JP2022062158A - キメラrsv/bpiv3 fタンパクを発現する組換えヒト/ウシパラインフルエンザウイルス3(b/hpiv3)およびその使用 - Google Patents
キメラrsv/bpiv3 fタンパクを発現する組換えヒト/ウシパラインフルエンザウイルス3(b/hpiv3)およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、2015年1月20日に出願された米国特許仮出願第62/105,667号の優先権を主張する。
イルスゲノムを含む組換えパラインフルエンザウイルスであり得る。パラミクソウイルスは、例えば、組換えヒト/ウシパラインフルエンザウイルス3(B/HPIV3)、組換えヒトパラインフルエンザウイルス1(HPIV1)、組換えヒトパラインフルエンザウイルス2(HPIV2)、組換えヒトパラインフルエンザウイルス3(HPIV3)または組換えウシパラインフルエンザウイルス3(BPIV3)であり得る。
添付の配列表に列挙される核酸およびアミノ酸配列は、37 C.F.R.1.822に定義されるようなヌクレオチド塩基の標準文字略語およびアミノ酸の3文字表記を使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。配列表は、参照により本明細書に組
み込まれる、2016年1月19日に作成された「Sequence.txt」(約344kb)と名付けられたファイルの形態でASCIIテキストファイルとして提出されている。
Fタンパク質のベクター粒子との相互作用の効率を改善するであろうということを前提として置換した。これらの修飾は、遺伝子操作されたRSV Fのセンダイ粒子への組込みを実際に増大したが、センダイFタンパク質遺伝子も欠失された場合のみであった。ベクターFタンパク質を欠失する必要は、ワクチン接種のための感染性弱毒化ウイルスの作製とは適合せず、また、二価ワクチンを作製するために必要とされると考えられるベクター保護抗原の1種も除去する。
が見出され、RSV Fの発現の増大および高度膜融合性RSV Fタンパク質によって媒介される合胞体形成の細胞変性効果の低減を提供した。
特に断りのない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes X、Jones &
Bartlett Publishers出版、2009;およびMeyersら(編)、The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine、Wiley-VCH出版、16巻、2008;およびその他の同様の参考文献に見出すことができる。
する核酸配列、下流調節配列ならびに場合により、mRNAの発現の調節に関与するその他の核酸配列を含み得る。
CTを含むタンパク質の製造につながるような、組換え手段による遺伝子中の、RSV Fエクトドメインをコードする核酸配列と、異種Fタンパク質のTMおよびCTをコードする核酸配列との間の遺伝子連結を指す。いくつかの実施形態では、RSV FエクトドメインのC末端残基を、TMのN末端残基と直接連結することができる(ペプチド結合によって)。いくつかの実施形態では、RSV FエクトドメインのC末端残基を、ペプチドリンカー(グリシン-セリンリンカーなど)を介してTMのN末端残基と間接的に連結することができる。
incott Williams & Wilkins、Philadelphia、2001)。HPIV1、HPIV2およびHPIV3は、別個の血清型に相当し、大幅な交差免疫性を誘発しない。HPIVは、クループ、肺炎または気管支炎などの呼吸器感染症の病原体である。
、これでは、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、非天然アミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣物である。「残基」とは、アミド結合またはアミド結合模倣物によってポリペプチド中に組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣物を指す。ポリペプチドは、アミノ末端(N末端)の末端およびカルボキシ末端(C末端)の末端を有する。「ポリペプチド」は、ペプチドまたはタンパク質と同義的に使用され、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指すように使用される。
Physiol、301:L148~L156、2011;およびNam and Kun (編)Respiratory Syncytial Virus: Prevention Diagnosis and Treatment Nova Biomedical Nova Science Publisher、2011;およびCane(編)Respiratory Syncytial Virus Elsevier
Science、2007)。
0の最初の22残基)はタンパク質分解によって切断される。残りのF0残基は、オリゴマー形成して、三量体を形成し、これは、やはり、2つの保存されたフューリンコンセンサス切断配列(およそF0位置109/110および136/137;例えば、RARR109(配列番号1、残基106~109)およびRKRR136(配列番号1、残基133~136))で、細胞性プロテアーゼによってタンパク質分解によってプロセシングされて、pep27ポリペプチドを切り出し、2つのジスルフィド結合断片、F1およびF2を生成する。これらの断片のうち小さい方、F2は、F0前駆体のN末端部分に起因し、およそF0の残基26~109を含む。これらの断片のうち大きい方、F1は、C末端に細胞外/内腔領域(約残基137~529)、TM(約残基530~550)およびCT(約残基551~574)を含むF0前駆体のC末端部分(およそ、残基137~574)を含む。
Fエクトドメインのタンパク質複合体を含む。
Fタンパク質は、RSV Fタンパク質の融合前コンホメーションとは結合するが、融合後コンホメーションとは結合しない抗体、例えば、抗原部位Φ内のエピトープと特異的に結合する抗体、例えば、D25またはAM22抗体によって特異的に結合される。さらなるRSV F融合前特異的抗体として、5C4およびMPE8抗体が挙げられる。
& Sharp、CABIOS 5:151~3、1989;Corpetら、Nuc. Acids Res.16:10881~90、1988;Huangら.Comp
uter Appls. in the Biosciences 8、155~65、1992;およびPearsonら、Meth.Mol.Bio.24:307~31、1994に記載されている。Altschulら、J.Mol.Biol.215:403~10、1990には、配列アラインメント法および相同性算出の詳細な考察が提示されている。
h.2:482、1981の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman &
Wunsch、J.Mol.Biol.48:443、1970の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444、1988の類似性の探索方法によって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WI)のコンピュータによる実施によって、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって(例えば、Sambrookら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第4版、Cold Spring Harbor、New York、2012)およびAusubelら(In Current Protocols in Molecular Biiology、John Wiley & Sons、New York、詳細な付録104、2013を参照のこと))実施できる。有用なアルゴリズムの1つの例として、PILEUPがある。PILEUPは、Feng & Doolittle、J. Mol. Evol.35:351~360、1987の進行性のアラインメントの単純化法を使用する。使用される方法は、Higgins & Sharp、CABIOS5:151~153、1989によって記載された方法と同様である。PILEUPを使用し、参照配列がその他の試験配列と比較されて、以下のパラメーター:デフォルトギャップ加重(3.00)、デフォルトギャップ長加重(0.10)および加重エンドギャップを使用して配列同一性関係パーセントが決定される。PILEUPは、例えばGCG配列解析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン7.0(Devereauxら、Nuc. Acids Res.12:387~395、1984)から得ることができる。
の脂質二重層にまたがるアミノ酸配列。膜貫通ドメインを使用して、抗原を膜に固定することができる。いくつかの例では、膜貫通ドメインは、RSV F膜貫通ドメインである。
複数のウイルス病原体に由来する抗原を含み、それらのウイルス病原体に対する免疫応答を誘導するために使用できる組換えパラミクソウイルスが、提供される。組換えパラミクソウイルスは、異種遺伝子をコードするゲノムを含む。組換えパラミクソウイルスは、異種ウイルス病原体の膜貫通タンパク質(例えば、ウイルスの糖タンパク質)のエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む。エクトドメインは、パラミクソウイルス由来のエンベロープタンパク質のCTまたはTMおよびCTと連結して、パラミクソウイルスエンベロープで異種ウイルス由来の膜貫通タンパク質のエクトドメインの発現を可能にすることができる。例えば、組換えパラミクソウイルスは、PIV由来のFタンパク質のTMおよびCTと連結しているRSV Fタンパク質のエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えPIVであり得る。組換えパラミクソウイルスおよびその修飾のさらなる説明は、本明細書において提供される。
る。
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、HPIV1 N、P、C、M、F、HNおよびLタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む組換えHPIV1であり得る。HPIV1ゲノムの核酸配列およびその中の遺伝子は、当技術分野で公知であり、遺伝子開始および遺伝子終結配列ならびにウイルスゲノムおよびアンチゲノムプロモーターなどの、遺伝子発現を制御する構造的および機能的遺伝子エレメントも同様である。例示的HPIV1 Washington/1964株ゲノム配列は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるGenBank受託番号AF457102.1として提供される。この例示的HPIV1 Washington/1964株ゲノム配列は:
HPIV1 N、配列番号24(参照により本明細書に組み込まれる、GenBankタンパク質番号AAL89400.1)、
HPIV1 P、配列番号25(参照により本明細書に組み込まれる、GenBankタンパク質番号AAL89402.1)
HPIV1 C、配列番号26(PのORF、参照により本明細書に組み込まれる、GenBankタンパク質番号AAL89403.1)、
HPIV1 M、配列番号27(参照により本明細書に組み込まれる、GenBankタンパク質番号AAL89406.1)
HPIV1 F、配列番号28(参照により本明細書に組み込まれる、GenBankタンパク質番号AAL89407.1)
HPIV1 HN、配列番号29(参照により本明細書に組み込まれる、GenBankタンパク質番号AAL89408.1)
HPIV1 L、配列番号30(参照により本明細書に組み込まれる、GenBankタンパク質番号AAL89409.1)
として示されるN、P、C、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする。
I型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン(RSV Fエクトドメインなど)をコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えHPIV1であり得る。HPIV1 Fタンパク質TMおよびCT配列は、公知である(例えば、参照により本明細書に組み込まれるGenBank受託番号AF457102.1を参照のこと)。例示的HPIV1 Fタンパク質TMおよびCT配列は、以下として示される:
HPIV1 F TM:QIIMIIIVCILIIIICGILYYLY、配列番号31の残基1~23
HPIV1 F CT:RVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN、配列番号31の残基24~59
HPIV1 F TM+CT:QIIMIIIVCILIIIICGILYYLYRVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN、配列番号31
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスベクターは、HPIV2 N、P、V、M、F、HNおよびLタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む組換えHPIV2であり得る。これらのHPIV2タンパク質をコードする遺伝子の核酸配列は、当技術分野で公知であり、遺伝子開始および遺伝子終結配列ならびにウイルスゲノムおよびアンチゲノムプロモーターなどの、遺伝子発現を制御する構造的および機能的遺伝子エレメントも同様である。例示的HPIV2 V94株ゲノム配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGenBank受託番号AF533010.1として提供されている。この例示的HPIV2 V94株ゲノム配列は:
HPIV2 N、配列番号32(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF533010.1によってコードされる)
HPIV2 P、配列番号33(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF533010.1によってコードされる)
HPIV2 V、配列番号34(PのORF、参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF533010.1によってコードされる)
HPIV2 M、配列番号35(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF533010.1によってコードされる)
HPIV2 F、配列番号36(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF533010.1によってコードされる)
HPIV2 HN、配列番号37(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF533010.1によってコードされる)
HPIV2 L、配列番号38(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF533010.1によってコードされる)
として示されるN、P、V、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする。
HPIV2 F TMドメイン:TLYSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYII、配列番号39の残基1~28
HPIV2 F CT:KLVSQIHQFRALAATTMFHRENPAVFSKNNHGNIYGIS、配列番号39の残基29~66
HPIV2 F TM+CT:TLYSLSAIALILSVITLVVVGLLIA
YIIKLVSQIHQFRALAATTMFHRENPAVFSKNNHGNIYGIS、配列番号39
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、HPIV3 N、P、C、M、F、HNおよびLタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む組換えHPIV3であり得る。これらのHPIV3タンパク質をコードする遺伝子の核酸配列は、当技術分野で公知であり、遺伝子開始および遺伝子終結配列ならびにウイルスゲノムおよびアンチゲノムプロモーターなどの、遺伝子発現を制御する構造的および機能的遺伝子エレメントも同様である。例示的HPIV3 JS株ゲノム配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGenBank受託番号Z11575として提供されている。この例示的HPIV3 JS株ゲノム配列について、N、P、C、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする核酸配列は、以下に示される。
HPIV3 N、配列番号40(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号Z11575のヌクレオチド111~1658によってコードされる)
HPIV3 P、配列番号41(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号Z11575のヌクレオチド1784~3595によってコードされる)
HPIV3 C、配列番号114(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号Z11575のヌクレオチド1794~2393によってコードされる)
HPIV3 M、配列番号42(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号Z11575のヌクレオチド3753~4814によってコードされる)
HPIV3 F、配列番号43(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号Z11575のヌクレオチド5072~6691によってコードされる)
HPIV3 HN、配列番号44(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号Z11575のヌクレオチド6806~8524によってコードされる)
HPIV3 L、配列番号45(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号Z11575のヌクレオチド8646~15347によってコードされる)
MEYWKHTNHGKDAGNELETSMATHGNKLTNKIIYILWTIILVLLSIVFIIVLINSIKSEKAHESLLQDINNEFMEITEKIQMASDNTNDLIQSGVNTRLLTIQSHVQNYIPISLTQQMSDLRKFISEITIRNDNQEVLPQRITHDVGIKPLNPDDFWRCTSGLPSLMKTPKIRLMPGPGLLAMPTTVDGCVRTPSLVINDLIYAYTSNLITRGCQDIGKSYQVLQIGIITVNSDLVPDLNPRISHTFNINDNRKSCSLALLNIDVYQLCSTPKVDERSDYASSGIEDIVLDIVNYDGSISTTRFKNNNISFDQPYAALYPSVGPGIYYKGKIIFLGYGGLEHPINENVICNTTGCPGKTQRDCNQASHSTWFSDRRMVNSIIVVDKGLNSIPKLKVWTISMRQNYWGSEGRLLLLGNKIYIYTRSTSWHSKLQLGIIDITDYSDIRIKWTWHNVLSRPGNNECPWGHSCPDGCITGVYTDAYPLNPTGSIVSSVILDSQKSRVNPVITYSTATERVNELAILNRTLSAGYTTTSCITHYNKGYCFHIVEINHKSLNTFQPMLFKTEIPKSCS(配列番号101)
atggaatactggaagcataccaatcacggaaaggatgctggtaatgagctggagacgtctatggctactcatggcaacaagctcactaataagataatatacatattatggacaataatcctggtgttattatcaatagtcttcatcatagtgctaattaattccatcaaaagtgaaaaggcccacgaatcattgctgcaagacataaataatgagtttatggaaattacagaaaagatccaaatggcatcggataataccaatgatctaatacagtcaggagtgaatacaaggcttcttacaattcagagtcatgtccagaattacataccaatatcattgacacaacagatgtcagatcttaggaaattcattagtgaaattacaattagaaatgataatcaagaagtgctgccacaaagaataacacatgatgtaggtataaaacctttaaatccagatgatttttggagatgcacgtctggtcttccatctttaatgaaaactccaaaaataaggttaatgccagggccgggattattagctatgccaacgactgttgatggctgtgttagaactccgtctttagttataaatgatctgatttatgcttatacctcaaatctaattactcgaggttgtcaggatataggaaaatcatatcaagtcttacagatagggataataactgtaaactcagacttggtacctgacttaaatcctaggatctctcatacctttaacataaatgacaataggaagtcatgttctctagcactcctaaatatagatgtatatca
actgtgttcaactcccaaagttgatgaaagatcagattatgcatcatcaggcatagaagatattgtacttgatattgtcaattatgatggttcaatctcaacaacaagatttaagaataataacataagctttgatcaaccatatgctgcactatacccatctgttggaccagggatatactacaaaggcaaaataatatttctcgggtatggaggtcttgaacatccaataaatgagaatgtaatctgcaacacaactgggtgccccgggaaaacacagagagactgtaatcaagcatctcatagtacttggttttcagataggaggatggtcaactccatcattgttgttgacaaaggcttaaactcaattccaaaattgaaagtatggacgatatctatgcgacaaaattactgggggtcagaaggaaggttacttctactaggtaacaagatctatatatatacaagatctacaagttggcatagcaagttacaattaggaataattgatattactgattacagtgatataaggataaaatggacatggcataatgtgctatcaagaccaggaaacaatgaatgtccatggggacattcatgtccagatggatgtataacaggagtatatactgatgcatatccactcaatcccacagggagcattgtgtcatctgtcatattagactcacaaaaatcgagagtgaacccagtcataacttactcaacagcaaccgaaagagtaaacgagctggccatcctaaacagaacactctcagctggatatacaacaacaagctgcattacacactataacaaaggatattgttttcatatagtagaaataaatcataaaagcttaaacacatttcaacccatgttgttcaaaacagagattccaaaaagctgcagttaa(配列番号102)
くとも95%など)の配列同一性を有するHPIV3 Fタンパク質CTと連結しているI型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン(RSV Fエクトドメインなど)をコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む組換えHPIV3であり得る。HPIV3 Fタンパク質TMおよびCT配列は公知である(例えば、GenBank番号Z11575のヌクレオチド5072~6691によってコードされるタンパク質を参照のこと)。HPIV3 JS株に由来する例示的HPIV3 Fタンパク質TMおよびCT配列は、以下として示される:
HPIV3 F TMドメイン:IIIILIMIIILFIINITIITIAI、配列番号46の残基1~23
HPIV3 F CT:KYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK、配列番号46の残基24~46
HPIV3 F TM+CT:IIIILIMIIILFIINITIITIAIKYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK、配列番号46
