す。異種Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと「連結された」ＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする遺伝子への言及は、遺伝子の発現が、ＮからＣ末端方向に、ＲＳＶ Ｆエクトドメイン、ＴＭおよびＣＴを含むタンパク質の製造につながるような、組換え手段による遺伝子中の、ＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする核酸配列と、異種Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴをコードする核酸配列との間の遺伝子連結を指す。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ ＦエクトドメインのＣ末端残基を、ＴＭのＮ末端残基と直接連結することができる（ペプチド結合によって）。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ ＦエクトドメインのＣ末端残基を、ペプチドリンカー（グリシン－セリンリンカーなど）を介してＴＭのＮ末端残基と間接的に連結することができる。
リンカー：２つの分子を１つの連続分子に連結するために使用することができる二機能性分子。ペプチドリンカーの限定されない例として、グリシン－セリンリンカーが挙げられる。
天然タンパク質、配列またはジスルフィド結合：例えば、選択的突然変異によって修飾されていないポリペプチド、配列またはジスルフィド結合。例えば、標的エピトープに対する抗原の抗原性を集中させるための、または天然タンパク質中に存在しないジスルフィド結合を、タンパク質中に導入するための選択的突然変異。天然タンパク質または天然配列はまた、野生型タンパク質または野生型配列とも呼ばれる。非天然ジスルフィド結合は、天然タンパク質中に存在しないジスルフィド結合、例えば、遺伝子工学によるタンパク質への１つまたはそれ以上のシステイン残基の導入のためにタンパク質中に形成するジスルフィド結合である。
核酸分子：ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびに上記の合成形態および混合ポリマーのセンスならびにアンチセンス鎖の両方を含み得るヌクレオチドのポリマー形態。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態を指す。用語「核酸分子」は、本明細書において、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、普通、特に断りのない限り、少なくとも１０塩基の長さである。この用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在するおよび／または天然に存在しないヌクレオチド連結によって一緒に連結している天然に存在するおよび修飾されたヌクレオチドのいずれか、または両方を含み得る。
作動可能に連結された：第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的関係に位置している場合に、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、プロモーターは、コード配列と作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結された核酸配列は、連続しており、２つのタンパク質コーディング領域を接続する必要がある場合には、同一リーディングフレームにある。
パラミクソウイルス：エンベロープ非分割型マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスのファミリー。パラミクソウイルスの例として、それだけには限らないが、１、２、３、４Ａおよび４Ｂ型（それぞれ、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＨＰＩＶ４ＡおよびＨＰＩＶ４Ｂ）を含むヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、マウスパラインフルエンザ１型（センダイウイルス、ＭＰＩＶ１）、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩＶ３）、パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５、以前は、サルウイルス５、ＳＶ５と呼ばれた）、サルウイルス４１（ＳＶ４１）ならびにムンプスウイルスが挙げられる。ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、ＭＰＩＶ１およびＢＰＩＶ３は、レスピロウイルス属に分類される。ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ４、ＳＶ５、ＳＶ４１およびムンプスウイルスは、ルブラウイルス属に分類される。ＭＰＩＶ１、ＰＩＶ５およびＢＰＩＶ３は、それぞれＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２およびＨＰＩＶ３の動物関連物である（Ｃｈａｎｃｏｃｋら、Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｋｎｉｐｅら（編）、１３４１～１３７９、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００１）。ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２およびＨＰＩＶ３は、別個の血清型に相当し、大幅な交差免疫性を誘発しない。ＨＰＩＶは、クループ、肺炎または気管支炎などの呼吸器感染症の病原体である。
パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）：記述的に一緒にグループ化されるパラミクソウイルス科に由来するいくつかのエンベロープ非分割型マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス。これは、レスピロウイルス属のメンバーのすべて（例えば、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３）およびルブラウイルス属のいくつかのメンバー（例えば、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ４、ＰＩＶ５）を含む。アブラウイルス属のメンバー（例えば、ＮＤＶ）は、歴史的にＰＩＶと呼ばれており、このグループの一部として考えられる。ＨＰＩＶ血清型１、２および３は、世界中で乳児および小児における重症呼吸器感染症を引き起こすことにおいて、ＲＳＶのみに次ぐ第２のものであり、ＨＰＩＶ３は、疾患の影響の点でＨＰＩＶのうちで最も重要である。ＰＩＶは、２種の構造モジュール：（１）ウイルスゲノムを含有する内部リボ核タンパク質コアまたはヌクレオカプシドおよび（２）外側の大まかに球形のリポタンパク質エンベロープで構成されている。ＰＩＶウイルスゲノムは、およそ１５，０００ヌクレオチドの長さであり、少なくとも８つのポリペプチドをコードする。これらのタンパク質は、ヌクレオカプシド構造タンパク質（属に応じてＮＰ、ＮＣまたはＮ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、融合糖タンパク質（Ｆ）、血球凝集素－ノイラミニダーゼ糖タンパク質（ＨＮ）、大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）ならびにＣおよびＤタンパク質を含む。Ｐ遺伝子は、アクセサリータンパク質をコードする１つまたはそれ以上のさらなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。遺伝子順序は、３’－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｆ－ＨＮ－Ｌ－５’であり、各遺伝子は、ｍＲＮＡをコードする別個のタンパク質をコードする。ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３およびＢＰＩＶ３ウイルスの配列などの例示的ＰＩＶ株配列は、当業者に公知である。
医薬上許容される担体：有用である医薬上許容される担体は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１９版、１９９５には、開示される免疫原の医薬送達に適した組成物および製剤が記載されている。
一般に、担体の性質は、使用されている特定の投与様式に応じて変わる。例えば、非経口製剤は、普通、媒体として水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの医薬上および生理学的に許容される流体を含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤の形態）には、従来の非毒性固体担体として、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与されるべき医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存料およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンなどの微量の非毒性補助物質を含有し得る。対象への投与に適した特定の実施形態では、担体は、無菌であり、および／または所望の免疫応答を誘導するのに適した組成物の１もしくはそれ以上の測定された用量を含有する単位投与形中に懸濁されるもしくはそうでなければ含有される。また、治療目的でそれを使用するための薬物適用によって達成される。単位投与形は、例えば、滅菌内容物を含有する密閉バイアルもしくは対象への注射のためのシリンジ中、またはその後の可溶化および投与のために凍結乾燥されるか、または固体もしくは徐放投与形中であり得る。
ポリペプチド：長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらない、アミノ酸の任意の鎖。「ポリペプチド」は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーを含むアミノ酸ポリマーに当てはまり、ならびに、これでは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、非天然アミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣物である。「残基」とは、アミド結合またはアミド結合模倣物によってポリペプチド中に組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣物を指す。ポリペプチドは、アミノ末端（Ｎ末端）の末端およびカルボキシ末端（Ｃ末端）の末端を有する。「ポリペプチド」は、ペプチドまたはタンパク質と同義的に使用され、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指すように使用される。
プライム－ブーストワクチン接種：免疫応答を誘導するための、対象への、第１の免疫原性組成物（プライマーワクチン）の投与と、それに続く、第２の免疫原性組成物（ブースターワクチン）の投与を含む免疫療法。プライマーワクチン後にブースターワクチンが対象に投与され；当業者ならば、プライマーワクチンとブースターワクチンの投与の間の適した時間間隔を理解し、このような時間枠の例は、本明細書に開示されている。プライム－ブーストプロトコールにさらなる投与、例えば、第２のブーストを含めることができる。
組換え体：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有し、例えば、１つまたはそれ以上の核酸置換、欠失もしくは挿入を含む、および／または２つのそうでなければ分離している配列のセグメントの人工的な組合せによって作製される配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学合成によって、より一般的には、単離された核酸のセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子工学技術によって達成できる。
組換えウイルスは、組換え核酸分子を含むゲノムを含むものである。
組換えタンパク質は、天然に存在しない配列を有する、または２つのそうでなければ分離している配列のセグメントの人工的な組合せによって作製される配列を有するものである。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、細菌もしくは真核細胞などの宿主細胞中に、または組換えウイルスのゲノム中に導入されている異種（例えば、組換え）核酸によってコードされる。
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）：パラミクソウイルス科のエンベロープ非分割型マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス。ＲＳＶゲノムは、約１５，０００ヌクレオチドの長さであり、糖タンパク質ＳＨ、ＧおよびＦを含む１１種のタンパク質をコードする１０種の遺伝子を含む。Ｆタンパク質は、融合を媒介し、細胞質へのウイルスの侵入を可能にし、合胞体の形成も促進する。Ｇ糖タンパク質の抗原性の相違に主に基づいて、ヒトＲＳＶ株の２つの抗原サブグループ、ＡおよびＢサブグループが記載されている。ウシＲＳＶを含む、その他の種のＲＳＶ株も知られている。例示的ＲＳＶ株配列は、当業者に公知である。さらに、ｈＲＳＶに感染したモデル生物ならびにウシにおけるｂＲＳＶ感染の使用など、種特異的ＲＳＶに感染したモデル生物を含むヒトＲＳＶ感染のいくつかのモデルも利用可能である（例えば、Ｂｅｒｎら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、３０１：Ｌ１４８～Ｌ１５６、２０１１；およびＮａｍ ａｎｄ Ｋｕｎ （編）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ： Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、２０１１；およびＣａｎｅ（編）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７）。
ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質：ウイルスおよび細胞膜の融合を促進するＲＳＶエンベロープ糖タンパク質。実際は、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、Ｆ０と指定される、単一のポリペプチド前駆体およそ５７４アミノ酸の長さとして最初に合成される。Ｆ０は、局在性を小胞体に向けるＮ末端シグナルペプチドを含み、これでは、シグナルペプチド（およそ、Ｆ０の最初の２２残基）はタンパク質分解によって切断される。残りのＦ０残基は、オリゴマー形成して、三量体を形成し、これは、やはり、２つの保存されたフューリンコンセンサス切断配列（およそＦ０位置１０９／１１０および１３６／１３７；例えば、ＲＡＲＲ１０９（配列番号１、残基１０６～１０９）およびＲＫＲＲ１３６（配列番号１、残基１３３～１３６））で、細胞性プロテアーゼによってタンパク質分解によってプロセシングされて、ｐｅｐ２７ポリペプチドを切り出し、２つのジスルフィド結合断片、Ｆ１およびＦ２を生成する。これらの断片のうち小さい方、Ｆ２は、Ｆ０前駆体のＮ末端部分に起因し、およそＦ０の残基２６～１０９を含む。これらの断片のうち大きい方、Ｆ１は、Ｃ末端に細胞外／内腔領域（約残基１３７～５２９）、ＴＭ（約残基５３０～５５０）およびＣＴ（約残基５５１～５７４）を含むＦ０前駆体のＣ末端部分（およそ、残基１３７～５７４）を含む。
３つのＦ２－Ｆ１プロモーターは、成熟Ｆタンパク質においてオリゴマー形成し、これは、標的細胞膜との接触の際に、コンホメーション変化（「融合後」コンホメーションへの）をうけるように始動される準安定な「融合前」コンホメーションをとる。このコンホメーション変化は、Ｆ１ポリペプチドのＮ末端に位置し、宿主細胞膜と結合し、ウイルスまたは感染細胞の膜の、標的細胞膜との融合を促進する融合ペプチドとして知られる疎水性配列を露出する。
ＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞外部分は、Ｆ２タンパク質およびＦ１エクトドメインを含むＲＳＶ Ｆエクトドメインである。ＲＳＶ Ｆエクトドメイン三量体は、３つのＲＳＶ Ｆエクトドメインのタンパク質複合体を含む。
ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＲＳＶ Ｆの融合後コンホメーションへの推移および分泌系における成熟ＲＳＶ Ｆタンパク質への次のプロセシングにつながる膜融合事象の誘発の前は、「融合前」コンホメーションをとる。融合前コンホメーションにおける例示的 ＲＳＶ Ｆタンパク質の３次元構造は、公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４１６０４６３に開示されている。融合前状態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＲＳＶ Ｆ残基６２～６９および１９６～２０９を含み、またＤ２５およびＡＭ２２モノクローナル抗体のエピトープも含む「抗原部位Φ」と呼ばれるその膜遠位頂端に、抗原部位を含む。従って、融合前コンホメーションにおいて安定化される組換えＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前コンホメーションとは結合するが、融合後コンホメーションとは結合しない抗体、例えば、抗原部位Φ内のエピトープと特異的に結合する抗体、例えば、Ｄ２５またはＡＭ２２抗体によって特異的に結合される。さらなるＲＳＶ Ｆ融合前特異的抗体として、５Ｃ４およびＭＰＥ８抗体が挙げられる。
配列同一性：アミノ酸配列間の類似性は、別に、配列同一性と呼ばれる配列間の類似性の点で表される。配列同一性は、同一性パーセント（または類似性または相同性）の点で測定されることが多く；パーセンテージが高いほど、２種の配列は、より類似している。ポリペプチドの相同体、オルソログまたは変異体は、標準法を使用してアラインされると、比較的高度の配列同一性を有する。
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが：Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４、１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３：２３７～４４、１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１～３、１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１～９０、１９８８；Ｈｕａｎｇら．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ． ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８、１５５～６５、１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７～３１、１９９４に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～１０、１９９０には、配列アラインメント法および相同性算出の詳細な考察が提示されている。
ひとたびアラインされると、マッチの数は、両配列中に同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在する位置の数をカウントすることによって決定される。配列同一性パーセントは、マッチの数を、同定された配列において示される配列の長さによって、または、明瞭にされた長さ（同定された配列において示される配列に由来する１００の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基など）のいずれかによって除することと、続いて、得られた値に１００を乗じることによって決定される。例えば、１５５４個のアミノ酸を有する試験配列とアラインされた場合に１１６６のマッチを有するペプチド配列は、試験配列と７５．０パーセント同一である（１１６６÷１５５４＊１００＝７５．０）。配列同一性パーセント値は、小数第１位に四捨五入される。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３および７５．１４は、７５．１に切り捨てられ、一方で、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８および７５．１９は、７５．２に切り上げられる。長さ値は、常に整数となる。
ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３、１９９０）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源からおよびインターネットで入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネットでＮＣＢＩウェブサイトから入手可能である。
ポリペプチド（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）の相同体および変異体は、通常、目的のアミノ酸配列との全長アラインメントにわたってカウントされた少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有することによって特性決定される。参照配列に対してさらに大きな類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価された場合に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性などの同一性パーセンテージの増大を示す。配列同一性について、全配列未満が比較される場合には、相同体および変異体は、通常、１０～２０個のアミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列に対してその類似性に応じて、少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有し得る。このような短いウィンドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、インターネットでＮＣＢＩウェブサイトから入手可能である。当業者ならば、これらの配列同一性範囲は、単に指針のために提供され；提供される範囲の外側にある強力に重大な相同体を得ることができるということは完全にあり得ると理解するであろう。
核酸配列の配列比較のために、通常、ある配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用して、試験および参照配列がコンピュータに入力されると、必要に応じて、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが使用される。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、１９８１の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、１９７０の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４、１９８８の類似性の探索方法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のコンピュータによる実施によって、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１２）およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、詳細な付録１０４、２０１３を参照のこと））実施できる。有用なアルゴリズムの１つの例として、ＰＩＬＥＵＰがある。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．３５：３５１～３６０、１９８７の進行性のアラインメントの単純化法を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ５：１５１～１５３、１９８９によって記載された方法と同様である。ＰＩＬＥＵＰを使用し、参照配列がその他の試験配列と比較されて、以下のパラメーター：デフォルトギャップ加重（３．００）、デフォルトギャップ長加重（０．１０）および加重エンドギャップを使用して配列同一性関係パーセントが決定される。ＰＩＬＥＵＰは、例えばＧＣＧ配列解析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン７．０（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７～３９５、１９８４）から得ることができる。
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適しているアルゴリズムの別の例として、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがあり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０、１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２、１９７７に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）によって公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴＰプログラム（アミノ酸配列のための）は、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）および１０の予測（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５、１９８９を参照のこと）。オリゴヌクレオチドは、最大約１００ヌクレオチド塩基長の線形ポリヌクレオチド配列である。
本明細書において、「少なくとも９０％の同一性」への言及は、指定の参照配列に対する「少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはさらには１００％の同一性」を指す。
対象：生存している多細胞脊椎動物、ヒトおよび非ヒト哺乳類を含むカテゴリー。一例では、対象はヒトである。特定の例では、対象は、新生児である。さらなる例では、ＲＳＶ感染の阻害を必要とする対象が選択される。例えば、対象は、感染しておらず、ＲＳＶ感染のリスクにあるか、または感染し、治療の必要があるかのいずれかである。
膜貫通ドメイン（ＴＭ）：細胞またはウイルスまたはウイルス様粒子の脂質二重層などの脂質二重層にまたがるアミノ酸配列。膜貫通ドメインを使用して、抗原を膜に固定することができる。いくつかの例では、膜貫通ドメインは、ＲＳＶ Ｆ膜貫通ドメインである。
ワクチン：感染またはその他の種類の疾患の予防、寛解、または治療のために投与される免疫応答を刺激可能である免疫原性材料の調製。免疫原性材料は、減弱されたもしくは死滅した微生物（細菌またはウイルスなど）または抗原性タンパク質、ペプチドまたはそれらに由来するＤＮＡを含み得る。減弱されたワクチンは、あまり病原性形態を生成しないように修飾されているが、病原性形態に対する抗体および細胞性免疫を誘発する能力はそれにもかかわらず保持する病原性の生物である。不活性化された（死滅した）ワクチンは、化学物質、熱またはその他の処理を用いて不活性化されているが、生物に対する抗体を誘発する、以前は病原性の生物である。ワクチンは、予防的（防止的または保護的）および治療的応答の両方を誘発し得る。投与方法は、ワクチンに応じて変わるが、接種、経口摂取、吸入または投与のその他の形態を含み得る。ワクチンは、免疫応答をブーストするためにアジュバントとともに投与できる。
ベクター：目的の抗原（単数または複数）のコード配列と作動可能に連結しているプロモーター（単数または複数）を有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含有し、コード配列を発現できる実体。限定されない例として、裸のまたはパッケージングされた（脂質および／またはタンパク質）ＤＮＡ、裸のまたはパッケージングされたＲＮＡ、複製能力がない場合もあるウイルスもしくは細菌もしくはその他の微生物または複製能力がある場合があるウイルスもしくは細菌もしくはその他の微生物の小成分が挙げられる。ベクターは、構築物と呼ばれることもある。組換えＤＮＡベクターは、組換えＤＮＡを有するベクターである。ベクターは、複製起点などの宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含み得る。ベクターはまた、当技術分野で公知の１種またはそれ以上の選択マーカー遺伝子およびその他の遺伝子エレメントを含み得る。ウイルスベクターは、１種またはそれ以上のウイルスに由来する少なくともいくつかの核酸配列を有する組換え核酸ベクターである。
ＩＩ．組換えウイルスベクター
複数のウイルス病原体に由来する抗原を含み、それらのウイルス病原体に対する免疫応答を誘導するために使用できる組換えパラミクソウイルスが、提供される。組換えパラミクソウイルスは、異種遺伝子をコードするゲノムを含む。組換えパラミクソウイルスは、異種ウイルス病原体の膜貫通タンパク質（例えば、ウイルスの糖タンパク質）のエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む。エクトドメインは、パラミクソウイルス由来のエンベロープタンパク質のＣＴまたはＴＭおよびＣＴと連結して、パラミクソウイルスエンベロープで異種ウイルス由来の膜貫通タンパク質のエクトドメインの発現を可能にすることができる。例えば、組換えパラミクソウイルスは、ＰＩＶ由来のＦタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結しているＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えＰＩＶであり得る。組換えパラミクソウイルスおよびその修飾のさらなる説明は、本明細書において提供される。
パラミクソウイルスゲノムは、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする遺伝子を含む。ゲノムはまた、ゲノムプロモーターおよび抗プロモーターを、プロモーター－Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｌ－抗プロモーターの順序で含む。組換えパラミクソウイルスのゲノム中に含まれる異種遺伝子は、パラミクソウイルスゲノムの遺伝子間またはプロモーターとＮ遺伝子もしくはＬ遺伝子と抗プロモーターの間の任意の位置に位置し得る。異種遺伝子を、ウイルスゲノムからの発現を促進するように適当な遺伝子開始および遺伝子終結配列によってフランキングすることができる。好ましい実施形態では、異種遺伝子を、プロモーターとＮ遺伝子の間またはＮ遺伝子とＰ遺伝子の間に位置付けることができる。
一実施形態では、組換えパラミクソウイルスのゲノム中に含まれる異種遺伝子は、パラミクソウイルスのＦタンパク質のＣＴまたはＴＭおよびＣＴと連結しているＩ型膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型ウイルスの糖タンパク質）のエクトドメインをコードする。その他の実施形態では、組換えパラミクソウイルスのゲノム中に含まれる異種遺伝子は、パラミクソウイルスのＨＮタンパク質のＣＴまたはＴＭおよびＣＴと連結しているＩＩ型膜貫通タンパク質（例えば、ＩＩ型ウイルスの糖タンパク質）エクトドメインをコードする。
組換えパラミクソウイルスは、例えば、組換えＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＢＰＩＶ３、ＰＩＶ５、センダイウイルスまたはＮＤＶまたはそれらのキメラであり得る。このような組換えパラミクソウイルスのさらなる説明は、以下に提供される。
異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えパラミクソウイルスを作製する一般法は、当業者に公知であり、このような方法において使用するためのウイルス配列および試薬も同様である。異種遺伝子を含む組換えＰＩＶベクター（組換えＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３またはＨ／ＢＰＩＶ３ベクターなど）を作製する方法の限定されない例、ベクターを減弱する方法（例えば、組換えまたは化学的手段によって）ならびにこのような方法において使用するためのウイルス配列および試薬は、各々、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１２／００４５４７１号；同２０１０／０１１９５４７号；同２００９／０２６３８８３号；同２００９／００１７５１７号；同８０８４０３７号；同６，４１０，０２３号；同８，３６７，０７４号；同７，９５１，３８３号；同７，８２０，１８２号；同７７０４５０９号；同７６３２５０８号；同７６２２１２３号；同７２５０１７１号；同７２０８１６１号；同７２０１９０７号；同７１９２５９３号およびＮｅｗｍａｎら２００２ Ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｓ ２４：７７～９２、Ｔａｎｇら、２００３ Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７７（２０）：１０８１９～１０８２８において提供されている。異種遺伝子を含む組換えＮＤＶベクターを作製する方法の限定されない例ならびにこのような方法において使用するためのウイルス配列および試薬は、各々、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１２／００６４１１２号；およびＢａｓａｖａｒａｊａｐｐａら２０１４ Ｖａｃｃｉｎｅ、３２：３５５５～３５６３およびＭｃＧｉｎｎｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８５：３６６～３７７、２０１１年において提供されている。異種遺伝子を含む組換えセンダイベクターを作製する方法の限定されない例ならびにこのような方法において使用するためのウイルス配列および試薬は、各々、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１４０１８６３９７号およびＪｏｎｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、３０：９５９～９６８、２０１２において提供されている。
Ａ．ＨＰＩＶ１ベクター
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１であり得る。ＨＰＩＶ１ゲノムの核酸配列およびその中の遺伝子は、当技術分野で公知であり、遺伝子開始および遺伝子終結配列ならびにウイルスゲノムおよびアンチゲノムプロモーターなどの、遺伝子発現を制御する構造的および機能的遺伝子エレメントも同様である。例示的ＨＰＩＶ１ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／１９６４株ゲノム配列は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４５７１０２．１として提供される。この例示的ＨＰＩＶ１ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／１９６４株ゲノム配列は：
ＨＰＩＶ１ Ｎ、配列番号２４（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質番号ＡＡＬ８９４００．１）、
ＨＰＩＶ１ Ｐ、配列番号２５（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質番号ＡＡＬ８９４０２．１）
ＨＰＩＶ１ Ｃ、配列番号２６（ＰのＯＲＦ、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質番号ＡＡＬ８９４０３．１）、
ＨＰＩＶ１ Ｍ、配列番号２７（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質番号ＡＡＬ８９４０６．１）
ＨＰＩＶ１ Ｆ、配列番号２８（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質番号ＡＡＬ８９４０７．１）
ＨＰＩＶ１ ＨＮ、配列番号２９（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質番号ＡＡＬ８９４０８．１）
ＨＰＩＶ１ Ｌ、配列番号３０（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質番号ＡＡＬ８９４０９．１）
として示されるＮ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする。
これらのＨＰＩＶ１遺伝子の対応する遺伝子開始および遺伝子終結配列は、以下に提供される：
Figure 0007020917000001
さらに、それぞれ、ヌクレオチド１～９６および１５５４４～１５６００として、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４５７１０２．１において示されるような、ＨＰＩＶ２ Ｖ９４株のウイルスリーダー／ゲノムプロモーターおよびトレーラー／アンチゲノムプロモーター。
組換えパラミクソウイルスは、上記で示されるようなＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする、または上記で示されるＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質に対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を個々に有するＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１であり得る。
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする、または以下に示されるようなＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１であり得る。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質ＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする、または以下に示されるようなＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質ＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質ＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１であり得る。ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴ配列は、公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４５７１０２．１を参照のこと）。例示的ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴ配列は、以下として示される：
ＨＰＩＶ１ Ｆ ＴＭ：ＱＩＩＭＩＩＩＶＣＩＬＩＩＩＩＣＧＩＬＹＹＬＹ、配列番号３１の残基１～２３
ＨＰＩＶ１ Ｆ ＣＴ：ＲＶＲＲＬＬＶＭＩＮＳＴＨＮＳＰＶＮＡＹＴＬＥＳＲＭＲＮＰＹＭＧＮＮＳＮ、配列番号３１の残基２４～５９
ＨＰＩＶ１ Ｆ ＴＭ＋ＣＴ：ＱＩＩＭＩＩＩＶＣＩＬＩＩＩＩＣＧＩＬＹＹＬＹＲＶＲＲＬＬＶＭＩＮＳＴＨＮＳＰＶＮＡＹＴＬＥＳＲＭＲＮＰＹＭＧＮＮＳＮ、配列番号３１
Ｂ．ＨＰＩＶ２ベクター
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスベクターは、ＨＰＩＶ２ Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ２であり得る。これらのＨＰＩＶ２タンパク質をコードする遺伝子の核酸配列は、当技術分野で公知であり、遺伝子開始および遺伝子終結配列ならびにウイルスゲノムおよびアンチゲノムプロモーターなどの、遺伝子発現を制御する構造的および機能的遺伝子エレメントも同様である。例示的ＨＰＩＶ２ Ｖ９４株ゲノム配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５３３０１０．１として提供されている。この例示的ＨＰＩＶ２ Ｖ９４株ゲノム配列は：
ＨＰＩＶ２ Ｎ、配列番号３２（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ５３３０１０．１によってコードされる）
ＨＰＩＶ２ Ｐ、配列番号３３（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ５３３０１０．１によってコードされる）
ＨＰＩＶ２ Ｖ、配列番号３４（ＰのＯＲＦ、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ５３３０１０．１によってコードされる）
ＨＰＩＶ２ Ｍ、配列番号３５（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ５３３０１０．１によってコードされる）
ＨＰＩＶ２ Ｆ、配列番号３６（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ５３３０１０．１によってコードされる）
ＨＰＩＶ２ ＨＮ、配列番号３７（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ５３３０１０．１によってコードされる）
ＨＰＩＶ２ Ｌ、配列番号３８（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ５３３０１０．１によってコードされる）
として示されるＮ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする。
これらのＨＰＩＶ２遺伝子の対応する遺伝子開始および遺伝子終結配列は、以下に提供される：
Figure 0007020917000002
さらに、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５３３０１０．１において示されるようなＨＰＩＶ２ Ｖ９４株のウイルスリーダー／ゲノムプロモーターおよびトレーラー／アンチゲノムプロモーターは、それぞれ、ヌクレオチド１～１７５および１５５６５～１５６５４として示される。
組換えパラミクソウイルスは、上記で示されるようなＨＰＩＶ２ Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする、または上記で示されるＨＰＩＶ２ Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質に対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を個々に有するＨＰＩＶ２ Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ２であり得る。
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるＨＰＩＶ２ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする、または以下に示されるようなＨＰＩＶ２ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＨＰＩＶ２ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えＨＰＩＶ２であり得る。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなＨＰＩＶ２ Ｆタンパク質ＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする、または以下に示されるようなＨＰＩＶ２ Ｆタンパク質ＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＨＰＩＶ２ Ｆタンパク質ＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えＨＰＩＶ２であり得る。ＨＰＩＶ２ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴ配列は、公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５３３０１０．１を参照のこと）。ＨＰＩＶ３ ＪＳ株由来の例示的ＨＰＩＶ２ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴ配列は、以下として示される：
ＨＰＩＶ２ Ｆ ＴＭドメイン：ＴＬＹＳＬＳＡＩＡＬＩＬＳＶＩＴＬＶＶＶＧＬＬＩＡＹＩＩ、配列番号３９の残基１～２８
ＨＰＩＶ２ Ｆ ＣＴ：ＫＬＶＳＱＩＨＱＦＲＡＬＡＡＴＴＭＦＨＲＥＮＰＡＶＦＳＫＮＮＨＧＮＩＹＧＩＳ、配列番号３９の残基２９～６６
ＨＰＩＶ２ Ｆ ＴＭ＋ＣＴ：ＴＬＹＳＬＳＡＩＡＬＩＬＳＶＩＴＬＶＶＶＧＬＬＩＡＹＩＩＫＬＶＳＱＩＨＱＦＲＡＬＡＡＴＴＭＦＨＲＥＮＰＡＶＦＳＫＮＮＨＧＮＩＹＧＩＳ、配列番号３９
Ｃ．ＨＰＩＶ３ベクター
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３であり得る。これらのＨＰＩＶ３タンパク質をコードする遺伝子の核酸配列は、当技術分野で公知であり、遺伝子開始および遺伝子終結配列ならびにウイルスゲノムおよびアンチゲノムプロモーターなどの、遺伝子発現を制御する構造的および機能的遺伝子エレメントも同様である。例示的ＨＰＩＶ３ ＪＳ株ゲノム配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ１１５７５として提供されている。この例示的ＨＰＩＶ３ ＪＳ株ゲノム配列について、Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする核酸配列は、以下に示される。
ＨＰＩＶ３ Ｎ、配列番号４０（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１１５７５のヌクレオチド１１１～１６５８によってコードされる）
ＨＰＩＶ３ Ｐ、配列番号４１（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１１５７５のヌクレオチド１７８４～３５９５によってコードされる）
ＨＰＩＶ３ Ｃ、配列番号１１４（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１１５７５のヌクレオチド１７９４～２３９３によってコードされる）
ＨＰＩＶ３ Ｍ、配列番号４２（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１１５７５のヌクレオチド３７５３～４８１４によってコードされる）
ＨＰＩＶ３ Ｆ、配列番号４３（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１１５７５のヌクレオチド５０７２～６６９１によってコードされる）
ＨＰＩＶ３ ＨＮ、配列番号４４（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１１５７５のヌクレオチド６８０６～８５２４によってコードされる）
ＨＰＩＶ３ Ｌ、配列番号４５（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１１５７５のヌクレオチド８６４６～１５３４７によってコードされる）
いくつかの実施形態では、ＨＰＩＶ３ベクター中のＨＮ遺伝子は、以下に示されるアミノ酸配列を含むＨＰＩＶ３ ＨＮタンパク質をコードする
MEYWKHTNHGKDAGNELETSMATHGNKLTNKIIYILWTIILVLLSIVFIIVLINSIKSEKAHESLLQDINNEFMEITEKIQMASDNTNDLIQSGVNTRLLTIQSHVQNYIPISLTQQMSDLRKFISEITIRNDNQEVLPQRITHDVGIKPLNPDDFWRCTSGLPSLMKTPKIRLMPGPGLLAMPTTVDGCVRTPSLVINDLIYAYTSNLITRGCQDIGKSYQVLQIGIITVNSDLVPDLNPRISHTFNINDNRKSCSLALLNIDVYQLCSTPKVDERSDYASSGIEDIVLDIVNYDGSISTTRFKNNNISFDQPYAALYPSVGPGIYYKGKIIFLGYGGLEHPINENVICNTTGCPGKTQRDCNQASHSTWFSDRRMVNSIIVVDKGLNSIPKLKVWTISMRQNYWGSEGRLLLLGNKIYIYTRSTSWHSKLQLGIIDITDYSDIRIKWTWHNVLSRPGNNECPWGHSCPDGCITGVYTDAYPLNPTGSIVSSVILDSQKSRVNPVITYSTATERVNELAILNRTLSAGYTTTSCITHYNKGYCFHIVEINHKSLNTFQPMLFKTEIPKSCS（配列番号１０１）
配列番号１０１をコードする例示的ＤＮＡ配列は、以下のように提供される：
atggaatactggaagcataccaatcacggaaaggatgctggtaatgagctggagacgtctatggctactcatggcaacaagctcactaataagataatatacatattatggacaataatcctggtgttattatcaatagtcttcatcatagtgctaattaattccatcaaaagtgaaaaggcccacgaatcattgctgcaagacataaataatgagtttatggaaattacagaaaagatccaaatggcatcggataataccaatgatctaatacagtcaggagtgaatacaaggcttcttacaattcagagtcatgtccagaattacataccaatatcattgacacaacagatgtcagatcttaggaaattcattagtgaaattacaattagaaatgataatcaagaagtgctgccacaaagaataacacatgatgtaggtataaaacctttaaatccagatgatttttggagatgcacgtctggtcttccatctttaatgaaaactccaaaaataaggttaatgccagggccgggattattagctatgccaacgactgttgatggctgtgttagaactccgtctttagttataaatgatctgatttatgcttatacctcaaatctaattactcgaggttgtcaggatataggaaaatcatatcaagtcttacagatagggataataactgtaaactcagacttggtacctgacttaaatcctaggatctctcatacctttaacataaatgacaataggaagtcatgttctctagcactcctaaatatagatgtatatcaactgtgttcaactcccaaagttgatgaaagatcagattatgcatcatcaggcatagaagatattgtacttgatattgtcaattatgatggttcaatctcaacaacaagatttaagaataataacataagctttgatcaaccatatgctgcactatacccatctgttggaccagggatatactacaaaggcaaaataatatttctcgggtatggaggtcttgaacatccaataaatgagaatgtaatctgcaacacaactgggtgccccgggaaaacacagagagactgtaatcaagcatctcatagtacttggttttcagataggaggatggtcaactccatcattgttgttgacaaaggcttaaactcaattccaaaattgaaagtatggacgatatctatgcgacaaaattactgggggtcagaaggaaggttacttctactaggtaacaagatctatatatatacaagatctacaagttggcatagcaagttacaattaggaataattgatattactgattacagtgatataaggataaaatggacatggcataatgtgctatcaagaccaggaaacaatgaatgtccatggggacattcatgtccagatggatgtataacaggagtatatactgatgcatatccactcaatcccacagggagcattgtgtcatctgtcatattagactcacaaaaatcgagagtgaacccagtcataacttactcaacagcaaccgaaagagtaaacgagctggccatcctaaacagaacactctcagctggatatacaacaacaagctgcattacacactataacaaaggatattgttttcatatagtagaaataaatcataaaagcttaaacacatttcaacccatgttgttcaaaacagagattccaaaaagctgcagttaa（配列番号１０２）
これらのＨＰＩＶ３遺伝子の対応する遺伝子開始および遺伝子終結配列は、以下に提供される：
Figure 0007020917000003
さらに、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ１１５７５において示されるようなＨＰＩＶ３ ＪＳ株のウイルスゲノムおよびアンチゲノムプロモーターは、それぞれ、ヌクレオチド１～９６（ゲノムプロモーター）およびヌクレオチド１５３６７～１５４６２（アンチゲノムプロモーター）として提供される。
組換えパラミクソウイルスは、上記で示されるようなＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする、または上記で示されるＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質に対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を個々に有するＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３であり得る。
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする、または以下に示されるようなＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３であり得る。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質ＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする、または以下に示されるようなＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質ＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質ＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３であり得る。ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴ配列は公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１１５７５のヌクレオチド５０７２～６６９１によってコードされるタンパク質を参照のこと）。ＨＰＩＶ３ ＪＳ株に由来する例示的ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴ配列は、以下として示される：
ＨＰＩＶ３ Ｆ ＴＭドメイン：ＩＩＩＩＬＩＭＩＩＩＬＦＩＩＮＩＴＩＩＴＩＡＩ、配列番号４６の残基１～２３
ＨＰＩＶ３ Ｆ ＣＴ：ＫＹＹＲＩＱＫＲＮＲＶＤＱＮＤＫＰＹＶＬＴＮＫ、配列番号４６の残基２４～４６
ＨＰＩＶ３ Ｆ ＴＭ＋ＣＴ：ＩＩＩＩＬＩＭＩＩＩＬＦＩＩＮＩＴＩＩＴＩＡＩＫＹＹＲＩＱＫＲＮＲＶＤＱＮＤＫＰＹＶＬＴＮＫ、配列番号４６
Ｄ．ウシＰＩＶ３およびキメラヒト／ウシＰＩＶ３ベクター
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、ＢＰＩＶ３およびＨＰＩＶ３由来のＮ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質の組合せをコードするウイルスゲノムを含むウシＰＩＶ３（ＢＰＩＶ３）またはキメラパラミクソウイルスであり得る。例えば、キメラウイルスゲノムは、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮタンパク質ならびにＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、ＭおよびＬタンパク質をコードできる。これらのＨＰＩＶ３およびＢＰＩＶ３タンパク質をコードする遺伝子の核酸配列は、当技術分野で公知であり、遺伝子開始および遺伝子終結配列ならびにウイルスゲノムおよびアンチゲノムプロモーターなどの、遺伝子発現を制御する構造的および機能的遺伝子エレメントも同様である。例示的ＢＰＩＶ３ Ｋａｎｓａｓゲノム配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１７８６５４として提供されている。この例示的ＢＰＩＶ３ Ｋａｎｓａｓ株ゲノム配列は、以下に示されるＮ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする：
ＢＰＩＶ３ Ｎ、配列番号４７（各々、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１７８６５４のヌクレオチド１１１～１６５８によってコードされるＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＦ２８２５４）
ＢＰＩＶ３ Ｐ、配列番号４８（各々、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１７８６５４のヌクレオチド１７８４～３５７４によってコードされるＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＦ２８２５５）
ＢＰＩＶ３ Ｃ、配列番号１１５（参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１７８６５４のヌクレオチド１７９４～２３９９によってコードされる）
ＢＰＩＶ３ Ｖ、配列番号１１６（ヌクレオチド２５００～２５０７に位置する遺伝子編集部位で、ヌクレオチド２５０５～２５０６の間にヌクレオチドｇが挿入された、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１７８６５４のヌクレオチド１７８４～３０１８によってコードされる）
ＢＰＩＶ３ Ｍ、配列番号４９（各々、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１７８６５４のヌクレオチド３７３５～４７９０によってコードされるＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＦ２８２５６）
