CN105473604B - 融合前rsv f蛋白和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，其包括稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白。还公开了编码所述抗原的核酸和产生所述抗原的方法。此外公开了在受试者中产生免疫反应的方法。在一些实施方案中，所述方法是用于在受试者中治疗或预防RSV感染的方法，其通过向所述受试者施用治疗有效量的所述抗原来实现。

Description

融合前RSV F蛋白和其用途
相关申请
本申请要求2013年3月13日提交的美国临时申请No.61/780,910、2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/798,389、2013年7月23日提交的美国临时申请No.61/857,613和2013年8月9日提交的美国临时申请No.61/863,909的优先权，所述临时申请各自以全文引用的方式并入。
技术领域
本公开涉及用于诱导和检测针对呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫反应的多肽、聚核苷酸、组合物和其使用方法。
发明背景
呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒属（Pneumovirus)中的包膜非节段性负链RNA病毒。它是儿童在其人生第一年中患细支气管炎和肺炎的最常见原因。RSV也造成反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，其可能发生在任何年龄，尤其是在老年人或者心脏、肺或免疫系统受损的那些人中。目前使用被动免疫来预防由RSV感染造成的严重疾病，尤其是在具有早产、支气管肺发育不良或先天性心脏病的婴儿中。目前的治疗包括施用RSV中和抗体帕利珠单抗(Palivizumab)(
Figure BDA0000844346390000011
MedImmune，Inc.)，其结合RSV融合(F)蛋白上的24个氨基酸的线性构象表位。
在自然界中，RSV F蛋白最初以单一多肽前体形式表达，称为F0。F0在内质网中三聚化并且在两个保守位点被细胞弗林样蛋白酶处 理，产生F1、F2和Pep27多肽。所述Pep27多肽被切除并且不构成成熟F蛋白的一部分。所述F2多肽源自F0前体的N端部分并且经由两个二硫键连接至F1多肽。所述F1多肽源自F0前体的C端部分并且经由跨膜结构域将成熟F蛋白锚定在膜中，所述跨膜结构域连接至约24个氨基酸的胞质尾。F2-F1异二聚体的三个原体组装形成成熟F蛋白，其采用亚稳态融合前构象，它被触发以进行融合病毒和靶细胞膜的构象变化。由于其在RSV入侵中的强制作用，RSV F蛋白是中和抗体的靶标和疫苗开发的主题；然而，像其他RSV抗原一样，先前关于开发基于RSV F蛋白的疫苗的努力已被证实是不成功的。
发明内容
如本文所述，阐明了RSV F蛋白呈其融合前构象的三维结构。本公开首次揭示了RSV F的融合前构象的原子水平细节，它在其膜远端顶端呈现独特的抗原位点(“抗原位点
Figure BDA0000844346390000021
”)。使用融合前F的三维结构作为指导，工程改造并构建融合前F的稳定化形式(“PreF”抗原)，并且用于产生RSV中和免疫反应，所述免疫反应相比于利用先前基于RSV F蛋白的免疫原所实现的免疫反应大许多倍，并且其在动物模型中提供针对RSV激发的保护。所述PreF抗原可以例如用作RSV的潜在疫苗和用作诊断分子。
公开了稳定在融合前构象的分离重组RSV F蛋白，以及编码所述重组RSV F蛋白的核酸分子。在若干实施方案中，所述重组RSV F蛋白稳定在融合前构象，其可以特异性结合于融合前特异性抗体如D25、5C4、AM22和/或MPE8抗体。在若干实施方案中，所述重组RSV F蛋白包含抗原位点
Figure BDA0000844346390000022
其包含RSV F蛋白序列如SEQ ID NO：370的残基62-69和196-209。在一些实施方案中，免疫原在20℃下在磷酸盐缓冲盐水中在生理pH下在不存在抗体的情况下温育至少24小时后，所述免疫原可以特异性结合于所述抗体。在其他实施方案中，免疫原当溶解在水溶液中时可以形成均质群体，其中所述群体中的至少90％的免疫原可以特异性结合于融合前特异性抗体。
在一些实施方案中，F2多肽和F1多肽分别包含RSV F位置62-69和196-209，并且所述F2多肽包含RSV F位置26-109的8-84个残基或由RSV F位置26-109的8-84个残基组成，并且所述F1多肽包含RSV F位置137-529的14-393个残基或由RSV F位置137-529的14-393个残基组成，其中所述RSV F位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
在若干实施方案中，所述重组RSV F蛋白包括一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代将所述蛋白稳定在融合前构象，例如，其将所述F蛋白的膜远端部分(包括F1多肽的N端区域)稳定在融合前构象。例如，所述氨基酸取代可以引入非天然二硫键或者可以是填充空腔的氨基酸取代。在若干实施方案中，所述重组RSV F蛋白包括S155C和S290C取代，其形成将所述蛋白稳定在融合前构象的非天然二硫键；也就是说，在特异性结合于一种或多种融合前规范抗体和/或呈现存在于RSV F蛋白的融合前而非融合后构象上的抗原位点如抗原位点
Figure BDA0000844346390000031
的构象中。在其他实施方案中，所述重组RSV F蛋白还可包括在位置190、位置207、或位置190和207处的F、L、W、Y、H或M取代。在一个非限制性实例中，所述重组RSV F蛋白包括S155C、S290C、S190F和V207L取代(在本文中称为“DSCav1”)。
在其他实施方案中，所述重组RSV F蛋白可包括对F1多肽的C端的一种或多种修饰(例如截短和氨基酸取代)，所述修饰与稳定化F多肽的膜远端区域的修饰一起，可以增加所述重组F蛋白在融合前构象中的稳定化。示例性修饰包括将F1多肽连接至三聚化结构域(例如折叠子结构域)或者将一个或多个半胱氨酸残基引入F1多肽的C端区域中(例如，在位置512和513处)，其可以形成原体间二硫键。
所述PreF抗原可以包括在蛋白质纳米粒子上，或病毒样粒子上。此外公开了编码所述PreF抗原的核酸分子。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括作为单链RSV F蛋白的重组RSV F蛋白。
其他实施方案包括表位-骨架蛋白，其包括连接至异源骨架蛋白的RSV F位置62-69和196-209或其环状重排体(circular permutant)，其中所述表位骨架蛋白特异性结合于融合前特异性抗体。
此外提供了包括所述PreF抗原、蛋白质纳米粒子、核酸分子或载体的组合物。所述组合物可以是适于施用至受试者的药物组合物，并且也可包含在单位剂型中。所述组合物还可包括佐剂。
公开了在受试者中产生免疫反应的方法，以及在受试者中治疗、抑制或预防RSV感染的方法。在所述方法的一些实施方案中，向受试者如人类或牛受试者施用有效量的所公开抗原和/或编码所公开抗原的核酸分子。在一些实施方案中，所述方法包括施用免疫原性组合物，所述组合物包括经过选择以在受试者中诱导Th1偏向性免疫反应的佐剂。在其他实施方案中，所述方法包括使用利用本文公开的修饰而稳定在融合前构象中的人类A亚型和人类B亚型RSV F蛋白进行初免-加强免疫。公开了在感染RSV的受试者中检测或分离RSV结合抗体的方法。在一些实施方案中，所述重组RSV F蛋白可以用于检测和定量多克隆血清反应中的目标抗体。
根据参考附图进行的以下详细说明，所述实施方案的前述和其他目标、特征和优点将变得更显而易见。
附图说明
图1A-1C是示出与融合前RSV F三聚体复合的人类抗体D25的RSV中和、F糖蛋白识别和晶体结构的一组曲线图和图解。RSV F的融合前构象是亚稳态的，并且当以可溶形式表达时容易采用融合后状态；多种有效抗体(包括D25)结合于最近揭示的在融合前F糖蛋白顶部的抗原位点。(A)RSV被包括帕利珠单抗(FDA批准的预防性抗体)的抗体中和以预防严重的RSV疾病。(B)测量抗体与融合后F糖蛋白的结合的酶联免疫吸附测定法(ELISA)。(C)以飘带和分子表面图表示的D25-RSV F三聚体结构。F糖蛋白三聚体的一个原体以飘带显 示。对于另外两个F原体显示分子表面。结合于以飘带显示的F原体的D25 Fab也以飘带图显示，其中重链呈深灰色阴影，而轻链呈浅灰色阴影。其他D25 Fab呈相同阴影，但以表面图显示。
图2A和图2B是示出RSV F的结构重排的一组图解和与RSV二级结构比对的序列。为了介导病毒细胞入侵，RSV F糖蛋白从亚稳定的融合前构象转变为稳定的融合后构象。(A)融合前和融合后结构。外部图像显示融合前(左)和融合后(右)三聚体结构，其与图1C中呈相同阴影。在成熟蛋白中存在的三个N连接糖基化位点中的每一个模拟以棒示出的复杂聚糖。内部图像显示以飘带图表示的单个RSV F原体。(B)RSV F序列和二级结构。N连接糖基化位点以黑色三角形突出显示，抗原位点被标记，并且向下的箭头指示弗林裂解位点的位置。在序列(SEQ ID NO：370)下示出二级结构，其中圆柱形表示α螺旋并且箭头表示β链。无序或缺失的残基由“X”指示；在融合前构象与融合后构象之间移动超过
Figure BDA0000844346390000052
的残基以灰色阴影显示并且用方框框住。
图3A-3C是示出RSV F与D25的界面的一组图解和序列比对。抗体D25结合在融合前F三聚体的顶端横跨两个原体的四级表位。(A)D25与RSV F之间的界面的特写。与D25相互作用的F残基的侧链被标记并且以棒显示。氧原子呈浅灰色阴影并且氮原子呈深灰色阴影。氢键以虚线描绘。两个图像的关系是围绕垂直轴旋转90°。(B)在融合前和融合后F分子上的D25表位的位置和构象。示出在D25界面处的RSV F残基。α4和α5后的极性用箭头指示，其中指示片段N端和C端。(C)在由D25识别的区域中的F残基的序列保守。不同于hRSV/A的人类RSV亚型B(hRSV/B)或牛RSV(bRSV)中的氨基酸被加以下划线。胞外域被定义为F残基26-109和137-524。
图4A-4D是关于抗原位点
Figure BDA0000844346390000051
的一系列曲线图和数字图像。高效的RSV中和抗体靶向在融合前F三聚体的膜远端顶端处的位点。(A)测量抗体阻断D25与RSV感染细胞结合的能力随抗体浓度变化的函 数。(B)通过阴性染色电子显微镜分析RSV F/Fab复合物：(左)
Figure BDA0000844346390000061
限幅通过在
Figure BDA0000844346390000062
分辨率下滤光并限幅以包括F-三聚体空腔的RSV F+D25 Fab的晶体结构的再投影。(中)263个RSV F+D25 Fab粒子的比对平均值。(右)550个RSV F+AM22 Fab粒子的比对平均值。中间图中的比例尺是
Figure BDA0000844346390000063
(C)融合抑制和(D)靶向抗原位点
Figure BDA0000844346390000064
的抗体和靶向其他抗原位点的F特异性抗体的连接抑制活性。对于连接抑制测定法，使用肝素作为阳性对照。
图5示出说明了用于表达RSV F和D25的复合物的方法的示意图。将表达RSV F(+)Fd(F环)、D25轻链(L环)和D25重链(在铰链区中具有或不具有终止密码子，H环)的质粒同时转染至悬浮的HEK293细胞中。可选地，RSV F(+)Fd质粒可用转染后3小时添加至细胞中的纯化的D25 Fab或IgG转染。通过同时表达F和D25 Fab来获得最好的产率(每升细胞约1.0mg纯化复合物)。
图6示出说明了D25结合的RSV F与融合前PIV5F的比较的一组飘带图。D25结合的RSV F(+)Fd(左)和PIV5F-GCNt(右)的飘带图。两种蛋白质之间的二级结构元件存在优异一致性，但仅具有约12％序列同一性。最显著的差异之一是融合肽的位置(F1亚基的N端)，也示于图7中。PIV5F结构描述为由三个结构域组成：I、II和III(Yin等，Nature，439，38(2006))。结构域III称为膜远端叶，而结构域I和II涵盖中央筒和膜近端叶。此处显示的裂解的PIV5结构是从PDB ID：4GIP产生的(Welch等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.109，16672(2012))。
图7示出说明了I型融合前病毒糖蛋白的一系列图解。RSV F、PIV5 F(PDB ID：4GIP(Welch等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.109，16672(2012))、流感HA(PDB ID：2HMG；Wilson等，Nature，289，366(1981))和埃博拉GP(PDB ID：3CSY；Lee等，Nature，454，177(2008))的融合前结构以分子表面显示，其中每个原体被不同地着色。在底行上，对于F2(RSV和PIV5)或HA1(流感)的C端残基显示球体， 并且对于融合肽的N端残基显示球体。RSV和PIV5都是副粘病毒并且其F蛋白共有约12％序列同一性。虽然埃博拉GP是I型融合蛋白，但其缺乏GP2上的游离N端融合肽，而是含有II型和III型融合蛋白中常见的内部融合环。因此，从融合肽比较中忽略埃博拉GP。
图8是关于RSV被IgG和Fab中和的一组曲线图。D25、AM22和莫维珠单抗(Motavizumab)与IgG或Fab同样良好地中和RSV。注意到莫维珠单抗曲线图的x轴不同于其他。
图9A和图9B是示出RSV F糖蛋白上的抗原位点的特性的一系列图解和曲线图。仅针对抗原位点
Figure BDA0000844346390000071
的抗体特异性结合于融合前构象并具有出色的中和效能。(A)对于位点
Figure BDA0000844346390000072
显示结合于融合前RSV F三聚体的单个D25 Fab的图像，以及AM22和D25的中和曲线。对于位点I，箭头指向Pro389，已知的逃逸突变(Lopez等，J.Virol.，72，6922(1998))。关于抗体131-2a显示中和曲线。与抗体2F(Magro等，J.Virol.，84，7970(2010))一样，抗体131-2a仅中和病毒的约50％。(B)对于抗原位点II和IV，使用抗体-肽结构的坐标来制造结合于融合前和融合后(McLellan等，J.Virol.，85，7788(2011))F结构的莫维珠单抗(位点II)和101F(位点IV)的模型(McLellan等，J.Virol.，84，12236(2010)；McLellan等，Nat.Struct.Mol.Biol.，17，248(2010))。
图10示出聚丙烯酰胺凝胶的图像，其说明了具有S155C和S290C氨基酸取代以及连接至F1的C端的折叠子结构域的重组RSV F蛋白构建体的表达，和示出S155C与S290C之间的二硫键仅可形成在RSV F蛋白的融合前构象中的一组图解。
图11是示出来自使用具有S155C和S290C氨基酸取代和连接至F1的C端的折叠子结构域的重组RSV F蛋白构建体的ELISA和凝胶过滤测定法的结果的一组曲线图。ELISA数据表明S155C/S290C构建体被RSV F融合前特异性抗体特异性结合。凝胶过滤概况显示S155C/S290C构建体仅以三聚体形式存在，而在含缺乏S155C/S290C 取代的对照RSV F构建体的溶液中以聚集体和玫瑰花结形式存在。
图12示出具有S155C和S290C氨基酸取代以及连接至F1的C端的折叠子结构域的重组RSV F蛋白构建体的阴性染色电子显微镜图像。大图下面的图像是单独的粒子的2D平均值。结果表明，S155C/S290C构建体稳定在融合前构象。
图13-14示出说明了施用天然RSV(RSV)、福尔马林灭活的RSV(FI-RSV)、具有S155C和S290C氨基酸取代以及连接至F1的C端的折叠子结构域的重组RSV F蛋白构建体(融合前F)、或稳定在融合后构象的RSV F蛋白构建体(融合后RSV)的小鼠的中和抗体反应的一组曲线图。示出初始免疫后第5周(图13)和第7周(图14)的抗体反应。
图15示出通过S155C和S290C取代稳定在融合前构象的可溶性重组RSV F蛋白的晶体的数字图像。左，标准光图像；右，紫外光图像，指示蛋白质。来自水性缓冲溶液的晶体的形成表明，这种蛋白质在溶液中基本上是均质的。
图16示出通过工程改造的二硫键突变S155C和S290C(“DS”)、填充空腔的突变S190F和V207L(“Cav1”)和附接的C端异源三聚化结构域(Fd)稳定化的基于RSV F蛋白的抗原(RSV_A F(+)FdTHS)的设计。D25结合的RSV F结构显示具有以粉红色和棕褐色着色的分子表面所示的两个原体和以飘带所示的第三原体。示出在融合前构象与融合后构象之间移动超过
Figure BDA0000844346390000081
的F1的N端和C端残基。插图示出残基S155C与S290C之间的工程改造的二硫键(称为“DS”)，以及填充空间的空腔突变S190F和V207L(称为“Cav1”)。T4噬菌体次要纤维蛋白三聚化结构域的模型显示在融合前三聚体的底部。在人类RSV亚型A中包括S155C和S290C以及S190F和V207L取代、和附接的C端异源折叠子结构域的RSV F蛋白被称为RSV_A F(+)FdTHSDSCav1。可与D25识别相容、但不够稳定以允许以均质 三聚体形式纯化的突变被标记并以黑色棒图示出。
图17示出RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的抗原性表征。使用OctetRED 384TM仪器(ForteBio，Melno Park，CA)测量可溶性D25、AM22、5C4、101F、莫维珠单抗和帕利珠单抗Fab与固定化RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的相互作用的缔合和解离速率。提供每种抗体的平衡解离常数。
图18示出RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的尺寸排阻色谱法。使凝血酶裂解以除去标签后的纯化蛋白通过16/70Superose 6尺寸排阻柱。洗脱体积与糖基化三聚体一致。
图19示出了列出通过DS、Cav1或DSCav1改变而稳定化的RSV_A F(+)FdTHS变体的抗原性和物理特性的表格。最左栏限定RSV F变体，并且其余栏提供变体特性，包括来自短暂表达的质粒的产率、针对多种抗原位点的抗原性，和在各种温度、pH和摩尔渗透压浓度下温育1小时后或达到10次冷冻-解冻循环的D25结合的保持(以分数量提供)。DSCav1变体保持抗原位点
Figure BDA0000844346390000092
识别，具有改进的物理稳定性，如通过在暴露于温度、pH、摩尔渗透压浓度和冷冻-解冻极值后相比于DS或Cav1变体更高的D25反应性保持来判定。
图20示出RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的
Figure BDA0000844346390000093
晶体结构的飘带图。较粗的飘带对应于增加的B因子。虽然是稳定化突变，但在三聚体顶端的抗原位点
Figure BDA0000844346390000091
仍保持显著灵活性。
图21示出RSV_A F(+)FdTHS DSCav1与D25结合的RSV F的比较。RSV_A F(+)FdTHSDSCav1的飘带图与白色着色的D25结合的RSV F(PDB ID 4JHW)的飘带图叠置。所述图像的关系是围绕垂直轴旋转90°。
图22示出RSV_A F(+)FdTHS DSCav1结构中的稳定化突变。具有等高线为1σ的2Fo-Fc电子密度的RSV_A F(+)FdTHS DSCav1晶体 结构的球-棒图以网格显示。这些图像指示观察到对应于半胱氨酸残基155和290之间的二硫键(左)以及填充空腔的Phe190残基(右)的电子密度。
图23示出RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的小鼠免疫原性。用与50μg poly I：C佐剂混合的10μg RSV_A F(+)FdTHS DSCav1蛋白使每组十只CB6小鼠免疫化。免疫化发生在第0周和第3周，并且对于来自第5周和第7周的血清测试RSV亚型A(RSV_A)和B(RSV_B)的中和。平均值由水平线指示。
图24显示RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的非人类灵长类动物(NHP)免疫原性。用与500μg poly I：C佐剂混合的50μg RSV_A F(+)FdTHS DSCav1蛋白使每组四只RSV原生恒河猴免疫化。免疫化发生在第0周和第4周，并且对于来自第6周的血清测试RSV亚型A(左)和B(右)的中和。平均值由水平线指示。
图25A-25C示出表达载体的质粒图谱。(A)用于表达来自人类亚型A的重组RSV F蛋白的RSV_AF(+)FdTHS DSCav1 paH表达载体(SEQ ID NO：384)的图谱，所述重组RSV F蛋白包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，其与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合。(B)用于表达来自人类亚型B(菌株B1)的重组RSV F蛋白的RSV_B(B1)F(+)FdTHS DSCav1 paH表达载体(SEQ ID NO：386)的图谱，所述重组RSV F蛋白包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，其与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合。(C)用于表达来自人类亚型B(菌株18537)的重组RSV F蛋白的RSV_B(18537)F(+)FdTHS DSCav1 paH表达载体(SEQ ID NO：388)的图谱，所述重组RSV F蛋白包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，其与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合。
图26A-26D示出对于RSV的基于结构的疫苗设计(超位点范 例)。(A)RSV造成的自然感染诱导多种抗体，其具有一定范围的病毒中和效能。(B)天然诱导的高效抗体的表位簇限定病毒易攻击超位点。示出识别RSV F三聚体顶端的表位的有效中和抗体D25的抗原结合片段。三聚体顶端的空间重叠表位也由AM22和5C4抗体识别，所述抗体与D25共有相同的所需中和特征。这些重叠表位限定作为RSV易攻击超位点的抗原位点
Figure BDA0000844346390000111
(C)在目标超位点的选择后，迭代设计过程、抗原性和物理特性的表征、原子水平结构测定和免疫原性评估允许编码目标超位点的疫苗抗原的基于结构的优化。(D)因为病毒易攻击超位点自然地诱导高度保护性抗体，所以用“超位点免疫原”进行免疫化相比于基于由次要或非强效中和抗体识别的病毒区域的免疫原更容易诱导保护性反应。
图27示出可溶性三聚体位点
Figure BDA0000844346390000112
稳定化的RSV F的设计。超过100种的含有T4次要纤维蛋白-三聚化结构域(折叠子)的RSV F变体被设计以更稳定地保持抗原位点
Figure BDA0000844346390000113
此处显示具有模拟折叠子的RSV F三聚体在其D25结合构象中的结构。所述三聚体显示具有呈浅灰棕色和粉红色阴影的分子表面形式的两个原体，和呈飘带形式的第三启动子。所述飘带在其融合前与融合后之间相对固定的区域中呈白色阴影，而在融合前与融合后构象之间移动超过
Figure BDA0000844346390000117
的N端和C端残基呈更深灰色阴影。与表达和初始D25识别相容，但不够稳定以允许以均质三聚体形式纯化的突变被标记并且以黑色棒图示出。插图示出关于DS、Cav1和TriC变体以棒图示的稳定化突变的特写，其全部稳定地保持抗原位点
Figure BDA0000844346390000114
(图31)。
图28A-28C示出被工程改造以保存抗原位点
Figure BDA0000844346390000115
的RSV F三聚体的结构。(A-C)示出RSV F变体的六种结构，被稳定化突变(DS、Cav1、DS-Cav1和DS-Cav1-TriC)和被晶格(立方和四方)和结晶pH标记。(A)RSV F三聚体以Cα蠕虫图显示，根据原子迁移率因子着色。缺失的区域以虚线显示。这些发生在C端膜近端区域，其中折叠子基序不可见，除非在DS-Cav1-TriC结构中(最右边)。在DS结构中，顶部区域中的两个环也是无序的。(B)RSV F原体的抗原位点
Figure BDA0000844346390000116
以飘带 图显示，其中指示呈灰色的D25结合的RSV F的结构和不同变体。稳定化突变被标记并且以棒图示出。(C)原子水平细节以棒图示出，其中融合前与融合后构象之间改变构象的RSV F的区域呈深灰色，而保持不变的那些呈较浅灰色。指示用于稳定化突变的稳定化碳原子。在Cav1(pH 5.5)中和在DS-Cav1(pH 5.5)中，观察到新颖特征，其涉及F2肽的C端与硫酸根离子和融合肽的相互作用。在DS-Cav1-TriC结构中，D486H-E487Q-F488W-D489H突变与三聚体轴周围的两个相邻原体相互作用。
图29A-29B示出关于工程改造的RSV F三聚体的免疫原性的结果。被工程改造以稳定地显示抗原位点
Figure BDA0000844346390000121
的RSV F蛋白所诱导的中和效价相比于由融合后F所诱导的中和效价显著更高。(A)来自用10μg RSV F免疫化的小鼠的血清的中和效价(左)。融合后F以及由抗体AM22或D25结合的RSV F在每只小鼠20μg下免疫化(右)。几何平均值由水平线指示。(B)来自用50μg RSV F蛋白变体免疫化的恒河猴的血清的中和效价。几何平均值由水平线指示。保护阈值由虚线指示，并且提供关于融合后相对于DS-Cav1的p值。
图30A-30D示出抗原位点
Figure BDA0000844346390000122
稳定化的RSV F的物理、结构和抗原特性如何与免疫原性相关。(A)位点
Figure BDA0000844346390000123
的物理稳定性相对于免疫原性。插图示出如通过图31中的D25活性保持的7次测量所测定的transFer物理稳定性信息被平均化(水平轴)并与来自图29的所诱导RSV保护效价进行比较(垂直轴)。(B)位点
Figure BDA0000844346390000124
的结构拟态相对于免疫原性。插图示出信息转移。结构拟态(水平轴)是不同结构之间的rmsd(图28)和对于D25的所有原子在
Figure BDA0000844346390000125
内的D25结合的RSV F。将这与来自图29的所诱导的RSV保护效价进行比较(垂直轴)。(C)来自免疫化恒河猴的血清的抗原分析。直接测量(空白，黑色条)或在与过量融合后F(深灰色条)或DS-Cav1(浅灰色条)温育后测量血清与固定化DS-Cav1(左)或融合后F(右)的结合。将四个恒河猴血清的平均反应制成曲线，其中具有标准偏差的误差条。(D)NHP血清的免疫原性和抗原性的相关性。将每组中的四个恒河猴血清的平 均中和效价相对于与DS-Cav1和融合后F的结合反应的比率制图。
图31A-31B是示出RSV F蛋白免疫原的抗原和物理表征的结果的表格。#限定三聚状态，但如果三聚状态不可纯化，则是主要低聚物质的低聚状态。如果总产率＜0.1mg/l，则低聚状态未测定(N.D.)。*示出特定低聚状态的产率。＞1000nM＝在1μM Fab浓度下无结合。N/A＝不可用。
图32示出融合前和融合后RSV F结构中的S155和S290的位置。丝氨酸残基155和290的β碳在D25结合的RSV F结构中相隔
Figure BDA0000844346390000131
并且在融合后结构中相隔
Figure BDA0000844346390000132
突变S155C和S290C(称为“DS”)将结构限制在融合前构象中。
图33A-33C示出稳定化F蛋白的阴性染色。A)和B)示出DS和DS-Cav1的阴性染色标本的代表性领域。所述蛋白质高度均质，其中在DS和DSCav1中分别观察到＜1％和＜0.1％的F后构象。F后构象的实例由黑色箭头指示。比例尺＝50nm。2D粒子平均值以插图形式在两倍放大率下示于右上角。比例尺＝5nm。C)示出2D平均值与F+D25复合物(McLellan等，2013)的平均值的比较。比例尺＝5nm。
图34示出粗培养上清液的基于抗体D25的ELISA与纯化的低聚RSV F糖蛋白变体的产率相关(Spearman R＝0.7752和P值＝0.0041)。通过在4℃下在采集后一周的粗培养上清液的D25 ELISA测定293Expi细胞的RSV F糖蛋白产生并且发现其与纯的低聚RSV F糖蛋白变体的产率相关(表1)。
图35示出粗培养上清液的基于抗体莫维珠单抗的ELISA相对于纯化的RSV F糖蛋白变体的产率。(A)通过在4℃下在采集后立即和(B)在采集后一周进行粗培养上清液的莫维珠单抗ELISA来测定293Expi细胞的RSV F糖蛋白产生。将ELISA数据相对于RSV F糖蛋白变体在streptactin亲和色谱后的产率来绘制曲线。有趣的是，三种蛋白质RSV F(+)Fd和两种变体F137W-F140W和T357C-N371C通过莫 维珠单抗ELISA检测为高抑制剂，但在大规模纯化后获得低产率(点沿着纵坐标显示)。
图36示出使用尺寸排阻色谱法的工程改造的RSV F糖蛋白的表征。RSV F变体，a：Cav1；b：Cav1-TriC；c：DS-Cav1-TriC；d：F488W；e：DS-Cav1；f：TriC；g：DS-TriC；h：DS；展现球状三聚体蛋白的洗脱概况特征，而RSV F变体i：S190F-V296F；j：K87F-V90L；k：V207L-V220L；l：V178N；m：S403C-T420C；n：I506K；o：V185E；p：F137W-F140W-F488W；q：D486H-E487Q-D489H展现较高低聚物质的洗脱概况特征。已知分子量的蛋白质标准被标记在色谱图底部。
图37示出从上文所示的抗原位点
Figure BDA0000844346390000141
不可见的DS区域由虚线表示。
图38A-38B示出关于非人类灵长类动物免疫化的免疫原-佐剂复合物的抗原表征的结果。(A)在第0天和(B)在第4周在用poly I：C配制免疫原和NHP免疫化后不到3小时，相对于1μM D25抗原结合片段评估RSV F融合后、DS和DS-Cav1样品反应性。
图39A-39B示出来自免疫化小鼠和恒河猴的血清的抗原分析。A)对来自用多种稳定化RSV F变体免疫化的小鼠的血清评估其与固定化DS-Cav1的结合，DS-Cav1是直接测量的或在用过量D25或莫维珠单抗抗原结合片段温育后测量以评估位点
Figure BDA0000844346390000142
或位点II反应。B)对来自恒河猴的血清评估其与固定化DS-Cav1或也用D25或莫维珠单抗抗原结合片段阻断的融合后RSV F变体的结合。显示动物血清的平均反应，其中具有标准偏差的误差条。
图40示出结晶数据收集和修正统计(refinement statistics)。
图41示出使用具有DS取代的RSV亚型B构建体的作用以及包括TLR4激动剂的所述佐剂可以与稳定化F蛋白一起作用。用与50ul Ribi(Ribi佐剂系统，Sigma)配制的10μg的DSS155C/S290C形式的稳定化融合前F使CB6F1/J小鼠免疫化。在第0周和第3周用A亚型构建体(SEQ ID NO：185)、B亚型构建体(SEQ ID NO：1479)或两者(各10μg)接种小鼠。在第5周时间点(第二次注射后第2周)，获得血清用于中和测定法。来自这个实验的两种主要研究结果是，1)前FA-DS和前FB-DS诱导相等水平的针对RSV亚型A的中和活性，而前FB-DS相比于前FB-DS诱导较高水平的针对RSV亚型B的中和活性。这表明使用RSV亚型B构建体相比于A亚型构建体可具有更好的交叉中和潜力或者包括来自两种亚型的元件的杂合形式的RSV F可为优选的。2)Ribi佐剂是含有单磷酰脂质A的水包油乳液，它是TLR4激动剂并代表一些商业佐剂。这些数据显示，除了polyI：C(TLR3激动剂)之外，包括TLR4激动剂的佐剂与作为疫苗抗原的稳定化融合前F蛋白一起发挥作用。
图42示出稳定化融合前F可以在明矾以及polyI：C中配制并保持由针对抗原位点
Figure BDA0000844346390000151
的抗体反应所赋予的免疫原性。用源自A亚型并与明矾(氢氧化铝凝胶10mg/ml，Brenntag，Frederikssund，Denmark)或polyI：C一起配制的20μg DS S155C/S290C形式的稳定化融合前F使BALB/c小鼠免疫化。小鼠在第0周和第3周接种，并且在第5周时间点(第二次注射后第2周)，获得血清用于中和测定法。
图43是示出融合前稳定化的单链RSV F(scF)抗原的示例性设计方案的示意图，包括涉及若干不同RSV scF设计的变量。关于RSV scF no.9(BZGJ9DS-Cav1；SEQ ID NO：669)的设计要素以深灰色轮廓绘出。
图44A和44B示出单链RSV F构建体no.9(scF no.9；BZGJ9DSCav1；SEQ ID NO：669)的设计。编号指示下文所述各种组分的残基位置。(A)如图44B中所示的弗林裂解的RSV F(+)糖蛋白(顶部)和RSV scF no.9设计(底部)的示意图，示出折叠子三聚化结构域(灰色椭圆形)，和桥接F2(左)和F1(右)的多肽主链的人工连接 子(灰色正方形)。(B)使用融合前稳定化的RSV F(+)结构作为模型的RSV scF no.9设计的结构基础(PBD ID：4MMV，以全文引用的方式并入本文中)。RSV F(+)以草图示出并且折叠子三聚化结构域以球形图示出。左侧示出融合前稳定化的RSV F(+)三聚体，其中三种原体以黑色、灰色和白色着色。右侧示出单一RSV F(+)原体，其示出F1(中灰色)、F2(深灰色)、融合肽(所示)和折叠子三聚化结构域(浅灰色，所示)。插图示出以棒图示的融合肽，和接合残基104和147的柔性连接子序列的位置(虚线)。
图45示出关于在HEK293-F细胞中表达的工程改造的单链RSV F构建体的设计、低聚状态和生产产率的表格。指示RSV F构建体no.9DSCav1(scF no.9；BZGJ9DSCav1；SEQ IDNO：669)、RSV F构建体no.10DSCav1(scF no.10；BZGJ10DSCav1；SEQ ID NO：670)、RSV F构建体no.11DSCav1(scF no.11；BZGJ11DSCav1；SEQ ID NO：671)。所提供的连接子序列包括GSGNIGLGG(SEQ ID NO：364)、GSGGNGIGLGG(SEQ ID NO：359)、GSGNVLGG(SEQ ID NO：361)和GSGNVGLGG(SEQ ID NO：362)。(％)融合前稳定化突变包括以下：S155C和S290C(DS)；S190F和V207L(Cav1)；无额外突变(a)。所有变体都含有点突变L373R。(＝＝)三聚化结构域包括以下：L512C和L513C(CC)；D486C、E487P和F489C(CPC)。(#)根据尺寸色谱法通常观察到变体以低聚物状态的混合物形式存在。如果观察到可测量的三聚体级分，则低聚状态被列为“三聚体”。如果未观察到三聚体级分，则提供主要物质的低聚状态。如果在尺寸色谱法之前的总产率＜0.1mg/L，则低聚状态列出为未测定(N.D.)。如果低聚状态不可通过尺寸排阻色谱法区分，则低聚状态被列为“聚集体”。(*)所示产率为Strep Tag后纯化的计算值并且关于指定低聚状态列出。(Φ)HEK 293F产率是基于scF构建体中可见的Expi293F表达产率与自由式293F表达产率之间的比率观测值(约2∶1)来估算的。
图46A和图46B是示出通过尺寸排阻色谱法对工程改造的单链RSV F糖蛋白进行表征的一组曲线图。(A)RSV scF变体(scF no.3、 4、6、8至11)和含有DS-Cav1稳定化突变的RSV F(+)的尺寸排阻概况。单链构建体表达于HEK293F细胞中并且F(+)DS-Cav1表达于Expi293-F细胞中。F(+)DS-Cav1和scF no.3DS-Cav1、no.4DS-Cav1、no.6DS-Cav1和no.9DS-Cav1展现球状三聚体蛋白质的洗脱概况特性，而scF no.11DSCav1展现球状单体蛋白质的洗脱概况特性。RSV scF no.8DS-Cav1和scF no.10DS-Cav1展现表明单体和三聚体物质的异质混合物的洗脱概况。(B)含有不同稳定化突变的RSV F(+)DS-Cav1和RSV scF no.9的尺寸排阻概况。F(+)DS-Cav1和scF no.9Cav1表达于Expi 293-F细胞中并且其余scF no.9变体表达于HEK293F细胞中。scF no 9变体的洗脱概况中的轻微偏差表明，scF no.9相比于三聚体F(+)在更高分子量下操作。星号指示纯化标签在凝胶过滤之前裂解。
图47是总结了RSV scF no.9DS-Cav1的抗原表征结果的表格。
图48是示出RSV scF no.9DS-Cav1的三维结构的结晶数据和修正统计的表格。
图49A和49B示出关于RSV scF no.9DS-Cav1三聚体的晶体结构的一系列图解。以草图(深灰色)显示的原体定向保持不变。粗虚线表示位于膜近端区域的C端折叠子基序，其在晶体结构中不可见。(A)RSV scF no.9DS-Cav1三聚体显示具有以草图和飘带图(深灰色)以及分子表面图(浅灰色)示出的原体。插图显示“GS”scF no.9连接子环(所示)和相邻原体(深灰色)的放大，都以棒图示出。(B)RSV scF no.9DS-Cav1结构中的融合前稳定化突变。DS和Cav1融合前稳定化突变以棒图指示和示出。
图50是示出RSV scF no.9DS-Cav1(中灰色)与F(+)DS-Cav1结构(浅灰色；rmsd＝
Figure BDA0000844346390000171
)和与D25结合的F(+)结构(深灰色；rmsd＝
Figure BDA0000844346390000172
)的结构比对的图解，都以草图显示。插图示出scF no.9连接子环和F(+)DS-Cav1结构与D25结合的F(+)结构的融合肽的特写。
图51示出说明了使用RSV scF no.9DS-Cav1的晶体结构的RSV scF设计no.3、4、6、8-11的比较的图解。粗虚线代表C端折叠子基序。RSV scF no.9DS-Cav1原体以草图显示(深灰色)。插图示出接合残基105(F2)和145(F1)的以棒图示的“GS”scF no.9连接子环的放大。将接合残基97(F2)和150(F1)的scF设计no.3、4、6和8(细虚线)的柔性连接子序列的预测位置定位在scF no.9DS-Cav1晶体结构上。将scF设计no.3、4、6和8(细虚线)的连接子序列的预测位置定位在scF no.9DS-Cav1三聚体结构上。连接子端点残基位置是近似的。
图52示出关于工程改造的单链RSV F糖蛋白的表征的一组数字图像，其由StrepTag纯化后SDS-PAGE凝胶电泳表征。RSV scF构建体表达于HEK293F细胞中并通过His6标签和StrepTag亲和色谱法纯化。
图53是提供所示构建体(每组10只动物)的第5周中和数据的一组曲线图和表格。在第0周和第3周对每只动物用10μg蛋白质+50μg Poly I：C进行免疫化。
图54是突出了RSV scF no.9(SEQ ID NO：669)的三维结构中的RSV F位置101处的脯氨酸残基的飘带和棒图。结构指示，单链连接子区域可通过除去脯氨酸101或缩短/突变连接子残基和相邻残基来改进。
图55是示出scF no.9构建体(SEQ ID NO：669)的修饰以产生BZG J9-1至BZG J9-10构建体的曲线图和序列比对。所述序列比对示出分别对应于SEQ ID NO：698-707的RSV F残基97-159的BZG J9-1至BZG J9-10序列。这些构建体表达于Expi细胞中并通过凝胶过滤评估(左)。
图56是示出包括scF no.9蛋白的铁蛋白纳米粒子的一系列曲线图和示意图，其通过将scF no.9中的F1多肽的C端连接至铁蛋白亚基而产生。这种构建体被称为“BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-铁蛋白”并以SEQ ID NO：1429提供。
图57是示出BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-铁蛋白相比于RSV F DS-Cav1的物理稳定性的一组曲线图。
图58A-58C是示出不同的融合前稳定化RSV F蛋白的免疫原性的一组曲线图和表格。所测试的三种构建体是RSV F DSCav1(SEQ ID NO：371)、BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-铁蛋白(SEQ ID NO：1429)和scF no.9(也称为BZGJ9DS-Cav1，SEQ ID NO：669)。将体重为8.26-11.34kg的印度源普通猕猴(Macaca mulatta)动物在第0周对每只动物用50μg蛋白质+500μg Ribi肌肉内注射免疫原，在第4周对每只动物用50μg蛋白质+500μg Ribi加强；在第3.5周评估免疫原性。
图59A和图59B是示出来自具有DSCav1突变(SEQ ID NO：372)的B18537菌株的RSVF蛋白的三维结构的一组图解。(A)RSV F的原体的草图。(B)具有以表面和飘带图示出的其他原体的融合糖蛋白的三聚体形式。
图60A-60D是示出具有DSCav1取代的RSV B18537 F糖蛋白的原子水平细节并显示DSCav1取代可以引入RSV F糖蛋白B亚型中以稳定化抗原位点
Figure BDA0000844346390000191
的一组图像。(A)突出了DS-Cav1突变。(B)位于三聚体顶端的抗原位点
Figure BDA0000844346390000192
以深灰色以棒图示出。(C)融合肽与β链15、16和19之间相互作用以形成原体间延长折叠。(D)F2C端与融合肽之间的相互作用。
图61A和图61B是示出具有DSCav1取代的RSV B18537融合糖蛋白的抗原表征的一组曲线图和数字图像。(A)通过每个Fab分子的连续稀释进行原型位点特异性抗体的生物层干涉测量并且测量与固定化B18537 F DSCav1蛋白的缔合和解离速率。(B)来自菌株B18537和A2的抗原位点
Figure BDA0000844346390000201
的结构比较。标记出两个菌株之间不同的表面暴露残基。
图62A和图62B是示出具有DSCav1的RSV菌株B18537 F蛋白的纯化的曲线图。A.在StrepTagII亲和纯化后的洗脱级分(还原的和非还原的)和流过级分的SDS-PAGE。B.RSVB18537 F糖蛋白在GFB缓冲液中在120ml Superdex-200尺寸排阻柱上的凝胶过滤。
图63-68示出稳定在融合前构象中而无C端三聚化结构域以维持RSV F的膜近端叶的稳定性的三聚体重组RSV F蛋白的设计和产生。代替C端三聚化结构域，通过用半胱氨酸残基取代α10螺旋的氨基酸将二硫键环引入F1多肽的C端中。
图69A-69E是示出所示重组RSV F变体的ELISA数据的一组表格。RSV F变体(SEQID NO：859-1018)的表达和抗原稳定性。将编码这些RSV F变体的DNA以96孔格式在一定条件下转染至细胞中，其中重组RSV F蛋白从细胞中分泌到细胞培养基中。每种构建体含有造成蛋白质进入分泌系统并被分泌的前导序列。然后将培养基离心并且将上清液用于结合至位点
Figure BDA0000844346390000202
特异性抗体D25和位点II特异性抗体莫维珠单抗(“Mota”，图69A-69E)的抗原性测试。所测试的条件包括在第0天的D25和莫维珠单抗结合(条件1和2)、在第0天在70℃下温育一小时后的D25和莫维珠单抗结合(条件3和4)，和在4℃下1周后的D25和莫维珠单抗结合(条件5和6)。对照是具有折叠子结构域的DSCav1构建体。每种构建体的特异性抗原性数据提供于图69A-69E中，其中所测试的条件记录在标题行。
图70A-70E是示出产生RSV F抗原位点
Figure BDA0000844346390000203
免疫原的不同设计策略的一组示意图。抗原位点
Figure BDA0000844346390000204
包括在融合前RSV F螺旋α4的外表面上的D25识别位点和仅在每个原体的螺旋α1的N端的环。使用五种方法来呈现免疫原表面上的分离位点
Figure BDA0000844346390000205
表位：A)环状排列(即出于设计容易性和稳定性原因改变二级结构连接子以改变位点
Figure BDA0000844346390000206
节段的 连接性)，B)将位点
Figure BDA0000844346390000211
并入小的骨架蛋白中，C)环状排列或骨架位点