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、BPIV3およびHPIV3由来のN、P、C、V、M、F、HNおよびLタンパク質の組合せをコードするウイルスゲノムを含むウシPIV3(BPIV3)またはキメラパラミクソウイルスであり得る。例えば、キメラウイルスゲノムは、HPIV3 FおよびHNタンパク質ならびにBPIV3 N、P、C、V、MおよびLタンパク質をコードできる。これらのHPIV3およびBPIV3タンパク質をコードする遺伝子の核酸配列は、当技術分野で公知であり、遺伝子開始および遺伝子終結配列ならびにウイルスゲノムおよびアンチゲノムプロモーターなどの、遺伝子発現を制御する構造的および機能的遺伝子エレメントも同様である。例示的BPIV3 Kansasゲノム配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGenBank受託番号AF178654として提供されている。この例示的BPIV3 Kansas株ゲノム配列は、以下に示されるN、P、C、V、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする:
BPIV3 N、配列番号47(各々、参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF178654のヌクレオチド111~1658によってコードされるGenBank受託番号:AAF28254)
BPIV3 P、配列番号48(各々、参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF178654のヌクレオチド1784~3574によってコードされるGenBank受託番号:AAF28255)
BPIV3 C、配列番号115(参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF178654のヌクレオチド1794~2399によってコードされる)
BPIV3 V、配列番号116(ヌクレオチド2500~2507に位置する遺伝子編集部位で、ヌクレオチド2505~2506の間にヌクレオチドgが挿入された、GenBank番号AF178654のヌクレオチド1784~3018によってコードされる)
BPIV3 M、配列番号49(各々、参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF178654のヌクレオチド3735~4790によってコードされるGenBank受託番号:AAF28256)
BPIV3 F、配列番号50(各々、参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF178654のヌクレオチド5066~6688によってコードされるGenBank受託番号:AAF28257)
BPIV3 HN、配列番号51(各々、参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF178654のヌクレオチド6800~8518によってコードされるGenBank受託番号:AAF28258)
BPIV3 L、配列番号52(各々、参照により本明細書に組み込まれる、GenBank番号AF178654のヌクレオチド8640~15341によってコードされる
GenBank受託番号:AAF28259)
Kansas株のウイルスゲノムおよびアンチゲノムプロモーターは、それぞれ、ヌクレオチド1~96(ゲノムプロモーター)およびヌクレオチド15361~15456(アンチゲノム プロモーター)として提供される。
ようなBPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTに対して少なくとも90%(少なくとも95%など)の配列同一性を有するTMおよびCTと連結しているI型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン(RSV Fエクトドメインなど)をコードする異種遺伝子をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、BPIV3に由来するN、P、C、V、M、F、HNおよびLタンパク質をコードするゲノムを含む組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなBPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、または以下に示されるようなBPIV3 Fタンパク質のCTに対して少なくとも90%(少なくとも95%など)の配列同一性を有するCTと連結しているI型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン(RSV Fエクトドメインなど)をコードする異種遺伝子をさらに含み得る。
BPIV3 F TMドメイン:ITIIIVMIIILVIINITIIVV、配列番号53の残基1~21
BPIV3 F CT: IIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ、配列番号 53の残基22~57
BPIV3 F TM+CT:ITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ、配列番号 53
として示される。
一実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、センダイウイルス Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、またはセンダイウイルス Fタンパク質のCTに対して少なくとも90%(少なくとも95%など)の配列同一性を有するTMおよびCTと連結している、I型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン(RSV Fエクトドメインなど)をコードする異種遺伝子を含むセンダイウイルス N、P、C、V、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする組換えウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスであり得る。一実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、センダイウイルスFタンパク質のCTと連結している、またはセンダイウイルスFタンパク質のCTに対して少なくとも90%(少なくとも95%など)の配列同一性を有するCTと連結している、I型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン(RSV Fエクトドメインなど)をコードする異種遺伝子を含むセンダイウイルスN、P、C、V、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする組換えウイルスゲノムを含む組換えセンダイウイルスであり得る。センダイウイルスFタンパク質TMおよびCT配列は公知である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、GenBank受託番号BAN84670を参照のこと)。例示的センダイウイルスFタンパク質TMおよびCT配列は:
センダイF TMドメイン:VITIIVVMVVILVVIIVIIIV(配列番号103の残基1~21)
センダイF CT:LYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR(配列番号103の残基22~65)
センダイF TM+CT:VITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR、配列番号103
として示される。
いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなNDV
Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、または以下に示されるようなNDV Fタンパク質のTMおよびCTに対して少なくとも90%(少なくとも95%など)の配列同一性を有するTMおよびCTと連結している、I型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン(RSV Fエクトドメインなど)をコードする異種遺伝子を含むNDV N、P、V、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする組換えウイルスゲノムを含む組換えNDVウイルスであり得る。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、以下に示されるようなNDV Fタンパク質のCTと連結している、または以下に示されるようなNDV Fタンパク質のCTに対して少なくとも90%(少なくとも95%など)の配列同一性を有するCTと連結している、I型膜タンパク質由来の組換えウイルス糖タンパク質エクトドメイン(RSV Fエクトドメインなど)をコードする異種遺伝子を含むNDV N、P、V、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする組換えウイルスゲノムを含む組換えNDVウイルスであり得る。NDVウイルスFタンパク質TMおよびCT配列は公知である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、GenBank受託番号AAC28374を参照のこと)。例示的NDVウイルスFタンパク質TMおよびCT配列は、
NDV F TMドメイン:IVLTIISLVFGILSLILACYL(配列番号104の残基1~21)
NDV F CT:MYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM(配列番号104の残基22~49)
NDV F TM+CT:IVLTIISLVFGILSLILACYLMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM、配列番号104
として示される。
組換えパラミクソウイルスベクターは、異種ウイルス病原体の1種またはそれ以上の異種エンベロープタンパク質(またはその抗原性断片)のエクトドメインをコードする1種またはそれ以上の異種遺伝子を含む組換えゲノムを含み、これでは、エクトドメインは、組換えパラミクソウイルス由来のエンベロープタンパク質のTMおよびCTと連結している。例えば、麻疹ウイルス、サブグループAもしくはサブグループB呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス、1型もしくは2型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス(ザイールエボラウイルスなど)、インフルエンザウイルスまたは高度病原性コロナウイルス(SARS、MERS)由来の1種またはそれ以上の異種エンベロープタンパク質(またはその抗原性断片)を、開示された組換えパラミクソウイルスによって発現させることができる。有用なエンベロープタンパク質の例として、それだけには限らないが、麻疹ウイルスHAおよびFタンパク質、サブグループAまたはサブグループB呼吸器合胞体ウイルスF、GおよびSHタンパク質、ムンプスウイルスHNおよびFタンパク質、ヒトパピローマウイルスL1タンパク質、1型または2型ヒト免疫不全ウイルスgp160タンパク質、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスgB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gLおよびgMタンパク質、狂犬病ウイルスGタンパク質、エプスタイン・バーウイルスgp350タンパク質、フィロウイルスGタンパク質、ブニヤウイルスGタンパク質、フラビウイルスプレEおよびNS1タンパク質、ヒトメタニューモウイルス(HMPV)GおよびFタンパク質、エボラウイルスGPタンパク質、アルファウイルスEタンパク質ならびにSARSおよびMERS Sタンパク質ならびにそれらの抗原性ドメイン、断片およびエピトープが挙げられる。1種またはそれ以上の異種遺伝子または転写単位を、パラミクソウイルスウイルスゲノムまたはアンチゲノム中に挿入する例示的方法は、各々、参照により本明細書に組み込まれるWO04/027037およびUS2013/0052718に記載されている。
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(配列番号1)
RSV F B1 HEKタンパク質配列、受託番号AAB82436:
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK(配列番号2、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、GenBank受託番号AAB82436)
RSV F B1 HEK核酸配列:
auggagcugcugauccacagguuaagugcaaucuuccuaacucuugcuauuaaugcauuguaccucaccucaagucagaacauaacugaggaguuuuaccaaucgacauguagugcaguuagcagagguuauuuuagugcuuuaagaacagguugguauaccagugucauaacaauagaauuaaguaauauaaaagaaaccaaaugcaauggaacugacacuaaaguaaaacuuauaaaacaagaauuagauaaguauaagaaugcagugacagaauuacagcuacuuaugcaaaacacaccagcugccaacaaccgggccagaagagaagcaccacaguauaugaacuauacaaucaauaccacuaaaaaccuaaauguaucaauaagcaagaagaggaaacgaagauuucugggcuucuuguuagguguaggaucugcaauagcaagugguauagcuguauccaaaguucuacaccuugaaggagaagugaacaagaucaaaaaugcuuuguuaucuacaaacaaagcuguagucagucuaucaaauggggucaguguuuuaaccagcaaaguguuagaucucaagaauuacauaaauaaccaauuauuacccauaguaaaucaacagagcugucgcaucuccaacauugaaacaguuauagaauuccagcagaagaacagcagauuguuggaaaucaacagagaauucagugucaaugcagguguaacaacaccuuuaagcacuuacauguuaacaaacagugaguuacuaucauugaucaaugauaugccuauaacaaaugaucagaaaaaauuaaugucaagcaauguucagauaguaaggcaacaaaguuauucuaucaugucuauaauaaaggaagaaguccuugcauauguuguacagcuaccuaucuaugguguaauagauacaccuugcuggaaauuacacacaucaccucuaugcaccaccaacaucaaagaaggaucaaauauuuguuuaacaaggacugauagaggaugguauugugauaaugcaggaucaguauccuucuuuccacaggcugacacuuguaaaguacaguccaaucgaguauuuugugacacuaugaacaguuugacauuaccaagugaagucagccuuuguaacacugacauauucaauuccaaguaugacugcaaaauuaugacaucaaaaacagacauaagcagcucaguaauuacuucucuuggagcuauagugucaugcuaugguaaaacuaaaugcacugcauccaacaaaaaucgugggauuauaaagacauuuucuaaugguugugacuaugugucaaacaaaggaguagauacugugucagugggcaacacuuuauacuauguaaacaagcuggaaggcaagaaccuuuauguaaaaggggaaccuauaauaaauuacuaugacccucuaguguuuccuucugaugaguuugaugcaucaauaucucaagucaaugaaaaaaucaaucaaaguuuagcuuuuauucguagaucugaugaauuacuacauaauguaaauacuggcaaaucuacuacaaauauuaugauaacuacaauuauuauaguaaucauuguaguauuguuaucauuaauagcuauugguuugcuguuguauugcaaagccaaaaacacaccaguuacacuaagcaaagaccaacuaaguggaaucaauaauauugcauucagcaaauag(配列番号3、参照によりその全体が
本明細書に組み込まれる、GenBank受託番号:AF013254.1、ヌクレオチド5666~7390)
シグナルペプチド(配列番号1、残基1~22):MELLILKANAITTILTAVTFCF
F2ポリペプチド(配列番号1、残基23~109):ASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKV
KLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARR
Pep27(配列番号1、残基110~136):ELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR
F1(配列番号1、残基137~574):
FLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
成熟タンパク質のF1エクトドメイン(配列番号1、残基137~529):
FLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITT
F1膜貫通ドメイン(配列番号1、残基530~550):IIIVIIVILLSLIAVGLLLYC
F1 CT(配列番号1、残基551~574):KARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
GeneArt最適化されたRSV F A2 HEK DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcacaacaatcctgaccgccgtgaccttctgcttcgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgccgtgaccgagctgcagctgctgatgcagtccacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgccccggttcatgaactacaccctcaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggcttcctgctgggcgtgggcagcgccattgcctctggcgtggccgtgtctaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccacaaacaaggccgtggtgtccctgagcaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgccggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaatgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgagcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcccctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccccctgtgcaccaccaacacaaaagagggcagcaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgataatgccgg
cagcgtgtcattctttccacaggccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaacctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtccgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgacgccagcatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagagcgacgagctgctgcacaatgtgaatgccggcaagagcaccacaaacatcatgatcaccactatcatcatcgtgatcatcgtcatcctgctgagtctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgcaaggccagatccacccctgtgaccctgtccaaggatcagctgtccggcatcaacaatatcgccttctccaactga(配列番号4)
GenScript最適化されたRSV F A2 HEK DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctctaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgacctctaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcgtcaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtctatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtaaggcaagaagcaccccagtcactctgtcaaaagaccagctgtcagggattaacaacattgccttcagtaactga(配列番号5)
HEK置換を有するRSV F A2タンパク質(RSV F_A2_HEK):配列番号1
GeneArt最適化されたRSV F_A2_HEK DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcacaacaatcctgaccgccgtgaccttctgcttcgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgccgtgaccgagctgcagctgctgatgcagtccacccccgccaccaacaaccgggc
cagaagagaactgccccggttcatgaactacaccctcaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggcttcctgctgggcgtgggcagcgccattgcctctggcgtggccgtgtctaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccacaaacaaggccgtggtgtccctgagcaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgccggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaatgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgagcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcccctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccccctgtgcaccaccaacacaaaagagggcagcaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgataatgccggcagcgtgtcattctttccacaggccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaacctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtccgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgacgccagcatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagagcgacgagctgctgcacaatgtgaatgccggcaagagcaccacaaacatcatgatcaccactatcatcatcgtgatcatcgtcatcctgctgagtctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgcaaggccagatccacccctgtgaccctgtccaaggatcagctgtccggcatcaacaatatcgccttctccaactga(配列番号6)
GenScript最適化されたRSV F_A2_HEK DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctctaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgacctctaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcgtcaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtctatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtaaggcaagaagcaccccagtcactctgtcaaaagaccagctgtcagggattaacaacattgccttcagtaactga(配列番号7)