ＢＰＩＶ３ Ｆ、配列番号５０（各々、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１７８６５４のヌクレオチド５０６６～６６８８によってコードされるＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＦ２８２５７）
ＢＰＩＶ３ ＨＮ、配列番号５１（各々、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１７８６５４のヌクレオチド６８００～８５１８によってコードされるＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＦ２８２５８）
ＢＰＩＶ３ Ｌ、配列番号５２（各々、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１７８６５４のヌクレオチド８６４０～１５３４１によってコードされるＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＦ２８２５９）
いくつかの実施形態では、キメラＢ／ＨＰＩＶ３ベクター中に含まれるＨＰＩＶ３ ＨＮ遺伝子は、配列番号１０１もしくは配列番号４４として示されるアミノ酸配列を含むＨＰＩＶ３ ＨＮタンパク質またはその変異体をコードする。配列番号１０１をコードする例示的ＤＮＡ配列は、配列番号１０２として提供される。
いくつかの実施形態では、キメラＢ／ＨＰＩＶ３ベクターは、ＢＰＩＶ３ Ｆ遺伝子の代わりにＨＰＩＶ３ Ｆ遺伝子、例えば、配列番号４３として示されるＨＰＩＶ３ Ｆアミノ酸配列またはその変異体をコードする遺伝子を含み得る。
これらのＢＰＩＶ３遺伝子の対応する遺伝子開始および遺伝子終結配列は、以下に提供される：
Figure 0007020917000004
さらに、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１７８６５４において示されるようなＢＰＩＶ３ Ｋａｎｓａｓ株のウイルスゲノムおよびアンチゲノムプロモーターは、それぞれ、ヌクレオチド１～９６（ゲノムプロモーター）およびヌクレオチド１５３６１～１５４５６（アンチゲノム プロモーター）として提供される。
ＨＰＩＶ３およびＢＰＩＶ３ウイルス由来のＮ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む組換えパラミクソウイルスは、上記で示されるようなＨＰＩＶ３およびＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ タンパク質の混合物をコードし得る、または個々に、上記で示されるＢＰＩＶ３もしくはＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質に対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有する、ＢＰＩＶ３およびＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質の混合物をコードし得る。
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、上記で示されるようなＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮタンパク質ならびにＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、ＭおよびＬタンパク質をコードする、または個々に、上記で示される対応するＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮタンパク質もしくはＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、ＭおよびＬタンパク質に対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮタンパク質ならびにＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、ＭおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含み得る。
いくつかの実施形態では、ＢＰＩＶ３に由来するＮ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするゲノムを含む組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している、または以下に示されるようなＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＴＭおよびＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＢＰＩＶ３に由来するＮ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするゲノムを含む組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している、または以下に示されるようなＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、ＨＰＩＶ３およびＢＰＩＶ３ウイルスに由来するＮ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質（ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮタンパク質ならびにＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、ＭおよびＬタンパク質など）をコードするゲノムを含む組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している、または以下に示されるようなＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＴＭおよびＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＩＶ３およびＢＰＩＶ３ウイルスに由来するＮ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするゲノムを含む組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している、または以下に示されるようなＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子をさらに含み得る。ＢＰＩＶ３ Ｋａｎｓａｓ株に由来する例示的ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴ配列は：
ＢＰＩＶ３ Ｆ ＴＭドメイン：ＩＴＩＩＩＶＭＩＩＩＬＶＩＩＮＩＴＩＩＶＶ、配列番号５３の残基１～２１
ＢＰＩＶ３ Ｆ ＣＴ： ＩＩＫＦＨＲＩＱＧＫＤＱＮＤＫＮＳＥＰＹＩＬＴＮＲＱ、配列番号 ５３の残基２２～５７
ＢＰＩＶ３ Ｆ ＴＭ＋ＣＴ：ＩＴＩＩＩＶＭＩＩＩＬＶＩＩＮＩＴＩＩＶＶＩＩＫＦＨＲＩＱＧＫＤＱＮＤＫＮＳＥＰＹＩＬＴＮＲＱ、配列番号 ５３
として示される。
いくつかの実施形態では、ＨＰＩＶ３およびＢＰＩＶ３ウイルスに由来するＮ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質（ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮタンパク質ならびにＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、ＭおよびＬタンパク質など）をコードするゲノムを含む組換えパラミクソウイルスは、上記で示されるようなＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している、または上記で示されるようなＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＴＭおよびＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＩＶ３およびＢＰＩＶ３ウイルスに由来するＮ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするゲノムを含む組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している、または以下に示されるようなＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＣＴと連結しているＩ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子をさらに含み得る。
Ｅ．センダイウイルス
一実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、センダイウイルス Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している、またはセンダイウイルス Ｆタンパク質のＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＴＭおよびＣＴと連結している、Ｉ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子を含むセンダイウイルス Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする組換えウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスであり得る。一実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、センダイウイルスＦタンパク質のＣＴと連結している、またはセンダイウイルスＦタンパク質のＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＣＴと連結している、Ｉ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子を含むセンダイウイルスＮ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする組換えウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスであり得る。センダイウイルスＦタンパク質ＴＭおよびＣＴ配列は公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＮ８４６７０を参照のこと）。例示的センダイウイルスＦタンパク質ＴＭおよびＣＴ配列は：
センダイＦ ＴＭドメイン：ＶＩＴＩＩＶＶＭＶＶＩＬＶＶＩＩＶＩＩＩＶ（配列番号１０３の残基１～２１）
センダイＦ ＣＴ：ＬＹＲＬＲＲＳＭＬＭＧＮＰＤＤＲＩＰＲＤＴＹＴＬＥＰＫＩＲＨＭＹＴＮＧＧＦＤＡＭＡＥＫＲ（配列番号１０３の残基２２～６５）
センダイＦ ＴＭ＋ＣＴ：ＶＩＴＩＩＶＶＭＶＶＩＬＶＶＩＩＶＩＩＩＶＬＹＲＬＲＲＳＭＬＭＧＮＰＤＤＲＩＰＲＤＴＹＴＬＥＰＫＩＲＨＭＹＴＮＧＧＦＤＡＭＡＥＫＲ、配列番号１０３
として示される。
Ｆ．ＮＤＶ
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなＮＤＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している、または以下に示されるようなＮＤＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＴＭおよびＣＴと連結している、Ｉ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子を含むＮＤＶ Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする組換えウイルスゲノムを含む組換えＮＤＶウイルスであり得る。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなＮＤＶ Ｆタンパク質のＣＴと連結している、または以下に示されるようなＮＤＶ Ｆタンパク質のＣＴに対して少なくとも９０％（少なくとも９５％など）の配列同一性を有するＣＴと連結している、Ｉ型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）をコードする異種遺伝子を含むＮＤＶ Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードする組換えウイルスゲノムを含む組換えＮＤＶウイルスであり得る。ＮＤＶウイルスＦタンパク質ＴＭおよびＣＴ配列は公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ２８３７４を参照のこと）。例示的ＮＤＶウイルスＦタンパク質ＴＭおよびＣＴ配列は、
ＮＤＶ Ｆ ＴＭドメイン：ＩＶＬＴＩＩＳＬＶＦＧＩＬＳＬＩＬＡＣＹＬ（配列番号１０４の残基１～２１）
ＮＤＶ Ｆ ＣＴ：ＭＹＫＱＫＡＱＱＫＴＬＬＷＬＧＮＮＴＬＤＱＭＲＡＴＴＫＭ（配列番号１０４の残基２２～４９）
ＮＤＶ Ｆ ＴＭ＋ＣＴ：ＩＶＬＴＩＩＳＬＶＦＧＩＬＳＬＩＬＡＣＹＬＭＹＫＱＫＡＱＱＫＴＬＬＷＬＧＮＮＴＬＤＱＭＲＡＴＴＫＭ、配列番号１０４
として示される。
Ｇ．異種遺伝子
組換えパラミクソウイルスベクターは、異種ウイルス病原体の１種またはそれ以上の異種エンベロープタンパク質（またはその抗原性断片）のエクトドメインをコードする１種またはそれ以上の異種遺伝子を含む組換えゲノムを含み、これでは、エクトドメインは、組換えパラミクソウイルス由来のエンベロープタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。例えば、麻疹ウイルス、サブグループＡもしくはサブグループＢ呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス、１型もしくは２型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス（ザイールエボラウイルスなど）、インフルエンザウイルスまたは高度病原性コロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ）由来の１種またはそれ以上の異種エンベロープタンパク質（またはその抗原性断片）を、開示された組換えパラミクソウイルスによって発現させることができる。有用なエンベロープタンパク質の例として、それだけには限らないが、麻疹ウイルスＨＡおよびＦタンパク質、サブグループＡまたはサブグループＢ呼吸器合胞体ウイルスＦ、ＧおよびＳＨタンパク質、ムンプスウイルスＨＮおよびＦタンパク質、ヒトパピローマウイルスＬ１タンパク質、１型または２型ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０タンパク質、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬおよびｇＭタンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、エプスタイン・バーウイルスｇｐ３５０タンパク質、フィロウイルスＧタンパク質、ブニヤウイルスＧタンパク質、フラビウイルスプレＥおよびＮＳ１タンパク質、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）ＧおよびＦタンパク質、エボラウイルスＧＰタンパク質、アルファウイルスＥタンパク質ならびにＳＡＲＳおよびＭＥＲＳ Ｓタンパク質ならびにそれらの抗原性ドメイン、断片およびエピトープが挙げられる。１種またはそれ以上の異種遺伝子または転写単位を、パラミクソウイルスウイルスゲノムまたはアンチゲノム中に挿入する例示的方法は、各々、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０４／０２７０３７およびＵＳ２０１３／００５２７１８に記載されている。
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスゲノム中に含まれる異種遺伝子は、ウシＲＳＶ Ｆタンパク質またはヒトＲＳＶ Ｆタンパク質などのＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインをコードする。ヒトＲＳＶは、２グループ：ＡおよびＢに分類することができる。グループＡおよびＢは、主に、結合（Ｇ）および融合（Ｆ）タンパク質の配列変動性に基づいて、サブグループＡ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２を含む。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、任意のＲＳＶグループ（グループＡまたはグループＢなど）またはサブグループＡ１、Ａ２、Ｂ１もしくはＢ２などのＲＳＶのサブグループに由来し得る。
サブグループＡ２に由来する例示的ヒトＲＳＶ Ｆタンパク質配列および対応するＧｅｎＢａｎｋ参照（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、以下に示されている：
ＲＳＶ Ｆ Ａ２ ＨＥＫタンパク質配列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN（配列番号１）
ＲＳＶ Ｆ Ｂ１ ＨＥＫタンパク質配列、受託番号ＡＡＢ８２４３６：
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK（配列番号２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ８２４３６）
ＲＳＶ Ｆ Ｂ１ ＨＥＫ核酸配列：
auggagcugcugauccacagguuaagugcaaucuuccuaacucuugcuauuaaugcauuguaccucaccucaagucagaacauaacugaggaguuuuaccaaucgacauguagugcaguuagcagagguuauuuuagugcuuuaagaacagguugguauaccagugucauaacaauagaauuaaguaauauaaaagaaaccaaaugcaauggaacugacacuaaaguaaaacuuauaaaacaagaauuagauaaguauaagaaugcagugacagaauuacagcuacuuaugcaaaacacaccagcugccaacaaccgggccagaagagaagcaccacaguauaugaacuauacaaucaauaccacuaaaaaccuaaauguaucaauaagcaagaagaggaaacgaagauuucugggcuucuuguuagguguaggaucugcaauagcaagugguauagcuguauccaaaguucuacaccuugaaggagaagugaacaagaucaaaaaugcuuuguuaucuacaaacaaagcuguagucagucuaucaaauggggucaguguuuuaaccagcaaaguguuagaucucaagaauuacauaaauaaccaauuauuacccauaguaaaucaacagagcugucgcaucuccaacauugaaacaguuauagaauuccagcagaagaacagcagauuguuggaaaucaacagagaauucagugucaaugcagguguaacaacaccuuuaagcacuuacauguuaacaaacagugaguuacuaucauugaucaaugauaugccuauaacaaaugaucagaaaaaauuaaugucaagcaauguucagauaguaaggcaacaaaguuauucuaucaugucuauaauaaaggaagaaguccuugcauauguuguacagcuaccuaucuaugguguaauagauacaccuugcuggaaauuacacacaucaccucuaugcaccaccaacaucaaagaaggaucaaauauuuguuuaacaaggacugauagaggaugguauugugauaaugcaggaucaguauccuucuuuccacaggcugacacuuguaaaguacaguccaaucgaguauuuugugacacuaugaacaguuugacauuaccaagugaagucagccuuuguaacacugacauauucaauuccaaguaugacugcaaaauuaugacaucaaaaacagacauaagcagcucaguaauuacuucucuuggagcuauagugucaugcuaugguaaaacuaaaugcacugcauccaacaaaaaucgugggauuauaaagacauuuucuaaugguugugacuaugugucaaacaaaggaguagauacugugucagugggcaacacuuuauacuauguaaacaagcuggaaggcaagaaccuuuauguaaaaggggaaccuauaauaaauuacuaugacccucuaguguuuccuucugaugaguuugaugcaucaauaucucaagucaaugaaaaaaucaaucaaaguuuagcuuuuauucguagaucugaugaauuacuacauaauguaaauacuggcaaaucuacuacaaauauuaugauaacuacaauuauuauaguaaucauuguaguauuguuaucauuaauagcuauugguuugcuguuguauugcaaagccaaaaacacaccaguuacacuaagcaaagaccaacuaaguggaaucaauaauauugcauucagcaaauag（配列番号３、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ０１３２５４．１、ヌクレオチド５６６６～７３９０）
上記の配列によって例示されるように、ｈＲＳＶ Ｆタンパク質は、顕著な配列保存を示し、ｈＲＳＶサブグループにわたって８５％を超える配列同一性を有する。ＲＳＶ Ｆ配列の保存および知識の幅を考慮して、当業者は、種々のＲＳＶ Ｆ鎖とサブグループの間の対応するＲＳＶ Ｆアミノ酸位置を容易に同定できる。本明細書において開示されるアミノ酸置換の番号付けは、特に断りのない限り、配列番号１として示されるＡ２株由来の例示的ｈＲＳＶ Ｆタンパク質配列を参照して行われる。
例示目的で、Ａ２株由来のＲＳＶ Ｆタンパク質（配列番号１）のシグナルペプチド、Ｆ２ポリペプチド、ｐｅｐ２７、Ｆ１、Ｆ１エクトドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、以下として示される：
シグナルペプチド（配列番号１、残基１～２２）：ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦ
Ｆ２ポリペプチド（配列番号１、残基２３～１０９）：ＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＡＴＮＮＲＡＲＲ
Ｐｅｐ２７（配列番号１、残基１１０～１３６）：ＥＬＰＲＦＭＮＹＴＬＮＮＡＫＫＴＮＶＴＬＳＫＫＲＫＲＲ
Ｆ１（配列番号１、残基１３７～５７４）：
FLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
成熟タンパク質のＦ１エクトドメイン（配列番号１、残基１３７～５２９）：
FLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITT
Ｆ１膜貫通ドメイン（配列番号１、残基５３０～５５０）：ＩＩＩＶＩＩＶＩＬＬＳＬＩＡＶＧＬＬＬＹＣ
Ｆ１ ＣＴ（配列番号１、残基５５１～５７４）：ＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスゲノム中に含まれる異種遺伝子は、ヒトＲＳＦ Ｆタンパク質のエクトドメインをコードし、ここで、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、配列番号１（ＷＴ ＲＳＶ Ｆ Ａ）、２（ＷＴ ＲＳＶ Ｆ Ｂ）、１２（Ａ２ ＨＥＫ）、１４（Ａ２ ＨＥＫ＋ＤＳ）もしくは１９（Ａ２ ＨＥＫ＋ＤＳ－Ｃａｖ１）のうち１種のＲＳＶエクトドメインに対して少なくとも８５％（少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％など）同一のアミノ酸配列を含む、または配列番号１２、１４もしくは１９のＲＳＶエクトドメインのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている組換えｈＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする異種遺伝子を含むゲノムを含み得る。例えば、組換えｈＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする遺伝子を、ＧＡ、ＤＮＡ２．０（Ｄ２）またはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＧＳ）最適化アルゴリズムを使用してヒト発現のためにコドン最適化することができる（実施例１を参照のこと）。ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されているＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸配列の限定されない例は、以下のとおりに提供される：
ＧｅｎｅＡｒｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ Ａ２ ＨＥＫ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcacaacaatcctgaccgccgtgaccttctgcttcgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgccgtgaccgagctgcagctgctgatgcagtccacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgccccggttcatgaactacaccctcaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggcttcctgctgggcgtgggcagcgccattgcctctggcgtggccgtgtctaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccacaaacaaggccgtggtgtccctgagcaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgccggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaatgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgagcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcccctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccccctgtgcaccaccaacacaaaagagggcagcaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgataatgccggcagcgtgtcattctttccacaggccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaacctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtccgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgacgccagcatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagagcgacgagctgctgcacaatgtgaatgccggcaagagcaccacaaacatcatgatcaccactatcatcatcgtgatcatcgtcatcctgctgagtctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgcaaggccagatccacccctgtgaccctgtccaaggatcagctgtccggcatcaacaatatcgccttctccaactga（配列番号４）
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ Ａ２ ＨＥＫ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctctaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgacctctaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcgtcaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtctatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtaaggcaagaagcaccccagtcactctgtcaaaagaccagctgtcagggattaacaacattgccttcagtaactga（配列番号５）
コドン最適化された（ヒト発現のために）配列のさらなる例は、以下に提供される。
異種遺伝子によってコードされるＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現、ビリオンエンベロープ上でのＲＳＶ Ｆタンパク質の利用可能性または例えば、融合前コンホメーションにおいてＲＳＶ Ｆタンパク質の安定性を改善する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、位置６６のグルタミン酸置換、位置１０１のプロリン置換または両方を含み得る。例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、Ｋ６６Ｅ置換およびＱ１０１Ｐ置換の「ＨＥＫ」置換を含み得る。ＨＥＫアミノ酸置換を含むＡ２サブグループ由来のＲＳＶ Ｆタンパク質の例示的ＤＮＡおよびタンパク質配列は、以下に示されている。
ＨＥＫ置換を有するＲＳＶ Ｆ Ａ２タンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ）：配列番号１
ＧｅｎｅＡｒｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcacaacaatcctgaccgccgtgaccttctgcttcgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgccgtgaccgagctgcagctgctgatgcagtccacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgccccggttcatgaactacaccctcaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggcttcctgctgggcgtgggcagcgccattgcctctggcgtggccgtgtctaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccacaaacaaggccgtggtgtccctgagcaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgccggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaatgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgagcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcccctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccccctgtgcaccaccaacacaaaagagggcagcaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgataatgccggcagcgtgtcattctttccacaggccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaacctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtccgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgacgccagcatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagagcgacgagctgctgcacaatgtgaatgccggcaagagcaccacaaacatcatgatcaccactatcatcatcgtgatcatcgtcatcctgctgagtctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgcaaggccagatccacccctgtgaccctgtccaaggatcagctgtccggcatcaacaatatcgccttctccaactga（配列番号６）
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctctaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgacctctaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcgtcaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtctatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtaaggcaagaagcaccccagtcactctgtcaaaagaccagctgtcagggattaacaacattgccttcagtaactga（配列番号７）
さらなる実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前コンホメーションにおいてＲＳＶ Ｆタンパク質のエクトドメインを安定化する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、非天然ジスルフィド結合を形成し、その融合前コンホメーションにおいてＲＳＶ Ｆタンパク質を安定化する、位置１５５および２９０のシステイン置換の対の「ＤＳ」置換を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、位置１９０および／または２０７で１つまたはそれ以上の空洞を埋めて、融合前コンホメーションにおいてタンパク質を安定化するアミノ酸置換を含み得る。例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、１９０Ｆ置換および／または２０７Ｌ置換を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、Ｓ１９０ＦおよびＦ２０７Ｌの「Ｃａｖ１」置換を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前コンホメーションにおいてタンパク質を安定化するための、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０ＦおよびＶ２０７ＬのＤＳ－Ｃａｖ１置換を含み得る。ＤＳ－Ｃａｖ１アミノ酸置換を含む、Ａ２サブグループ由来のＲＳＶ Ｆタンパク質（キメラＴＭおよび／またはＣＴドメインを有する）の例示的ＤＮＡおよびタンパク質配列は、配列番号１０～１１および２１～２３として示される。
融合前コンホメーションにおいてＲＳＶ Ｆエクトドメインを安定化するために使用できるさらなるアミノ酸置換およびタンパク質修飾は、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４１６０４６３に開示されている。ＨＥＫ置換を、融合前コンホメーションにおいてＲＳＶ Ｆタンパク質を安定化するためのアミノ酸置換のいずれかと組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスゲノム中に含まれる異種遺伝子は、組換えパラミクソウイルスのＦタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする。
一実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、組換えｈＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含む組換えＨＰＩＶ１ゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１である。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、例えば、配列番号３１の残基１～２３（ＴＭ）、配列番号３１の残基２４～５９（ＣＴ）または配列番号３１（ＴＭ＋ＣＴ）として示されるような、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質由来のＴＭおよびＣＴと連結することができる。例示的配列は、以下に提供される：
ＨＥＫおよびＤＳ－Ｃａｖ１置換およびＨＰＩＶ１ Ｆ ＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ ＦＡ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｈ１ＣＴ）：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCRVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN（配列番号１３３）
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｈ１ＣＴ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtcgagtgcggagactgctggtcatgattaacagcacccacaattcccccgtcaacgcctacacactggagtctaggatgcgcaatccttatatggggaacaatagcaactgatag（配列番号１３４）
ＨＥＫおよびＤＳ－Ｃａｖ１置換ならびにＨＰＩＶ１ Ｆ ＴＭおよびＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｈ１ＴＭＣＴ）：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTQIIMIIIVCILIIIICGILYYLYRVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN（配列番号１３５）
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｈ１ＴＭＣＴ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacacagatcattatgatcattatcgtgtgcattctgattatcattatctgtggcatcctgtactatctgtaccgagtgcggagactgctggtcatgattaacagcacccacaattcccccgtcaacgcctacacactggagtctaggatgcgcaatccttatatggggaacaatagcaactgatag（配列番号１３６）
一実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、組換えｈＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含む組換えＨＰＩＶ２ゲノムを含む組換えＨＰＩＶ２である。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、例えば、配列番号３９の残基１～２８（ＴＭ）、配列番号３９の残基２９～６６（ＣＴ）または配列番号３９（ＴＭ＋ＣＴ）として示されるような、ＨＰＩＶ２ Ｆタンパク質由来のＴＭおよびＣＴと連結することができる。
一実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、組換えｈＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３であり得る。組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインは、例えば、配列番号４６の残基１～２３（ＴＭ）、配列番号４６の残基２４～４６（ＣＴ）または配列番号４６（ＴＭ＋ＣＴ）として示されるような、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質由来のＴＭおよびＣＴと連結することができる。例示的配列は以下に提供される：
ＨＥＫおよびＤＳ－Ｃａｖ１置換ならびにＨＰＩＶ３ Ｆ ＣＴドメイン（ＲＳＶ Ｆ＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｈ３ＣＴ）タンパク質配列を含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK（配列番号８）
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｈ３ＣＴ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtaagtactaccgtatccagaagaggaacagagttgaccagaacgataagccatacgtgctcactaacaagtga（配列番号９）
ＨＥＫおよびＤＳ－Ｃａｖ１置換ならびにＨＰＩＶ３ Ｆ ＴＭおよびＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｈ３ＴＭＣＴ）タンパク質配列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIILIMIIILFIINITIITIAIKYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK（配列番号１０）
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｈ３ＴＭＣＴ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcatcttgatcatgatcatcatcctgttcatcatcaacatcacaatcatcaccatcgctatcaagtactaccgtatccagaagaggaacagagttgaccagaacgataagccatacgtgctcactaacaagtga（配列番号１１）
一実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮタンパク質ならびにＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、ＭおよびＬタンパク質をコードする組換えウイルスゲノムを含むキメラＰＩＶであり、ここで、ウイルスゲノムは、例えば、配列番号５３の残基１～２１（ＴＭ）、配列番号５３の残基２２～５７（ＣＴ）または配列番号５３（ＴＭ＋ＣＴ）として示されるような、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質由来のＴＭおよび／またはＣＴと連結している組換えｈＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子をさらに含む。ＨＥＫ、ＤＳおよび／またはＣａｖ１置換ならびに開示された組換えパラミクソウイルスにおいて使用できるＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質由来の異種ＴＭおよび／またはＣＴドメインを含むＡ２サブグループの組換えＲＳＶ Ｆタンパク質の例示的ＤＮＡおよびタンパク質配列が、以下に示される。
ＨＥＫ置換ならびにＢＰＩＶ３ Ｆ ＴＭおよびＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿Ｂ３ＴＭＣＴ）タンパク質配列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ（配列番号１２）
ＧｅｎｅＡｒｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿Ｂ３ＴＭＣＴ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtctaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccagcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgagcattatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcaccatcatcattgtgatgattatcatcctcgtgatcatcaacatcacaatcatcgtcgtgattattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga（配列番号１３）
ＨＥＫおよびＤＳ置換、ｈＲＳＶ Ｆ ＴＭ ドメインおよびＢＰＩＶ３ Ｆ ＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ＿Ｂ３ＣＴ）タンパク質配列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ（配列番号１４）
ＧｅｎｅＡｒｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ＿Ｂ３ＣＴ ＤＮＡ配列：atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccagcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtgatcctgctgagcctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgtatcatcaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga（配列番号１５）
ＨＥＫおよびＤＳ－Ｃａｖ１置換、ｈＲＳＶ ＦＴＭドメインおよびＢＰＩＶ３ Ｆ ＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｂ３ＣＴ）タンパク質配列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ（配列番号１６）
ＧｅｎｅＡｒｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｂ３ＣＴ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccttcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcttgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtgatcctgctgagcctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgtatcatcaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga（配列番号１７）
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｂ３ＣＴ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtatcattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacattctgaccaacagacag（配列番号１８）
ＨＥＫおよびＤＳ置換ならびにＢＰＩＶ３ Ｆ ＴＭおよびＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ＿Ｂ３ＴＭＣＴ）タンパク質配列：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ（配列番号１９）
ＧｅｎｅＡｒｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ＿Ｂ３ＴＭＣＴ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccagcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcaccatcatcattgtgatgattatcatcctcgtgatcatcaacatcacaatcatcgtcgtgattattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga（配列番号２０）
Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ＿Ｂ３ＴＭＣＴ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgacctccaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcgtcaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcaccatcattatcgtgatgattatcattctggtcatcattaacatcacaatcattgtggtcatcattaagttccaccggattcagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacatcctgaccaatagacagtga（配列番号１３７）
ＨＥＫおよびＤＳ－Ｃａｖ１置換ならびにＢＰＩＶ３ Ｆ ＴＭおよびＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｂ３ＴＭＣＴ）タンパク質配列:
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ（配列番号２１）
ＧｅｎｅＡｒｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｂ３ＴＭＣＴ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccttcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcttgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcaccatcatcattgtgatgattatcatcctcgtgatcatcaacatcacaatcatcgtcgtgattattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga（配列番号２２）
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｂ３ＴＭＣＴ ＤＮＡ配列：
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcaccatcattatcgtgatgattatcattctggtcatcattaacatcacaatcattgtggtcatcattaagttccaccggattcagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacatcctgaccaatagacagtga（配列番号２３）
一実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、組換えｈＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含む組換えセンダイウイルスゲノムを含む。このような実施形態では、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＴＭおよびＣＴは、例えば、配列番号１０３の残基１～２１（ＴＭ）、配列番号１０３の残基２２～６５（ＣＴ）または配列番号１０３（ＴＭ＋ＣＴ）として示されるような、センダイウイルスＦタンパク質由来であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、センダイウイルスＴＭおよび／またはＣＴと連結している組換えｈＲＳＶ Ｆエクトドメインは、配列番号１０５～１０８のうち１種として示されるアミノ酸配列を含み得る。
ＨＥＫ置換およびセンダイウイルス Ｆ ＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＳｅＶＣＴ）タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR（配列番号１０５）
ＨＥＫ置換ならびにセンダイウイルス Ｆ ＴＭおよびＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＳｅＶＴＭＣＴ）タンパク質配列MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR（配列番号１０６）
ＨＥＫおよびＤＳ－Ｃａｖ１置換ならびにセンダイウイルス Ｆ ＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＳｅＶＣＴ）タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR（配列番号１０７）
ＨＥＫおよびＤＳ－Ｃａｖ１置換ならびにセンダイウイルス Ｆ ＴＭおよびＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＳｅＶＴＭＣＴ）タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR（配列番号１０８）
一実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、組換えｈＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含む組換えＮＤＶゲノムを含む。このような実施形態では、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＴＭおよびＣＴは、例えば、配列番号１０４の残基１～２１（ＴＭ）、配列番号１０４の残基２２～４９（ＣＴ）または配列番号１０４（ＴＭ＋ＣＴ）として示されるような、ＮＤＶウイルスＦタンパク質、細胞質尾部由来であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＤＶ ＴＭおよび／またはＣＴと連結している組換えｈＲＳＶ Ｆエクトドメインは、配列番号１０９～１１３のうち１種として示されるアミノ酸配列を含み得る。
ＨＥＫ置換およびＮＤＶ Ｆ ＣＴドメインを含むＡ２株由来の ｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＮＤＶＣＴ）タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM（配列番号１０９）
ＨＥＫ置換ならびにＮＤＶ Ｆ ＴＭおよびＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＮＤＶＴＭＣＴ）タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIVLTIISLVFGILSLILACYLMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM（配列番号１１０）
ＨＥＫおよびＤＳ－Ｃａｖ１置換ならびにＮＤＶ Ｆ ＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＮＤＶＣＴ）タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM（配列番号１１２）
ＨＥＫおよびＤＳ－Ｃａｖ１置換ならびにＮＤＶ Ｆ ＴＭおよびＣＴドメインを含むＡ２株由来のｈＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＮＤＶＴＭＣＴ）タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR（配列番号１１３）
Ｈ．組換えパラミクソウイルスのさらなる説明
特定の実施形態