Figure BDA0000844346390000212
的三聚化以匹配在融合前RSV F情形中观察到的天然位点
Figure BDA0000844346390000213
三聚化(如在左图中)，D)包括所有结构域III以增加位点
Figure BDA0000844346390000214
折叠的稳定化，和E)将A-D合并在纳米粒子平台上以增加免疫原性。
图71是在所示条件下通过ELISA设计、产生和测试对于位点
Figure BDA0000844346390000215
特异性抗体D25、AN22和5C4的抗原性的最小位点
Figure BDA0000844346390000216
免疫原的总结。表格示出落在每种设计类别内并且产生至少1.5的ELISA结果的位点
Figure BDA0000844346390000217
免疫原的数目。
图72A-72F是示出结合至D25、AN22或5C4抗体的所示最小位点
Figure BDA0000844346390000218
构建体的ELISA数据的一组表格。所测试的条件包括在4℃下0周和1周后的D25结合(条件1和2)、在60℃下1小时后的D25结合(条件3)、在70℃下1小时后的D25结合(条件4)、在80℃下1小时后的D25结合(条件5)、在90℃下1小时后的D25结合(条件6)或在100℃下1小时后的D25结合(条件7)、在4℃下两周后的AM22结合(条件8)、在0周下的5C4结合(条件9)。也示出在70℃下1小时后的D25、AM22和D25结合的平均值。ELISA评分≥1.5以深灰色突出显示；0.5-1.5的评分以浅灰色突出显示。
图73是示出用DS形式的稳定化融合前F亚型A或B或两者免疫化诱导针对两种亚型的中和活性的一组曲线图。
图74是示出在第0周和第4周在两个剂量免疫化后在小鼠中的DSCav1抗体反应是持久的一组曲线图。
图75是示出DS免疫化可以预防小鼠中的RSV感染的一组曲线图。
图76是示出DS免疫化在小鼠激发后不诱导2型细胞因子反应的一组曲线图。
图77是示出在先前已经在第0周和第4周用DS-Cav1或DS免 疫化的非人类灵长类动物中对于DSCav1的中和免疫反应加强并且在第3剂量后持续的一组曲线图。
图78是示出DS-CAV1可以在明矾中有效配制并保持免疫原性的曲线图。
图79是示出明矾是非人类灵长类动物中的DSCav1的有效佐剂的一组曲线图。
图80是示出当从单独地或作为蛋白质加强的初免的基于基因的载体表达时DS-CAV1具免疫原性的曲线图。
图81是示出在非人类灵长类动物中使用野生型F蛋白的基于基因的递送，DS-Cav1RSV F亚型A或B可以加强初免的一组曲线图和表格。
图82是示出DS-Cav1 RSV F亚型A或B可以加强rAd-F(A)WT初免的非人类灵长类动物的一组曲线图。
图83是示出用DS形式的稳定化融合前F亚型A或B或两者进行免疫化可诱导针对两种RSV亚型的中和活性的一组曲线图。
图84是示出改变糖基化可降低稳定化融合前F的免疫原性的曲线图。
序列表
所附序列表中列出的核酸氨基酸序列是使用如37C.F.R.1.822中所定义的核苷酸碱基标准字母缩写和氨基酸三字母代码示出。仅示出每种核酸序列的一条链，但互补链应理解为通过对所显示链的提及包括。序列表以命名为“Sequence.txt”(约3.2MB)的文件形式以ASCII文本文件形式提交，所述文件创建于2014年3月12日，并且以引用的方式并入本文中。在所附序列表中：
SEQ ID NO：1-128是来自RSV A型的天然RSV F蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：129-177是来自RSV B型的天然RSV F蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：178-184是来自牛RSV的天然RSV F蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：185-350是重组RSV F蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：351是T4次要纤维蛋白折叠子结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：352和355-365是肽连接子的氨基酸序列。
SEQ ID NO：353是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)铁蛋白(
Figure BDA0000844346390000231
登录号EJB64322.1，以引用的方式并入本文中，如在2013年2月28日在数据库中所存在)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：354是封装素(encapsulin)蛋白(
Figure BDA0000844346390000232
登录号YP_001738186.1，以引用的方式并入本文中，如在2013年2月28日在数据库中所存在)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：366和367分别是AM22mAb的VH和VL氨基酸序列。
SEQ ID NO：368和369分别是D25mAb的VH和VL氨基酸序列。
SEQ ID NO：370是原型A2菌株(GENBANK登录号P03420，以引用的方式并入本文中，如在2012年2月28日在数据库中所存在)的重组RSV F0蛋白变体氨基酸序列，其相比于P03420序列包括P102A、I379V和M447V取代。
SEQ ID NO：371是来自人类亚型A的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合。四个突变残基和C端附接物被加以下划线。
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAP RDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK(RSV_A F(+)FdTHS DSCav1)
SEQ ID NO：372是来自人类亚型B的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合。四个突变残基和C端附接物被加以下划线。
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVCKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYINNQLLPILNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAP RDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK(RSV_B F(+)FdTHS DSCav1)
SEQ ID NO：373是来自牛RSV的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C、S 190F和V207L氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合。四个突变残基和C端附接物被加以下划线。
MAATAMRMIISIIFISTYMTHITLCQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTGWYTSVVTIELSKIQKNVCKSTDSKVKLIKQELERYNNAVIELQSLMQNEPASFSRAKRGIPELIMYTRNSTKRFYGLMGKKRKRRFLGFLLGIGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKELLPKLNNHDCRISNIETVIEFQQKNNRLLEIAREFSVNAGITTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMCVVKEEVIAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTDNKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPTDVNLCNTDIFNTKYDCKIMTSKTDISSSVITSIGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKALYIKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASIAQVNAKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAP RDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK(bRSV F(+)FdTHS DSCav1)
SEQ ID NO：374是来自人类亚型A的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C和S190F氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTagII融合。三个突变残基和C端附接物被加以下划线。
SEQ ID NO：375是来自人类亚型B的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C和S190F氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTagII融合(RSV_B F(+)FdTHS DSS 190F)
SEQ ID NO：376是来自牛RSV的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C和S190F氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合。(bRSV F(+)FdTHS DSS 190F)
SEQ ID NO：377是来自RSV A的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C、S190F、V207L氨基酸取代，与C端铁蛋白结构域融合。(RSV_AF(+)FdTHS DSCav1铁蛋白)
SEQ ID NO：378是来自RSV B的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C、S190F、V207L氨基酸取代，与C端铁蛋白结构域融合。(RSV_B F(+)FdTHS DSCav1铁蛋白)
SEQ ID NO：379是来自bRSV的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C、S190F、V207L氨基酸取代，与C端铁蛋白结构域融合。(bRSV F(+)FdTHS DSCav1铁蛋白)
SEQ ID NO：380是来自RSV A的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C、S190F氨基酸取代，与C端铁蛋白结构域融合。(RSV_A F(+)FdTHS DSS190F铁蛋白)
SEQ ID NO：381是来自RSV B的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C、S190F氨基酸取代，与C端铁蛋白结构域融合。(RSV_B F(+)FdTHS DSS190F铁蛋白)
SEQ ID NO：382是来自bRSV的重组RSV F蛋白的氨基酸序列，其包括S155C、S290C、S190F氨基酸取代，与C端铁蛋白结构域融合。(bRSV F(+)FdTHS DSS 190F铁蛋白)
SEQ ID NO：383是编码来自人类亚型A的重组RSV F蛋白的示例性核苷酸序列，其包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合(编码从VRC3798表达的RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的DNA)。
SEQ ID NO：384是用于表达来自人类亚型A的重组RSV F蛋白的表达载体的核苷酸序列，其包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合(RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 paH载体；VRC3798)。
SEQ ID NO：385是编码来自人类亚型B(菌株B1)的重组RSV F蛋白的示例性核苷酸序列，其包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合(编码RSV_B(B1)F(+)FdTHS DSCav1的DNA；从VRC3764表达)。
SEQ ID NO：386是用于表达来自人类亚型B(菌株B1)的重组RSV F蛋白的表达载体的核苷酸序列，其包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合(RSV_B(B1)F(+)FdTHS DSCav1 paH载体；VRC3764)。
SEQ ID NO：387是编码来自人类亚型B(菌株18537)的重组RSV F蛋白的示例性核苷酸序列，其包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合(编码RSV_B F(+)FdTHS DSCav1的DNA；从VRC3799表达)。
SEQ ID NO：388是用于表达来自人类亚型B(菌株18537)的重组RSV F蛋白的表达载体的核苷酸序列，其包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合(RSV_B F(+)FdTHS DSCav1 paH载体；VRC3799)。
SEQ ID NO：389-693是稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：694-697是修饰折叠子结构域多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：698-697是修饰折叠子结构域多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：698-828、1429-1442和1474-1478是单链重组RSV F蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：829-1025和1456-1468是连接至可裂解的折叠子结构域或不连接至折叠子结构域的重组RSV F蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1026是不具有融合前稳定化取代的RSV F蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：901-968是稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1027-1088和1099-1428是在实施例14中描述的最小位点
Figure BDA0000844346390000271
免疫原的氨基酸序列。
结构坐标
由D25 Fab结合的RSV F蛋白的晶体结构的原子坐标叙述于2013年3月13日提交的美国临时申请No.61/780,910的表1中，所述临时申请以全文引用的方式并入本文中。由D25Fab结合的RSV F蛋白的晶体结构的这些原子坐标也以蛋白质数据库登录号4JHW存放，并且以引用的方式并入本文中，如2013年5月1日在所述数据库中所存在。
具体实施方式
RSV F糖蛋白是I型融合蛋白，其促进病毒和细胞膜的融合(Walsh和Hruska，J.Virol.，47，171(1983))。在初始合成后，RSV F采用储存折叠能量的亚稳态融合前构象，所述折叠能量在与宿主细胞膜接触后在结构重排为高度稳定的融合后构象期间释放。已发现RSV F蛋白上的三个抗原位点(I、II和IV)诱导中和活性(Arbiza等，J.Gen.Virol.，73，2225(1992)；Lopez等，J.Virol.，72，6922(1998)；López等，J.Virol.，64，927(1990))，并且都存在于RSV F蛋白的融合后形式上，如通过结构和生物物理研究所测定(McLellan等，J.Virol.，85，7788(2011)；Swanson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，108，9619(2011))。然而，人类血清对融合后RSV F的吸收不能除去大多数的F特异性中和活性，这表明RSV F的融合前形式带有新颖的中和抗原位点(Magro等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，109，3089(2012))。
在本文公开的研究之前，可溶性融合前RSV F蛋白的均质制剂是不可用的，从而妨碍融合前F结构的确定和新颖融合前F特异性抗原位点的鉴定。如本文所述，鉴定了中和RSV、但不特异性结合融合后RSV F的RSV F蛋白特异性抗体，并且获得由这些抗体识别的融合前F的三维结构。本文提供的结果首次揭示RSV F的融合前构象和一类显著有效的RSV融合前F中和抗体的中和机制。使用融合前F的三维结构作为指导，构建融合前F的稳定化形式(“PreF”抗原)并用于产生相比于利用先前的基于RSV F蛋白的免疫原所实现大许多倍的RSV中和免疫反应。
I.术语
除非另外说明，否则技术术语是根据常规用法使用的。分子生物学中的常见术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes VII，由Oxford University Press出版，1999；Kendrew等(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994；和Robert A.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology：aComprehensive Desk Reference，由VCH Publishers，Inc.出版，1995；和其他类似参考 文献中。
除非上下文另外明确说明，否则如本文所用的单数形式“一”和“所述”是指单数以及复数。例如，术语“抗原”包括单数或复数个抗原并且可视为与短语“至少一个抗原”等效。如本文所用，术语“包含”是指“包括”。因此，“包含抗原”是指“包括抗原”而不排除其他要素。还应理解，除非另外说明，否则关于核酸或多肽给出的任何和所有的碱基尺寸或氨基酸尺寸和所有分子量或分子质量值都是近似值，并且出于说明目的提供。虽然可以使用与本文所述的那些类似或等效的许多方法和材料，但本文描述特别合适的方法和材料。在有冲突的情况下，以本说明书(包括术语的解释)为准。另外，材料、方法和实施例仅具说明性，而不旨在具限制性。为了促进各种实施方案的评论，提供以下术语的解释：
5C4：特异性结合于RSV F蛋白的融合前构象而不特异性结合于RSV F蛋白的融合后构象的中和单克隆抗体。所述5C4抗体包括具有分别以SEQ ID NO：1470和1471示出的氨基酸序列的重链和轻链可变区。如McLellan等，Science，340(6136)：1113-7，2013中所述，5C4特异性结合于RSV F蛋白在其融合前构象而非融合后构象中存在的四级表位。在若干实施方案中，抗体5C4特异性结合于本文公开的PreF抗原。
5C4重链可变域：EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTFFHWVKQRPEQGLEWIGRIDPADGHTKYDPKFQGKATITADTSSNTAFLQLSSLTSVDTAVYYCATTITAVVPTPYNAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO：1470)
5C4κ轻链可变域：DIVLTQSPASLAVSLGQRTTISCRASESVDSFDNSFIHWYQQKPGQPPKLLIFLASSLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：1471)
佐剂：用于增强抗原性的媒介物。佐剂包括吸附有抗原的矿物(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；或油包水乳液，例如，其中抗原溶液在矿物油(弗氏不完全佐剂)中乳化，有时包括有杀灭的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性(抑制抗原的降解和/或造成巨噬细胞流入)。免疫刺激性寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可以用作佐剂。佐剂包括生物分子(“生物佐剂”)，例如共刺激分子。示例性佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L、4-1BBL和toll样受体(TLR)激动剂，例如TLR-9激动剂。本领域普通技术人员熟知佐剂(参见例如Singh(编)Vaccine Adjuvantsand Delivery Systems.Wiley-Interscience，2007)。佐剂可以与所公开的PreF抗原组合使用。
施用：通过所选途径将组合物引入受试者中。施用可以是局部或全身的。例如，如果所选途径是静脉内的，则通过将组合物引入受试者的静脉内来施用所述组合物(例如包括所公开免疫原的组合物)。
药剂：可用于实现目标或结果的任何物质或任何物质组合；例如，可用于抑制受试者中的RSV感染的物质或物质组合。药剂包括蛋白质、核酸分子、化合物、小分子、有机化合物、无机化合物或其他所关注分子，例如病毒，例如重组病毒。药剂可包括治疗剂(例如抗RSV剂)、诊断剂或医药剂。在一些实施方案中，药剂是多肽剂(例如免疫原性RSV多肽)、或抗病毒剂。本领域技术人员应理解，特定药剂可用于实现一种以上结果。
AM22：特异性结合于RSV F蛋白的融合前构象而非RSV F蛋白的融合后构象的中和单克隆抗体。AM22蛋白和核酸序列是已知的，例如，AM22抗体的重链和轻链氨基酸序列阐述于美国专利申请公开No.2012/0070446(其以全文引用的方式并入本文中)。如实施例1中所述，AM22特异性结合于表位(包括在抗原位点
Figure BDA0000844346390000301
上)，包括RSV F蛋白在其融合前构象而非融合后构象中存在的位置。这种表位包括在RSV F位置62-69和196-209内，并且位于呈融合前构象的RSV F 蛋白的膜远端顶端(参见例如图2B和图9A)。在本公开之前，未知AM22对融合前构象具特异性。在若干实施方案中，抗体AM22特异性结合于本文公开的PreF抗原。
氨基酸取代：抗原中的一个氨基酸被另一个氨基酸置换或氨基酸的缺失。在一些实例中，抗原中的氨基酸被来自同源蛋白的氨基酸取代。
动物：活的多细胞脊椎动物或无脊椎生物体，类别包括例如哺乳动物。术语哺乳动物包括人类哺乳动物和非人类哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人类和兽医受试者，例如非人类灵长类动物。因此，施用至受试者可包括施用至人类受试者。兽医受试者的非限制性实例包括家养动物(例如猫和狗)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊和山羊)，和实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠和非人类灵长类动物)
抗体：在自然界中基本上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其特异性结合并识别分析物(例如抗原或免疫原)，例如RSV F蛋白或其抗原片段。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、6、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。如本文所用的术语“抗体”包括例如通过完整抗体的修饰和通过使用重组DNA方法的从头合成产生的抗体片段。
抗体例如以完整免疫球蛋白形式和以多种充分表征的抗体片段形式存在。例如，结合于RSV F蛋白的Fab、Fv和单链Fv(SCFv)将是RSV F蛋白特异性结合剂。这包括完整免疫球蛋白和本领域中众所周知的变体和其部分，例如Fab′片段、F(ab)′2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定化Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是其中免疫球蛋白的轻链可变区与免疫球蛋白的重链可变区由连接子结合的融合蛋白，而在dsFv中，所述链已经突变以引入二硫键来稳定化链的缔合。所述术语还包括遗传工程改造形式如嵌合抗体(例如人源化鼠 类抗体)、异源结合抗体(例如双特异性抗体)。也参见Pierce Catalog and Handbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)；Kuby，J.，Immunology，第3版，W.H.Freeman&Co.，New York，1997。
抗体片段定义如下：(1)Fab，含有通过用酶木瓜蛋白酶消化完整抗体以得到完整轻链和一个重链的一部分而产生的抗体分子的单价抗原结合片段的片段；(2)Fab′，通过用胃蛋白酶处理完整抗体，接着还原以得到完整轻链和重链的一部分而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab′片段；(3)(Fab′)2，通过用酶胃蛋白酶处理完整抗体而无后续还原而获得的抗体的片段；(4)F(ab′)2，通过两个二硫键将两个Fab′片段保持在一起的二聚体；(5)Fv，以两条链表示的含有轻链的可变区和重链的可变区的遗传工程改造的片段；和(6)单链抗体(“SCA”)，呈遗传融合的单链分子形式的含有通过合适的多肽连接子连接的轻链的可变区和重链的可变区的遗传工程改造的分子。
通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。存在两种类型的轻链，λ和κ。存在五个主要重链种类(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。所公开的抗体可以种类切换。
每个重链和轻链含有恒定区和可变区，(所述区域也称为“结构域”)。在若干实施方案中，重链和轻链可变域组合以特异性结合抗原。在其他实施方案中，仅需要重链可变域。例如，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在不存在轻链的情况下具功能性和稳定性(参见例如Hamers-Casterman等，Nature，363：446-448，1993；Sheriff等，Nat.Struct.Biol.，3：733-736，1996)。轻链和重链可变域含有由三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)中断的“框架”区(参见例如Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services，1991)。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种内是相对保守的。抗体的框架区，即组成部分轻链和重链的组合框架区，用于定位和比对三维空间中的CDR。
CDR主要负责结合至抗原的表位。给定CDR的氨基酸序列边界可以容易地使用多种众所周知方案中的任一种来确定，包括由Kabat等(“Sequences of Proteins ofImmunological Interest，”第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991；“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani等(JMB 273，927-948，1997；“Chothia”编号方案)和Lefranc等(“IMGT unique numbering for immunoglobulin and Tcell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains，”Dev.Comp.Immunol.，27：55-77，2003；“IMGT”编号方案)所述的那些。
每条链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3(从N端到C端)，并且通常也通过特定CDR所定位的链来鉴定。因此，VHCDR3位于其所存在的抗体的重链的可变域中，而VLCDR1是来自其所存在的抗体的轻链的可变域的CDR1。轻链CDR有时被称为CDR L1、CDR L2和CDR L3。重链CDR有时被称为CDR H1、CDR H2和CDR H3。
抗原：可以刺激动物中的抗体或T细胞反应的产生的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收到动物中的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫性的产品反应，包括由异源抗原诱导的那些，例如所公开的重组RSV F蛋白。
抗原的实例包括(但不限于)多肽、肽、脂质、多糖、其组合(例如糖肽)和含有抗原决定子的核酸，例如由免疫细胞所识别的那些。在一些实例中，抗原包括源自所关注病原体的肽，例如RSV。在具体实例中，抗原是源自RSV，例如包括稳定在融合前构象的修饰RSV F蛋白的抗原。“表位”或“抗原决定子”是指与B和/或T细胞反应的抗原区域。
抗RSV剂：特异性抑制RSV复制或感染细胞的药剂。抗RSV剂的非限制性实例包括单克隆抗体帕利珠单抗(
Figure BDA0000844346390000331
Medimmune，Inc.)和小分子抗病毒药物利巴韦林(ribavirin)(由许多来源制造，例如，Warrick Pharmaceuticals，Inc.)。
原子坐标或结构坐标：从与在X射线单色光束被原子(散射中心)如抗原或与抗体复合的抗原衍射时获得的模式有关的数学方程式获得的数学坐标。在一些实例中，所述抗原可以是呈晶体形式的RSV F蛋白(例如通过结合至融合前特异性抗体或通过引入稳定化修饰而稳定在融合前构象)。使用衍射数据来计算晶体的重复单元的电子密度图谱。使用所述电子密度图谱来确定单独的原子在晶体的晶胞内的位置。在一个实例中，术语“结构坐标”是指从与X射线单色光束例如被晶体形式的RSV F蛋白的原子衍射时获得的模式有关的数学方程式获得的笛卡尔坐标。
本领域普通技术人员理解，由X射线晶体学确定的一组结构坐标不是没有标准误差。对于本公开的目的，使用主链原子，当叠加时具有小于约1.0埃、例如约0.75、或约0.5、或约0.25埃的蛋白质主链原子(N、Cα、C和O)的均方根差的任何组的结构坐标应(在不存在相反的明确说明的情况下)被认为是相同的。
填充空腔的氨基酸取代：填充RSV F蛋白的蛋白质核内的空腔、例如RSV F蛋白的原体中存在的空腔或RSV F蛋白的原体之间的空腔的氨基酸取代。空腔基本上是不存在氨基酸或氨基酸侧链的折叠蛋白质内的空隙。在若干实施方案中，引入填充空腔的氨基酸取代以填充RSV F蛋白融合前构象中存在的RSV F蛋白核中的空腔，其在转变为融合后构象后塌陷(例如，具有降低的体积)。
环状排列：其中蛋白质三级结构的不同区域之间的连接被修改，以使得主要序列中的不同区域的相对顺序被改变，但三级结构中的区域的布置被保留的修饰重组蛋白。例如，利用4链反平行折叠，在链A、B、C和D的情况下，其具有以下N端和C端和连接性，
N端-链A-连接子-链B-连接子-链C-连接子-链D -C端，通过改变链之间的连接子连接的4条链A、B、C和D的环状重排体将包括N端和C端改变的排列：
N端-链C-连接子-链D-连接子-链A-连接子-链B-C端N端保守的排列：
N端-链A-连接子-链D-连接子-链C-连接子-链B-C端C端保守的排列：
N端-链C-连接子-链B-连接子-链A-连接子-链D-C端。
接触：以直接物理缔合布置；包括呈固体和液体形式。接触包括一个分子与另一个分子之间的接触，例如一种多肽(例如抗原)的表面上的氨基酸，其接触另一种多肽(例如抗体)。接触还包括施用，例如通过所选途径将所公开的抗原施用至受试者。
对照：参考标准。在一些实施方案中，对照是从健康患者获得的阴性对照样品。在其他实施方案中，对照是从诊断患有RSV感染的患者获得的阳性对照样品。在其他实施方案中，对照是历史对照或标准参考值或值范围(例如先前测试的对照样品，例如具有已知预后或结果的RSV患者群体，或代表基线或正常值的样品群体)。
测试样品与对照之间的差异可以是增加或相反地降低。差异可以是定性差异或定量差异，例如统计学显著差异。在一些实例中，差异是相对于对照增加或降低至少约5％，例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约500％或大于500％。
D25：特异性结合于RSV F蛋白的融合前构象而非RSV F蛋白的融合后构象的中和单克隆抗体。D25蛋白和核酸序列是已知的，例 如，D25抗体的重链和轻链氨基酸序列阐述于以全文引用的方式并入本文中的美国专利申请公开No.2010/0239593中；也参见Kwakkenbos等，Nat.Med.，16：123-128，2009。如实施例1中所述，D25特异性结合于RSV F蛋白在其融合前构象而非融合后构象上存在的四级表位(包括于抗原位点
Figure BDA0000844346390000361
上)。这种表位包括在RSV F位置62-69和196-209内，并且位于RSV F蛋白呈融合前构象的膜远端顶端(参见例如图2B和图9A)。在本公开之前，未知D25对RSV F蛋白的融合前构象具特异性。在若干实施方案中，抗体D25特异性结合于本文公开的PreF抗原。
简并变体和保守变体：编码包括由于遗传密码而简并的序列的多肽的聚核苷酸。例如，编码包括由于遗传密码而简并的序列的所公开抗原或特异性结合所公开抗原的抗体的聚核苷酸。存在20种天然氨基酸，其中大部分由一个以上的密码子指定。因此，包括所有的简并核苷酸序列，只要由所述核苷酸序列编码的抗原或结合抗原的抗体的氨基酸序列不变即可。由于遗传密码的简并性，大量的功能上相同的核酸编码任何给定多肽。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都编码氨基酸精氨酸。因此，在蛋白质编码序列内指定精氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述相应密码子中的任一个而不改变所编码的蛋白质。这样的核酸变异是“沉默变异”，这是保守变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述每种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子)可以通过标准技术被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个“沉默变异”是隐含在每个所述序列中。
本领域普通技术人员应认识到，改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸(例如小于5％，在一些实施方案中小于1％)的单独的取代、缺失或添加是保守变异，其中改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。
提供功能上类似的氨基酸的保守氨基酸取代是本领域中众所周知的。以下六组各自含有彼此是保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
蛋白质内并非所有的残基位置都将容许原本“保守的”取代。例如，如果氨基酸残基是蛋白质功能所必需的，则甚至原本保守的取代可破坏所述活性，例如抗体与目标表位的特异性结合可被目标表位中的保守突变破坏。
表位：抗原决定子。这些是抗原性分子上的特定化学基团或肽序列，以使得它们诱导特异性免疫反应，例如，表位是与B和/或T细胞反应的抗原区域。抗体结合特定抗原表位，例如RSV F蛋白的表位，例如，RSV F蛋白的融合前构象上存在的D25或AM22表位。
表位可由通过蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸或不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常保持暴露于变性溶剂，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常失去。表位在独特的空间构象中通常包括至少3个并且更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。测定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和核磁共振。表位也可包括氨基酸的翻译后修饰，例如N连接的糖基化。
在一个实施方案中，当呈现与MHC分子结合的表位时，T细胞与所述表位反应。表位可由通过蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸 或不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常保持暴露于变性溶剂，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常失去。表位在独特的空间构象中通常包括至少3个并且更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。测定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和核磁共振。
“目标表位”是抗原上特异性结合所关注抗体如单克隆抗体的特定表位。在一些实例中，目标表位包括接触所关注抗体以使得目标表位可通过确定与所关注抗体接触的氨基酸残基来选择的氨基酸残基。
有效量：足以产生所需反应、例如针对RSV F蛋白的免疫反应，或减少或消除病状或疾病如RSV感染的征象或症状的药剂如PreF抗原或编码PreF抗原的核酸或其他药剂的量。例如，这可能是抑制病毒复制或可测量地改变病毒感染的外在症状所需的量。一般来说，这种量将足以可测量地抑制病毒(例如，RSV)复制或感染性。当施用至受试者时，通常将使用将达到目标组织浓度(例如，在呼吸组织中)的剂量，其已证明实现病毒复制的体外抑制。在一些实例中，“有效量”是治疗(包括预防)任何病症或疾病的一种或多种症状和/或潜在病因，例如治疗RSV感染的量。在一个实例中，有效量是治疗有效量。在一个实例中，有效量是预防特定疾病或病状的一种或多种征象或症状(例如与RSV感染相关的一种或多种征象或症状)发展的量。
表达：核酸翻译成蛋白质。蛋白质可被表达并保持在细胞内，变成细胞表面膜的组分，或分泌到胞外基质或培养基中。
表达控制序列：调节可操作地连接的异源核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制并调节核酸序列的转录和适当时翻译时，表达控制序列可操作地连接至核酸序列。因此表达控制序列可包括适当启动子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前面的起始密码子(ATG)、内含子的剪接信号、维持所述基因的适当阅读框以允许mRNA 的适当翻译，和终止密码子。术语“控制序列”旨在最低限度地包括其存在可以影响表达的组分，并且还可包括其存在是有利的其他组分，例如，前导序列和融合伴侣序列。表达控制序列可包括启动子。
启动子是足以引导转录的最小序列。还包括足以使得启动子独立性基因表达关于细胞类型特异性、组织特异性可控或者可通过外部信号或药剂诱导的那些启动子元件；这些元件可位于基因的5′或3′区域中。包括组成性和可诱导启动子(参见例如Bitter等，Methods in Enzymology 153：516-544，1987)。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用可诱导启动子如噬菌体λ、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等的pL。在一个实施方案中，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可使用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的基因组的启动子(例如反转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。还可使用由重组DNA或合成技术产生的启动子来提供核酸序列的转录。
可将聚核苷酸插入含有启动子序列的表达载体中，所述启动子序列促进宿主的所插入遗传序列的有效转录。所述表达载体通常含有复制起点、启动子，以及允许转化细胞的表型选择的特定核酸序列。
铁蛋白：储存铁并以受控方式释放的蛋白质。所述蛋白质由几乎所有的活生物体产生。铁蛋白组装成球状蛋白质复合物，其在一些情况下由24个蛋白质亚基组成。在一些实例中，使用铁蛋白以在其表面上形成呈递纳米粒子的抗原，例如RSV抗原，如稳定在融合前构象的所公开RSV F蛋白抗原。
折叠子结构域：天然形成三聚体结构的氨基酸序列。在一些实例中，折叠子结构域可包括在稳定在融合前构象的所公开RSV F蛋白抗原的氨基酸序列中以使得所述抗原将形成三聚体。在一个实例中，折叠子结构域是以SEQ ID NO：351(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF)所示的T4折叠子结构域。若干实施方案包括可以从纯化蛋白质裂解的折叠子结构域，例如通过并入与折叠子结构域相邻的凝血酶裂解位点，其可以用于裂解目的。
糖蛋白(gp)：含有共价连接至多肽侧链的寡糖链(聚糖)的蛋白质。在共翻译或翻译后修饰中将碳水化合物连接至所述蛋白质。这个过程被称为糖基化。在具有胞外延伸的区段的蛋白质中，所述胞外区段通常被糖基化。糖蛋白通常是重要的整合膜蛋白，其中它们在细胞-细胞相互作用中发挥作用。在一些实例中，糖蛋白是RSV糖蛋白，例如稳定在融合前构象的RSV F蛋白抗原或其免疫原性片段。
糖基化位点：在多肽如蛋白质的表面上容纳聚糖连接的氨基酸序列。N连接的糖基化位点是NX(S/T)的三重序列，其中N是天冬酰胺，X是除脯氨酸之外的任何残基，并且(S/T)是丝氨酸或苏氨酸残基。聚糖是多糖或寡糖。聚糖也可用于指糖结合物如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖的碳水化合物部分。
同源蛋白：具有类似结构和功能的蛋白质，例如，来自在两种或更多种物种或病毒菌株中具有类似结构和功能的所述两种或更多种物种或病毒菌株的蛋白质。例如，来自RSVA的RSV F蛋白是与来自牛RSV的RSV F蛋白同源的蛋白。同源蛋白共有类似的蛋白质折叠特征并且可以被视为结构同源物。
同源蛋白通常共有高程度的序列保守，例如至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列保守，和高程度的序列同一性，例如至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
宿主细胞：其中载体可繁殖和表达其DNA的细胞。所述细胞可以是原核或真核的。所述术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应理解，所有后代可能与亲本细胞不相同，因为在复制期间可存在突变。 然而，当使用术语“宿主细胞”时包括这些后代。
免疫原：能够在哺乳动物、例如感染病原体或处于感染病原体的风险下的哺乳动物中诱导免疫反应的蛋白质或其部分。免疫原的施用可导致针对所关注病原体的保护免疫性和/或主动免疫性。在一些实例中，免疫原包括所公开的PreF抗原。
免疫反应：免疫系统的细胞如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激物的反应。在一个实施方案中，所述反应对特定抗原具特异性(“抗原特异性反应”)。在一个实施方案中，免疫反应是T细胞反应，例如CD4+反应或CD8+反应。在另一个实施方案中，所述反应是B细胞反应，并导致特异性抗体的产生。
“Th1”偏向性免疫反应的特征在于存在产生IL-2和IFN-γ的CD4+T辅助细胞，和因此IL-2和IFN-γ的分泌或存在。相比之下，“Th2”偏向性免疫反应的特征在于产生IL-4、IL-5和IL-13的CD4+辅助细胞占优势。