Fタンパク質は、位置190および/または207で1つまたはそれ以上の空洞を埋めて、融合前コンホメーションにおいてタンパク質を安定化するアミノ酸置換を含み得る。例えば、RSV Fタンパク質は、190F置換および/または207L置換を含み得る
。いくつかの実施形態では、RSV Fタンパク質は、S190FおよびF207Lの「Cav1」置換を含み得る。いくつかの実施形態では、RSV Fタンパク質は、融合前コンホメーションにおいてタンパク質を安定化するための、S155C、S290C、S190FおよびV207LのDS-Cav1置換を含み得る。DS-Cav1アミノ酸置換を含む、A2サブグループ由来のRSV Fタンパク質(キメラTMおよび/またはCTドメインを有する)の例示的DNAおよびタンパク質配列は、配列番号10~11および21~23として示される。
HEKおよびDS-Cav1置換およびHPIV1 F CTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV FA2_HEK_DS-Cav1_H1CT):
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCRVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN(配列番号133)
GenScript最適化されたRSV F A2_HEK_DS-Cav1_H1CT
DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctga
ccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtcgagtgcggagactgctggtcatgattaacagcacccacaattcccccgtcaacgcctacacactggagtctaggatgcgcaatccttatatggggaacaatagcaactgatag(配列番号134)
HEKおよびDS-Cav1置換ならびにHPIV1 F TMおよびCTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F A2_HEK_DS-Cav1_H1TMCT):
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTQIIMIIIVCILIIIICGILYYLYRVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN(配列番号135)
GenScript最適化されたRSV F A2_HEK_DS-Cav1_H1TMCT DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacacagatcattatgatcattatcgtgtgcattctgattatcattatctgtggcatcctgtactatctgtaccgagtgcggagactgctggtcatgattaacagcacccacaattcccccgtcaacgcctacacactggagtctaggatgcgcaatccttatatggggaacaatagcaactgatag(配列番号136)
HPIV2 Fタンパク質由来のTMおよびCTと連結することができる。
HEKおよびDS-Cav1置換ならびにHPIV3 F CTドメイン(RSV F_HEK_DS-Cav1_H3CT)タンパク質配列を含むA2株由来のhRSV Fタンパク質:
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK(配列番号8)
GenScript最適化されたRSV F_HEK_DS-Cav1_H3CT DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtaagtactaccgtatccagaagaggaacagagttgaccagaacgataagccatacgtgctcactaacaagtga(配列番号9)
HEKおよびDS-Cav1置換ならびにHPIV3 F TMおよびCTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_HEK_DS-Cav1_H3TMCT)タンパク質配列:
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSP
LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIILIMIIILFIINITIITIAIKYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK(配列番号10)
GenScript最適化されたRSV F_HEK_DS-Cav1_H3TMCT DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcatcttgatcatgatcatcatcctgttcatcatcaacatcacaatcatcaccatcgctatcaagtactaccgtatccagaagaggaacagagttgaccagaacgataagccatacgtgctcactaacaagtga(配列番号11)
HEK置換ならびにBPIV3 F TMおよびCTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_B3TMCT)タンパク質配列:
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ(配列番号12)
GeneArt最適化されたRSV F_A2_HEK_B3TMCT DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtctaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccagcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgagcattatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcaccatcatcattgtgatgattatcatcctcgtgatcatcaacatcacaatcatcgtcgtgattattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga(配列番号13)
HEKおよびDS置換、hRSV F TM ドメインおよびBPIV3 F CTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_DS_B3CT)タンパク質配列:
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ(配列番号14)
GeneArt最適化されたRSV F_A2_HEK_DS_B3CT DNA配列:atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccagcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaa
gaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtgatcctgctgagcctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgtatcatcaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga(配列番号15)
HEKおよびDS-Cav1置換、hRSV FTMドメインおよびBPIV3 F CTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3CT)タンパク質配列:
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ(配列番号16)
GeneArt最適化されたRSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3CT DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccttcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcttgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtgatcctgctgagcctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgtatcatcaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga(配列番号17)
GenScript最適化されたRSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3CT
DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgt
cctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtatcattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacattctgaccaacagacag(配列番号18)
HEKおよびDS置換ならびにBPIV3 F TMおよびCTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_DS_B3TMCT)タンパク質配列:
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ(配列番号19)
GeneArt最適化されたRSV F_A2_HEK_DS_B3TMCT DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccagcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcaccatcatcattgtgatgattatcatcctcgtgatcatcaacatcacaatcatcgtcgtgattattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga(配列番号20)
Genescript最適化されたRSV F_A2_HEK_DS_B3TMCT DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgacctccaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcgtcaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcaccatcattatcgtgatgattatcattctggtcatcattaacatcacaatcattgtggtcatcattaagttccaccggattcagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacatcctgaccaatagacagtga(配列番号137)
HEKおよびDS-Cav1置換ならびにBPIV3 F TMおよびCTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3TMCT)タンパク質配列:
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ(配列番号21)
GeneArt最適化されたRSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3TMCT
DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccttcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcttgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccgg
ctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagctgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcaccatcatcattgtgatgattatcatcctcgtgatcatcaacatcacaatcatcgtcgtgattattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtga(配列番号22)
GenScript最適化されたRSV F_A2_HEK_DS-Cav1_B3TMCT DNA配列:
atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcaccatcattatcgtgatgattatcattctggtcatcattaacatcacaatcattgtggtcatcattaagttccaccggattcagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacatcctgaccaatagacagtga(配列番号23)
HEK置換およびセンダイウイルス F CTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_SeVCT)タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDP
LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR(配列番号105)
HEK置換ならびにセンダイウイルス F TMおよびCTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_SeVTMCT)タンパク質配列MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR(配列番号106)
HEKおよびDS-Cav1置換ならびにセンダイウイルス F CTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_SeVCT)タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR(配列番号107)
HEKおよびDS-Cav1置換ならびにセンダイウイルス F TMおよびCTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_SeVTMCT)タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR(配列番号108)
HEK置換およびNDV F CTドメインを含むA2株由来の hRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_NDVCT)タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT
DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM(配列番号109)
HEK置換ならびにNDV F TMおよびCTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_NDVTMCT)タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIVLTIISLVFGILSLILACYLMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM(配列番号110)
HEKおよびDS-Cav1置換ならびにNDV F CTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_NDVCT)タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM(配列番号112)
HEKおよびDS-Cav1置換ならびにNDV F TMおよびCTドメインを含むA2株由来のhRSV Fタンパク質(RSV F_A2_HEK_NDVTMCT)タンパク質配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR(配列番号113)
特定の実施形態
いくつかの実施形態では、上流から下流に、PIVゲノムプロモーターと、それに続く、PIV N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインを含むI型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えパラインフルエンザウイルス(PIV)を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Nタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、RSV Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、PIV Fタンパク質のTMおよびCTと連結している。
伝子は、ゲノムプロモーターと、Nタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、RSV
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV1 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207
L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している。
これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Nタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、RSV Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、センダイウイルスFタンパク質のTMおよびCTと連結している。
、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Nタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、RSV Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、PIV Fタンパク質のCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV1 Fタンパク質のCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のCTと連結している。
よび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のCTと連結している。
る遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV3 Fタンパク質のCTと連結している。
SV Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、PIV5 Fタンパク質のCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C置換を含み、HPIV1
Fタンパク質のTMおよびCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C置換を含み、HPIV3
Fタンパク質のTMおよびCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C置換を含み、BPIV3
Fタンパク質のTMおよびCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C置換を含み、BPIV3
Fタンパク質のTMおよびCTと連結している。
と連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C置換を含み、HPIV1
Fタンパク質のCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C置換を含み、HPIV3
Fタンパク質のCTと連結している。
続く、HPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインを含むI型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えHPIV3を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Nタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、RSV
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C置換を含み、BPIV3
Fタンパク質のCTと連結している。
Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C置換を含み、BPIV3
Fタンパク質のCTと連結している。
続く、BPIV3 N、PおよびM遺伝子、HPIV3 FおよびHN遺伝子ならびにBPIV3 L遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインを含むI型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えB/HPIV3を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Nタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、RSV Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C置換を含み、HPIV3 Fタンパク質のCTと連結している。
く、PIV5 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインを含むI型膜タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含むウイルスゲノムを含む組換えPIV5を含む組換えパラミクソウイルスが提供され、これでは、異種遺伝子は、ゲノムプロモーターと、Nタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、RSV Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C置換を含み、PIV5 Fタンパク質のCTと連結している。
開示される組換えパラミクソウイルスは、自己複製性である、すなわち、適当な宿主細胞の感染後に複製可能である。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、例えば、ヒト対象に投与された場合に減弱された表現型を有する。
BGら Vaccine 30:959~968 2012)。減弱の別の手段は、cp45 HPIV3ウイルスにおいてなど、複数の遺伝子において起こり得るミスセンス突然変異によって例示される(Skiadopoulos MHら J Virol第73:1374~81 1999)。減弱性点突然変異のその他の例は、以下の実施例2においてHPIV1について提供される。実施例2においてHPIV1によって例示されるような、1つまたはいくつかのコドンの欠失も、減弱表現型を付与し得る。また、実施例1において例示されるように、異種エクトドメインと連結しているベクターTMおよびCTまたはCTドメインの存在は、ベクターを強力に減弱し得る。HPIV1における減弱性突然変異のその他の例は、Bartlett EJらVirol J 4:67 2007)によって記載されており、HPIV2については、Nolan SMら、Vaccine第23:4765~4774 2005)によって記載されている。1つまたはそれ以上のアクセサリー遺伝子のすべてまたは一部の欠失も、減弱の手段である(Durbin A Virology 261:319~330 1999)。
答の規模を測定することによって評価できる。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、第1の免疫処置後に動物の約60~80%が抗体を発生するおよび第2の免疫処置後に動物の約80~100%が応対を発生する場合に十分な免疫原性を有する。好ましくは、免疫応答は、発生元パラミクソウイルスおよび組換えパラミクソウイルス中に含まれる異種遺伝子が由来するウイルス病原体の両方による感染から保護する。