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＰＩＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ１ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ１ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ１Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、センダイウイルスゲノムプロモーターと、それに続く、センダイウイルスＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、センダイウイルスＦタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、センダイウイルスゲノムプロモーターと、それに続く、センダイウイルスＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、センダイウイルスＦタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＮＤＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＮＤＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＮＤＶを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＮＤＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＮＤＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＮＤＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＮＤＶを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＮＤＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶ５ゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ５ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＰＩＶ５を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＰＩＶ５ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶ５ゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ５ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＰＩＶ５を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＰＩＶ５ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＰＩＶ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ１ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ１ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ１Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、センダイウイルスゲノムプロモーターと、それに続く、センダイウイルスＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、センダイウイルスＦタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、センダイウイルスゲノムプロモーターと、それに続く、センダイウイルスＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、センダイウイルスＦタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＮＤＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＮＤＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＮＤＶを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＮＤＶ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＮＤＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＮＤＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＮＤＶを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＮＤＶ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶ５ゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ５ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＰＩＶ５を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＰＩＶ５ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶ５ゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ５ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＰＩＶ５を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ置換を含み、ＰＩＶ５ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＰＩＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ１ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ１ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、センダイウイルスゲノムプロモーターと、それに続く、センダイウイルスＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、センダイウイルスＦタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、センダイウイルスゲノムプロモーターと、それに続く、センダイウイルスＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、センダイウイルスＦタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＮＤＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＮＤＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＮＤＶを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＮＤＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＮＤＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＮＤＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＮＤＶを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＮＤＶ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶ５ゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ５ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＰＩＶ５を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＰＩＶ５ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶ５ゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ５ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＰＩＶ５を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＰＩＶ５ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＰＩＶ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ１ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ１ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ１を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＨＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＢＰＩＶ３ゲノムプロモーターと、それに続く、ＢＰＩＶ３ Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｌ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＢ／ＨＰＩＶ３を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、センダイウイルスゲノムプロモーターと、それに続く、センダイウイルスＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、センダイウイルスＦタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、センダイウイルスゲノムプロモーターと、それに続く、センダイウイルスＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、センダイウイルスＦタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＮＤＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＮＤＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＮＤＶを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＮＤＶ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＮＤＶゲノムプロモーターと、それに続く、ＮＤＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＮＤＶを含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＮＤＶ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶ５ゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ５ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＰＩＶ５を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Ｎタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＰＩＶ５ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
いくつかの実施形態では、上流から下流に、ＰＩＶ５ゲノムプロモーターと、それに続く、ＰＩＶ５ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えＰＩＶ５を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ置換を含み、ＰＩＶ５ Ｆタンパク質のＣＴと連結している。
ＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムを含む本明細書において開示される組換えパラミクソウイルスの実施形態のいずれか（上記で論じられる組換えパラミクソウイルスのいずれかなど）では、組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子は、ＲＳＶ Ｆ位置１～５２９を含むポリペプチド配列をコードし得る。
さらなる説明
開示される組換えパラミクソウイルスは、自己複製性である、すなわち、適当な宿主細胞の感染後に複製可能である。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、例えば、ヒト対象に投与された場合に減弱された表現型を有する。
組換えパラミクソウイルスの減弱は、当技術分野で公知の種々の方法を使用して、例えば、組換えパラミクソウイルスの生物学的機能の変化を引き起こし、減弱された表現型をもたらす、１つまたはそれ以上の突然変異を導入することによって達成できる。異種遺伝子の挿入はまた、減弱された表現型をもたらし得る。好ましくは、異種遺伝子をコードするゲノムを含むパラミクソウイルスは、野生型パラミクソウイルスと比較して、細胞または哺乳類において約１００～５０００倍またはそれ以上減弱される。
開示された組換えパラミクソウイルスは、適切な減弱、表現型復帰への抵抗性および免疫原性を確認するために、周知のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルで試験できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは、修飾されたパラミクソウイルスは、例えば、温度感受性複製などの１つまたはそれ以上の所望の表現型について試験できる。開示された組換えパラミクソウイルスはまた、ＰＩＶおよび／または組換えウイルス（例えば、ＲＳＶ）中に含まれる異種遺伝子のウイルス病原体を用いる感染の動物モデルにおいて試験できる。さまざまな動物モデルが知られている。
組換え減弱パラミクソウイルスは、好ましくは、野生型パラミクソウイルスと比較して、細胞または哺乳類において約１００～５０００倍減弱される。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルスの複製のレベルが、広範な使用のためにウイルスワクチンの製造を提供するのに十分であることが好ましい。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで減弱されたパラミクソウイルスのウイルスの複製のレベルが、ｍｌあたり、少なくとも１０６、より好ましくは、少なくとも１０７、最も好ましくは、少なくとも１０８であることが好ましい。減弱性突然変異は、好ましくは、安定であるものである。少なくとも２、３、４またはさらに多くの減弱性突然変異を有する組換えパラミクソウイルスがより安定である可能性が高い。
進行中の前臨床研究によって、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２およびＨＰＩＶ３を減弱するいくつかの突然変異または修飾が同定され、これは、可能性あるワクチンおよびベクター骨格として減弱された株を製造するように逆遺伝学によって導入される。ＨＰＩＶ骨格中に外来遺伝子を含めることもまた、それ自体減弱である。これは、ゲノム長および遺伝子数ならびに外来タンパク質の効果の増大を含むさまざまな効果により得る。適当なレベルの減弱を達成しようとする場合には、原因が何であれ、インサートの減弱効果も考慮されなければならない。
ＨＰＩＶ１、２および３の減弱株は、血清陰性乳幼児における臨床研究にあったか、または現在臨床研究にある（Ｋａｒｒｏｎら２０１２ Ｖａｃｃｉｎｅ ３０：３９７５～３９８１；Ｓｃｈｍｉｄｔら ２０１１ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｍｅｄ．５：５１５～５２６）。これらの減弱ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２およびＨＰＩＶ３株またはそのバージョンは、異種ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するための可能性あるベクターである。
減弱された表現型を提供するパラミクソウイルスのゲノムへの修飾の例は、当技術分野で公知であり、例えば、各々、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１２／００４５４７１号；同２０１０／０１１９５４７号；同２００９／０２６３８８３号；同２００９／００１７５１７号；同８０８４０３７号；同６，４１０，０２３号；同８，３６７，０７４号；同７，９５１，３８３号；同７，８２０，１８２号；同７７０４５０９号；同７６３２５０８号；同７６２２１２３号；同７２５０１７１号；同７２０８１６１号；同７２０１９０７号；同７１９２５９３号；同２０１２／００６４１１２号；同２０１４０１８６３９７号；ならびにＮｅｗｍａｎら ２００２ Ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｓ ２４：７７～９２、Ｔａｎｇら、２００３ Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７７（２０）：１０８１９～１０８２８；Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａら ２０１４ Ｖａｃｃｉｎｅ、３２：３５５５～３５６３；ＭｃＧｉｎｎｅｓら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、８５： ３６６～３７７、２０１１；およびＪｏｎｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、３０：９５９～９６８、２０１２に記載されている。例えば、ＰＩＶ３の減弱は、ＨＰＩＶ３由来のＦおよびＨＮを除いてＢＰＩＶ３遺伝子を含有するＢ／ＨＰＩＶ３ ウイルスなどの、ヒトを含む霊長類における宿主域制限を付与するＢＰＩＶ３由来遺伝子の存在によって達成できる（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓ ＭＨら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：１１４１～８、２００３）。センダイウイルスはまた、宿主域制限のために霊長類において制限される（Ｊｏｎｅｓ ＢＧら Ｖａｃｃｉｎｅ ３０：９５９～９６８ ２０１２）。減弱の別の手段は、ｃｐ４５ ＨＰＩＶ３ウイルスにおいてなど、複数の遺伝子において起こり得るミスセンス突然変異によって例示される（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓ ＭＨら Ｊ Ｖｉｒｏｌ第７３：１３７４～８１ １９９９）。減弱性点突然変異のその他の例は、以下の実施例２においてＨＰＩＶ１について提供される。実施例２においてＨＰＩＶ１によって例示されるような、１つまたはいくつかのコドンの欠失も、減弱表現型を付与し得る。また、実施例１において例示されるように、異種エクトドメインと連結しているベクターＴＭおよびＣＴまたはＣＴドメインの存在は、ベクターを強力に減弱し得る。ＨＰＩＶ１における減弱性突然変異のその他の例は、Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＥＪらＶｉｒｏｌ Ｊ ４：６７ ２００７）によって記載されており、ＨＰＩＶ２については、Ｎｏｌａｎ ＳＭら、Ｖａｃｃｉｎｅ第２３：４７６５～４７７４ ２００５）によって記載されている。１つまたはそれ以上のアクセサリー遺伝子のすべてまたは一部の欠失も、減弱の手段である（Ｄｕｒｂｉｎ Ａ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６１：３１９～３３０ １９９９）。
組換え減弱パラミクソウイルスの免疫原性は、動物モデル（非ヒト霊長類、例えば、アフリカミドリザルなど）において、１回の免疫処置後におよび２回目の免疫処置後にパラミクソウイルスに対する抗体を形成する動物の数を調べることによって、ならびにその応答の規模を測定することによって評価できる。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、第１の免疫処置後に動物の約６０～８０％が抗体を発生するおよび第２の免疫処置後に動物の約８０～１００％が応対を発生する場合に十分な免疫原性を有する。好ましくは、免疫応答は、発生元パラミクソウイルスおよび組換えパラミクソウイルス中に含まれる異種遺伝子が由来するウイルス病原体の両方による感染から保護する。
Ｉ．さらなるベクター
組換えＲＳＶ Ｆタンパク質およびそれをコードする核酸分子は、ＰＩＶベクター以外のベクターに含まれる（または発現される）ということが認められよう。例えば、プラスミドベクターおよびその他のウイルスベクターを、例えば、宿主細胞における組換えＲＳＶ Ｆタンパク質もしくはその断片の発現のために、または本明細書に開示されるような対象の免疫処置のために使用できる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プライム－ブーストワクチン接種の一部として対象に投与できる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プライム－ブーストワクチン接種において使用するためのプライマーワクチンまたはブースターワクチンなどのワクチン中に含まれる。
いくつかの例では、ベクターは、複製能力のあるおよび／または減弱されるウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターはまた、条件的に複製能力がある場合もある。その他の例では、ウイルスベクターは、宿主細胞では複製に欠損がある。
ポリオーマ、すなわち、ＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋら、１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．、７３：１５３３１５３６）、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ、１９９２、Ｃｕｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：３９～６；Ｂｅｒｌｉｎｅｒら、１９８８、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１６～６２９；Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、１９９２、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６６：４４０７～４４１２；Ｑｕａｎｔｉｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２５８１～２５８４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、Ｃｅｌｌ、６８：１４３～１５５；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：２２３３～２２３９；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ－Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１：２４１～２５６）、ワクシニアウイルス（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４：４９５～４９９）、アデノ随伴ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９１～１２３；Ｏｎら、１９９０、Ｇｅｎｅ、８９：２７９～２８２）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：６７～９０；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２９５２２９６５；Ｆｉｎｋら、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．第３：１１～１９；Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１：３３７～３７１；Ｆｒｅｓｓｅら、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４０：２１８９～２１９９）、シンドビスウイルス（Ｈ．Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒら、１９９５、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ第６：１１６１～１１６７；米国特許第５，０９１，３０９号および同５，２２１７，８７９号）、アルファウイルス（Ｓ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１１：１８～２２；Ｉ．Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第９３：１１３７１～１１３７７）ならびに鳥類起源のレトロウイルス（Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、１９８４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４：７４９～７５４；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｐｌｏｓら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：３３９１～３３９７）、マウス起源のレトロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：１～２４；Ｍｉｌｌｅｒら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５：４３１～４３７；Ｓｏｒｇｅら、１９８４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４：１７３０～１７３７；Ｍａｎｎら、１９８５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５４：４０１～４０７）およびヒト起源のレトロウイルス（Ｐａｇｅら、１９９０、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４：５３７０～５２７６；Ｂｕｃｈｓｃｈａｌｃｈｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２７３１～２７３９）を含む、組換えＲＳＶ Ｆタンパク質またはその免疫原性断片を発現するために使用できるいくつかのウイルスベクターが構築されている。バキュロウイルス（オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス；ＡｃＭＮＰＶ）ベクターも当技術分野で公知であり、商業的供給源（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．など）から得ることができる。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、開示された組換えＲＳＶ Ｆタンパク質またはその免疫原性断片（ＲＳＶ Ｆエクトドメインなど）を発現するアデノウイルスベクターを含み得る。種々の起源、サブタイプまたはサブタイプの混合物由来のアデノウイルスを、アデノウイルスベクターのウイルスゲノムの供給源として使用できる。非ヒトアデノウイルス（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ、鳥類、イヌ、ヒツジまたはウシアデノウイルス）を使用して、アデノウイルスベクターを作製できる。例えば、サルアデノウイルスを、アデノウイルスベクターのウイルスゲノムの供給源として使用できる。サルアデノウイルスは、血清型１、３、７、１１、１６、１８、１９、２０、２７、３３、３８、３９、４８、４９、５０または任意のその他のサルアデノウイルス血清型のものであり得る。サルアデノウイルスは、例えば、ＳＶ、ＳＡｄＶ、ＳＡＶまたはｓＡＶなどの当技術分野で公知の任意の適した略語を使用することによって呼ぶことができる。いくつかの例では、サルアデノウイルスベクターは、血清型３、７、１１、１６、１８、１９、２０、２７、３３、３８または３９のサルアデノウイルスベクターである。一例では、チンパンジー血清型Ｃ Ａｄ３ベクターが使用される（例えば、Ｐｅｒｕｚｚｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２７：１２９３～１３００、２００９を参照のこと）。ヒトアデノウイルスを、アデノウイルスベクターのウイルスゲノムの供給源として使用できる。ヒトアデノウイルスは、種々のサブグループまたは血清型のものであり得る。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８および３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５および５０）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５および６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３６～３９および４２～４８）、サブグループＥ（例えば、血清型４）、サブグループＦ（例えば、血清型４０および４１）、未分類血清グループ（例えば、血清型４９および５１）または任意のその他のアデノウイルス血清型のものであり得る。当業者は、複製能力のあるおよび複製に欠損のあるアデノウイルスベクター（単独におよび多重に複製に欠損のあるアデノウイルスベクターを含む）に精通している。多重に複製に欠損のあるアデノウイルスベクターを含む複製に欠損のあるアデノウイルスベクターの例は、米国特許第５，８３７，５１１号；同５，８５１，８０６号；同５，９９４，１０６号；同６，１２７，１７５号；同６，４８２，６１６号；および同７，１９５，８９６号ならびに国際特許出願番号ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９５／１６７７２、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／２２３７８、ＷＯ９７／１２９８６、ＷＯ９７／２１８２６およびＷＯ０３／０２２３１１に開示されている。
ＩＩＩ．組換え法、ベクターおよび宿主細胞
本明細書において開示される組換えパラミクソウイルスおよびポリヌクレオチドは、合成および組換え法によって製造できる。従って、感染性パラミクソウイルスクローンをコードするポリヌクレオチドおよび感染性クローンを含む宿主細胞ならびに組換え法によってこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法も提供される。
本明細書において開示される組換えＲＳＶ Ｆタンパク質のいずれかをコードする単離された核酸分子も提供される。
上記で論じたように、開示されたパラミクソウイルスまたはポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の技術によって合成または調製される。例えば、ＷＯ９４／０２７０３７およびＵＳ２０１３００５２７１８を参照のこと。野生型パラミクソウイルスゲノムのヌクレオチド配列は、公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋでインターネットで（ｗｗｗ－ｎｃｂｉ－ｎｌｍ－ｎｉｈｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚでアクセス可能）容易に入手可能である。開示された組換えパラミクソウイルスをコードするヌクレオチド配列は、無細胞環境においてＤＮＡポリメラーゼを使用することを含む当業者に公知の方法を使用して合成または増幅できる。さらに、当業者ならば、さまざまな機能的に同等な核酸を構築するために、配列が異なるが同一タンパク質成分をコードする核酸などの遺伝暗号を容易に使用できる。
例示的核酸は、クローニング技術によって調製できる。適当なクローニングおよび配列決定技術の例ならびに多数のクローニング演習によって熟練者を指示するのに十分な使用説明書は公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１２およびＡｕｓｕｂｅｌら （Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、詳細な付録１０４、２０１３）。生物学的試薬および実験機器の製造業者からの製品情報もまた、有用な情報を提供する。このような製造業者として、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ－Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）ならびに当業者に公知の多数のその他の商業的供給源が挙げられる。
組換えパラミクソウイルスのゲノムは、得られた組換えパラミクソウイルスが、弱のレベルまたは免疫原性などの所望の生物学的機能を保持する限り、１つまたはそれ以上の変動（例えば、アミノ酸欠失、置換または挿入を引き起こす突然変異）を含み得る。配列におけるこれらの変動は、天然に存在する変動である場合もあり、当業者に公知の遺伝子工学技術の使用によってそれらが遺伝子操作される場合もある。このような技術の例は、例えば、両方とも参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１２）およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １０４、２０１３）に見られる。
本明細書に記載される核酸コード化に、その生物活性を減少させることなく修飾を行うことができる。オリゴヌクレオチド媒介性（部位指定）突然変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、制限選択突然変異誘発などといった既知組換え法を使用して、アミノ酸置換、挿入および欠失を行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１２）およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、詳細な付録１０４、２０１３）を参照のこと）。クローニング、発現または融合タンパク質へのターゲッティング分子の組込みを容易にするために、いくつかの修飾を行うことができる。このような修飾は、当業者に周知であり、例えば、終結コドン、開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されるメチオニン、好都合に位置づけられた制限部位を作製するためにいずれかの末端に配置されるさらなるヌクレオチドが挙げられる。
「保存的」アミノ酸置換とは、対象に投与された場合にタンパク質の免疫応答を誘導する能力などのタンパク質の機能に実質的に影響を及ぼさない、または低減しない置換である。用語保存的変動はまた、非置換親アミノ酸の代わりの置換アミノ酸の使用を含む。さらに、当業者ならば、コードされる配列中の単一のアミノ酸または小さいパーセンテージ（例えば、５％未満、いくつかの実施形態では、１％未満）のアミノ酸を変更、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加は、変化がアミノ酸の化学的に同様のアミノ酸での置換をもたらす保存的変動であるということを認識するであろう。
機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換の表は、当業者に周知である。以下の６グループは、互いの保存的置換であると考えられるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
開示される組換えパラミクソウイルスは、生物学的サンプルから単離されたウイルスから製造できる。ポリヌクレオチドおよびベクターは、ポリメラーゼ連鎖反応などの当技術分野で公知の標準組換え法によって製造できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１２）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、詳細な付録１０４、２０１３））。核酸配列を変更または修飾する方法もまた、当業者に公知である。
パラミクソウイルスゲノムは、宿主における増殖のために選択マーカーを含むベクター中に連続してクローニングされたポリメラーゼ連鎖反応カセットから組み立てることができる。このようなマーカーとして、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の細菌において培養するためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
標準組換え法を使用して、ポリヌクレオチドを、クローニングのために再現可能なベクター中に挿入することができる。種々のベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態であり得る。さまざまな手順によってベクター中に適当な核酸配列を挿入することができる。一般に、核酸は、当技術分野で公知の技術を使用して、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）中に挿入される。ベクター成分として、一般に、それだけには限らないが、１種またはそれ以上のシグナル配列、複製起点、１種またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列が挙げられる。これらの成分のうち１つまたはそれ以上を含む適したベクターの構築は、当業者に公知である標準連結技術を使用する。
適した再現可能なベクターの例として、制限するものではないが、ｐＵＣ１９またはｐＴＭ１が挙げられる。ポリヌクレオチドを、例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、細胞性ポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＳＰ１プロモーターなどの適当なプロモーターと作動可能に連結することができる。再現可能なベクターは、転写開始、転写終結のための部位および翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含み得る。
パラミクソウイルスゲノムまたはパラミクソウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドから構成される組換えベクターの、例えば、細菌細胞または真核細胞などの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、電気的核輸送、化学的形質導入、電気的形質導入、感染またはその他の方法によって影響を受ける。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１２）およびＡｕｓｕｂｅｌら （Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、詳細な付録１０４、２０１３）などの標準的な実験マニュアルに記載されている。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびＦｕＧＥＮＥ ６（商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）などの市販のトランスフェクション試薬も利用可能である。適した宿主細胞として、それだけには限らないが、ＨＥｐ－２細胞、ＦＲｈＬ－ＤＢＳ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＭＲＣ－５細胞およびＶｅｒｏ細胞が挙げられる。
ＩＶ．免疫原性組成物
本明細書に記載されるような組換えパラミクソウイルス（異種組換えＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするゲノムを含む組換えＰＩＶなど）および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物も提供される。このような組成物は、当業者に公知のさまざまな投与様式によって、例えば、鼻腔内経路によって対象に投与できる。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９９５などの刊行物に、より詳細に記載されている。
従って、許容される温度範囲内での貯蔵の際の安定性の増大を促進しながら生物活性を保持するのに役立つように、本明細書に記載される組換えパラミクソウイルスを、医薬上許容される担体とともに製剤化できる。可能性ある担体として、それだけには限らないが、生理学的に平衡化された培養培地、リン酸バッファー生理食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョン）、種々の種類の湿潤剤、タンパク質、ペプチドもしくは加水分解物（例えば、アルブミン、ゼラチン）などの凍結保護添加物もしくは安定化剤、糖（例えば、スクロース、ラクトース、ソルビトール）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸ナトリウム）またはその他の保護的薬剤が挙げられる。得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージングでき、または凍結乾燥できる。凍結乾燥した調製物は、単回または複数回投薬のいずれかのための投与に先立って滅菌溶液と組み合わせる。
製剤化された組成物、特に、液体製剤は、それだけには限らないが、有効濃度（通常、≦１％ ｗ／ｖ）のベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン、および／またはプロピルパラベンを含む、貯蔵の際の分解を防止または最小化するための静菌剤を含有し得る。静菌剤は、一部の患者にとって禁忌となり得；従って、凍結乾燥製剤は、このような成分を含有する、または含有しない溶液で再構成される。
開示の医薬組成物は、生理学的条件に近づけるために必要に応じて、医薬上許容される媒体物質として、ｐＨ調整および緩衝剤、張力調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタンおよびオレイン酸トリエタノールアミンなどを含有し得る。
医薬組成物は、場合により、宿主の免疫応答を増強するためにアジュバントを含み得る。適したアジュバントとして、例えば、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、ミョウバン、ＡｌＰＯ４、アルハイドロゲル、脂質Ａおよびその誘導体または変異体、オイルエマルジョン、サポニン、中性リポソーム、ワクチンおよびサイトカインを含有するリポソーム、非イオン性ブロックコポリマーならびにケモカインがある。当技術分野で周知の多数のその他の適したアジュバントの中で、ＰＯＥ－ＰＯＰ－ＰＯＥブロックコポリマーなどの、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）およびポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）を含有する非イオン性ブロックポリマー、ＭＰＬ（商標）（３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ；Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＩＮ）ならびにＩＬ－１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、アジュバントとして使用できる（Ｎｅｗｍａｎら、１９９８、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５：８９～１４２）。これらのアジュバントは、非特異的な方法で免疫系を刺激し、従って、医薬製剤に対する免疫応答を増強するのに役立つという点で利点を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、ある特定のＲＳＶサブグループまたは株に由来するＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする組換えパラミクソウイルスおよびまた異なるＲＳＶサブグループまたは株に由来するＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする組換えパラミクソウイルスを含み得る。例えば、組成物は、サブタイプＡおよびサブタイプＢ ＲＳＶに由来する組換えＲＳＶ Ｆタンパク質を含む組換えパラミクソウイルスを含み得る。異なるベクターが混合物中にあり、同時に投与することができる、または別個に投与することができる。ＲＳＶの特定の株の間の交差保護の現象のために、第１の株に由来するＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードするある種のパラミクソウイルスを用いる免疫処置は、同一または異なるサブグループのいくつかの異なる株に対して保護し得る。
いくつかの例では、組換えウイルスベクターまたはその組成物を、その他の病原体、特にその他の小児疾病を引き起こすものに対する保護応答を誘導するその他の医薬製剤（例えば、ワクチン）と組み合わせることが望ましいものであり得る。例えば、本明細書において記載されるような組換えパラミクソウイルスを含む組成物を、標的とされる年齢グループ（例えば、およそ１～６カ月齢の乳児）のための、予防接種諮問委員会（Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（ＡＣＩＰ；ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ａｃｉｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によって推奨されるその他のワクチンと、同時に（通常、別個に）または逐次投与できる。これらのさらなるワクチンとして、それだけには限らないが、ＩＮ投与されるワクチンが挙げられる。そのようなものとして、本明細書に記載される組換えＲＳＶ Ｆタンパク質を含む組換えパラミクソウイルスは、例えば、Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）、ジフテリア、テタヌスおよび百日咳（ＤＴａＰ）、肺炎球菌細菌（ＰＣＶ）、ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）、ポリオ、インフルエンザならびにロタウイルスに対するワクチンと同時にまたは逐次投与できる。
例えば、ワクチンなどの免疫原性組成物中で使用するための組換えパラミクソウイルスは、その減弱および免疫原性に基づいて選択される。これらのワクチン選択基準は、周知の方法に従って決定される。好ましくは、候補ウイルスは、安定な減弱表現型を有し、免疫処置された宿主において複製を示し、レシピエントにおいて免疫応答、好ましくは、保護的免疫応答の生成を効果的に誘発する。好ましくは、候補ウイルスは、免疫応答を刺激し、拡大し、例えば、異なるウイルス株またはサブグループに対する免疫応答を誘導し、および／または異なる免疫学的基礎（例えば、分泌対血清免疫グロブリン、細胞性免疫など）によって媒介される免疫応答を刺激する。
医薬組成物は、通常、有効量の開示されたパラミクソウイルスを含有し、従来技術によって調製できる。通常、免疫原性組成物の各用量中の組換えウイルスの量は、大きな有害な副作用を伴わずに免疫応答を誘導する量として選択される。いくつかの実施形態では、組成物を、対象において免疫応答を誘導するために、例えば、対象においてＰＩＶおよび／またはＲＳＶ感染を防ぐために使用するための単位投与形で提供できる。単位投与形は、対象への投与のための適した単回の予め選択された投与量または２もしくはそれ以上の予め選択された単位投与量の適した著しい、もしくは測定された倍数および／または単位用量もしくはその倍数を投与するための計量機構を含有する。その他の実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。
Ｖ．免疫応答を誘発する方法
１種またはそれ以上の開示された組換えパラミクソウイルスを対象に投与することによって、対象において免疫応答を誘発する方法が本明細書において提供される。特定の例では、対象はヒトである。免疫応答は、保護的免疫応答、例えば、パラミクソウイルスまたは組換えパラミクソウイルス中に含まれる異種遺伝子のウイルスによるその後の感染を防ぐまたは低減する応答であり得る。免疫応答の誘発を使用して、ウイルス感染およびそれと関連している疾病を治療または阻害できる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＩＶ Ｆタンパク質膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞質尾部と連結している組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムを含む減弱された組換えパラインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物の投与を含む。
例えば、ＲＳＶおよび／またはＰＩＶに対する曝露または曝露の可能性のために、ＲＳＶおよび／またはＰＩＶ感染などのパラミクソウイルス感染を有する、または発症するリスクにある対象が、治療のために選択される。開示された免疫原の投与後に、パラミクソウイルス感染もしくはそれと関連する症状または両方について対象をモニタリングできる。
対象への組換えパラミクソウイルスの鼻腔内投与の方法は、当業者に公知であり、投与のために対象を選択し、鼻腔内投与のための組換えパラミクソウイルスを含む免疫原性組成物を調製し、対象を組換えパラミクソウイルスに対する免疫応答について評価する方法も同様である。このような方法の例示的記載は、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＫａｒｒｏｎら、２０１２ Ｖａｃｃｉｎｅ、３０（２６）、３９７５～３９８１に見出すことができる。
本開示の治療薬および方法を用いる治療が意図される通常の対象は、ヒトならびに非ヒト霊長類およびその他の動物を含む。ほぼすべてのヒトが、５歳までにＲＳＶおよびＰＩＶに感染するので、全出生コホートが免疫処置の関連集団として含まれる。これは、例えば、誕生から６カ月齢の、６カ月齢から５歳のいつでも、抗体の受動伝達によってその乳児を保護するために妊娠中の女性（または妊娠可能年齢の女性）、新生児またはまだ子宮内のものの家族の一員、５０歳を超える対象において、免疫処置計画を開始することによって行うことができる。この開示の範囲は、母体免疫を含むものとする。いくつかの実施形態では、対象は、ＲＳＶまたはＰＩＶ３特異的抗体について血清陰性であるヒト対象である。さらなる実施形態では、対象は、６カ月齢未満、３カ月齢未満または１カ月齢未満などの１歳未満である。
重症な症状の（例えば、入院を必要とする）ＲＳＶおよび／またはＰＩＶ感染の最大リスクにある対象として、未熟児気管支肺異形成症を有する小児が挙げられ、先天性心疾患は、重症疾患に最もなりやすい。小児期および成人期の間に、疾患はより軽症になるが、下気道疾患を伴うことがあり、一般に、副鼻腔炎を合併する。入院している高齢者（例えば、６５歳を超えるヒト）では、疾患重症度は増大する。重症疾患はまた、重症複合型免疫不全疾患を有する、または骨髄もしくは肺移植後の人において起こる。従って、これらの対象が、開示された組換えパラミクソウイルスの投与のために選択される。
本開示の方法に従う予防または治療のための対象を同定するために、許容されたスクリーニング方法を使用して、対象の、標的とされるもしくは疑われる疾患もしくは状態と関連するリスク因子を調べる、または既存の疾患もしくは状態の状態を調べる。これらのスクリーニング法として、例えば、標的とされるまたは疑われる疾患または状態と関連する可能性がある環境的、家族的、職業的およびその他のこのような因子を決定するための従来の後処理ならびにパラミクソウイルス感染を検出および／または特性決定するために当技術分野で利用可能であり、周知である、種々のＥＬＩＳＡおよびその他のイムノアッセイ法などの診断方法が挙げられる。これらおよびその他の慣例の方法によって、臨床医が、本開示の方法および医薬組成物を使用する療法を必要とする患者を選択することが可能となる。これらの方法および原理に従って、組成物を、本明細書における教示または当業者に公知のその他の従来の方法に従って、独立予防または治療プログラムとして、またはその他の治療に対するフォローアップ、補助もしくは協調治療計画として投与できる。
開示された組換えパラミクソウイルスの投与は、予防または治療目的であり得る。予防的に提供する場合には、免疫原を、任意の症状に先立って、例えば、感染に先立って提供することができる。予防的投与は、任意のその後の感染を防ぐことまたは寛解させることができる免疫応答を誘発するように働く。いくつかの実施形態では、方法は、パラミクソウイルス感染に感染するリスクにある患者を選択することと、有効量の開示された組換えパラミクソウイルスを対象に投与することとを含み得る。組換えパラミクソウイルスを、パラミクソウイルスに対する予測される曝露の前に提供して、免疫応答を誘発して、ウイルスに対する曝露もしくは疑われる曝露後に、または感染の実際の開始後に、予測される重症度、感染および／または関連疾患症状の期間または程度を減弱することができる。いくつかの例では、本明細書に開示される方法を使用する治療は、対象の生存時間を延長する。
ＲＳＶおよびＰＩＶ抗原を含む開示される組換えパラミクソウイルスの、対象への投与は、対象が野生型ＲＳＶまたはＰＩＶにその後感染する、または再感染する場合に、肺炎および細気管支炎などの重篤下気道疾患またはクループに対して保護的である免疫応答の生成を誘発することができる。天然循環型ウイルスが依然として、特に上気道において感染を引き起こすことが可能であるが、ワクチン接種の結果としての鼻炎の可能性は低減し、野生型ウイルスによるその後の感染による抵抗性のブーストの可能性がある。ワクチン接種後、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで相同（同一サブグループの）野生型ウイルスを中和可能である、検出可能なレベルの宿主によって生み出された血清および分泌抗体がある。多数の例では、宿主抗体はまた、異なる非ワクチンサブグループの野生型ウイルスも中和する。より高いレベルの、例えば、別のサブグループの異種株に対する交差保護を達成するために、ＲＳＶサブグループＡおよびＢ両方の少なくとも１種の主たる株に由来するＲＳＶ Ｆタンパク質を含む組換えウイルスベクターを含む組成物を用いて対象にワクチン接種できる。
本明細書において開示される組換えウイルスベクターおよびその免疫原性組成物は、対象、好ましくは、ヒトにおいてウイルス中に含まれる抗原に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量で対象に提供される。有効量は、所望の免疫応答をもたらすためにウイルスの何らかの成長および増殖を可能にするが、ウイルス関連症状または疾病をもたらさない。本明細書において提供される指針および当技術分野における知識に基づいて、当業者ならば、生ワクチンにおいて使用するためのウイルスの適切な量を容易に決定できる。正確な量は、いくつかの因子、例えば、対象の健康状態および体重、投与様式、ウイルスの減弱度、製剤の性質ならびに対象の免疫系が損なわれているか否かに応じて変わる。
１種またはそれ以上の開示された組換えパラミクソウイルスを含む免疫原性組成物は、協調（またはプライム－ブースト）ワクチン接種プロトコールまたはコンビナトリアル製剤において使用することができる。特定の実施形態では、新規コンビナトリアル免疫原性組成物および協調免疫処置プロトコールは、各々、ＲＳＶおよびＰＩＶタンパク質に対する免疫応答などの抗ウイルス免疫応答の誘発に向けられた別個の免疫源または製剤を使用する。抗ウイルス免疫応答を誘発する別個の免疫原性組成物は、単一の免疫処置ステップで対象に投与される多価免疫原性組成物に組み合わせることができ、またはそれらを協調（またはプライム－ブースト）免疫処置プロトコールにおいて別個に（一価の免疫原性組成物で）投与することができる。
いくつかのブーストがあり得ることおよび各ブーストが、異なる開示された免疫原であり得ることが考慮される。いくつかの例では、ブーストは、別のブーストまたはプライムと同一免疫原であり得ることも考慮される。
開示された組換えパラミクソウイルスの投与の際、対象の免疫系は、通常、ウイルスタンパク質に特異的な抗体を製造することによって免疫原性組成物に応答する。このような応答は、免疫学的に有効な用量が対象に送達されたことを示す。
各個々の対象について、個体の必要性および免疫原性組成物を投与するか、またはその投与を監督する人物の専門的判断に従って、特定の投与計画を評価し、経時的に調整することができる。いくつかの実施形態では、対象の抗体応答は、有効投与量／免疫処置プロトコールの評価に関連して決定される。ほとんどの例では、対象から得られた血清または血漿中の抗体力価を評価することは十分となる。ブースター接種を施すか否かおよび／または個体に投与される治療薬の量を変更するか否かの決定は、少なくとも部分的に、抗体力価レベルに基づき得る。抗体力価レベルは、例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質を含む抗原と結合する血清中の抗体の濃度を測定する、例えば、免疫結合アッセイに基づき得る。開示された免疫原の実際の投与量は、疾患徴候および対象の個々の状態（例えば、対象の年齢、大きさ、適応度、症状の程度、感受性因子など）、投与時間および経路、同時に投与されているその他の薬物または治療ならびに対象において所望の活性または生物学的応答を誘発するための組成物の特定の薬理学などの因子に従って変わる。投与計画は、最適予防または治療応答を提供するように調整することができる。
有効投与量の決定は、通常、動物モデル研究と、それに続くヒト臨床治験に基づき、対象における標的とされる疾患症状または状態の出現または重症度を大幅に低減する、または対象において所望の応答（中和免疫応答など）を誘発する投与プロトコールによって導かれる。これに関連して適したモデルとして、例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、フェレット、非ヒト霊長類および当技術分野で公知のその他の承認された動物モデル対象が挙げられる。あるいは、有効投与量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル（例えば、免疫学的および組織病理学的アッセイ）を使用して決定できる。このようなモデルを使用して、治療上有効な量の組成物（例えば、所望の免疫応答を誘発するのに、または標的とされる疾患の１種もしくはそれ以上の症状を軽減するのに有効である量）を投与するための適当な濃度および用量を決定するのに、通常の算出および調整しか必要ではない。代替実施形態では、組成物の有効量または有効用量は、治療または診断目的のいずれかで、本明細書において示されるような疾患または状態と相関している１種またはそれ以上の選択された生物学的活性を単純に阻害し、または増強し得る。一実施形態では、ウイルス投与の一般的な範囲は、ヒト対象あたり約１０４～約１０５ＰＦＵウイルスを含むヒト対象あたり約１０３～約１０７個のプラーク形成単位（ＰＦＵ）またはより多くのウイルスである。
免疫応答を誘導して、感染を低減または防止する免疫原性組成物の投与は、感染が、例えば、薬剤の不在下で、または参照薬剤との比較において、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％または約８０％またはさらに約９０％の感染が測定可能に減少される限り、このような感染を排除できるが、必ずしも完全にではない。治療と必要とするものとして、ＲＳＶおよび／またはＰＩＶなどのパラミクソウイルスに感染している、またはその感染のリスクにある、一般集団および／または患者が挙げられる。
一例では、所望の応答は、ＲＳＶおよび／またはＰＩＶ感染または再感染を阻害するまたは低減するまたは防止することである。ＲＳＶおよび／またはＰＩＶ感染は、方法が有効であるために、完全に排除または低減または防止されることを必要としない。例えば、有効量の開示された組換えパラミクソウイルスの投与は、その後のＲＳＶおよび／またはＰＩＶ感染を、所望の量だけ、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％またはさらに少なくとも１００％低減できる（例えば、細胞の感染によって、またはＲＳＶおよび／もしくはＰＩＶによって感染した対象の数もしくはパーセンテージによって測定されるような）（適した対象と比較した、検出可能なＲＳＶおよび／またはＰＩＶ感染の排除または防止）。
投与量および用量の数は、例えば、先のパラミクソウイルス感染または免疫処置によってプライムされた成人またはいずれかのものにおける設定に応じて変わり、単回用量が十分なブースターである場合もある。無感作対象では、いくつかの例では、少なくとも２用量、例えば、少なくとも３用量を施すことができる。いくつかの実施形態では、例えば、年１回のインフルエンザワクチン接種とともに、年１回のブーストを施す。