免疫原性组合物：包括诱导免疫反应、例如针对表达抗原的病毒的可测量CTL反应或针对抗原的可测量B细胞反应(例如抗体产生)的抗原的组合物。因而，免疫原性组合物包括一种或多种抗原(例如，多肽抗原)或抗原表位。免疫原性组合物还可包括能够诱导或增强免疫反应的一种或多种额外组分，例如赋形剂、载体和/或佐剂。在某些情况下，施用免疫原性组合物以诱导免疫反应，其保护受试者免于由病原体诱导的症状或病状。在一些情况下，通过在受试者暴露于病原体(例如，RSV)之后抑制所述病原体的复制来预防(或降低或改善)由所述病原体造成的症状或疾病。在一个实例中，“免疫原性组合物”包括稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其诱导针对表达RSV F蛋白的病毒的可测量CTL反应，或诱导针对RSV F蛋白的可测量B细胞反应(例如抗体产生)。它进一步指编码抗原的分离核酸，例如可以用于表达抗原(和因此用于诱导针对这种多肽的免疫反应) 的核酸。
对于体外使用，免疫原性组合物可包括抗原或编码抗原的核酸。对于体内使用，免疫原性组合物通常将包括在药学上可接受的载体和/或其他药剂中的蛋白质、免疫原性肽或核酸。可通过公认的测定法容易地对任何特定肽，例如稳定在融合前构象的所公开RSV F蛋白或编码稳定在融合前构象的所公开RSV F蛋白的核酸，测试其诱导CTL或B细胞反应的能力。免疫原性组合物可包括本领域技术人员众所周知的佐剂。
免疫学反应条件：包括提及允许针对特定表位产生的抗体结合于所述表位并且其结合程度相比于基本上所有其他表位可检测地更大和/或基本上排除与基本上所有其他表位的结合的条件。免疫学反应条件取决于抗体结合反应形式并且通常是用于免疫测定方案中的那些或体内遭遇的那些条件。所述方法中使用的免疫学反应条件是“生理条件”，其包括提及在活的哺乳动物或哺乳动物细胞内部的典型条件(例如温度、摩尔渗透压浓度、pH)。虽然公认一些器官经受极端条件，但有机体内和细胞内环境通常是约pH 7(例如pH 6.0至pH 8.0，更通常是pH 6.5至7.5)，含有水作为主要溶剂，并且在高于0℃并低于50℃的温度下存在。摩尔渗透压浓度在支持细胞活力和增殖的范围内。
免疫学探针：可用于选择针对特定表位或抗原的来自血清(包括来自人类患者血清)的抗体的分子。在一些实例中，稳定在融合前构象的所公开的RSV F蛋白可以在对呈融合前构象的RSV F蛋白具特异性的抗体的阳性和阴性选择中用作免疫学探针。
免疫原性表面：能够诱导免疫反应的分子(例如RSV F蛋白)的表面。免疫原性表面包括所述表面的限定特征，例如三维形状和表面电荷。在一些实例中，当蛋白质和抗体结合在一起时，免疫原性表面由蛋白质或肽的表面上与抗体(例如中和抗体)接触的氨基酸限定。 目标表位包括免疫原性表面。免疫原性表面与抗原表面同义。
抑制或治疗疾病：例如，在处于疾病(例如RSV感染)的风险下的受试者中，抑制疾病或病状的充分发展。“治疗”是指改善疾病或病理状况在其已开始发展后的征象或症状的治疗干预。关于疾病或病理状况的术语“改善”是指任何可观测的有益治疗作用。有益作用可例如由以下证实：易感受试者中的疾病的临床症状的延迟发作，疾病的一些或所有临床症状的严重程度的降低，疾病的较缓慢进展，受试者的总体健康或健康状况的改善，或本领域中众所周知的对特定疾病具特异性的其他参数。“预防性”治疗是出于降低患上病变的风险而向未展现疾病征象或仅展现早期征象的受试者施用的治疗。
术语“降低”是相对术语，以使得如果在施用药剂后反应或病状定量减弱，或如果它在施用药剂后相比于参考药剂减弱，则药剂降低反应或病状。类似地，术语“预防”未必是指药剂完全消除反应或病状，只要反应或病状的至少一种特征被消除即可。因此，降低或预防感染或反应(例如病理反应，例如，疫苗增强的病毒疾病)的免疫原性组合物可以但未必完全消除这种感染或反应，只要所述感染或反应相比于在不存在药剂的情况下的感染或反应或相比于参考药剂可测量地减弱，例如，至少约50％，例如至少约70％、或约80％、或甚至约90％(即降至10％或更小)即可。
分离的：“分离的”生物组分(例如蛋白质，例如所公开的PreF抗原或编码这种抗原的核酸)已经从其他生物组分(例如其中组分天然存在的其他生物组分，例如其他染色体和染色体外DNA、RNA和蛋白质)中基本上分离或纯化。已经“分离的”蛋白质、肽和核酸包括通过标准纯化方法纯化的蛋白质。所述术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达制备的蛋白质或肽以及化学合成的蛋白质、肽和核酸分子。分离无需绝对纯度，并且可包括至少50％分离、例如至少75％、80％、90％、95％、98％、99％或甚至99.9％分离的蛋白质、肽或核酸分子。本文公开的PreF抗原(例如，稳定在融合前构象的分离的重 组RSV F蛋白)是从呈融合后构象的RSV F蛋白中分离的，例如，从呈融合后构象的RSV F蛋白中至少80％分离，至少90％、95％、98％、99％或甚至99.9％分离。在若干实施方案中，PreF抗原基本上与不包括抗原位点
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和/或不被融合前特异性单克隆抗体(例如D25或AM22)特异性结合的RSV F蛋白分离，例如，PreF抗原可与不包括抗原位点
Figure BDA0000844346390000442
和/或不被融合前特异性单克隆抗体(例如D25或AM22)特异性结合的RSV F蛋白至少80％分离，至少90％、95％、98％、99％或甚至99.9％分离。
Kd：给定相互作用例如多肽-配体相互作用或抗体-抗原相互作用的解离常数。例如，对于抗体(例如D25)和抗原(例如RSV F蛋白)的双分子相互作用，它是双分子相互作用的单独组分的浓度除以复合物的浓度。测定抗体：抗原相互作用的Kd的方法是本领域普通技术人员熟知的。
标记：直接或间接地结合至另一个分子以促进所述分子的检测的可检测化合物或组合物。标记的特定的非限制性实例包括荧光标签、酶连接和放射性同位素。在一些实例中，所公开的PreF抗原用可检测标记来标记。在一些实例中，将标记连接至所公开的抗原或编码这种抗原的核酸。
连接子：可用于将两个或更多个分子连接成一个连续分子，例如将载体分子连接至免疫原性多肽的双功能分子。肽连接子的非限制性实例包括(G4S)1、(G4S)2或(G4S)3肽连接子。
术语“结合”、“接合”、“键合”或“连接”可能是指将两个分子制成一个连续分子；例如，将两个其他多肽连接成一个连续多肽，或将载体分子或其他分子共价连接至免疫原性多肽，例如如本文所公开的重组RSV F蛋白。连接可能是通过化学或重组方式。“化学方式”是指例如免疫原性多肽部分与载体分子之间的反应以使得在两个分子之间形成共价键以形成一个分子。
MPE8：特异性结合于RSV F蛋白的融合前构象而非RSV F蛋白的融合后构象的中和单克隆抗体。如Corti等(Nature，501(7467)439-443，2013，以全文引用的方式并入本文中)中所述，MPE8抗体结合于RSV F蛋白的融合前而非融合后构象上存在的表位。MPE8表位并非抗原位点
Figure BDA0000844346390000451
的一部分。重链和轻链可变区序列分别以SEQ ID NO：1472和1473示出。
天然抗原或天然序列：已经通过选择性突变、例如将抗原的抗原性聚焦至目标表位的选择性突变而修饰的抗原或序列。天然抗原或天然序列也被称为野生型抗原或野生型序列。
核酸：由通过磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关的天然存在的结构变体和其合成的非天然存在的类似物)构成的聚合物、相关的天然存在的结构变体，和其合成的非天然存在的类似物。因此，所述术语包括其中核苷酸和其间的连接包括非天然存在的合成类似物例如并且不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等的核苷酸聚合物。这些聚核苷酸可以例如使用自动化DNA合成器来合成。所述术语“寡核苷酸”通常是指通常不大于约50个核苷酸的短的聚核苷酸。应理解，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，这也包括其中“U”代替“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。
“核苷酸”包括(但不限于)包括与糖连接的碱基的单体(例如嘧啶、嘌呤或其合成类似物)或包括与氨基酸连接的碱基的单体(如在肽核酸(PNA)中)。核苷酸是聚核苷酸中的一个单体。核苷酸序列是指聚核苷酸中的碱基序列。
常规符号在本文用于描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左手端是5′端；双链核苷酸序列的左手方向被称为5′方向。核苷酸至新生RNA转录物的5′至3′添加方向被称为转录方向。具有与mRNA相同 序列的DNA链被称为“编码链”；具有与从DNA转录的mRNA相同的序列并且位于RNA转录物的5′至5′端的DNA链上的序列被称为“上游序列”；具有与RNA相同的序列并且是编码RNA转录物的3′至3′端的DNA链上的序列被称为“下游序列”。
“cDNA”是指与呈单链或双链形式的mRNA互补或相同的DNA。
“编码”是指聚核苷酸中的核苷酸如基因、cDNA或mRNA的特定序列的固有特性，所述核苷酸充当在生物过程中用于合成其他聚合物和大分子的模板，其具有限定序列的核苷酸(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定序列的氨基酸和由此产生的生物特性。因此，如果由基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常以序列表形式提供的编码链和用作基因或cDNA的转录模板的非编码链可以被称为编码所述蛋白质或所述基因或cDNA的其他产物。除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。在一些实例中，核酸编码所公开的PreF抗原。
可操作地连接：当第一核酸序列处于与第二核酸序列的功能关系中时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子可操作地连接至所述编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且必要时接合同一阅读框中的两个蛋白质编码区域。
融合前特异性抗体：特异性结合于呈融合前构象的RSV F蛋白，但不会特异性结合于呈融合后构象的RSV F蛋白的抗体。示例性融合前特异性抗体包括D25、AM22、5C4和MPE8抗体。
多肽：氨基酸的任何链，与长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷 酸化)无关。“多肽”适用于氨基酸聚合物，包括天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸，例如相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物。“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物并入多肽中的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基末端(N端)和羧基末端(C端)。“多肽”可与肽或蛋白质互换使用，并且在本文中可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物。
氨基酸残基的单个连续多肽链可包括多个多肽。例如，RSV F0多肽包括N端信号肽、F2多肽、pep27多肽，和包括F1胞外结构域、跨膜结构域和胞质尾的F1多肽。此外，在一些实施方案中，重组RSV F蛋白是包括通过肽连接子连接至RSV F1多肽的RSV F2多肽的单链RSV F蛋白。
在许多情况下，多肽折叠成特定三维结构，并且可以包括表面暴露的氨基酸残基和非表面暴露的氨基酸残基。在一些情况下，蛋白质可以包括一起折叠到功能单元中的多个多肽。例如，RSV F蛋白由三聚化形成多聚蛋白质的F1/F2异二聚体构成。“表面暴露的氨基酸残基”是在蛋白质表面上具有一定程度的暴露的那些氨基酸，例如以使得当蛋白质在溶液中时它们可以接触溶剂。相比之下，非表面暴露的氨基酸是不暴露于蛋白质表面上的那些氨基酸残基，以使得当蛋白质在溶液中时它们不接触溶液。在一些实例中，非表面暴露的氨基酸残基是蛋白质核心的一部分。
“蛋白质核心”是折叠蛋白质的内部，其基本上无溶剂暴露，例如呈溶液中的水分子形式的溶剂。通常，蛋白质核心主要由疏水性或无极性氨基酸构成。在一些实例中，蛋白质核心可含有带电荷的氨基酸，例如天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和/或赖氨酸。蛋白质核心中包括未补偿的带电荷氨基酸(补偿的带电荷氨基可以呈盐桥形式)可导致失稳的蛋白质。也就是说，具有较低Tm的蛋白质，因而蛋白质核心中不具有未补偿的带电荷氨基酸的类似蛋白质。在其他实例中，蛋 白质核心可具有在所述蛋白质核心内的空腔。空腔基本上是其中不存在氨基酸或氨基酸侧链的折叠蛋白质内的空隙。这些空腔也可以使蛋白质相对于不具有空腔的类似蛋白质失稳。因此，当产生蛋白质的稳定化形式时，取代核心内的氨基酸残基以填充野生型蛋白中存在的空腔可为有利的。
肽、多肽或蛋白质中的氨基酸通常经由酰胺键(CONH)化学结合在一起。另外，氨基酸可通过其他化学键结合在一起。例如，氨基酸或氨基酸类似物的连接可包括CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH--(顺式和反式)、-COCH2--、-CH(OH)CH2-和-CHH2SO-(这些和其他可见于Spatola，in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，andProteins，B.Weinstein编，Marcel Dekker，New York，第267页(1983)；Spatola，A.F.，VegaData(1983年3月)，第1卷，第3期，Peptide Backbone Modifications(一般评论)；Morley，Trends Pharm Sci第463-468页，1980；Hudson等，Int J Pept Prot Res 14：177-185，1979；Spatola等，Life Sci 38：1243-1249，1986；Harm J.Chem.Soc Perkin Trans.1307-314，1982；Almquist等，J.Med.Chem.23：1392-1398，1980；Jennings-White等，TetrahedronLett 23：2533，1982；HolladaV等，Tetrahedron.Lett 24：4401-4404，1983；和Hruby LifeSci 31：189-199，1982)。
肽修饰：肽例如稳定在融合前构象的所公开的RSV F蛋白可以被修饰，例如以包括相比于天然RSV蛋白质序列的氨基酸取代，或通过多种化学技术以产生具有与未修饰肽基本上相同的活性和构象和任选地具有其他所需特性的衍生物。例如，蛋白质的羧酸基团，无论是羧基端或侧链，可以药学上可接受的阳离子的盐形式提供或酯化以形成C1-C16酯，或转化为式NR1R2的酰胺，其中R1和R2各自独立地是H或C1-C16烷基，或组合以形成杂环，例如5元或6元环。肽的氨基，无论是氨基端或侧链，可呈药学上可接受的酸加成盐如HCl、HBr、乙酸盐、苯甲酸盐、甲苯磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐和其他有机盐形式，或者可被修饰成C1-C16烷基或二烷基氨基或进一步转化 为酰胺。
可以使用公认的技术将肽侧链的羟基转化为C1-C16烷氧基或C1-C16酯。肽侧链的苯基和苯酚环可以被一个或多个卤素原子如F、Cl、Br或I或用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸和其酯或这些羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基可以扩展至同源C2-C4亚烷基。硫醇可以用多种公认保护基团如乙酰胺基团中的任一种来保护。
药学上可接受的载体：使用的药学上可接受的载体是常规的。E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第19版，1995，描述了适于所公开免疫原的药物递送的组合物和制剂。
一般来说，载体的性质将取决于所使用的特定施用模式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如，散剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，待施用的药物组合物可含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或单月桂酸脱水山梨醇酯。在特定实施方案中，适于施用至受试者的载体可为无菌的，和/或悬浮或以其他方式包含在含有一个或多个所测量剂量的适于诱导所需抗RSV免疫反应的组合物的单位剂型中。它可能也伴随着用于治疗目的的药物。单位剂型可以例如在含有无菌内含物的密封小瓶中或用于注射至受试者的注射器中，或者冻干以供后续溶解和施用或呈固体或控释剂量。
初免-加强疫苗接种：包括向受试者施用第一免疫原性组合物(初免疫苗)，接着施用第二免疫原性组合物(加强疫苗)以诱导免疫反应的免疫疗法。所述初免疫苗和/或所述加强疫苗包括表达免疫反应所针对的抗原的载体(例如病毒载体、RNA或DNA载体)。所述加强疫苗在所述初免疫苗之后施用至受试者；本领域技术人员应了解施用初免疫苗与加强疫苗之间的合适时间间隔，并且这些时间框架的实例公开于本文中。在一些实施方案中，初免疫苗、加强疫苗、或初免疫苗和加强疫苗另外包括佐剂。在一个非限制性实例中，初免疫苗是基于DNA的疫苗(或基于基因递送的其他疫苗)，并且加强疫苗是基于蛋白质亚基或蛋白质纳米粒子的疫苗。
蛋白质纳米粒子：多亚基的、基于蛋白质的多面体形结构。所述亚基各自由蛋白质或多肽(例如糖基化多肽)和任选地以下中的单个或多个特征组成：核酸、辅基、有机和无机化合物。蛋白质纳米粒子的非限制性实例包括铁蛋白纳米粒子(参见例如Zhang，Y.Int.J.Mol.Sci.，12：5406-5421，2011，以引用的方式并入本文中)、封装素纳米粒子(参见例如Sutter等，Nature Struct.and Mol.Biol.，15：939-947，2008，以引用的方式并入本文中)、硫氧化还原酶(SOR)纳米粒子(参见例如Urich等，Science，311：996-1000，2006，以引用的方式并入本文中)、2，4-二氧四氢喋啶合成酶(lumazine synthase)纳米粒子(参见例如Zhang等，J.Mol.Biol.，306：1099-1114，2001)或丙酮酸脱氢酶纳米粒子(参见例如Izard等，PNAS 96：1240-1245，1999，以引用的方式并入本文中)。铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶和丙酮酸脱氢酶是自组装成球状蛋白质复合物的单体蛋白质，其在一些情况下分别由24、60、24、60和60个蛋白质亚基组成。在一些实例中，铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶单体连接至所公开的抗原(例如，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白)并自组装成在表面上呈现所公开的抗原的蛋白质纳米粒子，其可以施用至受试者以刺激对抗原的免疫反应。
重组：重组核酸是具有非天然存在的序列或具有通过序列的两个原本分隔的区段的人工组合而得到的序列者。这种人工组合可以通过化学合成，或者更通常通过核酸的分离区段的人工操纵，例如通过遗传工程改造技术来实现。重组蛋白是具有非天然存在的序列或具有通过序列的两个原本分隔的区段的人工组合而得到的序列者。在若干实 施方案中，重组蛋白是由已经引入宿主细胞如细菌或真核细胞中的异源(例如重组)核酸编码的。核酸可以引入例如具有能够表达由所引入核酸编码的蛋白质的信号的表达载体上，或者核酸可以整合到宿主细胞染色体中。
改装氨基酸取代：例如通过增强疏水性相互作用或氢键形成来增加蛋白质中的邻近残基的相互作用或例如通过消除类似带电荷残基簇来降低邻近残基的不利或排斥相互作用的氨基酸取代。在若干实施方案中，引入改装氨基酸取代以增加RSV F蛋白融合前构象中的邻近残基(其在RSV F融合后构象中不是紧密接近的)的相互作用。通常，引入改装氨基酸取代将增加RSV F蛋白的融合前构象的Tm，并且降低RSV F蛋白的融合后构象的Tm。
呼吸道合胞病毒(RSV)：副粘病毒科的包膜非节段性负义单链RNA病毒。它是儿童在其人生第一年中患细支气管炎和肺炎的最常见原因并且所有儿童在3岁前几乎都会感染。RSV也造成反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，其可能发生在任何年龄，尤其是在老年人或心脏、肺或免疫系统受损的那些人中。在美国，RSV细支气管炎是造成婴儿住院治疗的主要原因和整个儿童期哮喘和喘鸣的主要原因(Shay等，JAMA，282，1440(1999)；Hall等，N.Engl.J.Med.，360，588(2009))。在全球范围内，RSV每年造成66,000-199,000例五岁以下的儿童死亡(Nair等，Lancet，375，1545(2010))，并且在一月至一岁龄的婴儿死亡中占6.7％，这多于除疟疾外的任何其他单一病原体(Lozano等，Lancet，380，2095(2013))。
RSV基因组长度为约15,000个核苷酸并且包括编码11种蛋白质(包括糖蛋白SH、G和F)的10种基因。F蛋白介导融合，从而允许病毒进入细胞质中以及促进合胞体的形成。基于G糖蛋白的抗原性的差异，已经描述了人类RSV菌株的两种亚型，A亚型和B亚型。其他物种的RSV菌株也是已知的，包括牛RSV。示例性RSV菌株序列是本领域普通技术人员已知的。此外，人类RSV感染的若干模型 也是可用的，包括感染hRSV的生物体模型，以及感染物种特异性RSV(例如在牛中使用bRSV感染)的生物体模型(参见例如Bern等，Am J，Physiol.LungCell Mol.Physiol.，301：L148-L156，2011)。
若干种诊断RSV感染的方法也是已知的，包括使用直接荧光抗体检测(DFA)、色谱快速抗原检测，和使用RT PCR的病毒RNA的检测。可以例如通过空斑测定法、抗原捕捉酶免疫测定法(EIA)或PCR来确定病毒载量的定量。可通过亚型特异性中和测定法或ELISA来进行抗体水平的定量。目前RSV治疗是被动施用单克隆抗体帕利珠单抗
Figure BDA0000844346390000521
其识别RSV F蛋白(Johnson等，J.Infect.Dis.，176，1215(1997)；Beeler和van Wyke Coelingh，J.Virol.，63，2941(1989))并降低严重疾病的发病率(The IMpact-RSV Study Group，Pediatrics，102，531(1998))。(也参见例如Nam和Kun(编).Respiratory SyncytialVirus：Prevention，Diagnosis and Treatment.Nova Biomedical Nova SciencePublisher，2011；和Cane(编)Respiratory Syncytial Virus.Elsevier Science，2007。)
存在RSV的若干亚型，包括人类亚型A、人类亚型B和牛亚型。在RSV亚型内，存在每种亚型的单独的菌株。例如，本文提供的SEQ ID NO：1-128包括A亚型RSV的许多菌株的RSVF蛋白序列，其(如下表3中所示)是高度同源的。
RSV融合(F)蛋白：促进病毒和细胞膜的融合的RSV包膜糖蛋白。在自然界中，RSV F蛋白最初合成为长度为约574个氨基酸的单个多肽前体，称为F0。F0包括引导定位至内质网的N端信号肽，其中所述信号肽(F0的约前25个残基)被蛋白水解裂解。其余F0残基低聚化以形成三聚体，所述三聚体在两个保守的弗林一致裂解序列(约F0位置109和136；例如，RARR109(SEQ ID NO：124，残基106-109)和RKRR136(SEQ ID NO：124，残基133-136))再次被细胞蛋白酶蛋白水解处理以产生两个二硫键连接的片段F1和F2。这些片段越小，F2源自F0前体的N端部分并包括F0的大致残基26-109。这些片段越 大，F1包括F0前体的C端部分(大致残基137-574)，其包括胞外/内腔区域(约残基137-524)、跨膜结构域(约残基525-550)和在C端的胞质域(约残基551-574)。
三个F2-F1原体在成熟F蛋白中低聚化，其采用亚稳态“融合前”构象，所述构象被触发以在与目标细胞膜接触后经历构象变化(变成“融合后”构象)。这种构象变化暴露疏水性序列，称为融合肽，其位于F1多肽的N端，并且其与宿主细胞膜缔合并促进病毒或感染细胞的膜与目标细胞膜融合。
已经鉴定了特异性结合于RSV F蛋白上的抗原位点的多种中和抗体。这些包括单克隆抗体131-2a和2F，其结合于抗原位点I(居于残基P389中心)；单克隆抗体帕利珠单抗和莫维珠单抗，其结合于抗原位点II(居于残基254-277中心)；和单克隆抗体101F和mAb19，其结合于抗原位点IV(居于残基429-437中心)。
单链RSV F蛋白：以包括RSV F1多肽和RSV F2多肽的单一多肽链表达的重组RSV F蛋白。单链RSV F蛋白三聚化以形成RSV F蛋白胞外域。单链RSV F蛋白不包括侧接RSV F蛋白的pep27多肽的弗林裂解位点；因此，当在细胞中产生时，F0多肽不裂解成单独的F1和F2多肽。在一些实施方案中，单链RSV F蛋白包括两个弗林裂解位点的缺失，pep27多肽和融合肽。在一个实施方案中，位置103或105连接至RSV蛋白的位置145以产生单链构造。在若干实施方案中，F1和F2多肽的其余部分是通过连接子如肽连接子接合的。
RSV F0多肽(F0)：RSV F蛋白的前体，包括N端信号肽的氨基酸、F2多肽、pep27多肽，和包括F1胞外域、跨膜结构域和胞质尾的F1多肽。天然F0多肽在信号序列裂解位点和两个弗林裂解位点(大致F0位置109和136；例如，RARR109(SEQ ID NO：124，残基106-109)和RKRR136(SEQ ID NO：124，残基133-136))被蛋白水解处理，产生F1和F2片段。来自许多不同的RSV亚群的F0多肽的实例是已知 的，包括来自A、B和牛亚群，其实例在本文分别以SEQ ID NO：1-128、129-177和178-184示出。
RSV F1多肽(F1)：RSV F蛋白的肽链。如本文所用，“F1多肽”是指天然F1多肽和包括相比于天然序列的修饰(例如，氨基酸取代、插入或缺失)、例如被设计以将重组F蛋白(包括修饰的F1多肽)稳定在SV F蛋白融合前构象的修饰的F1多肽。天然F1包括RSV F0前体的大致残基137-574，并包括(从N端至C端)胞外/内腔区域(约残基137-524)、跨膜结构域(约残基525-550)和胞质域(约残基551-574)。若干实施方案包括相比于天然F1序列修饰的F1多肽，例如缺乏跨膜域和胞质域和/或包括将重组F蛋白(含有F1多肽)稳定在融合前构象的一个或多个氨基酸取代的F1多肽。在一个实例中，所公开的RSV F蛋白包括具有跨膜域和胞质域的缺失和在位置155和290的半胱氨酸取代的F1多肽。在另一个实例中，所公开的RSV F蛋白包括具有跨膜域和胞质域的缺失、在位置155和290的半胱氨酸取代和在位置190的苯丙氨酸取代的F1多肽。在另一个实例中，所公开的RSV F蛋白包括具有跨膜域和胞质域的缺失、在位置155和290的半胱氨酸取代、在位置190的苯丙氨酸取代和在位置207的亮氨酸取代的F1多肽。在若干实施方案中，F1多肽包括C端连接至三聚化结构域。天然F1序列的许多实例是已知的，其在本文中以SEQ ID NO：1-184的大致位置137-524提供。
RSV F2多肽(F2)：RSV F蛋白的多肽链。如本文所用，“F2多肽”是指天然F2多肽和包括相比于天然序列的修饰(例如，氨基酸取代)、例如被设计以将重组F蛋白(包括修饰的F2多肽)稳定在SV F蛋白融合前构象的修饰的F2多肽。天然F2包括RSV F0前体的大致残基26-109。在天然RSV F蛋白中，F2多肽通过两个二硫键连接至F1多肽。天然F2序列的许多实例是已知的，其在本文中以SEQ ID NO：1-184的大致位置26-109提供。
RSV pep27多肽(pep27)：在RSV F蛋白的成熟期间从F0前体切 除的具27个氨基酸的多肽。pep27侧接两个弗林裂解位点，其在F蛋白成熟期间被细胞蛋白酶裂解以产生F1和F2多肽。天然pep27序列的实例是已知的，其在本文中SEQ ID NO：1-184的位置110-136提供。
RSV F蛋白融合前构象：在触发促融合事件前由RSV F蛋白采用的结构构象，所述促融合事件导致RSV F转变为融合后构象并且在加工后在分泌系统中变成成熟RSV F蛋白。呈融合前构象的示例性RSV F蛋白的三维结构公开于本文中(参见实施例1)并且由融合前特异性抗体D25结合的呈融合前构象的示例性RSV F蛋白的结构坐标提供于表1中。如本文所示，RSV F的融合前构象与其他副粘病毒的融合前构象的总体结构类似(例如PIV，参见图7)，但具有一些显著差异。在融合前状态中，RSV F蛋白包括在膜远端顶端的抗原位点(“抗原位点
Figure BDA0000844346390000556
”，参见实施例1)，其包括RSV F残基62-69和196-209，并且还包括D25和AM22抗体的表位。如本文所用，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白可以被对RSV F蛋白的融合前构象具特异性的抗体(例如特异性结合于抗原位点
Figure BDA0000844346390000552
内的表位的抗体，例如D25或AM22抗体)特异性结合。其他融合前特异性抗体包括5C4和MPE8抗体。
RSV F蛋白融合后构象：由并非融合前构象的RSV F蛋白采用的结构构象，并且其中RSV F蛋白的N端和C端在稳定的螺旋-螺旋中是接近的。RSV F蛋白的融合后构象已经在原子水平下描述(参见例如McLellan等，J.Virol.，85，7788，2011；Swanson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，108，9619，2011；和以PDB登录号3RRR存放的结构坐标；所述文献各自以引用的方式并入本文中)。RSV F蛋白的融合后构象与关于其他副粘病毒糖蛋白(包括PIV5 F蛋白)已知者是类似的。在融合后构象中，RSV F蛋白不包括抗原位点
Figure BDA0000844346390000555
并且因此不包括D25表位并且不被D25或AM22特异性结合。例如在F蛋白与细胞膜融合后出现RSV融合后构象。当表达时可以折叠成融合后构象的RSV F蛋白的序列以SEQ ID NO：1469形式提供。
再表面化抗原或再表面化免疫原：源自野生型抗原的多肽免疫原，其中在目标表位外面或外部的氨基酸残基以系统性方式突变以将抗原的免疫原性聚焦到所需的目标表位。在一些实例中，再表面化抗原被称为抗原性隐形免疫原或抗原性隐形抗原。
均方根差(RMSD)：相比于平均值的偏差平方的算术平均值的平方根。在若干实施方案中，RMSD以表示相比于参考三维结构的结构坐标的偏差或变化的方式使用。这个数字通常在两种结构的最佳叠加后计算，作为等效Cα原子之间的均方距离的平方根。在一些实施方案中，参考三维结构包括本文在表1中所示的结合至单克隆抗体D25的RSV F蛋白的结构坐标。
序列同一性/相似性：两个或更多个核酸序列或者两个或更多个氨基酸序列之间的同一性/相似性，以所述序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以同一性百分比测量；百分比越高，序列同一性越高。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相对高程度的序列同一性/相似性。
比较序列的比对方法是本领域中众所周知的。各种程序和比对算法描述于：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988；Higgins和Sharp，Gene，73：237-44，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-3，1989；Corpet等，Nuc.Acids Res.16：10881-90，1988；Huang等，Computer Appls.in the Biosciences 8，155-65，1992；和Pearson等，Meth.Mol.Bio.24：307-31，1994；Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-10，1990中，呈现序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
一旦比对，则通过计算两种序列中存在相同的核苷酸或氨基酸残基的位置数目来确定匹配数目。通过将匹配数目除以所鉴定序列中所述的序列长度，或除以铰接长度(例如来自所鉴定序列中所示的序列 的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，接着将所得值乘以100来确定序列同一性百分比。例如，当与具有1554个氨基酸的测试序列比对时，具有1166个匹配的肽序列与所述测试序列具有75.0％同一性(1166÷1554*100＝75.0)。将序列同一性百分比值四舍五入至最接近的十分位。例如，将75.11、75.12、75.13和75.14四舍五入到75.1，而将75.15、75.16、75.17、75.18和75.19四舍五入到75.2。长度值通常总是整数。
NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403，1990)可获自若干来源，包括美国国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和通过互联网，与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。关于如何使用这种程序来确定序列同一性的描述可通过互联网在NCBI网站上获得。
多肽的同源物和变体的特征通常在于与所关注的氨基酸序列具有在全长比对上计算的至少约75％、例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。当通过这种方法评估时，与参考序列具有甚至更大的相似性的蛋白质将显示增加的同一性百分比，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性。当在不到整个序列上比较序列同一性时，同源物和变体在10-20个氨基酸的短窗口上通常将具有至少80％序列同一性，并且取决于其与参考序列的相似性可具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性。用于测定在这些短窗口上的序列同一性的方法可通过互联网在NCBI网站上获得。本领域技术人员应理解，这些序列同一性范围仅提供用于指导；完全有可能获得可落在所提供范围外的强烈显著的同源物。
对于核酸序列的序列比较，通常一个序列充当参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标，并且必要时指定算法程序参数。使用默认程序参数。比较序列的比对方法是本领域中众所周知的。可以例如 通过以下来进行比较序列的最佳比对：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981的局部同源性算法；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970的同源性比对算法；Pearson和Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444，1988的相似性搜索方法；这些算法的计算机化执行(在Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)；或手工比对和目视检查(参见例如Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第4版，Cold SpringHarbor，New York，2012)和Ausubel等(In Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，至增刊104，2013)。有用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.35：351-360，1987的渐进比对方法的简化。所用方法与Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-153，1989所述的方法类似。使用PILEUP，将参考序列与其他测试序列进行比较以使用以下参数来测定序列同一性百分比关系：默认空位权重(3.00)、默认空位长度权重(0.10)和加权的末端空位。PILEUP可以获自GCG序列分析软件包，例如，7.0版(Devereaux等，Nuc.Acids Res.12：387-395，1984)。
适于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的另一个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990和Altschul等，NucleicAcids Res.25：3389-3402，1977中。用于执行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov)公开可用。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11，比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4和两个链的比较作为默认值。BLASTP程序(对于氨基酸序列)使用字长(W)3，和期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵作为默认值(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)。寡核苷酸是长度为至多约100个核苷酸碱基的线性聚核苷酸序列。
两个核酸之间的序列相似性的另一个象征是杂交能力。两个核酸的序列越相似，它们将杂交的条件越严格。杂交条件的严格度具序列 依赖性并且在不同的环境参数下是不同的。因此，产生特定严格程度的杂交条件将根据所选杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而改变。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na+和/或Mg++浓度)将决定杂交的严格度，但洗涤时间也影响严格度。通常，严格条件选择为相比于特定序列在指定离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃至20℃。Tm是50％的目标序列与完全匹配的探针杂交的温度(在指定离子强度和pH下)。用于核酸杂交和严格度计算的条件可以见于例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Tijssen，Hybridization WithNucleic Acid Probes，Part I：Theory and Nucleic Acid Preparation，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Ltd.，NY，NY，1993；和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第4版，John Wiley&Sons，Inc.，1999。
如本文所用，对于“至少80％同一性”的提及是指与指定参考序列的“至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性”。
信号肽：将新近合成的分泌或膜蛋白引导至并通过膜(例如，内质网膜)的短氨基酸序列(例如，长度为约18-25个氨基酸)。信号肽通常位于多肽的N端并且在所述多肽已经穿过膜后通过信号肽酶除去。信号肽序列通常含有三个常见结构特征：N端极性碱性区域(n区域)、疏水性核心和亲水性c区域。示例性信号肽序列以SEQ ID NO：1-182的残基1-25示出(来自A、B和牛RSV的RSV F蛋白信号肽)。
特异性结合：当提及抗体：抗原蛋白质复合物的形成时，是指在蛋白质的异源群体和其他生物制剂的存在下，决定目标蛋白质、肽或多糖(例如糖蛋白)的存在的结合反应。因此，在指定条件下，抗体优先结合至特定目标蛋白、肽或多糖(例如病原体(例如RSV F)的表面上存在的抗原)并且不以显著量结合于样品或受试者中存在的其他蛋白质或多糖。特异性结合于RSV F蛋白的融合前构象的抗体(例如，和特异性结合于抗原位点
Figure BDA0000844346390000601
的抗体)不会特异性结合于RSV F蛋白的融合后构象。特异性结合可以通过本领域中已知的方法来确定。关于抗体：抗原或Fab：抗原复合物，抗原和抗体的特异性结合具有小于约10-6摩尔浓度、例如小于约10-7摩尔浓度、10-8摩尔浓度、10-9摩尔浓度或甚至小于约10-10摩尔浓度的Kd(或表观Kd)。
可溶性蛋白：能够在室温下溶解在水性液体中并且保持溶解的蛋白质。蛋白质的溶解度可根据蛋白质在水基液体中的浓度、液体的缓冲条件、其他溶质在液体中的浓度例如盐和蛋白质浓度和液体加热而改变。在若干实施方案中，可溶性蛋白是在室温下在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中溶解至浓度为至少0.5mg/ml并且保持溶解至少48小时的蛋白。
治疗剂：当适当施用至受试者时能够诱导所需的治疗或预防作用的化学化合物、小分子或其他组合物如核酸分子。
治疗有效量的有效量：足以预防、治疗(包括预防)、降低和/或改善任何病症或疾病的症状和/或潜在病因，例如预防、抑制和/或治疗RSV感染的药剂(例如所公开的抗原或含有所公开的抗原的免疫原性组合物)的量。在一些实施方案中，治疗有效量足以降低或消除疾病如RSV感染的症状。例如，这可能是抑制病毒复制或可测量地改变病毒感染的外在症状所需的量。一般来说，这种量将足以可测量地抑制病毒(例如，RSV)复制或感染性。当施用至受试者时，通常将使用将达到目标组织浓度的剂量，其已证实实现病毒复制的体外抑制。应理解，为获得针对病原体的保护性免疫反应可能需要多次施用免疫原性组合物。因此，治疗有效量涵盖与先前或后续施用组合促进获得保护性免疫反应的分数剂量。
跨膜结构域：插入脂质双层、例如细胞或病毒或病毒样粒子的脂 质双层中的氨基酸序列。跨膜结构域可用于将抗原锚定至膜。在一些实例中，跨膜结构域是RSV F蛋白跨膜结构域。示例性RSV F跨膜结构域是本领域普通技术人员熟知的，并且提供于本文中。例如，示例性RSV F跨膜结构域的氨基酸序列以SEQ ID NO：1-183的大致位置525-550提供。
转化的：转化细胞是已经通过分子生物学技术引入核酸分子的细胞。如本文所用，术语转化涵盖可将核酸分子引入这种细胞中的所有技术，包括用病毒载体转染，用质粒载体转化，和通过电穿孔、脂转染和粒子枪加速引入DNA。
疫苗：在受试者中引起预防性或治疗性免疫反应的药物组合物。在一些情况下，免疫反应是保护性免疫反应。通常，疫苗向病原体(例如病毒病原体)的抗原或者向与病理状况相关的细胞成分诱导抗原特异性免疫反应。疫苗可包括聚核苷酸(例如编码所公开的抗原的核酸)、肽或多肽(例如所公开的抗原)、病毒、细胞或一种或多种细胞成分。
载体：如引入宿主细胞中从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。重组DNA载体是具有重组DNA的载体。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可包括一种或多种可选择标记基因和本领域中已知的其他遗传元件。病毒载体是具有至少一些源自一种或多种病毒的核酸序列的重组DNA载体。
复制缺陷型病毒载体，由于例如缺乏至少一种复制必需的基因功能而需要补充复制所需的一个或多个病毒基因组区域。例如，以使得病毒载体在典型宿主细胞中，特别是在治疗方法过程中可被病毒载体感染的人类患者中的宿主细胞中不复制。复制缺陷型病毒载体和其使用系统的实例是本领域中已知的并包括例如复制缺陷型LCMV载体(参见例如美国专利公开No.2010/0297172，以全文引用的方式并入本文中)和复制缺陷型腺病毒载体(参见例如PCT申请公开No. WO2000/00628，以引用的方式并入本文中)。
病毒：基本上由被蛋白质外壳包围的核酸核心组成并具有仅在活细胞内部复制的能力的病毒。“病毒复制”是通过至少一个病毒生命周期的存在而产生另外的病毒。病毒可颠覆宿主细胞的正常功能，导致细胞以由病毒决定的方式工作。例如，当未感染细胞通常不这样做时，病毒感染可导致产生细胞因子或对应于细胞因子的细胞。在一些实例中，病毒是病原体。