組換えRSV Fタンパク質およびそれをコードする核酸分子は、PIVベクター以外のベクターに含まれる(または発現される)ということが認められよう。例えば、プラスミドベクターおよびその他のウイルスベクターを、例えば、宿主細胞における組換えRSV Fタンパク質もしくはその断片の発現のために、または本明細書に開示されるような対象の免疫処置のために使用できる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プライム-ブーストワクチン接種の一部として対象に投与できる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プライム-ブーストワクチン接種において使用するためのプライマーワクチンまたはブースターワクチンなどのワクチン中に含まれる。
、J.Virol.、54:401~407)およびヒト起源のレトロウイルス(Pageら、1990、J.Virol.、64:5370~5276;Buchschalcherら、1992、J.Virol.、66:2731~2739)を含む、組換えRSV Fタンパク質またはその免疫原性断片を発現するために使用できるいくつかのウイルスベクターが構築されている。バキュロウイルス(オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス;AcMNPV)ベクターも当技術分野で公知であり、商業的供給源(PharMingen、San Diego、Calif.;Protein Sciences Corp.、Meriden、Conn.;Stratagene、La Jolla、Calif.など)から得ることができる。
本明細書において開示される組換えパラミクソウイルスおよびポリヌクレオチドは、合成および組換え法によって製造できる。従って、感染性パラミクソウイルスクローンをコードするポリヌクレオチドおよび感染性クローンを含む宿主細胞ならびに組換え法によってこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法も提供される。
Corp.、Aldrich Chemical Company(Milwaukee、WI)、Glen Research、Inc.、GIBCO BRL Life Technologies、Inc.(Gaithersburg、MD)、Fluka
Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG、Buchs、Switzerland)、Invitrogen(Carlsbad、CA)およびApplied Biosystems(Foster City、CA)ならびに当業者に公知の多数のその他の商業的供給源が挙げられる。
Biology、John Wiley & Sons、New York、through supplement 104、2013)に見られる。
うことができる(例えば、Sambrookら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第4版、Cold Spring Harbor、New York、2012)およびAusubelら(In Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、詳細な付録104、2013)を参照のこと)。クローニング、発現または融合タンパク質へのターゲッティング分子の組込みを容易にするために、いくつかの修飾を行うことができる。このような修飾は、当業者に周知であり、例えば、終結コドン、開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されるメチオニン、好都合に位置づけられた制限部位を作製するためにいずれかの末端に配置されるさらなるヌクレオチドが挙げられる。
1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
ンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列が挙げられる。これらの成分のうち1つまたはそれ以上を含む適したベクターの構築は、当業者に公知である標準連結技術を使用する。
本明細書に記載されるような組換えパラミクソウイルス(異種組換えRSV Fタンパク質をコードするゲノムを含む組換えPIVなど)および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物も提供される。このような組成物は、当業者に公知のさまざまな投与様式によって、例えば、鼻腔内経路によって対象に投与できる。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、Remingtons Pharmaceutical Sciences、第19版、Mack Publishing
Company、Easton、Pennsylvania、1995などの刊行物に、より詳細に記載されている。
次投与できる。
1種またはそれ以上の開示された組換えパラミクソウイルスを対象に投与することによって、対象において免疫応答を誘発する方法が本明細書において提供される。特定の例では、対象はヒトである。免疫応答は、保護的免疫応答、例えば、パラミクソウイルスまたは組換えパラミクソウイルス中に含まれる異種遺伝子のウイルスによるその後の感染を防ぐまたは低減する応答であり得る。免疫応答の誘発を使用して、ウイルス感染およびそれと関連している疾病を治療または阻害できる。いくつかの実施形態では、方法は、PIV
Fタンパク質膜貫通(TM)ドメインおよび細胞質尾部と連結している組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムを含む減弱された組換えパラインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物の投与を含む。
内のものの家族の一員、50歳を超える対象において、免疫処置計画を開始することによって行うことができる。この開示の範囲は、母体免疫を含むものとする。いくつかの実施形態では、対象は、RSVまたはPIV3特異的抗体について血清陰性であるヒト対象である。さらなる実施形態では、対象は、6カ月齢未満、3カ月齢未満または1カ月齢未満などの1歳未満である。
に由来するRSV Fタンパク質を含む組換えウイルスベクターを含む組成物を用いて対象にワクチン接種できる。
挙げられる。あるいは、有効投与量は、in vitroモデル(例えば、免疫学的および組織病理学的アッセイ)を使用して決定できる。このようなモデルを使用して、治療上有効な量の組成物(例えば、所望の免疫応答を誘発するのに、または標的とされる疾患の1種もしくはそれ以上の症状を軽減するのに有効である量)を投与するための適当な濃度および用量を決定するのに、通常の算出および調整しか必要ではない。代替実施形態では、組成物の有効量または有効用量は、治療または診断目的のいずれかで、本明細書において示されるような疾患または状態と相関している1種またはそれ以上の選択された生物学的活性を単純に阻害し、または増強し得る。一実施形態では、ウイルス投与の一般的な範囲は、ヒト対象あたり約104~約105PFUウイルスを含むヒト対象あたり約103~約107個のプラーク形成単位(PFU)またはより多くのウイルスである。
GE Healthcare)を使用して蛍光プラークをカウントする。抗体力価は、Reed & Muench、Am. J. Hyg.、27、493~497、1938の方法に従って算出された、プラーク数の50%低減をもたらす希釈として表されている。
項1.組換えパラミクソウイルスであって、(a)該パラミクソウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメイン(TM)および細胞質尾部(CT)と連結している異種ウイルスのI型膜貫通タンパク質のエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノム;または(b)該パラミクソウイルスのHNタンパク質のTMおよびCTと連結している異種ウイルスのII型膜貫通タンパク質のエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノムとを含む、前記組換えパラミクソウイルス。
TMおよびCTは、HPIV2 Fタンパク質に由来し;組換えPIVは、組換えHPIV3であり、RSV Fエクトドメインと連結しているPIV F TMおよびCTは、HPIV3 Fタンパク質に由来し;または組換えPIVは、組換えB/HPIV3であり、RSV Fエクトドメインと連結しているPIV F TMおよびCTは、BPIV3 Fタンパク質に由来する、項12または13の組換えパラミクソウイルス。
して示されるアミノ酸配列、または配列番号46と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み;または組換えPIVは、組換えB/HPIV3であり、RSV Fエクトドメインと連結しているPIV F TMおよびCTは、配列番号53として示されるアミノ酸配列、または配列番号53と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、項4~15のいずれか1つの組換えパラミクソウイルス。
N、P、C、M、F、HNおよびLタンパク質をコードするウイルスゲノムを含み、RSV Fエクトドメインと連結しているTMおよびCTは、HPIV3 Fタンパク質に由来する、項4~17のいずれか1つの組換えパラミクソウイルス。
RSV F_HEK_DS-Cav1_H3TMCT)として示されるヌクレオチド配列を含み;または組換えB/HPIV3であり、異種遺伝子は、BPIV3 F TMお
よびCTと連結しているRSV Fエクトドメインをコードし、配列番号22(GenArt RSV F_HEK_DS-Cav1_B3TMCT)もしくは配列番号23(GenScript RSV F_HEK_DS-Cav1_B3TMCT)として示されるヌクレオチド配列を含む、項22の組換えパラミクソウイルス。
よび医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
本実施例は、初期継代ウイルス由来のRSV F配列を使用することによる組み換えB/HPIV3によって、コドン-最適化によって、安定かつ高度に免疫原性の融合前および融合後型のRSV Fによって、ならびにRSV Fタンパク質TMおよびCTを遺伝子操作することによって発現されたRSV Fの免疫原性および安定性を向上し、それによってこれがベクター粒子により効率的に組み込まれるようなアプローチを記載している。
31:109~114)。ワクチンレシピエントから脱落したワクチンウイルスの解析によって、検体のうち約50%が、RSV F発現を摂動させることが予測される変異を有するワクチンウイルスを含むことが示された。これは、免疫原性を低下させる可能性が高い。臨床試験材料(CTM)のレトロスペクティブ解析によって、このウイルスの2.5%が、RSV Fを発現しないことが示された(Yangら.2013.Vaccine 31:2822~2827)。さらに、RSV Fインサートが、タンパク質レベルでその発現を不活性化した変異を蓄積したという観察、および増殖の間にこれらの変異が増幅されたという観察によって、RSV Fタンパク質の発現をサイレンシングする選択的な利点があることが示唆される。これは、合胞体形成を効率的に媒介する、RSV Fタンパク質の高度に融合性の性質に起因する可能性が高い。in vitroでは、これによって、細胞基質の破壊が生じ、これによってベクター複製が低下される。さらに、高レベルの外来糖タンパク質の合成は、小胞体およびエキソサイトーシス経路を通じたベクター糖タンパク質の合成、プロセシングおよび輸送を妨害する場合があり、とりわけ、ビリオン形態形成を立体的に妨害する場合がある。これらの効果は、in vitroおよびin vivoの両方で生じる場合がある。
72:4467~4471)。1960年代由来のこの初期継代(または低継代)株は、その増殖に使用されたヒト胚腎臓(HEK)細胞培養後にHEKと呼ばれる。このHEKウイルスは、現在の高度に継代された実験室バージョンのRSV株A2とは、2つのアミノ酸アサインメントが異なった(Connorsら.1995.Virology 208:478~484;Whiteheadら.1998.J Virol 72:4467~4471)。HEKバージョンは、アサインメント66Eおよび101Pを有したが、高度に継代された実験室A2株は、アサインメント66Kおよび101Qを有した(以後、「非HEK」アサインメントと呼ぶ)(図1)。しかし、ウイルス株の間、または所定の株のストックの間の配列相違の出現は、RNAウイルスには、その変異速度を考慮
すれば一般的であり、HEKの相違は以前には重要であることは知られていなかった。さらに、RSV NIHΔM2-2と呼ばれる弱毒化されたRSVワクチン中候補のHEKアサインメントの存在は、細胞培養中の複製の有効性におけるわずかな低下を伴っていた。さらに、66位置のHEKアサインメントは、RSV感染の間に合胞体形成に影響することが特定された。従って、複製の低下とのそれらの関連を考慮して、HEKアサインメントを回避することが意図された。しかし、HEKアサインメントを含むRSV Fのバージョンは、最初のコドン最適化に偶発的に使用されたので、平行なGA-最適化非HEKバージョンを構築して、2つのバージョンを比較した(図1)。2つのバージョンのRSV Fを、BPIV3遺伝子開始および遺伝子末端転写シグナルの制御下に置いて、rB/HPIV3ベクターの第2位置に挿入した(図1)。転写シグナルおよび挿入位置は、RSV Fを発現する全ての引き続くrB/HPIV3構築物で使用して、それによって全体を通じた直接比較を得た。
たベクターの好ましい選択を妨害し得る)を低下するので、有利である。従って、HEKアサインメントは、Fタンパク質のさらに天然でかつ臨床的に関連する形態に相当する三重の利点を有し、タンパク質発現の適度の増大をもたらし、RSV Fインサートをサイレンシングするための選択圧を低下する。
F(非HEK/非opt)よりも10倍(Vero細胞)および16倍(LLC-MK2細胞)高かった(図5)。より効率的なORFを有する発現のレベルは、合胞体形成のレベルの漸増が、HEKアサイントメントの存在にもかかわらずF発現のレベルの増大と関連して証明されたほど高かったが、合胞体形成は、HEKアサイントメントの非存在下でさらにより早くかつさらに広範であったと推定される。
RSVが非弱毒化ウイルスであるという警告とともに含まれたが、このベクターは弱毒化されて、その理由のために比較的免疫原性が低い場合があった。1日あたり1ウイルスあたり6匹の動物を感染後3日目および5日目に安楽死させて、鼻甲介および肺をウイルス滴定のために収集して、複製をin vivoで測定した。これによって、RSV F
インサートを保有するベクターは、空ベクターと比較して鼻甲介(上気道)で適度に弱毒化され、実質的には肺(下気道)で弱毒化されることが示された(図8)。空ベクターと比較した弱毒化の増大は、ウイルス脱落に関するより低い値によって証明された。これはまた、3日目および5日目の力価の比較によって証明された:空ベクターに関しては、3日目および5日目の力価は匹敵したが、RSV Fを保有するベクターに関しては、3日目の力価は、5日の力価よりも低く、これによって、これらの構築物が、その最大力価を達成するのにより長くかかることが示された。驚くべきことに、RSV Fインサートを有するベクターの中でも、RSV F発現が増大しているベクターは、より低いRSV F発現を有するもの、すなわち、非HEK/非optよりも弱毒化されていなかった。従って、rB/HPIV3ベクターへのRSV Fインサートの追加は、in vivoで弱毒化されていた(おそらく、ゲノム長さまたは遺伝子数の増大などのいくつかの一般的な特徴に起因して)ただし、これは、RSV Fタンパク質の合成のレベルよりも実質的に影響されると思われなかった。
Fタンパク質発現の発現における10~16倍の増大は、RSV中和血清抗体の誘導における有意な増大(増大に向かう傾向は観察されたが)も、wt RSVチャレンジに対する防御における有意な増大も生じなかったことが示された。対照的に、ヒト免疫不全ウイルス抗原の発現における同様のレベルの増大は、異なる動物モデルでは他のウイルスベクターおよびDNAワクチンでの防御の向上を生じた(Gaoら.2003.AIDS research and human retrovirus 19:817~823;Carneroら.2009.J Virol 83:584~597)。以前には、rB/HPIV3ベクターでの位置1または2対6での挿入に起因する、RSV Fの発
現における30~69倍の相違が、ハムスターでの防御有効性における有意な相違を誘導したことも観察されている(Liang Bら.2014.J Virol 88:4237~4250)。従って、抗原合成の増大は、免疫原性の増大を付与すると一般に考えられる。しかし、いくつかの場合には、この効果は、疑いなく検出されるほど十分に大きくない場合があり、また所定のin vivoモデルは、十分に感受性ではない場合もあるようである。従って、本研究における10~16倍の相違は、半許容的なハムスターモデルでは統計学的に有意であるのに十分な大きさの効果を誘導するには十分でない場合がある。より高いRSV F発現の有益な効果は、他の特徴と組み合わせて、または許容的なホスト、すなわち霊長類およびヒトでは、前臨床および臨床評価でのより大きいサンプルサイズで、さらに顕著である場合がある。具体的には、この研究で観察されたFタンパク質発現の10~16倍の増大は、Vero(アフリカミドリザル)またはLLC-MK2(アカゲザル)の細胞におけるものであり、ここではヒト使用のためのコドン-最適化は、ヒトに対するこれらの霊長類の比較的近い系統発生学上の関連性を考えれば、有効である可能性が高い。対照的に、in vivoの免疫原性アッセイは、ハムスターを使用し、ここではヒト使用のためのコドン最適化は、発現の増大、およびそれによる免疫原性に有効ではない場合もある。
基づく(McLellanら.2013.Science 340:1113~1117;Magroら.2012.Proc Nat’l Acad.Sci.U.S.A.109:3089~3094)。近年では、RSV Fの融合前型の構造は、決定され、構造ベースの変異を通じてこの融合前コンホメーションを安定化することが可能になる:これらの1つは、ジスルフィド結合(DS)の導入を含み、別に、三量体構造(Cav1)における予測の腔におけるアミノ酸置換を含み、これらの組み合わせは、DS-Cav1と呼ばれる(McLellanら.2013.Science 342:592~598)。組み換えのDSおよびDS-Cav1型のRSV Fタンパク質を、マウスおよびサルでのサブユニットワクチンとして評価し、融合後型よりも有意に高いレベルのRSV中和血清抗体を誘導することが示された(DS-Cav1型は、DS型よりも免疫原性である)(McLellanら.2013.Science 342:592~598)。
RSV対照は、補体含有および補体依存性のアッセイの両方で中和された抗体を誘導するのに効果的であった。著しいことに、融合前(DS)Fを有するベクターは、高品質のRSV中和抗体を誘導するのにおいてwt RSVと統計学的に同様であった(図15B)。これは、注目すべきである。なぜならこの弱毒化されたベクターは、弱毒化されていないwt RSVよりも100~1000倍少ない効率で複製し、wt RSVによって付与された中和活性は、RSV Gタンパク質からの寄与の追加があった。これによって、RSV Fの融合前(DS)型を発現するベクターは、極めて有効な中和抗体を誘導するのに極めて強力であって、免疫原性が高かったことが示唆される。
ベクター構築物が、RSVチャレンジに対して、もたらす防御が最低であった融合後型を除いて、実質的な防御を提供した(図16B)。wt RSV対照は、鼻甲介ではほぼ完全に近い防御を、および肺では完全な防御を提供した;しかし既に注記されたとおり、wt RSVは、細胞免疫の潜在的な抗原として全てのRSVタンパク質を発現することおよび最大1000倍、より効率的に複製することに加えて、FおよびG中和抗原の両方を発現するという利点を有した(図14)。
Fタンパク質がまたビリオン表面で効率的に出現した。
に必須であるので、このことは重要である。組み込みの高い有効性は、RSV Fの発現をサイレンシングする変異について強力な選択圧を課すことはないことも示唆される。
に、これらの条件下でin vivoで弱毒化されていた(すなわち、複製を妨害した)ことを示唆していることは注目すべきである。これが、ハムスターのような半許容的な宿主では証明された場合、ヒト宿主で実質的にさらに顕著である場合がある。弱毒化されなかったwt RSV(A2)対照は、弱毒化されたベクターと比較して、鼻甲介では100~1000倍高い力価まで、および肺では1000~10,000倍高い力価まで複製した。
ccine 31:2822~2827)、重要な問題は、RSV Fインサートの発現が、in vivoで複製の間に安定なままであったか否かであった。図8、14および23におけるハムスターで解析された12の異なるrB/HPIV3-RSV-F構築物の全ての遺伝的安定性をアッセイした。感染後3日目および5日目で収集した肺および鼻甲介の組織ホモジネートを、ウイルスプラーク中のRSV Fタンパク質およびベクタータンパク質の発現を同時に検出し得る蛍光二重染色プラークアッセイによって解析した(図26)。このアッセイでは、RSV F発現は、赤色蛍光によって可視化されたF特異的抗体で検出し、PIV3抗原の発現を、緑色蛍光によって可視化された、HPIV3-特異的な抗血清(精製されたHPIV3ビリオンで超免疫されたウサギ由来)で検出した。融合されたとき、RSV Fの発現を維持したrB/HPIV3プラークは、黄色に見えたが、RSV Fインサートの発現を失っているプラークは緑のままであった(図26)。この解析によって、RSV Fインサートは一般的にハムスターでの複製の間安定であることが示された(図26)。ほとんどのサンプルに関して、より高く希釈したウェルで回収されたウイルスの全て(個々のプラークが識別される)が、黄色のプラークとして見られ、従って、RSV Fタンパク質を発現した。他の検体のサブセットでは、プラークのサブセットにおけるRSV Fの発現の散在性の喪失があり、それによって、わずかな率の緑のプラークが生じた(通常は<12%)。さらに、RSV Fの発現の喪失は、時間とともに漸増したという証拠はなく;言い換えれば、3日目に比較して5日目からの検体の発現の喪失の頻度が高いことは無かった。単一の場合に、3日目からの単一の鼻甲介検体中での発現の喪失が高レベルであったが(14%の残りの発現、9番の群におけるハムスター511番)、同じ動物由来の肺検体は100%発現を有した。一般には、これによって、RSV Fインサートの発現は、試験された構築物の全てについて実質的に安定であることが示された。不釣合いに不安定となった構築物は出現しなかったことも示された。従って、高レベルのRSV Fの発現および合胞体形成、またはRSVの安定化型の発現、またはrB/HPIV3ベクターのために弱毒化されたベクター粒子への改変されたFの高レベルの組み込みが、RSV Fの発現がサイレンシングされた変異体の出現を支持することは無いようであった。
の複製、免疫原性および防御有効性に対する「DS」および「B3TMCT」変異の効果をさらに検討するために、2つの候補(HEK/GA-opt/DSおよびHEK/GA-opt/DS/B3TMCT)を、アカゲザルでの複製および免疫原性について評価した(図28)。未改変のRSV Fを有するB/HPIV3ベクター(非HEK/非opt)を、比較のためのベースライン対照として含んだ。霊長類における研究の費用および倫理的懸念を考慮して、限られた数の構築物を評価した。サルを、組み合わせたINおよび気管内(IT)経路によって、全部で2×106のTCID50の各々のrBHPIV3ベクターを使用して免疫した。鼻咽頭スワブおよび気管洗浄液サンプルを示した日に収集して(図29)ウイルス脱落を複製の指標としてモニターした。血清を0、14、21、および28日目に収集した。全ての動物を28日目に、wt RSVをINおよびITを使用して、1部位あたり106pfuでチャレンジして、血清サンプルを35および56日目に収集した。