対象の免疫処置後、適当な時点で対象から血清を集め、凍結し、抗体力価のアッセイおよび／または中和試験のために保存することができる。抗体レベルの定量化は、サブタイプ特異的中和アッセイまたはＥＬＩＳＡによって実施できる。中和活性をアッセイするための方法は、当業者に公知であり、本明細書においてさらに記載され、それだけには限らないが、プラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイ、マイクロ中和アッセイ、フローサイトメトリーベースのアッセイ、単一サイクル感染アッセイが挙げられる。いくつかの実施形態では、血清中和活性を、ＲＳＶまたはＰＩＶ偽ウイルスのパネルを使用してアッセイできる。血清サンプルにおいて、先に記載されるように（ｄｅ Ｇｒａａｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４３：１６９～１７４、２００７）、ＰＲＶＮアッセイによってウイルス－中和抗体力価を決定する。手短には、増強された緑色蛍光タンパク質を発現する、およそ５０ｐ．ｆ．ｕ．のＮＬ／１／００またはＮＬ／１／９９を有する血清サンプルを希釈し、３７℃で６０分間インキュベートできる。続いて、ウイルス－血清混合物を、２４ウェルプレート中のＶｅｒｏ－１１８細胞に加え、３７℃でインキュベートする。２時間後、上清を等量の感染培地および２％メチルセルロースの混合物によって置換する。６日後、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して蛍光プラークをカウントする。抗体力価は、Ｒｅｅｄ ＆ Ｍｕｅｎｃｈ、Ａｍ． Ｊ． Ｈｙｇ．、２７、４９３～４９７、１９３８の方法に従って算出された、プラーク数の５０％低減をもたらす希釈として表されている。
さらなる実施形態：
項１．組換えパラミクソウイルスであって、（ａ）該パラミクソウイルスのＦタンパク質の膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質尾部（ＣＴ）と連結している異種ウイルスのＩ型膜貫通タンパク質のエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノム；または（ｂ）該パラミクソウイルスのＨＮタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結している異種ウイルスのＩＩ型膜貫通タンパク質のエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムとを含む、前記組換えパラミクソウイルス。
項２。組換えヒト／ウシパラインフルエンザウイルス３（Ｂ／ＨＰＩＶ３）、組換えヒトパラインフルエンザウイルス１（ＨＰＩＶ１）、組換えヒトパラインフルエンザウイルス２（ＨＰＩＶ２）、組換えヒトパラインフルエンザウイルス２（ＨＰＩＶ３）、組換えパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）、組換えセンダイウイルスまたは組換えニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である、項１の組換えパラミクソウイルス。
項３。ＰＩＶ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴと連結している組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ） Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムを含む組換えパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）；ＮＤＶ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴと連結している組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムを含む組換えＮＤＶ；またはセンダイウイルス Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴと連結している組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスを含む、項２の組換えパラミクソウイルス。
項４。ＰＩＶ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴと連結している組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムを含む組換えＰＩＶを含む、項１～３のいずれかの組換えパラミクソウイルス。
項５。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、ヒトＲＳＶ（ｈＲＳＶ）Ｆタンパク質に由来する、項４の組換えパラミクソウイルス。
項６。ｈＲＳＶ Ｆタンパク質は、サブタイプＡ ｈＲＳＶまたはサブタイプＢ ｈＲＳＶに由来する、項４または５の組換えパラミクソウイルス。
項７。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、天然ＲＳＶ Ｆタンパク質配列と比較して１つまたはそれ以上のアミノ酸置換によって、ＲＳＶ Ｆ融合前コンホメーションにおいて安定化される、項４～６のいずれか１つの組換えパラミクソウイルス。
項８。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、（ａ）６６Ｅ；（ｂ）１０１Ｐ；（ｃ）１５５Ｃおよび２９０Ｃ；（ｄ）１９０Ｆ；（ｅ）２０７Ｌ；または（ｆ）（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ａ）および（ｅ）；（ａ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｅ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｃ）および（ｄ）；もしくは（ｃ）および（ｅ）；もしくは（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の組合せとして示されるアミノ酸を含み、ここで、アミノ酸番号付けは、配列番号１として示されるＲＳＶ Ｆタンパク質配列に対応する、項４～７のいずれか１つの組換えパラミクソウイルス。
項９。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、（ａ）Ｋ６６Ｅ；（ｂ）Ｑ１０１Ｐ；（ｃ）Ｓ１５５ＣおよびＳ２９０Ｃ；（ｄ）Ｓ１９０Ｆ；（ｅ）Ｖ２０７Ｌ；または（ｆ）（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ａ）および（ｅ）；（ａ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｅ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｃ）および（ｄ）；もしくは（ｃ）および（ｅ）；もしくは（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の組合せとして示されるアミノ酸置換を含む、項８の組換えパラミクソウイルス。
項１０。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌを含む、項８または９の組換えパラミクソウイルス。
項１１。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、配列番号１（ＷＴ ＲＳＶ Ｆ Ａ）、２（ＷＴ ＲＳＶ Ｆ Ｂ）、１２（Ａ２ ＨＥＫ）、１４（Ａ２ ＨＥＫ＋ＤＳ）もしくは２１（Ａ２ ＨＥＫ＋ＤＳ－Ｃａｖ１）のうちの１つのＲＳＶ エクトドメインと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、または配列番号１２、１４もしくは２１のＲＳＶエクトドメインのアミノ酸配列を含む、項４～１０のいずれか１つの組換えパラミクソウイルス。
項１２。ＰＩＶは、組換えＰＩＶ１、組換えＰＩＶ２または組換えＰＩＶ３である、項４～１１のいずれか１つの組換えパラミクソウイルス。
項１３。組換えＰＩＶは組換えＰＩＶ１であり、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＴＭおよびＣＴは、ＰＩＶ１ Ｆタンパク質に由来し；組換えＰＩＶは組換えＰＩＶ２であり、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＴＭおよびＣＴは、ＰＩＶ２ Ｆタンパク質に由来し；または組換えＰＩＶは組換えＰＩＶ３であり、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＴＭおよびＣＴは、ＰＩＶ３ Ｆタンパク質に由来する、項１２の組換えパラミクソウイルス。
項１４。組換えＰＩＶは、組換えＨＰＩＶ１であり、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＰＩＶ Ｆ ＴＭおよびＣＴは、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質に由来し；組換えＰＩＶは、組換えＨＰＩＶ２であり、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＰＩＶ Ｆ ＴＭおよびＣＴは、ＨＰＩＶ２ Ｆタンパク質に由来し；組換えＰＩＶは、組換えＨＰＩＶ３であり、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＰＩＶ Ｆ ＴＭおよびＣＴは、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質に由来し；または組換えＰＩＶは、組換えＢ／ＨＰＩＶ３であり、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＰＩＶ Ｆ ＴＭおよびＣＴは、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質に由来する、項１２または１３の組換えパラミクソウイルス。
項１５。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、ｈＲＳＶ Ｆタンパク質に由来し、ＴＭおよびＣＴは、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質に由来する、項４～１４のいずれか１つの組換えパラミクソウイルス。
項１６。組換えＰＩＶは、組換えＨＰＩＶ１であり、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＰＩＶ Ｆ ＴＭおよびＣＴは、配列番号３１として示されるアミノ酸配列、または配列番号３１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；組換えＰＩＶは、組換えＨＰＩＶ２であり、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＰＩＶ Ｆ ＴＭおよびＣＴは、配列番号３９として示されるアミノ酸配列、または配列番号３９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；組換えＰＩＶは、組換えＨＰＩＶ３であり、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＰＩＶ Ｆ ＴＭおよびＣＴは、配列番号４６として示されるアミノ酸配列、または配列番号４６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；または組換えＰＩＶは、組換えＢ／ＨＰＩＶ３であり、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＰＩＶ Ｆ ＴＭおよびＣＴは、配列番号５３として示されるアミノ酸配列、または配列番号５３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項４～１５のいずれか１つの組換えパラミクソウイルス。
項１７。組換えＰＩＶは、組換えＨＰＩＶ３であり、異種遺伝子は、配列番号１０として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＨＰＩＶ３ Ｆ ＴＭおよびＣＴと連結しているｈＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードし；または組換えＰＩＶは、組換えＢ／ＨＰＩＶ３であり、異種遺伝子は、配列番号２１として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＢＰＩＶ３ Ｆ ＴＭおよびＣＴと連結しているｈＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする、項４～１６のいずれか１つの組換えパラミクソウイルス。
項１８。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、ｈＲＳＶ Ｆタンパク質に由来し、組換えＰＩＶは、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮタンパク質ならびにＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、ＭおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含み、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＴＭおよびＣＴは、ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質に由来し；組換えＰＩＶは、ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含み、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＴＭおよびＣＴは、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質に由来し；組換えＰＩＶは、ＨＰＩＶ２ Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含み、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＴＭおよびＣＴは、ＨＰＩＶ２ Ｆタンパク質に由来し；または組換えＰＩＶは、ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含み、ＲＳＶ Ｆエクトドメインと連結しているＴＭおよびＣＴは、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質に由来する、項４～１７のいずれか１つの組換えパラミクソウイルス。
項１９。ＰＩＶ ＴＭおよびＣＴと連結している組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインは、ＰＩＶゲノムのゲノムプロモーターの下流の第１または第２の遺伝子によってコードされる、項４～１８のいずれか１つの組換えパラミクソウイルス。
項２０。ウイルスゲノムは、上流から下流に、ＰＩＶゲノムプロモーターと、それに続くＮ、Ｐ、Ｃ／Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子を含み；ＰＩＶ ＴＭおよびＣＴと連結している組換えＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする遺伝子は、ゲノムプロモーターとＮタンパク質をコードする遺伝子との間またはＮタンパク質をコードする遺伝子とＰタンパク質をコードする遺伝子との間に位置する、項１８または１９の組換えパラミクソウイルス。
項２１。それぞれ配列番号２１、１０１、４７、４８、４９、５２として示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子ならびにＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、ＭおよびＬ遺伝子をコードするウイルスゲノムを含む、項１８～１９のいずれか１つの組換えパラミクソウイルス。
項２２。異種遺伝子は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、先の項のいずれか１つの組換えパラミクソウイルス。
項２３。組換えＨＰＩＶ３であり、異種遺伝子は、ＨＰＩＶ３ Ｆ ＴＭおよびＣＴと連結しているＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードし、配列番号１１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＲＳＶ Ｆ＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｈ３ＴＭＣＴ）として示されるヌクレオチド配列を含み；または組換えＢ／ＨＰＩＶ３であり、異種遺伝子は、ＢＰＩＶ３ Ｆ ＴＭおよびＣＴと連結しているＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードし、配列番号２２（ＧｅｎＡｒｔ ＲＳＶ Ｆ＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｂ３ＴＭＣＴ）もしくは配列番号２３（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＲＳＶ Ｆ＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｂ３ＴＭＣＴ）として示されるヌクレオチド配列を含む、項２２の組換えパラミクソウイルス。
項２４。ウイルスゲノムのＩ型膜タンパク質のＴＭおよびＣＴと連結しているＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムを含む組換えウイルスベクター。
項２５。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、Ｋ６６ＥおよびＱ１０１Ｐアミノ酸置換を含む、項２４のウイルスベクター。
項２６。Ｋ６６ＥおよびＱ１０１Ｐアミノ酸置換を含むＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムを含む、組換えウイルスベクター。
項２７。ＲＳＶ Ｆタンパク質は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換によって融合前または融合後コンホメーションにおいて安定化されている、項２４～２６のいずれか１つのウイルスベクター。
項２８。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０ＦおよびＶ２０７Ｌアミノ酸置換によって融合前コンホメーションにおいて安定化されている、項２４～２７のいずれか１つのウイルスベクター。
項２９。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、可溶性であり、ウイルスベクターを含む宿主細胞から分泌される、項２６～２８のいずれか１つのウイルスベクター。
項３０。組換えヒト／ウシパラインフルエンザウイルス３（Ｂ／ＨＰＩＶ３）、組換えヒトパラインフルエンザウイルス１（ＨＰＩＶ１）、組換えヒトパラインフルエンザウイルス１（ＨＰＩＶ２）、組換えヒトパラインフルエンザウイルス１（ＨＰＩＶ３）、組換えパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）、組換えセンダイウイルスまたは組換えニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である、項２４～２９のいずれか１つのウイルスベクター。
項３１。ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、ヒトＲＳＶ（ｈＲＳＶ）Ｆタンパク質に由来する、項２４～３０のいずれか１つのウイルスベクター。
項３２。ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする異種遺伝子は、配列番号１８のヌクレオチド１～１５８７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ最適化されたＲＳＶ Ｆ＿Ａ２＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｂ３ＣＴ ＤＮＡ配列によってコードされるエクトドメイン）として示される核酸配列を含む、項２４～３１のいずれか１つのウイルスベクター。
項３３。組換えパラミクソウイルスまたはウイルスベクターに感染した宿主細胞によって製造されたウイルス粒子の少なくとも９０％は、異種遺伝子によってコードされるエクトドメインを含むウイルスエンベロープを含む、先の項のいずれか１つの組換えパラミクソウイルスまたはウイルスベクター。
項３４。減弱されている、先の項のいずれか１つの組換えパラミクソウイルスまたはウイルスベクター。
項３５。先の項のいずれか１つの組換えパラミクソウイルスまたはウイルスベクターおよび医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
項３６。アジュバントをさらに含む、項３５の免疫原性組成物。
項３７。対象においてウイルスおよびそれによってコードされる異種抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、項３５または項３６の免疫原性組成物の治療上有効な量を対象に投与することを含む、前記方法。
項３８。対象においてパラミクソウイルスおよびそれによってコードされる異種抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、項３５または項３６の免疫原性組成物の治療上有効な量を対象に投与することを含み、免疫原性組成物は、異種抗原をコードする異種遺伝子を含む組換えパラミクソウイルスを含む、前記方法。
項３９。対象においてＲＳＶおよびＰＩＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、項３５または項３６の免疫原性組成物の治療上有効な量を含む免疫原性組成物を対象に投与することを含み、免疫原性組成物は、ＲＳＶ抗原をコードする異種遺伝子を含む組換えパラミクソウイルスを含む、前記方法。
項４０。免疫応答は、保護的免疫応答である、項３７～３９のいずれか１つの方法。
項４１。免疫原性組成物のプライム－ブースト投与を含む、項３７～４０のいずれか１つの方法。
項４２。免疫原性組成物の鼻腔内または非経口投与を含む、項３７～４１のいずれか１つの方法。
項４３。対象は、ヒトまたは獣医学的対象である、項３７～４２のいずれか１つの方法。
項４４。対象は、ＲＳＶもしくはＰＩＶ感染のリスクにある、またはＲＳＶもしくはＰＩＶ感染を有する、項３７～４３のいずれか１つの方法。
項４５。対象は、１歳未満である、項３７～４４のいずれか１つの方法。
項４６。項１～２５のいずれか１つの組換えパラミクソウイルスのゲノムを含む核酸分子。
項４７。Ｋ６６ＥおよびＱ１０１Ｐアミノ酸置換を含む、組換えＲＳＶ Ｆタンパク質またはその免疫原性断片。
項４８。（ａ）Ｓ１５５ＣおよびＳ２９０Ｃ；（ｂ）Ｓ１９０Ｆ；（ｃ）Ｖ２０７Ｌ；または（ｆ）（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｃ）；もしくは（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の組合せをさらに含む、項４７の組換えＲＳＶ Ｆタンパク質またはその免疫原性断片。
項４９。ＲＳＶ Ｆエクトドメインを含む、項４７または項４８の組換えＲＳＶ Ｆタンパク質の免疫原性断片。
項５０。項４７～４９のいずれか１つの組換えＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸分子。
以下の実施例は、特定の実施形態の特定の特徴を例示するために示しているが、特許請求の範囲は、例証した特徴に限定すべきではない。
弱毒化されたパラインフルエンザウイルスベクターによって発現される呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）糖タンパク質の改善された発現および免疫原性
本実施例は、初期継代ウイルス由来のＲＳＶ Ｆ配列を使用することによる組み換えＢ／ＨＰＩＶ３によって、コドン－最適化によって、安定かつ高度に免疫原性の融合前および融合後型のＲＳＶ Ｆによって、ならびにＲＳＶ Ｆタンパク質ＴＭおよびＣＴを遺伝子操作することによって発現されたＲＳＶ Ｆの免疫原性および安定性を向上し、それによってこれがベクター粒子により効率的に組み込まれるようなアプローチを記載している。
序。投与された弱毒生ＲＳＶ株は、ＲＳＶワクチンの１つのストラテジーに相当し、これらは現在、開発中である（Ｈｕｒｗｉｔｚ．２０１１．Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ．１０：１４１５～１４３３；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｍｅｌｅｒｏ．２０１１．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１６２：８０～９９；Ｋａｒｒｏｎら．２０１３．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３７２：２５９～２８４）。弱毒生ＲＳＶ株は通常は、鼻腔内（ＩＮ）経路によって投与される。しかし、弱毒は一般には、抗原合成の低下を生じ、これが免疫原性の低下を生じる。弱毒と免疫原性との間の適切なバランスを得ることは、ＲＳＶにとって困難であった。
完全な、感染性ＨＰＩＶは、トランスフェクトされた細胞培養物中のクローニングされたｃＤＮＡから全体として生成される（逆遺伝学を使用する）。発現のために設計された外来遺伝子を、それがＨＰＩＶ転写シグナル（遺伝子開始および遺伝子末端シグナルと呼ばれ、それぞれ各々の遺伝子の開始および終わりに位置する）に隣接され、逆遺伝学によってＨＰＩＶゲノム中に追加の遺伝子として挿入されるように改変する。次いで、外来遺伝子を、他のＨＰＩＶ遺伝子のように、別のｍＲＮＡに転写する。ＨＰＩＶは、いくつかの追加の外来遺伝子に適応して発現する場合がある（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら．２００２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９７：１３６～１５２）。しかし、複数の遺伝子は、過度に弱毒化される場合があり、点突然変異を収集する場合がある（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら．２００２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９７：１３６～１５２）。
ＨＰＩＶ転写は、ゲノムの３’末端で単一プロモーターで開始し、連続的に進行する。ポリメラーゼの画分は、各々の遺伝子接合部で鋳型から離れて、遺伝子転写の負の勾配が生じる。従って、プロモーター近位の遺伝子は、下流の遺伝子よりも高頻度に発現される。プロモーターに近い外来遺伝子の配置によって、発現が増大されるが、下流のベクター遺伝子の発現に影響する能力を有する。遺伝子開始もしくは遺伝子終止の転写シグナルの効率における相違、または時には存在するが理解が劣るＲＮＡ鋳型中の他の構造的特徴の効果などの他の特徴もまた、挿入された遺伝子またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現に予想外に影響し得る（Ｗｈｅｌａｎら．２００４．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８３：６１～１１９）。さらに、いくつかの場合には、ウイルス構築物の特性は、まだ特定されていない因子によって大きく影響される；例えば、ＰＩＶ３ベクターのＰ－Ｍ遺伝子接合部へのＲＳＶ Ｆ遺伝子の挿入は、実質的に温度感受性であって、かつ弱毒化されたウイルスを生じた（Ｌｉａｎｇ Ｂら．２０１４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：４２３７～４２５０）。従って、ＨＰＩＶゲノムからの発現の幅広い詳細は、一般的に公知であるが、特異的な構築物は、予測不能な結果を生じる場合がある。
以前の研究では、Ｂ／ＨＰＩＶ３ベクターをベクターとして使用して、ＲＳＶ Ｇ遺伝子およびＦタンパク質を、プロモーター後の第１および第２のゲノム位置で追加した遺伝子から発現するか、またはＮ遺伝子とＰ遺伝子との間の第２ゲノム位置における追加の遺伝子からＲＳＶ Ｆ遺伝子を発現した。後者のウイルス（ＭＥＤＩ－５３４と呼ばれる）を、血清陰性の小児での臨床研究で評価したところ、弱毒化し、十分耐容され、感染性であったが、期待よりはＲＳＶに対して免疫原性が少なかった（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら．２０１２．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ３１：１０９～１１４）。ワクチンレシピエントから脱落したワクチンウイルスの解析によって、検体のうち約５０％が、ＲＳＶ Ｆ発現を摂動させることが予測される変異を有するワクチンウイルスを含むことが示された。これは、免疫原性を低下させる可能性が高い。臨床試験材料（ＣＴＭ）のレトロスペクティブ解析によって、このウイルスの２．５％が、ＲＳＶ Ｆを発現しないことが示された（Ｙａｎｇら．２０１３．Ｖａｃｃｉｎｅ ３１：２８２２～２８２７）。さらに、ＲＳＶ Ｆインサートが、タンパク質レベルでその発現を不活性化した変異を蓄積したという観察、および増殖の間にこれらの変異が増幅されたという観察によって、ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現をサイレンシングする選択的な利点があることが示唆される。これは、合胞体形成を効率的に媒介する、ＲＳＶ Ｆタンパク質の高度に融合性の性質に起因する可能性が高い。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、これによって、細胞基質の破壊が生じ、これによってベクター複製が低下される。さらに、高レベルの外来糖タンパク質の合成は、小胞体およびエキソサイトーシス経路を通じたベクター糖タンパク質の合成、プロセシングおよび輸送を妨害する場合があり、とりわけ、ビリオン形態形成を立体的に妨害する場合がある。これらの効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で生じる場合がある。
初期継代（ＨＥＫ）バージョンのＲＳＶ Ｆタンパク質およびコドン最適化されたバージョンのＲＳＶ Ｆオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現。ウイルス抗原の発現の増大は典型的には、免疫原性の向上をもたらした。ベクターの抗原をコードするＯＲＦのコドン最適化は、その発現を増大し、次にはその免疫原性を、例えば、ウイルスまたはＤＮＡベクターから発現されたヒト免疫不全ウイルス抗原で示されたように向上する（Ｇａｏら．２００３．ＡＩＤＳ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １９：８１７～８２３；Ｃａｒｎｅｒｏら．２００９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８３：５８４～５９７）。しかし、これらの配列変化は、翻訳の改善を超える効果、例えば、ｍＲＮＡの安定性および輸送に対する効果を有する場合があり、そのため、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を変更する効果は、複雑であり、かつ予測不能である場合がある。従って、ＲＳＶ Ｆ配列のコドン最適化されたバージョンを、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＧＡ）アルゴリズムを使用して設計し、それがタンパク質発現を付与したか否かを決定するために評価した。
このコドン最適化ＯＲＦを設計するとき、１９６０年代からのＲＳＶ株Ａ２の初期継代バージョンのアミノ酸配列は誤って使用された（Ｃｏｎｎｏｒｓら．１９９５．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０８：４７８～４８４；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら．１９９８．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：４４６７～４４７１）。１９６０年代由来のこの初期継代（または低継代）株は、その増殖に使用されたヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞培養後にＨＥＫと呼ばれる。このＨＥＫウイルスは、現在の高度に継代された実験室バージョンのＲＳＶ株Ａ２とは、２つのアミノ酸アサインメントが異なった（Ｃｏｎｎｏｒｓら．１９９５．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０８：４７８～４８４；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら．１９９８．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：４４６７～４４７１）。ＨＥＫバージョンは、アサインメント６６Ｅおよび１０１Ｐを有したが、高度に継代された実験室Ａ２株は、アサインメント６６Ｋおよび１０１Ｑを有した（以後、「非ＨＥＫ」アサインメントと呼ぶ）（図１）。しかし、ウイルス株の間、または所定の株のストックの間の配列相違の出現は、ＲＮＡウイルスには、その変異速度を考慮すれば一般的であり、ＨＥＫの相違は以前には重要であることは知られていなかった。さらに、ＲＳＶ ＮＩＨΔＭ２－２と呼ばれる弱毒化されたＲＳＶワクチン中候補のＨＥＫアサインメントの存在は、細胞培養中の複製の有効性におけるわずかな低下を伴っていた。さらに、６６位置のＨＥＫアサインメントは、ＲＳＶ感染の間に合胞体形成に影響することが特定された。従って、複製の低下とのそれらの関連を考慮して、ＨＥＫアサインメントを回避することが意図された。しかし、ＨＥＫアサインメントを含むＲＳＶ Ｆのバージョンは、最初のコドン最適化に偶発的に使用されたので、平行なＧＡ－最適化非ＨＥＫバージョンを構築して、２つのバージョンを比較した（図１）。２つのバージョンのＲＳＶ Ｆを、ＢＰＩＶ３遺伝子開始および遺伝子末端転写シグナルの制御下に置いて、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの第２位置に挿入した（図１）。転写シグナルおよび挿入位置は、ＲＳＶ Ｆを発現する全ての引き続くｒＢ／ＨＰＩＶ３構築物で使用して、それによって全体を通じた直接比較を得た。
Ｖｅｒｏ細胞に、２つの異なるベクター（「ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ」および「非ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ」と呼ばれる）を感染させ、細胞溶解液を感染後４８時間調製し、タンパク質を、変性性界面活性剤の存在下で、かつ還元条件または非還元条件下でゲル電気泳動に供した。別々のタンパク質を、ウエスタンブロッティングによって膜にトランスファーして、ＲＳＶ Ｆに特異的な抗体を使用して解析した（図２）。これによって、ＨＥＫアサインメントの存在は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現における小さい（約２倍）が、一貫した増大を伴うことが示された（図２）。この知見の１つの非限定的な説明は、ＨＥＫアサインメントがＦタンパク質安定性を増大したことが、タンパク質合成に対する効果がある場合があるが、ただし、ＨＥＫおよび非ＨＥＫバージョンのＦ ＯＲＦが、２つのコドンを除いて同一であったならば、可能性は少ないと思われる。さらに、非還元条件下で解析した場合、ＨＥＫアサインメントの存在は、ＲＳＶ Ｆ三量体のゲル移動度の低下を伴っていた（図２）。これによって、これらのアサインメントは、Ｆタンパク質三量体構造を変更したことが示唆された。さらに著しいことに、ＲＳＶ ＦのＨＥＫバージョンの発現は、既に注記されたとおり、ＨＥＫバージョンがわずかに増大したレベルで発現された場合でさえ、非ＨＥＫバージョンと比較して合胞体形成の劇的な低下を伴った（図３）。このアッセイは、ｒＢ／ＨＰＩＶ３空ベクターによって感染された細胞で誘導される明白な合胞体の全般的な欠如を利用するが、ベクター由来のＲＳＶ Ｆタンパク質の発現は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現量と一般的に比例する合胞体形成を生じる。これによって、ＰＩＶベクターから発現されたＲＳＶ Ｆタンパク質の量および機能性のアッセイが得られる。ＨＥＫに関係するこれらの観察によって、ＨＥＫアサインメントは、ＲＳＶ Ｆの合成／安定性、構造、および融合活性における相違と関連すること、ならびにこれらの効果が、任意の他のＲＳＶタンパク質の非存在下で生じ、従って、異種ベクターからの発現に直接関連したことが示された。
ＨＥＫアサインメントは、１９６０年代からのＲＳＶ株Ａ２の低継代ストックに由来するので、それらは、もとの臨床単離体の代表である可能性が高いが、非ＨＥＫアサインメントは、その後数十年にわたるｉｎ ｖｉｔｒｏの広範な継代の間に出現した。これによって、ＨＥＫバージョンのＦの低融合性表現型が、もとの生物学的ウイルスをより代表することが示唆される。非ＨＥＫバージョンは、細胞培養における継代の間に選択された超融合性の改変体に相当し得る。ＲＳＶ Ｆの高融合性バージョンは、ウイルスを不安定化し得るので、実際に好ましくない場合があるが、細胞単層における急速な増殖の実験室設定では選択され得る。ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の臨床単離体からのＲＳＶ Ｆの２２６の配列を検査して、臨床単離体が通常ＨＥＫアサインメントを含むことを見出した。これは、循環中のＲＳＶの代表であるこれらのアサインメントと一致する。いずれにしても、ＨＥＫアサインメントは、Ｆタンパク質発現の適度の増大をもたらし、低融合性であった形態のＲＳＶ Ｆをもたらした。合胞体形成における低下は、これが細胞病原性（そうでなければＨＰＩＶベクター複製、およびＲＳＶ Ｆインサートがサイレンシングされたベクターの好ましい選択を妨害し得る）を低下するので、有利である。従って、ＨＥＫアサインメントは、Ｆタンパク質のさらに天然でかつ臨床的に関連する形態に相当する三重の利点を有し、タンパク質発現の適度の増大をもたらし、ＲＳＶ Ｆインサートをサイレンシングするための選択圧を低下する。
ＲＳＶ Ｆ発現および免疫原性に対するコドン－最適化の効果もまた評価した。上記のＨＥＫ－含有およびＧＡ－最適化バージョン（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ）を、２つの他の異なるアルゴリズムによって作製された２つの他のコドン最適化ＲＳＶ ＨＥＫ Ｆ配列とともに使用した。多重最適化バージョンの評価は、費用および不便さを増大させ、有用であるとは示されなかったので、典型的な実施ではない。２つの他の供給源は、ＤＮＡ２．０（Ｄ２）およびＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＧＳ）アルゴリズムであった；また比較のために含まれるのは、非ＨＥＫ、非コドン－最適化バージョンであった（図４）。コドン最適化は、有意に向上されたＲＳＶ Ｆタンパク質合成を生じ、これは驚くべきことに、異なるバージョンに関しては大きさが異なった。最高の発現が、ＨＥＫ－含有ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ－最適化Ｆタンパク質（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ）で観察され、これは、未改変のＲＳＶ Ｆ（非ＨＥＫ／非ｏｐｔ）よりも１０倍（Ｖｅｒｏ細胞）および１６倍（ＬＬＣ－ＭＫ２細胞）高かった（図５）。より効率的なＯＲＦを有する発現のレベルは、合胞体形成のレベルの漸増が、ＨＥＫアサイントメントの存在にもかかわらずＦ発現のレベルの増大と関連して証明されたほど高かったが、合胞体形成は、ＨＥＫアサイントメントの非存在下でさらにより早くかつさらに広範であったと推定される。
コドン対最適化はまた、以前に記載のアルゴリズムを使用して、Ｆタンパク質発現を増大する手段としても評価した（Ｃｏｌｅｍａｎら．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：１７８４～１７８７）。コドン対最適化は、高い発現に関連するコドン対の頻度を増大する。しかし、これは、ＲＳＶ Ｆの場合はなんら発現の増大を付与しなかった。
予想に反して、ＲＳＶ Ｆ発現の１０～１６倍の増大、および合胞体形成における付随する増大は、細胞培養物中のベクター複製に有意な負の影響を有さなかった（図７）。高レベルのＲＳＶ Ｆ発現および合胞体形成は、既に注記されたように、任意の多数の工程でベクターを妨害すると予測され、この工程としては、ベクター糖タンパク質合成、プロセシング、エキソサイトーシス、ベクター粒子形成および細胞生存が挙げられるが、これは事実ではなかった。これは、特に驚くべきことであった。なぜなら、既に注記されたとおり、ＭＥＤＩ－５３４におけるＲＳＶ Ｆ遺伝子の発現をサイレンシングした蓄積および変異の増幅によって、ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現に対して実質的な選択圧があったことが示唆された。空ベクターと比較して、ＲＳＶ Ｆインサートを有する全てのベクターを、適度に弱毒化した（図７）－おそらくゲノム長および遺伝子数の増大などの一般的な弱毒化効果を含む－ただし、お互いに対して同様の反応速度論で複製されて、空ベクターのピーク力価よりもわずかに低い高いピーク力価まで増殖した（図７）。ピーク力価のわずかな相違は、実験の変動に相当する可能性が高い。
ｉｎ ｖｉｖｏ複製では、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの免疫原性および防御有効性を、ハムスターのモデルで評価した。ハムスターの群を、動物１匹あたり１０５個の組織培養感染用量（ｔｉｓｓｕｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ－ｄｏｓｅ－５０単位）（ＴＣＩＤ５０）という用量でｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを使用して鼻腔内免疫した。さらに、１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）という用量で与えた野性型（ｗｔ）ＲＳＶを、ＲＳＶ－特異的な免疫の誘導のための陽性対照として含んだ。ｗｔ ＲＳＶ対照は、ｗｔ ＲＳＶが非弱毒化ウイルスであるという警告とともに含まれたが、このベクターは弱毒化されて、その理由のために比較的免疫原性が低い場合があった。１日あたり１ウイルスあたり６匹の動物を感染後３日目および５日目に安楽死させて、鼻甲介および肺をウイルス滴定のために収集して、複製をｉｎ ｖｉｖｏで測定した。これによって、ＲＳＶ Ｆインサートを保有するベクターは、空ベクターと比較して鼻甲介（上気道）で適度に弱毒化され、実質的には肺（下気道）で弱毒化されることが示された（図８）。空ベクターと比較した弱毒化の増大は、ウイルス脱落に関するより低い値によって証明された。これはまた、３日目および５日目の力価の比較によって証明された：空ベクターに関しては、３日目および５日目の力価は匹敵したが、ＲＳＶ Ｆを保有するベクターに関しては、３日目の力価は、５日の力価よりも低く、これによって、これらの構築物が、その最大力価を達成するのにより長くかかることが示された。驚くべきことに、ＲＳＶ Ｆインサートを有するベクターの中でも、ＲＳＶ Ｆ発現が増大しているベクターは、より低いＲＳＶ Ｆ発現を有するもの、すなわち、非ＨＥＫ／非ｏｐｔよりも弱毒化されていなかった。従って、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターへのＲＳＶ Ｆインサートの追加は、ｉｎ ｖｉｖｏで弱毒化されていた（おそらく、ゲノム長さまたは遺伝子数の増大などのいくつかの一般的な特徴に起因して）ただし、これは、ＲＳＶ Ｆタンパク質の合成のレベルよりも実質的に影響されると思われなかった。
ベクターの免疫原性は、標準的なアッセイである、モルモット補体を補充した６０％プラーク減少アッセイによってＲＳＶ中和抗体の血清力価を測定することによって評価した。ＲＳＶ Ｆを発現する全てのベクターは、ＨＥＫアサインメントまたはコドン－最適化にかかわらず、同様に高い力価のＲＳＶ－中和血清抗体を誘導した（図９）。漸増するＲＳＶ Ｆ発現と関連した中和力価のわずかな進行性の増大があったが、その相違は、統計学的に有意ではなかった。対照と並行して感染させられたｗＴ ＲＳＶは、ベクターよりも有意に高い力価のＲＳＶ－中和抗体を誘導した。しかし、ＲＳＶ感染によって誘導された中和抗体は、ＦおよびＧ中和抗原の両方からの寄与を含んだが、このベクターは、中和力価に寄与するＦ特異的抗体のみを有したことに注目することが重要である。さらに、弱毒化されなかったｗｔ ＲＳＶ対照は、弱毒化されたベクターよりも、特に肺で（図８）、効率的に複製し、これは、その免疫原性をベクターの免疫原性と比較して増大した。
これらのベクターの防御有効性を評価するために、図９の実験由来の、６匹の動物の群の免疫されたハムスターに、動物１匹あたり１０６ｐｆｕのｗｔ ＲＳＶでの鼻腔内感染で免疫３０日後にチャレンジした。鼻甲介および肺を、チャレンジ後３日目で安楽死させた動物から収集して、組織ホモジネートを調製して、プラークアッセイによって評価して、チャレンジＲＳＶ複製のレベルを測定した。ＲＳＶ Ｆを発現するベクターは、肺ではほぼ完全な防御をもたらし、鼻甲介では中間レベルの防御をもたらしたが、ｗｔ ＲＳＶは両方の解剖学的部位でほぼ完全な防御をもたらした（図１０）。ＲＳＶチャレンジに対する防御有効性においてＲＳＶ Ｆを発現するベクターの間で有意な相違はなかった。ＲＳＶによってもたらされる防御は、Ｆタンパク質およびＧタンパク質の両方に対する中和抗体、ならびに潜在的に全てのＲＳＶタンパク質に対する細胞免疫からの寄与を含むが、ベクターによってもたらされる防御は、Ｆタンパク質のみに対する体液性免疫および細胞性免疫を含むことに注意すべきである。さらに、注記したとおり、ＲＳＶの対照は、特に肺では、その免疫原性および防除効率を増大する、免疫の間にベクターよりも高い力価まで複製した、弱毒化されていないｗｔウイルスであった（図８）。
これらの結果、ＨＥＫアサインメントおよびコドン最適化配列の使用から生じるＲＳＶ Ｆタンパク質発現の発現における１０～１６倍の増大は、ＲＳＶ中和血清抗体の誘導における有意な増大（増大に向かう傾向は観察されたが）も、ｗｔ ＲＳＶチャレンジに対する防御における有意な増大も生じなかったことが示された。対照的に、ヒト免疫不全ウイルス抗原の発現における同様のレベルの増大は、異なる動物モデルでは他のウイルスベクターおよびＤＮＡワクチンでの防御の向上を生じた（Ｇａｏら．２００３．ＡＩＤＳ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ １９：８１７～８２３；Ｃａｒｎｅｒｏら．２００９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８３：５８４～５９７）。以前には、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターでの位置１または２対６での挿入に起因する、ＲＳＶ Ｆの発現における３０～６９倍の相違が、ハムスターでの防御有効性における有意な相違を誘導したことも観察されている（Ｌｉａｎｇ Ｂら．２０１４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：４２３７～４２５０）。従って、抗原合成の増大は、免疫原性の増大を付与すると一般に考えられる。しかし、いくつかの場合には、この効果は、疑いなく検出されるほど十分に大きくない場合があり、また所定のｉｎ ｖｉｖｏモデルは、十分に感受性ではない場合もあるようである。従って、本研究における１０～１６倍の相違は、半許容的なハムスターモデルでは統計学的に有意であるのに十分な大きさの効果を誘導するには十分でない場合がある。より高いＲＳＶ Ｆ発現の有益な効果は、他の特徴と組み合わせて、または許容的なホスト、すなわち霊長類およびヒトでは、前臨床および臨床評価でのより大きいサンプルサイズで、さらに顕著である場合がある。具体的には、この研究で観察されたＦタンパク質発現の１０～１６倍の増大は、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル）またはＬＬＣ－ＭＫ２（アカゲザル）の細胞におけるものであり、ここではヒト使用のためのコドン－最適化は、ヒトに対するこれらの霊長類の比較的近い系統発生学上の関連性を考えれば、有効である可能性が高い。対照的に、ｉｎ ｖｉｖｏの免疫原性アッセイは、ハムスターを使用し、ここではヒト使用のためのコドン最適化は、発現の増大、およびそれによる免疫原性に有効ではない場合もある。
ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによって発現されたＲＳＶ Ｆの融合前および融合後型の免疫原性の評価。全てのパラミクソウイルスＦタンパク質と同様、ＲＳＶ Ｆタンパク質は最初に、感染した細胞の表面上に最初に蓄積して、ビリオン中に組み込まれるバージョンである融合前コンホメーションにアセンブルする。融合前Ｆは、例えば、隣接する標的細胞膜との接触によって誘発されて、膜融合を媒介する大量のコンホメーション変化を受け、Ｆタンパク質は、融合後コンホメーションで終わっている（Ｃａｌｄｅｒら．２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７１：１２２～１３１；ＭｃＬｅｌｌａｎら．２０１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０：１１１３～１１１７；ＭｃＬｅｌｌａｎら．２０１１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５：７７８８－７７９６；Ｓｗａｎｓｏｎら．２０１１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０８：９６１９～９６２４）。ＲＳＶ Ｆタンパク質は、誘発に対して極めて感受性であることがパラミクソウイルスの間で顕著であり、成熟前に容易に誘発され、これは、ＲＳＶ感染性の顕著な不安定性に寄与し得る。感染した細胞中で蓄積するＲＳＶ Ｆタンパク質の多くがコンホメーション的には異種であり、これは、ウイルス中和抗体の誘導を減らすためのデコイとして機能し得ることも証明されている（Ｓａｋｕｒａｉら．１９９９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：２９５６～２９６２）。従って、これは、安定化されたコンホメーションでＲＳＶ Ｆを発現するための２つ以上の理由で利点である。
近年では、ＲＳＶ Ｆの安定な融合後型が記載されている（ＭｃＬｅｌｌａｎら．２０１１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５：７７８８～７７９６；Ｓｗａｎｓｏｎら．２０１１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０８：９６１９～９６２４）。この安定な融合後型は、疎水性融合ペプチドの短縮、ならびにＣ末端膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質尾部（ＣＴ）の除去によって組み換え的に生成された（Ｒｕｉｚ－Ａｒｇｕｅｌｌｏら．２００４．Ｊ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８５：３６７７－３６８７）。ＴＭおよびＣＴを欠くことで、この融合後型は、膜固定されず、分泌されるであろう。ＲＳＶ Ｆの融合後型は、免疫原性であって防御的であることがマウスで示されている（Ｓｗａｎｓｏｎら．２０１１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０８：９６１９～９６２４）。
しかし、ＲＳＶ Ｆの融合前型は、融合後型よりもかなり免疫原性であると考えられる（ＭｃＬｅｌｌａｎら．２０１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０：１１１３～１１１７）。これは、回復期にある動物およびヒトの血清における中和活性の大部分が融合後Ｆタンパク質に結合せず、おそらく融合前型に特異的である抗体によってもたらされたという観察に基づく（ＭｃＬｅｌｌａｎら．２０１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０：１１１３～１１１７；Ｍａｇｒｏら．２０１２．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：３０８９～３０９４）。近年では、ＲＳＶ Ｆの融合前型の構造は、決定され、構造ベースの変異を通じてこの融合前コンホメーションを安定化することが可能になる：これらの１つは、ジスルフィド結合（ＤＳ）の導入を含み、別に、三量体構造（Ｃａｖ１）における予測の腔におけるアミノ酸置換を含み、これらの組み合わせは、ＤＳ－Ｃａｖ１と呼ばれる（ＭｃＬｅｌｌａｎら．２０１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２：５９２～５９８）。組み換えのＤＳおよびＤＳ－Ｃａｖ１型のＲＳＶ Ｆタンパク質を、マウスおよびサルでのサブユニットワクチンとして評価し、融合後型よりも有意に高いレベルのＲＳＶ中和血清抗体を誘導することが示された（ＤＳ－Ｃａｖ１型は、ＤＳ型よりも免疫原性である）（ＭｃＬｅｌｌａｎら．２０１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２：５９２～５９８）。
弱毒生ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターから発現された場合ＲＳＶ Ｆの融合後型および融合前型の免疫原性を評価した。融合後型および安定化された融合前型（ＤＳおよびＤＳ－Ｃａｖ１）のＲＳＶ Ｆ（ＨＥＫアサインメントを伴う）を、ＧＡコドン最適化して、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの第２ゲノム位置に挿入した（図１１）。これらを、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔと、およびＨＥＫ－含有のバージョン、ＧＡ－最適化Ｆタンパク質（これからＣＴおよびＴＭが欠失され、エクトドメイン（Ｅｃｔｏ）を残した）と比較した（図１１）。これらの構築物をまた、非ＨＥＫ／非ｏｐｔ構築物とも比較した。
ＧＡ－最適化Ｆ ＯＲＦを、図１１およびその後の実験に示すデータで使用した。ＧＳ最適化合物ＯＲＦを有する並行構築物を、ある場合には構築した（図３５を参照のこと）が、まだ評価すべきである。ＧＳ－最適化ＯＲＦの優れた発現を考慮すれば（図３５）、ＧＳ－最適化バージョンは、さらに免疫原性であって、かつ防御性である場合もある。また、識別子「ＨＥＫ」および「ＧＡ－ｏｐｔ」は時には、図１１およびその後の図で、ならびにその後のテキストでは、簡略にするために構築物名から省かれるが、これらの特徴の存在は、図では示されている（すなわち、「ＲＳＶ Ｆの全ての上記のバージョンは、ＨＥＫ、ＧＡ－最適化」である、図１１）。
これらの種々の形態のＲＳＶ Ｆを有するベクターをレスキューして、各々を高い同様の力価までｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖した（図１２）。これらは、一般には、増殖の反応速度論に関してわずかに弱毒化され、空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターと比較した最終の収率は、他のベクター構築物について以前に注記されたとおりであった（図７を参照のこと）。
種々の形態のＲＳＶ Ｆタンパク質の発現の有効性を、種々の構築物で感染させたＶｅｒｏ細胞およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞で評価した（図１３ＡおよびＢ）。感染させた細胞培養を、感染後４８時間で回収して、ウエスタンブロッティングによって解析した。天然型のＲＳＶ Ｆ（すなわち、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ）は、予想どおり細胞会合していた。融合後型およびＥｃｔｏ型は、分泌されること、同様に細胞会合されることが見出された。融合後Ｆの分泌は、一貫してＥｃｔｏ型のものよりも効率的であった：Ｅｃｔｏ型は、高い含量の疎水性配列を含むので、より多くが細胞会合のまま残る場合がある。予期せぬことに、ＤＳおよびＤＳ－Ｃａｖ１型のＦは、より効率的に発現された（図１３Ｂ）。これらのウイルスは、同様の反応速度論を繰り返したので、そしてＯＲＦは、同様にＧＡ最適化されたので、発現のこの増大は、ＤＳおよびＤＳ－Ｃａｖ１型のタンパク質安定性の増大を反映した可能性が高い。タンパク質の遺伝子操作は、糖タンパク質の発現、プロセシングおよび安定性に、そしてしばしばネガティブな方式で実質的に影響し得、そのためこの生ベクターによるＤＳおよびＤＳ－Ｃａｖ１の効果的な発現は、容易に予測できなかった本質的な特性であった。
ｉｎ ｖｉｖｏでのこれらのベクターの複製をハムスターで評価した（図１４）。鼻甲介では、ＲＳＶ Ｆインサートを有する全てのベクターは、空ベクターよりも適度に弱毒化された（図１４Ａ）。空ベクターと比較した弱毒化の増大は、ウイルス脱落についての値が低いことによって証明された。これはまた、３日目および５日目の力価の比較によって証明された：空ベクターに関しては、これらの値は匹敵したが、ＲＳＶ Ｆを保有しているベクターに関しては、５日目の力価は、３日目の力価よりも高く、このことは、これらの構築物が、その最大力価に達するのにより長くかかることを示している。融合後Ｆを有するベクターは、他の形態のＦを有するベクターよりも高い力価まで複製したが、融合前Ｆ（ＤＳ）を有するベクターは、低い力価まで複製し、これは、実験の変動に相当する場合があるか、またはベクター複製に対する公正な不同性の効果に相当する場合がある。肺では、ＲＳＶ Ｆインサートを有する全てのベクターは、空ベクターよりも実質的にさらに弱毒化された（図１４Ｂ）。鼻甲介と一致して、融合後Ｆを有するベクターはまた、肺における他のベクターよりもいくぶん高くまで複製したが、融合前（ＤＳ）バージョンを発現するベクターは、いくぶんかさらに弱毒化されたと思われた。完全にｗｔウイルスであるＲＳＶ対照は、ＲＳＶ Ｆを発現する弱毒化されたｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターよりも効率的に複製された；例えば、ｗｔ ＲＳＶは、それぞれ鼻甲介および肺で、融合前（ＤＳ）Ｆを発現するベクターよりも１００倍および１０００倍高い力価まで複製した。ＲＳＶ－中和血清抗体力価は、６０％プラーク減少アッセイによって決定した。これは２つの方法で行った：（ｉ）追加した補体の存在下で（これは、図９に既に示されるように有用な手法である）、および（ｉｉ）補体の追加なしで（それぞれ、図１５ＡおよびＢ）。追加した補体が存在することで、ウイルス－特異的な抗体の最も鋭敏な検出が得られる。なぜなら、補体は潜在的に、ビリオンに結合する全ての抗体にウイルス溶解能力を付与し、また立体的な効果を発揮し得るからである（Ｙｏｄｅｒら ２００４ Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ７２：６８８～６９４）。対照的に、補体依存性の中和アッセイは、補体タンパク質のウイルス溶解機能または立体効果に関与することなく、ＲＳＶを中和できる高い質の中和抗体のみを検出する。「補体なしで行う中和アッセイは、呼吸器官の生理学的条件を最も反映し得る」ことが示唆されている（Ｙｏｄｅｒら ２００４ Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ７２：６８８～６９４）。補体含有アッセイ（図１５Ａ）では、融合後Ｆを有するベクターは、これがハムスターにおいて最高の力価まで複製された場合でさえ、ベクターの中でも免疫原性が劣っていた；一方、融合前（ＤＳ）Ｆを有するベクターは、これが最も弱毒化された場合でさえ、試験したベクターの中でも最も免疫原性であった。補体依存性のアッセイでは（図１５Ｂ）、ベクターの間で、融合前（ＤＳ）Ｆを発現するベクターのみが、高い力価の中和抗体を誘導した。未改変の融合後またはＥｃｔｏＦを有する他のベクターで、高い質の中和抗体を誘導するのに効果的であったものはなかった。ｗｔ ＲＳＶ対照は、補体含有および補体依存性のアッセイの両方で中和された抗体を誘導するのに効果的であった。著しいことに、融合前（ＤＳ）Ｆを有するベクターは、高品質のＲＳＶ中和抗体を誘導するのにおいてｗｔ ＲＳＶと統計学的に同様であった（図１５Ｂ）。これは、注目すべきである。なぜならこの弱毒化されたベクターは、弱毒化されていないｗｔ ＲＳＶよりも１００～１０００倍少ない効率で複製し、ｗｔ ＲＳＶによって付与された中和活性は、ＲＳＶ Ｇタンパク質からの寄与の追加があった。これによって、ＲＳＶ Ｆの融合前（ＤＳ）型を発現するベクターは、極めて有効な中和抗体を誘導するのに極めて強力であって、免疫原性が高かったことが示唆される。