病毒样粒子(VLP)：源自若干种病毒中的任一种的非复制病毒外壳。VLP通常由一种或多种病毒蛋白组成，例如(但不限于)被称为衣壳、包衣、外壳、表面和/或包膜蛋白的那些蛋白质，或源自这些蛋白质的粒子形成多肽。在蛋白质在适当表达系统中重组表达后，VLP可以自发形成。用于产生特定VLP的方法是本领域中已知的。在病毒蛋白质的重组表达后VLP的存在可以使用本领域中已知的常规技术来检测，例如通过电子显微镜、生物物理表征等。此外，VLP可以通过已知技术例如密度梯度离心来分离并通过特征密度条带来鉴定。参见例如Baker等(1991)Biophys.J.60：1445-1456；和Hagensee等(1994)J.Virol.68：4503-4505；Vincente，J Invertebr Pathol.，2011；Schneider-Ohrum和Ross，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，354：53073，2012。
II.若干实施方案的描述
本文公开了RSV F蛋白经历了其融合前构象与融合后构象之间的急剧结构重排(参见下文实施例1)。如图2B中所示，呈融合前构象的F1多肽的N端区域(部分对应于图2A中所示的膜远端叶)包括所示的α2、α3、β3、β4和α4螺旋和β折叠结构，而融合后结构中的F1多肽的N端的相应区域包括延伸的α5螺旋结构。此外，呈融合前构象的F1多肽的C端区域(部分对应于图2A中所示的膜近端叶)包括所示的β22、α9和β23β折叠和螺旋结构，而融合后构象结构中 的F1多肽的相应C端区域包括延伸的α10螺旋结构。因此，呈融合前构象的RSV F蛋白的膜远端和膜近端叶包括不存在于RSV F蛋白呈融合后构象的相应区域中的若干不同结构元件。对应于这些区域的氨基酸位置(和序列)在图2中以灰色突出显示，包括F1多肽的位置137-216和461-513。
提供稳定或“锁定”在融合前构象的RSV F蛋白抗原，称为“PreF抗原”。使用结构导向设计，靶向RSV F1和F2多肽的位置以进行修饰(例如，氨基酸取代)以阻碍或防止RSV F蛋白从融合前构象转变为融合后构象。这些抗原具有效用，例如，作为免疫原以诱导针对RSVF蛋白的中和反应。
A.天然RSVF蛋白
来自不同RSV群组的天然RSV F蛋白，以及编码这些蛋白质的核酸序列和方法是已知的。例如，若干亚型A、B和牛前体RSV F0蛋白的序列以SEQ ID NO：1-184提供。这些序列中的每个的GenInfo标识符(gi)和相应的登录号以及相应的RSV群组提供于表3中：
表3.示例性亚型A、B和牛RSV F蛋白序列
Figure BDA0000844346390000631
Figure BDA0000844346390000641
Figure BDA0000844346390000651
Figure BDA0000844346390000661
Figure BDA0000844346390000671
所述RSV F蛋白展现在RSV亚型间的显著的序列保守(参见表3，其在不同亚型和F蛋白区段间显示平均成对序列同一性)。例如，在F0前体分子间，RSV亚型A和B共有90％序列同一性，并且RSV亚型A和B各自共有与bRSV F蛋白的81％序列同一性。在RSV亚型内，F0序列同一性甚至更大；例如在RSV A、B和牛亚型中的每一个中，RSV F0前体蛋白具有约98％序列同一性。几乎所有鉴定的RSV F0前体蛋白的长度为约574个氨基酸，其中长度的较小差异通常是由于C端胞质尾的长度。RSV F蛋白间的序列同一性示于表4中：
表4.RSV F蛋白序列同一性
Figure BDA0000844346390000672
Figure BDA0000844346390000681
鉴于RSV F序列的保守，本领域普通技术人员可以容易地比较不同天然RSV F序列之间的氨基酸位置，以鉴定不同RSV菌株和亚型之间的相应RSV F氨基酸位置。例如，在几乎所有鉴定的天然RSV F0前体蛋白间，弗林裂解位点落在相同氨基酸位置中。因此，不同菌株和亚型间的RSV F蛋白序列的保守允许使用参考RSV F序列来比较RSV F蛋白中特定位置处的氨基酸。对于本公开的目的(除非上下文另外说明)，关于以SEQ ID NO：124示出的参考F0蛋白前体多肽给出RSV F蛋白氨基酸位置(对应于
Figure BDA0000844346390000684
登录号P03420，以引用的方式并入本文中，如2013年2月28日在
Figure BDA0000844346390000685
中所存在)。
B.PreF抗原
本文公开了包括稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的分离抗原(“PreF抗原”)。所述PreF抗原含有已经相比于天然形式进行修饰以增加免疫原性的重组RSV F蛋白或其片段。例如，所公开的重组RSV F蛋白已经相比于天然RSV序列进行修饰以稳定在融合前构象。本领域普通技术人员应理解，所公开的PreF抗原可用于在脊椎动物(例如哺乳动物，例如人类和牛)中诱导针对RSV(例如RSV A、RSV B或牛RSV)的免疫原性反应。因此，在若干实施方案中，所公开的抗原是免疫原。
D25抗体识别包括RSV F蛋白的多个原体的四级表位。当RSV F糖蛋白呈融合前构象时，这种表位包含在位于所述RSV F糖蛋白的膜远端顶端上的抗原位点(“抗原位点
Figure BDA0000844346390000691
”)内(参见例如图1C)，而这种表位的二级结构元件在融合前和融合后F构象之间保持大概不变，其相对定向基本上改变，其中α4螺旋相对于融合前构象和融合后构象中的链β2转动约180°(参见例如图3B)。RSV F蛋白在融合前构象和融合后构象之间的结构的构象变化决定了D25表位在RSV F蛋白上的存在。因此，在若干实施方案中，可以通过确定D25单克隆抗体与抗原的特异性结合来鉴定包括稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的PreF抗原。本领域普通技术人员应理解，特异性结合于RSV F蛋白的抗原位点
Figure BDA0000844346390000692
的其他抗体(例如AM22抗体或5C4抗体)，或具融合前特异性但不结合抗原位点
Figure BDA0000844346390000693
的其他抗体(例如MPE8)也可以用于鉴定包括稳定在融合前构象的RSV F蛋白的PreF抗原。
因此，本文公开的PreF抗原被对RSV F融合前构象而非融合后构象具特异性的抗体特异性结合。在若干实施方案中，PreF抗原D25和/或AM22抗体特异性结合，所述抗体(如本文所公开)是对RSV F蛋白的融合前构象而非融合后构象具特异性的抗体。在若干实例中，融合前特异性抗体(例如D25或AM22)以小于约10-6摩尔浓度、例如小于约10-7摩尔浓度、10-8摩尔浓度或小于10-9摩尔浓度的解离常数特异性结合于PreF抗原。可通过本领域中已知的方法来测定特异性结合。特异性结合的测定可容易地通过使用或修改常规程序来进行，例如ELISA、免疫竞争、表面等离子体共振或其他免疫吸附测定法(描述于许多标准教科书中，包括Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，CSHL，New York，1999)。
在其他实施方案中，PreF抗原并不被结合RSV F蛋白的融合后构象的抗体特异性结合。例如，对六个螺旋束具特异性的抗体仅见于RSV F蛋白的融合后构象中(例如，如Magro等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.，109：3089-3094，2012中所述)。在若干实例中，结合于PreF抗原的RSV F融合后特异性抗体的解离常数大于10-5摩尔浓度，例如至 少10-5摩尔浓度、10-4摩尔浓度或10-3摩尔浓度。
在若干实施方案中，PreF抗原中的任一个包括在RSV F蛋白融合前特异性抗体结合构象(例如D25或AM22结合构象)中的RSV F蛋白融合前表位(例如D25或AM22表位)。例如，在若干实施方案中，当PreF抗原并不被D25或AM22结合时，即PreF抗原稳定在D25或AM22结合的构象时，PreF抗原中的任一个包括在D25或AM22表位结合的构象(例如，由表1中提供的结构坐标定义的构象)中的表位。测定所公开的PreF抗原是否包括在RSV F蛋白融合前特异性单克隆抗体结合的构象(例如D25或AM22结合构象)中的RSV F蛋白融合前表位(例如D25或AM22表位)的方法是本领域普通技术人员已知的并且进一步公开于本文中(参见例如McLellan等，Nature，480：336-343，2011；和美国专利申请公开No.2010/0068217，其各自以全文引用的方式并入本文中)。例如，可以将与RSV F蛋白复合的D25 Fab片段的所公开的三维结构与所公开的PreF抗原中的任一种的三维结构进行比较。
本领域普通技术人员应理解，虽然抗原的结构坐标与如本文所公开的融合前F蛋白的结构坐标并不严格相同，但所公开的PreF抗原可以包括在融合前特异性单克隆抗体结合构象中的表位。例如，在若干实施方案中，所公开的PreF抗原中的任一种包括RSV F融合前特异性表位(例如D25或AM22表位)，其在不存在RSV F融合前特异性单克隆抗体的情况下可以在结构上叠加在与RSV F融合前特异性单克隆抗体复合的相应表位上，其中其坐标的均方根差(RMSD)小于1.0、0.75、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3或
Figure BDA0000844346390000701
残基，其中RMSD是对于至少三个连续氨基酸在多肽主链原子N、Cα、C、O上测量的。
在若干实施方案中，所述PreF抗原可溶在水溶液中。例如，在一些实施方案中，所述PreF抗原可溶在缺乏洗涤剂的溶液中。在一些实施方案中，所述PreF抗原在室温(例如，20-22℃)下在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中溶解至至少0.5mg/ml(例如至少1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml或至少5.0mg/ml)的浓度并且保持溶解至少12小时(例如至少24小时、至少48小时、至少一周、至少两周或更长时间)。在一个实施方案中，所述磷酸盐缓冲盐水包括NaCl(137mM)、KCl(2.7mM)、Na2HPO4(10mM)、KH2PO4(1.8mM)pH 7.4。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲盐水还包括CaCl2(1mM)和MgCl2(0.5mM)。本领域技术人员熟知测定蛋白质是否随时间推移而保持在溶液中的方法。例如，可以使用标准方法测试溶解在水溶液中的蛋白质随时间的浓度。
在若干实施方案中，所公开的PreF抗原中的任一种可用于在受试者中诱导针对RSV的免疫反应。在若干这些实施方案中，免疫反应的诱导包括产生针对RSV的中和抗体。测定中和活性的方法是本领域普通技术人员已知的并且进一步描述于本文中，并且包括(但不限于)空斑还原中和(PRNT)测定法、微量中和测定法(参见例如Anderson等，J.Clin.Microbiol.，22：1050-1052，1985)，或基于流式细胞术的测定法(参见例如Chen等，J.Immunol.Methods.，362：180-184，2010)。其他中和测定法描述于本文中，并且是本领域普通技术人员熟知的。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其当溶解在水溶液中时，形成稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的群体。所述水溶液可以是例如在生理pH例如pH7.4下的磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，所述群体是包括例如都稳定在融合前构象的一种或多种重组RSV F蛋白的均质群体。在一些实施方案中，均质群体中至少约90％的重组RSV F蛋白(例如至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的RSVF蛋白)稳定在融合前构象。在一些实施方案中，均质群体中至少约90％的重组RSV F蛋白(例如至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的RSV F蛋白)被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000711
)。应理解，呈特定构象的RSV F蛋白的均质群体可以 包括变异(例如蛋白质修饰变异，例如，糖基化状态)，其不改变RSV F蛋白的构象状态。在若干实施方案中，重组RSV F蛋白的群体随时间保持均质。例如，PreF抗原可以包括重组RSV F蛋白，其当溶解在水溶液中时，形成稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的群体，持续至少12小时，例如至少24小时、至少48小时、至少一周、至少两周或更长时间。
在若干实施方案中，分离的PreF抗原与呈融合后构象的RSV F蛋白基本上分离。因此，所述PreF抗原可以例如与呈融合后构象的RSV F蛋白至少80％分离、至少90％、95％、98％、99％或甚至99.9％分离。在若干实施方案中，所述PreF抗原也与不包括抗原位点
Figure BDA0000844346390000721
和/或不被融合前特异性单克隆抗体(例如D25或AM22)特异性结合的RSV F蛋白分离。例如，所述PreF抗原可以与不包括抗原位点
Figure BDA0000844346390000722
和/或不被融合前特异性单克隆抗体(例如D25或AM22)特异性结合的RSV F蛋白至少80％分离、至少90％、95％、98％、99％或甚至99.9％分离。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其当在水溶液中温育时形成稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白群体，其中在如下条件之后，所述群体中至少70％(例如至少80％、或至少90％或至少95％或至少98％)的分离抗原特异性结合于RSV F蛋白融合前特异性抗体(例如D25或AM22)
(a)在50℃下，在350mM NaCl pH 7.0中温育一小时；
(b)在25℃下，在350mM NaCl pH 3.5中温育一小时；
(c)在25℃下，在350mM NaCl pH 10中温育一小时；
(d)在25℃下，在10mM摩尔渗透压浓度pH 7.0中温育一小时；
(e)在25℃下，在3000mM摩尔渗透压浓度pH 7.0中温育一小时；
(g)(a)-(e)中的两种或更多种的组合；或
(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(a)和(e)；(b)和(d)；(b)和(e)；(c)和(d)；(c)和(e)；(a)、(b)和(d)；(a)、(c)和(d)；(a)、(b)和(e)；或(a)、(c)和(e)的组合。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其当在水溶液中温育时，形成稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的群体，其中在350mM NaCl pH 7.0中在十次冷冻-解冻循环后，所述群体中至少60％(例如至少70％、至少80％、或至少90％)的所分离抗原特异性结合于融合前特异性抗体。
在一些实施方案中，所述PreF抗原以不包括呈融合后构象的可检测RSV F蛋白的均质群体形式提供。RSV F蛋白可通过阴性染色电子显微镜检测和/或被融合后抗体特异性结合。
1.稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白
本文所公开的PreF抗原包括稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白并包括F1多肽和F2多肽。所述F1多肽、F2多肽或两者可以包括将重组RSV F蛋白稳定在其融合前构象的至少一种修饰(例如，氨基酸取代)。在若干实施方案中，所述F2多肽和所述F1多肽通过肽连接子连接(例如，在包括单链RSV F蛋白的实施方案中)。重组RSV F蛋白在融合前构象中的稳定化保持至少一个融合前特异性表位(即，RSV F蛋白的融合前(而非融合后)构象中存在的表位)，其特异性结合于RSV F融合前特异性单克隆抗体(即，特异性结合于呈融合前构象而非融合后构象的RSV F蛋白的抗体)。因此，所公开的PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000731
)。
在一些实例中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括来自RSV A病毒的F1和/或F2多肽，例如，来自以SEQ ID NO：1-128 或370中的一个提供的RSV F0蛋白的F1和/或F2多肽，其被修饰以将重组RSV F蛋白稳定在融合前构象。在一些实例中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括来自RSV B病毒的F1和/或F2多肽，例如，来自以SEQ ID NO：129-177中的一个提供的RSV F0蛋白的F1和/或F2多肽，其被修饰以将重组RSV F蛋白稳定在融合前构象。在一些实例中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括来自RSV牛病毒的F1和/或F2多肽，例如，来自以SEQ ID NO：178-184中的一个提供的RSV F0蛋白的F1和/或F2多肽，其被修饰以将重组RSV F蛋白稳定在融合前构象。还可使用来自其他RSV亚型的F1和/或F2多肽。所述重组RSV F蛋白可以包括天然RSV序列的修饰，例如氨基酸取代、缺失或插入、糖基化和/或与无关蛋白质(例如，蛋白质标签)共价连接，只要所述PreF抗原保持重组RSV F蛋白稳定在融合前构象即可。来自不同RSV亚群的RSV F蛋白以及编码这些蛋白质的核酸序列和用于将这些核酸序列操纵和插入载体中的方法是本文中所公开和本领域中已知的(参见例如Tan等，PLOS one，7：e51439，2011；Sambrook等，Molecular Cloning，a LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates andJohn Wiley&Sons，New York，N.Y.(1994))。
在一些实施方案中，所述重组RSV F蛋白包含F2多肽和F1多肽或由F2多肽和F1多肽组成，所述F2多肽和F1多肽包含与如SEQ ID NO：1-184中的任一个、例如SEQ ID NO：124所示的天然RSV F蛋白序列的分别地氨基酸26-103和145-310具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重组RSV F蛋白包含F2多肽和F1多肽或由F2多肽和F1多肽组成，所述F2多肽和F1多肽包含与如SEQ ID NO：1-184中的任一个、例如SEQ ID NO：124所示的天然RSV F蛋白序列的分别地氨基酸26-103和145-513具有至少80％(例如至少90％、至少95％、至少98％或甚至100％)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重组RSV F蛋白包含F2多肽和F1多肽或由F2多肽和F1多肽组成，所述F2多肽和F1多肽包含与如SEQ ID NO：1-184中的任一个、例如SEQ ID NO：124所示的天然RSV F蛋白序列的分别地氨基酸26-103和145-529具有至少80％(例如至少90％、至少95％、至少98％或甚至100％)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重组RSV F蛋白包含F2多肽和F1多肽或由F2多肽和F1多肽组成，所述F2多肽和F1多肽包含与如SEQ ID NO：1-184中的任一个、例如SEQ ID NO：124所示的天然RSV F蛋白序列的分别地氨基酸26-103和145-551具有至少80％(例如至少90％、至少95％、至少98％或甚至100％)同一性的氨基酸序列。
在一些实例中，所述PreF抗原包括包含F1和/或F2多肽的重组RSV F蛋白，所述F1和/或F2多肽包括与来自RSV A病毒的RSV F1和/或F2多肽，例如以SEQ ID NO：1-128或370中的一个提供的来自RSV F0蛋白质的F1和/或F2多肽具有至少75％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的多肽序列。在其他实例中，所述PreF抗原包括包含F1和/或F2多肽的重组RSV F蛋白，所述F1和/或F2多肽包括与来自RSV B病毒的RSV F1和/或F2多肽，例如以SEQ ID NO：129-177中的一个提供的来自RSV F0蛋白质的F1和/或F2多肽具有至少75％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的多肽序列。在其他实例中，所述PreF抗原包括包含F1和/或F2多肽的重组RSV F蛋白，所述F1和/或F2多肽包括与来自RSV牛病毒的RSV F1和/或F2多肽，例如以SEQ ID NO：178-184中的一个提供的来自RSV F0蛋白质的F1和/或F2多肽具有至少75％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的多肽序列。
在若干实施方案中，所述PreF抗原包括包含F1多肽的重组RSV F蛋白，所述F1多肽包括以下或由以下组成：来自天然F1多肽序列、例如SEQ ID NO：1-184或370中的一个的位置137-513的至少300 个连续氨基酸(例如至少310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420或430个连续氨基酸)，包括与天然F1多肽序列、例如SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置137-513具有至少75％(例如至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的任何多肽序列。例如，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含F1多肽的重组F蛋白，所述F1多肽包括以下或由以下组成：SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置137-513、137-481、137-491、或位置137至C端、或位置137至跨膜结构域，其包括与天然F1多肽序列、例如SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置137-513、或位置137至C端、或位置137至跨膜结构域具有至少75％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的任何多肽序列。本领域普通技术人员应理解，包括重组RSV F蛋白的PreF抗原可以包括相比于天然F1多肽的胞外域(例如，位置137-524)具有N端或C端截短(例如，缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个或更多个氨基酸)的F1多肽，只要所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000761
)即可。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含最大长度，例如长度为不超过300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430个或不超过440个氨基酸的F1多肽。所述F1多肽可包括所公开的序列，由所公开的序列组成或基本上由所公开的序列组成。所公开的连续的F1多肽序列还可在任一端与其他无关序列(例如，非RSV F1蛋白序列、非RSV F蛋白序列、非RSV、非病毒包膜或非病毒蛋白序列)接合。
在若干实施方案中，所述PreF抗原包括包含F2多肽的重组RSV F蛋白，所述F2多肽包括以下或由以下组成：来自天然F2多肽序列、例如SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109的至少60 个连续氨基酸(例如至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108或109个连续氨基酸)，其包括与天然F1多肽序列、例如SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109具有至少75％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的多肽序列。例如，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含F2多肽的重组F蛋白，所述F2多肽包括以下或由以下组成：来自天然F2多肽序列、例如SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109的70-109个连续氨基酸(例如60-100、75-95、80-90、75-85、80-95、81-89、82-88、83-87、83-84或84-85个连续氨基酸)，其包括与天然F2多肽序列、例如SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置137-513具有至少75％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的任何多肽序列。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括F2多肽，其也具有最大长度，例如长度为不超过60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸。所述F2多肽可包括所公开的序列，由所公开的序列组成或基本上由所公开的序列组成。所公开的连续的F2多肽序列还可在任一端与其他无关序列(例如，非RSV F2蛋白序列、非RSV F蛋白序列、非RSV、非病毒包膜或非病毒蛋白序列)接合。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括F2多肽，所述F2多肽包括以下或由以下组成：来自天然F2多肽序列、例如SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109的至少60个连续氨基酸(例如至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99、100、101、102、103、104、105、106、107、108或109个连续氨基酸)，其包括与天然F2多肽序列、例如SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的氨基酸26-109具有至少75％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的多肽序列，并且还包括F1多肽，所述F1多肽包括以下或由以下组成：来自天然F1多肽序列、例如SEQ ID NO：1-184或370中的一个的位置137-513的至少300个连续氨基酸(例如至少310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420或430个连续氨基酸)，其包括与天然F1多肽序列、例如SEQ IDNO：1-184或370中的任一个的位置137-513具有至少75％(例如至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的任何多肽序列。
在一个非限制性实例中，所述PreF抗原包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，所述F2多肽和F1多肽包括SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的分别地位置26-109和137-513，其包括与SEQ ID NO：1-184或370的任一个的分别地位置26-109和137-513具有至少75％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的多肽序列。
如上文所述，所述RSV F蛋白最初合成为F0前体蛋白并且在真核细胞中成熟期间在多个位点(包括两个保守弗林裂解位点)裂解。因此，天然RSV F蛋白缺乏F0前体蛋白的N端信号肽和pep27肽(或其部分)。在若干实施方案中，稳定在融合前构象的所公开的重组RSV F蛋白不包括信号肽(或其部分)和/或不包括pep27肽(或其部分)。本领域普通技术人员应理解，可以通过在将通过细胞蛋白酶从F0前体切除信号肽和pep27肽的细胞中表达重组F0多肽来产生缺乏RSV F信号肽和/或pep27肽的重组RSV F蛋白。
若干实施方案包括PreF抗原，其包括任何所公开的重组RSV F蛋白的多聚体，例如，包括2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多 个所公开的重组RSV F蛋白的多聚体。在若干实例中，任何所公开的重组RSV F蛋白可以连接(例如，经由肽连接子)至另一个重组RSV F蛋白以形成多聚体。
本领域中应理解，可对蛋白质的氨基酸序列作出一些变异而不影响所述蛋白质的活性。这些变异包括氨基酸残基的插入、氨基酸残基的缺失和氨基酸残基的取代。序列中的这些变异可以是天然存在的变异或者它们可以通过使用本领域技术人员已知的遗传工程改造技术来进行工程改造。这些技术的实例见于Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989，第9.31-9.57页，或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其两者都以全文引用的方式并入本文中。因此，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括F1多肽、F2多肽、或F1与F2多肽，其相比于相应的天然RSV序列包括一个或多个氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，所述F1多肽、F2多肽、或F1多肽与F2多肽相比于天然F1多肽序列、例如如SEQ ID NO：1-184或370中的任一个所示的天然RSV序列包括至多20个(例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个)氨基酸取代，其中所述PreF抗原被RSV F融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000791
)。在其他实施方案中，所述F1多肽、F2多肽、或F1多肽与F2多肽相比于天然F1多肽序列、例如如SEQ ID NO：1-184或370中的任一个所示的天然RSV序列包括至多20个(例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个)保守氨基酸取代，其中所述PreF抗原被RSV F融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000792
)。例如，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括呈融合前构象的重组RSV F蛋白，其被修饰以出于蛋白质产生目的来增加蛋白质的表达，例如，通过消除RSV F蛋白上存在的 一个或多个核定位信号。使用标准程序(在一个特定的非限制性实施方案中包括定点诱变或在另一个特定的非限制性实施方案中包括PCR)，对于编码F1或F2多肽序列的核苷酸序列(例如编码包括F1和F2多肽的F0多肽的核苷酸序列)的操纵可用于产生这些变体。可选地，可以使用标准方法来合成F1和F2多肽。最简单的修饰涉及用具有类似生物化学特性的氨基酸取代一个或多个氨基酸。这些所谓的保守取代可能对所得蛋白质的活性具有最小影响。
a.膜远端稳定化修饰
如本文所公开，RSV F蛋白经历其融合前构象与融合后构象之间的结构重排。如图2B中所示，呈融合前构象的F1多肽的N端区域(部分对应于图2A中所示的膜远端叶)包括所示的α2、α3、β3、β4和α4螺旋和β折叠结构，而融合后结构中的F1多肽的N端的相应区域包括延伸的α5螺旋结构，不存在α2、α3、β3、β4和α4螺旋和β折叠结构。此外，呈融合前构象的F1多肽的C端区域(部分对应于图2A中所示的膜近端叶)包括所示的β22、α9和β23β折叠和螺旋结构，而融合后构象结构中的F1多肽的相应C端区域包括延伸的α10螺旋结构和延伸的螺旋，不存在β22、α9和β23β折叠和螺旋结构。因此，呈融合前构象的RSV F蛋白的膜远端和膜近端叶包括在呈融合后构象的RSV F蛋白的相应区域中不存在的若干不同结构元件。
由在RSV F蛋白的融合前构象和融合后构象中所鉴定的结构特征所指导，将RSV F蛋白稳定在融合前构象的若干模式是可用的，包括引入一个或多个非天然二硫键，填充RSVF蛋白内的空腔，改装RSV F蛋白中的残基，引入N连接的糖基化位点和其组合的氨基酸取代。本文提供的稳定化修饰是将重组RSV F蛋白稳定在融合前构象的靶向修饰。在若干实施方案中，所述RSV F蛋白并未通过非特异性交联如戊二醛交联、例如膜结合的RSV F三聚体的戊二醛交联稳定化。
在一些非限制性实施方案中，所述PreF抗原包括通过引入二硫键而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述重组RSV F蛋白包括S155C和S290C；G151C和I288C；A153C和K461C；A149C和Y458C；G143C和S404S取代；或Y33C和V469C氨基酸取代。这些重组RSV F蛋白(包括连接至F1多肽的C端的折叠子结构域)的前体蛋白的非限制性实例在本文中以SEQID NO：185、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：209和SEQ ID NO：211示出。在其他非限制性实施方案中，所述PreF抗原包括通过引入二硫键和一个或多个填充空腔的取代而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述重组RSV F蛋白包括S155C、S290C取代，和在位置190和/或位置207的大的疏水性残基(例如，S190F、S190W或S190L取代，和/或V207L、V207F或V207W取代)。这些重组RSV F前体蛋白(包括连接至F1多肽的C端的折叠子结构域)的前体蛋白的非限制性实例在本文中以SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：372、SEQ ID NO：373、SEQ ID NO：374、SEQ ID NO：375和SEQ ID NO：376示出。
本文所公开的重组RSV F蛋白的许多序列包括蛋白酶裂解位点(例如凝血酶位点)、蛋白质标签(例如His标签、Strep标签II、Avi标签等)的序列，其对于RSV F蛋白的功能、例如对于在受试者中诱导免疫反应不是必需的。本领域普通技术人员应认识到这些序列，并且在适当时理解这些标签或蛋白酶裂解位点不包括在所公开的重组RSV F蛋白中。
i.非天然二硫键
在若干实施方案中，所述PreF抗原包括通过至少一个非天然二硫键而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，所述非天然二硫键包括一对交联的半胱氨酸残基。非天然二硫键是在天然RSV F蛋白中不存在的二硫键，并且通过蛋白质工程改造(例如，通过包括形成非天然二硫键的一个或多个取代的半胱氨酸残基)而引入。例如，在一 些实施方案中，任何所公开的重组RSV F蛋白通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个包括一对交联的半胱氨酸残基的二硫键中的任一个而稳定在融合前构象。在一个特定的非限制性实例中，重组RSV F蛋白通过单一一对交联的半胱氨酸残基而稳定在融合前构象。在另一个非限制性实例中，任何所公开的重组RSV F蛋白通过两对交联的半胱氨酸残基而稳定在融合前构象。
可以通过一个或多个氨基酸取代将形成二硫键的半胱氨酸残基引入天然RSV F蛋白序列中。例如，在一些实施方案中，单个氨基酸取代引入半胱氨酸，其与天然RSV F蛋白序列中存在的半胱氨酸残基形成二硫键。在其他实施方案中，将两个半胱氨酸残基引入天然RSV序列中以形成二硫键。本领域普通技术人员使用呈融合前构象的RSV F蛋白的所公开结构和呈融合后构象的RSV F蛋白的先前鉴定的结构可以容易地确定将RSV F蛋白稳定在融合前构象的二硫键的半胱氨酸(或多个半胱氨酸)的位置。
例如，半胱氨酸的氨基酸位置通常在用于形成RSV F蛋白的融合前构象中的二硫键的足够近的距离内。使用三维结构数据来确定两个残基是否在关于二硫键形成的彼此足够近的距离内的方法是已知的(参见例如Peterson等，Protein engineering，12：535-548，1999和Dombkowski，Bioinformatics，19：1852-1853，3002(公开了DISULFIDE BYDESIGNTM)，其各自以引用的方式并入本文中)。例如，可以基于本文提供的呈融合前构象的RSV F蛋白的三维结构来手动选择残基，或者可以使用诸如DISULFIDEBYDESIGNTM等软件。不希望受理论束缚，用于形成二硫键的理想距离通常被视为对于Cα-Cα距离约
Figure BDA0000844346390000821
对于Sγ-Sγ距离约
Figure BDA0000844346390000822
和对于Cβ-Cβ距离
Figure BDA0000844346390000823
(使用最佳旋转异构体)。本领域普通技术人员应理解，当选择三维结构中可以被用于引入二硫键的半胱氨酸取代的残基时，包括这些距离的变化。例如，在一些实施方案中，所选择的残基具有小于
Figure BDA0000844346390000824
的Cα-Cα距离和/或小于
Figure BDA0000844346390000825
的Cβ-Cβ距离。在一些实施方案中，所选择的残基具有
Figure BDA0000844346390000826
的Cα-Cα距离和/或
Figure BDA0000844346390000827
的Cβ-Cβ距离。 在若干实施方案中，在RSV F蛋白的融合前而非融合后构象中，半胱氨酸的氨基酸位置在用于形成二硫键的足够近的距离内。
本领域普通技术人员可以容易地确定RSV F蛋白的融合前构象与融合后构象之间的特定氨基酸的相对位置，例如通过比较本文中由表1中提供的结构坐标定义的融合前结构与McLellan等，J.Virol.，85，7788，2011中所述的先前鉴定的融合后结构，其中结构坐标以PDB登录号3RRR存放。测定两种蛋白质结构之间(例如，融合前与融合后RSV F蛋白的三维结构之间)的特定氨基酸的相对位置的方法是已知的。例如，本领域普通技术人员可以使用已知的叠置方法来比较两种结构(例如，使用LSQKAB程序(Kabsch W.Acta.Cryst.A32 922-923(1976))的方法)。在一个实例中，可以通过使用LSQKAB来叠置融合前和融合后结构以比对由表1中提供的结构坐标定义的F蛋白位置26-60、77-97、220-322和332-459与由以PDB登录号3RRR存放的结构坐标定义的F蛋白位置26-60、77-97、220-322和332-459，并且比较融合前和融合后结构中的每个残基的Cα原子之间的距离以鉴定两种结构之间的特定残基的偏差。
在若干实施方案中，所述PreF抗原包括通过分别引入改变构象的氨基酸位置中的半胱氨酸与引入不改变融合前和融合后结构之间的构象的氨基酸位置中的半胱氨酸之间的二硫键而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白。例如，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括引入一对半胱氨酸的氨基酸取代，其中第一半胱氨酸在RSV F蛋白的一个氨基酸位置中，所述氨基酸位置在RSV F蛋白融合前和融合后构象的三维结构之间具有至少5(例如至少6、至少7、至少8、至少9或至少10)埃的均方根差，并且第二半胱氨酸在RSV F蛋白的一个氨基酸位置中，所述氨基酸位置在RSV F蛋白融合前和融合后构象的三维结构之间具有小于4(例如小于3、2或1)埃的均方根差，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000831
)。
基于融合前和融合后RSV F结构的比较，存在至少两个经历大的构象变化的区域，位于F1亚基的N端和C端(分别是残基137-216和461-513)。例如，如图2B中所示，F1多肽的位置137-216和461-513经历F蛋白前构象和F蛋白后构象之间的结构重排，而F1多肽的位置217-460保持相对不变。因此，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括通过F1多肽的位置137-216或461-513之一中的第一半胱氨酸与F1多肽的位置217-460之一中的第二半胱氨酸之间的二硫键而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白。在其他实施方案中，所述PreF抗原包括通过F1多肽的位置137-216或461-513之一中的第一半胱氨酸与F2多肽的位置如F2多肽的位置26-109之一(例如，位置26-61或77-97之一)中的第二半胱氨酸之间的二硫键而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括通过分别引入改变融合前与融合后结构之间的构象的氨基酸位置的半胱氨酸之间的二硫键而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白。例如，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括引入一对半胱氨酸的氨基酸取代，其中第一半胱氨酸和第二半胱氨酸在RSV F蛋白的氨基酸位置中，所述氨基酸位置在RSV F蛋白融合前构象与融合后构象的三维结构之间具有至少5(例如至少6、至少7、至少8、至少9或至少10)埃的均方根差，其中所述PreF抗原包括与RSV F融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)的特异性结合活性，和/或包括RSV F融合前特异性表位(例如，D25或AM22表位)。在一些这样的实施方案中，所述PreF抗原包括通过F1多肽的位置137-216中的第一半胱氨酸与第二半胱氨酸之间的二硫键而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白。在其他实施方案中，所述PreF抗原包括通过F1多肽的位置461-513中的第一半胱氨酸与第二半胱氨酸之间的二硫键而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白。在其他实施方案中，所述PreF抗原包括通过F1多肽的分别地位置137-216和461-513中的第一半胱氨酸与第二半胱氨酸之间的二硫键而稳定在融合前构象的重组 RSV F蛋白。
本领域普通技术人员可以使用呈融合前构象的RSV F蛋白的三维结构的结构坐标(其阐述于表1中)和呈融合后构象的RSV F蛋白的三维结构的结构坐标(其阐述于蛋白质数据库登录号3RRR中)而容易地确定RSV F蛋白的融合前构象和融合后构象中的特定氨基酸的位置(和两种构象之间的任何位置差异)。例如，这些比较方法描述于实施例1中。表5提供半胱氨酸对的实例和可用于将RSV F蛋白稳定在融合前构象的氨基酸取代。
表5.用于二硫键稳定化的示例性半胱氨酸对
Figure BDA0000844346390000851
Figure BDA0000844346390000861
Figure BDA0000844346390000871
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)二硫键的重组RSV F蛋白，其包括位于表5的第2栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54行的一个或多个中所列出的RSV F位置的半胱氨酸残基之间的二硫键，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000872