たにもかかわらず(図29)、ハムスター(図24)においてよりもアカゲザルで実質的に大きかった(図31)。従って、HEK/GA-opt/DS/B3TMCTの1pfuあたりの固有の免疫原性は、ハムスターにおいてよりもアカゲザルでかなり大きいことがみられ、従って、ヒトでは同様に大きい場合がある。ハムスターにおけるこの見かけの非感受性によって、例えば、ハムスターモデルが、RSV F発現における16倍の増大と関連する免疫原性の相違を確実には提供しなかった理由が説明される(図9)。ヒト使用のためのコドン最適化が、霊長類に比較したハムスターモデルにおける免疫原性の低下に寄与する場合がある、霊長類細胞(およびヒトのワクチン接種された人)と比較してハムスターにおける発現では匹敵する増大をもたらすことがない場合もあることも注目されるべきである。(2)別のテーマは、RSV Fによって誘導された合胞体形成の量を減らすための望ましい状況であった。in vitroでは、合胞体形成は、単層培養物中で複製を制限することはないようであったが、製造に使用されたマイクロキャリア細胞培養系における因子になる可能性もあり、そのため、合胞体形成を制御することは賢明なようである。構築物のほとんどでは、HEKアサインメントが存在し、これは、合胞体形成を強力に抑制した。DSおよびDS-Cav1構築物は、HEKアサインメントと同様に、また合胞体形成を強力に抑制し、それによって、予測されない利益を提供した。上方制御された合胞体形成と関連した1つの構築物、すなわちHEK/GA-opt/B3CTは、複製(図23)および免疫原性(図24)の低下をハムスターで示し、これによって、合胞体形成の増大が、in vivoで有害である場合もあることが示される。これは、霊長類宿主ではさらに顕著である場合もある。従って、GS-opt、HEK、DSまたはDS-Cav1、およびB3TMCTの組み合わせは、合胞体形成の2つの抑制因子(HEKおよびDS-Cav1)の状況では、および超融合性ではなかったパッケージングシグナルの存在下では(B3TMCT)、最高レベルのRSV Fの発現(HEKプラスGS-opt、さらに、Fタンパク質蓄積の増大を提供すると思われた融合前Fタンパク質の安定化)をもたらす組み合わせとして特定された。(3)2つの特徴(すなわちB3TMCTおよびDS変異)は独立して、高品質のRSV中和血清抗体の実質的な誘導を伴っていた。アカゲザル研究によって、B3TMCTは、ヒトにおける予測されるワクチン能力に関連して、霊長類宿主においてこれらの2つの因子のさらに重要なものであることが示唆された(図32)。重要なことに、B3TMCT改変はまた、RSV-中和血清抗体応答の量を劇的に増大した(図31)。(4)予期せぬことに、かつ偶発的に、RSV Fの発現およびパッケージングを改善した特徴は、二重免疫蛍光アッセイによって評価した場合、RSV Fの発現の喪失について重要な選択圧を付与することは無い様であった。既に注記したとおり、RSV Fインサートの発現の喪失は、MEDI-534で問題であったが、本研究では多数の特徴を使用して、MEDI-534で使用されなかった融合を下方制御し、これは、RSV Fインサートを安定化するのに重要な役割を果たした場合もある。さらに、パッケージングシグナルの2つの重複するセットを評価することによって、超融合性であったものを特定して回避すること、ならびに実質的に融合が低下したものを特定して選択することが可能であった。(5)免疫原性を増大するのにおける重要な因子として特に出現したB3TMCT改変。HEK、GA-optまたはGS-opt、およびDSまたはDS-Cav1改変は二次的な改善として出現した。B3TMCTは、注記されたとおり、アカゲザルでベクターを強力に弱毒化する効果を有した。高度に弱毒化されたrB/HPIV3ベクターの状況でのこの改変の使用は、実質的に過剰弱毒化されると思われたベクターを生じた。しかし、逆遺伝学を使用して、B3TMCT
Fタンパク質(所望により、HEK、プラスGA-またはGS-opt、プラスDSまたはDS-Cav1改変を有する)を、弱毒化の少ないベクター骨格、例えば、野性型HPIV1、2、もしくは3、または1つまたはそれ以上の公知の安定化された弱毒化変異を保有するバージョンと組み合わせて、弱毒化の少ない構築物が作製される。rB/HPIV3中のB3TMCT構築物は、極めて過剰弱毒化されているにもかかわらず、極めて高度に免疫原性であったので、10倍から100倍よく複製するこのタンパク質を発現する構築物は、適切に弱毒化され、および実質的にさらに免疫原性でなければならない。
追加のアッセイを行って、以下を評価した:(i)DS融合前安定化変異およびB3TMCTパッケージングシグナルを含む構築物のGS-optバージョン、ならびに(ii)DS変異と組み合わされた2つの腔充填変異体S190FおよびV270Lを含む、DS-Cav1融合前安定化変異。アッセイされたFタンパク質はまた、2つのHEKアミノ酸アサインメントを含み、これが上記のようなA2株の初期継代(HEK-7と呼ばれる)のものと同一のアミノ酸配列を生じる。これらのアッセイによって以下が示される:
1.DS-Cav1およびB3TMCTは独立して、in vivo防御に最も関連すると考えられる、有意なレベルの補体依存性RSV中和抗体を誘導する能力を付与する。
2.DS-Cav1プラスB3TMCTの組み合わせは、免疫原性のさらなる増大を生じる。
3.2つの最も免疫原性の構築物は、HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT(図53、第7群)およびHEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT(第10群)であって、これは、コドン最適化の供給源でのみ異なり、GS-optは、最も免疫原性であるようであった。
4.HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT(第7群)およびHEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT(図53、第10群)は、ペアワイズ比較では統計学的に識別不能であったが、HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT(図53、第10群)の方は、wt RSVよりも有意に免疫原性であった。これらの知見によって、HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT(第10群)は、特に補体を添加する必要性なしで検出される高度に効率的な中和抗体について、ハムスターモデルでは、最も免疫原性の構築物であり(図53)、従って、GS-optおよびDS-Cav1によるさらなる改変は、免疫原性を増大するようであった。これはまた、ハムスターチャレンジ研究では最も防御的構築物であった。
5.大型プラーク表現型および弱毒化を付与する変異を獲得するためのrB/HPIV3ベクターについての性向を、ベクターHNタンパク質中の3つのヌクレオチドおよび2つのアミノ酸変異によって本質的に排除した。
6.HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCTインサートを、第1の遺伝子位置(プレ-N)から発現して、Vero細胞で効率的に複製した構築物を、高い割合のRSV F発現を有する調製物中で得られ、RSV Fタンパク質が効率的に発現される。
方のDS-Cav1-含有構築物が、107TCID50/mlより高い力価まで複製した。このパターンの適度の弱毒化は、異なるバージョンのRSV Fを発現する他のrB/HPIV3ベクターで得られた結果と極めて類似していた(例えば、図7、12、および20)。従って、これらの結果によって、これらの改変されたインサートを保有するrB/HPIV3が、ワクチン製造にとって十分満足である効率的な方式で複製することが示された。
ごく部分的に分泌され(図50A、下側パネル)、その分泌型は全体的に、切断されたF1鎖であったが(図4A、下部パネル、レーン8)、全ての細胞会合型は、未切断のF0(図4A、上側パネル、BおよびC、レーン8)。RSV Fの他の試験された形態で、培地上清中で検出されたものはなく、このことはそれらが分泌されなかったことを示した。DS-Cav1/(1-513)Foldon構築物の効率的でない切断および分泌は予想されなかった。なぜなら、この三量体化ドメインは、精製されたFタンパク質を調製するために以前に首尾よく使用されているからである(McLellanら Science 2013 Nov 1;342(6158):592~8.doi:10.1126/science.1243283)。これによって、ベクターの構築物による外来タンパク質の発現が、予測不能である場合もあることが図示され、ただし本明細書における複数の構築物の詳細な評価は、多数の適切な、首尾よい構築物の特定につながる包活的な評価を提供する。
散在性の変異を反映し、したがって、各々構築物のいくつかの独立した調製物の評価は、RSV Fタンパク質の発現の割合が極めて高い1つまたはそれ以上を特定する可能性が高い。
J Med Virol 72:688~694、2004)。対照的には、補体の非存在下でin vitroでRSVを中和する抗体は、防御に最も関連することが示唆され(Yoderら J Med Virol 72:688~694,2004)、以前の研究は、RSVチャレンジに対する、より高いレベルの防御と関連していた(Liangら J Virol 89:9499~9510、2015)。追加の補体のin vitro依存性で中和する抗体は、「高品質」であり、かつ質的に優れた免疫原性の指標であると考えられる。
HEK/GS-opt)を発現するベクターは、実施例1由来の結果を確認および拡張する、検出可能なRSV中和抗体を誘導しなかった。融合前安定化変異(DS、DS-Cav1)およびパッケージングシグナルB3TMCTは、高品質のRSV中和抗体の免疫原性を独立して増大した(例えば、B3TMCTの非存在下におけるDSおよび/またはCav1を有する構築物は、第3群、4群および9群で例証されるが、DS/Cav-1の非存在下におけるB3TMCTを有する構築物は、第5群で例証される)。融合前安定化変異プラスB3TMCTの組み合わせは、免疫原性の追加的改善を有し、この改善は、GA-optおよびGS-opt構築物(例えば、第6、7および10群)で観察された。補体依存性アッセイでは、HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT構築物(第10群)は、低い力価(6.8 Log2 PRNT60)を誘導したが、有意に低くはなかったそのGA-opt対応物 HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT(第7群)を除いて任意の他のベクターによって誘導されたよりも有意に高い力価のRSV-中和血清抗体(7.6 Log2 PRNT60)を誘導した。しかし、HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT構築物(第10群)によって誘導された抗体力価は(ただし、HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT(第7群)は違うが)、wt RSV(12群)の抗体力価よりも有意に高く、従って、HEK
/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT構築物(第10群)は、高い品質のRSV中和抗体についてベクターおよびwt RSVの間で最も免疫原性であった。
HEK/GA-opt/DS-Cav1/B3TMCT)、前者のウイルスは、URTではさらに弱毒化された(図56A);しかし、それらは、LRTでは同様の効率で複製した(図56B)ことは注目に値する。これらの結果はまた、図51においてハムスターで観察されたものと一致している。HEK/GA-opt/DS/B3TMCTは、第1NHP研究で試験した同じ構築物と比較して、この研究ではURTおよびLRTの両方で有意に高い力価(約10倍高い)まで複製した(図29、実施例1)。前の研究でのサル(図29)は、図56で使用されるサルよりも6歳上で、かつ体重が2~3倍大きかった。これらのウイルスの複製は、若いサルではさらに効率的である場合があるか、または相違は、これらの2つの実験の間の変動を反映し得る。
J Mol Biol 335:1343~1357 2004)によって、全てのこれらのHN変異が、HN球状の頭部の二量体境界に位置することが示された。さらに、H552Q変異は、ノイラミニダーゼ処理細胞に対する増殖によって選択され、大型プラーク表現型を有し、シアル酸含有受容体に対して高い結合活性を有し、Fタンパク質の増強された誘因を有し、げっ歯類で弱毒化されていたHPIV3改変体で以前に記載された(Mosconaら J Virol 67:6463~6468;Porottoら J
Virol 81:3216~3228;Palermoら J Virol 83:6900~6908)。これによって、rB/HIPIV3ベクター中のHPIV3 HN遺伝子の偶発性の変異が同様であって、かつおそらくVero細胞についてrB/HPIV3ベクターの結合親和性を増大したという理由で選択されたことが示唆されたことが示唆された。しかし、大型プラーク表現型がin vivoで実質的な弱毒化を伴ったという他者による観察(Mosconaら J Virol 67:6463~6468;Porottoら J Virol 81:3216~3228;Palermoら J Virol 83:6900~6908)は、これが過剰な弱毒化をもたらす可能性が高いので、本発明のベクターに関して不利であろう。HPIV3逆遺伝学系は、HN遺伝子で2つの変異を含んだ:T263Iミスセンス変異をもたらすcDNAクローン中の偶発性のC7589Tヌクレオチド変異(完全なアンチゲノム配列に対する)、ならびにマーカーとして意図的に導入されたP370T変異をもたらすC7913AおよびA7915T変異があった(Durbinら Virology 235:323~332、1997)。この後者のミスセンス変異は、2つの利用可能なHPIV3-中和モノクローナル抗体(MAb423/6および170/7)によって認識されるエピトープを除去するように設計された。これらの変異は、それらの野性型アサインメント、すなわち759
3C(263T)および7913C+7915A(370P)に対して修復された(図58B)。顕著なことに、これらの変化は、Vero細胞での継代の間に大型プラーク表現型の獲得を妨げた(示さず)。従って、HPIV3 HN遺伝子を保有するさらなるベクター構築物(限定するものではないが、rB/HPIV3-およびHPIV3-ベースのベクターを含む)は好ましくは、これらのアサインメントを含むべきである。例えば、I263TおよびT370P変異が、図58Aに示されるHEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCT/プレ-N構築物中に組み込まれた。HPIV3 HN遺伝子を保有する目的の全てのベクターは、263Tおよび370Pアサインメントを含むように改変する。
本実施例は、2つの弱毒化されたrHPIV1骨格の3つのゲノム位置由来のRSV
F抗原を発現する弱毒生rHPIV1ベクターのRSVワクチンの開発および前臨床評価を図示する。ハムスターにおける前臨床評価によって、rHPIV1 CΔ170-F1ベクター(弱毒化欠失変異(CΔ170)をP/C遺伝子中に保有し、かつRSV Fをプレ-N位置から発現する)は、十分に弱毒化され、安定であり、かつRSVおよびHPIV1に対して免疫原性であり、RSVチャレンジ感染に対する有意な防御を提供したことが示された。この研究によって、rHPIV1を、RSVワクチンベクターとして使用して、2つの主な小児期疾患に対して二重の防御を達成し得ることが実証された。
4~4603;Schmidtら 2002 J Virol 76:1088~1089;Tangら 2002 J Virol 78:11198~11207;Bernsteinら 2012 Pediatr Infect Dis 31:109~114;実施例1も参照のこと)。このウイルスは、rB/HPIV3と呼ばれ、霊長類のBPIV3の弱毒化表現型と、HPIV3の主な中和抗原とを組み合わせる、HPIV3のものによって、逆遺伝学を使用してFおよびHN遺伝子が置き代えられたBPIV3(Schmidtら 2001 J Virol 75:4594~4603;Schmidtら 2002 J Virol 76:1088~1089;Tangら 2002 J Virol 78:11198~11207;Bernsteinら 2012 Pediatr Infect Dis 31:109~114)からなり、rB/HPIV3は、RSV FおよびG遺伝子を効率的に発現することが示された。血清陰性の小児におけるRSVおよびHPIV3についての二価ワクチンとしてのリードrB/HPIV3/RSV-F構築物の臨床評価によって、これは感染性であって、十分耐容され、弱毒化されたが、期待されるよりもRSV Fに対して免疫原性が低いことが示された(Bernsteinら 2012 Pediatr Infect Dis 31:109~114)。これは、RSV Fインサートの発現をサイレンシングした臨床トライアル材料における遺伝子不安定性に対して少なくとも部分的に起因するようであった(Yangら.2013.Vaccine 31:2822~2827)。しかし、さらなる研究は、RSV Fインサートを安定化し、ベクター構築物の種々のパラメーターを特徴付けて最適化することによって免疫原性の増大を得るために進行中である(Liangら.2014.J virology 88:4237-4250)。HPIV1は、RSV F抗原を発現するための別の魅力的なベクターである。具体的には、HPIV1は、RSVまたはHPIV3よりも小児ではいくぶんか後に感染し(Counihanら.2001.Pediatric infectious disease journal 20:646~653;Reedら.1997.J Infect Dis 175:807~813)、そのためHPIV1ベクターのRSVワクチンを、弱毒生RSVまたはrB/HPIV3ベクターのワクチンの後に使用して、RSVに対する免疫応答がブーストされるであろう。
~2028)、これがウイルス弱毒化を生じる。弱毒化の機構は、構築物の固有の免疫原性を増大する能力を有する。なぜならCにおけるこの変異は、宿主インターフェロン応答およびアポトーシス応答を増大し、その両方が免疫原性を増大する能力を有するからである。CΔ170変異は、重複するPおよびC ORF中の6ヌクレオチド欠失からなる。C ORFでは、これは、2つのアミノ酸の欠失、および第3のアミノ酸の置換を生じるが(具体的には、三つ組み168-RDF-170は、単一アミノ酸Sに変化された)、重複するP ORFでは、これは、2つのアミノ酸の欠失を生じる(172-GF-173)。欠失変異は、安定性増大を有すると考えられる。なぜなら、それらは、同じ部位の復帰突然変異のリスクが低いことに起因して、より大きい遺伝子型および表現型の安定性を付与するからである。LY942A変異は、温度感受性である。これは、L ORFにおけるミスセンス変異(942-Y~A)であって、これは、直接証明されたように(McAuliffeら 2004.J Virol 78:2029~2036)、脱弱毒化されるために高度に抵抗性であるように3nt置換を含むように設計された(図42)。(ii)本研究で検討された第2のパラメーター(HPIVゲノム中の外来遺伝子の挿入の位置)は、重要である。なぜなら、これは、外来遺伝子の発現のレベルに影響し、同様にそのベクターに対するその弱毒化の影響にも影響するからである。HPIVゲノムでは、プロモーターにより近いRSV F遺伝子の挿入は、転写勾配に起因して、より高いレベルの発現を提供すると期待されよう。しかし、外来遺伝子がプロモーターに近いほど、影響し得る下流ベクター遺伝子の数は多い。なぜなら、これらのベクター遺伝子の各々が、現在、プロモーターからさらに除去された1つの位置であり、結果として発現効率が低いからである。さらに、第1の位置における外来遺伝子の配置は、プロモーターの機能に影響する能力を有する。外来遺伝子の挿入はまた、予測できない効果を有し得る。これは、また、ゲノム長および遺伝子数の増大などの効果を通じて減弱し得る。
細胞およびウイルス。LLC-MK2(ATCC CCL-7)アカゲザル腎臓およびVero(ATCC CCL-81)アフリカミドリザル腎臓細胞株を、5%ウシ胎仔血清(FBS;HyClone/Logan、UT)および1mMのL-グルタミン(Life Technologies)を補充したGlutaMAX(Life Technologies,Grand Island,NY)を含むOpti-MEMI培地中で維持した。BSR T7/5細胞は、T7 RNAポリメラーゼを構成的に発現するベビーハムスター腎臓21(BHK-21)細胞である(Buchholzら.1999.J
Virol 73:251~259)。これらの細胞は、10%のFBS、2mMのL-グルタミンおよび2%のMEMアミノ酸(Life Technologies)を補充したGlasgow最小必須培地(GMEM;Life Technologies)中で維持した。培地にはまた、継代1つおきに2%ジェネティシン(Life Technologies)を補充して、T7ポリメラーゼ構築物を保有する細胞を選択した。
中で行った。感染させた細胞を、細胞変性効果の出現まで32℃でインキュベートした。ウイルスストック回収に関して、培養上清を回収して、1500rpmで10分間4℃で遠心分離することによって清澄化した。ウイルスストックのアリコートを、ドライアイス上で急速凍結して、-80℃で保管した。HPIV1力価を、上記のように1.2%トリプシンを含有する無血清Opti-MEMI培地を用いてLLC-MK2細胞上で96ウェルプレート中で10倍階段希釈によって決定し、続いて32℃で7日間インキュベーションした。感染された細胞を、モルモット赤血球を用いて赤血球吸着(HAD)によって検出し、力価を、前に記載のとおり(Bartlettら.2006.Vaccine 24:2674~2684)、log10組織培養感染用量50%(TCID50/ml)として算出した。各々のウイルスの温度感受性(ts)表現型は、前に記載のとおり(Skiadopoulosら.1999.Vaccine 18:503~510)32、35、36、37、38、39および40℃でそれらの複製効率を評価することによって研究した。各々のウイルスの滴定は、上記のように、LLC-MK2細胞の96ウェルの複製プレート中で行い、7日間種々の温度で温度制御水浴中で、密閉容器中でインキュベートした。力価を、HADによって決定して、TCID50/mlとして報告した。
PAGE 2-Stepであった(Operon,Huntsville,AL)。次いで、配列決定によって決定した、所望の変異を有するクローンをプラスミドmaxiprep(EndoFree Plasmid Maxi Kit;Qiagen)によって精製して、全体に配列決定した。CΔ170またはLY942A変異のいずれかを有するrHPIV1 pFLCを、MluI、AscI、またはNotI酵素(New England Biolabs,Ipswich MA)で消化して、Calf Intestinal Phosphatase(New England Biolabs)で処理して、ゲル抽出(QIAEX II Gel Extraction Kit;Qiagen,Valencia CA)によって精製した。
F断片に関して、フォワードプライマーは、ACGCGTCCCGGGAACAATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCC(配列番号127)であり、かつリバースプライマーは、ACGCGTCGTACGCATTCACCCTAAGTTTTTCTTACTTTCTATCAGTTGGAGAAGGCGATATTGTTGATGCCGG(配列番号128)であった。第2のF2遺伝子位置中への挿入のためにAscI制限部位を含むRSV F断片に関して、フォワードプライマーは、GGCGCGCCCCCGGGAACAATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCC(配列番号129)であって、およびリバースプライマーは、GGCGCGCCCGTACGCCATTCACCCTAAGTTTTTCTTACTTGATTCTATCAGTTGGAGAAGGCGATATTGTTGATGCCGG(配列番号130)であった。第3のF3遺伝子位置中への挿入のためにNotI制限部位を含むRSV F断片に関して、フォワードプライマーは、GCGGCCGCCCGGGAAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAATGAACAATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCC(配列番号131)であって、リバースプライマーは、GCGGCCGCCGTACGCTATCAGTTGGAGAAGGCGATATTGTTGATGCCGG(配列番号111)であった。
発現するBSR T7/5細胞中でレスキューした(Buchholzら.1999.J.Virology 73:251~259)。このrHPIV1 cDNAは、Washington/20993/1964(HPIV1 WASH/64)臨床単離体由来である。BSR T7/5細胞は、6ウェルプレート中で90%コンフルエンシーまで増殖させ、アンチゲノムpFLCプラスミド(5ug)を用いて同時トランスフェクトして、以前に記載のとおり(Bartlettら.2005.Vaccine 23:4631~4646;Newmanら.2002.Virus Genes 24:77~92)、Lipofectamine 2000(20ul)(Life Technologies)を用いて、それぞれ、HPIV1 N、PおよびLタンパク質を発現するpTM-N(0.8ug)、pTM-P(0.8ug)およびpTM-L(0.1ug)支持プラスミドとともにレスキューさせた。トランスフェクトされた細胞を37℃で一晩インキュベートして、OptiMEM培地(Life Technologies,Grand Island,NY)を用いて2回洗浄し、新鮮なOptiMEM(1mMのL-グルタミンおよび1.2%トリプシン含有)を細胞に添加した後に、32℃でインキュベーションした。トランスフェクションの48時間後、細胞を、培地中への擦り落とすことによって回収し、細胞懸濁物を、OptiMEM、1mMのL-グルタミン、1.2%トリプシン(Life Technologies)中で、LLC-MK2細胞の50%コンフルエント単層に添加し、32℃でインキュベートした。ウイルスを、7日後に回収して、さらに32℃でLLC-MK2細胞中で1継代(HPIV1-CΔ170)または2継代(HPIV1-LY942A)によってさらに増幅した。ウイルス力価を、上記のように96ウェルプレート中で、LLC-MK2細胞での10倍連続希釈によって決定した。全ての組み換えウイルスを配列決定して、偶発性の変異の欠失を確認した。このために、ウイルスRNAを、ウイルスストックから抽出して(QiaAmp Viral RNA