これらのベクターの防御有効性を評価するために、図１５の実験由来の免疫されたハムスターを、動物１匹あたり１０６ｐｆｕのｗｔ ＲＳＶを使用した鼻腔内感染によって免疫後３０日チャレンジした。その動物を感染の３日後に屠殺して、鼻甲介および肺を、回収してプラーク滴定によってアッセイした組織ホモジネートに処理した（図１６）。鼻甲介では（図１６Ａ）、非ＨＥＫ／非ｏｐｔ Ｆ、またはＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ、またはＥｃｔｏ Ｆを発現する構築物は、適度なレベルの防御をもたらしたが、融合後Ｆおよび特に融合前（ＤＳ）Ｆは、いくぶんかさらに防御的であった。肺では（図１６Ｂ）、全てのベクター構築物が、ＲＳＶチャレンジに対して、もたらす防御が最低であった融合後型を除いて、実質的な防御を提供した（図１６Ｂ）。ｗｔ ＲＳＶ対照は、鼻甲介ではほぼ完全に近い防御を、および肺では完全な防御を提供した；しかし既に注記されたとおり、ｗｔ ＲＳＶは、細胞免疫の潜在的な抗原として全てのＲＳＶタンパク質を発現することおよび最大１０００倍、より効率的に複製することに加えて、ＦおよびＧ中和抗原の両方を発現するという利点を有した（図１４）。
ＤＳ構築物に対するＣａｖ－１変異の追加によって、サブユニットワクチンとして免疫原性の増大がもたらされ（ＭｃＬｅｌｌａｎら．２０１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２：５９２～５９８）、これは、ウイルスベクターから発現された融合前ＲＳＶ Ｆの免疫原性をさらに増強することが予測される。また、ＲＳＶ ＦのＤＳおよびＤＳ－Ｃａｖ１型は、発現に最大の増大を提供した、ＧＳ最適化の状況で免疫原性および防御効率に関してはまだ評価することが残っている（図５および図６）。これらのさらなる構築物が構築されて、回収され、作業用プールとして調製された（図３５）。
ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのビリオン粒子への組み込みを容易にすることによってＲＳＶ Ｆタンパク質の免疫原性を強化する。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはアデノ随伴ウイルス粒子への抗原の組み込みは、それらの免疫原性を増大することが示されている（Ｒｙｂｎｉｋｅｒら．２０１２．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６：１３８００～１３８０４；ＭｃＧｉｎｎｅｓら．２０１１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５：３６６～３７７）。しかし、感染性ウイルスのウイルスエンベロープへの異種抗原の組み込みがその免疫原性を増強し得るか否かは不明であった。ｒＢ／ＨＰＩＶ３によって発現された場合、天然のＲＳＶ Ｆタンパク質（すなわち、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ）をごく微量のベクター粒子に組み込む（下を参照のこと）。
Ｚｉｍｍｅｒら（Ｚｉｍｍｅｒら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００５ ７９：１０４６７～７７）による以前の研究では、ＨＰＩＶ１のマウス関連であり、またＨＰＩＶ３に密接に関連する、センダイウイルスに追加された遺伝子からのＲＳＶ Ｆタンパク質の発現を評価した。その研究によって、ｒＢ／ＨＰＩＶ３と同様、極めて小さいＲＳＶ Ｆタンパク質がセンダイウイルスベクター粒子に組み込まれたことが示された。研究者らは、ＣＴまたはＣＴプラスＴＭのＲＳＶ Ｆタンパク質を、センダイＦタンパク質由来の対応する配列によって、これがベクター粒子との外来ＲＳＶ Ｆタンパク質の相互作用の有効性を改善するという前提で、置き換えた。これらの改変は、センダイ粒子への遺伝子操作されたＲＳＶ Ｆの組み込みを実際に増大したが、ただしセンダイＦタンパク質遺伝子が欠失された場合のみであった。ベクターＦタンパク質を欠失するためのその要件は、本研究では望ましくない。なぜなら、ｒＢ／ＨＰＩＶ３からベクターＦタンパク質を欠くことは、特にｉｎ ｖｉｖｏでその複製特性を実質的に変更する能力を有し、またＨＰＩＶ３防御的抗原の１つも除去する。
このストラテジーが適切ではないであろうことを示すこの明らかな先例にもかかわらず、ＲＳＶ Ｆタンパク質がベクター（ＰＩＶ）Ｆタンパク質のもので置き換えられたＣＴまたはＣＴプラスＴＭを有したｒＢ／ＨＰＩＶ３構築物を作製した（これによって、それぞれ、Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴと呼ばれる構築物が生じた、図１７）。ｒＢ／ＨＰＩＶ３由来のＴＭおよびＣＴ領域は、それぞれ２１アミノ酸および２６アミノ酸の長さであった。本研究の構築物は、天然のＦタンパク質中にＨＥＫアサインメントおよびＧＡ最適化を含んだＦタンパク質のバージョン（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ）で、およびまた融合前ＤＳおよびＤＳ－Ｃａｖ１型でも行った（図１７）。（ＧＡ－最適化Ｆ ＯＲＦを使用した）。全てのキメラＦ遺伝子を、上記の構築物との直接比較のためにｒＢ／ＨＰＩＶ３の第２位置に挿入した。
全てのウイルスは、逆遺伝学によって容易に回復した。ＲＳＶ Ｆのパッケージング効率およびその改変された誘導体を定量するために、スクロース精製したウイルスを、ウエスタンブロット解析のために調製して、粒子中のＲＳＶ Ｆの量を決定した（図１８）。等量の各々のスクロース精製ストック（１サンプルあたり０．５ｕｇのタンパク質）を、変性、還元ゲル電気泳動に供して、ウエスタンブロッティングによって解析した。これによって、非キメラ Ｆタンパク質（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ由来）は、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ビリオン中に比較的劣った組み込みを有したことが示された（図１８、レーン２）。しかし、Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴ改変は、組み込み効率を１９～２０倍まで劇的に向上した（図１８、レーン３および４）。実際、等しいタンパク質量のｗｔ ＲＳＶビリオンと比較した場合（図１８、レーン５）、ベクター粒子中の組み込まれたＢ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴ Ｆタンパク質の量は、ＲＳＶ粒子中の天然のＦの量に等しいと思われた。同様に、パッケージングの有効性の向上はまた、Ｂ３ＣＴまたはＢ３ＴＭＣＴとのＲＳＶ Ｆのキメラの融合前（ＤＳ）型についても観察された（図１８、レーン６および７）。従って、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターへのＲＳＶ Ｆ Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴの効率的なパッケージングは、ベクターＦタンパク質の欠失を必要とせず、従って、センダイの前例とは劇的に異なった。
ＲＳＶ Ｆのパッケージングはまた、ＲＳＶ－特異的な抗体および免疫－金標識を使用した透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で検査した（図１９Ａ～Ｆ）。ＲＳＶ粒子の表面上のＲＳＶ Ｆスパイクを標識した（図１９Ａ）が、標識は空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの表面では観察できなかった（図１９Ｂ）。天然のＲＳＶ Ｆの極めて限られた標識を、極めてわずかな天然のＦが、ウエスタンブロット解析によって、精製されたｒＢ／ＨＰＩＶ３ビリオン中で検出されたことを示す図１８の結果と一致して、ベクターエンベロープ中で検出した（図１９Ｃ）。対照的に、Ｂ３ＣＴまたはＢ３ＴＭＣＴとのキメラＦを発現するベクターは、標識の増強を示し（図１９Ｄおよび図１９Ｅ）ており、これはベクターエンベロープへのこれらのキメラ型の効率的なパッケージングを示す。同様に、Ｂ３ＴＭＣＴとの融合前（ＤＳ）ＲＳＶ Ｆはまた、ベクター粒子へ効率的にパッケージングされた（図１９Ｆ）。これによって、Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴ改変が、ｒＢ／ＨＰＩＶ３粒子へのＲＳＶ Ｆの組み込みの劇的な増大を生じたことが確認された。さらに、これによって、組み込まれたＲＳＶ Ｆタンパク質が、真正のＲＳＶ粒子のものと外見的に同様の免疫学的に活性な表面スパイクで存在したことが示された。さらに、安定化された融合前ＤＳ Ｆタンパク質がまたビリオン表面で効率的に出現した。
ベクター粒子へのＲＳＶ Ｆ Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴのパッケージングの高い効率によって、これがベクター複製を減弱する可能性が惹起された。なぜなら、ビリオン表面は、効率性のために組織化されて、表面タンパク質についてのその能力が限られており、その結果表面タンパク質の組成物中の変化が減弱されると一般には仮定されるためであり、特に、改変されたＢ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴ ＲＳＶ Ｆタンパク質は、内部ビリオンタンパク質と相互作用すると考えられるベクターのＦタンパク質のＣＴまたはＴＭＣＴ領域を含んだからである。例えば、ベクターエンベロープ中へのＲＳＶ Ｆの効率的な組み込みが、ベクターＨＮおよびＦ糖タンパク質を置き代える場合があり、またはベクター成分の間の相互作用を妨害する場合もある（例えば、ビリオンアセンブリの間のベクターＦおよびＨＮ糖タンパク質と内部Ｍタンパク質との間、またはウイルス進入を効率的に開始するように相互作用しなければならないベクターＦとＨＮタンパク質との間）。驚くべきことに、ＲＳＶ Ｆ Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴを保有する全てのベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高い力価まで効率的に複製し、この高い力価はＴＭおよびＣＴに対して改変されていないＲＳＶ Ｆタンパク質を有するベクターのものとは識別可能であることが見出された（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ、図２０）。従って、ベクター粒子へのＲＳＶ Ｆの組み込み増大に起因した、低下の証拠はｉｎ ｖｉｔｒｏでの複製ではなんらなかった。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの効率的なベクター複製は、効率的なワクチン製造および臨床評価に必須であるので、このことは重要である。組み込みの高い有効性は、ＲＳＶ Ｆの発現をサイレンシングする変異について強力な選択圧を課すことはないことも示唆される。
ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによるＲＳＶ Ｆのキメラ型の細胞内発現は、ウエスタンブロットによって試験した。これは、感染４８時間後に回収したＶｅｒｏ細胞で評価した（図２１）。興味深いことに、Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴバージョンのＦは、両方とも効率的に発現され、実際、天然のＦ（すなわち、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ）よりもわずかに効率的に発現されるようであった（図２１Ａ）。さらに、ＤＳまたはＤＳ－Ｃａｖ１改変は、前に注記されたとおり（図１３Ｂ）、発現をさらに増大する（図２１Ｂ）ようであった。これらの効果は、相加的であるようであった、なぜならＢ３ＣＴまたはＢ３ＴＭＣＴを有するＤＳまたはＤＳ－Ｃａｖ１構築物は、ＤＳまたはＤＳ－Ｃａｖ１単独を有するものよりもさらに効率的に発現されたからである。この発現増大は、ワクチン目的には有利であり得る。なぜなら発現増大によって高レベルの抗原が得られるからである。注記したとおり、タンパク質遺伝子操作およびドメインスワッピングは、糖タンパク質の発現、プロセシングおよび安定性に負に影響する能力を有し、そのためこの生ベクターによって、ＤＳ、ＤＳ－Ｃａｖ１、Ｂ３ＣＴ、およびＢ３ＴＭＣＴ改変を有するこれらの糖タンパク質の効率的な発現は、容易には予測されなかった特性であった。
これらの構築物がＶｅｒｏ細胞で合胞体形成を誘導する能力をアッセイした。予期せぬことに、Ｂ３ＣＴ置換を保有するＲＳＶ Ｆは、超融合性の表現型を示し、一方で、Ｂ３ＴＭＣＴ置換を保有するものは、低融合性である天然のＦ（例えば、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ）に似ていた（図２２；また図３も参照のこと）。インキュベーションの延長の際、Ｂ３ＴＭＣＴは、細胞単層中で合胞体形成を誘導し、これはやはり機能的であって、コンホメーション的にインタクトであったことが示される。これらの知見によって、Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴ構築物の間で、Ｂ３ＴＭＣＴ構築物の方が、広範な合胞体形成および得られた細胞病理学が、細胞基質を成熟前に破壊することによってｉｎ ｖｉｔｒｏでおよびｉｎ ｖｉｖｏでベクター産生を低下し得、また成熟前の誘発に起因して感染性の安定性を妨害し得るおかげで好ましいことが示唆された。細胞単層中で合胞体を誘導した融合前ＤＳ型はなかった。これは全く予期せぬことではなかった。なぜなら、融合前Ｆタンパク質の安定化バージョンは、融合を媒介するのに必要な大きなコンホメーション変化を受ける能力が低いはずであるからである。これらの知見によって、融合前ＤＳ型のＲＳＶ Ｆが実際に、ベクター感染細胞の状況では実質的に安定化されたことが示唆される。
Ｂ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴ ＲＳＶ Ｆ構築物を発現するベクターの複製を、ハムスターで鼻腔内感染によって検査した（図２３）。非ＨＥＫ非最適化（非ＨＥＫ／非ｏｐｔ）であったＦ、またはＨＥＫおよびＧＡ－最適化（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ）であったＦを有するベクターを、空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターと比較して鼻甲介中で幾分かさらに弱毒化し、これによってインサートの弱毒化効果を図示する。空ベクターと比較した弱毒化の増大は、ウイルス脱落について低い値で証明された。これはまた、３日目および５日目の力価の比較によって証明された：空ベクターに関して、これらの値は匹敵したが、ＲＳＶ Ｆを保有するベクターについては、３日目の力価は、５日目の力価よりも低く、このことは、これらの構築物が、その最大力価に達するにはより長くかかることを示している）。Ｂ３ＣＴもしくはＢ３ＴＭＣＴ、またはＢ３ＣＴ（ＤＳ／Ｂ３ＣＴ）もしくはＢ３ＴＭＣＴ（ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ）との融合前Ｆ（ＤＳ）を発現するベクターは、鼻甲介では実質的に（そしてほとんどの場合は有意に）さらに弱毒化された（図２３Ａ）。これは、ベクター粒子へのＲＳＶ Ｆタンパク質の組み込みの弱毒化効果を反映する可能性が高い：この弱毒化効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは観察されなかった（図２０）。肺では、ＲＳＶ Ｆを発現する全てのベクターは実質的に、空ベクターと比較してさらに弱毒化された（図２３Ｂ）。低融合性Ｂ３ＣＴ構築物は、並行した安定化ＤＳ／Ｂ３ＣＴ構築物よりも鼻甲介および肺の両方で有意にさらに弱毒化されており、このことは、融合の増大が実際に、これらの条件下でｉｎ ｖｉｖｏで弱毒化されていた（すなわち、複製を妨害した）ことを示唆していることは注目すべきである。これが、ハムスターのような半許容的な宿主では証明された場合、ヒト宿主で実質的にさらに顕著である場合がある。弱毒化されなかったｗｔ ＲＳＶ（Ａ２）対照は、弱毒化されたベクターと比較して、鼻甲介では１００～１０００倍高い力価まで、および肺では１０００～１０，０００倍高い力価まで複製した。
ベクターの免疫原性は、追加された補体の有りまたは無しにおける６０％プラーク減少アッセイによるＲＳＶ中和抗体のためにハムスター血清を分析することによって決定した（それぞれ、図２４ＡおよびＢ）。Ｂ３ＣＴまたはＢ３ＴＭＣＴ改変を有するＦタンパク質を発現する全ての構築物は、補体の存在下で検出したＲＳＶ中和血清抗体のかなりの力価を誘導した（図２４Ａ）。融合前ＤＳ変異とＢ３ＣＴまたはＢ３ＴＭＣＴとを組み合わせた構築物は、ＤＳ変異なしの平行な構築物と比較して、ある程度高いレベルの中和抗体を生じた。補体の存在下でアッセイした場合（図２４Ａ）、弱毒化されたベクター構築物の全てが、非弱毒化ｗｔ ＲＳＶと比較して低い力価のＲＳＶ－中和抗体を誘導したが、注記したとおり、ｗｔ ＲＳＶは、Ｇ中和抗原のさらなる寄与という利点を有し、かつ弱毒化されたベクターよりも１００倍～１０，０００倍効率的に複製した。
補体なしで行ったアッセイのバージョンでは（図２４Ｂ）、３つのベクターが、これらの条件下で検出されたＲＳＶ－中和抗体、すなわち、Ｂ３ＴＭＣＴ Ｆを発現するもの、ならびにＢ３ＣＴおよびＢ３ＴＭＣＴ改変を含む融合前ＤＳ Ｆを発現するものを効率的に誘導した。Ｂ３ＴＭＣＴおよびＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ構築物は、ｗｔ ＲＳＶよりもいくぶんか高い品質のＲＳＶ中和血清抗体を誘導したが、この相違は、有意ではなかった。それにもかかわらず、この知見は、ベクターが２つのＲＳＶ中和抗原のうちの１つのみを発現した条件では顕著であって、ｗｔ ＲＳＶと比較して１０倍から１０，０００倍劣った効率で複製した（図２２）。Ｂ３ＴＭＣＴベクターと対照的に、Ｂ３ＣＴは、補体の非存在下でアッセイした場合、Ｂ３ＴＭＣＴと同様の効率でビリオン中に組み込まれた場合でさえ（図１８）、有意な抗体応答を誘導しなかった（図２４Ｂ）。同様に、ＤＳ／Ｂ３ＣＴはまた、Ｂ３ＴＭＣＴ、ＤＳよりも免疫原性が低かった（図２４Ｂ）。これによって、Ｂ３ＴＭＣＴは、Ｂ３ＣＴと比較してＲＳＶ Ｆの構造的にまたは抗原的に優れた形態であり得ることが示され、またこれは、Ｂ３ＣＴの超融合性表現型が、その発現および免疫原性をｉｎ ｖｉｖｏで低下したということであり得る。これらの研究によって、Ｂ３ＴＭＣＴは、ＲＳＶ Ｆの免疫原性を大きく向上したことが明確に示された。
ベクターの防御的有効性を評価するために、免疫されたハムスターに、１０６ｐｆｕのｗｔ ＲＳＶを免疫後３０日で鼻腔内チャレンジした（図２５）。免疫原性データと一致して、Ｂ３ＣＴは、鼻甲介および肺の両方で防御性が劣っていた。Ｂ３ＴＭＣＴは、ＲＳＶチャレンジに対してさらに防御性であって、ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴは、ベクター構築物の最も防御性なもの（ただし相違は小さい）であって、免疫されたハムスターのうち１匹だけが、鼻甲介で検出可能なＲＳＶ複製を示しており、全てが肺で完全に防御されており、非弱毒化ｗｔ ＲＳＶ対照によって付与されたのと同様の防御を提供した（図２４）。ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ構築物とｗｔ ＲＳＶとの間の防御有効性の匹敵するレベルは特に顕著であった、なぜならｗｔ ＲＳＶは、ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴよりも２～４対数力価高く複製し、ＦおよびＧ ＲＳＶ中和抗原の両方を発現し、かつ全てのＲＳＶタンパク質を、細胞免疫のための潜在的な抗原として発現した。これによって、ＲＳＶ Ｆ（ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ）のパッケージングされた融合前型を有するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターは、極めて高い免疫原性および防御性であることが示される。
ハムスターにおけるｒＢ／ＨＰＩＶ３－ＲＳＶ－Ｆ構築物の安定性。臨床研究におけるＭＥＤＩ－５３４の遺伝的不安定性を伴う経験を考慮して（Ｙａｎｇら ２０１３ Ｖａｃｃｉｎｅ ３１：２８２２～２８２７）、重要な問題は、ＲＳＶ Ｆインサートの発現が、ｉｎ ｖｉｖｏで複製の間に安定なままであったか否かであった。図８、１４および２３におけるハムスターで解析された１２の異なるｒＢ／ＨＰＩＶ３－ＲＳＶ－Ｆ構築物の全ての遺伝的安定性をアッセイした。感染後３日目および５日目で収集した肺および鼻甲介の組織ホモジネートを、ウイルスプラーク中のＲＳＶ Ｆタンパク質およびベクタータンパク質の発現を同時に検出し得る蛍光二重染色プラークアッセイによって解析した（図２６）。このアッセイでは、ＲＳＶ Ｆ発現は、赤色蛍光によって可視化されたＦ特異的抗体で検出し、ＰＩＶ３抗原の発現を、緑色蛍光によって可視化された、ＨＰＩＶ３－特異的な抗血清（精製されたＨＰＩＶ３ビリオンで超免疫されたウサギ由来）で検出した。融合されたとき、ＲＳＶ Ｆの発現を維持したｒＢ／ＨＰＩＶ３プラークは、黄色に見えたが、ＲＳＶ Ｆインサートの発現を失っているプラークは緑のままであった（図２６）。この解析によって、ＲＳＶ Ｆインサートは一般的にハムスターでの複製の間安定であることが示された（図２６）。ほとんどのサンプルに関して、より高く希釈したウェルで回収されたウイルスの全て（個々のプラークが識別される）が、黄色のプラークとして見られ、従って、ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現した。他の検体のサブセットでは、プラークのサブセットにおけるＲＳＶ Ｆの発現の散在性の喪失があり、それによって、わずかな率の緑のプラークが生じた（通常は＜１２％）。さらに、ＲＳＶ Ｆの発現の喪失は、時間とともに漸増したという証拠はなく；言い換えれば、３日目に比較して５日目からの検体の発現の喪失の頻度が高いことは無かった。単一の場合に、３日目からの単一の鼻甲介検体中での発現の喪失が高レベルであったが（１４％の残りの発現、９番の群におけるハムスター５１１番）、同じ動物由来の肺検体は１００％発現を有した。一般には、これによって、ＲＳＶ Ｆインサートの発現は、試験された構築物の全てについて実質的に安定であることが示された。不釣合いに不安定となった構築物は出現しなかったことも示された。従って、高レベルのＲＳＶ Ｆの発現および合胞体形成、またはＲＳＶの安定化型の発現、またはｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのために弱毒化されたベクター粒子への改変されたＦの高レベルの組み込みが、ＲＳＶ Ｆの発現がサイレンシングされた変異体の出現を支持することは無いようであった。
図１～図２６で記載され評価された１２ ｒＢ／ＨＰＩＶ３構築物をさらに、潜在的な温度感受性表現型について評価した。各々のベクターについて、等しいアリコートを、メチルセルロース下で３２、３５、３６、３７、３８、３９、および４０℃でプラークにした（図２７）。プラーク形成における１００倍以上の低下は、その温度での温度感受性の指標であった。空のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターは、４０℃で温度感受性（ｔｓ）であったが（図２７）、ＨＰＩＶ３もＢＰＩＶ３もこの温度でｔｓではなかった。これによって、キメラ化（すなわち、ＢＰＩＶ３骨格へのＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮ遺伝子の置き換え）は、わずかなｔｓ表現型をもたらしたことが示される。さらにＲＳＶ Ｆインサートを含んだあらゆるベクターは、３７～３８℃でｔｓであって、これによって追加の遺伝子の存在によってｔｓ表現型が増強されたことが示される。最もｔｓであった構築物は、Ｂ３ＣＴ、Ｂ３ＴＭＣＴ、およびＤＳ／Ｂ３ＣＴであった（図２７において、７、８、１２番）。これは、ウイルス粒子へのＲＳＶ Ｆのパッケージングがこの表現型を増強したことを意味した。１つの可能性のある説明は、ベクター中のＲＳＶ Ｆの存在が、その粒子を温度上昇に対していくぶんか不安定でかつ影響を受けやすくさせたということであったろう。ＲＳＶ Ｆの効率的なパッケージングを有する残りの構築物、すなわち、ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ（図２７における構築物１３）は、わずかにｔｓが劣り、これによって、ＤＳおよびＢ３ＴＭＣＴに関連する低融合性の表現型が、不安定性をある程度まで改善したことが示唆されている。まとめると、これらの知見によって、構築物の設計次第で、弱毒化を付与するか、または弱毒化を軽減する手段が提供され、いずれにしても、ワクチンウイルスを設計するのに重要な情報が提供される。
アカゲザルにおける選択されたｒＢ／ＨＰＩＶ３－ＲＳＶ－Ｆ構築物の評価。ベクターの複製、免疫原性および防御有効性に対する「ＤＳ」および「Ｂ３ＴＭＣＴ」変異の効果をさらに検討するために、２つの候補（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳおよびＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ）を、アカゲザルでの複製および免疫原性について評価した（図２８）。未改変のＲＳＶ Ｆを有するＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（非ＨＥＫ／非ｏｐｔ）を、比較のためのベースライン対照として含んだ。霊長類における研究の費用および倫理的懸念を考慮して、限られた数の構築物を評価した。サルを、組み合わせたＩＮおよび気管内（ＩＴ）経路によって、全部で２×１０６のＴＣＩＤ５０の各々のｒＢＨＰＩＶ３ベクターを使用して免疫した。鼻咽頭スワブおよび気管洗浄液サンプルを示した日に収集して（図２９）ウイルス脱落を複製の指標としてモニターした。血清を０、１４、２１、および２８日目に収集した。全ての動物を２８日目に、ｗｔ ＲＳＶをＩＮおよびＩＴを使用して、１部位あたり１０６ｐｆｕでチャレンジして、血清サンプルを３５および５６日目に収集した。
非ＨＥＫ／非ｏｐｔおよびＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳウイルスは、上気道および下気道において１ｍｌあたり約１０５および１０３のＴＣＩＤ５０単位のピーク力価まで複製した（それぞれ、図２９Ａおよび図２９Ｂ）。対照的に、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ構築物はアカゲザルの上気道および下気道の両方で劇的にさらに弱毒化された（図２９Ａおよび図２９Ｂ）。これによって、Ｂ３ＴＭＣＴは、ｒＢ／ＨＰＩＶ３構築物に対する実質的な弱毒を付与することが示されたが、ＤＳ変異は、有意な弱毒を付与するとは思われなかった。従って、ハムスターで弱毒を付与するＢ３ＴＭＣＴ改変の軽度の傾向（図２３）は非ヒト霊長類では実質的に大きかった。
注記したとおり、血清を０、１４、２１、２８、３５、および５６日目に収集した。ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターに特異的な血清抗体を、ＨＰＩＶ３に対する６０％プラーク減少アッセイによって解析した（図３０）。これによって、高度に弱毒化されたＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ構築物に対するベクター特異的な中和血清抗体応答は、非ＨＥＫ／非ｏｐｔおよびＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ構築物と比較して遅く、かつ幾分か低下されたことが示された。これは、抗原負荷の低下が免疫原性を低下するという予測と一致している。２８日後、力価は、さらに同様になり、予想どおり、２８日目のＲＳＶチャレンジからのベクター特異的な免疫をブーストすることはなかった（なぜならＲＳＶはなんらベクター抗原を含まなかったからであった）。
ＲＳＶ－特異的な中和血清抗体応答は、補体の有りおよび無しで行ったプラーク減少アッセイで定量された（それぞれ、図３１および３２）。補体の存在下でのアッセイによって、ＲＳＶ－中和血清抗体がより急速に、かつ他の２つの構築物についてよりもＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ構築物に対する応答で有意に高い力価まで誘導された（図３１）。ＲＳＶ－特異的な中和血清抗体のより大きい誘導は、注目すべきであって、かつ驚くべきである。なぜならこの構築物は、複製においてさらにいっそう高く制限されたからであった（図２９）。ハムスターで以前にアッセイされた時（図２４）、この構築物は、統計学的に有意ではなかったＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳと比較して明白な増大を有した：非ヒト霊長類で観察されたより大きい増大は、ハムスターモデルが、これらのヒトおよびウシ／ヒトウイルスについて感度の劣るモデルであるという概念と一致している。例えば、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ構築物に対する応答におけるアカゲザルでのＲＳＶ－中和血清抗体のより大きい誘導がまた、アッセイを、補体の非存在下で行って２８日目に高品質の抗体を測定した時、観察された：実際に、他の２つの構築物に対するこの構築物についての力価の相違は、補体の存在下で観察されたものよりも実質的に大きかった（図３２）。まとめると、これらの結果によって、ＤＳ変異は、ＲＳＶ中和血清抗体の量を実質的に増大しない（図３１）が、品質は増大した（図３２）ことが示されたが、Ｂ３ＴＭＣＴ改変のさらなる添加は、ＲＳＶ－中和血清抗体の量（図３１）および質（図３２）の両方を劇的に増大した。
２８日目に投与されたＲＳＶチャレンジウイルスは、全てのベクターによって完全に制限され、感染性チャレンジＲＳＶは、任意の動物由来の鼻咽頭のスワブおよび気管洗浄液サンプルから回収される場合があり、従って、この実験は、これらのウイルスの比較の特性にさらなる情報を提供しなかった。実験動物における短期ＲＳＶチャレンジに対する完全な防御が時に観察される。なぜならこれらのモデルにおけるＲＳＶ複製の半許容的な性質によって、複製の制限が容易になるからである。ＲＳＶ特異的な抗体応答は継続して、２８日後に増大したが、この応答が一次感染またはチャレンジに起因したか否かは明確ではない。
蛍光二重染色プラークアッセイを使用して、ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現のために、ピーク脱落の時間であった、４、５および６日目にアカゲザルから回収したウイルスを解析した。データのまとめを図３３に示す。この解析によって、ＲＳＶ Ｆインサートが一般的に、サルでの複製の間に安定であることが示された。その結果は、ハムスターの研究について図２６に示される結果と極めて同様であった。アカゲザル由来のほとんどのサンプルに関して、ほぼ全ての回収されたウイルスが、黄色のプラークとして見られ、従って、ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現した。いくつかの検体でのＲＳＶ Ｆ発現の散在性の喪失があった（所定の検体における回収されたプラークのうち典型的には１０％未満）。発現の喪失が時間と共に有意に増大したという証拠はなく、早期の時点では、時折、発現の喪失の証拠が観察されたが、同じ動物から後の時点では観察されなかった。特定の構築物が別の構築物に対してＲＳＶ Ｆ発現の不釣り合いに大きい喪失と関連していたという証拠もなかった。例えば、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／Ｂ３ＴＭＣＴの発現が、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターについて大きく減弱されたにもかかわらず、ＲＳＶ Ｆの発現が失われたウイルスの選択の増大という証拠はなかった。
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＧＳ）最適化を有するＲＳＶ Ｆのエクトドメイン（アミノ酸１～５１３、ＴＭおよびＣＴドメインを欠いている）を発現し、かつＨＥＫアサインメントおよびＤＳ－Ｃａｖ１改変を含むｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターもまた生成された。エクトドメインを、そのＣ末端で三量体安定化フォールドオン配列が続く連結された４アミノ酸、すなわち、構築物１９番に融合した（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／［１－５１３］Ｆｏｌｄｏｎ）。この形態の融合前ＲＳＶ Ｆは、マウスおよびアカゲザルにおいてサブユニットワクチンとして以前に評価された（ＭｃＬｅｌｌａｎら．２０１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２：５９２～５９８）。このＲＳＶ Ｆタンパク質は、構築物８番（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／Ｅｃｔｏ）に似ているが、ただしＧＳ最適化に起因するさらに効率的な翻訳の改善、ＤＳ－Ｃａｖ１改変に起因する優れた免疫原性、およびフォールドオン安定化ドメインに起因するより大きい三量体安定性を伴う部分的に分泌された型として、発現されるべきである。この構築物を使用して、分泌されたＤＳ－Ｃａｖ１型が、膜アンカー型、すなわち、１６番（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１）およびビリオン組み込み型、すなわち１８番（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ）と比較して、どの程度免疫原性であるかを比較する。
この研究からのポイント：（１）ハムスターモデルは、便利だが、種々の構築物を使用した、複製、発現および免疫原性における変化に対していくらか非感受性である場合があり、これらの構築物と関連する効果、例えば、弱毒化および免疫原性が、これらのワクチン構築物を意図しているヒト宿主において実質的に大きい場合がある。例えば、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ構築物における３ＴＭＣＴ改変の存在は、ハムスターモデルにおいて弱毒化に適度の増大しか付与しないが（図２３）、これは真正のヒト宿主とさらに密接に関係するアカゲザルで実質的にさらに弱毒化されていた（図２９）。さらに、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴと他の構築物との間のＲＳＶ－中和抗体の免疫原性における相違は、その構築物がアカゲザルにおいて実質的にさらに弱毒化されたにもかかわらず（図２９）、ハムスター（図２４）においてよりもアカゲザルで実質的に大きかった（図３１）。従って、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴの１ｐｆｕあたりの固有の免疫原性は、ハムスターにおいてよりもアカゲザルでかなり大きいことがみられ、従って、ヒトでは同様に大きい場合がある。ハムスターにおけるこの見かけの非感受性によって、例えば、ハムスターモデルが、ＲＳＶ Ｆ発現における１６倍の増大と関連する免疫原性の相違を確実には提供しなかった理由が説明される（図９）。ヒト使用のためのコドン最適化が、霊長類に比較したハムスターモデルにおける免疫原性の低下に寄与する場合がある、霊長類細胞（およびヒトのワクチン接種された人）と比較してハムスターにおける発現では匹敵する増大をもたらすことがない場合もあることも注目されるべきである。（２）別のテーマは、ＲＳＶ Ｆによって誘導された合胞体形成の量を減らすための望ましい状況であった。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、合胞体形成は、単層培養物中で複製を制限することはないようであったが、製造に使用されたマイクロキャリア細胞培養系における因子になる可能性もあり、そのため、合胞体形成を制御することは賢明なようである。構築物のほとんどでは、ＨＥＫアサインメントが存在し、これは、合胞体形成を強力に抑制した。ＤＳおよびＤＳ－Ｃａｖ１構築物は、ＨＥＫアサインメントと同様に、また合胞体形成を強力に抑制し、それによって、予測されない利益を提供した。上方制御された合胞体形成と関連した１つの構築物、すなわちＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／Ｂ３ＣＴは、複製（図２３）および免疫原性（図２４）の低下をハムスターで示し、これによって、合胞体形成の増大が、ｉｎ ｖｉｖｏで有害である場合もあることが示される。これは、霊長類宿主ではさらに顕著である場合もある。従って、ＧＳ－ｏｐｔ、ＨＥＫ、ＤＳまたはＤＳ－Ｃａｖ１、およびＢ３ＴＭＣＴの組み合わせは、合胞体形成の２つの抑制因子（ＨＥＫおよびＤＳ－Ｃａｖ１）の状況では、および超融合性ではなかったパッケージングシグナルの存在下では（Ｂ３ＴＭＣＴ）、最高レベルのＲＳＶ Ｆの発現（ＨＥＫプラスＧＳ－ｏｐｔ、さらに、Ｆタンパク質蓄積の増大を提供すると思われた融合前Ｆタンパク質の安定化）をもたらす組み合わせとして特定された。（３）２つの特徴（すなわちＢ３ＴＭＣＴおよびＤＳ変異）は独立して、高品質のＲＳＶ中和血清抗体の実質的な誘導を伴っていた。アカゲザル研究によって、Ｂ３ＴＭＣＴは、ヒトにおける予測されるワクチン能力に関連して、霊長類宿主においてこれらの２つの因子のさらに重要なものであることが示唆された（図３２）。重要なことに、Ｂ３ＴＭＣＴ改変はまた、ＲＳＶ－中和血清抗体応答の量を劇的に増大した（図３１）。（４）予期せぬことに、かつ偶発的に、ＲＳＶ Ｆの発現およびパッケージングを改善した特徴は、二重免疫蛍光アッセイによって評価した場合、ＲＳＶ Ｆの発現の喪失について重要な選択圧を付与することは無い様であった。既に注記したとおり、ＲＳＶ Ｆインサートの発現の喪失は、ＭＥＤＩ－５３４で問題であったが、本研究では多数の特徴を使用して、ＭＥＤＩ－５３４で使用されなかった融合を下方制御し、これは、ＲＳＶ Ｆインサートを安定化するのに重要な役割を果たした場合もある。さらに、パッケージングシグナルの２つの重複するセットを評価することによって、超融合性であったものを特定して回避すること、ならびに実質的に融合が低下したものを特定して選択することが可能であった。（５）免疫原性を増大するのにおける重要な因子として特に出現したＢ３ＴＭＣＴ改変。ＨＥＫ、ＧＡ－ｏｐｔまたはＧＳ－ｏｐｔ、およびＤＳまたはＤＳ－Ｃａｖ１改変は二次的な改善として出現した。Ｂ３ＴＭＣＴは、注記されたとおり、アカゲザルでベクターを強力に弱毒化する効果を有した。高度に弱毒化されたｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの状況でのこの改変の使用は、実質的に過剰弱毒化されると思われたベクターを生じた。しかし、逆遺伝学を使用して、Ｂ３ＴＭＣＴ Ｆタンパク質（所望により、ＨＥＫ、プラスＧＡ－またはＧＳ－ｏｐｔ、プラスＤＳまたはＤＳ－Ｃａｖ１改変を有する）を、弱毒化の少ないベクター骨格、例えば、野性型ＨＰＩＶ１、２、もしくは３、または１つまたはそれ以上の公知の安定化された弱毒化変異を保有するバージョンと組み合わせて、弱毒化の少ない構築物が作製される。ｒＢ／ＨＰＩＶ３中のＢ３ＴＭＣＴ構築物は、極めて過剰弱毒化されているにもかかわらず、極めて高度に免疫原性であったので、１０倍から１００倍よく複製するこのタンパク質を発現する構築物は、適切に弱毒化され、および実質的にさらに免疫原性でなければならない。
ＲＳＶ ＦのＯＲＦおよびタンパク質の改変バージョンを発現する組み換えｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを使用する追加のアッセイ
追加のアッセイを行って、以下を評価した：（ｉ）ＤＳ融合前安定化変異およびＢ３ＴＭＣＴパッケージングシグナルを含む構築物のＧＳ－ｏｐｔバージョン、ならびに（ｉｉ）ＤＳ変異と組み合わされた２つの腔充填変異体Ｓ１９０ＦおよびＶ２７０Ｌを含む、ＤＳ－Ｃａｖ１融合前安定化変異。アッセイされたＦタンパク質はまた、２つのＨＥＫアミノ酸アサインメントを含み、これが上記のようなＡ２株の初期継代（ＨＥＫ－７と呼ばれる）のものと同一のアミノ酸配列を生じる。これらのアッセイによって以下が示される：
１．ＤＳ－Ｃａｖ１およびＢ３ＴＭＣＴは独立して、ｉｎ ｖｉｖｏ防御に最も関連すると考えられる、有意なレベルの補体依存性ＲＳＶ中和抗体を誘導する能力を付与する。
２．ＤＳ－Ｃａｖ１プラスＢ３ＴＭＣＴの組み合わせは、免疫原性のさらなる増大を生じる。
３．２つの最も免疫原性の構築物は、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（図５３、第７群）およびＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（第１０群）であって、これは、コドン最適化の供給源でのみ異なり、ＧＳ－ｏｐｔは、最も免疫原性であるようであった。
４．ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（第７群）およびＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（図５３、第１０群）は、ペアワイズ比較では統計学的に識別不能であったが、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（図５３、第１０群）の方は、ｗｔ ＲＳＶよりも有意に免疫原性であった。これらの知見によって、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（第１０群）は、特に補体を添加する必要性なしで検出される高度に効率的な中和抗体について、ハムスターモデルでは、最も免疫原性の構築物であり（図５３）、従って、ＧＳ－ｏｐｔおよびＤＳ－Ｃａｖ１によるさらなる改変は、免疫原性を増大するようであった。これはまた、ハムスターチャレンジ研究では最も防御的構築物であった。
５．大型プラーク表現型および弱毒化を付与する変異を獲得するためのｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターについての性向を、ベクターＨＮタンパク質中の３つのヌクレオチドおよび２つのアミノ酸変異によって本質的に排除した。
６．ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴインサートを、第１の遺伝子位置（プレ－Ｎ）から発現して、Ｖｅｒｏ細胞で効率的に複製した構築物を、高い割合のＲＳＶ Ｆ発現を有する調製物中で得られ、ＲＳＶ Ｆタンパク質が効率的に発現される。
動物研究のまとめ。図３５によって、示したとおり、ハムスターでの２つの異なる研究でおよびアカゲザルでの２つの異なる研究で評価した構築物を示す：「第１のハムスター研究」は、図８～９、１４～１６、および２３～２６を包含し；「第１ＮＨＰ研究」は、図２９～図３３を包含し；「第２ハムスター研究」は、図５１～図５４を包含し；「第２のＮＨＰ研究」は、図５５および５７を包含する。
ＧＡ－ｏｐｔウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏのマルチサイクル複製。図４６および図４７は、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１構築物のマルチサイクル複製を、それ自体の上に、またはＢ３ＴＭＣＴパッケージングシグナル（図３５の構築物１３番および１５番）をさらに追加して、空ベクターと比較して図示する。これは、ワクチン製造のために使用した細胞基質である、アフリカミドリザル腎臓Ｖｅｒｏ細胞（図４６）において、およびＶｅｒｏ細胞とは異なり、典型的には、Ｉ型インターフェロンを発現するためのウイルス感染によって誘導される、一般的な実験室細胞株である、アカゲザル腎臓ＬＬＣ－ＭＫ２細胞（Ｂ）において行った。この実験によって、２つのＤＳ－Ｃａｖ１－含有構築物（Ｂ３ＴＭＣＴの有りまたは無し）が効率的に、かつお互いに対して同様に複製し、空ベクターと比較して適度に弱毒化されたことが示された。この適度の弱毒化にかかわらず、両方のＤＳ－Ｃａｖ１－含有構築物が、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌより高い力価まで複製した。このパターンの適度の弱毒化は、異なるバージョンのＲＳＶ Ｆを発現する他のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターで得られた結果と極めて類似していた（例えば、図７、１２、および２０）。従って、これらの結果によって、これらの改変されたインサートを保有するｒＢ／ＨＰＩＶ３が、ワクチン製造にとって十分満足である効率的な方式で複製することが示された。
ＧＳ－ｏｐｔウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏでのマルチサイクル複製。図４８は、さらなる追加のＤＳ－Ｃａｖ１（１６番）、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（１８番）の組み合わせ、およびＤＳ－Ｃａｖ１の組み合わせ、エクトドメイン１～５１３、およびエクトドメインオリゴマー化を生成するためのＣ末端「フォールドオン」ドメイン（１９番）を有するバージョンと比較したＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ骨格（図３５の構築物５番）のマルチサイクル複製を比較のための空ベクターとともに図示する。Ｖｅｒｏ（図４８Ａ）およびＬＬＣ－ＭＫ２（Ｂ）細胞における評価によって、種々の形態のＲＳＶ Ｆを発現するベクターが、極めて類似の反応速度論および収率で複製し、空ベクターと比較して適度に弱毒化されることが示された。それらは全てが、細胞培養物中で１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍＬより高い力価まで複製した。これらの結果によって、これらの改変されたインサートを保有するｒＢ／ＨＰＩＶ３が、ワクチン製造に十分満足である効率的な方式で複製することが示された。
ＧＡ－およびＧＳ－ｏｐｔウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるマルチサイクル複製。図４９は、ＧＡ－最適化またはＧＳ－最適化であることで異なる構築物の対のマルチサイクル複製を図示する：具体的には：ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１対ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１（頂部パネル、図３５由来の、それぞれ構築物１６番および１３番）、ならびにＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ対ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（底部パネル、図３５由来、それぞれ、構築物１８番および１５番）。構築物の２つの対を、各々Ｖｅｒｏ細胞（図４９Ａ、Ｃ）およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞（Ｂ，Ｄ）で評価した。ＧＳ－ｏｐｔ構築物は時に、特にはインキュベーションの最初の３～４日の間、ＧＡ－ｏｐｔ構築物よりもわずかに、より効率的に複製した（例えば、図４９Ｃおよび ４９Ｄ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＲＳＶ Ｆの発現。図５０は、Ｖｅｒｏ細胞およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞におけるｒＢ／ＨＰＩＶ３構築物によるＲＳＶ Ｆおよびベクタータンパク質の発現を図示する。これによって、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ（図５０，レーン２；図３５、構築物３番）対ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ（図５０、レーン３；図３５、構築物５）による発現を比較する：実施例１（図５）に記載の結果と一致して、ＧＳ－最適化は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のいくらか大きい発現が生じた。ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ構築物をまた、さらに、ＤＳ－Ｃａｖ１（図５０、レーン３；図３５、構築物１６番）、またはＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（図５０、レーン５；図３５、構築物１８番）、またはＤＳ－Ｃａｖ１／（１－５１３）Ｆｏｌｄｏｎ（図５０，レーン８；図３５、構築物１９番）を含んだバージョンと比較した。また、比較のために含まれるのは、ｗｔ ＲＳＶ感染した細胞（図５０，レーン６）またはモック感染した細胞（レーン７）であった。この結果によって、各々のＧＳ－ｏｐｔ構築物が、効率的なＲＳＶ Ｆの発現を指向したことが示され、実際、ｗｔ ＲＳＶが発現したよりもはるかに多くのＲＳＶ Ｆを発現した（図５０、レーン６）。全長ＤＳ－Ｃａｖ１ Ｆタンパク質をコードする３つのＧＳ－ｏｐｔ構築物を感染させた細胞（図５０、レーン４、５、および８）は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のＦ０前駆体のいくぶんか大きい蓄積を有し、これによって、その融合前安定化が、切断の効率をわずかに低下し得ることが示唆された。しかし一般には、各々の構築物は、ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するのに極めて効率的であった。融合前Ｆｏｌｄｏｎ構築物、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／（１－５１３）Ｆｏｌｄｏｎ（図５０、レーン８）は、培地中にごく部分的に分泌され（図５０Ａ、下側パネル）、その分泌型は全体的に、切断されたＦ１鎖であったが（図４Ａ、下部パネル、レーン８）、全ての細胞会合型は、未切断のＦ０（図４Ａ、上側パネル、ＢおよびＣ、レーン８）。ＲＳＶ Ｆの他の試験された形態で、培地上清中で検出されたものはなく、このことはそれらが分泌されなかったことを示した。ＤＳ－Ｃａｖ１／（１－５１３）Ｆｏｌｄｏｎ構築物の効率的でない切断および分泌は予想されなかった。なぜなら、この三量体化ドメインは、精製されたＦタンパク質を調製するために以前に首尾よく使用されているからである（ＭｃＬｅｌｌａｎら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｎｏｖ １；３４２（６１５８）：５９２～８．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４３２８３）。これによって、ベクターの構築物による外来タンパク質の発現が、予測不能である場合もあることが図示され、ただし本明細書における複数の構築物の詳細な評価は、多数の適切な、首尾よい構築物の特定につながる包活的な評価を提供する。
ハムスターの研究。Ｂ３ＴＭＣＴ、ＤＳ、およびＤＳ－Ｃａｖ１のさらなる追加を含んだ多数のＧＡ－ｏｐｔおよびＧＳ－ｏｐｔ構築物（この構築物は、図３５において、「第２ハムスター研究」として特定される）を、複製の効率（図５１）、ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現の安定性、ＲＳＶ－中和血清抗体の刺激（図５２および５３）、およびＲＳＶチャレンジに対する防御有効性（図５４）についてハムスターで評価した。
ハムスターでの複製。ＧＡ－ｏｐｔおよびＧＳ－ｏｐｔ構築物を、ハムスターの上気道（鼻甲介）および下気道（肺）での複製について評価した（図５１）。鼻甲介では、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／Ｂ３ＴＭＣＴ（第５群）およびＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ（第６群）は、他よりも制限された。肺では、Ｂ３ＴＭＣＴ（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／Ｂ３ＴＭＣＴ、第５群、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ、第６群、およびＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ、第７群）を有するＧＡ－ｏｐｔ構築物を、さらに制限した。同様に、Ｂ３ＴＭＣＴを有するＧＳ－ｏｐｔ構築物、すなわち、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（第１０群）をまた、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１（第９群）よりも弱毒化した。これらの観察によって、Ｂ３ＴＭＣＴは、弱毒化のレベルを増大することが示唆された。さらに、ＧＡ－ｏｐｔ構築物は、ＧＳ－ｏｐｔ構築物よりも弱毒化されるようであった。例えば、ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴのＧＳ－ｏｐｔ構築物、すなわち、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１（第９群）およびＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（第１０群）は、ＬＲＴにおいて、５．０および４．２ Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｇという平均ピーク力価（等価なＧＡ－ｏｐｔ構築物の平均力価、すなわち、４．０および３．４ Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｇ（第４群および第７群）よりも高かった）まで複製した。これによって、ＧＳ－ｏｐｔ ＲＳＶ Ｆインサートは、ＧＡ－ｏｐｔ ＲＳＶ Ｆよりも弱毒化が劣ったことが示唆された。
ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現の安定性。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの複製の間のｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによるＲＳＶ Ｆ発現の安定性を、免疫後５日目で回収した免疫されたハムスターの鼻甲介および肺のサンプルを分析することによって、二重染色プラークアッセイで評価した。ほとんどのサンプル（１０７のうち９２）は、ＲＳＶをやはり発現している９０％超の複製されたベクターを有した；１０７のうち６つが、８９～８０％のＲＳＶ Ｆを発現するベクターを有した；１０７のうち９が、７９％未満のＲＳＶ Ｆを発現する複製されたベクターを有した；７つのサンプルのみが、５０％超のＲＳＶ Ｆ発現を失っているベクターを有した。ＲＳＶ Ｆ発現を失っている５０％超のベクターを有するこれらの７つのサンプルのうち、４つが、ＧＡ－ｏｐｔ構築物、３つがＧＳ－ｏｐｔ構築物であった。ＧＡ－ｏｐｔ、またはＧＳ－ｏｐｔ、またはＤＳ、またはＤＳ－Ｃａｖ１、またはＴＭＣＴが、不安定性の何らかの特定の増大と関連するという証拠はなかった。個々の調製物の間の不安定性の種々のレベルは、特定の構築物に大きく依存している散在性の変異を反映し、したがって、各々構築物のいくつかの独立した調製物の評価は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現の割合が極めて高い１つまたはそれ以上を特定する可能性が高い。
ＲＳＶ－中和血清抗体の力価。ＲＳＶ中和血清抗体力価は、モルモット補体を添加する（図５２）か、または補体の存在なしで（図５３）ＲＳＶ中和アッセイによって決定した。補体を追加して行ったアッセイは、通常は、ＲＳＶおよびＨＰＩＶ３中和アッセイについて使用する。なぜなら、補体が、そうでなければｉｎ ｖｉｔｒｏで中和されない場合もある、抗体に対するウイルス溶解および立体障害能力を付与し得るおかげで、このアッセイによってウイルス特異的な抗体の鋭敏な検出が可能になるからである（Ｙｏｄｅｒら Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ７２：６８８～６９４、２００４）。対照的には、補体の非存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＳＶを中和する抗体は、防御に最も関連することが示唆され（Ｙｏｄｅｒら Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ７２：６８８～６９４，２００４）、以前の研究は、ＲＳＶチャレンジに対する、より高いレベルの防御と関連していた（Ｌｉａｎｇら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８９：９４９９～９５１０、２０１５）。追加の補体のｉｎ ｖｉｔｒｏ依存性で中和する抗体は、「高品質」であり、かつ質的に優れた免疫原性の指標であると考えられる。