)。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)二硫键，包括通过表5的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54行中的一个或多个中列出的半胱氨酸氨基酸取代所引入的半胱氨酸残基之间的二硫键，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000873
)。
表5的第4栏中列出的SEQ ID NO示出包括所示取代以及信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的氨基酸序列。
因此，在其他实施方案中，所述PreF抗原包括RSV F蛋白，其包括如表5的第4栏中列出的SEQ ID NO中的任一个，例如表5的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54行中的一个列出的SEQ ID NO所示的F1多肽和F2多肽，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000882
)。例如，所述PreF抗原可以包括包含F1多肽和F2多肽的RSV F蛋白，其中所述F2和F1多肽包括如表5的第4栏中列出的SEQ IDNO中的任一个，例如表5的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54行中的一个列出的SEQ ID NO分别地位置26-109和137-513所示的氨基酸序列，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000881
)。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)原体内二硫键，包括位于表5的第2栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21行中的一个或多个 中列出的F1多肽的RSV F位置的半胱氨酸残基之间的二硫键。例如，所述PreF抗原可以包括重组RSV F蛋白，其包括一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)原体内二硫键，包括通过表5的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21行中的一个或多个中列出的F1多肽氨基酸取代所引入的半胱氨酸残基之间的二硫键。在任何这些实施方案中，所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000891
)。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括一个或多个(例如2、3、4、5、6或7个)原体内二硫键，包括位于表5的第2栏的第22、23、24、25、26、27或28行中的一个或多个中列出的F2和F1多肽的RSV F位置的半胱氨酸残基之间的二硫键。例如，所述PreF抗原可包括重组RSV F蛋白，其包括一个或多个(例如2、3、4、5、6或7个)原体内二硫键，包括由表5的第3栏的第22、23、24、25、26、27或28行中的一个或多个中列出的F2和F1多肽氨基酸取代引入的半胱氨酸残基之间的二硫键。在任何这些实施方案中，所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000892
)。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)原体间二硫键，包括位于表5的第2栏的第29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39行中的一个或多个中列出的F1多肽的RSV F位置的半胱氨酸残基之间的二硫键。例如，所述PreF抗原可包括重组RSV F蛋白，其包括一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)原体间二硫键，包括通过表5的第3栏的第29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39行中的一个或多个中列出的F1多肽氨基酸取代引入的半胱氨酸残基之间的二硫键。在任何这些实施方案中，所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异 性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000902
)。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括位于表5的第2栏的第40行中列出的F2和F1多肽的RSV F位置的半胱氨酸残基之间的原体间二硫键。在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括通过表5的第3栏的第40行中列出的F2和F1多肽中的氨基酸取代所引入的半胱氨酸残基之间的原体间二硫键。在任何这些实施方案中，所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSVF融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000901
)。
在一些实施方案中，可从F蛋白序列插入(或缺失)氨基酸以调节F蛋白结构中的残基的比对，以使得特定残基对在足够近的距离内以在融合前而非融合后构象中形成原体内或原体间二硫键。在若干这些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括位于F1多肽的RSV F位置的半胱氨酸残基之间的二硫键，以及表5的第2栏的第41、42或43行中的一个或多个中列出的氨基酸插入。在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括通过F1多肽氨基酸取代引入的半胱氨酸残基之间的二硫键，以及表5的第3栏的第41、42或43行中的一个或多个中列出的氨基酸插入。
在一个实例中，所述PreF抗原包括稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其包括在F1位置155和290的半胱氨酸之间的二硫键，例如具有S155C和S290C取代的重组F1多肽蛋白。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括表5或表5b中列出的半胱氨酸残基之间的二硫键中的两个或更多个的组合，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000903
)。应理解，一些组合将不会导致稳定在融合前构象的RSV F蛋白；这些组合可以通过本文所公开的方法来鉴定，例如通过 证实含有这种多肽的抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000911
)。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括将F蛋白稳定在融合前构象的非天然二硫键，其中所述F蛋白包括在表5b的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16行中的一个中列出的取代，其中半胱氨酸残基插入F蛋白中用于形成非天然二硫键。在任何这些实施方案中，所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000912
)。
表5b的第4栏中列出的SEQ ID NO阐述包括所示取代以及信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的氨基酸序列。因此，在其他实施方案中，所述PreF抗原包括RSV F蛋白，其包括如表5b的第4栏中列出的SEQ ID NO中的任一个，例如表5b的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16行之一列出的SEQ ID NO所示的F1多肽和F2多肽，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000913
)。例如，所述PreF抗原可包括包含F1多肽和F2多肽的RSV F蛋白，其中所述F2和F1多肽包括以表5b的第4栏中列出的SEQ ID NO中的任一个，例如表5b的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16行之一列出的SEQ ID NO的分别地位置26-109和137-513所示的氨基酸序列，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000914
)。
表5b.示例性稳定化F蛋白取代和序列
描述 取代 SEQ ID NO：
1 链内二硫键 S238C、E92C 421
2 链内二硫键 L193C、I59C 422
3 链内二硫键 I59C、L297C 423
4 链内二硫键 L297C、I292C 424
5 链内二硫键 K176C、S190C 425
6 链内二硫键 T189C、A177C 426
7 链内二硫键 T58C、K191C 427
8 链内二硫键 A424C、V450C 428
9 链内二硫键 L171C、K191C 429
10 链内二硫键 K176C、S190C 430
11 链间二硫键 K77C、I217C 431
12 链内二硫键 K427C、D448C 434
13 链内二硫键 G151C、N302C 435
14 链内二硫键 G151C、V300C 436
15 链内二硫键 T189C、V56C 437
16 链内二硫键 L171C、K191C 438
ii.填充空腔的氨基酸取代
RSV F蛋白的融合前构象的结构(例如，在如本文所公开的与D25 Fab的复合物中)与融合后RSV F蛋白的结构(例如公开于所公开的McLellan等，J.Virol.，85，7788，2011中)的比较鉴定了融合前构象中的若干内部空腔或凹穴，其对于F必须塌陷以转变为融合后构象。这些空腔包括表6中列出的那些。
因此，在若干实施方案中，所述PreF抗原包括通过一个或多个氨基酸取代而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，所述氨基酸取代引入降低内部空腔的体积的氨基酸，所述内部空腔在RSV F蛋白的融合后构象中塌陷。例如，通过用具有大的侧链的氨基酸取代具有小的侧链的氨基酸来填充空腔。所述空腔可以是原体内空腔或原体间空腔。将RSV蛋白稳定在其融合前构象的RSV F填充空腔的氨基酸取代的一个实例是具有S190F和V207L取代的RSV F蛋白。在另一个实施方案中，将RSV蛋白稳定在RSV F蛋白的融合前构象的填充空腔的氨基酸取代包括S190F、S190L、S190W、S190H、S190M或 S190Y取代。
本领域普通技术人员可以使用本文提供的方法来比较RSV F蛋白的融合前和融合后构象的结构以鉴定合适的空腔，和用于填充所鉴定的空腔的氨基酸取代。示例性空腔和用于降低这些空腔的体积的氨基酸取代提供于表6中。
表6.示例性填充空腔的氨基酸取代
Figure BDA0000844346390000931
所示空腔通过可以突变成填充空腔的较大残基的邻接空腔的小残基提及。应理解，其他残基(除了下文提及的空腔的残基之外)也可突变以填充相同的空腔。
因此，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括降低表6的第2栏中列出的一个或多个空腔体积的一个或多个氨基酸取代，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000932
)。在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括表6的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8或9行中列出的一个或多个氨基酸取代，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000933
)。
表6中列出的SEQ ID NO示出包括所示取代以及信号肽、F2多 肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ IDNO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的氨基酸序列。因此，在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括如表6的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7或8行中列出的SEQ ID NO中的任一个所示的F1多肽和F2多肽，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000941
)。例如，所述PreF抗原可包括重组RSV F蛋白，其包括如表6的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7或8行中列出的SEQ ID NO中的任一个所示的分别地位置26-109和137-513示出的F1多肽和F2多肽，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000942
)。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括表6b的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84行中的一个列出的氨基酸取代，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000943
)。
表6a中列出的SEQ ID NO示出包括所示取代、信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的氨基酸序列。因此，在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括如表6b的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84行之一列出的SEQ ID NO中的任一个所示的F1多肽和F2多肽，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000952
)。例如，所述PreF抗原可包括重组RSV F蛋白，其包括如表6b的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84行之一列出的SEQ ID NO中的任一个所示的分别地位置26-109和137-513示出的F1多肽和F2多肽，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390000953
)。
表6b.示例性填充空腔的氨基酸取代
Figure BDA0000844346390000951
Figure BDA0000844346390000961
Figure BDA0000844346390000971
Figure BDA0000844346390000981
iii.改装取代
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括通过一个或多个改装氨基酸取代而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白。在蛋白质中的氨基酸之间，改装取代增加吸引性相互作用(例如疏水性相互作用或氢键形成)，或降低排斥性相互作用(例如带相似电荷的残基簇之间的排斥力)。
本领域普通技术人员可以使用本文提供的方法来比较RSV F蛋白的融合前构象和融合后构象的结构以分别鉴定RSV F蛋白残基之间的排斥性和/或吸引性相互作用的合适位点，和用于降低或增加这些相互作用的氨基酸取代。例如，通过鉴定本文提供的融合前构象中的RSV F蛋白的结构中的排斥性相互作用，和引入降低这些排斥性相互作用的取代。可选地，所述RSV F蛋白可包括增加RSV F蛋白的融合前构象而非RSV F蛋白的融合后构象中的RSV F蛋白残基之间的吸引性相互作用的取代。示例性氨基酸取代提供于表7中。
表7.改装氨基酸取代
Figure BDA0000844346390000991
Figure BDA0000844346390001001
因此，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括表7的第2栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47行之一列出的氨基酸取代，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001011
)。
表7中列出的SEQ ID NO示出包括所示取代以及信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ IDNO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的氨基酸序列。因此，在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括如表7的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47行之一示出的F1多肽和F2多肽，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001012
)。例如，所述PreF抗原可包括重组RSV F蛋白，其包括如表7的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47行之一列出的SEQ ID NO中的任一个所示的分别地位置26-109和137-513示出的F1多肽和F2多肽，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001013
)。
若干实施方案包括上文列出的氨基酸取代的组合。
iv.N连接的糖基化位点
RSV F蛋白(例如，与如本文所公开的D25或AM22复合)的融合前构象的结构与融合后RSV F蛋白的结构(例如公开于所公开的McLellan等，J.Virol.，85，7788，2011中)的比较鉴定了RSV F蛋 白的若干区域，其在本文所述的融合前RSV F构象中是溶剂可及的，但在融合后RSV F构象中是溶剂不可及的(如McLellan等，J.Virol.，85，7788，2011中所公开)。
因此，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括在本文所述的融合前RSV F构象中溶剂可及、但在融合后RSV F构象中溶剂不可及的位置引入N连接的糖基化位点的氨基酸取代(如McLellan等，J.Virol.，85，7788，2011中所公开)。这些氨基酸取代通过增加蛋白质采用融合后状态所需的能量而将重组RSV F蛋白稳定在融合前构象。
为了产生N连接的糖基化位点，需要引入序列Asn-X-Ser/Thr(其中X是除Pro之外的任何氨基酸)。这可以通过用Ser/Thr氨基酸取代天然Asn残基C端的两个残基，或通过用Asn氨基酸取代天然Ser/Thr残基N端的两个残基，或通过被一个非脯氨酸氨基酸隔开的Asn和Ser/Thr残基的取代来实现。因此，在若干实施方案中，任何所公开的重组RSV F蛋白被糖基化。例如，RSV F蛋白包括在RSV F蛋白中引入N连接的糖基化位点的氨基酸取代，其在本文所公开的融合前RSV F构象中是溶剂可及的，但在如McLellan等，J.Virol.，85，7788，2011中所公开的RSV F的融合后构象中是溶剂不可及的。示例性N连接的糖基化位点修饰提供于表8中。
表8.示例性N连接的糖基化
行 N连接的糖基化位点位置 示例性取代 示例性SEQ ID NO
1 506 I506N和K508T 198
2 175 A177S 199
3 178 V178N 200
4 276 V278T 203
5 476 Y478T 204
6 185 V185N和V187T 214
7 160 L160N和G162S 215
8 503 L503N和F505S 216
9 157 V157N 217
在一些实施方案中，PreF抗原包括通过在F1多肽的一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或9个)位置506、175、178、276、476、185、160、503或157处的N连接的糖基化位点而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001031
)。例如，所述F1多肽可包括在F1多肽的一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或9个)位置506、175、178、276、476、185、160、503或157处引入N连接的糖基化位点的氨基酸取代。
表8中列出的SEQ ID NO示出包括所示取代以及信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ IDNO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含I506N和K508T取代以在位置506引入N连接的糖基化位点的F1多肽。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含A177S取代以在位置175引入N连接的糖基化位点的F1多肽。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含V178N取代以在位置178引入N连接的糖基化位点的F1多肽。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含V278T取代以在位置276引入N连接的糖基化位点的F1多肽。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含Y478T取代以在位置476引入N连接的糖基化位点的F1多肽。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含V185N和V187T取代以在位置185引入N连接的糖基化位点的F1多肽。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含L160N和G162S取代以在位置160引入N连接的糖基化位点的F1多肽。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含L503N和F505S取代以在位置503引入N连接的糖基化位点的F1多肽。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含V157N取代以在位置157引 入N连接的糖基化位点的F1多肽。在任何这些实施方案中，所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSVF融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001041
)。
在其他实施方案中，所述F1多肽包含SEQ ID NO：198(位置506的N连接的糖基化位点)；SEQ ID NO：199(位置175的N连接的糖基化位点)；SEQ ID NO：200(位置178的N连接的糖基化位点)；SEQ ID NO：203(位置276的N连接的糖基化位点)；SEQ ID NO：204(位置476的N连接的糖基化位点)；SEQ ID NO：214(位置185的N连接的糖基化位点)；SEQ ID NO：215(位置160的N连接的糖基化位点)；SEQ ID NO：216(位置503的N连接的糖基化位点)；或SEQ IDNO：217(位置157的N连接的糖基化位点)的残基137-513，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001042
)。
制造糖基化多肽的方法公开于本文中并且是本领域普通技术人员熟知的。例如，这些方法描述于美国专利申请公开No.2007/0224211；美国专利No.7,029,872；7,834,159；7,807,405；Wang和Lomino，ACS Chem.Biol.，7：110-122，2011；和Nettleship等，MethodsMol.Biol，498：245-263，2009中，其各自以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，通过在哺乳动物细胞如HEK293细胞或其衍生物如GnTI-/-细胞(
Figure BDA0000844346390001043
No.CRL-3022)中表达重组RSV F蛋白来产生糖基化PreF抗原。在一些实施方案中，通过在哺乳动物细胞如HEK293细胞或其衍生物中表达RSV F蛋白抗原来产生所述RSV F蛋白抗原，其中向培养基中添加苦马豆素以抑制糖基化机制的某些方面，例如以促进杂合聚糖的产生。
在若干实施方案中，所述F1多肽包括表8中列出的两个或更多个N连接的糖基化位点。
v.示例性稳定化修饰
本领域技术人员应理解，所述PreF抗原可包括通过一种或多种本文所述的稳定化氨基酸取代的组合，例如引入一个或多个二硫键、填充RSV F蛋白内的空腔、改装RSV F蛋白中的残基、引入N连接的糖基化位点的氨基酸取代的组合，而稳定在融合前构象的重组RSVF蛋白。例如，在若干实施方案中，重组RSV F蛋白包括引入二硫键并填充RSV F蛋白内的空腔的氨基酸取代。
在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括位置155和290处的一对半胱氨酸之间的二硫键，和位置190处的填充空腔的氨基酸取代；或位置155与290处的一对半胱氨酸之间的二硫键，位置190处的填充空腔的氨基酸取代，和位置207处的填充空腔的氨基酸取代。例如，位置190和/或位置207处的填充空腔的取代可以是大的芳族或疏水性氨基酸取代(例如酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸或色氨酸)。
在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C和S190F氨基酸取代。在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C和S190W氨基酸取代。在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C和S190L氨基酸取代。
在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代。在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C、S190W和V207L氨基酸取代。在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C、S190L和V207L氨基酸取代。在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C、S190F和V207F氨基酸取代。在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C、S190W和V207F氨基酸取代。在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C、S190L和V207F氨基酸取代。在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C、S190F和 V207W氨基酸取代。在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C、S190W和V207W氨基酸取代。在一些实施方案中，重组RSV F蛋白的F1多肽包括S155C、S290C、S190L和V207W氨基酸取代。
在若干实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括来自人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F1多肽和F2多肽，其中所述F1多肽包括稳定化取代的上述组合之一。
在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ IDNO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C和S190F氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C和S190W氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSVF蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C和S190L氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C和S190H氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C和S190M氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C和S190Y氨基酸取代。
在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ IDNO：1-184或370中的任一个的位置26-109和 137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190W和V207L氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190L和V207L氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190H和V207L氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ IDNO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190M和V207L氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190Y和V207L氨基酸取代。
在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ IDNO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190F和V207F氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190W和V207F氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190L和V207F氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370 中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190H和V207F氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ IDNO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190M和V207F氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190Y和V207F氨基酸取代。
在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ IDNO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190F和V207W氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190W和V207W氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190L和V207W氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190H和V207W氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ IDNO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190M和V207W氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190Y和V207W氨基酸取代。
在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ IDNO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190F、V207L和F488W氨基酸取代。在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSVF蛋白包括分别包含SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽，并且还包括S155C、S290C、S190F和F488W氨基酸取代。
在一些实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白包括分别包含SEQ IDNO：371(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSVA)、SEQ ID NO：372(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV B)、SEQ ID NO：373(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的牛RSV)、SEQ ID NO：374(具有S155C、S290C和S190F取代的RSV A)、SEQ ID NO：375(具有S155C、S290C和S190F取代的RSV B)或SEQ ID NO：376(具有S155C、S290C和S190F取代的牛RSV)的位置26-109和137-513的F2多肽和F1多肽。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其包括表8b的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54行之一列出的氨基酸取代。所述稳定化RSV F蛋白可以被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001092
)。
表8b：示例性重组RSV F蛋白取代以及具有和不具有C端凝血酶可裂解的折叠子结构域的序列
Figure BDA0000844346390001091
Figure BDA0000844346390001101
Figure BDA0000844346390001111
Figure BDA0000844346390001121
Figure BDA0000844346390001131
表8b中列出的SEQ ID NO示出包括所示取代、信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和 纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))或凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ IDNO：185的位置547-552))、三聚化结构域(折叠子结构域)和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括如表8b的第4栏(不具有折叠子结构域)或第5栏(具有可裂解的折叠子结构域)的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、59、50、51、52、53或54行之一的SEQ ID NO中所示的F1多肽(例如，大致位置137-513)和F2多肽(例如，大致位置26-109)。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其包括表8c的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13行之一列出的氨基酸取代。所述稳定化RSV F蛋白可以被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001141
)。
表8c中列出的SEQ ID NO示出包括所示取代、信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的氨基酸序列。因此，在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括如表8c的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13行之一的SEQ ID NO所示的F1多肽(例如，大致位置137-513)和F2多肽(例如，大致位置26-109)。
表8c：示例性重组RSV F蛋白取代和序列
Figure BDA0000844346390001151
b.膜近端稳定化修饰
在若干实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白的膜锚定形式(例如，具有跨膜结构域)。在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白的可溶性形式(例如，不具有跨膜结构域或其他膜锚)。应理解，存在用于产生可溶性或膜锚定重组RSV F蛋白(包括下文讨论的那些)的若干不同方法。实例包括引入三聚化结构 域，引入可形成稳定化F1的C端区域的二硫键的半胱氨酸对，和引入跨膜结构域(例如，对于包括膜锚定PreF抗原的应用)。
此外，如本文所公开，与D25 Fab复合的RSV F蛋白(即，呈融合前构象)的结构与融合后RSV F蛋白的结构(例如公开于McLellan等，J.Virol.，85，7788，2011中，其中坐标以PDB登录号3RRR存放)的比较显示膜近端叶和膜远端叶中的融合前构象与融合后构象之间的结构重排。若干实施方案包括靶向RSV F蛋白融合前构象的膜近端叶的稳定化的修饰。应理解，这些修饰对于将重组RSV F蛋白稳定在融合前构象不是严格必须的，但是在一些情况下，它们与其他融合前稳定化修饰如上文所述的那些组合。
i.三聚化结构域
在若干实施方案中，将所述PreF抗原连接至三聚化结构域，例如所述PreF抗原可包括包含具有连接至C端的三聚化结构域的F1多肽的重组RSV F蛋白。在一些实施方案中，所述三聚化结构域促进重组RSV F蛋白中的三个F1/F2单体的三聚化。若干外源多聚化结构域促进可溶性重组蛋白的稳定三聚体：GCN4亮氨酸拉链(Harbury等，1993Science 262：1401-1407)、来自肺表面活性蛋白的三聚化基序(Hoppe等，1994FEBSLett 344：191-195)、胶原蛋白(McAlinden等，2003J Biol Chem 278：42200-42207)和噬菌体T4次要纤维蛋白折叠子(Miroshnikov等，1998Protein Eng 11：329-414)，其中的任一个可以连接至PreF抗原中的F1多肽以促进重组F蛋白的三聚化，只要所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001161
)即可。
在一些实例中，所述PreF抗原可以连接至GCN4亮氨酸拉链结构域，例如所述PreF抗原可以包括包含具有连接至C端的GCN4亮氨酸拉链结构域的F1多肽的重组RSV F蛋白。在特定实例中，GCN4亮氨酸拉链结构域提供于本文所述的CSGJ系列的构建体中。
在一些实例中，所述PreF抗原可以连接至折叠子结构域，例如，所述PreF抗原可以包括包含具有连接至C端的折叠子结构域的F1多肽的重组RSV F蛋白。在特定实例中，所述折叠子结构域是T4次要纤维蛋白折叠子结构域如氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF(SEQ ID NO：351)，其采用β-螺旋桨构象，并且可以自主方式折叠并三聚化(Tao等，1997Structure 5：789-798)。
在一些特定实例中，所述PreF抗原包括连接至T4次要纤维蛋白折叠子结构域的重组RSV F蛋白，包括连接至如SEQ ID NO：185、189-303或371-376之一所述的折叠子结构域的F2多肽和F1多肽。通常，异源多聚化基序位于F1结构域的C端。任选地，所述多聚化结构域经由连接子如氨基酸连接子(例如序列GG)连接至F1多肽。所述连接子也可以是较长的连接子(例如，包括序列GG，例如氨基酸序列：GGSGGSGGS；SEQ ID NO：352)。众多构象上中性的连接子是本领域中已知的，其可以在这种情形中使用而不破坏PreF抗原的构象。一些实施方案包括用于从F1多肽除去折叠子结构域的蛋白酶裂解位点，例如(但不限于)F1多肽与折叠子结构域之间的凝血酶位点。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括上文列出的任何三聚化结构域修饰与第II.B.1.a章节中列出的任何修饰的组合。例如，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括上文列出的任何三聚化结构域修饰与以下的组合：一种或多种在表5的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或51行之一中列出的二硫键修饰，和/或一种或多种在表6的第1、2、3、4、5、6、7或8行之一中列出的填充空腔的修饰，和/或一种或多种在表7的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47行之一中列出的改装修饰，和/或一种或多种在表8的第1、2、3、4、5、6、7、8或9行之一中列出的糖基化修饰，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001181
)。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括连接至F1多肽的上文列出的任何三聚化结构域修饰，所述F1多肽包括位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键，和位置190的填充空腔的氨基酸取代；或位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键、位置190的填充空腔的氨基酸取代，和位置207的填充空腔的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括连接至F1多肽的上文列出的任何三聚化结构域修饰，所述F1多肽包括S155C、S290C和S190F氨基酸取代，S155C、S290C和S190W氨基酸取代，或S155C、S290C和S190L氨基酸取代。在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括连接至F1多肽的上文列出的任何三聚化结构域修饰，所述F1多肽包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207W氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207W氨基酸取代，或S155C、S290C、S190L和V207W氨基酸取代。