Mini Kit;Qiagen,Valencia,CA)、RNaseなしのDNase I(Qiagen)を用いて処置して、ウイルスレスキューに用いたプラスミドDNAを取り除いた。RNAを逆転写し(SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR;Invitrogen/Life Technologies)、および重複するゲノム領域は、RT-PCR(Advantage-HF 2 PCR Kit;Clontech Laboratories)によって増幅した。逆転写酵素を欠くRT-PCR対照を、全てのウイルスに含み、これによって、増幅産物は、ウイルスRNA由来であること、およびウイルス回復に用いられるpFLC cDNAに由来しないことが示された。各々のウイルス構築物のゲノム配列は、重複する、増幅したRT-PCR生成物の直接サンガー配列決定によって決定した。配列の読み取りを整列させて、ゲノム配列は、Sequencher program-version 5.1を用いてアセンブルした(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)。
のいずれかからRSV Fを発現するHPIV1 CΔ170またはHPIV1 LY942A構築物を感染させた。空のHPIV1 CΔ170およびHPIV1 LY942Aベクター、wt HPIV1、およびモック処置細胞を、対照として用いた。感染は、1細胞あたり5TCID50というMOIで行い、32℃でインキュベートした。感染後(感染後)48時間で、単層を、PBSを用いて2回洗浄して、400ulの1×LDSサンプル緩衝液(Life Technologies)を用いて溶解した。電気泳動のために、溶解液を、1×還元試薬(Life Technologies)との混合および37℃で30分間のインキュベーションによって還元して変性した。還元された変性された溶解液(40μl)を、4~12%のBis-Tris NuPAGEゲル(Novex-Life Technologies)にロードして、電気泳動を、1×MOPS緩衝液中で行った。タンパク質を、iBlotタンパク質転写システム(Life Technologies)を用いてPVDF膜に転写した。膜を、Licorブロッキング緩衝液(Licor Inc.Lincoln,NE)中で1時間ブロックして、マウスモノクローナルRSV F特異的な抗体(ab43812;Abcam,Cambridge,MA)およびウサギポリクローナルHPIV1 N特異的な抗体(HPIV1-N-485)を、ブロッキング緩衝液中で、1:1000希釈で用いてプローブした。HPIV1-N-485を、前に記載のとおり(Bartlettら.2010.Vaccine 28:767~779)、アミノ酸(aa)残基485~499のNにまたがるKLHコンジュゲートのNペプチドによるウサギの免疫によって生成した。同じ設定の溶解液で行った複製ブロットを、KLHコンジュゲートペプチドによるウサギの反復免疫によって惹起され、1:200希釈で使用されたHPIV1 P(SKIA-1)、F(SKIA-15)、またはHN(SKIA-13)についてウサギポリクローナル血清でプローブした。上記の抗体との一晩のインキュベーション後、膜を4×で、各々5分洗浄し、続いて、Licorブロッキング緩衝液で希釈した二次抗体とともに1時間インキュベーションした。対応する赤外線色素コンジュゲート二次抗体は、ヤギ抗マウスIRDye 680LTおよびヤギ抗ウサギIRDye800CW(LiCor)であった。膜をスキャンして、ブロット画像を、Odyssey赤外線画像化システム(LiCor)を用いて獲得した。3つの独立した実験由来のタンパク質バンドの蛍光強度を、Licor画像解析スイート(Image Studio)を使用することによって定量して、F3ウイルスに対して、RSV FまたはHPIV1ベクタータンパク質(N、P、F、およびHN)の発現として報告した。
20791;Abcam)のLicorブロッキング緩衝液の中で1:1600希釈での混合物とともに同時免疫染色することによって、感染されたVero細胞単層上で検出した。1時間のインキュベーション後、細胞を、1mlのブロッキング緩衝液を用いて1回洗浄し、赤外線色素コンジュゲートのヤギ抗マウス680LTおよびロバ抗ヤギ800CW(LiCor)を、各々ブロッキング緩衝液中に1:800希釈で含有する二次抗体混合物とともにインキュベートした。細胞を1×PBSを用いて2回洗浄し、同時染色したプラークの画像をOdyssey赤外線画像化システム(LiCor)上でプレートをスキャンすることによって獲得した。50プラーク未満を含むウェルを分析のために選択し、RSC F発現について陽性のrHPIV1プラークのパーセンテージを決定した。このアッセイを使用して、ワクチン接種物において、およびin vivo複製後のハムスターから単離されたウイルス中でRSV Fを発現する集団のパーセントを決定することによってRSV F発現の安定性を評価した。
ハムスターにおけるウイルス複製。全ての動物研究は、国立衛生研究所(NIH)の動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use
Committee)(IACUC)によって承認された。感染後3日目および5日目の各々のウイルスのin vivo複製、および免疫原性を、ハムスターで評価した。6週齢のゴールデンシリアンハムスターを、それぞれ、血球凝集抑制(HAI)アッセイおよびRSV中和アッセイによって、免疫前血清を解析することによって、HPIV1およびRSVについて血清陰性であると確認した(Coatesら.1966.Am J Epidemiol 83:299~313;Coatesら.1966.J Bacteriol 91:1263~1269;van Wyke Coelinghら.1988.J Infect Dis 157:655~662)。1ウイルスあたり6匹のハムスターの群を麻酔して、動物1匹あたり105 TCID50のウイルスを含有する、0.1mlのL15培地(Life Technologies)を鼻腔内に接種した。複製を評価するために、ハムスターを感染後3日目および5日目に安楽死させて、鼻甲介および肺をウイルス滴定のために収集した。チメンチン(Timentin)(200mg/ml)、アンピシリン(Ampicillin)(100mg/ml)、クレオシン(Cleocin)(150mg/ml)、およびアンホテリシン(Amphotericin)B(250 ug/ml)を含むL15培地中の組織ホモジネートを、LLC-MK2細胞での連続希釈によって滴定し、続いて、HADによってウイルス感染を検出した。ウイルス力価は、ハムスター組織1グラムあたりのTCID50として報告した。組織ホモジネートはまた、Vero細胞でプラークアッセイによって滴定し、上記のような蛍光二重染色プラークアッセイを用いることによってRSV FおよびHPIV1タンパク質の発現について染色した。結果を、RSV Fを発現するHPIV1プラークのパーセントとして報告した。
RSVおよびHPIV1に対する血清中のウイルス中和抗体(NAb)の誘導[60%プラーク減少中和試験(PRNT60)]。ワクチン候補の免疫原性を評価するために、ハムスターを上記のように免疫して、血清を免疫後28日でハムスターから収集した。RSV特異的な中和抗体(NAb)の力価は、eGFP発現性RSV(Munirら.2008.J Virol 82:8780~8796)を使用して、前に記載のように(Coatesら.1966.Am J Epidemiol 83:299~313)Vero細胞でPRNT60によって決定した。ハムスター血清を、56℃で30分間インキュベートして、補体タンパク質を不活性化し、続いて96ウェルプレート中でOpti-MEMI、2%FBS、1×ゲンタマイシン培地中で連続希釈した。Opti-MEM、2%FBS、1×ゲンタマイシン、10%モルモット補体中で希釈したRSV-eGFP(Yoderら.2004.J medical virology 72:688~6
94)(Lonza,Walkersville,MD)をさらに、等容積の連続希釈された血清サンプルとの混合によって1:1希釈し、続いて37℃で30分インキュベーションした。100μlの容積の血清-ウイルス混合物を、24ウェルプレート中で増殖されたVero細胞に添加し、ウイルスを32℃で振盪器上で2時間吸着させた。Opti-MEMI、8%メチルセルロース、2%FBS、1×ゲンタマイシンの積層を、添加して、5~6日間インキュベートし、プラーク形成を可能にした。単層上のRSVプラークを、Typhoon Imagerを用いて画像を走査および獲得することによって可視化した(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。各々のサンプルのプラークカウントを、決定して、NAb力価を、上記のとおり決定した(Coatesら.1966.Am J Epidemiol 83:299~313)。HPIV1-特異的なNAbの力価はまた、以下の改変を有するGFP発現性rHPIV1を用いて、RSVについて記載されるとおりの方法を用いて、Vero細胞上で60%プラーク減少アッセイによって決定した:第1、HPIV1中和アッセイの場合、モルモット補体は、ウイルスを中和することが見出されたので、使用せず、第2に、接種されたVero細胞を、血清を除去するためにウイルス吸着後に1×PBSで2回洗浄し、そして第3に、4%トリプシンを含有し、かつFBSを欠いているメチルセルロース積層培地を使用した。
3つの異なるゲノム位置からRSV Fタンパク質を発現する2つの弱毒化HPIV1骨格(rHPIV1 CΔ170およびrHPIV1 LY942A)の作製。2つの弱毒化HPIV1骨格を調製し、これは、脱弱毒化に対する安定性のために設計された、異なる、前に特定された弱毒化変異(すなわち、CΔ170およびLY942A)を各々が含んだ(序、図36および42)。CΔ170変異は、温度感受性を付与しないが、LY942A変異は、温度感受性変異であった。次に、株A2のRSV F ORFは、ヒト発現のためにコドン最適化されて、HPIV1遺伝子開始および遺伝子末端シグナルの制御下であるように遺伝子操作し、rHPIV1 CΔ170およびrHPIV1 LY942A骨格中に、3つの異なる、平行なゲノム位置で:すなわち第1遺伝子位置(プレ-N、rHPIV1 CΔ170-F1およびrHPIV1 LY942A-F1を生成);第2遺伝子位置(N-P、rHPIV1 CΔ170-F2およびrHPIV1 LY942A-F2を生成):および第3遺伝子位置(P-M、rHPIV1 CΔ170-F3およびrHPIV1 LY942A-F3を生成)で挿入した(図36)。各々の構築物は、「6規則(rule of six)」に従う(Calainら.1993.J
Virol 67:4822~4830)。各々のベクター遺伝子は、そのもとの六量体スペーシングを維持し、一方、F1、F2、およびF3インサートは、それぞれ、もとのN、P、およびP遺伝子のもとの六量体スペーシングを仮定した。RSV Fタンパク質はまた、HEKアミノ酸アサインメント、GluおよびProを、それぞれ、66および101残基で保持し(Whiteheadら.1998.J virology 72:4467~4471)、これは、株A2の初期継代由来のRSV Fの配列と一致し、また、ほとんどの他の臨床単離体とも一致している。
効率で回収され、ワーキングプールを作製するには多数の継代が必要であると思われた。各々のウイルスの完全な配列を決定して、偶発性の変異がないことを確認した。全てのrHPIV1/RSV-Fウイルスワーキングプールは、rHPIV1 LY942A-F2ウイルスを除いて見かけの偶発性の変異は無かった:このウイルスに関して、9つのクローンをレスキューし、そのうちの1つだけが、偶発性の変異を欠く正確なゲノム配列を有した。他の8つのクローンは、偶発性の変異を含み、これは、HPIV1 N遺伝子の下流のHPIV1転写シグナル(N遺伝子末端-遺伝子間-P遺伝子開始)および先行するRSV F ORFにおいて優勢であった。平行なrHPIV1 LY942A-F2およびrHPIV1 CΔ170-F2構築物の第2の位置におけるRSV F遺伝子の挿入部位は同一であったので、これによって、前者のウイルスによる問題は、それ自体による挿入部位ではなく、LY942A変異(例えば、変更したポリメラーゼ機能)に特異的であったことが示唆される。
最初に、ジスルフィド連結F1およびF2サブユニットへのフリン様プロテアーゼによる翻訳後切断であるF0前駆体として翻訳される。RSV Fに特異的なモノクローナル抗体での免疫染色によって、F0(70kD)およびF1(48kD)の両方が検出された。HPIV1 N、P、F、およびHNタンパク質を、対応する抗ペプチドポリクローナル抗体で検出した。3つの独立した実験のうち1つからの代表的なブロットを、図38Aに示し、3つ全ての実験からの結果を、それぞれ図38Bおよび図38CのrHPIV1
CΔ170および rHPIV1 LY942A構築物について定量し、値を各々のシリーズ中のF3構築物のものに対して1.0として正規化した。
Fを発現し(図38A,レーン1-3、および図38B)、これはタンパク質のバンド定量によって示されるように、F3と比較した場合、F1およびF2についてごくわずかに高く(図38B)、相違は統計学的に有意ではなかった。従って、予期せぬことに、F1からF3の発現の3’-5’極性勾配は観察されなかった。しかし、対照的に、RSV
F発現の強力な極性の勾配が、HPIV1 LY942Aウイルスの場合に観察され、F1ウイルスによるRSV Fの発現は、F2(p<0.01)およびF3(p<0.05)ウイルスと比較して有意に高かった(図38A、レーン5-6、および図38C)。
LY942A空ベクターと比較して、N、P、F、およびHNタンパク質において、極めて顕著でかつ有意な低下を示した。比較すると、rHPIV1 CΔ170-F2ウイルスはまた、P、F、およびHNタンパク質の発現の低下を示したが、Nタンパク質の発現の低下は示さなかった。これは、予測された。なぜなら、第2のF2位置のNの後ろの挿入は、3’-5’極性転写勾配に起因して下流遺伝子の発現を低下すると予想されるが
、上流のN遺伝子は、観察されたとおり影響されないと予想されるからである。しかし、予期せぬことにrHPIV1 LY942A-F2の場合、RSV Fは、N遺伝子の下流に挿入されたが、Nタンパク質の発現もネガティブに影響された。rHPIV1 LY942A-F1は、Nタンパク質の場合にのみ有意に低下した発現を有したが、P、F、およびHNタンパク質の発現は、rHPIV1 LY942A空ベクターの発現と匹敵していた。
ウイルス力価の平均log10低下は、同じ2つの温度でのwt rHPIV1の低下と比較して、≧2.0 log10であった(Bartlettら.2005.Vaccine 23:4631~4646)。ts表現型は、≦40℃というシャットオフ温度を有すると規定した。
CΔ170-F2および-F3構築物はまた、40℃のシャットオフ温度を有し、従って、空ベクターと有意に異なることはなかった。しかし、rHPIV1 CΔ170-F1ウイルスは、39℃という、より低いシャットオフ温度を有した(図43)。本研究では、rHPIV1 LY942A空ベクターは、以前の研究でのこの変異と関連する35~37℃という値と同様の36℃のシャットオフ温度を有した(McAuliffeら JVI 78:2029~2036、2004;Bartlettら Virol J 4:67、2007)。rHPIV1 LY942A-F1および-F2構築物は、空ベクターよりもtsであって、35℃のシャットオフ温度であったが、rHPIV1 LY942A-F3ベクターは、空ベクターと同じ36℃のシャットオフ温度を有した(図43)。従って、いずれかの弱毒化された骨格のF1位置へのRSV F遺伝子の挿入は、ts表現型を増大し、いずれかの骨格のF3位置への挿入は、ts表現型を増大せず、F2位置への挿入は、LY942A骨格についてのみ表現型を増大した。
用いてLLC-MK2細胞で滴定によってウイルス複製のために分析し、その力価をlog10TCID50/mlとして報告した。ウイルス力価は、URT(図40A)およびLRT(図40B)中で、それぞれ白抜き三角および黒塗りの丸として3日目および5日目について示される。各々の記号は個々の動物に相当する。
42A-F1および-F3を除く)は、5日目には、3日目よりも高かった(図40A)。対照的に、rB/HPIV3-F2は、5日目にピーク力価を得た。全体として、肺では、RSV Fを発現する全てのベクターは、感染後3日目および5日目にwt HPIV1と比較して有意に(p≦0.0001)制限された(図40B)、また5日目にrB/HPIV3-F2と比較して有意に制限された。
RSV Fを発現するキメラrHPIV1ウイルスによる免疫は、RSVおよびHPIV1に対する血清ウイルス中和抗体(NAb)を誘導する。RSV Fを発現するrHPIV1ウイルスの免疫原性を決定するために、1ウイルスあたり6つのハムスターの群を、動物1匹あたり105 TCID50を用いて鼻腔内に接種した。wt RSV、rHPIV1 CΔ170、rHPIV1 LY942A、およびrB/HPIV3-F2を、対照として含んだ。免疫されたハムスター由来の血清を、感染後28日目で収集し、RSVおよびHPIV1に対するNAb力価をPRNT60アッセイによって決定した(図45)。rHPIV1 CΔ170-F1、-F2、および-F3は、お互いに統計学的に異なることはない力価でRSV特異的NAbを誘導した。これは、驚くべきことではない。なぜなら全ての3つのウイルスが、同様のレベルのRSV Fタンパク質発現を示したからである(図38Aおよび38B)。rHPIV1 CΔ170-F1および-F2は、-F3ウイルスよりもわずかに高いRSV F発現を有したが、この相違は、統計学的に有意ではなかった(図38B)。同様に、-F1および-F2ウイルスはまた、感染の間に合成されたRSV Fの量とおそらく関連している-F3ウイルスよりも比較的高い融合活性および合胞体形成を示した(図39A~39C)。統計学的に有意ではないが、NAb力価は、発現されたRSV Fの量ではなくそれらのin vivo複製プロファイルとさらに一致するF2と比較してF1およびF3ウイルスに関してわずかに高いようである(図40A)。rHPIV1 CΔ170-F1、-F2、および-F3によって誘導されるRSV NAb力価はrB/HPIV3-F2によって誘導される力価よりも有意に低かった(rB/HPIV3-F2と比較したこれらのウイルスの有意に低下した複製からおそらく生じる相違)(図40Aおよび図40B)。
かし、LY942A変異は、高度に弱毒化され、36℃というシャットオフ温度でts表現型を付与したことに注目することが重要である(図43)。LY942A変異体ウイルスは、ハムスターでは示す複製が最小であるかまたは検出不能であったと予想された(体温:36.7~38.3℃;メルク・マニュアル(The Merck Manual))。骨格表現型と一致して、rHPIV1 LY942A-F1、-F2、および-F3はまた、それぞれ、35℃、35℃、および36℃というシャットオフ温度でtsであって、これによって、F1およびF2位置でのRSV Fの挿入は、シャットオフ温度を1℃ずつ低下し、それらをさらにtsにさせたことが示される。従って、rHPIV1 LY942A-F1は、許容温度でrHPIV1 CΔ170-F1、-F2、および-F3ウイルスのレベルと匹敵するレベルでRSV Fを発現できたが(図38A)、RSV
NAbを誘導することは、おそらくその強力なts表現型およびin vivoでの複製が不能なせいでできなかった。rHPIV1 LY942A-F2および-F3ウイルスは、見たところ、2つの交絡因子を有した:それらは比較的劣ったRSV F発現を示し(図38Aおよび図38C)、さらにtsであって、in vivoで複製せず(図40Aおよび図40B)、RSV NAb応答の欠失を生じた。従って、rHPIV1 LY942A-F1、-F2、および-F3ウイルスは、それらの過剰な弱毒化ts表現型ならびに複製および免疫原性のin vivoでの欠失という理由で、免疫原性ではなく、ワクチン候補物を生成しなかった。
。それらの劣った免疫原性は、おそらく、それらの強力なts表現型の結果(図43)およびin vivo複製がないこと(図40)の結果である。
げっ歯類および/または非ヒト霊長類において免疫原性であった、弱毒化および/またはts変異を保有するrHPIV1の種々の弱毒化バージョンは以前に開発された。それぞれ、6ヌクレオチドの欠失および3ヌクレオチドの置換を含むCΔ170またはLY942A変異のいずれかを含む2つの弱毒化rHPIV1骨格をアッセイした。RSV Fは、適切に弱毒化され、さらに十分に免疫原性であり、wt RSVチャレンジに対して防御する構築物を特定する目的で各々の骨格の第1、第2、または第3のゲノム位置に挿入された。RSV Fを発現する全てのrHPIV1ウイルスを、逆遺伝学によって首尾よくレスキューした。Vero細胞およびLLC-MK2細胞における増殖反応速度論によって、全てのウイルスが、感染後7日目で決定された極めて類似でかつ統計学的に識別できない最終力価まで増殖したことが示された(図37)。しかし、複製の有意な相違が、2日目に両方の細胞株で観察された。LY942A変異は、少なくともVero細胞ではCΔ170変異よりも強力な弱毒化効果を有すると思われた。予想に反して、rHPI
V1CΔ170ウイルスは、IFN-I欠損Vero細胞と比較して、I型インターフェロン(IFN-I)補体LLC-MK2中では弱毒化されなかった。RSV Fを発現するrHPIV1CΔ170のうちで、wt HPIV1と比較した有意な弱毒化が、Vero細胞において-F1および-F2ウイルスについて(図37A)およびLLC-MK2細胞において-F1について(図37B)観察されたが、-F3複製は、空ベクターおよびwt HPIV1と同様であった。これらのデータによって、-F1または-F2ウイルスにおいて3’近位位置により近いRSV Fの挿入は、弱毒化されるが、この効果は、一過性であって、全てのウイルスは、同様の最終の力価まで増殖した(図37Aおよび図37B)。-F1、-F2および-F3を含む全てのrHPIV1 LY942A骨格ベクターは、7日目に同様の最終力価まで増殖した。しかし、それらはまた、2日、3日および4日目でVero細胞およびLLC-MK2細胞の両方で複製の低下を示したが、5~7日間のwt HPIV1に対して同様であった。RSV Fインサートが誘導した弱毒化は、rHPIV1CΔ170ベクターと比較してrHPIV1LY942Aについてかなり大きく(図37D)、これによって、RSV Fインサートが既に有意に弱毒化された骨格に対してより強力な弱毒化効果を有することが示される。
ベクタータンパク質を発現したが、F1と比較してRSV F発現の10倍を超える低下を示した(図38Aおよび図38C)。これによって、第3ゲノム位置でのRSV F挿入は、ベクタータンパク質発現に負に影響しなかったことが示され(図38Aおよび図38C)、ただし、極性の転写勾配におけるその遠位位置におそらく起因して、劣ったRSV F発現が実証された。
位置でのRSV Fの挿入は、追加的な弱毒化効果を有することが示される。F1ウイルスは、所望の程度の弱毒化を有すると思われるが、F2およびF3ウイルスは、それぞれ過剰弱毒化および過小弱毒化されている。
ーの開発
本実施例は、改変されたRSV Fエクトドメインをコードする遺伝子をHPIV1ベクター骨格中に挿入して、RSV Fエクトドメインをそのエンベロープ上で発現し、弱毒化されており、伝染性であり、かつ防御抗体応答を誘導できる組み換えウイルスを生成できるということを示すアッセイを示す。F2位置はまた、有効な挿入部位として特定された。これらの知見は、以下を示す:
1.HPIV1 F TMCTドメインの操作上の境界を特定した(図60)。
2.HPIV1 F TMCTドメインを、組み換えRSV Fエクトドメイン、例えば、HEK/GS-opt/DS-Cav1に対して追加して、細胞表面で効率的に発現され、抗RSV-F抗体と反応性であるタンパク質が達成される。
3.HPIV1 F TMCT(HEK/GS-opt/DS-Cav1/H1TMCT)を含むRSV Fを、HPIV1ベクター粒子に効率的にパッケージングした(すなわち、RSVよりも1μgのビリオンタンパク質あたり高いレベルで、図64)。これは、センダイウイルスでの以前の研究に基づいた予測と完全に反しており(HPIV1のマウスの類、従っておそらくは、閉じた予測モデル)、ここではセンダイウイルスCTまたはTMCTを含むRSV Fは、内因性センダイウイルスFタンパク質が欠失された場合のみ、粒子中に効率的にパッケージングされた(Zimmerら 2005 J Virol 79:10467~10477)。
3.HEK/GS-opt/DS-Cav1およびHEK/GS-opt/DS-Cav1/H1TMCT型のRSV Fタンパク質を、第1または第2の遺伝子位置に挿入して、RSV Fを安定に発現し、in vitroで効率的に複製し(図63)、およびベクター粒子中に効率的に組み込まれるベクター構築物(HPIV1 F TMCTが存在する場合、図64)を生成することができる。
4.予期せぬことに、F1位置またはF2位置のいずれかが、融合性であるRSV Fタンパク質を発現するのに効率的である(例えば、HEK/GA-opt、実施例2)が、F2位置は、非融合性であったRSV Fの細胞内発現について特に効率的であった(例えば、HEK/GS-opt/DS-Cav1)。