補体依存性アッセイ（図５２）では、ＲＳＶ Ｆを発現する全てのｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターは、劣った免疫原性のＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ／（１－５１３）Ｆｏｌｄｏｎ構築物を除いて高い力価のＲＳＶ中和抗体を誘導した。ＧＳ－ｏｐｔ構築物は、ＧＡ－ｏｐｔ構築物のそれらの対応物よりもＲＳＶ血清中和抗体の高い力価を誘導した（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１については１１．０ Ｌｏｇ２ ＰＲＮＴ６０、（第９群） 対 ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１（第４群）について１０．２ Ｌｏｇ２ ＰＲＮＴ６０；ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴについて１１．８ Ｌｏｇ２ ＰＲＮＴ６０、（第１０群） 対 ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴについて１０．４ Ｌｏｇ２ ＰＲＮＴ６０、（第７群））。補体依存性アッセイ（図５２）では、ｗｔ ＲＳＶ（ゴールデンスタンダード）程度に統計学的に免疫原性であった３つの構築物は、ＧＳ－ｏｐｔ構築物ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ（第８群）、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１（第９群）、およびＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（第１０群）であったことは注目に値することであった。
補体依存性アッセイ（図５３）では、天然型のＲＳＶ Ｆ（非ＨＥＫ／非ｏｐｔおよび ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ）を発現するベクターは、実施例１由来の結果を確認および拡張する、検出可能なＲＳＶ中和抗体を誘導しなかった。融合前安定化変異（ＤＳ、ＤＳ－Ｃａｖ１）およびパッケージングシグナルＢ３ＴＭＣＴは、高品質のＲＳＶ中和抗体の免疫原性を独立して増大した（例えば、Ｂ３ＴＭＣＴの非存在下におけるＤＳおよび／またはＣａｖ１を有する構築物は、第３群、４群および９群で例証されるが、ＤＳ／Ｃａｖ－１の非存在下におけるＢ３ＴＭＣＴを有する構築物は、第５群で例証される）。融合前安定化変異プラスＢ３ＴＭＣＴの組み合わせは、免疫原性の追加的改善を有し、この改善は、ＧＡ－ｏｐｔおよびＧＳ－ｏｐｔ構築物（例えば、第６、７および１０群）で観察された。補体依存性アッセイでは、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ構築物（第１０群）は、低い力価（６．８ Ｌｏｇ２ ＰＲＮＴ６０）を誘導したが、有意に低くはなかったそのＧＡ－ｏｐｔ対応物 ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（第７群）を除いて任意の他のベクターによって誘導されたよりも有意に高い力価のＲＳＶ－中和血清抗体（７．６ Ｌｏｇ２ ＰＲＮＴ６０）を誘導した。しかし、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ構築物（第１０群）によって誘導された抗体力価は（ただし、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（第７群）は違うが）、ｗｔ ＲＳＶ（１２群）の抗体力価よりも有意に高く、従って、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ構築物（第１０群）は、高い品質のＲＳＶ中和抗体についてベクターおよびｗｔ ＲＳＶの間で最も免疫原性であった。
ＲＳＶチャレンジ。免疫されたハムスターに、ｗｔ ＲＳＶをＩＮチャレンジして、防御効率を評価した（図５４）。図５４に示されるとおり、全てのＲＳＶ Ｆ発現ベクターが（ＤＳ－Ｃａｖ１／（１－５１３）Ｆｏｌｄｏｎ構築物を除いて）、ＵＲＴ（図５４Ａ）およびＬＲＴ（図５４Ｂ）における有意な防御を誘導した。ＤＳ－Ｃａｖ１／（１－５１３）Ｆｏｌｄｏｎによる防御の欠失は、ＲＳＶ血清中和アッセイ（図５２および図５３）で示される、その劣った免疫原性と一致していた。ｗｔ ＲＳＶでもたらされた無菌免疫と比較して、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴは、全ての試験したベクターの間で最高の防御を付与し、これは、ｗｔ ＲＳＶにほぼ等しかった：このベクターが免疫した１匹のハムスターだけが、検出可能なｗｔ ＲＳＶを有し、鼻甲介では極めて低レベルでしかなかった。ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（第１０群）の防御有効性は、鼻甲介ではｗｔ ＲＳＶ（第１２群）の有効性と統計学的に識別不能であったが、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（第７群）は、有意に防御が劣り、前者の構築物が最も免疫原性の構築物であるという概念を支持する。ｗｔ ＲＳＶに対する防御におけるこの等価性は顕著である。なぜなら、ｗｔ ＲＳＶは、２つの中和抗原、ＧおよびＦを発現し、また細胞免疫の潜在的な抗原として全てのウイルスタンパク質を発現するが、このベクターは、ＲＳＶ Ｆタンパク質しか発現しないからである。細胞免疫は、げっ歯類におけるＲＳＶチャレンジ研究で強力な防御を付与することが示された（例えば、Ｃｏｎｎｏｒｓら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６６：１２７７～１２８１ １９９２）。
アカゲザルにおける評価。ハムスターで最大の免疫原性を有する３つのベクターを選択して、アカゲザルでのそれらの複製および免疫原性を評価した（図５５）。これらの構築物は、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ（図５５の頂部の構築物）を含み、これは、第１ＮＨＰ研究で特に有効であることが特定された（実施例１における、図２８～３２）。第２の構築物は、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴであって、これは、ＤＳの代わりにＤＳ－Ｃａｖ１を有することを除けば第１の構築物と同じである。第３の構築物はＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴであって、これはＧＡ－ｏｐｔの代わりにＧＳ－ｏｐｔを有するという点で前の構築物とは異なる。これらの後者の２つの構築物は、最高力価の「高品質」ＲＳＶ－中和血清抗体を図５３で誘導した。
アカゲザルでの複製。ＧＡ－ｏｐｔおよびＧＳ－ｏｐｔバージョンのＨＥＫ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴを有する平行な構築物は、鼻咽頭のスワブでサンプリングした場合、ＵＲＴにおいて同様の反応速度論で複製した（図５６Ａ）。しかし、これと同じことは、気管洗浄液でサンプリングした場合、ＬＲＴでは観察されなかった：ＧＳ－ｏｐｔバージョンは、ＧＡ－ｏｐｔバージョンよりも弱毒化が少なかった（図５６Ｂ）。これらの結果は、図５１においてハムスターで観察されたものと一致している。ＤＳ対ＤＳ－Ｃａｖ１を有する並行構築物の比較に関して（ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴ 対 ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ）、前者のウイルスは、ＵＲＴではさらに弱毒化された（図５６Ａ）；しかし、それらは、ＬＲＴでは同様の効率で複製した（図５６Ｂ）ことは注目に値する。これらの結果はまた、図５１においてハムスターで観察されたものと一致している。ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ／Ｂ３ＴＭＣＴは、第１ＮＨＰ研究で試験した同じ構築物と比較して、この研究ではＵＲＴおよびＬＲＴの両方で有意に高い力価（約１０倍高い）まで複製した（図２９、実施例１）。前の研究でのサル（図２９）は、図５６で使用されるサルよりも６歳上で、かつ体重が２～３倍大きかった。これらのウイルスの複製は、若いサルではさらに効率的である場合があるか、または相違は、これらの２つの実験の間の変動を反映し得る。
ＲＳＶ－中和血清抗体。図５６における３つのベクターは、アカゲザルではわずかに異なる効率で複製したが、それらは、補体依存性（図５７Ａ）および補体非依存性（図５７Ｂ）アッセイで決定された、匹敵する高レベルのＲＳＶ－中和血清抗体を誘導した。
第１遺伝子位置でのＲＳＶ Ｆの挿入。実施例１および本実施例における前のＢ／ＨＰＩＶ３－ＲＳＶ－Ｆ構築物の全てが、ベクターのＮとＰ遺伝子との間の、第２の遺伝子位置に挿入されたＲＳＶ遺伝子を含んだ。第１の位置での未改変のＲＳＶ Ｆの挿入は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の増殖の障害または発現の安定性の低下というなんら明らかな問題を伴わなかった。最適化された、遺伝子操作型のＲＳＶ Ｆが、効率的である場合があるか、かつ第１の遺伝子位置から安定に発現されるか否かを検討した。具体的には、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴバージョンのＲＳＶ Ｆを、プレ－Ｎ位置に挿入した（図５８Ａ）。
ベクターの表現型の不安定性を付与した、ＨＮにおける２つのアミノ酸アサインメントの特定および改変。ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで継代の際に表現型不安定性を示すことが以前に注記された（Ｌｉａｎｇら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：４２３７～４２５０）。具体的には、かなりの割合のベクターが、継代の間に大型プラークの表現型を獲得した。これは、異なるインサートおよび空ベクターとともに生じ、このことは、これがベクター単独の特性であって、外来遺伝子に特異的ではなかったことを示している。６つのクローニングされた大プラークウイルスのゲノム全体の配列解析によって、各々がＨＮでＨ５５２Ｑミスセンス変異を、同様に、Ｆで３つの異なるミスセンス変異のうちの１つを、およびいくつかの場合にはＬで１つまたは２つのミスセンス変異を獲得していたことが示された（Ｌｉａｎｇら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：４２３７～４２５０）。１１の追加の大型プラーククローンの部分的な配列決定によって、これらのうち７つが、ＨＮにおいてＨ５５２Ｑ変異を含むが、他の４つはお互いに、ＨＮ中に４つの他のミスセンス変異のうちの１つを含むことが示された（Ｎ２４０Ｋ、Ｐ２４１Ｌ、Ｒ２４２Ｋ、またはＦ５５８Ｌ）。ＨＰＩＶ３ ＨＮタンパク質の結晶構造との比較（Ｌａｗｒｅｎｃｅら Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３５：１３４３～１３５７ ２００４）によって、全てのこれらのＨＮ変異が、ＨＮ球状の頭部の二量体境界に位置することが示された。さらに、Ｈ５５２Ｑ変異は、ノイラミニダーゼ処理細胞に対する増殖によって選択され、大型プラーク表現型を有し、シアル酸含有受容体に対して高い結合活性を有し、Ｆタンパク質の増強された誘因を有し、げっ歯類で弱毒化されていたＨＰＩＶ３改変体で以前に記載された（Ｍｏｓｃｏｎａら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：６４６３～６４６８；Ｐｏｒｏｔｔｏら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１：３２１６～３２２８；Ｐａｌｅｒｍｏら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８３：６９００～６９０８）。これによって、ｒＢ／ＨＩＰＩＶ３ベクター中のＨＰＩＶ３ ＨＮ遺伝子の偶発性の変異が同様であって、かつおそらくＶｅｒｏ細胞についてｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの結合親和性を増大したという理由で選択されたことが示唆されたことが示唆された。しかし、大型プラーク表現型がｉｎ ｖｉｖｏで実質的な弱毒化を伴ったという他者による観察（Ｍｏｓｃｏｎａら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：６４６３～６４６８；Ｐｏｒｏｔｔｏら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１：３２１６～３２２８；Ｐａｌｅｒｍｏら Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８３：６９００～６９０８）は、これが過剰な弱毒化をもたらす可能性が高いので、本発明のベクターに関して不利であろう。ＨＰＩＶ３逆遺伝学系は、ＨＮ遺伝子で２つの変異を含んだ：Ｔ２６３Ｉミスセンス変異をもたらすｃＤＮＡクローン中の偶発性のＣ７５８９Ｔヌクレオチド変異（完全なアンチゲノム配列に対する）、ならびにマーカーとして意図的に導入されたＰ３７０Ｔ変異をもたらすＣ７９１３ＡおよびＡ７９１５Ｔ変異があった（Ｄｕｒｂｉｎら Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３～３３２、１９９７）。この後者のミスセンス変異は、２つの利用可能なＨＰＩＶ３－中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ４２３／６および１７０／７）によって認識されるエピトープを除去するように設計された。これらの変異は、それらの野性型アサインメント、すなわち７５９３Ｃ（２６３Ｔ）および７９１３Ｃ＋７９１５Ａ（３７０Ｐ）に対して修復された（図５８Ｂ）。顕著なことに、これらの変化は、Ｖｅｒｏ細胞での継代の間に大型プラーク表現型の獲得を妨げた（示さず）。従って、ＨＰＩＶ３ ＨＮ遺伝子を保有するさらなるベクター構築物（限定するものではないが、ｒＢ／ＨＰＩＶ３－およびＨＰＩＶ３－ベースのベクターを含む）は好ましくは、これらのアサインメントを含むべきである。例えば、Ｉ２６３ＴおよびＴ３７０Ｐ変異が、図５８Ａに示されるＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ／プレ－Ｎ構築物中に組み込まれた。ＨＰＩＶ３ ＨＮ遺伝子を保有する目的の全てのベクターは、２６３Ｔおよび３７０Ｐアサインメントを含むように改変する。
ウイルス回収。プレ－Ｎ位置に挿入されたＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴを有するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（図５８Ａ）を、回収して、８．２ ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価に増殖し、従って、ワクチン製造に重要である、ウイルス収率に関する増殖制限はわずかであるかまたは全くなかった。このウイルスのプラークサイズは一般には、第２位置（示さず）に挿入された同じバージョンのＲＳＶ Ｆよりも小さく、これによって、ウイルス収率では明らかでない、増殖に対するわずかな制限があったことが示される。
ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現の安定性。ウイルスの２つの調製物を、二重染色プラークアッセイによって解析して、ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現の安定性を評価した。ＣＬ２０ａおよびＣＬ２４ａと命名された、２つの独立のレスキューされたウイルスプールの二重染色のプラーク表現型を行った。プラークアッセイを、１０倍連続希釈ウイルスで感染させた２４ウェルプレート中で、Ｖｅｒｏ単層上で行った。感染させた単層に、０．８％のメチルセルロースを含有する培地を積層し、３２℃で６日間インキュベートした。氷冷の８０％メタノール中で固定した後、単層を、ＲＳＶ Ｆに対する３つのマウスモノクローナル抗体（１１２９、１１０９、１２４３）、およびウサギ抗ＨＰＩＶ３過免疫血清の混合物とともにインキュベートし、続いてＩＲＤｙｅ ６８０（赤、ＲＳＶ Ｆを検出する）コンジュゲートヤギ抗マウスおよびＩＲＤｙｅ ８００（緑、ＨＰＩＶ３を検出する）コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体とともにインキュベーションした。
１つの調製物は、細胞培養物中での継代後に安定であったが、第２の調製物は、約４０％のウイルス中で緑染色を有し、従って、ＲＳＶ Ｆ発現の喪失の証拠があった。これらの結果によって、ＲＳＶ Ｆ発現の喪失が生じる場合があり、かつウイルス複製において増幅されてもよいことが示され、ただし、これは散在性であると思われ、かつ注意深いモニタリングによって、高い割合の発現を有する調製物を特定できる。
細胞内タンパク質発現。プレ－Ｎ位置からのＲＳＶ Ｆの発現を、Ｖｅｒｏ細胞（図５９Ａ）およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞（図５９Ｂ）で解析した。Ｖｅｒｏ細胞では、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴバージョンのＲＳＶ Ｆを、Ｆ１およびＦ０鎖として発現し（図５９Ａ）、プレ－Ｎ位置からの総発現は、Ｎ－Ｐ位置から発現されたものに匹敵した。しかし、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞では（図５９Ｂ）、このバージョンのＲＳＶ ＦをＦ０鎖として優先的に発現させ、プレ－Ｎからの発現は実質的に、Ｎ－Ｐ位置のものより効率的であった（図５９Ｂ、レーン３、４、５）。両方の種類の細胞では、このバージョンのＲＳＶ Ｆは、未改変のＲＳＶ Ｆよりもかなり高いレベルで発現された（非ＨＥＫ／非ｏｐｔ、図５９Ａ、５９Ｂ、レーン３および４対レーン６）。
二価のＨＰＩＶ１／ＲＳＶワクチンとして、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合Ｆ糖タンパク質を発現する弱毒化ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ１）
本実施例は、２つの弱毒化されたｒＨＰＩＶ１骨格の３つのゲノム位置由来のＲＳＶ
Ｆ抗原を発現する弱毒生ｒＨＰＩＶ１ベクターのＲＳＶワクチンの開発および前臨床評価を図示する。ハムスターにおける前臨床評価によって、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１ベクター（弱毒化欠失変異（ＣΔ１７０）をＰ／Ｃ遺伝子中に保有し、かつＲＳＶ Ｆをプレ－Ｎ位置から発現する）は、十分に弱毒化され、安定であり、かつＲＳＶおよびＨＰＩＶ１に対して免疫原性であり、ＲＳＶチャレンジ感染に対する有意な防御を提供したことが示された。この研究によって、ｒＨＰＩＶ１を、ＲＳＶワクチンベクターとして使用して、２つの主な小児期疾患に対して二重の防御を達成し得ることが実証された。
序。ＲＳＶの弱毒化株を含むＲＳＶワクチンと比較して、ＲＳＶタンパク質を発現する弱毒生ＨＰＩＶベクター（例えば、ＨＰＩＶ１から開発されたベクター）を含むＲＳＶワクチンは、いくつかの利点をもたらす。ベクターとして用いられるＲＳＶおよびＨＰＩＶ血清型に対する二価ワクチンを提供することが１つの利点である。これは重要である。なぜなら、注記されたとおり、ＨＰＩＶはまた重要な、小児呼吸器疾患の未制御の因子であって、ＲＳＶの特徴と重複する疫学的および病理学的な特徴を有する。従って、組み合わせたＨＰＩＶ／ＲＳＶワクチンは、小児呼吸器疾患に対するカバーを広くするであろう理論的組み合わせである。さらに、ＲＳＶ感染性は、取扱いの間に不安定性にする傾向に関しては悪評があり、ワクチンの開発、製造および送達を複雑にする。ＨＰＩＶは実質的にさらに安定であり、これによって、その必要性が最大である発展途上国にＲＳＶワクチンを広げるために重要である場合がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖したＲＳＶは、製造を複雑にする長いフィラメントを形成する場合が多いが、ＨＰＩＶは、それより小さい球状の粒子を形成する。ＲＳＶは、ＨＰＩＶと比べて、本質的にさらに病原性であり、さらに可能性としては免疫抑制性であることもある場合があり、これは、ＨＰＩＶベクターのＲＳＶワクチンの別の利点であろう。これによって、また、げっ歯類において、弱毒生ＲＳＶ株に対して引き続き投与されたブーストとしてのＨＰＩＶベクターのワクチンの使用は、同じ弱毒化ＲＳＶ株の第２用量よりも免疫原性であったことも見出された。従って、一次免疫から生じるＲＳＶ特異的免疫は、ＨＰＩＶベクターのウイルスのものよりも効率的に弱毒化ＲＳＶ株の第２用量の複製を制限すると予測される場合があり、ＨＰＩＶベクターのＲＳＶワクチンの別の潜在的な利点が示される。
ＨＰＩＶ１ゲノムは、マイナス鎖ＲＮＡの一本鎖である。これは、短い３’リーダー領域に続いて、Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬタンパク質をコードする６遺伝子、ならびに短いトレーラー領域からなる。各々の遺伝子は、主なウイルスタンパク質：Ｎ、核タンパク質；Ｐ、リンタンパク質；Ｍ、内部マトリックスタンパク質；Ｆ、融合糖タンパク質；ＨＮ、ヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ糖タンパク質；およびＬ、メジャーポリメラーゼサブユニットをコードする。さらに、Ｐ遺伝子は、宿主インターフェロン（ＩＦＮ）応答を阻害し、かつアポトーシスをブロックする１セットのカルボキシ－コ－末端Ｃアクセサリータンパク質を発現する重複するＯＲＦを保持する（Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００８．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２：８９６５－８９７７）。他の非区分のマイナス鎖ＲＮＡウイルスと同様、ＨＰＩＶ１転写は、３’末端プロモーターで開始し、一連のモノシストロン性ｍＲＮＡを生成する遺伝子末端（ＧＥ）遺伝子間（ＩＧ）遺伝子開始（ＧＳ）シグナルによって調節された開始－停止プロセスでゲノムを下に進行させる。転写を低下する３’から５’への勾配があり、プロモーター近位の遺伝子は、より高レベルで発現された（Ｎａｇａｉ．１９９９．Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９：８３－９９）。他のパラミクソウイルスと同様、完全な感染性の複製コンピテントなＨＰＩＶ１は、トランスフェクトされたｃＤＮＡ由来の細胞培養物中で回収される（逆遺伝学）。
前の研究では、ＲＳＶ Ｆタンパク質についてのベクターとしてウシおよびヒトのＰＩＶ３のキメラの開発を記載している（Ｓｃｈｍｉｄｔら ２０００ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：８９２２～８９２９；Ｓｃｈｍｉｄｔら ２００１ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：４５９４～４６０３；Ｓｃｈｍｉｄｔら ２００２ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：１０８８～１０８９；Ｔａｎｇら ２００２ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：１１１９８～１１２０７；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら ２０１２ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３１：１０９～１１４；実施例１も参照のこと）。このウイルスは、ｒＢ／ＨＰＩＶ３と呼ばれ、霊長類のＢＰＩＶ３の弱毒化表現型と、ＨＰＩＶ３の主な中和抗原とを組み合わせる、ＨＰＩＶ３のものによって、逆遺伝学を使用してＦおよびＨＮ遺伝子が置き代えられたＢＰＩＶ３（Ｓｃｈｍｉｄｔら ２００１ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：４５９４～４６０３；Ｓｃｈｍｉｄｔら ２００２ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：１０８８～１０８９；Ｔａｎｇら ２００２ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：１１１９８～１１２０７；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら ２０１２ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３１：１０９～１１４）からなり、ｒＢ／ＨＰＩＶ３は、ＲＳＶ ＦおよびＧ遺伝子を効率的に発現することが示された。血清陰性の小児におけるＲＳＶおよびＨＰＩＶ３についての二価ワクチンとしてのリードｒＢ／ＨＰＩＶ３／ＲＳＶ－Ｆ構築物の臨床評価によって、これは感染性であって、十分耐容され、弱毒化されたが、期待されるよりもＲＳＶ Ｆに対して免疫原性が低いことが示された（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら ２０１２ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３１：１０９～１１４）。これは、ＲＳＶ Ｆインサートの発現をサイレンシングした臨床トライアル材料における遺伝子不安定性に対して少なくとも部分的に起因するようであった（Ｙａｎｇら．２０１３．Ｖａｃｃｉｎｅ ３１：２８２２～２８２７）。しかし、さらなる研究は、ＲＳＶ Ｆインサートを安定化し、ベクター構築物の種々のパラメーターを特徴付けて最適化することによって免疫原性の増大を得るために進行中である（Ｌｉａｎｇら．２０１４．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８８：４２３７－４２５０）。ＨＰＩＶ１は、ＲＳＶ Ｆ抗原を発現するための別の魅力的なベクターである。具体的には、ＨＰＩＶ１は、ＲＳＶまたはＨＰＩＶ３よりも小児ではいくぶんか後に感染し（Ｃｏｕｎｉｈａｎら．２００１．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｊｏｕｒｎａｌ ２０：６４６～６５３；Ｒｅｅｄら．１９９７．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７５：８０７～８１３）、そのためＨＰＩＶ１ベクターのＲＳＶワクチンを、弱毒生ＲＳＶまたはｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのワクチンの後に使用して、ＲＳＶに対する免疫応答がブーストされるであろう。
本研究では、ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するＨＰＩＶ１ベクターのワクチンを開発するための２つのパラメーターを評価した（図３６および４２）：（ｉ）２つの異なる弱毒化ＨＰＩＶ１骨格を比較して、（ｉｉ）ＨＰＩＶ１ベクターの第１、第２、および第３のゲノム位置でのＲＳＶ Ｆ遺伝子の挿入を比較した。第１のパラメーター、弱毒化のレベルは、それが安全性に対しておよび逆に免疫原性に対して関連するので重要である。具体的には、ＨＰＩＶ１ベクターは、非病原性であって、十分耐容されるように、十分弱毒化されなければならないが、満足に免疫原性であるためには十分な抗原を複製し、かつ発現しなければならない。ＨＰＩＶベクターに対するＲＳＶ Ｆのような外来遺伝子の添加によってまた、典型的には弱毒化が付与され、かつまた、温度感受性（ｔｓ）表現型（Ｌｉａｎｇら．２０１４．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８８：４２３７－４２５０）が付与され、かつインサートおよび特異的な弱毒化変異（単数可）の組み合わせ効果が決定されなければならなかった。本研究で使用される２つの異なるＨＰＩＶ１骨格は各々が、前の研究（１、３、２５）で開発された単一の弱毒化変異（ＣΔ１７０またはＬＹ９４２Ａ）を含んだ（１、３、２５）。これらの変異の各々は、ｉｎ ｖｉｖｏで適度に弱毒化されることが示されている（Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：２６７４～２６８４；Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊ ４：６７；Ｎｅｗｍａｎら．２００４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：２０１７～２０２８）。ＣΔ１７０変異は、非温度感受性である。これは、Ｃタンパク質が、宿主のＩ型インターフェロン応答およびアポトーシスを阻害する能力を低下し（Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：２６７４～２６８４；Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００８．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２：８９６５～８９７７；Ｎｅｗｍａｎら．２００４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：２０１７～２０２８）、これがウイルス弱毒化を生じる。弱毒化の機構は、構築物の固有の免疫原性を増大する能力を有する。なぜならＣにおけるこの変異は、宿主インターフェロン応答およびアポトーシス応答を増大し、その両方が免疫原性を増大する能力を有するからである。ＣΔ１７０変異は、重複するＰおよびＣ ＯＲＦ中の６ヌクレオチド欠失からなる。Ｃ ＯＲＦでは、これは、２つのアミノ酸の欠失、および第３のアミノ酸の置換を生じるが（具体的には、三つ組み１６８－ＲＤＦ－１７０は、単一アミノ酸Ｓに変化された）、重複するＰ ＯＲＦでは、これは、２つのアミノ酸の欠失を生じる（１７２－ＧＦ－１７３）。欠失変異は、安定性増大を有すると考えられる。なぜなら、それらは、同じ部位の復帰突然変異のリスクが低いことに起因して、より大きい遺伝子型および表現型の安定性を付与するからである。ＬＹ９４２Ａ変異は、温度感受性である。これは、Ｌ ＯＲＦにおけるミスセンス変異（９４２－Ｙ～Ａ）であって、これは、直接証明されたように（ＭｃＡｕｌｉｆｆｅら ２００４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：２０２９～２０３６）、脱弱毒化されるために高度に抵抗性であるように３ｎｔ置換を含むように設計された（図４２）。（ｉｉ）本研究で検討された第２のパラメーター（ＨＰＩＶゲノム中の外来遺伝子の挿入の位置）は、重要である。なぜなら、これは、外来遺伝子の発現のレベルに影響し、同様にそのベクターに対するその弱毒化の影響にも影響するからである。ＨＰＩＶゲノムでは、プロモーターにより近いＲＳＶ Ｆ遺伝子の挿入は、転写勾配に起因して、より高いレベルの発現を提供すると期待されよう。しかし、外来遺伝子がプロモーターに近いほど、影響し得る下流ベクター遺伝子の数は多い。なぜなら、これらのベクター遺伝子の各々が、現在、プロモーターからさらに除去された１つの位置であり、結果として発現効率が低いからである。さらに、第１の位置における外来遺伝子の配置は、プロモーターの機能に影響する能力を有する。外来遺伝子の挿入はまた、予測できない効果を有し得る。これは、また、ゲノム長および遺伝子数の増大などの効果を通じて減弱し得る。
６つのウイルス（２つの異なる弱毒化ＨＰＩＶ１骨格中のＲＳＶ Ｆの３つの異なる挿入部位に相当する）を構築し、逆遺伝学によってレスキューし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複製、ならびにＲＳＶ Ｆおよびベクタータンパク質の発現について解析した。ハムスターモデルを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏの複製（上気道および下気道）、ワクチンウイルス安定性、免疫原性、およびｗｔ ＲＳＶチャレンジに対する防御を評価した。
材料および方法
細胞およびウイルス。ＬＬＣ－ＭＫ２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７）アカゲザル腎臓およびＶｅｒｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）アフリカミドリザル腎臓細胞株を、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ／Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および１ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含むＯｐｔｉ－ＭＥＭＩ培地中で維持した。ＢＳＲ Ｔ７／５細胞は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現するベビーハムスター腎臓２１（ＢＨＫ－２１）細胞である（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら．１９９９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：２５１～２５９）。これらの細胞は、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび２％のＭＥＭアミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＧｌａｓｇｏｗ最小必須培地（ＧＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。培地にはまた、継代１つおきに２％ジェネティシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充して、Ｔ７ポリメラーゼ構築物を保有する細胞を選択した。
ＨＰＩＶ１を、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞中で増殖させた。ウイルス接種前に、５％ＦＢＳを含有する培地中で増殖したＬＬＣ－ＭＫ２細胞を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回洗浄して、ＦＢＳを除去した。ＨＰＩＶ１による感染は常に、１．２％トリプシン（ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１ｍＭのＬ－グルタミンを含有する無血清のＯｐｔｉ－ＭＥＭＩ培地中で行った。感染させた細胞を、細胞変性効果の出現まで３２℃でインキュベートした。ウイルスストック回収に関して、培養上清を回収して、１５００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離することによって清澄化した。ウイルスストックのアリコートを、ドライアイス上で急速凍結して、－８０℃で保管した。ＨＰＩＶ１力価を、上記のように１．２％トリプシンを含有する無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩ培地を用いてＬＬＣ－ＭＫ２細胞上で９６ウェルプレート中で１０倍階段希釈によって決定し、続いて３２℃で７日間インキュベーションした。感染された細胞を、モルモット赤血球を用いて赤血球吸着（ＨＡＤ）によって検出し、力価を、前に記載のとおり（Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：２６７４～２６８４）、ｌｏｇ１０組織培養感染用量５０％（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）として算出した。各々のウイルスの温度感受性（ｔｓ）表現型は、前に記載のとおり（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら．１９９９．Ｖａｃｃｉｎｅ １８：５０３～５１０）３２、３５、３６、３７、３８、３９および４０℃でそれらの複製効率を評価することによって研究した。各々のウイルスの滴定は、上記のように、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞の９６ウェルの複製プレート中で行い、７日間種々の温度で温度制御水浴中で、密閉容器中でインキュベートした。力価を、ＨＡＤによって決定して、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した。
ＲＳＶ Ｆ抗原を発現するｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０およびｒＨＰＩＶ１－ＬＹ９４２Ａウイルスの設計。ｒＨＰＩＶ１ウイルスは、野性型（ｗｔ）ＨＰＩＶ１株 Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／２０９９３／１９６４（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ４５７１０２）（Ｎｅｗｍａｎら．２００２．Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７～９２）由来の逆遺伝学システムを用いて構築した。ＨＰＩＶ１の組み換え全長アンチゲノムｃＤＮＡクローン（ｐＦＬＣ）を、３つの追加の固有の制限部位を含むように部位指向性突然変異誘発によって改変した：ＭｌｕＩ（ＡＣＧＣＧＴ、プレ－Ｎ位置、ヌクレオチド数１１３～１１８）、ＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ、Ｎ－Ｐ位置、ヌクレオチド数１７７６～１７８３）およびＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ、Ｐ－Ｍ位置、ヌクレオチド数３６０９～３６１６）。２つの弱毒化ｃＤＮＡ骨格を、ＣΔ１７０（Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊ ４：６７）またはＬＹ９４２Ａ（Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊ ４：６７；ＭｃＡｕｌｉｆｆｅら．２００４．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２０２９～２０３６）のいずれかの変異を、それぞれＰ／ＣまたはＬ ＯＲＦの中に、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を、製造業者の指示に従って用いて導入することによって生成した。以下の突然変異誘発プライマーを使用して、弱毒化されたＨＰＩＶ１骨格を生成した。ＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０変異に関しては、フォワードプライマーは、ＡＡＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＣＧＡＡＧ（配列番号１２１）であり、かつリバースプライマーは、ＣＴＴＣＧＴＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴ（配列番号１２２）であった。これらのプライマーは、６つの規則を維持しながらＰ／Ｃ ＯＲＦ（図４２）と比較して１７位置と１８位置との間に６－ヌクレオチド欠失（ＧＧＡＴＴＴ）を導入した（Ｃａｌａｉｎら．１９９３．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：４８２２～４８３０；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙら．１９９８．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：８９１～８９９）。前に記載のとおり（Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊ ４：６７）、Ｐ／Ｃ ＯＲＦ中のＣΔ１７０欠失は、Ｒ１６８Ｓ置換、ならびに１６９～１７０位置からのＤおよびＦの欠失を含み、ＲＤＦからＳへのＣタンパク質のアミノ酸配列における変化を生じる。この変異はまた、位置１７２～１７３へのＧ残基およびＦ残残基の２つの欠失を含むＰ ＯＲＦにも影響する。ＬＹ９４２Ａ変異に関しては、フォワードプライマーは、ＣＣＡＧＣＴＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＧＴＴＣＡＡＣＧＣＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＴＡＧＡＴＧＴＴＴＴＧＴＣ（配列番号１２３）であって、リバースプライマーは、ＧＡＣＡＡＡＡＣＡＴＣＴＡＧＣＴＧＴＡＧＡＣＡＴＣＧＣＧＴＴＧＡＡＣＣＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＡＧＣＴＧＧ（配列番号１２４）であった。これらのプライマー配列では、Ｌ ＯＲＦ中のａａ９４２における変異部位ＴＡＴ（Ｙ）～ＧＣＧ（Ａ）には下線を付す。突然変異誘発プライマー対は、精製されたＰＡＧＥ ２－Ｓｔｅｐであった（Ｏｐｅｒｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）。次いで、配列決定によって決定した、所望の変異を有するクローンをプラスミドｍａｘｉｐｒｅｐ（ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ）によって精製して、全体に配列決定した。ＣΔ１７０またはＬＹ９４２Ａ変異のいずれかを有するｒＨＰＩＶ１ ｐＦＬＣを、ＭｌｕＩ、ＡｓｃＩ、またはＮｏｔＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ）で消化して、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理して、ゲル抽出（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）によって精製した。
ＨＥＫアミノ酸アサインメントを有する株Ａ２由来のＲＳＶ Ｆ遺伝子：それぞれａａ位置６６および１０１のＧｌｕおよびＰｒｏ（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら．１９９８．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：４４６７～４４７１）を、ヒトコドン用法について最適化した（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）。ＲＳＶ Ｆ遺伝子インサートは、（図３６）ＨＰＩＶ１転写調節性配列：独立した転写物としてＲＳＶ Ｆ発現を可能にする遺伝子末端（ＧＥ）－遺伝子間（ＩＧ）－遺伝子開始（ＧＳ）シグナルを含むように設計した。全ての構築のために、ＲＳＶ Ｆ遺伝子インサートを、ＨＰＩＶ１ Ｎ ＧＥ（ＡＡＧＴＡＡＧＡＡＡＡＡ、配列番号１２５）およびＰ ＧＳ（ＡＧＧＧＴＧＡＡＴＧ、配列番号１２６）配列を、保存されたＩＧ配列（ＣＴＴ）とともに含み、一方ではＰ ＧＳについて＋１位相を維持するように設計した。ＲＳＶ Ｆインサートを、それぞれ、第１のプレ－Ｎ（Ｆ１）、第２のＮ－Ｐ（Ｆ２）、または第３のＰ－Ｍ（Ｆ３）位置での挿入のために、ＨＰＩＶ１ ＦＬＣ中のものに対して相補的な対応する隣接するＭｌｕＩ、ＡｓｃＩ、またはＮｏｔＩ制限部位を用いてＰＣＲによって生成した（図３６）。以下のＰＣＲプライマーを用いて、ＲＳＶ Ｆインサートを生成した。第１のＦ１遺伝子位置中への挿入のためにＭｌｕＩ制限部位を含むＲＳＶ Ｆ断片に関して、フォワードプライマーは、ＡＣＧＣＧＴＣＣＣＧＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号１２７）であり、かつリバースプライマーは、ＡＣＧＣＧＴＣＧＴＡＣＧＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＴＴＣＴＡＴＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＴＧＣＣＧＧ（配列番号１２８）であった。第２のＦ２遺伝子位置中への挿入のためにＡｓｃＩ制限部位を含むＲＳＶ Ｆ断片に関して、フォワードプライマーは、ＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号１２９）であって、およびリバースプライマーは、ＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＴＡＣＧＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＡＴＴＣＴＡＴＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＴＧＣＣＧＧ（配列番号１３０）であった。第３のＦ３遺伝子位置中への挿入のためにＮｏｔＩ制限部位を含むＲＳＶ Ｆ断片に関して、フォワードプライマーは、ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＡＡＧＴＡＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＧＧＴＧＡＡＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号１３１）であって、リバースプライマーは、ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＡＣＧＣＴＡＴＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＴＧＣＣＧＧ（配列番号１１１）であった。
ＲＳＶ Ｆ抗原を発現するｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０およびｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａウイルスの回復。第１（ＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１）、第２（ＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ２）、および第３（ＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ３）位置からＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０骨格、ならびに第１（ＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１）、第２（ＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２）、および第３（ＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ３）位置からＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａウイルスを、ｃＤＮＡから、ＨＰＩＶ１逆遺伝学システム（Ｎｅｗｍａｎら．２００２．Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７～９２）を使用することによって、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現するＢＳＲ Ｔ７／５細胞中でレスキューした（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら．１９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：２５１～２５９）。このｒＨＰＩＶ１ ｃＤＮＡは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／２０９９３／１９６４（ＨＰＩＶ１ ＷＡＳＨ／６４）臨床単離体由来である。ＢＳＲ Ｔ７／５細胞は、６ウェルプレート中で９０％コンフルエンシーまで増殖させ、アンチゲノムｐＦＬＣプラスミド（５ｕｇ）を用いて同時トランスフェクトして、以前に記載のとおり（Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００５．Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：４６３１～４６４６；Ｎｅｗｍａｎら．２００２．Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７～９２）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（２０ｕｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、それぞれ、ＨＰＩＶ１ Ｎ、ＰおよびＬタンパク質を発現するｐＴＭ－Ｎ（０．８ｕｇ）、ｐＴＭ－Ｐ（０．８ｕｇ）およびｐＴＭ－Ｌ（０．１ｕｇ）支持プラスミドとともにレスキューさせた。トランスフェクトされた細胞を３７℃で一晩インキュベートして、ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて２回洗浄し、新鮮なＯｐｔｉＭＥＭ（１ｍＭのＬ－グルタミンおよび１．２％トリプシン含有）を細胞に添加した後に、３２℃でインキュベーションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、培地中への擦り落とすことによって回収し、細胞懸濁物を、ＯｐｔｉＭＥＭ、１ｍＭのＬ－グルタミン、１．２％トリプシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞の５０％コンフルエント単層に添加し、３２℃でインキュベートした。ウイルスを、７日後に回収して、さらに３２℃でＬＬＣ－ＭＫ２細胞中で１継代（ＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０）または２継代（ＨＰＩＶ１－ＬＹ９４２Ａ）によってさらに増幅した。ウイルス力価を、上記のように９６ウェルプレート中で、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞での１０倍連続希釈によって決定した。全ての組み換えウイルスを配列決定して、偶発性の変異の欠失を確認した。このために、ウイルスＲＮＡを、ウイルスストックから抽出して（ＱｉａＡｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、ＲＮａｓｅなしのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて処置して、ウイルスレスキューに用いたプラスミドＤＮＡを取り除いた。ＲＮＡを逆転写し（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および重複するゲノム領域は、ＲＴ－ＰＣＲ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ－ＨＦ ２ ＰＣＲ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって増幅した。逆転写酵素を欠くＲＴ－ＰＣＲ対照を、全てのウイルスに含み、これによって、増幅産物は、ウイルスＲＮＡ由来であること、およびウイルス回復に用いられるｐＦＬＣ ｃＤＮＡに由来しないことが示された。各々のウイルス構築物のゲノム配列は、重複する、増幅したＲＴ－ＰＣＲ生成物の直接サンガー配列決定によって決定した。配列の読み取りを整列させて、ゲノム配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ－ｖｅｒｓｉｏｎ ５．１を用いてアセンブルした（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）。
Ｖｅｒｏ細胞およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞におけるキメラｒＨＰＩＶ１ウイルスの複製。６ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞またはＬＬＣ－ＭＫ２細胞単層の三連のウェルを、０．０１ ＴＣＩＤ５０という感染の多重度（ＭＯＩ）で、ＲＳＶ Ｆ（Ｆ１、Ｆ２、またはＦ３）を発現するＨＰＩＶ１（ＣΔ１７０またはＬＹ９４２Ａ）ウイルス、または空のＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０もしくはＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａベクター、またはｗｔ ＨＰＩＶ１を用いて感染させた。培養物を３２℃でインキュベートした。全部で２ｍｌの細胞培養上清培地からの０．５ｍｌのアリコートを、各々のウェルから２４時間間隔で収集し、新鮮培地で置き換えた。そのサンプルを急速凍結させて、－８０℃で保管した。ウイルス力価（ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）は、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞での連続希釈によって、続いて、上記のＨＡＤによる感染細胞の検出によって決定した。
ウエスタンブロッティングによるＲＳＶ ＦおよびＨＰＩＶ１ベクタータンパク質発現の解析。Ｖｅｒｏ細胞（１×１０６）に、３つのゲノム位置（Ｆ１、Ｆ２、またはＦ３）のいずれかからＲＳＶ Ｆを発現するＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０またはＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ構築物を感染させた。空のＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０およびＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａベクター、ｗｔ ＨＰＩＶ１、およびモック処置細胞を、対照として用いた。感染は、１細胞あたり５ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで行い、３２℃でインキュベートした。感染後（感染後）４８時間で、単層を、ＰＢＳを用いて２回洗浄して、４００ｕｌの１×ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて溶解した。電気泳動のために、溶解液を、１×還元試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）との混合および３７℃で３０分間のインキュベーションによって還元して変性した。還元された変性された溶解液（４０μｌ）を、４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ－Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードして、電気泳動を、１×ＭＯＰＳ緩衝液中で行った。タンパク質を、ｉＢｌｏｔタンパク質転写システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。膜を、Ｌｉｃｏｒブロッキング緩衝液（Ｌｉｃｏｒ Ｉｎｃ．Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）中で１時間ブロックして、マウスモノクローナルＲＳＶ Ｆ特異的な抗体（ａｂ４３８１２；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）およびウサギポリクローナルＨＰＩＶ１ Ｎ特異的な抗体（ＨＰＩＶ１－Ｎ－４８５）を、ブロッキング緩衝液中で、１：１０００希釈で用いてプローブした。ＨＰＩＶ１－Ｎ－４８５を、前に記載のとおり（Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２０１０．Ｖａｃｃｉｎｅ ２８：７６７～７７９）、アミノ酸（ａａ）残基４８５～４９９のＮにまたがるＫＬＨコンジュゲートのＮペプチドによるウサギの免疫によって生成した。同じ設定の溶解液で行った複製ブロットを、ＫＬＨコンジュゲートペプチドによるウサギの反復免疫によって惹起され、１：２００希釈で使用されたＨＰＩＶ１ Ｐ（ＳＫＩＡ－１）、Ｆ（ＳＫＩＡ－１５）、またはＨＮ（ＳＫＩＡ－１３）についてウサギポリクローナル血清でプローブした。上記の抗体との一晩のインキュベーション後、膜を４×で、各々５分洗浄し、続いて、Ｌｉｃｏｒブロッキング緩衝液で希釈した二次抗体とともに１時間インキュベーションした。対応する赤外線色素コンジュゲート二次抗体は、ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ ６８０ＬＴおよびヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬｉＣｏｒ）であった。膜をスキャンして、ブロット画像を、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像化システム（ＬｉＣｏｒ）を用いて獲得した。３つの独立した実験由来のタンパク質バンドの蛍光強度を、Ｌｉｃｏｒ画像解析スイート（Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ）を使用することによって定量して、Ｆ３ウイルスに対して、ＲＳＶ ＦまたはＨＰＩＶ１ベクタータンパク質（Ｎ、Ｐ、Ｆ、およびＨＮ）の発現として報告した。
蛍光二重染色プラークアッセイによって決定したＲＳＶ Ｆを発現するビリオンのパーセンテージ。赤外線蛍光ベースの２色プラークアッセイを開発して、Ｖｅｒｏ細胞単層上でＲＳＶ Ｆを発現するＨＰＩＶ１ベクターによって形成されるプラーク中のＲＳＶ ＦおよびＨＰＩＶ１タンパク質の発現を同時に検出した。各々のウイルスは、１ｍＭのＬ－グルタミンおよび１．２％トリプシンを含むＯｐｔｉＭＥＭ培地中で１０倍連続希釈し、１００μｌの各希釈液を、２４ウェルプレート中で増殖したＶｅｒｏ細胞単層二倍で添加した。接種された細胞を、振盪器で３２℃で２時間インキュベートし、その後、０．８％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１ｍＭのＬ－グルタミン、４％トリプシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する積層ＯｐｔｉＭＥＭＩ培地を各々のウェルに添加した。ウイルスサンプル由来の動物組織に関して、Ｔｉｍｅｎｔｉｎ（２００ｍｇ／ｍｌ）、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｍｇ／ｍｌ）、クレオシン（Ｃｌｅｏｃｉｎ）（１５０ｍｇ／ｍｌ）、およびアンホテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂ（２５０μｇ／ｍｌ）を、ペニシリンおよびストレプトマイシンの代わりに、メチルセルロース重層に含めた。３２℃で６日間のインキュベーション後、細胞を、８０％冷メタノールを用いて２回固定した。ｒＨＰＩＶ１－ＲＳＶ Ｆプラークを、前に記載のとおり（Ｍｕｒｐｈｙら．１９９０．Ｖａｃｃｉｎｅ ８：４９７～５０２）、各々１：２０００希釈で３つのＲＳＶ Ｆ特異的なモノクローナル抗体およびＨＰＩＶ１特異的なヤギポリクローナル抗体（ａｂ２０７９１；Ａｂｃａｍ）のＬｉｃｏｒブロッキング緩衝液の中で１：１６００希釈での混合物とともに同時免疫染色することによって、感染されたＶｅｒｏ細胞単層上で検出した。１時間のインキュベーション後、細胞を、１ｍｌのブロッキング緩衝液を用いて１回洗浄し、赤外線色素コンジュゲートのヤギ抗マウス６８０ＬＴおよびロバ抗ヤギ８００ＣＷ（ＬｉＣｏｒ）を、各々ブロッキング緩衝液中に１：８００希釈で含有する二次抗体混合物とともにインキュベートした。細胞を１×ＰＢＳを用いて２回洗浄し、同時染色したプラークの画像をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線画像化システム（ＬｉＣｏｒ）上でプレートをスキャンすることによって獲得した。５０プラーク未満を含むウェルを分析のために選択し、ＲＳＣ Ｆ発現について陽性のｒＨＰＩＶ１プラークのパーセンテージを決定した。このアッセイを使用して、ワクチン接種物において、およびｉｎ ｖｉｖｏ複製後のハムスターから単離されたウイルス中でＲＳＶ Ｆを発現する集団のパーセントを決定することによってＲＳＶ Ｆ発現の安定性を評価した。