例如，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在RSV F蛋白融合前构象的重组RSV F蛋白，其中连接至折叠子结构域的F2多肽和F1多肽包括如SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO： 201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ IDNO：264、SEQ ID NO：265、SEQ ID NO：266、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：270、SEQ ID NO：271、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ IDNO：275、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：280、SEQ ID NO：281、SEQ ID NO：282、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：302、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：190、SEQ IDNO：211、SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：283、SEQ ID NO：285或SEQ ID NO：263中的任一个的分别地位置26-109和137-544；或如SEQ IDNO：258、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：262、SEQ ID NO：296、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：298或SEQ ID NO：299中的任一个的分别地位置26-109和137-545的氨基酸序列，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001191
)。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在RSV F蛋白融合前构象的重组RSV F蛋白，其中连接至折叠子结构域的F2多肽和F1多肽包括如SEQ ID NO：371(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV A)、SEQ ID NO：372(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV B)、SEQ ID NO：373(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的牛RSV)、SEQ ID NO：374(具有S155C、S290C和S190F取代的RSVA)、SEQ ID NO：375(具有S155C、S290C和S190F取代的RSV B)或SEQ ID NO：376(具有S155C、S290C和S190F取代的牛RSV)中的任一个的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001192
)。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包 括来自人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F1多肽和F2多肽，其中所述F1多肽连接至上文列出的任何三聚化结构域修饰，并且所述F1多肽还包括本文所述的任何稳定化修饰(例如，稳定化取代的上述组合之一，例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)。
在一些实施方案中，上述PreF抗原包括稳定在RSV F蛋白融合前构象的重组RSV F蛋白，并且包括一个或多个填充空腔的氨基酸取代和折叠子结构域，其中连接至所述折叠子结构域的上述F2多肽和F1多肽包括如SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：195或SEQ ID NO：194中的任一个的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列；其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001202
)。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在RSV F蛋白融合前构象的重组RSV F蛋白，并且包括一个或多个改装氨基酸取代和折叠子结构域，其中连接至所述折叠子结构域的F2多肽和F1多肽包括如SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQ ID NO：288、SEQID NO：289、SEQ ID NO：290、SEQ ID NO：291、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：293、SEQ ID NO：294、SEQ ID NO：295、SEQ ID NO：296、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：326、SEQ ID NO：327、SEQID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：333、SEQ ID NO：334、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：336或SEQ ID NO：337中的任一个的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列；其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001201
)。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在RSV F蛋白融合前构象的重组RSV F蛋白，并且包括一个或多个N连接的糖基化位点和折叠子结构域，其中连接至折叠子结构域的F2多肽和F1多肽包括如选自SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216或SEQ ID NO：217的SEQ ID NO中的任一个的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列；其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001211
)。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括表5b的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16行之一列出的氨基酸取代，其中所述重组RSVF蛋白的F1多肽连接至折叠子结构域。一些实施方案包括用于从F1多肽除去折叠子结构域的蛋白酶裂解位点，例如凝血酶裂解位点。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在RSV F蛋白融合前构象的重组RSV F蛋白，其包括连接至折叠子结构域的F2多肽和F1多肽，其中连接至所述折叠子结构域的所述F2多肽和所述F1多肽包括如表5b的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16行之一中列出的SEQ ID NO之一的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列。在若干实施方案中，连接至所述折叠子结构域的所述F1多肽还包括蛋白酶裂解位点，例如(但不限于)F1多肽与折叠子结构域之间的凝血酶位点。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括在表6b的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84行中列出的氨基酸取代，其中所述重组RSV F蛋白的F1多肽连接至折叠子结构域。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在RSV F蛋白融合前构象的重组RSV F蛋白，其包括连接至折叠子结构域的F2多肽和F1多肽，其中连接至所述折叠子结构域的所述F2多肽和所述F1多肽包括如表6b的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84行之一列出的SEQ ID NO之一的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在RSV F蛋白融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述重组RSV F蛋白包括表8b的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、59、50、51、52、53或54行之一列出的氨基酸取代，其中所述重组RSV F蛋白的F1多肽连接至折叠子结构域。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在RSV F蛋白融合前构象的重组RSV F蛋白，其包括连接至折叠子结构域的F2多肽和F1多肽，其中连接至所述折叠子结构域的所述F2多肽和所述F1多肽包括如表8b的第5栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54行之一列出的SEQ ID NO之一的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列。这些序列包括F1多肽与折叠子结构域之间的凝血酶裂解位点。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在RSV F蛋白融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述重组RSV F蛋白包括在表8c的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13行中列出的氨基酸取代，其中所述重组RSV F蛋白的F1多肽连接至折叠子结构域。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在RSV F蛋白融合前构象的重组RSV F蛋白，其包括连接至折叠子结构域的F2多肽和F1多肽，其中连接至所述折叠子结构域的所述F2多肽和所述F1多肽包括如表8c的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13行中列出的SEQ ID NO的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列。
还可使用修饰的折叠子结构域，例如包括以GYIPEAPRDGQCYVRCDGEWVLLSTF(SEQID NO：694)、GYIPECPRDGQAYVCKDGEWVLLSTF(SEQ ID NO：695)、GYIPEAPRDGQCYCRKDGEWVLLSTF(SEQ ID NO：696)或GYIPEAPRDGQACVRKDGECVLLSTF(SEQ IDNO：697)示出的氨基酸序列的折叠子结构域。这些修饰的折叠子结构域包括添加两个半胱氨酸残基以形成稳定化二硫键的氨基酸取代。包括连接至修饰的折叠子结构域的DSCav1氨基酸取代的示例性RSV F蛋白序列包括以SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653和SEQ ID NO：654示出的那些。在一些实施方案中，任何所公开的重组RSV F蛋白可以连接至如本文所述的修饰的折叠子结构域。
ii.二硫键
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括包含用于稳定化重组RSV F蛋白的膜近端叶的一个或多个二硫键的F1多肽。可以通过一个或多个氨基酸取代将形成二硫键的半胱氨酸残基引入重组RSV F蛋白中。
本领域普通技术人员使用本文所述和本领域技术人员熟知的方 法可以容易地确定将RSV F蛋白的膜近端叶稳定在融合前构象的二硫键的半胱氨酸(或多个半胱氨酸)的位置。在一些实施方案中，通过用半胱氨酸残基取代α10螺旋的氨基酸来将二硫键环引入F1多肽的C端中。螺旋-螺旋的RSV F胞外域的三个α10螺旋稳定化蛋白质的膜近端部分。当在细胞中表达时，在引入α10螺旋中的半胱氨酸之间形成原体间二硫键，从而将三个α10螺旋“锁定”为紧密接近并且防止膜近端结构域从融合前构象移动至融合后构象。RSV F蛋白的α10螺旋包括残基492至跨膜结构域(残基529)。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括位于RSV F位置486和487的半胱氨酸残基之间，或位于RSV F位置512和513的半胱氨酸残基之间的二硫键，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001241
)。在一些这样的实施方案中，所述F1多肽分别包括D486C和E487C取代，L512C和L513C取代，或D486C、E487C、L512C和L513C取代。
在一些实施方案中，可以从F蛋白序列插入(或缺失)氨基酸以调节F蛋白结构中的残基的比对，以使得特定残基对在足够近的距离内以形成二硫键。在一些这样的实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括在位于486和487的半胱氨酸残基之间的二硫键；其中脯氨酸插入在位置486与487之间，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001242
)。在一些这样的实施方案中，所述F1多肽包括D486C和E487C取代，和在位置486与487之间的脯氨酸插入。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括位于位置493的半胱氨酸残基与插入位置329与330之间的半胱氨酸残基之间的二硫键，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异 性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001251
)。在一些这样的实施方案中，所述F1多肽包括S493C取代，和插入位置329与330之间的半胱氨酸残基。
在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括位于位置493的半胱氨酸残基与插入位置329与330之间的半胱氨酸残基之间的二硫键，并且还包括在残基492与493之间的甘氨酸插入，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001252
)。在一些这样的实施方案中，所述F1多肽包括S493C取代、插入位置329与330之间的半胱氨酸残基，和在残基492与493之间的甘氨酸插入。
在其他实施方案中，所述重组RSV F蛋白包括在α10螺旋中在位置525和526、512和513和/或519和520处的半胱氨酸取代，其可以形成原体间二硫键以稳定化F1多肽的C端区域。例如，在一些实施方案中，所述重组RSV F蛋白包括表23中列出的任何“基序”。在其他实施方案中，所述重组RSV F蛋白包括与如SEQ ID NO：829-1025或1456-1468中的任一个所示的氨基酸序列具有至少80％(例如至少90％、至少95％或至少98％同一性)的氨基酸序列，任选地不包括纯化标签或这些序列中包括的三聚化结构域。
在一些实施方案中，所述重组RSV F蛋白包括从位置512延伸C端，如CCHNVNAGKSTTN(SEQ ID NO：844的残基512-524)或CCHNVNACCSTTN(SEQ ID NO：849的残基X-Y)或CCHNVNACCSTTNICCTT(SEQ ID NO：853的残基512-529)中的一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括用于稳定化RSV F蛋白的膜近端叶的任何上述二硫键修饰与第II.B.1.a章节中列出的任何稳定化修饰的组合。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括用于稳定化上文列出的RSV F蛋白的膜近端叶的任何二硫键修饰与以下的组合：表5的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或51行或者表5b的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16行之一列出的二硫键取代，或表6的第1、2、3、4、5、6、7或8之一或者表6b的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84之一列出的填充空腔的取代，或表7的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47行之一列出的改装取代，或表8的第1、2、3、4、5、6、7、8或9行之一列出的糖基化修饰，或表8b的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、59、50、51、52、53或54行中列出的取代，或表8c的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13行中列出的取代，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001261
)。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括用于稳定化上文列出的RSV F蛋白的膜近端叶的任何二硫键修饰；并且还包括F1多肽，所述F1多肽包括在位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键，和在位置190的填充空腔的氨基酸取 代；或在位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键、在位置190的填充空腔的氨基酸取代，和位置207的填充空腔的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括用于稳定化上文列出的RSV F蛋白的膜近端叶的任何二硫键修饰；并且还包括F1多肽，所述F1多肽包括S155C、S290C和S190F氨基酸取代，S155C、S290C和S190W氨基酸取代，或S155C、S290C和S190L氨基酸取代。在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括用于稳定化上文列出的RSV F蛋白的膜近端叶的任何二硫键修饰；并且还包括F1多肽，所述F1多肽包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207W氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207W氨基酸取代，或S155C、S290C、S190L和V207W氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，所述F2多肽和F1多肽包括如SEQ ID NO：371(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSVA)、SEQ ID NO：372(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV B)、SEQ ID NO：373(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的牛RSV)、SEQ ID NO：374(具有S155C、S290C和S190F取代的RSV A)、SEQ ID NO：375(具有S155C、S290C和S190F取代的RSV B)或SEQ ID NO：376(具有S155C、S290C和S190F取代的牛RSV)中的任一个的分别地位置26-109和137-513所示的氨基酸序列，其中所述重组RSV F蛋白还包括用于稳定化上文列出的RSV F蛋白的膜近端叶的任何二硫键修饰，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001271
)。
在若干实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括来自人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F1多肽和F2多肽，其中所述重组RSV F蛋白还包括用于稳定化上文列出的RSV F蛋白的膜近端叶的任何二硫键修饰，并且其中所述F1多肽还包括本文所述的任何稳定化修饰(例如，稳定化取代的上述组合之一，例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)。
iii.跨膜结构域
在一些实施方案中，所述重组RSV F蛋白包括连接至F1多肽的跨膜结构域，例如，对于包括膜锚定PreF抗原的应用。例如，跨膜序列的存在可用于作为膜囊泡制剂的跨膜蛋白表达。所述跨膜结构域可以连接至含有任何本文提供的稳定化突变的F1蛋白，例如上文所述的那些，例如具有S155C/S290C半胱氨酸取代的F1蛋白。另外，所述跨膜结构域可以进一步连接至RSV F1胞质尾。包括信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、RSV跨膜结构域的实例以SEQ ID NO：323(不具有胞质域)和SEQ IDNO：324(具有胞质域)提供。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括连接至跨膜结构域的F1多肽与第II.B.1a章节中列出的任何稳定化修饰的组合。例如，在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括连接至跨膜结构域的F1多肽，并且还包括表5的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或51行或者表5b的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16行之一列出的二硫键取代，或表6的第1、2、3、4、5、6、7或8行之一或者表6b的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84行之一列出的填充空腔的取代，或表7的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47行之一列出的改装取代，或表8的第1、2、3、4、5、6、7、8或9行之一列出的糖基化修饰，或表8b的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、59、50、51、52、53或54中列出的取代，或表8c的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13行中列出的取代，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001291
)。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括连接至跨膜结构域的F1多肽，其中所述F1多肽还包括在位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键，和在位置190的填充空腔的氨基酸取代；或在位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键、在位置190的填充空腔的氨基酸取代，和在位置207的填充空腔的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括连接至跨膜结构域的F1多肽，其中所述F1多肽还包括S155C、S290C和S190F氨基酸取代，S155C、S290C和S190W氨基酸取代，或S155C、S290C和S190L氨基酸取代。在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括连接至跨膜结构域的F1多肽，其中所述F1多肽还包括S155C、S290C、S190F和V207L 氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207W氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207W氨基酸取代，或S155C、S290C、S190L和V207W氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括连接至跨膜结构域的F2多肽和F1多肽，其中连接至所述跨膜结构域的所述F2多肽和所述F1多肽包括如SEQ ID NO：371(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV A)、SEQ ID NO：372(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV B)、SEQ ID NO：373(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的牛RSV)、SEQ ID NO：374(具有S155C、S290C和S190F取代的RSVA)、SEQ ID NO：375(具有S155C、S290C和S190F取代的RSV B)或SEQ ID NO：376(具有S155C、S290C和S190F取代的牛RSV)中的任一个的分别地位置26-109和137-513所示的氨基酸序列，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001301
)。
在若干实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括来自人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F1多肽和F2多肽，其中所述F1多肽连接至上文列出的任何跨膜结构域，并且所述F1多肽还包括本文所述的任何稳定化修饰(例如，稳定化取代的上述组合之一，例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)。
iv.填充空腔的取代
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括包含F1多肽的重组RSV F蛋白，所述F1多肽包括用于稳定化重组RSV F蛋白的膜近端叶的 一个或多个填充空腔的取代。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，其包括具有V207L和L512F；L513F；L512F和L513F；L512Y和L513Y；L512F和L513Y；L512W和L513W；L5132W和L513Y；S509W；S509F；S509W和L512F；或S509W、L512F和L513F取代的F1多肽，其中所述PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001311
)。具有这些取代的示例性序列包括SEQ ID NO：672-682。
c.抗原位点
在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白并且包括进一步修饰以消除除抗原位点
Figure BDA0000844346390001315
之外的已知抗原位点。例如，所述重组RSV F蛋白可以包括破坏抗原位点I、II或IV的修饰。可以例如通过对这些位点具特异性的抗体的结合来鉴定这些修饰。
在一些实施方案中，提供包括重组RSV F蛋白的抗原，所述蛋白包括修饰以消除抗原位点
Figure BDA0000844346390001312
这些抗原例如可用作对照试剂。
用于除去抗原位点
Figure BDA0000844346390001313
和/或抗原位点II的示例性修饰列于表8c1中。
表8c1：示例性重组RSV F蛋白取代和序列
Figure BDA0000844346390001314
Figure BDA0000844346390001321
d.单链RSV F蛋白
在一些实施方案中，所述重组RSV F蛋白是单链RSV F蛋白，其包括包含RSV F1多肽和RSV F2多肽的单一多肽链。所公开的单链RSV F蛋白不包括侧接RSV F蛋白的pep27多肽的弗林裂解位点；因此，当在细胞中产生时，所述F多肽不裂解成单独的F1和F2多肽。在若干实施方案中，F1和F2多肽的其余部分是通过连接子如肽连接子接合的。
在若干实施方案中，产生包括F2、pep27和F1序列的单一多肽链。所述单链RSV F蛋白可以包括pep27序列，或这个序列可能缺失。此外，在其中pep27序列缺失的实例中，连接子(例如肽连接子)任选地可以安置在重组单链RSV F蛋白中的F2与F1多肽之间。在一些实施方案中，单链RSV F蛋白包括RSV F位置98-149或106-149的缺失，其除去两个弗林裂解位点、pep27多肽和融合肽。在一些实施方案中，单链RSV F蛋白包括RSV F位置98-136、98-144、98-149、106-136、104-144或106-144的缺失。
在若干实施方案中，本文(例如，在上文第(B.1.a)章节至第(B.1.c)章节中)所公开的稳定化突变可以包括在单链RSV F蛋白中。例如，在一些实施方案中，所述单链RSV F蛋白包括S155C和S290C取代；S155C、S290C和S190F取代；或S155C、S290C、S190F和V207L取代。在一些实施方案中，所述PreF抗原包括稳定在融合前构象的呈单链形式的重组RSV F蛋白，其包括表8d的第3栏的第1、2、3、4、5、6或7行之一列出的氨基酸取代。所述稳定化RSV F蛋白可以被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/ 或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001331
)。
示例性序列列于表8d中。表8d中列出的SEQ ID NO示出包括所示取代、信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))或凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))、三聚化结构域(折叠子结构域)、和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQID NO：185的位置559-568)))的氨基酸序列。因此，在其他实施方案中，所述PreF抗原包括重组RSV F蛋白，所述蛋白包括如表8d的第4栏(不具有折叠子结构域)或第5栏(具有可裂解的折叠子结构域)的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14行之一列出的SEQ ID NO所示的F1多肽(例如，大致位置137-513)和F2多肽(例如，大致位置26-109)。其他的示例性单链RSV F蛋白突变和序列描述于本文中，例如如表8e(例如，第34-43行)和表18中所公开。
表8d.单链重组RSV F蛋白
Figure BDA0000844346390001332
Figure BDA0000844346390001341
稳定在融合前构象的其他单链RSV f蛋白的序列提供于表19中，其包括具有不可裂解的折叠子结构域、可裂解的折叠子结构域并连接至蛋白质纳米粒子亚基的单链RSV F蛋白。
2.最小位点
Figure BDA0000844346390001342
免疫原
RSV F的位点
Figure BDA0000844346390001343
表位位于三聚体尖峰顶端上，并包括由三种中和抗体D25、AM22和5C4识别的区域。更具体地，如由RSV F/D25复合物的晶体结构所描绘，这个表位包含螺旋α4的外表面(残基196-209)和β2与α1之间的相邻环(残基63-68)。本文提供包括RSV F蛋白的这些最小方面并且可用于例如诱导针对RSV的免疫反应以及可用于特异性结合至RSV F蛋白抗体，例如作为探针以鉴定或检测这些抗体的免疫原。
因此，在一些实施方案中，所述重组RSV F蛋白包括刺激RSV的免疫反应所必需的最小区域。在一些实施方案中，所述RSV F蛋白包括以下或由以下组成：与表20中所示的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述重组RSV F蛋白包含如 表20中所示，例如如SEQ ID NO：1027-1052中所示的抗原位点
Figure BDA0000844346390001351
的环状排列。
最小表位区域可以连接至骨架蛋白以稳定化抗原构象中的表位。例如，本文列出的任何最小位点
Figure BDA0000844346390001352
抗原可以连接至2KNO、2A90、2W59、3U2E、2VJ1、1CHD、1PQZ或2MOE骨架蛋白。这些是位于PDB数据库中的特定序列的参考标识符，并且以引用的方式并入本文中，如2014年3月11日在数据库中所存在。连接至骨架蛋白的最小位点
Figure BDA0000844346390001353
抗原的特定实例提供于本文表20中。
任何最小位点
Figure BDA0000844346390001354
抗原可以连接至蛋白质纳米粒子亚基，例如铁蛋白亚基或2，4-二氧四氢喋啶合成酶亚基，以产生蛋白质纳米粒子。连接至蛋白质纳米粒子亚基的最小位点
Figure BDA0000844346390001355
抗原的特定实例提供于本文表21中。
在若干实施方案中，所述PreF抗原包括表位-骨架蛋白，其包括呈融合前特异性构象的RSV F蛋白融合前特异性表位。在一些实例中，所述表位骨架蛋白包括如本文所公开的任何稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白。所述融合前特异性表位可以安置在骨架蛋白中的任何地方(例如，在N端、C端或内部环)，只要包括所述表位骨架蛋白的PreF抗原被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001356
)即可。
用于鉴定和选择骨架的方法公开于本文中并且是本领域普通技术人员已知的。例如，用于表位骨架的叠加、接枝和从头设计的方法公开于以全文引用的方式并入本文中的美国专利申请公开No.2010/0068217中。
“叠加”表位-骨架是基于具有暴露的区段的骨架蛋白，其具有与目标表位类似的构象，这个“叠加区域”中的主链原子可以在结构上叠加在目标表位上，其坐标具有最小均方根差(RMSD)。通过以计 算方式搜索蛋白质晶体结构文库来鉴定合适的骨架；通过将表位残基置于叠加区域中并且在骨架的周围表面上进行另外的突变以防止与抗体的冲突或其他相互作用来设计表位-骨架。
“接枝”表位-骨架利用可以容纳暴露的区段被目标表位的结晶化构象置换的骨架蛋白。对于通过计算方式搜索所有的蛋白质晶体结构而鉴定的每种合适的骨架，暴露的区段被目标表位置换并且周围侧链被重新设计(突变)以容纳并稳定化插入的表位。最后，关于叠加表位-骨架，在骨架表面上和表位外部作出突变，以防止与抗体的冲突或其他相互作用。接枝骨架要求所置换的区段和插入的表位在其N端与C端之间具有相似的平移和旋转变换，并且周围的肽主链不与所插入的表位冲突。接枝与叠加之间的一个差异是：接枝试图精确地模拟表位构象，而叠加允许小的结构偏差。
“从头”表位-骨架是以计算方式从头设计以最佳地呈现表位的结晶化构象。这种方法是基于新颖折叠的计算设计(Kuhlman，B.等，2003 Science 302：1364-1368)。从头允许设计在尺寸上都最小的免疫原，因此它们不会呈现不希望的表位，以及针对热或化学变性高度稳定。
所述骨架可能是异源骨架。在若干实施方案中，所述天然骨架蛋白(不具有表位插入)不是病毒包膜蛋白。在其他实施方案中，所述骨架蛋白不是RSV蛋白。在其他实施方案中，所述骨架蛋白不是病毒蛋白。
在其他实施方案中，所述表位-骨架蛋白包括如SEQ ID NO：341-343中的任一个所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：341-343中的任一个具有至少80％序列同一性(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的多肽，并且其中所述表位-骨架蛋白被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构 象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001371
)。在其他实施方案中，所述RSV F蛋白是SEQ ID NO：341-343中的任一个，其中所述RSV F蛋白的氨基酸序列具有至多20个氨基酸取代，并且其中所述表位骨架蛋白被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或在不存在被相应的融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)结合的情况下包括RSVF融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001372
)。可选地，所述多肽可具有0个或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸取代。
稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白可以放置在骨架中的任何地方，只要所得表位-骨架蛋白被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或在不存在被相应的融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)结合的情况下包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001373
)即可。用于确定特定的表位-骨架蛋白是否被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合的方法公开于本文中并且是本领域普通技术人员已知的(参见例如国际申请公开No.WO 2006/091455和WO 2005/111621)。另外，可以使用多种充分定义的诊断测定法(包括常规免疫测定法格式)来测定抗体-抗原复合物的形成以检测和/或定量抗原特异性抗体。这些测定法包括例如酶免疫测定法，例如，ELISA、基于细胞的测定法、流式细胞术、放射性免疫测定法和免疫组织化学染色。众多的竞争性和非竞争性蛋白质结合测定法是本领域中已知的并且许多可购得。测定特定的表位-骨架蛋白是否在不存在被相应的融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)结合的情况下包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001374
)的方法也描述于本文中并且此外是本领域普通技术人员已知的。
3.病毒样粒子
在一些实施方案中，提供包括稳定在融合前构象的所公开的重组RSV F蛋白的病毒样粒子(VLP)。VLP缺乏为病毒复制所需的病毒组 分并且因此呈现高度减毒形式的病毒。当施用至受试者时，VLP可以呈现能够诱导针对RSV的免疫反应的多肽(例如，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白)。病毒样粒子和其制造方法是本领域普通技术人员已知和熟知的，并且来自若干病毒的病毒蛋白已知形成VLP，包括人类乳头状瘤病毒、HIV(Kang等，Biol.Chem.380：353-64(1999))、Semliki-Forest病毒(Notka等，Biol.Chem.380：341-52(1999))、人类多瘤病毒(Goldmann等，J.Virol.73：4465-9(1999))、轮状病毒(Jiang等，Vaccine 17：1005-13(1999))、细小病毒(Casal，Biotechnology and AppliedBiochemistry，第29卷，第2部分，第141-150页(1999))、犬细小病毒(Hurtado等，J.Virol.70：5422-9(1996))、戊型肝炎病毒(Li等，J.Virol.71：7207-13(1997))和新城疫病毒。例如，含有RSV抗原的嵌合VLP并且可以是基于新城疫病毒的VLP。基于新城疫的VLP先前已被证明在小鼠中诱导针对RSV的中和免疫反应。这些VLP的形成可以通过任何合适的技术来检测。本领域中已知的适于检测培养基中的VLP的技术的实例包括例如电子显微镜技术、动态光散射(DLS)、选择性色谱分离(例如，VLP的离子交换、疏水性相互作用和/或尺寸排阻色谱分离)和密度梯度离心。
在一些实施方案中，所述病毒样粒子包括包含F2多肽和F1多肽(例如连接至跨膜结构域的F1多肽)的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽包括在位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键，和在位置190的填充空腔的氨基酸取代；或在位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键、在位置190的填充空腔的氨基酸取代，和在位置207的填充空腔的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述病毒样粒子包括包含F2多肽和F1多肽(例如连接至跨膜结构域的F1多肽)的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽包括S155C、S290C和S190F氨基酸取代，S155C、S290C和S190W氨基酸取代，或S155C、S290C和S190L氨基酸取代。在其他实施方案中，所述病毒样粒子包括包含F2多肽和F1多肽(例如连接至跨膜结构域的F1多肽)的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽 包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207W氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207W氨基酸取代，或S155C、S290C、S190L和V207W氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述病毒样粒子包括包含F2多肽和F1多肽(例如连接至跨膜结构域的F1多肽)的重组RSV F蛋白，其中所述F2多肽和所述F1多肽包括如SEQ ID NO：371(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV A)、SEQ ID NO：372(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV B)、SEQ ID NO：373(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的牛RSV)、SEQ ID NO：374(具有S155C、S290C和S190F取代的RSVA)、SEQ ID NO：375(具有S155C、S290C和S190F取代的RSV B)或SEQ ID NO：376(具有S155C、S290C和S190F取代的牛RSV)中的任一个的分别地位置26-109和137-513所示的氨基酸序列。
在若干实施方案中，所述病毒样粒子包括包含来自人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F1多肽(例如连接至跨膜结构域的F1多肽)和F2多肽的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽包括本文所述的任何稳定化修饰(例如，稳定化取代的上述组合之一，例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)。
4.蛋白质纳米粒子
在一些实施方案中，提供包括任何所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白中的一种或多种的蛋白质纳米粒子，其中所述蛋白质纳米粒子被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性 结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001401