5.rHPIV1-CΔ170-F2/HEK/GS-opt/DS-Cav1およびrHPIV1-CΔ170-F2/HEK/GS-opt/DS-Cav1/H1TMCT構築物を、RSV Fタンパク質を効率的に発現するもの、および、特に後者の場合は、RSV Fをベクター粒子中へ効率的に組み込んだものとして特定した。
らに効率的に相互作用して、キメラRSV Fタンパク質の組み込みを促進することを前提として、HPIV1ベクターへのRSV Fタンパク質の組み込みを増大する目的で行った。
J Virol 73:251~259))、各々の全長抗ゲノムプラスミドならびにHPIV1 N、P、およびLタンパク質を発現する3つの発現プラスミドとを同時トランスフェクトすることによってレスキューした。HPIV1およびRSV Fタンパク質の同時発現を検出する二重染色プラークアッセイを行って、RSV F発現の安定性を決定した。プラークのかなりの部分が、RSV Fタンパク質を効率的に発現した。これらの同じ4つの調製物を、自動化配列決定(これによって、プライマーによって隠された、3’および5’末端でのそれぞれ22ヌクレオチドおよび26ヌクレオチドを除いて、その全体で各々のゲノムが解析された)によってコンセンサス配列解析に供した。このウイルスは、この方法によって検出可能な偶発性の変異がないことが見出された。
-CΔ170空ベクターにそった4つの構築物のセットをLLC-MK2細胞中で増殖させて、スクロース勾配遠心分離によって精製した。wt RSVを、Vero細胞中で増殖し、続いてスクロース勾配精製して、対照として含めた。約1μgの各々のスクロース-精製したウイルスを、RIPA緩衝液中で溶解し、還元して、変性して、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット解析に供した。RSV Fタンパク質およびHPIV1タンパク質(N、F、およびHN)を、マウスモノクローナル(Abcam)およびウサギポリクローナルペプチド-特異的抗体(実施例2を参照のこと)をそれぞれ、前に記載されたようなそれらの対応する赤外線色素コンジュゲート二次抗体とともに用いて検出した(実施例2;Mackowら 2015 J Virol 89:10319~10332)(図64)。それぞれ、第1および第2位置から全長RSV Fを発現した、F1/DS-Cav1およびF2/DS-Cav1精製したビリオンの解析によって、HPIV1ベクタービリオンにおいてRSV Fの検出可能なパッケージングは実証されなかった(図64、頂部パネル、レーン3および5)。対照的に、F1/DS Cav1-H1TMCTおよびF2/DS Cav1-H1TMCTビリオンの両方とも(図64,レーン4および6)、かなりの組み込みを示し、これは、F2/DS Cav1-H1TMCTよりもF1/DS Cav1-H1TMCTについて高かった。興味深いことに、両方のH1TMCTバージョンとも、ビリオンタンパク質の1μgあたりwt RSV(図64、レーン7)と比較してビリオン中でパッケージングされた多量のRSV Fを示す。
Fタンパク質についての抗血清は、HPIV1 Fタンパク質のCTドメインの最後の18アミノ酸を含むペプチドに対して惹起され、従ってこの抗血清は、HPIV1 F0およびF1タンパク質に加えて、HPIV1 Fタンパク質TMCTを含むRSV Fタンパク質の形態、すなわちF1/DS-Cav1/H1TMCTおよびF2/DS-Cav1/TMCTを検出した。RSV Fバンドの特定は、抗RSV Fモノクローナル抗体との同時染色によって確認された;これによって、RSV Fが、実際にHPIV1 F TMCTドメインとともに発現されることが確認される。
ぶんかさらに遅く複製した(図63)。F1ウイルスを感染された細胞中のRSV Fの細胞内発現の低いレベルは、ビリオン組み込みプロファイルと対照的であり(図64)、これによって、F2/DS-Cav1/H1TMCTと比較して、F1/DS-Cav1/H1TMCTについてのRSV Fのさらに高い組み込みが示される(レーン4対6)。F1およびF2位置の両方で、TMCTを有するDS-Cav1が、DS-Cav1単独よりもいくぶんか高いレベルで発現され、これによって、TMCTが、タンパク質またはmRNA転写物をさらに安定にすることによってRSV F発現を増強し得ることが示唆される。同様の効果がまた、B/HPIV3ベクターを感染されたVero細胞においてBPIV3 F TMCTを有するRSV Fでも観察された(図50A)。これはまた、HPIV1 N、P、F、およびHNタンパク質の細胞内発現が、F2ウイルスと比較してF1ウイルスについて極めて低かったこともまた注目すべきである(図65、第2、第3、および第4のパネル、レーン1および2対3および4)。これによって、F1ウイルスについて極めて低い遺伝子発現が明らかになるが(図65、レーン1および2)、見かけ上作製されるRSV Fタンパク質は、HPIV1 TMCTを保有するRSV Fの場合には、HPIV1ビリオン中に極めて効率的に組み込まれた(図64,レーン4)。
上記で考察されるとおり、RSV F HEK/GA-opt/DS構築物に対するBPIV3 Fタンパク質のTMCTの追加(B3TMCT)は、アカゲザルにおいてrB/HPIV3ベクターの実質的な弱毒化を生じた(図29)。B3TMCTに起因してハムスターでの弱毒化の証拠があった(図51)。これによって、B3TMCTがrB/HPIV3ベクターを過剰弱毒化させる能力が惹起された。1つの解決法は、弱毒化が少ないウイルス、例えば、wt HPIV3をベクターとして用いることである。さらに、HPIV3ベクターを用いた場合(すなわち、骨格遺伝子の全てが、HPIV3に由来する)、これは、HPIV3に対する細胞免疫についての抗原としてHPIV3タンパク質の完全な補体を提供し、従って、HPIV3ベースのベクターは、rB/HPIV3ベースのベクターよりもHPIV3に対して防御性であることができる。本実施例で考察される知見によって、予期せぬことに、RSV FインサートF1-HEK/GS-opt/DS-Cav1/H3TMCTの発現の安定性が、TMCTを欠くそのバージョン、すなわ
ちF1-HEK/GS-opt/DS-Cav1よりも安定であると考えられた。これは、予想に反していた。なぜなら、ベクター粒子への組み込みは、RSV F発現の維持に対して追加の選択圧をもたらすと期待されたが、これは観察されなかったからであった。
Microbiol 29:1175-1182、1991)。このウイルスの組み換えバージョン(rHPIV3)は、HPIV3逆遺伝学システムが確立された場合に導入されたHN(A263TおよびT370P)中に2つの変異を有する。本研究では、rHPIV3ベクターを、rB/HPIV3ベクターによる大きいプラーク形成を妨げることが見出されたHNタンパク質において263Tおよび370Pのアミノ酸アサインメントを含むように改変した(その改変は、図58Bに詳細に示された)。さらに、rHPIV3ベクターを、第1遺伝子位置中のRSV F(または潜在的には任意の他のインサート)の挿入のための、103~109位置での固有のBlpI部位の創出(図67A、頂部構築物)、または第2の遺伝子位置におけるRSV Fの挿入のための位置1675~1682での固有のAscI部位の創出(図67B、頂部構築物)によって改変した。
Fタンパク質中へ導入されたキメラも示される。
第1遺伝子位置(F1)に挿入されたHEK/GS-opt/DS-Cav1(図67A);
第1遺伝子位置(F1)に挿入されたHEK/GS-opt/DS-Cav1/H3TMCT(図67A);
第2遺伝子位置(F2)に挿入されたHEK/GS-opt/DS-Cav1(図67B);
第2遺伝子位置(F2)に挿入されたHEK/GS-opt/DS-Cav1/H3TMCT(図67B)。
以下の実施例によって、いくつかの異なるPIVベクターシステム(rB/HPIV3、rHPIV1、およびrHPIV3 JSを含む)を用いて、追加された遺伝子としてRSV Fタンパク質を効率的に発現できることが示される。変異体のパネルを構築して、ベクター(例えば、インサート位置、弱毒のレベルなど)およびRSV Fインサート(例えば、融合前安定化、ベクター粒子へのパッケージングなど)による種々の変動を体系的に評価した。変異体のパネルを細胞培養物中で、ハムスター中で、および非ヒト霊長類中で詳細な分析に供して、発現レベル、in vitroおよびin vivoの安定性、in vivoの弱毒化、免疫原性、および防御効率に関して有効な変異体を特定した。
287;427~435)。呼吸器合胞体ウイルスは、高レベルの合胞体形成に関して悪評高いので、そして高レベルの合胞体形成は実際、機能的なRSV Fタンパク質がPIVベクターから発現された場合に観察された(例えば、実施例1)ので、このウイルスがin vitroでベクター複製を妨害しなかったことは極めて驚くべきことであった。従って、開示された構築物の複製の効率によって、Vero細胞では効率的なワクチン製造が可能になる。さらに、低下した(HEKアサインメント)または本質的に排除された(DS,DS-Cav1)全体的な合胞体形成を導入された改変が導入され、これによって、高レベルの合胞体形成に起因する問題を未然に防ぐであろう。
rnsteinら 2012、Pediatr Infect Dis 31:109~114)。しかし、本開示で記載された改変された構築物は実質的に安定であった。合胞体形成を低減するかまたは阻害するような要因は、安定性に寄与する可能性が高い。いくつかの場合には、予測不能な因子が特定された。例えば、rB/HPIV3ベクター中のHN遺伝子は、大きいプラーク表現型を生じた実質的な不安定性を示すことが見出された。しかし、この問題は、HN遺伝子ではI263TおよびT370P置換によって排除された(図58)。安定性に関する予期せぬ知見の別の例は、rHPIV3 JSのF1位置から発現されたHEK/GS-opt/DS-Cav1/H3TMCT構築物の組み合わせによるRSV F発現の安定性の増大であった(図68A)。F1位置からの発現は、高レベルの発現のおかげで、最も不安定であったと予想された場合もあるが、これは、観察はされなかった。ベクターへのRSV Fタンパク質のパッケージングはまた、発現の喪失に関する選択圧を生じることも予想された場合があるが、これは観察されなかった。
Fが効率的に発現され、かつウイルス感染と適合するか否かは未知であったが、これは正しかった。TMCTパッケージングシグナルが、高程度の効率のパッケージング(これは並行して試験したRSV粒子のパッケージングと等しいかまたは超えた)と連動したことも驚くべきことであった。高度に効率的なパッケージングは、内因性のFおよびHN表面糖タンパク質を置き代えることなどによって、ベクター粒子の産生を破壊しなかったことも驚くべきことであった。
Claims (47)
- 組換えパラミクソウイルスであって、
パラミクソウイルスのFタンパク質の、細胞質尾部(CT)、または膜貫通ドメイン(TM)およびCTと連結している組換え呼吸器合胞体ウイルスRSV Fエクトドメインを含むI型膜タンパク質をコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノム
を含み、
組換えヒト/ウシパラインフルエンザウイルス3(B/HPIV3)、組換えヒトパラインフルエンザウイルス1(HPIV1)、組換えヒトパラインフルエンザウイルス2(HPIV2)、組換えヒトパラインフルエンザウイルス3(HPIV3)または組換えウシパラインフルエンザウイルス3(BPIV3)である、
前記組換えパラミクソウイルス。 - パラミクソウイルスのFタンパク質のTMおよびCTと連結しているRSV Fエクトドメインを含む、請求項1に記載の組換えパラミクソウイルス。
- パラミクソウイルスのFタンパク質のCTと連結しているRSV Fエクトドメインを含み、該RSV Fエクトドメインは、RSV F膜貫通ドメインを介してパラミクソウイルスのFタンパク質のCTと連結している、請求項1に記載の組換えパラミクソウイルス。
- RSV Fエクトドメインは、ヒトサブタイプA RSVまたはヒトサブタイプB RSVに由来する、請求項1~3のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。
- RSV Fエクトドメインは、天然RSV Fタンパク質配列と比較して1つまたはそれ以上のアミノ酸置換によって、RSV F融合前コンホメーションにおいて安定化されている、請求項1~4のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。
- RSV Fエクトドメインは、
(a)66E;
(b)101P;
(c)155Cおよび290C;
(d)190F;
(e)207L;または
(f)(a)および(b);(a)および(c);(a)および(d);(a)および(e);(a)、(d)および(e);(a)、(c)、(d)および(e);(a)、(b)および(c);(a)、(b)および(d);(a)、(b)および(e);(a)、(b)、(e)および(d);(a)、(b)、(c)、(d)および(e);(c)および(d);もしくは(c)および(e);もしくは(c)、(d)および(e)の組合せ
として示されるアミノ酸を含み、ここで、アミノ酸番号付けは、配列番号1として示されるRSV Fタンパク質配列に対応する、請求項5に記載の組換えパラミクソウイルス。 - RSV Fエクトドメインは、
(a)K66E;
(b)Q101P;
(c)S155CおよびS290C;
(d)S190F;
(e)V207L;または
(f)(a)および(b);(a)および(c);(a)および(d);(a)および
(e);(a)、(d)および(e);(a)、(c)、(d)および(e);(a)、(b)および(c);(a)、(b)および(d);(a)、(b)および(e);(a)、(b)、(e)および(d);(a)、(b)、(c)、(d)および(e);(c)および(d);もしくは(c)および(e);もしくは(c)、(d)および(e)の組合せ
として示されるアミノ酸置換を含む、請求項6に記載の組換えパラミクソウイルス。 - RSV Fエクトドメインは、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207Lを含む、請求項6または7に記載の組換えパラミクソウイルス。
- RSV Fエクトドメインは、配列番号1(WT RSV F A)、2(WT RSV F B)、12(A2 HEK)、14(A2 HEK DS)もしくは21(A2
HEK DS-Cav1)のうちの1つのRSV エクトドメインまたは配列番号1、2、12、14もしくは21のうちの1つのRSVエクトドメインと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、またはからなる、請求項1~5のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。 - (a)RSV FエクトドメインがHPIV1 Fタンパク質のCTと連結している、組換えHPIV1;
(b)RSV FエクトドメインがHPIV2 Fタンパク質のCTと連結している、組換えHPIV2;
(c)RSV FエクトドメインがHPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えHPIV3;
(d)RSV FエクトドメインがBPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えHPIV3;
(e)RSV FエクトドメインがHPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えBPIV3;
(f)RSV FエクトドメインがBPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えBPIV3;
(g)RSV FエクトドメインがHPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えB/HPIV3;または
(h)RSV FエクトドメインがBPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えB/HPIV3
を含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。 - (a)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているHPIV1 Fタンパク質のCTは、配列番号31の残基24~59として示されるアミノ酸配列、または配列番号31の残基24~59と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(a);
(b)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているHPIV2 Fタンパク質のCTは、配列番号39の残基29~66として示されるアミノ酸配列、または配列番号39の残基29~66と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(b);
(c)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているHPIV3 Fタンパク質のCTは、配列番号46の残基24~46として示されるアミノ酸配列、または配列番号46の残基24~46と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(c);
(d)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているBPIV3 Fタンパク質のCTは、配列番号53の残基22~57として示されるアミノ酸配列、または配列番号53の残基22~57と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(d);
(e)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているHPIV3 Fタンパク質のCTは、配列番号46の残基24~46として示されるアミノ酸配列、または配列番号46の残基24~46と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(e);
(f)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているBPIV3 Fタンパク質のCTは、配列番号53の残基22~57として示されるアミノ酸配列、または配列番号53の残基22~57と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(f);
(g)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているHPIV3 Fタンパク質のCTは、配列番号46の残基24~46として示されるアミノ酸配列、または配列番号46の残基24~46と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(g);または
(h)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているBPIV3 Fタンパク質のCTは、配列番号53の残基22~57として示されるアミノ酸配列、または配列番号53の残基22~57と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(h)
を含む、請求項10に記載の組換えパラミクソウイルス。 - (a)であって、HPIV1 F CTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号133として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(a);
(c)であって、HPIV3 F CTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号8として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(c);
(d)であって、BPIV3 F CTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号16として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(d);
(e)であって、HPIV3 F CTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号8として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(e);
(f)であって、BPIV3 F CTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号16として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(f);
(g)であって、HPIV3 F CTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号8として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(g);または
(h)であって、BPIV3 F CTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号16として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(h)
を含む、請求項10に記載の組換えパラミクソウイルス。 - (a)RSV FエクトドメインがHPIV1 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えHPIV1;
(b)RSV FエクトドメインがHPIV2 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えHPIV2;
(c)RSV FエクトドメインがHPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えHPIV3;
(d)RSV FエクトドメインがBPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えHPIV3;
(e)RSV FエクトドメインがHPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えBPIV3;
(f)RSV FエクトドメインがBPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えBPIV3;
(g)RSV FエクトドメインがHPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えB/HPIV3;または
(h)RSV FエクトドメインがBPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えB/HPIV3
を含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。 - (a)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているHPIV1 Fタンパク質のTMおよびCTは、配列番号31として示されるアミノ酸配列、または配列番号31と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(a);
(b)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているHPIV2 Fタンパク質のTMおよびCTは、配列番号39として示されるアミノ酸配列、または配列番号39と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(b);
(c)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているHPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTは、配列番号46として示されるアミノ酸配列、または配列番号46と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(c);
(d)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているBPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTは、配列番号53として示されるアミノ酸配列、または配列番号53と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(d);
(e)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているHPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTは、配列番号46として示されるアミノ酸配列、または配列番号46と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(e);