ハムスター研究
ハムスターにおけるウイルス複製。全ての動物研究は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。感染後３日目および５日目の各々のウイルスのｉｎ ｖｉｖｏ複製、および免疫原性を、ハムスターで評価した。６週齢のゴールデンシリアンハムスターを、それぞれ、血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイおよびＲＳＶ中和アッセイによって、免疫前血清を解析することによって、ＨＰＩＶ１およびＲＳＶについて血清陰性であると確認した（Ｃｏａｔｅｓら．１９６６．Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ ８３：２９９～３１３；Ｃｏａｔｅｓら．１９６６．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ９１：１２６３～１２６９；ｖａｎ Ｗｙｋｅ Ｃｏｅｌｉｎｇｈら．１９８８．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １５７：６５５～６６２）。１ウイルスあたり６匹のハムスターの群を麻酔して、動物１匹あたり１０５ ＴＣＩＤ５０のウイルスを含有する、０．１ｍｌのＬ１５培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を鼻腔内に接種した。複製を評価するために、ハムスターを感染後３日目および５日目に安楽死させて、鼻甲介および肺をウイルス滴定のために収集した。チメンチン（Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）（２００ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）（１００ｍｇ／ｍｌ）、クレオシン（Ｃｌｅｏｃｉｎ）（１５０ｍｇ／ｍｌ）、およびアンホテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂ（２５０ ｕｇ／ｍｌ）を含むＬ１５培地中の組織ホモジネートを、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞での連続希釈によって滴定し、続いて、ＨＡＤによってウイルス感染を検出した。ウイルス力価は、ハムスター組織１グラムあたりのＴＣＩＤ５０として報告した。組織ホモジネートはまた、Ｖｅｒｏ細胞でプラークアッセイによって滴定し、上記のような蛍光二重染色プラークアッセイを用いることによってＲＳＶ ＦおよびＨＰＩＶ１タンパク質の発現について染色した。結果を、ＲＳＶ Ｆを発現するＨＰＩＶ１プラークのパーセントとして報告した。
免疫原性
ＲＳＶおよびＨＰＩＶ１に対する血清中のウイルス中和抗体（ＮＡｂ）の誘導［６０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）］。ワクチン候補の免疫原性を評価するために、ハムスターを上記のように免疫して、血清を免疫後２８日でハムスターから収集した。ＲＳＶ特異的な中和抗体（ＮＡｂ）の力価は、ｅＧＦＰ発現性ＲＳＶ（Ｍｕｎｉｒら．２００８．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：８７８０～８７９６）を使用して、前に記載のように（Ｃｏａｔｅｓら．１９６６．Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ ８３：２９９～３１３）Ｖｅｒｏ細胞でＰＲＮＴ６０によって決定した。ハムスター血清を、５６℃で３０分間インキュベートして、補体タンパク質を不活性化し、続いて９６ウェルプレート中でＯｐｔｉ－ＭＥＭＩ、２％ＦＢＳ、１×ゲンタマイシン培地中で連続希釈した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、２％ＦＢＳ、１×ゲンタマイシン、１０％モルモット補体中で希釈したＲＳＶ－ｅＧＦＰ（Ｙｏｄｅｒら．２００４．Ｊ ｍｅｄｉｃａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：６８８～６９４）（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をさらに、等容積の連続希釈された血清サンプルとの混合によって１：１希釈し、続いて３７℃で３０分インキュベーションした。１００μｌの容積の血清－ウイルス混合物を、２４ウェルプレート中で増殖されたＶｅｒｏ細胞に添加し、ウイルスを３２℃で振盪器上で２時間吸着させた。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩ、８％メチルセルロース、２％ＦＢＳ、１×ゲンタマイシンの積層を、添加して、５～６日間インキュベートし、プラーク形成を可能にした。単層上のＲＳＶプラークを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒを用いて画像を走査および獲得することによって可視化した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。各々のサンプルのプラークカウントを、決定して、ＮＡｂ力価を、上記のとおり決定した（Ｃｏａｔｅｓら．１９６６．Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ ８３：２９９～３１３）。ＨＰＩＶ１－特異的なＮＡｂの力価はまた、以下の改変を有するＧＦＰ発現性ｒＨＰＩＶ１を用いて、ＲＳＶについて記載されるとおりの方法を用いて、Ｖｅｒｏ細胞上で６０％プラーク減少アッセイによって決定した：第１、ＨＰＩＶ１中和アッセイの場合、モルモット補体は、ウイルスを中和することが見出されたので、使用せず、第２に、接種されたＶｅｒｏ細胞を、血清を除去するためにウイルス吸着後に１×ＰＢＳで２回洗浄し、そして第３に、４％トリプシンを含有し、かつＦＢＳを欠いているメチルセルロース積層培地を使用した。
ワクチン候補物がＲＳＶ感染に対して防御する能力を、１０６ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶ株Ａ２を含有する０．１ｍｌのＬ１５培地を用いる鼻腔内接種による免疫後３０日でハムスターのチャレンジ感染によって試験した。ハムスターを安楽死させて、鼻甲介および肺をチャレンジ後３日目で回収し、これらの組織中のチャレンジＲＳＶのウイルス負荷を、Ｖｅｒｏ細胞でのプラークアッセイによって決定した（Ｄｕｒｂｉｎら．２００３．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ３７：１６６８～１６７７；Ｌｕｏｎｇｏら．２０１３．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８７：１９８５～１９９６）。
結果
３つの異なるゲノム位置からＲＳＶ Ｆタンパク質を発現する２つの弱毒化ＨＰＩＶ１骨格（ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０およびｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ）の作製。２つの弱毒化ＨＰＩＶ１骨格を調製し、これは、脱弱毒化に対する安定性のために設計された、異なる、前に特定された弱毒化変異（すなわち、ＣΔ１７０およびＬＹ９４２Ａ）を各々が含んだ（序、図３６および４２）。ＣΔ１７０変異は、温度感受性を付与しないが、ＬＹ９４２Ａ変異は、温度感受性変異であった。次に、株Ａ２のＲＳＶ Ｆ ＯＲＦは、ヒト発現のためにコドン最適化されて、ＨＰＩＶ１遺伝子開始および遺伝子末端シグナルの制御下であるように遺伝子操作し、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０およびｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ骨格中に、３つの異なる、平行なゲノム位置で：すなわち第１遺伝子位置（プレ－Ｎ、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１およびｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１を生成）；第２遺伝子位置（Ｎ－Ｐ、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ２およびｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２を生成）：および第３遺伝子位置（Ｐ－Ｍ、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ３およびｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ３を生成）で挿入した（図３６）。各々の構築物は、「６規則（ｒｕｌｅ ｏｆ ｓｉｘ）」に従う（Ｃａｌａｉｎら．１９９３．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：４８２２～４８３０）。各々のベクター遺伝子は、そのもとの六量体スペーシングを維持し、一方、Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３インサートは、それぞれ、もとのＮ、Ｐ、およびＰ遺伝子のもとの六量体スペーシングを仮定した。ＲＳＶ Ｆタンパク質はまた、ＨＥＫアミノ酸アサインメント、ＧｌｕおよびＰｒｏを、それぞれ、６６および１０１残基で保持し（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら．１９９８．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：４４６７～４４７１）、これは、株Ａ２の初期継代由来のＲＳＶ Ｆの配列と一致し、また、ほとんどの他の臨床単離体とも一致している。
ｒＨＰＩＶ１／ＲＳＶ Ｆウイルスを、逆遺伝学によって回収した。全てのウイルスを、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２構築物を除いて容易にレスキューし、これは、低い効率で回収され、ワーキングプールを作製するには多数の継代が必要であると思われた。各々のウイルスの完全な配列を決定して、偶発性の変異がないことを確認した。全てのｒＨＰＩＶ１／ＲＳＶ－Ｆウイルスワーキングプールは、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２ウイルスを除いて見かけの偶発性の変異は無かった：このウイルスに関して、９つのクローンをレスキューし、そのうちの１つだけが、偶発性の変異を欠く正確なゲノム配列を有した。他の８つのクローンは、偶発性の変異を含み、これは、ＨＰＩＶ１ Ｎ遺伝子の下流のＨＰＩＶ１転写シグナル（Ｎ遺伝子末端－遺伝子間－Ｐ遺伝子開始）および先行するＲＳＶ Ｆ ＯＲＦにおいて優勢であった。平行なｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２およびｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ２構築物の第２の位置におけるＲＳＶ Ｆ遺伝子の挿入部位は同一であったので、これによって、前者のウイルスによる問題は、それ自体による挿入部位ではなく、ＬＹ９４２Ａ変異（例えば、変更したポリメラーゼ機能）に特異的であったことが示唆される。
ＶｅｒｏおよびＬＬＣ－ＭＫ２細胞におけるＨＰＩＶ１／ＲＳＶ Ｆウイルスの複製。ＨＰＩＶ１／ＲＳＶウイルスの複製は、Ｖｅｒｏ細胞（図３７Ａおよび３７Ｃ）およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞（図３７Ｂおよび３７Ｄ）中で、それらの多段階増殖反応速度論を決定することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。細胞に、０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで感染させて、３２℃でインキュベートした。上清を、７日にわたって２４時間間隔で回収して、ウイルス力価をＨＡＤによって決定し、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した（図３７）。スチューデントのｔ検定を使用して、感染後（ｐ．ｉ．）２日目および７日目についてｗｔ ＨＰＩＶ１に対する各々のウイルスの力価の間の相違の統計学的有意差を決定した。７日目に、全てのウイルスが、Ｖｅｒｏ細胞中で７．２ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞では、７．４ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌよりも大きい最終力価まで複製し、ウイルスの間はわずかな相違であって、両方の細胞株では、ｗｔ ＨＰＩＶ１と比較して統計学的に有意ではなかった（図３７）。しかし、相違は、より早期の時点で、特に感染後（ｐ．ｉ．）２日目で観察された。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０ウイルスの場合（図３７ＡおよびＢ）には、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０空ベクターおよびｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ３は、感染後２日目で両方の細胞株中でｗｔ ＨＰＩＶ１と同様に複製した。しかし、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１の複製は、Ｖｅｒｏ細胞（ｐ＜０．００１）およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞（ｐ＜０．０５）で有意に低下し、およびｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０－Ｆ２のものは、Ｖｅｒｏ細胞で有意に低下した（ｐ＜０．０１）。ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａウイルス（図３７Ｃおよび３７Ｄ）について、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ空ベクターの複製は、Ｖｅｒｏ細胞ではｗｔ ｒＨＰＩＶ１のものより有意に低く、ただし、両方とも感染後２日目のＬＬＣ－ＭＫ２細胞で同様の力価まで増殖した。ｗｔ ｒＨＰＩＶ１と比較した複製の高度に有意な低下（ｐ＜０．０００１）が、Ｖｅｒｏ細胞でｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、－Ｆ２および－Ｆ３ウイルスで観察された。同様に、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３ウイルスは、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞での複製の有意な低下（それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．０００１、およびｐ＜０．０１）を示した。Ｖｅｒｏ細胞では、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１は、その親のｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ空ベクターと同じ速度で増殖したが、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２および－Ｆ３ウイルスの増殖（図３７Ｃ）は、比較的低下し、ただし、キメラウイルスの間のこれらの相違は、統計学的に有意ではなかった。
キメラｒＨＰＩＶ１／ＲＳＶ－ＦウイルスによるＲＳＶ ＦおよびＨＰＩＶベクタータンパク質の発現。ＲＳＶ Ｆタンパク質ならびにＨＰＩＶ１ベクターＮ、Ｐ、ＦおよびＨＮタンパク質の発現は、ウエスタンブロット解析によって全てのウイルスについて評価した。Ｖｅｒｏ細胞を５ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩで感染させ、３２℃で４８時間インキュベートした。変性および還元された溶解液を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットに供し、各々の個々のタンパク質に特異的な抗体を用いて解析した。ＲＳＶ Ｆは、最初に、ジスルフィド連結Ｆ１およびＦ２サブユニットへのフリン様プロテアーゼによる翻訳後切断であるＦ０前駆体として翻訳される。ＲＳＶ Ｆに特異的なモノクローナル抗体での免疫染色によって、Ｆ０（７０ｋＤ）およびＦ１（４８ｋＤ）の両方が検出された。ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｆ、およびＨＮタンパク質を、対応する抗ペプチドポリクローナル抗体で検出した。３つの独立した実験のうち１つからの代表的なブロットを、図３８Ａに示し、３つ全ての実験からの結果を、それぞれ図３８Ｂおよび図３８ＣのｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０および ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ構築物について定量し、値を各々のシリーズ中のＦ３構築物のものに対して１．０として正規化した。
ＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、およびＦ３ウイルスは、かなりの量のＲＳＶ
Ｆを発現し（図３８Ａ，レーン１－３、および図３８Ｂ）、これはタンパク質のバンド定量によって示されるように、Ｆ３と比較した場合、Ｆ１およびＦ２についてごくわずかに高く（図３８Ｂ）、相違は統計学的に有意ではなかった。従って、予期せぬことに、Ｆ１からＦ３の発現の３’－５’極性勾配は観察されなかった。しかし、対照的に、ＲＳＶ Ｆ発現の強力な極性の勾配が、ＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａウイルスの場合に観察され、Ｆ１ウイルスによるＲＳＶ Ｆの発現は、Ｆ２（ｐ＜０．０１）およびＦ３（ｐ＜０．０５）ウイルスと比較して有意に高かった（図３８Ａ、レーン５－６、および図３８Ｃ）。
ベクターＮ、Ｐ、Ｆ、およびＨＮタンパク質の発現は、ｗｔ ＨＰＩＶ１、空ベクター、ならびにＦ１、Ｆ２、およびＦ３構築物について、ＣΔ１７０およびＬＹ９４２Ａシリーズについて評価した。一般には、ＣΔ１７０変異は、ベクタータンパク質発現には影響せず、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０空ベクターは、ｗｔ ｒＨＰＩＶ１のものと同様のベクタータンパク質発現プロフィールを有したという結果であった（図３８Ｂ）。ＲＳＶ Ｆを発現する３つのバージョンのｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０ベクターの場合、Ｆ３ウイルスは、Ｎ、Ｐ、Ｆ、およびＨＮを、空のｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０ベクターのレベルと同様のレベルで発現した。Ｆ２ウイルスは、空のｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０ベクターと同様のＮタンパク質を発現したが、Ｐ、Ｆ、およびＨＮタンパク質の発現の低下を示し、そのうち、ＨＮの低下のみが、空ベクターと比較して統計学的に有意であった。Ｆ１ウイルスは、空ベクターに比較して、Ｎ（ｐ＜０．０５）、Ｐ（ｐ＜０．０１）、Ｆ（ｐ＜０．０５）、およびＨＮ（ｐ＜０．０５）を含む全てのベクタータンパク質で有意な低下を実証した。従って、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０ベクターへのＲＳＶ Ｆ遺伝子の挿入は、Ｆ３ウイルスを除いて下流ベクター遺伝子の発現を低下した。Ｆ１およびＦ２ウイルスの両方が、Ｖｅｒｏ細胞の感染の間早期に有意に低下した複製を示し（図３７Ａ）、およびベクタータンパク質の低下の合成によって、妥当な説明が得られる。
ＣΔ１７０変異とは対照的に、ＬＹ９４２Ａ変異は、ベクタータンパク質の発現に影響した：具体的には、ｗｔ ＨＰＩＶ１と比較して、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ空ベクターは、Ｐタンパク質（ｐ＜０．０５）、Ｆタンパク質（ｐ＜０．０５）、およびＨＮタンパク質（Ｐ＜０．０１）の発現が有意に低下しており、Ｎタンパク質については有意な相違はなかった（図３８Ａ、Ｃ）。ＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａの３つのバージョンの場合、Ｆ３ウイルスは、空ベクター骨格と比較してベクタータンパク質の量が軽度に低下していたが、有意な低下はなかった。興味深いことに、有意なベクタータンパク質低下のこの欠失は、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ３ウイルスと一致しており、Ｆ３インサート位置が、ベクタータンパク質発現を妨害せず、ベクターを妨害する部位が最小である部位を提供することが示唆される。Ｆ２ウイルスは他方では、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ空ベクターと比較して、Ｎ、Ｐ、Ｆ、およびＨＮタンパク質において、極めて顕著でかつ有意な低下を示した。比較すると、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ２ウイルスはまた、Ｐ、Ｆ、およびＨＮタンパク質の発現の低下を示したが、Ｎタンパク質の発現の低下は示さなかった。これは、予測された。なぜなら、第２のＦ２位置のＮの後ろの挿入は、３’－５’極性転写勾配に起因して下流遺伝子の発現を低下すると予想されるが、上流のＮ遺伝子は、観察されたとおり影響されないと予想されるからである。しかし、予期せぬことにｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２の場合、ＲＳＶ Ｆは、Ｎ遺伝子の下流に挿入されたが、Ｎタンパク質の発現もネガティブに影響された。ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１は、Ｎタンパク質の場合にのみ有意に低下した発現を有したが、Ｐ、Ｆ、およびＨＮタンパク質の発現は、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ空ベクターの発現と匹敵していた。
ｒＨＰＩＶ１／ＲＳＶ－Ｆベクターによる合胞体形成の比較。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＳＶ感染の特徴は、ＲＳＶ Ｆタンパク質によって媒介される特徴的な合胞体形成である。ｗｔ ＨＰＩＶ３またはｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０またはＬＹ９４２Ａ空ベクターによるＬＬＣ－ＭＫ２細胞単層の感染は、明白な合胞体形成を誘導しなかった（図３９、それぞれパネルＩ、Ｄ、またはＨ）。尖鋭な対比で、高レベルのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するＨＰＩＶ１ベクター、すなわち、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１および－Ｆ２ウイルス（図３９Ａおよび図３９Ｂ）およびｒＨＰＩＶ１－ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１ウイルス（図３９Ｅ）は、高レベルの合胞体を誘導した。合胞体形成は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現のレベルが、Ｆ１およびＦ２ウイルスを用いたよりもごくわずかに低い場合でさえ（図３８）、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ３ウイルス（図３９Ｃ）では証明されなかった（図３８）。合胞体形成はまた、ｒＨＰＩＶ１－ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２および－Ｆ３ウイルスでは証明されておらず（図３９Ｆおよび３９Ｇ）、これは、極めて低いレベルのＲＳＶ Ｆタンパク質を発現した（図３８）。この機能的なアッセイ（合胞体形成）によって、ＨＰＩＶ１ベクターから発現されたＲＳＶ Ｆタンパク質が折り畳まれて、正確にプロセシングされ、細胞表面で活性形態で蓄積することが示唆される。
さらに、ＣΔ１７０変異は、第２の細胞変性効果、すなわちアポトーシス増大と関連していた。これは、ｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０空ベクターで最も明白であった（図３９Ｄ）、なぜならアポトーシスの増強は、合胞体形成の非存在下でさらに容易に観察されたからである。ＣΔ１７０変異に起因するアポトーシスの誘導の増強は、高レベルのＲＳＶ－Ｆの発現にかかわらず（図３８Ｂ）、ｒＨＰＩＶ１－ＬＹ９４２Ａ－Ｆ３ウイルスがなぜ合胞体形成を誘導するのに効果的ではないかが説明される（図３９Ｃ）：ＣΔ１７０－媒介性の強化されたアポトーシスと関連する細胞の丸まり（例えば、図３９Ｄ）は、合胞体形成に必須の細胞間接触を低下し得ることを示唆することが合理的であるが、他の構築物を伴うＲＳＶ Ｆの極めて効率的な発現によって、合胞体形成がアポトーシス効果を克服するのに十分早期に開始することが可能になる場合がある（例えば、図３９Ｂ対図３９Ｃ）。
図３９でのＬＬＣ－ＭＫ２細胞で行った観察は、Ｖｅｒｏ細胞でも得られた。
ｒＨＰＩＶ１／ＲＳＶ－Ｆウイルスの温度感受性。注記したとおり、ＣΔ１７０変異は、以前の研究ではｔｓ表現型を付与しなかったが、ＬＹ９４２Ａ変異は、ｔｓ表現型を付与した（ＭｃＡｕｌｉｆｆｅら．２００４．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２０２９～２０３６；Ｎｅｗｍａｎら．２００４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：２０１７～２０２８）。ＨＰＩＶベクターへのＲＳＶ Ｆの挿入はまた、ｔｓ表現型を付与することが示された（Ｌｉａｎｇら．２０１４．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８８：４２３７～４２５０）。従って、ＨＰＩＶ１／ＲＳＶ－Ｆ構築物をｔｓ表現型の存在および大きさに関して評価した。具体的には、１０倍連続希釈物を調製して、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を感染するのに使用して、７つの複製物中で、３２、３５、３６、３７、３８、３９、および４０℃でインキュベートした。ウイルス力価は、モルモット赤血球を用いてＨＡＤによって決定し、力価は、ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した（図４３）。３２℃の許容温度での力価と比較した各々の制限温度での力価の低下（ｌｏｇ１０）を算出した。所定のウイルスについてのシャットオフ温度は、最低制限温度として規定し、ここで３２℃に対するその温度でのウイルス力価の平均ｌｏｇ１０低下は、同じ２つの温度でのｗｔ ｒＨＰＩＶ１の低下と比較して、≧２．０ ｌｏｇ１０であった（Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００５．Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：４６３１～４６４６）。ｔｓ表現型は、≦４０℃というシャットオフ温度を有すると規定した。
ＣΔ１７０変異は、以前の研究ではｔｓ表現型を付与しなかったが、本研究では、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０空ベクターは、４０℃というシャットオフ温度を有し（図３９）、従って、ｗｔ ＨＰＩＶ１と比較してｔｓであったが、効果は小さかった。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ２および－Ｆ３構築物はまた、４０℃のシャットオフ温度を有し、従って、空ベクターと有意に異なることはなかった。しかし、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１ウイルスは、３９℃という、より低いシャットオフ温度を有した（図４３）。本研究では、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ空ベクターは、以前の研究でのこの変異と関連する３５～３７℃という値と同様の３６℃のシャットオフ温度を有した（ＭｃＡｕｌｉｆｆｅら ＪＶＩ ７８：２０２９～２０３６、２００４；Ｂａｒｔｌｅｔｔら Ｖｉｒｏｌ Ｊ ４：６７、２００７）。ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１および－Ｆ２構築物は、空ベクターよりもｔｓであって、３５℃のシャットオフ温度であったが、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ３ベクターは、空ベクターと同じ３６℃のシャットオフ温度を有した（図４３）。従って、いずれかの弱毒化された骨格のＦ１位置へのＲＳＶ Ｆ遺伝子の挿入は、ｔｓ表現型を増大し、いずれかの骨格のＦ３位置への挿入は、ｔｓ表現型を増大せず、Ｆ２位置への挿入は、ＬＹ９４２Ａ骨格についてのみ表現型を増大した。
ＲＳＶ－Ｆを発現するワクチン接種物へのビリオンのパーセンテージ（ｉｎ ｖｉｔｒｏでのワクチン安定性）。ｒＨＰＩＶ１／ＲＳＶ－Ｆ構築物のワーキングプールを、蛍光二重染色プラークアッセイを用いて個々のウイルスプラーク中でのＲＳＶ Ｆ発現の頻度について評価した。Ｖｅｒｏ細胞に、１０倍連続希釈したウイルスを接種し、３２℃の許容温度でメチルセルロース積層下で６日間プラークを形成させた。ウイルスプラークを、３つのＲＳＶ Ｆ特異的マウスモノクローナル抗体およびヤギＨＰＩＶ１特異的ポリクローナル抗血清の混合物を使用することによって、ＲＳＶ ＦおよびＨＰＩＶ１タンパク質について同時免疫染色した（材料および方法を参照のこと）。一次抗体を、赤色および緑色の赤外色素とコンジュゲートした抗マウス－ＩｇＧおよび抗ヤギ－ＩｇＧ二次抗体を用いて検出し、ＲＳＶ Ｆを発現するＨＰＩＶ１プラークのパーセンテージを決定した。総数１４０、７７、および５９のプラークを、それぞれ、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３についてカウントし、全てが、ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現する１００％のＨＰＩＶ１プラークを有することを見出した。Ｆ１は、Ｆ２およびＦ３よりも小さいサイズのプラークを生じたが、Ｆ２およびＦ３プラークのサイズは、お互いと同様であった。全部で２１４、７０、および１９２のプラークを、ＲＳＶ Ｆ抗原を発現するＨＰＩＶ１プラークのうち１００％、１００％および９７％を示した、それぞれｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３についてカウントした。全体として、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａウイルスは、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０ウイルスと比べてかなり小さいサイズのプラークを形成した。このアッセイは、許容温度（３２℃）で行うので、小さい方のプラーク表現型（比較的さらに弱毒化された表現型およびより遅い伝播を示唆する）は、ｔｓ効果ではない場合もあることが示唆される。これはまた、それらの比較的遅い複製プロファイルとも一致していた（図３７）。
ハムスターの呼吸器官におけるｒＨＰＩＶ１／ＲＳＶ－Ｆウイルスの複製。ウイルスを、それがハムスターの上気道および下気道（それぞれＵＲＴおよびＬＲＴ）で複製する能力について評価した。ハムスターに、１動物あたり１０５ ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌの用量で鼻腔内接種した。ウイルス複製を評価するために、ハムスターを、感染後３日目および５日目に安楽死させ（１日あたり１ウイルスあたり６動物）、鼻甲介（ＵＲＴ）および肺（ＬＲＴ）を収集した。個々の鼻甲介および肺のホモジネートを、ＨＡＤアッセイを用いてＬＬＣ－ＭＫ２細胞で滴定によってウイルス複製のために分析し、その力価をｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した。ウイルス力価は、ＵＲＴ（図４０Ａ）およびＬＲＴ（図４０Ｂ）中で、それぞれ白抜き三角および黒塗りの丸として３日目および５日目について示される。各々の記号は個々の動物に相当する。
全体として、ＲＳＶ Ｆを発現する全てのｒＨＰＩＶ１ベクターについてのピークウイルス力価は、ｗｔ ＨＰＩＶ１の力価より低く、このことは、骨格変異の弱毒化効果（ＣΔ１７０またはＬＹ９４２Ａ）、および挿入されたＲＳＶ Ｆ遺伝子の効果を示唆している。ＵＲＴでは、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０空ベクターは、５日目に有意に弱毒化され３日目には弱毒化されないが、ｗｔ ＨＰＩＶ１と比較して肺では両日ともに有意に制限された。ＵＲＴでは、有意な複製の低下が、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１については３日目にのみ（ｐ＜０．０５）、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ２については両日で観察された（ｐ＜０．０００１）；－Ｆ３は、両日とも、ｗｔ ｒＨＰＩＶ１のものと同様のレベルで複製した。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３は全てが、３日目および５日目の肺で有意に（ｐ＜０．０００１）弱毒化された；Ｆ１およびＦ３は、全てで検出不能であって、Ｆ２は６匹の動物のうち５匹では検出できなかった。ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ空ベクター複製は、３日目に有意に低下し、ＵＲＴでは５日目にはウイルスは検出されなかったが、肺では両日とも検出されたウイルスはなく、このことは、ＬＹ９４２Ａ変異のｔｓ表現型と一致した有意な弱毒化を示唆している（ＭｃＡｕｌｉｆｆｅら．２００４．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２０２９～２０３６）（図４３）。ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３ウイルスはまた、３日目および５日目にＵＲＴおよび肺の両方で有意に（ｐ＜０．０００１）弱毒化され、ウイルス複製はほとんどの動物で検出不能であった。
以前には、ＡＧＭで強力に弱毒化されることが実証され（Ｂａｒｔｌｅｔｔら．２００７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊ ４：６７）、血清陰性の小児で過剰に弱毒化されたＨＰＩＶ１ワクチン候補（ｒＨＰＩＶ１－ＣＲ８４Ｇ／Δ１７０ＨＮ５５３ＡＬＹ９４２Ａ）を、開発中のワクチン候補物の複製比較のため、および弱毒化のレベルを評価するために対照として含んだ。予想どおり、このウイルスは、ハムスターでは有意に弱毒化され３日目および５日目にＵＲＴおよび肺で複製は観察されなかった。本研究で開発された構築物のほとんどは、弱毒化されたが、検出可能な複製は、小児で過剰に弱毒化された、前のワクチン候補よりもいくぶんか弱毒化が弱いことが示唆され、これによって、本研究で開発された構築物は、適切な弱毒化表現型を有し得ることが示唆される。第２のゲノム位置（ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２）からＲＳＶ Ｆを発現するキメラウシ／ヒトＰＩＶ３は、生のＲＳＶワクチンとして開発されている（序、および実施例１）。臨床試験では、このワクチン候補物は、安全かつ十分耐容されたレベルの複製を有する６～２４月齢のＲＳＶ血清陰性小児中で安全であることが見出された（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら．２０１２．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｊｏｕｒｎａｌ ３１：１０９～１１４）。ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２ウイルスは、試験されているｒＨＰＩＶ１ワクチン候補の弱毒および免疫原性の比較のアセスメントのための参照ウイルスとして含まれた。両日のｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、または－Ｆ３の複製レベルは、ＵＲＴおよび肺の両方においてｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２のものと統計学的に同様であるか、または有意に低かった。同様に、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３ウイルスはまた、ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２と比較して、３日目および５日目にＵＲＴおよび肺の両方で有意に低下した複製を示した。これらのデータによって、ＣΔ１７０またはＬＹ９４２Ａ骨格変異のいずれかを有するＨＰＩＶ１ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで十分に弱毒化されることが示唆され、かつｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２ウイルスに対して同様であるか、またはそれより弱毒化されている複製表現型が示される。
ＵＲＴでは、全てのウイルスについての力価（複製されなかったｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１および－Ｆ３を除く）は、５日目には、３日目よりも高かった（図４０Ａ）。対照的に、ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２は、５日目にピーク力価を得た。全体として、肺では、ＲＳＶ Ｆを発現する全てのベクターは、感染後３日目および５日目にｗｔ ＨＰＩＶ１と比較して有意に（ｐ≦０．０００１）制限された（図４０Ｂ）、また５日目にｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２と比較して有意に制限された。
ｉｎ ｖｉｖｏ複製後のキメラｒＨＰＩＶ１ウイルスによるＲＳＶ Ｆタンパク質発現の安定性。ＲＳＶ Ｆの発現をサイレンシングするウイルスの正の選択は、ＲＳＶ Ｆ免疫原性を損なう場合があるｉｎ ｖｉｖｏの複製の間に生じる場合がある（Ｙａｎｇら．２０１３．Ｖａｃｃｉｎｅ ３１：２８２２～２８２７）。変異は、ＲＳＶ Ｆ ＯＲＦの中で、またはその発現を制御する調節性転写シグナルで生じ得、その結果、ＲＳＶ Ｆタンパク質発現が低下されるか、または除かれる。ｉｎ ｖｉｖｏ安定性のためのｒＨＰＩＶ１ベクターを評価するために、Ｖｅｒｏ細胞に、感染したハムスターの鼻甲介および肺の連続希釈ホモジネートを感染させた。蛍光二重免疫染色プラークアッセイを行って、ＲＳＶ Ｆを発現するウイルス粒子のパーセンテージを決定した。肺での複製の欠失と一致して（図４０Ｂ）、肺ホモジネート中でＲＳＶ Ｆを発現する全てのベクターについて検出できたプラークはなかった。同様に、複製が劣るせいで、ＵＲＴ中でＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａウイルスについて、検出可能なプラークはなかった。ＵＲＴ中で効率的に複製された、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０ウイルスについての安定性の結果を示す（図４４）。これらのウイルスは、感染後３日目および５日目でＲＳＶ Ｆを発現する全体として９８％超のプラークでｉｎ ｖｉｖｏ複製後に安定であった。分析した３０のサンプルのうち、２９が１００％を有し、かつサンプルの１つだけがＲＳＶ Ｆを発現する９８％（２％損失）のＰＦＵを有した。これらのデータによって、ＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０ベクターは、ハムスターモデルではかなり安定であることが示唆され、少なくとも５日間のｉｎ ｖｉｖｏ複製後にＲＳＶ Ｆ発現がサイレンシングされた変異体の選択の証拠は示されなかった。
免疫原性
ＲＳＶ Ｆを発現するキメラｒＨＰＩＶ１ウイルスによる免疫は、ＲＳＶおよびＨＰＩＶ１に対する血清ウイルス中和抗体（ＮＡｂ）を誘導する。ＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１ウイルスの免疫原性を決定するために、１ウイルスあたり６つのハムスターの群を、動物１匹あたり１０５ ＴＣＩＤ５０を用いて鼻腔内に接種した。ｗｔ ＲＳＶ、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ、およびｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２を、対照として含んだ。免疫されたハムスター由来の血清を、感染後２８日目で収集し、ＲＳＶおよびＨＰＩＶ１に対するＮＡｂ力価をＰＲＮＴ６０アッセイによって決定した（図４５）。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３は、お互いに統計学的に異なることはない力価でＲＳＶ特異的ＮＡｂを誘導した。これは、驚くべきことではない。なぜなら全ての３つのウイルスが、同様のレベルのＲＳＶ Ｆタンパク質発現を示したからである（図３８Ａおよび３８Ｂ）。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１および－Ｆ２は、－Ｆ３ウイルスよりもわずかに高いＲＳＶ Ｆ発現を有したが、この相違は、統計学的に有意ではなかった（図３８Ｂ）。同様に、－Ｆ１および－Ｆ２ウイルスはまた、感染の間に合成されたＲＳＶ Ｆの量とおそらく関連している－Ｆ３ウイルスよりも比較的高い融合活性および合胞体形成を示した（図３９Ａ～３９Ｃ）。統計学的に有意ではないが、ＮＡｂ力価は、発現されたＲＳＶ Ｆの量ではなくそれらのｉｎ ｖｉｖｏ複製プロファイルとさらに一致するＦ２と比較してＦ１およびＦ３ウイルスに関してわずかに高いようである（図４０Ａ）。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３によって誘導されるＲＳＶ ＮＡｂ力価はｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２によって誘導される力価よりも有意に低かった（ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２と比較したこれらのウイルスの有意に低下した複製からおそらく生じる相違）（図４０Ａおよび図４０Ｂ）。
ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３ウイルスは、ＲＳＶに対してＮＡｂ応答を誘導できなかった。これは、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１がＶｅｒｏ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ感染に対してｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３のものと同様のＲＳＶ F発現を示したので予測されなかった（図３８Ａ）。しかし、ＬＹ９４２Ａ変異は、高度に弱毒化され、３６℃というシャットオフ温度でｔｓ表現型を付与したことに注目することが重要である（図４３）。ＬＹ９４２Ａ変異体ウイルスは、ハムスターでは示す複製が最小であるかまたは検出不能であったと予想された（体温：３６．７～３８．３℃；メルク・マニュアル（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ））。骨格表現型と一致して、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３はまた、それぞれ、３５℃、３５℃、および３６℃というシャットオフ温度でｔｓであって、これによって、Ｆ１およびＦ２位置でのＲＳＶ Ｆの挿入は、シャットオフ温度を１℃ずつ低下し、それらをさらにｔｓにさせたことが示される。従って、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１は、許容温度でｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３ウイルスのレベルと匹敵するレベルでＲＳＶ Fを発現できたが（図３８Ａ）、ＲＳＶ ＮＡｂを誘導することは、おそらくその強力なｔｓ表現型およびｉｎ ｖｉｖｏでの複製が不能なせいでできなかった。ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２および－Ｆ３ウイルスは、見たところ、２つの交絡因子を有した：それらは比較的劣ったＲＳＶ Ｆ発現を示し（図３８Ａおよび図３８Ｃ）、さらにｔｓであって、ｉｎ ｖｉｖｏで複製せず（図４０Ａおよび図４０Ｂ）、ＲＳＶ ＮＡｂ応答の欠失を生じた。従って、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３ウイルスは、それらの過剰な弱毒化ｔｓ表現型ならびに複製および免疫原性のｉｎ ｖｉｖｏでの欠失という理由で、免疫原性ではなく、ワクチン候補物を生成しなかった。
ハムスターにおけるＨＰＩＶ１特異的なＮＡｂ応答はまた、ＰＲＮＴ６０アッセイによっても評価した（図４５）。全体として、ＨＰＩＶ１ ＮＡｂ力価のレベルは、ＲＳＶ ＮＡｂ力価に比較して低かった。この方法で示すとおり、モルモット補体は、ＲＳＶの中和アッセイに含まれたが、ＨＰＩＶ１中和アッセイからは、それがＨＰＩＶ１を中和するので除外された。補体の欠失は、一般的に低下したＨＰＩＶ１ ＮＡｂ力価の理由である場合がある。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ２および－Ｆ３ウイルスは、検出可能なレベルのＨＰＩＶ１ ＮＡｂを誘導しなかった。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０空ベクターおよびｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１のみが、検出可能なＨＰＩＶ１－特異的なＮＡｂ応答を誘導し、これは、お互いと統計学的に異なることはない力価であった。これは、期待と正反対であった。なぜなら、全てのベクタータンパク質の発現は、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１について有意に低下されたからである（図３８Ａおよび図３８Ｂ）。これはまた、Ｆ２またはＦ３ウイルスと比較して１Ｃによる低いシャットフ温度を有し、かつこれは、Ｆ３ウイルスのレベルと同様のレベルでｉｎ ｖｉｖｏで複製した。従って、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１は、－Ｆ３ウイルスと比較して、同様または弱いＨＰＩＶ１特異的なＮＡｂ応答を誘導すると期待された。しかし、ＣΔ１７０－Ｆ２の劣ったＨＰＩＶ１免疫原性は、ＦおよびＨＮタンパク質のその低下した発現（図３８Ｂ）ならびにＵＲＴおよびＬＲＴにおける劣った複製（図４０）と一致していた。ＨＰＩＶ１ ＮＡｂ応答の欠失は、ＣΔ１７０－Ｆ３ウイルスについては予想されなかった。これは、全てのＨＰＩＶ１タンパク質を、空ベクターのものと同様のレベルで発現し（図３８Ａおよび図３８Ｂ）、同様に複製し、そして空ベクターのものと同様のシャットオフ温度を有したが、検出可能なＮＡｂ応答は示さなかった。
全てのｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａウイルス（空ベクターを含む）は、検出可能なレベルのＨＰＩＶ１特異的なＮＡｂを誘導しなかった。全てのｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａウイルスが、低下したレベルのＨＰＩＶ１タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏで発現し（図３８Ａおよび図３８Ｃ）、ｉｎ ｖｉｖｏでは劣った複製を示すか、または複製を示さなかった。これと一致して、これらのウイルスはまた、ＲＳＶに対する免疫原性の欠失も示した
。それらの劣った免疫原性は、おそらく、それらの強力なｔｓ表現型の結果（図４３）およびｉｎ ｖｉｖｏ複製がないこと（図４０）の結果である。
ＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１ベクターによる免疫は、ｗｔ ＲＳＶチャレンジに対する防御を提供する。ハムスターを、上記のようにＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１で免疫して、１０６ＰＦＵのｗｔ ＲＳＶを使用して免疫後３０日目でチャレンジした。ハムスターをチャレンジ後３日目で安楽死させて、鼻甲介および肺の中のＲＳＶ力価を、Ｖｅｒｏ細胞でプラークアッセイによって決定して、チャレンジＲＳＶ複製に対する防御を評価した（図４１Ａおよび図４１Ｂ）。ＲＳＶ感染および複製に対するワクチン候補によって得られる防御は、それらがＲＳＶ特異的な血清ＮＡｂを誘導する能力と相関した。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１および－Ｆ３は、ＲＳＶ複製に対して有意な防御を提供し、かつｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０空ベクターと比較してＵＲＴにおいて有意に低下した（それぞれ、ｐ＜０．０００１およびｐ＜０．０５）ＲＳＶ力価を示し、－Ｆ２ウイルスは効果を有さなかった。肺では、全ての３つのｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３ウイルスは、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０空ベクターと比較して平均ＲＳＶ力価を低下し、－Ｆ１ウイルスによるＲＳＶ低下のみが、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。予想どおり、ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２は、ＵＲＴ（Ｐ＜０．０００１）および肺（ｐ＜０．０５）において、ＲＳＶチャレンジに対して有意な防御を提供し、これは、前の報告と一致していた（Ｌｉａｎｇら．２０１４．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８８：４２３７～４２５０、および実施例１）。
ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２ウイルスとｒＨＰＩＶ１ワクチン候補との統計学的比較によって、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１によってもたらされる防御は、ＵＲＴおよび肺の両方でｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２の防御と統計学的に同様であったことが示された。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１は、ハムスターにおいて、感染後３日目でｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２の力価と同様の力価まで複製したが、感染後５日目で有意に低下した複製を示し、これによって、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１は、ｉｎ ｖｉｖｏで十分に弱毒化されることが示唆される。これによって、ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２のものと同様にＲＳＶチャレンジに対して防御するその能力とともに、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１は、弱毒化および免疫原性の所望の特徴を有することが示され、かつ弱毒生ＲＳＶワクチン候補としてさらにさらに開発されるべきであることが示された。
ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３ウイルスは、ＵＲＴおよび肺中でＲＳＶチャレンジに対する防御を提供せず、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ空ベクターのものと同様のチャレンジＲＳＶロードを示した。これは、ＲＳＶに対するｉｎ ｖｉｖｏ複製および免疫原性のそれらの欠失と一致していた。
考察
げっ歯類および／または非ヒト霊長類において免疫原性であった、弱毒化および／またはｔｓ変異を保有するｒＨＰＩＶ１の種々の弱毒化バージョンは以前に開発された。それぞれ、６ヌクレオチドの欠失および３ヌクレオチドの置換を含むＣΔ１７０またはＬＹ９４２Ａ変異のいずれかを含む２つの弱毒化ｒＨＰＩＶ１骨格をアッセイした。ＲＳＶ Ｆは、適切に弱毒化され、さらに十分に免疫原性であり、ｗｔ ＲＳＶチャレンジに対して防御する構築物を特定する目的で各々の骨格の第１、第２、または第３のゲノム位置に挿入された。ＲＳＶ Ｆを発現する全てのｒＨＰＩＶ１ウイルスを、逆遺伝学によって首尾よくレスキューした。Ｖｅｒｏ細胞およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞における増殖反応速度論によって、全てのウイルスが、感染後７日目で決定された極めて類似でかつ統計学的に識別できない最終力価まで増殖したことが示された（図３７）。しかし、複製の有意な相違が、２日目に両方の細胞株で観察された。ＬＹ９４２Ａ変異は、少なくともＶｅｒｏ細胞ではＣΔ１７０変異よりも強力な弱毒化効果を有すると思われた。予想に反して、ｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０ウイルスは、ＩＦＮ－Ｉ欠損Ｖｅｒｏ細胞と比較して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－Ｉ）補体ＬＬＣ－ＭＫ２中では弱毒化されなかった。ＲＳＶ Ｆを発現するｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０のうちで、ｗｔ ＨＰＩＶ１と比較した有意な弱毒化が、Ｖｅｒｏ細胞において－Ｆ１および－Ｆ２ウイルスについて（図３７Ａ）およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞において－Ｆ１について（図３７Ｂ）観察されたが、－Ｆ３複製は、空ベクターおよびｗｔ ＨＰＩＶ１と同様であった。これらのデータによって、－Ｆ１または－Ｆ２ウイルスにおいて３’近位位置により近いＲＳＶ Ｆの挿入は、弱毒化されるが、この効果は、一過性であって、全てのウイルスは、同様の最終の力価まで増殖した（図３７Ａおよび図３７Ｂ）。－Ｆ１、－Ｆ２および－Ｆ３を含む全てのｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ骨格ベクターは、７日目に同様の最終力価まで増殖した。しかし、それらはまた、２日、３日および４日目でＶｅｒｏ細胞およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞の両方で複製の低下を示したが、５～７日間のｗｔ ＨＰＩＶ１に対して同様であった。ＲＳＶ Ｆインサートが誘導した弱毒化は、ｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０ベクターと比較してｒＨＰＩＶ１ＬＹ９４２Ａについてかなり大きく（図３７Ｄ）、これによって、ＲＳＶ Ｆインサートが既に有意に弱毒化された骨格に対してより強力な弱毒化効果を有することが示される。
全てのウイルスを、それらが３２℃の許容温度でインキュベートされた感染されたＶｅｒｏ細胞のウエスタンブロット解析によってＲＳＶ Ｆタンパク質を発現する能力について検査した。ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｆ、およびＨＮタンパク質の発現をまた評価して、ベクタータンパク質発現に対する種々の位置でのＲＳＶ Ｆ挿入の効果を決定した。予期せぬことに、ＲＳＶ Ｆ発現の極性勾配は、ｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０ベクターに関しては観察されなかった。ｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０－Ｆ１は、試験した全てのベクタータンパク質の有意に低下された発現を実証した。同様に、Ｎタンパク質を除いて、ｒＨＰＩＶ１ＣΔ１７０－Ｆ２はまた、Ｐ、Ｆ、およびＨＮタンパク質の発現の低下を示した（図３８Ａおよび図３８Ｂ）。これと一致して、－Ｆ１および－Ｆ２ウイルスは両方とも、感染の間早期にＶｅｒｏ細胞中で複製の低下を示した（図３７Ａ）。これらのデータによって、Ｆ１およびＦ２ウイルスについて、ベクタータンパク質合成の低下およびその後の弱毒化された複製の組み合わせ効果は、ＲＳＶ Ｆ発現の低下およびその極性勾配の欠失を担う場合があることが示唆される。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ３は、その遠位ゲノム位置におそらく起因して、Ｆ１およびＦ２と比較してＲＳＶ Ｆ発現のわずかな低下を示した。ＲＳＶ Ｆ発現プロファイルは、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａベクターに関してかなり異なっており、これによって、Ｆ２およびＦ３と比較して、有意に高いＲＳＶ Ｆ発現を示すＦ１ウイルスで発現の強力な極性の勾配が実証された（図３８Ａおよび図３８Ｃ）。予想どおり、第１の位置におけるＲＳＶ Ｆの挿入は、Ｆ１ベクターについてのＮタンパク質発現を有意に低下したが、Ｐ、ＦおよびＨＮタンパク質は、影響されず、それらの空のベクター対応物の発現と同様の発現を有した（図３８Ａおよび図３８Ｃ）。ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２が示すＲＳＶ Ｆの発現は極めて劣っており、同様に全てのベクタータンパク質が示された（図３８Ａおよび図３８Ｃ）。上記のとおり、このウイルスは、高度に弱毒化された表現型およびレスキューの間の変異の蓄積に起因してレスキューすることが最も困難であった。しかし、実験で最後に使用したウイルスは、ゲノム配列決定によって確認された偶発性の変異は有さなかった。従って、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ骨格中のＦ２位置におけるＲＳＶ Ｆの挿入は、ウイルスでかなり有害であると思われ、このことは、ＲＳＶ Ｆを含む試験された全てのベクタータンパク質の大幅に有意な低下を示す。この結果についての非限定的な説明の１つは、これがインサート位置の組み合わせた効果であり、骨格を高度に弱毒化したことである。なぜならこのような効果は、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ２について観察されなかったからである。その増殖の反応速度論（図３７Ｃ－３７Ｄ）を参照して、ｒＨＰＩＶ１ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２は、全てのｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａベクターのうち最も弱毒化された。従って、ベクタータンパク質合成の全体的な低下は、その複製を有意に低下し、その結果、ＲＳＶ Ｆ発現の低下が生じたと思われる。ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ３ウイルスは、空ベクターと同様のレベルでベクタータンパク質を発現したが、Ｆ１と比較してＲＳＶ Ｆ発現の１０倍を超える低下を示した（図３８Ａおよび図３８Ｃ）。これによって、第３ゲノム位置でのＲＳＶ Ｆ挿入は、ベクタータンパク質発現に負に影響しなかったことが示され（図３８Ａおよび図３８Ｃ）、ただし、極性の転写勾配におけるその遠位位置におそらく起因して、劣ったＲＳＶ Ｆ発現が実証された。