)。纳米粒子的非限制性实例包括铁蛋白纳米粒子、封装素纳米粒子和硫氧化还原酶(SOR)纳米粒子，其由分别包括铁蛋白、封装素蛋白和SOR蛋白的单体亚基的组装构成。为了构建包括所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的蛋白质纳米粒子，将抗原连接至蛋白质纳米粒子(例如铁蛋白、封装素蛋白或SOR蛋白)的亚基。融合蛋白在适当条件下自组装成纳米粒子。
铁蛋白纳米粒子和其用于免疫化目的的用途(例如，对于针对流感抗原的免疫化)已经在本领域中公开(参见例如Kanekiyo等，Nature，499：102-106，2013，以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，将任何所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白连接至铁蛋白多肽或不同铁蛋白多肽的杂合体以构建铁蛋白纳米粒子，其中所述铁蛋白纳米粒子被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001402
)。铁蛋白是在所有动物、细菌和植物中存在的球状蛋白质，并且其主要用于通过运输水合铁离子和质子进出矿化核心来控制多核Fe(III)2O3形成的速率和位置。铁蛋白的球状形式由单体亚基构成，所述单体亚基是具有约17-20kDa的分子量的多肽。一个这样的单体亚基的序列的实例由SEQ ID NO：353表示。每个单体亚基具有螺旋束的拓扑结构，其包括四个反平行螺旋基序，其中第五较短螺旋(c端螺旋)大致垂直于4螺旋束的长轴。根据惯例，螺旋从N端起分别标记为‘A、B、C、D和E’。N端序列与衣壳三倍轴相邻并延伸至表面，而E螺旋在四倍轴与延伸至衣壳核心的C端堆叠在一起。这种堆叠的后果在衣壳表面上产生两个孔。预期这些孔中的一个或两个表示水合铁扩散进出衣壳的点。在产生后，这些单体亚基蛋白自组装成球状铁蛋白。因此，铁蛋白的球状形式包含24个单体亚基蛋白，并且具有拥有432对称性的衣壳样结构。构建铁蛋白纳米粒子的方法是本领域普通技术人员已知的并且进一步描述于本文中(参见例如Zhang.Int.J.Mol.Sci..12：5406-5421.2011，其以全文引 用的方式并入本文中)。
在特定实例中，铁蛋白多肽是大肠杆菌铁蛋白、幽门螺杆菌铁蛋白、人类轻链铁蛋白、牛蛙铁蛋白或其杂合物，例如大肠杆菌-人类杂合铁蛋白、大肠杆菌-牛蛙杂合铁蛋白或人类-牛蛙杂合铁蛋白。用于所公开的稳定在融合前构象的RSV F蛋白抗原的铁蛋白多肽的示例性氨基酸序列和编码铁蛋白多肽的核酸序列可见于
Figure BDA0000844346390001411
例如在登录号ZP_03085328、ZP_06990637、EJB64322.1、AAA35832、NP_000137 AAA49532、AAA49525、AAA49524和AAA49523下，其特定地以2013年2月28日可用的全文引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，将任何所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白连接至铁蛋白，所述铁蛋白包括与SEQ ID NO：353所示的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少97％)同一性的氨基酸序列。连接至铁蛋白的所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的特定实例包括以SEQ ID NO：350示出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述铁蛋白多肽是幽门螺杆菌铁蛋白(例如以SEQ ID NO：353示出的铁蛋白多肽)并包括在位置31的半胱氨酸残基取代，例如C31S、C31A或C31V取代。任何所公开的重组RSV F蛋白(例如，具有S155C、S290C和S190F取代，或具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV F多肽)可以连接至幽门螺杆菌铁蛋白(例如以SEQ ID NO：353示出的铁蛋白多肽)，其进一步包括在铁蛋白多肽的位置31的半胱氨酸残基取代，例如C31S、C31A或C31V取代。
在一些实施方案中，所述铁蛋白纳米粒子包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽连接至铁蛋白，并且其中所述F1多肽包括在位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键，和在位置190的填充空腔的氨基酸取代；或在位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键、在位置190的填充空腔的氨基酸取代和在位 置207的填充空腔的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述铁蛋白纳米粒子包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽连接至铁蛋白，并且其中所述F1多肽包括S155C、S290C和S190F氨基酸取代，S155C、S290C和S190W氨基酸取代，或S155C、S290C和S190L氨基酸取代。在其他实施方案中，所述铁蛋白纳米粒子包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽连接至铁蛋白，并且其中所述F1多肽包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207W氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207W氨基酸取代，或S155C、S290C、S190L和V207W氨基酸取代。
包括在铁蛋白纳米粒子上的RSV F蛋白可以是人类亚型A、人类亚型B或牛RSV F蛋白，其包括本文关于融合前稳定化所公开的取代。
在一些实施方案中，所述铁蛋白纳米粒子包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽连接至铁蛋白，并且其中所述F2多肽和所述F1多肽包括如SEQ ID NO：371(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV A)、SEQ ID NO：372(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV B)、SEQ ID NO：373(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的牛RSV)、SEQ ID NO：374(具有S155C、S290C和S190F取代的RSVA)、SEQ ID NO：375(具有S155C、S290C和S190F取代的RSV B)或SEQ ID NO：376(具有S155C、S290C和S190F取代的牛RSV)中的每一个的分别地位置26-109和137-513所示的氨基酸序列。在一个非限制性实施方案中，
在若干实施方案中，所述铁蛋白纳米粒子包括包含来自人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F1多肽和F2多肽的重组RSVF蛋白，其中所述F1多肽包括本文所述的任何稳定化修饰(例如，稳定化取代的上述组合之一，例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)。
在一些实施方案中，所述铁蛋白纳米粒子包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽连接至铁蛋白，并且其中连接至所述铁蛋白的所述F2多肽和所述F1多肽包括如SEQ ID NO：377(具有C端铁蛋白结构域的包括S155C、S290C、S190F、V207L氨基酸取代的RSV A)或SEQ ID NO：378-382的分别地位置26-109和137-679所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述铁蛋白纳米粒子包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽连接至铁蛋白，并且其中连接至铁蛋白的所述F2多肽和所述F1多肽包括表8e的第3栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49行中列出的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述铁蛋白纳米粒子包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽连接至铁蛋白，并且其中连接至所述铁蛋白的所述F2多肽和所述F1多肽包括表8e的第4栏的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49行中列出的SEQ ID NO中所示的F1和F2多肽的氨基酸序列。应理解，表8e中列出的SEQ ID NO.602-617和620-634和645-650包括信号序列和pep27多肽序列(当在真核细胞中产生相应的F蛋白时，其通过蛋白水解处理除去)，以及C端蛋白标签。
表8e：用于产生铁蛋白纳米粒子的示例性RSV F蛋白突变和序列
Figure BDA0000844346390001441
Figure BDA0000844346390001451
Figure BDA0000844346390001461
Figure BDA0000844346390001471
在其他实施方案中，将任何所公开的稳定在融合前构象的RSV F蛋白抗原连接至封装素多肽以构建封装素纳米粒子，其中所述封装素纳米粒子被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001472
)。封装素蛋白是也称为linocin样蛋白的细菌蛋白的保守家族，其形成充当包装酶的最小区间的大的蛋白质组装。所述封装素组装由单体亚基构成，所述单体亚基是具有约30kDa的分子量的多肽。一个这种单体亚基的序列的实例以SEQ ID NO：354提供。在产生后，所述单体亚基自组装成包括60个单体亚基的球状封装素组装。构建封装素纳米粒子的方法是本领域普通技术人员已知的，并且进一步描述于本文中(参见例如Sutter等，Nature Struct.andMol.Biol.，15：939-947，2008，其以全文引用的方式并入本文中)。在特定实例中，所述封装素多肽是细菌封装素，例如大肠杆菌或海栖热袍菌(Thermotoga maritime)封 装素。用于所公开的稳定在融合前构象的RSV F蛋白抗原的示例性封装素序列以SEQ ID NO：354示出。
在其他实施方案中，将任何所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白连接至硫氧化还原酶(SOR)多肽以构建SOR纳米粒子，其中所述SOR纳米粒子被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001481
)。SOR蛋白是微生物蛋白(例如来自嗜酸热古菌布氏酸双面菌(Acidianus ambivalens))，其形成24亚基蛋白组装。构建SOR纳米粒子的方法是本领域普通技术人员已知的(参见例如Urich等，Science，311：996-1000，2006，其以全文引用的方式并入本文中)。连接至SOR蛋白的所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的特定实例包括以SEQ ID NO：344和SEQID NO：345示出的氨基酸序列。
在其他实施方案中，将任何所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白连接至2，4-二氧四氢喋啶合成酶多肽以构建2，4-二氧四氢喋啶合成酶纳米粒子，其中所述2，4-二氧四氢喋啶合成酶纳米粒子被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001482
)。连接至2，4-二氧四氢喋啶合成酶蛋白的所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的特定实例包括以SEQ ID NO：346-348示出的氨基酸序列。
在其他实施方案中，将任何所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白连接至丙酮酸脱氢酶多肽以构建丙酮酸脱氢酶纳米粒子，其中所述丙酮酸脱氢酶纳米粒子被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001483
)。连接至丙酮酸脱氢酶蛋白的所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的特定实例包括以SEQ ID NO：349示出的氨基酸序列。
在一些实例中，例如利用连接子如Ser-Gly连接子，将任何所公 开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白连接至铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶蛋白的N端或C端。当在HEK 293自由式细胞中制造构建体时，使融合蛋白从细胞中分泌并自组装成纳米粒子。所述纳米粒子可以使用已知技术来纯化，例如通过几个不同的色谱程序，例如Mono Q(阴离子交换)，接着尺寸排阻(
Figure BDA0000844346390001491
6)色谱法。
若干实施方案包括铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶蛋白或其任何部分的单体亚基，其能够引导单体亚基自组装形成蛋白质的球状形式。来自任何已知的铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶蛋白的单体亚基的氨基酸序列可用于产生具有所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的融合蛋白，只要所述单体亚基能够自组装成纳米粒子即可，所述纳米粒子在其表面上显示稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白。
所述融合蛋白无需包含铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶蛋白的单体亚基多肽的全长序列。可以利用单体亚基多肽的部分或区域，只要所述部分包含引导单体亚基自组装形成蛋白质的球状形式的氨基酸序列即可。
在一些实施方案中，其可用于将突变工程改造到单体铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶亚基的氨基酸序列中。例如，其可用于改变位点如酶识别位点或糖基化位点以得到融合蛋白有益特性(例如半衰期)。
本领域技术人员应理解，应进行任何所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白与铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶蛋白的融合以使得所述融合蛋白的所公开的稳定在融合前构象部分的重组RSV F蛋白不干扰单体铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶亚基自组装成球状蛋白，并且所述融合蛋白的铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶 合成酶或丙酮酸脱氢酶蛋白部分不干扰所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白抗原诱导针对RSV的免疫反应的能力。在一些实施方案中，所述铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶蛋白和所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白可以直接接合在一起而不影响任一个部分的活性。在其他实施方案中，铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶蛋白和稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白是使用连接子(也称为间隔基)序列接合的。所述连接子序列经过设计以将融合蛋白的铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶部分和融合蛋白的稳定在融合前构象的所公开的重组RSV F蛋白部分关于彼此定位，以使得所述融合蛋白维持组装成纳米粒子以及诱导针对RSV的免疫反应的能力。在若干实施方案中，所述连接子序列包含氨基酸。优选使用的氨基酸是具有小的侧链的那些和/或不带电荷的那些。这些氨基酸不太可能干扰融合蛋白的适当折叠和活性。因此，单独或组合地用于连接子序列中的优选氨基酸是丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸。这种连接子序列的一个实例是SGG。可以按需要添加或减去氨基酸。本领域技术人员能够确定用于构建蛋白质纳米粒子的适当连接子序列。
在某些实施方案中，所述蛋白质纳米粒子具有100至5000kDa、例如约500至4600kDa的分子量。在一些实施方案中，当所述蛋白质纳米粒子包括稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白时，铁蛋白纳米粒子具有650kDa的近似分子量，封装素纳米粒子具有2100kDa的近似分子量，SOR纳米粒子具有1000kDa的近似分子量，2，4-二氧四氢喋啶合成酶纳米粒子具有4000kDa的近似分子量，并且丙酮酸脱氢酶纳米粒子具有4600kDa的近似分子量。
连接至铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶蛋白的所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白可以自组装成多亚基蛋白质纳米粒子，分别称为铁蛋白纳米粒子、封装素纳米粒子、SOR纳米粒子、2，4-二氧四氢喋啶合成酶纳米粒子和丙酮 酸脱氢酶纳米粒子。所述纳米粒子包括所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其具有与不包括所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的天然铁蛋白、封装素、SOR、2，4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶纳米粒子基本上相同的结构特性。也就是说，它们含有24、60、24、60或60个亚基(分别地)并且具有类似的相应对称性。在由包括所公开的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的单体亚基构建的纳米粒子的情况下，这些纳米粒子被融合前特异性抗体(例如，D25或AM22抗体)特异性结合，和/或包括RSV F融合前特异性构象(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390001511
)。
C.编码抗原的聚核苷酸
此外提供了编码所公开的PreF抗原(例如，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白、或表位-骨架蛋白、或含有这些蛋白的病毒样粒子或蛋白质纳米粒子)的聚核苷酸。这些聚核苷酸包括编码所述抗原的DNA、cDNA和RNA序列。
在一些实施方案中，所述核酸分子编码前体F0多肽，当在适当细胞中表达时，所述前体F0多肽被加工成所公开的PreF抗原。在一些实施方案中，所述核酸分子编码前体F0多肽，当在适当细胞中表达时，所述前体F0多肽被加工成所公开的PreF抗原，其中所述前体F0多肽从N端至C端包括信号肽、F2多肽、Pep27多肽和F1多肽。在一些实施方案中，所述Pep27多肽包括以SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置110-136所示的氨基酸序列，其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包括以SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置1-25示出的氨基酸序列，其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸分子编码前体F0多肽，当在适当细胞中表达时，所述前体F0多肽被加工成所公开的PreF抗原，其中 所述前体F0多肽包括以SEQ ID NO：185或189-303中的任一个示出的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子编码前体F0多肽，当在适当细胞中表达时，所述前体F0多肽被加工成所公开的PreF抗原，其中所述前体F0多肽包括以SEQ ID NO：185或189-303中的任一个的残基1-513示出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸分子编码前体F0多肽，当在适当细胞中表达时，所述前体F0多肽被加工成所公开的PreF抗原，所述PreF抗原包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，并且其中所述F1多肽包括在位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键，和在位置190的填充空腔的氨基酸取代；或在位置155和290的一对半胱氨酸之间的二硫键、在位置190的填充空腔的氨基酸取代，和在位置207的填充空腔的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述核酸分子编码前体F0多肽，当在适当细胞中表达时，所述前体F0多肽被加工成所公开的PreF抗原，所述PreF抗原包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，并且其中所述F1多肽包括S155C、S290C和S190F氨基酸取代，S155C、S290C和S190W氨基酸取代，或S155C、S290C和S190L氨基酸取代。在其他实施方案中，所述核酸分子编码前体F0多肽，当在适当细胞中表达时，所述前体F0多肽被加工成所公开的PreF抗原，所述PreF抗原包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，并且其中所述F1多肽包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207L氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190L和V207F氨基酸取代，S155C、S290C、S190F和V207W氨基酸取代，S155C、S290C、S190W和V207W氨基酸取代，或S155C、S290C、S190L和V207W氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述核酸分子编码前体F0多肽，当在适当 细胞中表达时，所述前体F0多肽被加工成所公开的PreF抗原，所述PreF抗原包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，其中所述F2多肽和所述F1多肽包括如SEQ ID NO：371(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV A)、SEQ ID NO：372(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的RSV B)、SEQ ID NO：373(具有S155C、S290C、S190F和V207L取代的牛RSV)、SEQ ID NO：374(具有S155C、S290C和S190F取代的RSVA)、SEQ ID NO：375(具有S155C、S290C和S190F取代的RSVB)或SEQ ID NO：376(具有S155C、S290C和S190F取代的牛RSV)中的任一个的分别地位置26-109和137-513所示的氨基酸序列。
在若干实施方案中，所述核酸分子编码前体F0多肽，当在适当细胞中表达时，所述前体F0多肽被加工成所公开的PreF抗原，所述PreF抗原包括包含来自人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽包括本文所述的任何稳定化修饰(例如，稳定化取代的上述组合之一，例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)。
在一个非限制性实例中，所述核酸分子编码前体F0多肽，当在适当细胞中表达时，所述前体F0多肽被加工成所公开的PreF抗原，所述PreF抗原包括包含F2多肽和F1多肽的重组RSV F蛋白，其中所述F1多肽被连接至铁蛋白，并且其中连接至所述铁蛋白的所述F2多肽和所述F1多肽包括如SEQ ID NO：377(具有C端铁蛋白结构域的包括S155C、S290C、S190F、V207L氨基酸取代的RSVA)或SEQ ID NO：378-382的分别地位置26-109和137-679所示的氨基酸序列。
在一个非限制性实例中，所述核酸分子包括以SEQ ID NO：383(来自人类亚型A的RSV F蛋白，其包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合)示出的序列。
在另一个非限制性实例中，所述核酸分子是表达载体，并且包括以SEQ ID NO：384(来自人类亚型A的RSV F蛋白，其包括S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸取代，与C端折叠子结构域、凝血酶裂解位点、6xHis标签和StrepTag II融合)示出的序列。
用于将本公开的核酸操纵和插入载体中的方法是本领域中众所周知的(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons，New York，N.Y.，1994)。
编码PreF抗原(例如，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，或表位-骨架蛋白，或含有这些蛋白的病毒样粒子或蛋白质纳米粒子)的核酸可以通过体外方法克隆或扩增，例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自持序列复制系统(3SR)和Qβ复制酶扩增系统(QB)。例如，可以使用基于分子的DNA序列的引物通过cDNA的聚合酶链反应来分离编码所述蛋白的聚核苷酸。多种克隆和体外扩增方法是本领域技术人员众所周知的。PCR方法描述于例如美国专利No.4,683,195；Mullis等，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.51：263，1987；和Erlich编，PCR Technology，(Stockton Press，NY，1989)中。也可以通过利用选自所需聚核苷酸的序列的探针在严格杂交条件下筛选基因组或cDNA文库来分离聚核苷酸。
编码PreF抗原(例如，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，或表位-骨架蛋白，或含有这些蛋白的病毒样粒子或蛋白质纳米粒子)的聚核苷酸包括重组DNA，将其并入载体中或并入自主复制质粒或病毒中或并入原核生物或真核生物的基因组DNA中，或者其以独立于其他序列的单独的分子(例如cDNA)形式存在。所述核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸的修饰形式。所述术语包括单一和双重形式的DNA。
编码PreF抗原(例如，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，或表位-骨架蛋白，或含有这些蛋白的病毒样粒子或蛋白质纳米粒子)的DNA序列可以通过DNA转移至合适的宿主细胞中而在体外表达。所述细胞可能是原核或真核的。所述术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应理解，所有后代可能不等同于亲本细胞，因为可能存在在复制期间发生的突变。稳定转移(意味着将外来DNA连续保持在宿主中)的方法是本领域中已知的。
编码PreF抗原(例如，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，或表位-骨架蛋白，或含有这些蛋白的病毒样粒子或蛋白质纳米粒子)的聚核苷酸序列可以可操作地连接至表达控制序列。将可操作地连接至编码序列的表达控制序列连接以使得在与表达控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。所述表达控制序列包括(但不限于)适当的启动子、增强子、转录终止子、在蛋白质编码基因前面的起始密码子(即ATG)、用于内含子的剪接信号、维持所述基因的正确阅读框以允许mRNA的适当翻译，和终止密码子。
宿主可以包括微生物、酵母、昆虫和哺乳动物有机体。在原核生物中表达具有真核或病毒序列的DNA序列的方法是本领域中众所周知的。合适的宿主细胞的非限制性实例包括细菌、古细菌、昆虫、真菌(例如，酵母)、植物和动物细胞(例如，哺乳动物细胞，例如人类)。使用的示例性细胞包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、SF9细胞、C129细胞、293细胞、脉孢霉(Neurospora)，和永生化哺乳动物骨髓和淋巴细胞系。哺乳动物细胞在培养物中的增殖技术是众所周知的(参见Jakoby和Pastan(编)，1979，Cell Culture.Methods in Enzymology，第58卷，Academic Press，Inc.，Harcourt Brace Jovanovich，N.Y.)。常用的哺乳动物宿主细胞系的实例是VERO和HeLa细胞、CHO细胞，和WI38、BHK和COS细胞系，但可使用如下细胞系，例如被设计以提供更高表达、所需糖基化模式或其他特征的细胞。在一些实施方案中，所述宿主细 胞包括HEK293细胞或其衍生物，例如GnTI-/-细胞(
Figure BDA0000844346390001561
No.CRL-3022)。
可通过如本领域技术人员众所周知的常规技术用重组DNA转化宿主细胞。当宿主是原核的(例如但不限于大肠杆菌)时，可以从在指数生长期后采集的细胞来制备能够DNA摄取的感受态细胞并且随后使用本领域中众所周知的程序通过CaCl2方法来处理。可选地，可以使用MgCl2或RbCl。还可以在形成宿主细胞的原生质体后或必要时通过电穿孔来进行转化。
当宿主是真核生物时，可以使用这些DNA转染方法如磷酸钙共沉淀、常规机械程序如显微注射、电穿孔、包裹在脂质体中的质粒的插入或病毒载体。真核细胞也可以与编码所公开的抗原的聚核苷酸序列和编码可选择表型的第二外来DNA分子如单纯疱疹胸苷激酶基因共转化。另一种方法是使用真核病毒载体如猿猴病毒40(SV40)或牛乳头状瘤病毒，来短暂感染或转化真核细胞并表达所述蛋白(参见例如Eukaryotic Viral Vectors，ColdSpring Harbor Laboratory，Gluzman编，1982)。
.病毒载体
编码稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的核酸分子可以包括在病毒载体中，例如以在宿主细胞中表达抗原，或用于如本文所公开的受试者的免疫化。在一些实施方案中，将病毒载体施用至受试者作为初免-加强疫苗接种的一部分。在若干实施方案中，将病毒载体包括在疫苗如初免疫苗或加强疫苗中以用于初免-加强疫苗接种。
在若干实例中，编码稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的病毒载体可具有复制能力。例如，所述病毒载体可在病毒基因组中具有突变(例如，插入编码PreF抗原的核酸)，其不抑制宿主细胞中的病毒复制。所述病毒载体也可以具有有条件的复制能力。在其他实例中，所述病毒载体在宿主细胞中具复制缺陷。
在若干实施方案中，稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白是通过可以经由呼吸道递送的病毒载体来表达的。例如，使用副粘病毒(PIV)载体如牛副流感病毒(BPIV)载体(例如，BPIV-1、BPIV-2或BPV-3载体)或人类PIV载体、偏肺病毒(MPV)载体、仙台病毒载体或麻疹病毒载体来表达所公开的抗原。表达RSV F和hPIV F蛋白(MEDI-534)的BPIV3病毒载体目前在临床试验中作为RSV疫苗。用于表达抗原的副粘病毒(PIV)载体的实例是本领域技术人员已知的(参见例如美国专利申请公开2012/0045471、2011/0212488、2010/0297730、2010/0278813、2010/0167270、2010/0119547、2009/0263883、2009/0017517、2009/0004722、2008/0096263、2006/0216700、2005/0147623、2005/0142148、2005/0019891、2004/0208895、2004/0005545、2003/0232061、2003/0095987和2003/0072773中；所述文献各自以全文引用的方式并入本文中)。在另一个实例中，使用新城疫病毒载体来表达所公开的抗原(参见例如McGinnes等，J.Virol.，85：366-377，2011，描述了在新城疫样粒子上表达的RSVF和G蛋白，所述文献以全文引用的方式并入)。在另一个实例中，使用仙台病毒载体来表达所公开的抗原(参见例如以全文引用的方式并入本文中的Jones等，Vaccine，30：959-968，2012中，其公开了使用基于仙台病毒的RSV疫苗以在灵长类动物中诱导免疫反应)。
其他病毒载体也可用于表达所公开的抗原，包括多瘤病毒即SV40(Madzak等，1992，J.Gen.Virol.，73：15331536)、腺病毒(Berkner，1992，Cur.Top.Microbiol.Immunol.，158：39-6；Berliner等，1988，BioTechniques，6：616-629；Gorziglia等，1992，J.Virol.，66：4407-4412；Quantin等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：2581-2584；Rosenfeld等，1992，Cell，68：143-155；Wilkinson等，1992，Nucl.AcidsRes.，20：2233-2239；Stratford-Perricaudet等，1990，Hum.Gene Ther.，1：241-256)、牛痘病毒(Mackett等，1992，Biotechnology，24：495-499)、腺相关病毒(Muzyczka，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.， 158：91-123；On等，1990，Gene，89：279-282)、包括HSV和EBV和CMV的疱疹病毒(Margolskee，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：67-90；Johnson等，1992，J.Virol.，66：29522965；Fink等，1992，Hum.Gene Ther.3：11-19；Breakfield等，1987，Mol.Neurobiol.，1：337-371；Fresse等，1990，Biochem.Pharmacol.，40：2189-2199)、辛德毕斯病毒(H.Herweijer等，1995，Human Gene Therapy 6：1161-1167；美国专利No.5,091,309和5,2217,879)、α病毒(S.Schlesinger，1993，TrendsBiotechnol.11：18-22；I.Frolov等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11371-11377)以及禽类(Brandyopadhyay等，1984，Mol.Cell Biol.，4：749-754；Petropouplos等，1992，J.Virol.，66：3391-3397)、鼠类(Miller，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：1-24；Miller等，1985，Mol.Cell Biol.，5：431-437；Sorge等，1984，Mol.Cell Biol.，4：1730-1737；Mann等，1985，J.Virol.，54：401-407)和人类来源(Page等，1990，J.Virol.，64：5370-5276；Buchschalcher等，1992，J.Virol.，66：2731-2739)的反转录病毒。杆状病毒(苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒；AcMNPV)载体也是本领域已知的，并且可获自商业来源(例如PharMingen，San Diego，Calif.；Protein Sciences Corp.，Meriden，Conn.；Stratagene，La Jolla，Calif.)。其他病毒载体是本领域普通技术人员熟知的。
在若干实施方案中，本文所公开的方法和组合物包括表达稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的腺病毒载体。来自各种来源、亚型或亚型混合物的腺病毒可以用作用于腺病毒载体的病毒基因组的来源。可以使用非人类腺病毒(例如，猿猴、黑猩猩、大猩猩、禽类、犬、羊或牛腺病毒)来产生腺病毒载体。例如，猿猴腺病毒可以用作腺病毒载体的病毒基因组的来源。猿猴腺病毒可以具有血清型1、3、7、11、16、18、19、20、27、33、38、39、48、49、50或任何其他猿猴腺病毒血清型。可以通过使用本领域中已知的任何合适的缩写如例如SV、SAdV、SAV或sAV来提及猿猴腺病毒。在一些实例中，猿猴腺病毒载体是具有血清型3、7、11、16、18、19、20、27、33、 38或39的猿猴腺病毒载体。在一个实例中，使用黑猩猩血清型C Ad3载体(参见例如Peruzzi等，Vaccine，27：1293-1300，2009)。人类腺病毒可以用作用于腺病毒载体的病毒基因组的来源。人类腺病毒可以具有各种亚群或血清型。例如，腺病毒可以具有亚群A(例如，血清型12、18和31)、亚群B(例如，血清型3、7、11、14、16、21、34、35和50)、亚群C(例如，血清型1、2、5和6)、亚群D(例如，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、36-39和42-48)、亚群E(例如，血清型4)、亚群F(例如，血清型40和41)、未分类的血清群(例如，血清型49和51)或任何其他腺病毒血清型。本领域普通技术人员熟知有复制能力的和复制缺陷型腺病毒载体(包括单一和多重复制缺陷型腺病毒载体)。包括多重复制缺陷型腺病毒载体的复制缺陷型腺病毒载体的实例公开于美国专利No.5,837,511；5,851,806；5,994,106；6,127,175；6,482,616；和7,195,896，以及国际专利申请No.WO 94/28152、WO 95/02697、WO 95/16772、WO 95/34671、WO 96/22378、WO 97/12986、WO97/21826和WO 03/022311中。
.组合物
所公开的PreF抗原、病毒载体和核酸分子可以包括在药物组合物(包括治疗性和预防性制剂)中，并且可以与一种或多种佐剂和任选地其他治疗成分如抗病毒药物组合在一起。在若干实施方案中，包括一种或多种所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子的组合物是免疫原性组合物。所述组合物可以包括任何PreF抗原，其包括如本文所公开的重组RSVF蛋白(例如包括任何如本文所公开的重组RSV F蛋白的蛋白质纳米粒子)、包括任何如本文所公开的重组RSV F蛋白的病毒样粒子、编码任何如本文所公开的重组RSV F蛋白的核酸分子，或编码或包括任何如本文所公开的重组RSV F蛋白的载体。
在一些实施方案中，所述组合物包括第一分离抗原，所述抗原包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代， 或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于A亚型RSV F蛋白；和第二分离抗原，所述抗原包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于B亚型RSV F蛋白。
在一些实施方案中，所述组合物包括第一蛋白质纳米粒子，所述第一蛋白质纳米粒子包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于A亚型RSV F蛋白；和第二蛋白质纳米粒子，所述第二蛋白质纳米粒子包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于B亚型RSV F蛋白。
在一些实施方案中，所述组合物包括第一病毒载体，所述第一病毒载体包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于A亚型RSV F蛋白；和第二病毒载体，所述第二病毒载体包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于B亚型RSV F蛋白。
在一些实施方案中，所述组合物包括第一病毒样粒子，所述第一病毒样粒子包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于A亚型RSV F蛋白；和第二病毒样粒子，所述第二病毒样粒子包括通 过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于B亚型RSV F蛋白。
在一些实施方案中，所述组合物包括编码通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的第一核酸分子(例如表达载体)，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于A亚型RSVF蛋白；和包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的第二核酸分子(例如表达载体)，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于B亚型RSV F蛋白。
这些药物组合物可以通过本领域普通技术人员已知的多种施用模式来施用至受试者，例如，经鼻、经肺、肌肉内、皮下、静脉内、腹膜内或肠胃外途径。
为了配制组合物，所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子可以与各种药学上可接受的添加剂以及用于分散结合物的基质或媒介物组合。所需添加剂包括(但不限于)pH控制剂，例如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸等。另外，可以包括局部麻醉剂(例如，苄醇)、等渗剂(例如，氯化钠、甘露糖醇、山梨糖醇)、吸附抑制剂(例如，
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80)、增溶剂(例如，环糊精和其衍生物)、稳定剂(例如，血清白蛋白)和还原剂(例如，谷胱甘肽)。所述组合物可以包括佐剂，例如氢氧化铝(
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可获自Brenntag Biosector，Copenhagen，Denmark和
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Wyeth Laboratories，Madison，NJ)、弗氏佐剂、MPLTM(3-O-脱酰化单磷酰脂质A；Corixa，Hamilton，IN)、IL-12(Genetics Institute，Cambridge，MA)、TLR激动剂(例如TLR-9激动剂)以及本领域中众所周知的许多其他合适佐剂。