(f)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているBPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTは、配列番号53として示されるアミノ酸配列、または配列番号53と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(f);
(g)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているHPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTは、配列番号46として示されるアミノ酸配列、または配列番号46と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(g);または
(h)であって、RSV Fエクトドメインと連結しているBPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTは、配列番号53として示されるアミノ酸配列、または配列番号53と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(h)
を含む、請求項13に記載の組換えパラミクソウイルス。 - (a)であって、HPIV1 F TMおよびCTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号135として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(a);
(c)であって、HPIV3 F TMおよびCTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号10として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(c);
(d)であって、BPIV3 F TMおよびCTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号21として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(d);
(e)であって、HPIV3 F TMおよびCTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号10として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(e);
(f)であって、BPIV3 F TMおよびCTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号21として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(f);
(g)であって、HPIV3 F TMおよびCTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号10として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(g);または
(h)であって、BPIV3 F TMおよびCTと連結しているRSV Fエクトドメインは、配列番号21として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む(h)
を含む、請求項13に記載の組換えパラミクソウイルス。 - ウイルスゲノムがHPIV1 N、P、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、RSV Fエクトドメインと連結しているCTまたはTMおよびCTがHPIV1 Fタンパク質に由来する、組換えHPIV1;
ウイルスゲノムがHPIV2 N、P、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、RSV Fエクトドメインと連結しているCTまたはTMおよびCTがHPIV2 Fタンパク質に由来する、組換えHPIV2;
ウイルスゲノムがHPIV3 N、P、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、RSV Fエクトドメインと連結しているCTまたはTMおよびCTがHPIV3 Fタンパク質に由来する、組換えHPIV3;
ウイルスゲノムがHPIV3 N、P、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、RSV Fエクトドメインと連結しているCTまたはTMおよびCTがBPIV3 Fタンパク質に由来する、組換えHPIV3;
ウイルスゲノムがBPIV3 N、P、V、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、RSV Fエクトドメインと連結しているCTまたはTMおよびCTがHPIV3 Fタンパク質に由来する、組換えBPIV3;
ウイルスゲノムがBPIV3 N、P、V、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、RSV Fエクトドメインと連結しているCTまたはTMおよびCTがBPIV3 Fタンパク質に由来する、組換えBPIV3;
ウイルスゲノムがHPIV3 FおよびHNタンパク質ならびにBPIV3 N、P、V、MおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、RSV Fエクトドメインと連結しているCTまたはTMおよびCTがHPIV3 Fタンパク質に由来する、組換えB/HPIV3;または
ウイルスゲノムがHPIV3 FおよびHNタンパク質ならびにBPIV3 N、P、V、MおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、RSV Fエクトドメインと連結しているTMおよびCTがBPIV3 Fタンパク質に由来する、組換えB/HPIV3を含む、請求項1~15のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。 - 組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子は、ウイルスゲノムのゲノムプロモーターの下流の第1のまたは第2の遺伝子である、請求項1~16のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。
- ウイルスゲノムは、パラインフルエンザウイルスFタンパク質をコードする遺伝子を含み、特に、該パラインフルエンザウイルスFタンパク質は、組換えパラミクソウイルスのFタンパク質である、請求項1~17のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。
- 組換えパラミクソウイルスは、
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV1ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV1 N、P、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間またはNタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置する、組換えHPIV1;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV2ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV2 N、P、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間またはNタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置する、組換えHPIV2;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV3 N、P、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、組換
えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間またはNタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置する、組換えHPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、P、M、F、HNおよびLタンパク質をコードする遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間またはNタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置する、組換えBPIV3;または
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、PおよびMタンパク質、HPIV3 FおよびHNタンパク質ならびにBPIV3 Lタンパク質をコードする遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間またはNタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置する、組換えB/HPIV3
を含む、請求項16~18のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。 - 組換えB/HPIV3を含み、HPIV3 FおよびHN遺伝子ならびにBPIV3 N、P、MおよびLタンパク質は、それぞれ配列番号43、101、47、48、49、52として示されるアミノ酸配列、またはそれぞれ配列番号43、101、47、48、49、52と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項16~19のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。
- 組換えB/HPIV3または組換えHPIV3を含み、ウイルスゲノムは、HPIV3
HNタンパク質をコードする遺伝子を含み、該HPIV3 HNタンパク質は、残基263および307にそれぞれトレオニンおよびプロリンを含む、請求項1~20のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。 - RSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項1~21のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。
- 異種遺伝子が配列番号11として示されるヌクレオチド配列(GS RSV F_HEK_DS-Cav1_H3TMCT)を含む、組換えHPIV3;
異種遺伝子が配列番号11として示されるヌクレオチド配列(GS RSV F_HEK_DS-Cav1_H3TMCT)を含む、組換えB/HPIV3;または
異種遺伝子が配列番号22(GA RSV F_HEK_DS-Cav1_B3TMCT)または配列番号23(GS RSV F_HEK_DS-Cav1_B3TMCT)として示されるヌクレオチド配列を含む、組換えB/HPIV3、
異種遺伝子が配列番号20(GA RSV F_HEK_DS_B3TMCT)または配列番号137(GS RSV F_HEK_DS_B3TMCT)として示されるヌクレオチド配列を含む、組換えB/HPIV3
を含む、請求項22に記載の組換えパラミクソウイルス。 - ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV1ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV1 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV1 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えHPIV1;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV1ゲノムプロモーターと、それに続く、
HPIV1 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV1 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えHPIV1;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えHPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えHPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えHPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えHPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えBPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えBPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、PおよびM遺伝子、HPIV3 FおよびHN遺伝子ならびにBPIV3 L遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えB/HPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、PおよびM遺伝子、HPIV3 FおよびHN遺伝子ならびにBPIV3 L遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタ
ンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV
Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えB/HPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、PおよびM遺伝子、HPIV3 FおよびHN遺伝子ならびにBPIV3 L遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えB/HPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、PおよびM遺伝子、HPIV3 FおよびHN遺伝子ならびにBPIV3 L遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV
Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV3 Fタンパク質のTMおよびCTと連結している、組換えB/HPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV1ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV1 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV1 Fタンパク質のCTと連結している、組換えHPIV1;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV1ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV1 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV1 Fタンパク質のCTと連結している、組換えHPIV1;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えHPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えHPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えHPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、HPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、HPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコー
ドする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えHPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えBPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、P、M、F、HNおよびL遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えBPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、PおよびM遺伝子、HPIV3 FおよびHN遺伝子ならびにBPIV3 L遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えB/HPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、PおよびM遺伝子、HPIV3 FおよびHN遺伝子ならびにBPIV3 L遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV
Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、BPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えB/HPIV3;
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、PおよびM遺伝子、HPIV3 FおよびHN遺伝子ならびにBPIV3 L遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、ゲノムプロモーターとNタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えB/HPIV3;または
ウイルスゲノムが、上流から下流に、BPIV3ゲノムプロモーターと、それに続く、BPIV3 N、PおよびM遺伝子、HPIV3 FおよびHN遺伝子ならびにBPIV3 L遺伝子を含み、組換えRSV Fエクトドメインをコードする異種遺伝子が、Nタンパク質をコードする遺伝子とPタンパク質をコードする遺伝子との間に位置し、RSV
Fエクトドメインが、66E、101P、155C、290C、190Fおよび207L置換を含み、HPIV3 Fタンパク質のCTと連結している、組換えB/HPIV3を含む、請求項1に記載の組換えパラミクソウイルス。 - HPIV1は、CΔ170またはLY942A減弱突然変異を含み;
HPIV3は、HPIV3 JS株であり;
HPIV3は、HNタンパク質中にI263TおよびT370P置換を含み;または
B/HPIV3は、HNタンパク質中にI263TおよびT370P置換を含む、
請求項1~24のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。 - 組換えRSV Fエクトドメインは、RSV F位置1~529を含み;
特に、組換えRSV Fエクトドメインは、配列番号21の残基1~529と少なくと
も90%同一であるアミノ酸配列を含み;
特に、組換えRSV Fエクトドメインは、配列番号21の残基1~529と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含み;
特に、組換えRSV Fエクトドメインは、配列番号21の残基1~529のアミノ酸配列を含む、請求項1~25のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。 - rB/HPIV3-F2-HEK/GS-opt/DS-Cav1/B3TMCTを含み、HNタンパク質中にI263TおよびT370P置換をさらに含む、請求項1に記載の組換えパラミクソウイルス。
- 組換えパラミクソウイルスであって、
(a)パラミクソウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメイン(TM)および細胞質尾部(CT)と連結している異種ウイルスのI型膜貫通タンパク質のエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノム;または
(b)パラミクソウイルスのHNタンパク質のTMおよびCTと連結している異種ウイルスのII型膜貫通タンパク質のエクトドメインをコードする異種遺伝子を含むウイルスゲノム
を含む前記組換えパラミクソウイルス。 - 異種遺伝子が、パラミクソウイルスのFタンパク質の、細胞質尾部(CT)、または膜貫通ドメイン(TM)およびCTと連結している組換え呼吸器合胞体ウイルRSV Fエクトドメインをコードし、
組換えヒト/ウシパラインフルエンザウイルス3(B/HPIV3)、組換えヒトパラインフルエンザウイルス1(HPIV1)、組換えヒトパラインフルエンザウイルス2(HPIV2)、組換えヒトパラインフルエンザウイルス3(HPIV3)、組換えウシパラインフルエンザウイルス3(BPIV3)、組換えPIV5、組換えセンダイウイルスまたは組換えニューカッスル病ウイルスである、
請求項28に記載の組換えパラミクソウイルス。 - 組換えパラミクソウイルスまたはウイルスベクターに感染した宿主細胞によって産生されるウイルス粒子の少なくとも90%は、異種遺伝子によってコードされるエクトドメインを含むウイルスエンベロープを含む、請求項1~29のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。
- 感染性ウイルス、減弱ウイルスおよび自己複製ウイルスである、請求項1~30のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。
- RSV Fエクトドメインは、パラミクソウイルスのウイルスエンベロープ上に存在する、請求項1~31のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルス。
- 請求項1~32のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルスおよび医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項33に記載の免疫原性組成物。
- 対象においてRSV Fタンパク質に対する免疫応答を誘発する方法であって、治療上有効な量の請求項33または34に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む前記方法。
- 対象において呼吸器合胞体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスに対する免疫応
答を誘発する方法であって、治療上有効な量の請求項33または34に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む前記方法。 - 免疫応答は、保護的免疫応答である、請求項35または36に記載の方法。
- 免疫原性組成物のプライム-ブースト投与を含む、請求項35~37のいずれか1項に記載の方法。
- 免疫原性組成物の鼻腔内または非経口投与を含む、請求項35~38のいずれか1項に記載の方法。
- 対象は、ヒトまたは獣医学的対象である、請求項35~39のいずれか1項に記載の方法。
- 対象は、RSVもしくはPIV感染のリスクがある、またはRSVもしくはPIV感染を有する、請求項35~40のいずれか1項に記載の方法。
- 対象は、1歳未満である、請求項35~41のいずれか1項に記載の方法。
- 対象は、免疫無防備状態であるか、または高齢である、請求項35~41のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1~32のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルスのゲノムを含む核酸分子。
- 組換えRSV Fエクトドメインであって、K66EおよびQ101Pアミノ酸置換を含み、場合により(a)~(d):
(a)S155CおよびS290C;
(b)S190F;
(c)V207L;または
(d)(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);もしくは(a)、(b)および(c)の組合せ
のうちの1つをさらに含む前記組換えRSV Fエクトドメイン。 - 請求項44に記載の組換えRSV Fエクトドメインをコードする核酸分子。
- 対象においてRSVまたはRSVおよびPIVに対する免疫応答を誘発するための、請求項1~32のいずれか1項に記載の組換えパラミクソウイルスの使用。
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