天然のＲＳＶ Ｆは、合胞体形成を生じる近接する、感染させた細胞の原形質膜融合を生じる。ＨＰＩＶ１ベクターＦタンパク質は、合胞体形成を生じず、従って、これは、ＲＳＶ Ｆの機能性および天然型、ならびに発現の量の指標として用いられる。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０またはＬＹ９４２Ａベクターから発現されたＲＳＶ Ｆによる合胞体の形成を、Ｖｅｒｏ細胞およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞で評価した。単層中のほとんどの細胞の融合を示す過剰な合胞体形成は、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１および－Ｆ２を用いて、ならびにｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１を用いて観察され（図３９）、このことは、組み換えＲＳＶ Ｆタンパク質が、機能的でありかつ恐らく天然のコンホメーションであることを示唆している。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ３ならびにＬＹ９４２Ａ－Ｆ２および－Ｆ３は、おそらく、明白な合胞体形成は示さなかった。合胞体形成の程度は、ウエスタンブロットによって検出されたＲＳＶ Ｆ発現のレベルと一致していた（図３８Ａ～図３８Ｃ）。
ｔｓ表現型は、ｉｎ ｖｉｖｏでウイルス複製に重要な役割を果たし、それによって免疫原性が決定されるので、ＲＳＶ Ｆを発現するベクターのｔｓ表現型を評価した。４０℃でさえｔｓではないｗｔ ＨＰＩＶ１とは対照的に、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０およびＬＹ９４２Ａ骨格は、それぞれ４０℃および３６℃でｔｓであった（図４３）。注目すべきは、Ｆ１でのｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０における、およびＦ１またはＦ２位置でのｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２ＡにおけるＲＳＶ Ｆの挿入は、シャットオフ温度を１℃ずつ下げ、それによって、それらはわずかにさらにｔｓとなったことである。この効果は、ＨＰＩＶ１に固有ではない場合がある。なぜなら、同様の効果が、以前の研究、Ｌｉａｎｇら．２０１４．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８８：４２３７～４２５０において、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターへのＲＳＶ Ｆ挿入で観察されたからであった）。ｔｓ表現型の増強は、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ２について観察されたが、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ２については観察されず、このことで、外来遺伝子の挿入によって、既に有意にｔｓであるウイルスのｔｓ表現型が増強されることが示される。
ｒＨＰＩＶ１ベクターは、それらの複製および免疫原性を評価するためにハムスターにおいて評価した。全てのｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａウイルスは、過剰に弱毒化されて、ウイルス複製はほとんどの動物のＵＲＴおよび肺で検出不能であった。これは、３５～３６℃のシャットオフ温度を有するそれらの高度にｔｓの表現型と一致している。複製できないことは、ＲＳＶ Ｆ挿入に起因するものではないようだが、それらのｔｓ表現型の影響である可能性が高い。なぜなら空ベクターでさえ肺では複製せず、ＵＲＴでの複製は劣っていたからである。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３は、全体として高度に制限されており、肺では検出不能であったが、空のｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０ベクターは、低レベルの複製を示し、これは、ｗｔ ＨＰＩＶ１のものよりも有意に低く、これによってＲＳＶ Ｆインサートの存在は、肺において既に弱毒化されたｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０骨格に対して追加の弱毒化の影響を有したことが示唆される。肺とは対照的に、全てのｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０ベクターは、全ての動物のＵＲＴで十分複製した。Ｆ１およびＦ２ウイルスは、ただしＦ３ではないが、ｗｔ ＨＰＩＶ１と比較して有意に弱毒化されており、Ｆ２は、Ｆ１よりも弱毒化されていた。これは予想されなかった。なぜなら、一般に、ゲノムの３’末端により近い挿入は、より高い弱毒化を生じるからである。これはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＦ１およびＦ２（ただしＦ３ではない）の比較的遅い初期増殖と一致しており（図３７）、これによって、Ｆ１および特にはＦ２
位置でのＲＳＶ Ｆの挿入は、追加的な弱毒化効果を有することが示される。Ｆ１ウイルスは、所望の程度の弱毒化を有すると思われるが、Ｆ２およびＦ３ウイルスは、それぞれ過剰弱毒化および過小弱毒化されている。
弱毒化と免疫原性との間の最適のバランスを得ることは、弱毒生ワクチンによるチャレンジである。弱毒化されたｒＨＰＩＶ１ベクターが十分弱毒化されたか否かを評価するために、それらの複製を、第２のゲノム位置からＲＳＶ Ｆを発現するリーディングＲＳＶワクチンベクターである、ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２の複製と比較した（Ｌｉａｎｇら．２０１４．Ｊ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８８：４２３７～４２５０）。３日目および５日目のｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、または－Ｆ３の複製は、ＵＲＴおよび肺の両方で、ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２の複製と統計学的に同様であるか、または有意に低かった。これによって、ＲＳＶ Ｆの挿入と一緒のＣΔ１７０変異が、少なくともこの動物モデルで、所望のレベルの弱毒化を達成したらしく、その結果３つの全てのベクターが肺で高度に制限されるが、免疫原性に必要であるＵＲＴにおけるｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２と同様の弱毒化された複製を実証することが示唆される。
ＲＮＡウイルスベクターのワクチンで遭遇した困難は、ｉｎ ｖｉｖｏでの外来抗原遺伝子の不安定性である（Ｙａｎｇら．２０１３．Ｖａｃｃｉｎｅ ３１：２８２２～２８２７）。変異は、エラー・プローン（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ）ポリメラーゼ、およびインサートの発現を維持する必要性の欠失に起因して生成する。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの背信のせいで得られた外来抗原における何らかの変異は、それらが選択性の利点を提供するにつれて正に選択される。免疫後のｉｎ ｖｉｖｏでのＲＳＶ Ｆ発現の安定性を決定するために、ハムスターの呼吸組織から回収されたウイルスを、蛍光二重染色プラークアッセイによって解析した。これは、ＵＲＴにおいて検出可能な複製を示したＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、およびＦ３ウイルスについてのみ行ってもよい（図４４）。サンプルのほとんどについて、安定なＲＳＶ Ｆ発現は、ＲＳＶ Ｆ発現が９８％プラークについて検出された１つのＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１サンプルを除いて、３つ全てのウイルスについて観察された。これらのデータによって、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０ベクターが、ｉｎ ｖｉｖｏ複製の間にＲＳＶ Ｆの安定な発現を維持することが示された。
ｒＨＰＩＶ１ベクターの免疫原性は、ＰＲＮＴ６０アッセイを行うことによって評価した。ＲＳＶのアッセイは、補体単独によるＨＰＩＶ１の直接中和のおかげで、ＨＰＩＶ１中和アッセイから除去したモルモット補体の存在下で行った。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１、－Ｆ２、および－Ｆ３は、それぞれ、７．３、４．７、および６．７というＰＲＮＴ６０（ｌｏｇ２）力価でＲＳＶ中和抗体を誘導した（図４５）。Ｆ１は最高の抗体力価を実証したが、これは、Ｆ２およびＦ３によって誘導される抗体力価と統計学的に同様であった。これらの力価は、ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２またはｗｔ ＲＳＶ対照によって誘導される力価よりも有意に低く、これはＵＲＴおよび肺の両方で、それらの全体的に比較的低下した複製という結果である場合がある。ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３ウイルスは、検出可能なＲＳＶまたはＨＰＩＶ１中和抗体応答を誘導せず、これは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてそれらの複製が欠けていることと一致していた。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１のみ（およびＦ２でもＦ３でもない）は、検出可能なＨＰＩＶ１中和抗体を誘導した。これは予測不能であった。なぜなら、Ｆ２およびＦ３は、ハムスターで複製を示し（図４０）およびＲＳＶ ＮＡｂを誘導したからであった。上記で示されるとおり、モルモット補体（ＰＲＮＴ６０読み出しを増強することが公知）は、ＨＰＩＶ１中和アッセイには含まれない場合がある。全体的な低いＨＰＩＶ１抗体力価および検出可能な応答の欠失は、ハムスター中で複製されたウイルスでさえ、補体を欠くアッセイの、より弱い感度に起因する場合がある。
ＲＳＶ感染に対するベクターの防御有効性を決定するために、全ての免疫されたハムスターを、１匹の動物あたり高用量（１０６ｐｆｕ）のｗｔ ＲＳＶを用いて免疫後３０日目で鼻腔内にチャレンジした。チャレンジに対する保護は、鼻甲介および肺におけるＲＳＶ複製を決定することによって評価した（図４１Ａおよび図４１Ｂ）。保護は免疫原性と直接相関した（図４５）。ＲＳＶ ＮＡｂ力価と高度に一致して、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１は、Ｆ３よりも保護的であって、防御はＦ２によって提供されなかった。保護は、ＵＲＴおよび肺の両方でＦ１について、およびＦ３についてはＵＲＴでのみ統計学的に有意であった。重要なことに、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１は、ＵＲＴおよび肺における防御を与え、これはｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２とは統計学的に識別できなかった。これは、いくぶん予想されなかった。なぜなら、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１は、ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２のものよりも有意に低いＲＳＶ Ｎａｂ力価を誘導し、これによって、比較的低いＮＡｂ力価が、同様の防御を達成するために十分であったことが示唆される。この解釈は、コットンラットの呼吸器官でのＲＳＶ複製が、血清Ｎａｂ力価が１：１００以上であった場合に低下されるという証拠によって支持される（Ｐｒｉｎｃｅら．１９８５．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ５５：５１７～５２０）。やはり、それらでセロコンバージョンがないことと一致して、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａ－Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３は、チャレンジに対してなんら防御を提供せず、空のベクターのものと同様のＲＳＶロードを有した。これらのデータによって、ｒＨＰＩＶ１ ＬＹ９４２Ａベクターは、それらのｔｓ表現型に起因して過剰弱毒化され、ハムスター中で複製を生じず、ＲＳＶおよびＨＰＩＶ１の両方の免疫原性の欠失を生じたことが明確に示される。対照的に、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０ベクターは、肺で高度に制限されるが、ＵＲＴでは複製した。本研究で試験されたベクターの中で、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１は、十分に弱毒化され、まだＲＳＶに対して十分に免疫原性であると思われる。ハムスター中で過剰に弱毒化されると思われた構築物は、さらに許容される霊長類宿主で評価した場合、さらに適切に行われることが認識される。
まとめると、本実施例は、挿入された遺伝子からＲＳＶ Ｆ抗原を発現するために適切な見込みのある弱毒化された骨格として、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０を特定した。ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０ベクターのＦ１（プレ－Ｎ）ゲノム位置が、ＲＳＶ Ｆを挿入するために試験された位置の間で好ましかったことが体系的にも決定された。この研究によってまた、ｒＨＰＩＶ１ ＣΔ１７０－Ｆ１は、見込みのあるワクチン候補であり、かつ以下のいくつかの所望の特徴を保有することが実証された：（ｉ）これは、非ヒト霊長類（３）における弱毒化のために十分特徴付けられた骨格に基づく、（ｉｉ）これは、ワクチン製造のための本質的な特徴である、ｗｔ ＨＰＩＶ１のものと同様の最終力価までＶｅｒｏ細胞中で複製した、（ｉｉｉ）ＲＳＶ Ｆの挿入は、これを、空のＣΔ１７０骨格よりもわずかに多く、ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２と同様のレベルまで弱毒化し、（ｉｖ）この構築物は、ｉｎ ｖｉｖｏ複製後に安定であって、ＲＳＶ Ｆ発現を維持した、そして（ｖ）これは、最も免疫原性のＨＰＩＶ１ベクターであって、最高のＲＳＶおよびＨＰＩＶ１中和抗体力価を誘導し、かつまたｗｔ ＲＳＶチャレンジに対して最も防御的であった。
この知見によって、ＲＳＶおよびＨＰＩＶ１に対する粘膜免疫のための二価ワクチンとしてＲＳＶ Ｆを発現するＨＰＩＶ １ベクターを使用することが可能であることが示される。ＨＰＩＶ１ベクターのＲＳＶワクチンは、一次ＲＳＶワクチンとして、または生弱毒化ＲＳＶによって最初に誘導された免疫をブーストするために用いられる。ＨＰＩＶ１ベクターのＲＳＶワクチンアプローチは、弱毒化されたＲＳＶ株の開発に関連する内因性の問題を取り除き、かつ資源の限られた状況でさえＲＳＶ免疫プログラムが容易にできる。
ＲＳＶ Ｆタンパク質の最適化バージョンを発現するｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ベクターの開発
本実施例は、改変されたＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする遺伝子をＨＰＩＶ１ベクター骨格中に挿入して、ＲＳＶ Ｆエクトドメインをそのエンベロープ上で発現し、弱毒化されており、伝染性であり、かつ防御抗体応答を誘導できる組み換えウイルスを生成できるということを示すアッセイを示す。Ｆ２位置はまた、有効な挿入部位として特定された。これらの知見は、以下を示す：
１．ＨＰＩＶ１ Ｆ ＴＭＣＴドメインの操作上の境界を特定した（図６０）。
２．ＨＰＩＶ１ Ｆ ＴＭＣＴドメインを、組み換えＲＳＶ Ｆエクトドメイン、例えば、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１に対して追加して、細胞表面で効率的に発現され、抗ＲＳＶ－Ｆ抗体と反応性であるタンパク質が達成される。
３．ＨＰＩＶ１ Ｆ ＴＭＣＴ（ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴ）を含むＲＳＶ Ｆを、ＨＰＩＶ１ベクター粒子に効率的にパッケージングした（すなわち、ＲＳＶよりも１μｇのビリオンタンパク質あたり高いレベルで、図６４）。これは、センダイウイルスでの以前の研究に基づいた予測と完全に反しており（ＨＰＩＶ１のマウスの類、従っておそらくは、閉じた予測モデル）、ここではセンダイウイルスＣＴまたはＴＭＣＴを含むＲＳＶ Ｆは、内因性センダイウイルスＦタンパク質が欠失された場合のみ、粒子中に効率的にパッケージングされた（Ｚｉｍｍｅｒら ２００５ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：１０４６７～１０４７７）。
３．ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１およびＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴ型のＲＳＶ Ｆタンパク質を、第１または第２の遺伝子位置に挿入して、ＲＳＶ Ｆを安定に発現し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に複製し（図６３）、およびベクター粒子中に効率的に組み込まれるベクター構築物（ＨＰＩＶ１ Ｆ ＴＭＣＴが存在する場合、図６４）を生成することができる。
４．予期せぬことに、Ｆ１位置またはＦ２位置のいずれかが、融合性であるＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するのに効率的である（例えば、ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ、実施例２）が、Ｆ２位置は、非融合性であったＲＳＶ Ｆの細胞内発現について特に効率的であった（例えば、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１）。
５．ｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０－Ｆ２／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１およびｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０－Ｆ２／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴ構築物を、ＲＳＶ Ｆタンパク質を効率的に発現するもの、および、特に後者の場合は、ＲＳＶ Ｆをベクター粒子中へ効率的に組み込んだものとして特定した。
ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１。本実施例では、ｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ベクターを用いて、ＲＳＶ Ｆタンパク質のさらに改変されたバージョンを発現した。全てのインサートが、ＲＳＶ Ｆを含み、これは、ヒト発現について、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（ＧＳ－ｏｐｔ）によってコドン最適化され、２つのＨＥＫアミノ酸アサインメント、すなわち、ＧｌｕおよびＰｒｏを、残基６６および１０１で有した。さらに、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ ＲＳＶ Ｆタンパク質は、安定化された融合前変異ＤＳ（Ｓ１５５ＣおよびＳ２９０Ｃ）およびＣａｖ１（Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ）を含んで、ＲＳＶ Ｆ融合前頭部および抗原性部位Φ（ＲＳＶ－中和抗体の優勢を担うことが示された）を安定化した（ＭｃＬｅｌｌａｎら ２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２：５９２～５９８）。
ＨＰＩＶ１ ＴＭＣＴ。さらに、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１ ＲＳＶ Ｆタンパク質のバージョンを作製し、ここではそのＴＭＣＴドメインを、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のものによって置き換えた。ＨＰＩＶ１ ＴＭおよびＣＴドメインの組成は、以前には決定されていなかった。図６０は、ＲＳＶ Ｆタンパク質（頂部のライン）およびＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質（第２のライン）のＴＭおよびＣＴドメインを示し、かつキメラを示しており、ここではＲＳＶ Ｆタンパク質の予想されるエクトドメインがＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質の予測されるＴＭＣＴドメインに結合される。これは、ＨＰＩＶ１ Ｆ－特異的なＴＭＣＴドメインが、ウイルスアセンブリの間に他のベクタータンパク質とさらに効率的に相互作用して、キメラＲＳＶ Ｆタンパク質の組み込みを促進することを前提として、ＨＰＩＶ１ベクターへのＲＳＶ Ｆタンパク質の組み込みを増大する目的で行った。
ｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ベクター構築物。図６１および図６２は、構築物であって、ここで実施例２由来のｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ベクターを用いて、第１の遺伝子位置（Ｆ１）中に位置する、２つのインサートのいずれかを許容する構築物を示す：発現されたＲＳＶ Ｆ ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１、ｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０－Ｆ１／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１を生成（図６１および６２、頂部構築物）；またはＲＳＶ Ｆ ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴ、ｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０－Ｆ１／ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴ（底部構築物）を生成。これらの２つの構築物は、第２の構築物中のＲＳＶ Ｆは、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質由来のＴＭＣＴを有するという点でのみ異なることに注意のこと。図６２は、いずれかのインサートを、ｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ベクターの第２の遺伝子位置（Ｆ２）に入れている２つの並行構築物を示す。全てのウイルスは、六量体のゲノムヌクレオチド長を保持するように設計した（６つの規則（ｒｕｌｅ ｏｆ ｓｉｘ））（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙら １９９８ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：８９１～８９９）。各々のベクター遺伝子は、その野性型六量体位相（ｐｈａｓｉｎｇ）を維持した；Ｆ１およびＦ２インサートは、それぞれ、Ｎ遺伝子およびＰ遺伝子の六量体位相を有した。
ウイルスの回収。４つの構築物を、ＢＨＫ ＢＳＲ Ｔ７／５細胞（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現するベビーハムスター腎臓細胞（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら １９９９ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：２５１～２５９））、各々の全長抗ゲノムプラスミドならびにＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質を発現する３つの発現プラスミドとを同時トランスフェクトすることによってレスキューした。ＨＰＩＶ１およびＲＳＶ Ｆタンパク質の同時発現を検出する二重染色プラークアッセイを行って、ＲＳＶ Ｆ発現の安定性を決定した。プラークのかなりの部分が、ＲＳＶ Ｆタンパク質を効率的に発現した。これらの同じ４つの調製物を、自動化配列決定（これによって、プライマーによって隠された、３’および５’末端でのそれぞれ２２ヌクレオチドおよび２６ヌクレオチドを除いて、その全体で各々のゲノムが解析された）によってコンセンサス配列解析に供した。このウイルスは、この方法によって検出可能な偶発性の変異がないことが見出された。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマルチサイクル複製。４つの回収されたウイルス（すなわち、ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１、Ｆ１またはＦ２位置で、Ｈ１ＴＭＣＴの有りまたは無し）を、三連で各々のウイルスを用いて１細胞あたり０．０１ ＴＣＩＤ５０というＭＯＩでＶｅｒｏ細胞を感染すること、および培養上清を７日間にわたって２４時間ごとに収集することによってｉｎ ｖｉｔｒｏでのマルチサイクル複製について評価した。収集されたサンプル中のウイルス力価は、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞での連続希釈および赤血球吸着アッセイによって決定した。ＲＳＶ Ｆインサートを有する全てのベクターは、ｗｔ ＨＰＩＶ１およびｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０と比較して比較的弱毒化されており、約７．０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの最終力価まで増殖した（図６３）。Ｆ１／ＤＳ－Ｃａｖ１およびＦ１／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴ（注、名称のうち「ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ」の部分は、テキストおよび図では、簡略化のために省略してもよい）は、感染後（ｐ．ｉ．）１日目および２日目で（複製の対数期の間）Ｆ２／ＤＳ－Ｃａｖ１およびＦ２／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴよりも遅く複製したが、Ｆ２／ＤＳ－Ｃａｖ１およびＦ２／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴと同様であった７日目（回収日）までに高力価に達した。従って、全ての構築物は、高い最終力価まで増殖し、これはＶｅｒｏ細胞でのワクチン製造の影響を受け易い。
ベクタービリオンへのタンパク質の組み込み。ｗｔ ＨＰＩＶ１、およびｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０空ベクターにそった４つの構築物のセットをＬＬＣ－ＭＫ２細胞中で増殖させて、スクロース勾配遠心分離によって精製した。ｗｔ ＲＳＶを、Ｖｅｒｏ細胞中で増殖し、続いてスクロース勾配精製して、対照として含めた。約１μｇの各々のスクロース－精製したウイルスを、ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解し、還元して、変性して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析に供した。ＲＳＶ Ｆタンパク質およびＨＰＩＶ１タンパク質（Ｎ、Ｆ、およびＨＮ）を、マウスモノクローナル（Ａｂｃａｍ）およびウサギポリクローナルペプチド－特異的抗体（実施例２を参照のこと）をそれぞれ、前に記載されたようなそれらの対応する赤外線色素コンジュゲート二次抗体とともに用いて検出した（実施例２；Ｍａｃｋｏｗら ２０１５ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８９：１０３１９～１０３３２）（図６４）。それぞれ、第１および第２位置から全長ＲＳＶ Ｆを発現した、Ｆ１／ＤＳ－Ｃａｖ１およびＦ２／ＤＳ－Ｃａｖ１精製したビリオンの解析によって、ＨＰＩＶ１ベクタービリオンにおいてＲＳＶ Ｆの検出可能なパッケージングは実証されなかった（図６４、頂部パネル、レーン３および５）。対照的に、Ｆ１／ＤＳ Ｃａｖ１－Ｈ１ＴＭＣＴおよびＦ２／ＤＳ Ｃａｖ１－Ｈ１ＴＭＣＴビリオンの両方とも（図６４，レーン４および６）、かなりの組み込みを示し、これは、Ｆ２／ＤＳ Ｃａｖ１－Ｈ１ＴＭＣＴよりもＦ１／ＤＳ Ｃａｖ１－Ｈ１ＴＭＣＴについて高かった。興味深いことに、両方のＨ１ＴＭＣＴバージョンとも、ビリオンタンパク質の１μｇあたりｗｔ ＲＳＶ（図６４、レーン７）と比較してビリオン中でパッケージングされた多量のＲＳＶ Ｆを示す。
同じ実験で、ＨＰＩＶ１ベクタービリオン中へのＨＰＩＶ１ Ｎ、ＨＮ、およびＦタンパク質の組み込みも評価した（図６４）。ＨＰＩＶ１ Ｎタンパク質のビリオン組み込みは、いかなるインサートの発現によってもほとんど影響されなかった（図６４、頂部からの第２パネル）。ＨＮタンパク質は、Ｆ１／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴ、Ｆ２／ＤＳ－Ｃａｖ１、およびＦ２／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴ構築物については低下した（図６４、頂部からの第３のパネル、レーン４、５、および６）。ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のビリオン組み込みは、Ｆ２／ＤＳ－Ｃａｖ１およびＦ２／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴについて低下し（図６４、頂部からの第４のパネル、レーン５および６）。ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質についての抗血清は、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質のＣＴドメインの最後の１８アミノ酸を含むペプチドに対して惹起され、従ってこの抗血清は、ＨＰＩＶ１ Ｆ０およびＦ１タンパク質に加えて、ＨＰＩＶ１ Ｆタンパク質ＴＭＣＴを含むＲＳＶ Ｆタンパク質の形態、すなわちＦ１／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴおよびＦ２／ＤＳ－Ｃａｖ１／ＴＭＣＴを検出した。ＲＳＶ Ｆバンドの特定は、抗ＲＳＶ Ｆモノクローナル抗体との同時染色によって確認された；これによって、ＲＳＶ Ｆが、実際にＨＰＩＶ１ Ｆ ＴＭＣＴドメインとともに発現されることが確認される。
細胞内タンパク質発現。次に、ベクター感染細胞中でのＲＳＶ Ｆタンパク質およびＨＰＩＶ１ベクタータンパク質の細胞内発現を評価した。Ｖｅｒｏ細胞に、各々の構築物を用いて１細胞あたり１０ ＴＣＩＤ５０のＭＯＩで感染させ、３２℃で４８時間インキュベートした。細胞タンパク質を、１×ＬＤＳ緩衝液を用いて単層の直接溶解によって回収し、還元し、変性して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析に供した（図６５）。ＲＳＶ ＦおよびＨＰＩＶ１タンパク質を、図６４に記載されたのと同じ抗体を用いることによって検出した。全ての構築物は、感染された細胞中でＲＳＶ Ｆタンパク質を発現可能であった；Ｆ２／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴは、最高の発現を有し、それに続くのがＦ２／ＤＳ－Ｃａｖ１、Ｆ１／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴ、およびＦ１／ＤＳ－Ｃａｖ１であった（図６５、レーン４、３、２、および１）。第１遺伝子位置へのＲＳＶ Ｆインサートの挿入が、最高レベルの発現を生じるであろう（転写の勾配に起因して）という期待に反して、Ｆ１／ＤＳ－Ｃａｖ１およびＦ１／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴウイルス（図６４、レーン１および２）は、Ｆ２ウイルスと比較して低下したＲＳＶ Ｆ発現を有した（レーン３および４）。既に注記されたとおり、Ｆ１ウイルスは、低下したＲＳＶ Ｆ発現におそらく起因して、Ｆ２ウイルスよりも指数関数増殖の間にいくぶんかさらに遅く複製した（図６３）。Ｆ１ウイルスを感染された細胞中のＲＳＶ Ｆの細胞内発現の低いレベルは、ビリオン組み込みプロファイルと対照的であり（図６４）、これによって、Ｆ２／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴと比較して、Ｆ１／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ１ＴＭＣＴについてのＲＳＶ Ｆのさらに高い組み込みが示される（レーン４対６）。Ｆ１およびＦ２位置の両方で、ＴＭＣＴを有するＤＳ－Ｃａｖ１が、ＤＳ－Ｃａｖ１単独よりもいくぶんか高いレベルで発現され、これによって、ＴＭＣＴが、タンパク質またはｍＲＮＡ転写物をさらに安定にすることによってＲＳＶ Ｆ発現を増強し得ることが示唆される。同様の効果がまた、Ｂ／ＨＰＩＶ３ベクターを感染されたＶｅｒｏ細胞においてＢＰＩＶ３ Ｆ ＴＭＣＴを有するＲＳＶ Ｆでも観察された（図５０Ａ）。これはまた、ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｆ、およびＨＮタンパク質の細胞内発現が、Ｆ２ウイルスと比較してＦ１ウイルスについて極めて低かったこともまた注目すべきである（図６５、第２、第３、および第４のパネル、レーン１および２対３および４）。これによって、Ｆ１ウイルスについて極めて低い遺伝子発現が明らかになるが（図６５、レーン１および２）、見かけ上作製されるＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＨＰＩＶ１ ＴＭＣＴを保有するＲＳＶ Ｆの場合には、ＨＰＩＶ１ビリオン中に極めて効率的に組み込まれた（図６４，レーン４）。
本発明の実験におけるＦ１ウイルスによる低下したＲＳＶ Ｆ発現は、実施例２で報告された結果とは対照的であって、これには、この同じベクターの第１の遺伝子位置からのＲＳＶ Ｆタンパク質のＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ型の発現を含んだ。その場合、ＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞内発現は効率的であって、Ｆ１対Ｆ２の構築物について極めて似ていたが、ＨＰＩＶ１ベクタータンパク質の発現は、いくぶんか、Ｆ１対Ｆ２について低下しており、ただしそれほど大幅ではなかった（図３８Ａ、左の最初の２つのレーン、および図３８Ｂ）。相違は、図３８で発現されたＲＳＶ Ｆのバージョンは、融合性であって、これは、細胞の単層を通じてウイルスがさらに効率的に伝播することを補助し得、かつさらに大きいタンパク質合成を生じるさらに効率的な感染を促進できるが、図６４で発現されたＦタンパク質は、融合前コンホメーションで凍結されたＤＳ－Ｃａｖ１バージョンであり、従って非融合性であるということである場合がある。ＤＳ－Ｃａｖ１を発現する構築物は、効率的には伝播しない場合があり、各々の感染された細胞は、よりＲＳＶタンパク質を作製し得、これによって、より高レベルのビリオン組み込みが説明される。しかし、比較的高いＭＯＩの感染が各々の実験に用いられた（５というＭＯＩ）ので、細胞の大部分が、感染されて、伝播が重要な因子ではなかったかもしれない。従って、Ｆ１位置からのＦタンパク質のＤＳ－Ｃａｖ１型の細胞内発現の低下は、予想されず、Ｆ２位置をベクター使用にさらに適切な可能性が高いとして指す。
ＲＳＶ Ｆタンパク質の最適化バージョンを発現するｗｔ ｒＨＰＩＶ３株ＪＳベクターの開発
上記で考察されるとおり、ＲＳＶ Ｆ ＨＥＫ／ＧＡ－ｏｐｔ／ＤＳ構築物に対するＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭＣＴの追加（Ｂ３ＴＭＣＴ）は、アカゲザルにおいてｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの実質的な弱毒化を生じた（図２９）。Ｂ３ＴＭＣＴに起因してハムスターでの弱毒化の証拠があった（図５１）。これによって、Ｂ３ＴＭＣＴがｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを過剰弱毒化させる能力が惹起された。１つの解決法は、弱毒化が少ないウイルス、例えば、ｗｔ ＨＰＩＶ３をベクターとして用いることである。さらに、ＨＰＩＶ３ベクターを用いた場合（すなわち、骨格遺伝子の全てが、ＨＰＩＶ３に由来する）、これは、ＨＰＩＶ３に対する細胞免疫についての抗原としてＨＰＩＶ３タンパク質の完全な補体を提供し、従って、ＨＰＩＶ３ベースのベクターは、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベースのベクターよりもＨＰＩＶ３に対して防御性であることができる。本実施例で考察される知見によって、予期せぬことに、ＲＳＶ ＦインサートＦ１－ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ３ＴＭＣＴの発現の安定性が、ＴＭＣＴを欠くそのバージョン、すなわちＦ１－ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１よりも安定であると考えられた。これは、予想に反していた。なぜなら、ベクター粒子への組み込みは、ＲＳＶ Ｆ発現の維持に対して追加の選択圧をもたらすと期待されたが、これは観察されなかったからであった。
ｗｔ ｒＨＰＩＶ３ ＪＳ株ベクター。野性型（ｗｔ）組み換え（ｒ）ＨＰＩＶ３ ＪＳ株（これはまた、ｒＢ／ＨＰＩＶ３についてのＦおよびＨＮ遺伝子の供給源でもあった）を、ベクターとして選択した。このウイルスの生物学的バージョンは以前には、まだ特定されるべきである１つまたはそれ以上の偶発性弱毒化変異におそらく起因して、以前に評価された株と比較して（Ｋａｐｉｋｉａｎら １９６１ ＪＡＭＡ １７８：１２３～１２７）成体で自然に弱毒化されることが示された（Ｃｌｅｍｅｎｔｓら．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２９：１１７５－１１８２、１９９１）。このウイルスの組み換えバージョン（ｒＨＰＩＶ３）は、ＨＰＩＶ３逆遺伝学システムが確立された場合に導入されたＨＮ（Ａ２６３ＴおよびＴ３７０Ｐ）中に２つの変異を有する。本研究では、ｒＨＰＩＶ３ベクターを、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによる大きいプラーク形成を妨げることが見出されたＨＮタンパク質において２６３Ｔおよび３７０Ｐのアミノ酸アサインメントを含むように改変した（その改変は、図５８Ｂに詳細に示された）。さらに、ｒＨＰＩＶ３ベクターを、第１遺伝子位置中のＲＳＶ Ｆ（または潜在的には任意の他のインサート）の挿入のための、１０３～１０９位置での固有のＢｌｐＩ部位の創出（図６７Ａ、頂部構築物）、または第２の遺伝子位置におけるＲＳＶ Ｆの挿入のための位置１６７５～１６８２での固有のＡｓｃＩ部位の創出（図６７Ｂ、頂部構築物）によって改変した。
ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１＋／－Ｈ３ＴＭＣＴ。ｗｔ ｒＨＰＩＶ３ ＪＳベクターを用いて、ＲＳＶ Ｆ ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１タンパク質をそのままで、またはＲＳＶ Ｆタンパク質のＴＭＣＴドメインを、ＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質のものと置き換えたさらなる改変とともに発現した（Ｈ３ＴＭＣＴと呼ぶ、図６６）。ＲＳＶ Ｆタンパク質の状況でのＨＰＩＶ３ Ｆタンパク質（Ｈ３ＴＭＣＴ）のＴＭおよびＣＴドメインの活性は、未知であった。図６６によって、またＨ３ＴＭＣＴがＲＳＶ Ｆタンパク質中へ導入されたキメラも示される。
ＲＳＶ Ｆを発現する４つのｒＨＰＩＶ３ベースの構築物発現の例を図６７に示す。具体的にはこの例は以下である：
第１遺伝子位置（Ｆ１）に挿入されたＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１（図６７Ａ）；
第１遺伝子位置（Ｆ１）に挿入されたＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ３ＴＭＣＴ（図６７Ａ）；
第２遺伝子位置（Ｆ２）に挿入されたＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１（図６７Ｂ）；
第２遺伝子位置（Ｆ２）に挿入されたＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ３ＴＭＣＴ（図６７Ｂ）。
これらのＲＳＶ ＦのＯＲＦは、図６７のＴＭＣＴが、ＨＰＩＶ３タンパク質由来のＨ３ＴＭＣＴであることを除いて、図６１および図６２のｒＨＰＩＶ１－ＣΔ１７０ベクターに挿入されたのと同じであることに注意のこと。さらに、図６７の各々のＲＳＶ Ｆインサートは、別のｍＲＮＡとして発現についてＨＰＩＶ３転写シグナルの制御下であった。ヌクレオチド番号付け（図６７）は、各々の最終構築物の完全なアンチゲノムＲＮＡ配列に対する。全てのウイルスは、六量体ゲノム長および野性型六量体位相を維持するように設計された；Ｆ１およびＦ２インサートは、それぞれ、もとのＮおよびＰ遺伝子の六量体位相（正常には、第１および第２の遺伝子位置にある）を有した。全てのインサートは、合成的に誘導された（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。
ウイルスおよび二重染色解析の回収。ウイルスを、全長抗ゲノムプラスミドおよび３つの発現プラスミド（ＨＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質を発現する）の各々を用いてＢＨＫ ＢＳＲ Ｔ７／５細胞を同時トランスフェクトすることによってレスキューした。全てのウイルスを、首尾よくレスキューして、および２つのＰ２（すなわち、第２継代）ウイルスストックを、４つの構築物の各々について調製した。
実施例１～４に示される結果に対するコメント
以下の実施例によって、いくつかの異なるＰＩＶベクターシステム（ｒＢ／ＨＰＩＶ３、ｒＨＰＩＶ１、およびｒＨＰＩＶ３ ＪＳを含む）を用いて、追加された遺伝子としてＲＳＶ Ｆタンパク質を効率的に発現できることが示される。変異体のパネルを構築して、ベクター（例えば、インサート位置、弱毒のレベルなど）およびＲＳＶ Ｆインサート（例えば、融合前安定化、ベクター粒子へのパッケージングなど）による種々の変動を体系的に評価した。変異体のパネルを細胞培養物中で、ハムスター中で、および非ヒト霊長類中で詳細な分析に供して、発現レベル、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの安定性、ｉｎ ｖｉｖｏの弱毒化、免疫原性、および防御効率に関して有効な変異体を特定した。
以前の研究で、ＲＳＶ Ｆのような高度に融合性のタンパク質が、非区分のマイナス鎖ウイルスベクター中で不安定化される場合がある（それらの高レベルの合胞体形成は、ベクター複製を妨害するので）ことが示された：例えば，麻疹ウイルスの融合Ｆタンパク質は、原型の水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）によって発現された場合「極めて不安定性」であることが示された（Ｑｕｉｎｏｎｅｓ－Ｋｏｃｈｓら ２００１ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８７；４２７～４３５）。呼吸器合胞体ウイルスは、高レベルの合胞体形成に関して悪評高いので、そして高レベルの合胞体形成は実際、機能的なＲＳＶ Ｆタンパク質がＰＩＶベクターから発現された場合に観察された（例えば、実施例１）ので、このウイルスがｉｎ ｖｉｔｒｏでベクター複製を妨害しなかったことは極めて驚くべきことであった。従って、開示された構築物の複製の効率によって、Ｖｅｒｏ細胞では効率的なワクチン製造が可能になる。さらに、低下した（ＨＥＫアサインメント）または本質的に排除された（ＤＳ，ＤＳ－Ｃａｖ１）全体的な合胞体形成を導入された改変が導入され、これによって、高レベルの合胞体形成に起因する問題を未然に防ぐであろう。
複数の特異的なストラテジーを実証して、ＨＥＫアサインメントの包含、コドン最適化、およびプロモーター近位位置での配置を含む外来ＲＳＶ Ｆ遺伝子の発現を増大した。しかし、その結果は、必ずしも予測可能ではなく、本開示で提供される過度の実験の重要性を示している。さらに、第１の遺伝子位置からの発現は、最高レベルの発現を生じると期待されるが、これは、ＤＳ－Ｃａｖ１変異に起因して非融合性であったＲＳＶ Ｆタンパク質をそれが発現する場合、ＨＰＩＶ１ベクターにはあてはまらなかった（図６５）。従って、ベクターの性質およびインサートの性質は、新規な特徴を生じることに寄与した。
弱毒化の多数の平均を検討し、これには、ウシ／ヒトキメラｒＢ／ＨＰＩＶ３の使用、天然に弱毒化されたＨＰＩＶ３ ＪＳ株の使用、およびＨＰＩＶ１（ＣΔ１７０およびＬＹ９４２Ａ）で例証された安定化されたポイントおよび欠失変異の使用も含んでいた。さらに、外来のインサートの存在によって、いくつかの環境で弱毒化が得られ、Ｂ３ＴＭＣＴ改変が実質的に弱毒化された。従って、試薬および生物学的特徴付けによって、ある範囲の有用な弱毒表現型を示すベクターが得られる。重要なことに、目的のベクターは、ワクチン製造のために必要な、Ｖｅｒｏ細胞における効率的な複製および安定性を保持していたことが示された。
ＲＳＶ Ｆインサートの発現の安定性は、以前の構築物での主要な問題であった（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら ２０１２、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３１：１０９～１１４）。しかし、本開示で記載された改変された構築物は実質的に安定であった。合胞体形成を低減するかまたは阻害するような要因は、安定性に寄与する可能性が高い。いくつかの場合には、予測不能な因子が特定された。例えば、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター中のＨＮ遺伝子は、大きいプラーク表現型を生じた実質的な不安定性を示すことが見出された。しかし、この問題は、ＨＮ遺伝子ではＩ２６３ＴおよびＴ３７０Ｐ置換によって排除された（図５８）。安定性に関する予期せぬ知見の別の例は、ｒＨＰＩＶ３ ＪＳのＦ１位置から発現されたＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｈ３ＴＭＣＴ構築物の組み合わせによるＲＳＶ Ｆ発現の安定性の増大であった（図６８Ａ）。Ｆ１位置からの発現は、高レベルの発現のおかげで、最も不安定であったと予想された場合もあるが、これは、観察はされなかった。ベクターへのＲＳＶ Ｆタンパク質のパッケージングはまた、発現の喪失に関する選択圧を生じることも予想された場合があるが、これは観察されなかった。
２つの改変が、免疫原性の増大のために主に重要であることが示された：すなわち、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前コンホメーションを安定化する変異体ＤＳおよびＣａｖ１、ならびにベクター粒子への外来糖タンパク質の効率的な組み込みを指向するパッケージングシグナルとして機能するＴＭＣＴ改変。融合前コンホメーションで安定化されたＲＳＶ Ｆが効率的に発現され、かつウイルス感染と適合するか否かは未知であったが、これは正しかった。ＴＭＣＴパッケージングシグナルが、高程度の効率のパッケージング（これは並行して試験したＲＳＶ粒子のパッケージングと等しいかまたは超えた）と連動したことも驚くべきことであった。高度に効率的なパッケージングは、内因性のＦおよびＨＮ表面糖タンパク質を置き代えることなどによって、ベクター粒子の産生を破壊しなかったことも驚くべきことであった。
特に予期されなかったのは、一方ではＤＳおよびＤＳ－Ｃａｖ１改変、ならびに他方ではＴＭＣＴ改変が各々、ｉｎ ｖｉｖｏでの防御に最も関連すると考えられる高品質ＲＳＶ－中和抗体の産生の極めて大きい増大をもたらしたという知見であった。これらの２種類の改変は、異なる機構を通じてこの効果を達成する可能性が高かった：特に、ＤＳおよびＣａｖ１改変は恐らく、抗原性部位Φを安定化することによってそれらの効果を有するが、ＴＭＣＴによって媒介されるパッケージングは、抗原提示の増大を提供する、粒子型で生成されたＲＳＶ Ｆ抗原の緊密にパッケージングされた高度に反復的なアレイを提供する可能性が高い。重要なことに、これらの効果は、非ヒト霊長類で極めて明白であって（図３１）、補体依存性抗体に関して単一の初回用量から２５０超の逆数力価を生じる。さらに、２つの効果（ＤＳ－Ｃａｖ１およびＴＭＣＴ）は、ある程度まで相加的であった。
記載した方法および組成物の正確な詳細は、記載した実施形態の趣旨から逸脱することなく、変更されても、または改変されてもよいことが明白である。本発明者らは、添付の特許請求の範囲の範囲および趣旨内におさまる全てのこのような改変形態および変形形態を特許請求する。

Claims (26)

  1. 組換えパラミクソウイルスであって、
    上流から下流に、パラインフルエンザウイルスＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬタンパク質をコードする遺伝子を含み、そして、ＮおよびＰタンパク質をコードする遺伝子の間に、ウシパラインフルエンザウイルス３（ＢＰＩＶ３）のＦタンパク質の膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質尾部（ＣＴ）と連結している組換え呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ Ｆエクトドメインを含むＩ型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含む、ウイルスゲノム
    を含み；
    組換えヒト／ウシパラインフルエンザウイルス３（Ｂ／ＨＰＩＶ３）であり；また
    感染性で、弱毒化された、自己複製ウイルスである、
    前記組換えパラミクソウイルス。
  2. ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、ヒトサブタイプＡ ＲＳＶまたはヒトサブタイプＢ ＲＳＶに由来する、請求項１に記載の組換えパラミクソウイルス。
  3. ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、天然ＲＳＶ Ｆタンパク質配列と比較して、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換によって、ＲＳＶ Ｆ融合前コンホメーションにおいて安定化されている、請求項１または２に記載の組換えパラミクソウイルス。
  4. ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６位および１０１位においてそれぞれグルタミン酸およびプロリン（６６Ｅおよび１０１Ｐ）を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えパラミクソウイルス。
  5. ＲＳＶ Ｆエクトドメインは、６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよ
    び２０７Ｌを含む、請求項４に記載の組換えパラミクソウイルス。
  6. ウイルスゲノムがＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮタンパク質ならびにＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、Ｖ、ＭおよびＬタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えパラミクソウイルス。
  7. ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結しているＲＳＶ Ｆエクトドメインが配列番号２１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、アミノ酸６６Ｅ、１０１Ｐ、１５５Ｃ、１９０Ｆ、２０７Ｌおよび２９０Ｃを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換えパラミクソウイルス。
  8. ＢＰＩＶ３ Ｆタンパク質のＴＭおよびＣＴと連結しているＲＳＶ Ｆエクトドメインが配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の組換えパラミクソウイルス。
  9. ＨＰＩＶ３ ＦおよびＨＮタンパク質ならびにＢＰＩＶ３ Ｎ、Ｐ、ＭおよびＬタンパク質は、それぞれ配列番号４３、１０１、４７、４８、４９、５２として示されるアミノ酸配列を含む、請求項６～８のいずれか１項に記載の組換えパラミクソウイルス。
  10. ＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードする異種遺伝子は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～９のいずれか１項に記載の組換えパラミクソウイルス。
  11. 異種遺伝子が配列番号２２（ＧＡ ＲＳＶ Ｆ＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｂ３ＴＭＣＴ）または配列番号２３（ＧＳ ＲＳＶ Ｆ＿ＨＥＫ＿ＤＳ－Ｃａｖ１＿Ｂ３ＴＭＣＴ）として示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の組換えパラミクソウイルス。
  12. Ｂ／ＨＰＩＶ３は、ＨＮタンパク質中にＩ２６３ＴおよびＴ３７０Ｐ置換を含む、
    請求項１～１１のいずれか１項に記載の組換えパラミクソウイルス。
  13. ｒＢ／ＨＰＩＶ３－Ｆ２－ＨＥＫ／ＧＳ－ｏｐｔ／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴを含み、ＨＮタンパク質中にＩ２６３ＴおよびＴ３７０Ｐ置換をさらに含む、請求項１に記載の組換えパラミクソウイルス。
  14. 組換えパラミクソウイルスまたはウイルスベクターに感染した宿主細胞によって産生されるウイルス粒子の少なくとも９０％は、異種遺伝子によってコードされるエクトドメインを含むウイルスエンベロープを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組換えパラミクソウイルス。
  15. 請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えパラミクソウイルスおよび医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
  16. 対象においてＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答を誘発するための医薬であって、治療上有効な量の請求項１５に記載の免疫原性組成物を含む前記医薬。
  17. 対象において呼吸器合胞体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発するための医薬であって、治療上有効な量の請求項１５に記載の免疫原性組成物を含む前記医薬。
  18. 免疫応答は、保護的免疫応答である、請求項１６または１７に記載の医薬。
  19. 免疫原性組成物のプライム－ブースト投与として投与される、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の医薬。
  20. 鼻腔内投与される、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の医薬。
  21. 対象は、ヒトまたは獣医学的対象である、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の医薬。
  22. 対象は、ＲＳＶもしくはＰＩＶ感染のリスクがある、またはＲＳＶもしくはＰＩＶ感染を有する、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の医薬。
  23. 対象は、１歳未満である、請求項１６～２２のいずれか１項に記載の医薬。
  24. 対象は、免疫無防備状態であるか、または高齢である、請求項１６～２３のいずれか１項に記載の医薬。
  25. 請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えパラミクソウイルスのゲノムを含む核酸分子。
  26. 請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えパラミクソウイルスを含む、対象においてＲＳＶまたはＲＳＶおよびＰＩＶに対する免疫応答を誘発するための医薬。
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