当组合物是液体时，通常将如关于将0.9％(w/v)生理盐水溶液的张力视为1所测量的制剂张力调节至在施用位点将诱导无实质上、不可逆组织损伤的值。通常，将溶液的张力调节至约0.3至约3.0、例如约0.5至约2.0、或约0.8至约1.7的值。
所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子可以分散在基质或媒介物中，其可包括能够分散抗原的亲水性化合物，和任何所需添加剂。所述基质可选自广泛范围的合适化合物，包括(但不限于)聚羧酸或其盐、羧酸酐(例如马来酸酐)与其他单体(例如，(甲基)丙烯酸甲酯、丙烯酸等)的共聚物，亲水性乙烯基聚合物如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮，纤维素衍生物如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等，和天然聚合物如壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸钠、明胶、透明质酸和其无毒金属盐。通常，选择可生物降解的聚合物作为基质或媒介物，例如，聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-乙醇酸)共聚物和其混合物。可选地或另外地，可以使用合成脂肪酸酯如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等作为媒介物。亲水性聚合物和其他媒介物可以单独或组合使用，并且可以通过部分结晶、离子键合、交联等赋予媒介物以增强的结构完整性。所述媒介物可以多种形式提供，包括流体或粘性溶液、凝胶、糊剂、粉末、微球和薄膜，例如用于直接施用至粘膜表面。
所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子可以根据多种方法与基质或媒介物组合，并且抗原的释放可以通过扩散、媒介物的崩解或水通道的相关形成。在一些情况下，将所公开的抗原或编码、表达或包括所述抗原的核酸或病毒载体分散在由合适的聚合物(例如2-氰基丙烯酸异丁酯)制备的微胶囊(微球)或纳米胶囊(纳米球)中(参见例如Michael等，J.Pharmacy Pharmacol.43：1-5，1991)，并且分散在生物相容性分散介质中，其在延长的时间内得到持续递送和生物活性。
所述药物组合物可含有接近生理条件所需的物质作为药学上可 接受的媒介物，例如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯和油酸三乙醇胺。对于固体组合物，可以使用常规无毒的药学上可接受的媒介物，其包括例如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
用于施用所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子的药物组合物也可以配制成适于高浓度的活性成分的溶液、微乳液或其他有序结构。所述媒介物可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)和其合适混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣如卵磷脂，在可分散制剂的情况下通过维持所需粒度，和通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。在许多情况下，将希望在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露糖醇和山梨糖醇，或氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的药剂例如单硬脂酸盐和明胶而产生所公开抗原的延长吸收。
在某些实施方案中，可以时间释放制剂，例如包括缓释聚合物的组合物来施用所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子。这些组合物可用将保护免于快速释放的媒介物，例如控释媒介物如聚合物、微囊化递送系统或生物粘附凝胶来制备。可以通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝水凝胶和明胶)来产生本公开的各种组合物中的延长递送。当需要控释制剂时，根据本公开适用的控释粘合剂包括对活性剂呈惰性并且能够并入所公开的抗原和/或其他生物活性剂的任何生物相容性控释材料。众多这些材料是本领域中已知的。有用的控释粘合剂是在其递送(例如，在粘膜表面，或在体液存在下)后在生理条件下缓慢代谢的材料。适当的粘合剂包括(但不限于)本领域中众所周知用于持续释放制剂中的生物相容性聚合物和共聚物。这些生物相容性化合物是无毒的并且对周围组织呈惰性，并且不会触发显著的不良副作用，例如鼻刺激、免疫反应、炎症等。它们代谢成也具生物相容性并且容易从体内除去的代谢产物。用于治疗性蛋白的受控递送的众多系统是已知的(例如，美国专利No.5,055,303； 美国专利No.5,188,837；美国专利No.4,235,871；美国专利No.4,501,728；美国专利No.4,837,028；美国专利No.4,957,735；和美国专利No.5,019,369；美国专利No.5,055,303；美国专利No.5,514,670；美国专利No.5,413,797；美国专利No.5,268,164；美国专利No.5,004,697；美国专利No.4,902,505；美国专利No.5,506,206；美国专利No.5,271,961；美国专利No.5,254,342；和美国专利No.5,534,496)。
供使用的示例性聚合物材料包括(但不限于)从具有可水解酯键的共聚和均聚的聚酯衍生的聚合物基质。这些中的许多在本领域中已知可生物降解并且产生不具有毒性或具有低毒性的降解产物。示例性聚合物包括聚乙醇酸和聚乳酸、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)、聚(D-乳酸-共-乙醇酸)和聚(L-乳酸-共-乙醇酸)。其他有用的可生物降解或可生物侵蚀的聚合物包括(但不限于)诸如以下聚合物：聚(ε-己内酯)、聚(ε-己内酯-共-乳酸)、聚(ε-己内酯-共-乙醇酸)、聚(β-羟基丁酸)、聚(2-氰基丙烯酸烷酯)、水凝胶如聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚酰胺、聚(氨基酸)(例如，L-亮氨酸、谷氨酸、L-天冬氨酸等)、聚(酯脲)、聚(2-羟基乙基DL-天冬酰胺)、聚缩醛聚合物、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚马来酰胺、聚糖和其共聚物。用于制备这些制剂的许多方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978)。其他有用的制剂包括控释微胶囊(美国专利No.4,652,441和4,917,893)、可用于制造微胶囊和其他制剂的乳酸-乙醇酸共聚物(美国专利No.4,677,191和4,728,721)和用于水溶性肽的持续释放组合物(美国专利No.4,675,189)。
药物组合物通常是无菌的并且在制造、储存和使用条件下稳定。可以通过将所需量的所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子并入具有本文所列举成分之一或组合的适当溶剂中，在需要时接着过滤灭菌来制备无菌溶液。通常，通过将所公开的抗原和/或其他生物活性剂并入含有基本分散介质和来自本文所列举那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在无菌粉末的情况下，制备方法包括真 空干燥和冷冻干燥，其得到所公开的抗原加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉末。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现微生物作用的预防。
用于制备可施用组合物的实际方法将是本领域技术人员已知或显而易见的并且更详细地描述于诸如以下出版物中：Remingtons Pharmaceutical Sciences，第19版，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，1995。
在若干实施方案中，所述组合物包括佐剂。本领域普通技术人员熟知佐剂，例如，可以包括在免疫原性组合物中的那些。在若干实施方案中，选择佐剂以在施用免疫原性组合物的受试者中诱导Th1偏向性免疫反应，所述免疫原性组合物含有佐剂和所公开的抗原，或编码、表达或包括所述抗原的核酸或病毒载体。
一种合适的佐剂是无毒的细菌脂多糖衍生物。脂质A的合适的无毒衍生物的一个实例是单磷酰脂质A或更特别地是3-脱酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。参见例如美国专利No.4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进与IFN-y(Th1)表型的CD4+T细胞反应。可以根据GB2220211 A中公开的方法制造3D-MPL。在化学上它是3-脱酰化单磷酰脂质A与3、4、5或6个酰化链的混合物。在组合物中，可以使用小粒子3D-MPL。小粒子3D-MPL具有使得它能够无菌过滤通过0.22μm过滤器的粒度。这些制剂描述于WO94/21292中。
在其他实施方案中，脂多糖可以是β(1-6)葡糖胺二糖，如美国专利No.6,005,099和欧洲专利No.0 729 473 B1中所述。本领域技术人员将能够基于这些参考文献的教导容易地制造各种脂多糖如3D-MPL。除了前述免疫刺激剂(其在结构上与LPS或MPL或3D-MPL类似)之外，作为MPL的上述结构的子部分的酰化单糖和二糖衍生 物也是合适的佐剂。
在若干实施方案中，使用Toll样受体(TLR)激动剂作为佐剂。例如，所公开的PreF抗原可以与TLR激动剂组合在用于诱导针对RSV的中和免疫反应的免疫原性组合物中。例如，所述TLR激动剂可以是TLR-4激动剂如脂质A的合成衍生物(参见例如WO 95/14026和WO01/46127)、葡糖苷磷酸烷酯(AGP；参见例如WO 98/50399或美国专利No.6,303,347；6,764,840)。能够经由TLR-4引起信号传导反应的其他合适的TLR-4配体例如是来自革兰氏阴性细菌的脂多糖和其衍生物或其片段，特别是LPS的无毒衍生物(例如3D-MPL)。其他合适的TLR激动剂是：热休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性蛋白A、透明质酸寡糖、硫酸肝素片段、纤连蛋白片段、纤维蛋白原肽和β-防御素-2和胞壁酰二肽(MDP)。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP 60、70或90。其他合适的TLR-4配体如WO 2003/011223和WO 2003/099195中所述。
其他TLR激动剂(例如能够经由TLR信号传导途径引起信号传导反应的药剂)也可用作佐剂，例如TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和/或TLR9的激动剂。因此，在一个实施方案中，所述组合物还包括选自以下的佐剂：TLR-1激动剂、TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂或其组合。
在一个实施方案中，使用能够经由TLR-1引起信号传导反应的TLR激动剂，例如以下中的一种或多种：三酰化脂肽(LP)；酚可溶性调控蛋白；结核分枝杆菌LP；S-(2，3-双(棕榈酰氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-L-ys(4)--OH、模拟细菌脂蛋白的乙酰化氨基末端的三盐酸盐(Pam3Cys)LP和来自伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)的OspA LP。在另一个实施方案中，使用能够经由TLR-2引起信号传导反应的TLR激动剂，例如以下中的一种或多种：脂蛋白、肽基聚糖、来自结核分枝杆菌、伯氏疏螺旋体或梅毒螺旋体(T pallidum)的细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的物种的肽基聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟菌属孔蛋白、细菌纤毛、耶尔森菌毒力因子、CMV病毒体、麻疹血细胞凝集素和来自酵母的酵母聚糖。在一些实施方案中，使用能够经由TLR-3引起信号传导反应的TLR激动剂，例如以下中的一种或多种：双链RNA(dsRNA)、或聚肌胞苷酸(Poly IC)、与病毒感染相关的分子核酸模式。在其他实施方案中，使用能够经由TLR-5引起信号传导反应的TLR激动剂，例如细菌鞭毛蛋白。在其他实施方案中，使用能够经由TLR-6引起信号传导反应的TLR激动剂，例如分枝杆菌脂蛋白、二酰化LP和酚可溶性调控蛋白中的一种或多种。其他TLR6激动剂描述于WO 2003/043572中。在一个实施方案中，使用能够经由TLR-7引起信号传导反应的TLR激动剂，例如单链RNA(ssRNA)、洛索立宾(loxoribine)、在位置N7和C8的鸟苷类似物、或咪唑喹啉化合物或其衍生物中的一种或多种。在一个实施方案中，所述TLR激动剂是咪喹莫特(imiquimod)。其他TLR7激动剂描述于WO 2002/085905中。在一些实施方案中，使用能够经由TLR-8引起信号传导反应的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-8引起信号传导反应的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如瑞喹莫德(resiquimod)(R848)；瑞喹莫德也能够被TLR-7识别。可以使用的其他TLR-8激动剂包括WO 2004/071459中所述的那些。
在其他实施方案中，佐剂包括能够经由TLR-9诱导信号传导反应的TLR激动剂。例如，所述佐剂可以包括HSP90、细菌或病毒DNA，和/或含DNA的非甲基化CpG核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)。例如，含CpG的寡核苷酸主要诱导Th1反应。这些寡核苷酸是众所周知的并且例如描述于WO 95/26204、WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利No.5,278,302、5,666,153、和6,008,200和5,856,462中。因此，在所公开的组合物中用作佐剂的寡核苷酸包括含CpG的寡核苷酸，例如，含有两个或更多个二核苷酸CpG基序。还包括具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸。
可以与抗原、或编码、表达或包括抗原的核酸或病毒载体一起用于免疫原性组合物中的其他佐剂(例如，独立地或与3D-MPL或本文所述的另一种佐剂组合)是皂苷，例如QS21。在一些实例中，使用皂苷作为佐剂，例如，用于PreF抗原的全身施用。使用皂苷(例如，使用源自南美奎拉雅属皂树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮的Quil A)作为佐剂是本领域普通技术人员熟知的(参见例如US 5,057,540和EP 0 362 279 B1；EP 0 109 942B1；WO 96/11711；WO 96/33739)。溶血皂苷QS21和QS17(Quil A的HPLC纯化级分)已经被描述为有效的系统佐剂，并且其制造方法公开于美国专利No.5,057,540和EP 0 362 279 B1中。
所述佐剂也可包括矿物盐如铝或钙盐，特别是氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙。
用于组合物中的另一类合适的Th1偏向性佐剂包括基于外膜蛋白(OMP)的免疫刺激组合物。基于OMP的免疫刺激组合物特别适合作为粘膜佐剂，例如，用于鼻内施用。基于OMP的免疫刺激组合物是来自革兰氏阴性细菌例如奈瑟氏菌物种的一类OMP(包括一些孔蛋白)制剂，其可用作载体或用于免疫原(例如细菌或病毒抗原)组合物中(参见例如美国专利No.5,726,292；美国专利No.4,707,543)。此外，蛋白体能够自动组装成约20nm至约800nm的囊泡或囊泡样OMP簇，并且非共价合并、协调、缔合(例如，静电性或疏水性)，或者以其他方式与蛋白质抗原(Ag)、特别是具有疏水性部分的抗原配合。可以例如如本领域中所述来制备蛋白体(参见例如美国专利No.5,726,292或美国专利No.5,985,284；2003/0044425)。
蛋白体主要由通过洗涤剂保持在溶液中的来自脑膜炎奈瑟氏菌的化学提取的外膜蛋白(OMP)(主要是孔蛋白A和B以及4类OMP)组成(Lowell G H.Proteosomes forImproved Nasal，Oral，or Injectable Vaccines.Levine M M，Woodrow G C，Kaper J B，Cobon G S编，New Generation Vaccines.New York：Marcel Dekker，Inc.1997；193-206)。蛋 白体可用多种抗原配制，例如源自病毒来源的纯化或重组蛋白，包括本文所公开的PreF多肽。洗涤剂的逐步去除允许形成直径为约100-200nm的颗粒状疏水性复合物(Lowell GH.Proteosomes for Improved Nasal，Oral，or Injectable Vaccines.Levine M M，Woodrow G C，Kaper J B，Cobon G S编，New Generation Vaccines.New York：MarcelDekker，Inc.1997；193-206)。
不同佐剂的组合也可以与所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子一起用于组合物中。例如，如已经指出，QS21可以与3D-MPL一起配制。QS21∶3D-MPL的比率通常将为约1∶10至10∶1；例如1∶5至5∶1，和通常基本上1∶1。通常，所述比率在2.5∶1至1∶1 3D-MPL：QS21(例如AS01(GlaxoSmithKline))的范围内。另一种组合佐剂制剂包括3D-MPL和铝盐如氢氧化铝(例如AS04(GlaxoSmithKline))。当组合配制时，这种组合可以增强抗原特异性Thl免疫反应。
在一些情况下，佐剂制剂是矿物盐如钙或铝(明矾)盐，例如磷酸钙、磷酸铝或氢氧化铝。在一些实施方案中，所述佐剂包括油和水乳液，例如水包油乳液(例如MF59(Novartis)或AS03(GlaxoSmithKline))。水包油乳液的一个实例包含在水性载体中的可代谢油如角鲨烯、母育酚如生育酚(例如α-生育酚)，和表面活性剂如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)或聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80)。
药物组合物通常含有治疗有效量的所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子并且可以通过常规技术来制备。免疫原性组合物(包括用于施用至人类受试者的那些)的制备通常描述于Pharmaceutical Biotechnology，第61卷，Vaccine Design-the subunit andadjuvant approach，由Powell和Newman编辑，Plenum Press，1995；New Trends andDevelopments in Vaccines，由Voller等编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中。囊封在脂质体中例如由Fullerton，美国专利No.4,235,877描述。蛋白质与大分子的结合例如由Likhite， 美国专利No.4,372,945和Armor等，美国专利No.4,474,757公开。通常，免疫原性组合物的每个剂量中的抗原量选择为诱导免疫反应而无显著不良副作用的量。
所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子的量可以根据例如所用的特定抗原、施用途径和方案和目标群体而改变。通常，每个人类剂量将包含1-1000μg的蛋白质，例如约1μg至约100μg，例如约1μg至约50μg，例如约1μg、约2μg、约5μg、约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约40μg或约50μg。基于受试者群体(例如，婴儿或老年人)来选择免疫原性组合物中利用的量。可以通过涉及观测在受试者中的抗体效价和其他反应的标准研究来确定特定组合物的最佳量。应理解，免疫原性组合物中的治疗有效量的抗原可以包括不能通过施用单次剂量来诱导免疫反应，但在施用多次剂量后有效(例如在初免-加强施用方案中)的量。
在若干实例中，用于在人类中诱导针对RSV的免疫反应的药物组合物包括用于施用至婴儿(例如，初始剂量年龄为出生至1岁、例如0至6个月的婴儿)或老年患者受试者(例如年龄大于65岁的受试者)的治疗有效量的所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子。应理解，佐剂的选择在这些不同应用中可能不同，并且本领域技术人员可以根据经验确定每种情形的最佳佐剂和浓度。
在某些实施方案中，药物组合物是降低或预防RSV感染的疫苗。在一些实施方案中，免疫原性组合物是降低或预防RSV感染后的病理反应的疫苗。任选地，用除RSV之外的病原生物体的至少一种其他抗原来配制含有所公开的PreF抗原、病毒载体或核酸分子的药物组合物。例如，所述病原生物体可以是呼吸道病原体(例如造成呼吸系统感染的病毒或细菌)。在某些情况下，药物组合物含有源自除RSV之外的致病病毒如造成呼吸道感染如流感或副流感的病毒的抗原。在其他实施方案中，选择另外的抗原以促进施用或降低针对多种感染性生物体保护受试者所需的接种次数。例如，抗原可源自流感、乙型肝 炎、白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌、脊髓灰质炎病毒、链球菌或肺炎球菌等中的任何一种或多种。
.治疗方法
在若干实施方案中，在受试者中使用所公开的PreF抗原、或编码、表达或包括PreF抗原的核酸或病毒载体以诱导针对RSV的免疫反应。因此，在若干实施方案中，可以向受试者施用治疗有效量的包括所公开的PreF抗原、或编码、表达或包括所述抗原的核酸或病毒载体中的一种或多种的免疫原性组合物以产生针对RSV的免疫反应。
根据本文的公开内容，向需要治疗的受试者施用预防或治疗有效量的包括PreF抗原、或编码、表达或包括所述抗原的核酸或病毒载体的免疫原性组合物，持续时间和条件足以在受试者中预防、抑制和/或改善RSV感染。所述免疫原性组合物以足以在受试者中诱导针对RSV抗原如RSV F蛋白的免疫反应的量施用。
在一些实施方案中，施用至受试者的组合物包括(或编码)第一重组RSV F蛋白，其为稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白；和第二重组RSV F蛋白，其为稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白。在若干实施方案中，施用至受试者的组合物包括第一重组RSV F蛋白(其为稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白)和第二重组RSV F蛋白(其为稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白)的混合物(例如约1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2、1∶3、3∶1、1∶4、4∶1、3∶5、5∶3、1∶5、5∶1、5∶7、7∶5混合物)。
在一些实施方案中，施用至受试者的组合物包括第一蛋白质纳米粒子，所述第一蛋白质纳米粒子包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于A亚型RSV F蛋白；和第二蛋白质纳米粒子，所述第 二蛋白质纳米粒子包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于B亚型RSV F蛋白。
在一些实施方案中，施用至受试者的组合物包括编码通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的第一核酸分子(例如表达载体)，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于A亚型RSV F蛋白；和包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白的第二核酸分子(例如表达载体)，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于B亚型RSV F蛋白。
在一些实施方案中，向受试者施用包括铁蛋白纳米粒子的组合物，所述铁蛋白纳米粒子包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白。在一些实施方案中，施用至受试者的组合物包括第一铁蛋白纳米粒子，所述第一铁蛋白纳米粒子包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于A亚型RSV F蛋白；和第二铁蛋白纳米粒子，所述第二铁蛋白纳米粒子包括通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白，其中所述稳定化RSV F蛋白是基于B亚型RSV F蛋白。制造包括病毒抗原的铁蛋白纳米粒子的方法和其用于免疫化目的的用途(例如，用于针对流感抗原免疫化)已经在本领域中公开(参见例如Kanekiyo等，Nature，499：102-106，2013，其以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，选择例如由于暴露于RSV或暴露于RSV的可能性而具有RSV感染或处于患上RSV感染的风险下的受试者用于治疗。在施用治疗有效量的所公开的治疗组合物之后，可对受试者监测RSV感染、与RSV感染相关的症状或两者。因为几乎所有的人类在3岁前都会感染RSV，所以包括整个出生人口作为免疫化相关群体。这可例如通过从出生到6月龄的任何时间、从6月龄到5岁、在孕妇(或育龄期妇女)中以通过抗体的被动转移来保护其婴儿、新生儿或胎儿的家庭成员和年龄大于50岁的受试者中开始免疫化方案来进行。
处于具有严重症状的RSV感染(例如需要住院治疗)的最大风险下的受试者包括具有早产、支气管肺发育不良和先天性心脏病的儿童，其最容易患上严重的疾病。遗传性过敏症或遗传性过敏症家族史也与婴儿期严重疾病相关。在儿童期和成年期间，疾病较温和，但可能与下呼吸道疾病相关并且通常因鼻窦炎而复杂化。在机构内老人(例如，超过65岁的人)中疾病严重程度增加。严重疾病也发生在具有重症联合免疫缺陷疾病或在骨髓或肺移植后的人中。(参见例如Shay等，JAMA，282：1440-6，1999；Hall等，N Engl J Med.2009；360：588-598；Glezen等，Am J Dis Child.，1986；140：543-546；和Graham，Immunol.Rev.，239：149-166，2011，其各自以引用的方式并入本文中)。因此，可以选择这些受试者来施用所公开的PreF抗原，或编码、表达或包括PreF抗原的核酸或病毒载体。
预期用本公开的组合物和方法治疗的典型受试者包括人类以及非人类灵长类动物和其他动物，例如牛。为了鉴定用于根据本公开的方法进行预防或治疗的受试者，使用筛选方法来确定与靶向或疑似疾病或病状相关的风险因素，或确定受试者中现有疾病或病状的状态。这些筛选方法包括例如常规处理来确定可能与靶向或疑似疾病或病状相关的环境、家族、职业和其他这样的风险因素，以及诊断方法如各种ELISA和其他免疫测定方法，其在本领域中可用并且是众所周知的以检测和/或表征RSV感染。这些和其他常规方法允许临床医生 选择需要使用本公开的方法和药物组合物进行治疗的患者。免疫原性组合物可以作为独立的预防或治疗方案，或作为其他治疗的后续、辅助或协作治疗方案施用。
免疫原性组合物可用于协作疫苗接种方案或组合制剂中。在某些实施方案中，组合的免疫原性组合物和协作免疫化方案使用独立的免疫原或制剂，各自针对诱导对RSV抗原的免疫反应，例如对RSV F蛋白的免疫反应。诱导对RSV抗原的免疫反应的独立的免疫原性组合物可以组合于在单一免疫化步骤中施用至受试者的多价免疫原性组合物中，或者它们可以在协作免疫化方案中独立地施用(在单价免疫原性组合物中)。
免疫原性组合物的施用可能是用于预防或治疗目的。当预防性地提供时，在任何症状之前，例如在感染之前提供免疫原性组合物。免疫原性组合物的预防性施用用于预防或改善任何后续感染。当治疗性地提供时，在疾病或感染的症状发作时或之后，例如在RSV感染的症状发展后，或在RSV感染诊断后，提供免疫原性组合物。因此可以在预期暴露于RSV之前提供免疫原性组合物以减弱感染和/或相关疾病症状的预期严重程度、持续时间或程度，或在暴露或疑似暴露于病毒之后，或在感染实际起始之后提供免疫原性组合物。
施用诱导足够的免疫反应以治疗或预防致病性感染，例如，以抑制感染和/或降低感染的征象和/或症状。有效用于这种用途的量将取决于疾病的严重程度、受试者的一般健康状况和受试者的免疫系统的稳健性。所公开的免疫原性组合物的治疗有效量是提供如由临床医生或其他合格观察者所指出的症状的主观减轻或客观上可识别的改善的量。
对于预防性和治疗性目的，免疫原性组合物可以单次推注递送，在延长时段内经由连续递送(例如，连续透皮、粘膜或静脉内递送)，或以重复施用方案(例如，通过每小时、每天或每周一次的重复施用 方案)施用至受试者。免疫原性组合物的治疗有效剂量可以在延长的预防或治疗方案内以重复剂量提供，所述方案将产生临床显著结果以减轻与如本文所述的靶向疾病或病状相关的一种或多种症状或可检测病状。在上下文中有效剂量的测定通常是基于动物模型研究，继之以人类临床试验，并且由显著降低受试者中的靶向疾病症状或病状的发生或严重程度的施用方案指导。在这方面的合适模型包括例如鼠类、大鼠、猪、猫、雪貂、非人类灵长类动物，和本领域中已知的其他公认的动物模型受试者。可选地，可以使用体外模型(例如，免疫学和组织病理学测定法)来确定有效剂量。使用这些模型，仅需要普通的计算和调整来确定适当的浓度和剂量以施用治疗有效量的免疫原性组合物(例如，可有效引起所需免疫反应或减轻靶向疾病的一种或多种症状的量)。在可选的实施方案中，对于治疗性或诊断性目的，有效量或有效剂量的免疫原性组合物可简单地抑制或增强与如本文所述的疾病或病状相关的一种或多种所选生物活性。
在一个实施方案中，合适的免疫化方案包括用一种或多种免疫原性组合物进行至少三次独立的接种，其中第二次接种是在第一次接种后大于约两周、约三周至八周、或约四周后施用的。通常，第三次接种是在第二次接种后若干个月施用的，并且在特定实施方案中，在第一次接种后大于约五个月、在第一次接种后大于约六个月至约两年，或在第一次接种后约八个月至约一年。也需要超出第三次之外的定期接种来增强受试者的“免疫记忆”。可以通过从受试者获取血清的等分试样并且在免疫化程序过程中测定抗体效价来确定所选疫苗接种参数的适当性，例如，配方、剂量、方案等。如果这种检测表明，疫苗接种是次优的，则受试者可用额外剂量的免疫原性组合物加强，并且可以预期增强免疫反应的方式来调节疫苗接种参数。预期可存在若干次加强，并且每次加强可包括相同或不同的PreF抗原。
对于初免-加强方案，初免可以单次剂量或多次剂量施用，例如可以在数天、数周或数月内向受试者施用例如两个剂量、三个剂量、四个剂量、五个剂量或六个剂量或更多。加强可以单次剂量或多次剂 量施用，例如可以在一天、一周或数月内向受试者施用两个至六个剂量或更多。也可以给与多次加强，例如一次至五次或更多。在一系列连续接种中可以使用不同的剂量。例如，在初级接种中用相对较大的剂量，然后用相对较小的剂量加强。可以通过用本文公开的免疫原性组合物对受试者进行一次或多次接种来产生针对所选抗原表面的免疫反应。
在一些实施方案中，施用至受试者的初免组合物包括(或编码)作为稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白，并且施用至受试者的加强组合物包括(或编码)作为稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白。在一些实施方案中，施用至受试者的初免组合物包括(或编码)作为稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白，并且施用至受试者的加强组合物包括(或编码)作为稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白。
在一些实施方案中，所述方法包括施用包括稳定在融合前构象的重组A亚型RSV F蛋白和稳定在融合前构象的重组B亚型RSV F蛋白的组合物一次，或一次以上(例如在初免-加强方案中)作为一系列注射。
在一些实施方案中，所述方法包括施用包括包含稳定在融合前构象的重组A亚型RSV F蛋白的铁蛋白纳米粒子和包含稳定在融合前构象的重组B亚型RSV F蛋白的铁蛋白纳米粒子的组合物一次，或一次以上(例如在初免-加强方案中)作为一系列注射。
在一些实施方案中，所述方法包括施用包括编码稳定在融合前构象的重组A亚型RSV F蛋白的载体和编码稳定在融合前构象的重组B亚型RSV F蛋白的载体的组合物一次，或一次以上(例如在初免-加强方案中)作为一系列注射。在一些实施方案中，所述方法还可包括施用包括稳定在融合前构象的重组A亚型RSV F蛋白和稳定在融 合前构象的重组B亚型RSV F蛋白的组合物，和/或包括包含稳定在融合前构象的重组A亚型RSV F蛋白的铁蛋白纳米粒子和包含稳定在融合前构象的重组B亚型RSV F蛋白的铁蛋白纳米粒子的组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括施用包括编码稳定在融合前构象的重组A亚型RSV F蛋白的核酸分子和编码稳定在融合前构象的重组B亚型RSV F蛋白的核酸分子的组合物一次，或一次以上(例如在初免-加强方案中)作为一系列注射。在一些实施方案中，所述方法还可包括施用包括稳定在融合前构象的重组A亚型RSV F蛋白和稳定在融合前构象的重组B亚型RSV F蛋白的组合物，和/或包括包含稳定在融合前构象的重组A亚型RSV F蛋白的铁蛋白纳米粒子和包含稳定在融合前构象的重组B亚型RSV F蛋白的铁蛋白纳米粒子的组合物。
在一些实施方案中，施用至受试者的初免和加强组合物各自包括(或编码)作为稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白的第一重组RSV F蛋白，和作为稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白的第二重组RSV F蛋白。在若干实施方案中，施用至受试者的初免和加强组合物各自包括(或编码)作为稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白的第一重组RSV F蛋白和作为稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白的第二重组RSV F蛋白的混合物(例如约1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2、1∶3、3∶1、1∶4、4∶1、3∶5、5∶3、1∶5、5∶1、5∶7、7∶5混合物)。
在一些实施方案中，施用至受试者的初免和加强组合物各自包括作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白，和作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白的第二重组RSV F蛋白。
在一些实施方案中，施用至受试者的初免和加强组合物各自包括编码作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白的核酸分子，和编码作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白的核酸分子。
在一些实施方案中，施用至受试者的初免和加强组合物各自包括第一蛋白质纳米粒子(例如铁蛋白纳米粒子)，所述纳米粒子包括作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白；和第二蛋白质纳米粒子(例如铁蛋白纳米粒子)，所述纳米粒子包括作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白。
在一些实施方案中，施用至受试者的初免和加强组合物各自包含包括或编码作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白的载体，和包括或编码作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白的载体。
在一些实施方案中，施用至受试者的初免组合物包括编码作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白的第一核酸分子(例如DNA质粒表达载体)，和包括作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C 和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白的第二核酸分子(例如表达载体)，并且施用至受试者的加强组合物包括第一蛋白质纳米粒子(例如铁蛋白纳米粒子)，所述纳米粒子包括作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的A亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白；和第二蛋白质纳米粒子(例如铁蛋白纳米粒子)，所述纳米粒子包括作为通过任何本文所公开的取代(例如S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代)而稳定在融合前构象的B亚型RSV F蛋白的重组RSV F蛋白。
使用DNA质粒初免和铁蛋白纳米粒子加强的免疫化方案是本领域普通技术人员已知的(参见例如Wei等，Science，329(5995)：1060-4，2010，其以全文引用的方式并入本文中)。
免疫原性组合物的实际剂量将根据诸如以下因素而改变：受试者的疾病征兆和特定状态(例如，受试者的年龄、体型、健康、症状程度、易感因素等)、施用时间和途径、同时施用的其他药物或治疗，以及用于在受试者中引起所需活性或生物反应的免疫原性组合物的特定药理学。可以调整给药方案以提供最佳的预防或治疗反应。如上文在前述术语列表中所述，有效量也是其中所公开的抗原和/或其他生物活性剂的治疗有益作用在临床方面超过任何毒性或有害的副作用的量。
在本公开的方法和免疫原性组合物内的所公开的PreF抗原的治疗有效量的非限制性范围是每公斤体重约0.0001mg至每kg体重约10mg，例如约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、 约4mg/kg、约5mg/kg或约10mg/kg，例如每公斤体重0.01mg至约1mg、每公斤体重约0.05mg至约5mg、每公斤体重约0.2mg至约2mg、或每公斤体重约1.0mg至约10mg。
在一些实施方案中，所公开的PreF抗原、或编码、表达或包括PreF抗原的核酸或病毒载体的剂量设定量对于儿童、成人、老年人等包括例如约1-300μg，例如，剂量为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或约300μg的PreF抗原、或编码、表达或包括PreF抗原的核酸或病毒载体。剂量和给药次数将取决于例如在通过先前的RSV感染或免疫化初免的成人或任何人中的情形，单次剂量可能是足够的加强剂。在初生婴儿中，在一些实例中，将给与至少两个剂量，例如，至少三个剂量。在一些实施方案中，每年一次向老年受试者(例如，超过60岁的人)给与每年加强，例如，以及每年流感疫苗接种。用于制备可施用组合物的方法将是本领域技术人员已知或显而易见的并且更详细描述于诸如以下出版物中：Remingtons Pharmaceutical Sciences，第19版，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania，1995。
主治医师可改变剂量以在维持在目标位点(例如，全身循环)的所需浓度。可基于递送模式来选择较高或较低的浓度，例如，经表皮、经直肠、经口、经肺或鼻内递送相对于静脉内或皮下递送。也可以基于所施用制剂，例如肺内喷雾相对于粉末、持续释放口服相对于注射微粒或透皮递送制剂等的释放速率来调整剂量。为了达到相同的血清浓度水平，例如，具有5纳摩尔浓度(在标准条件下)的释放速率的缓释粒子相比于具有10纳摩尔浓度的释放速率的粒子的剂量将以约两倍施用。
在施用本公开的免疫原性组合物后，受试者的免疫系统通常通过产生对RSV F蛋白的融合前构象具特异性的抗体而应答于所述免疫原性组合物。这种应答意味着递送了有效剂量的免疫原性组合物。
在若干实施方案中，施用本文公开的免疫原性组合物与其他药剂如蛋白质、肽、抗体和其他抗病毒剂如抗RSV剂可为有利的。抗RSV剂的非限制性实例包括单克隆抗体帕利珠单抗(
Figure BDA0000844346390001811
；Medimmune，Inc.)和小分子抗病毒药物利巴韦林(由许多来源例如Warrick Pharmaceuticals，Inc.制造)。在某些实施方案中，免疫原性组合物与其他抗RSV剂同时施用。在某些实施方案中，免疫原性组合物与其他抗RSV治疗剂依序施用，例如在其他药剂之前或之后。本领域普通技术人员应知道，依序施用可能意味着紧随在适当的时段后或在适当的时段之后，例如数小时、数天、数周、数月或甚至数年后。
在其他实施方案中，将治疗有效量的包括编码所公开的PreF抗原的核酸的药物组合物施用至受试者以产生免疫反应。在一个特定的非限制性实例中，将治疗有效量的编码所公开的抗原的核酸施用至受试者以治疗或预防或抑制RSV感染。
施用核酸的一种方法是用质粒DNA，例如用哺乳动物表达质粒进行直接免疫化。如上文所述，编码所公开抗原的核苷酸序列可以安置在启动子控制下以增加分子的表达。另一种方法将使用RNA(例如自扩增RNA疫苗的非病毒递送，参见例如Geall等，Proc NatlAcad Sci U S A，109：14604-9，2012)。
通过核酸构建体进行免疫化是本领域中众所周知的并且例如教导于美国专利No.5,643,578(其描述通过引入编码所需抗原的DNA以引起细胞介导或体液反应而对脊椎动物进行免疫化的方法)、和美国专利No.5,593,972和美国专利No.5,817,637(其描述将编码抗原的核酸序列可操作地连接至能够实现表达的调节序列)。美国专利No.5,880,103描述了向有机体递送编码免疫原性肽或其他抗原的核酸的若干方法。所述方法包括核酸(或合成肽自身)和免疫刺激构建体或ISCOMSTM、在混合胆固醇和Quil ATM(皂苷)时自发形成的尺寸为30-40nm的带负电荷的笼状结构的脂质体递送。在多种感染(包括弓形虫病和爱泼斯坦-巴尔病毒诱导的肿瘤)实验模型中，使用 ISCOMSTM作为抗原的递送媒介物，已产生保护性免疫(Mowat和Donachie，Immunol.Today 12：383，1991)。已发现囊封在ISCOMSTM中的低至1μg剂量的抗原产生I类介导的CTL反应(Takahashi等，Nature 344：873，1990)。
在使用核酸用于免疫化的另一种方法中，也可通过减毒的病毒宿主或载体或细菌载体来表达所公开的抗原。可以使用重组牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、反转录病毒、巨细胞病毒或其他病毒载体来表达肽或蛋白质，从而引起CTL反应。例如，可用于免疫化方案中的牛痘载体和方法描述于美国专利No.4,722,848中。BCG(卡介苗)提供用于表达肽的另一种载体(参见Stover，Nature 351：456-460，1991)。
在一个实施方案中，将编码所公开的PreF抗原的核酸直接引入细胞中。例如，可以通过标准方法将核酸装载到金微球上并且通过装置如Bio-Rad的HELIOSTM基因枪引入皮肤中。所述核酸可以是“裸的”，由在强启动子控制下的质粒组成。通常，将DNA注射入肌肉中，但其也可直接注射至其他位点，包括接近转移灶的组织。注射剂量通常是0.5μg/kg至约50mg/kg，并且通常是约0.005mg/kg至约5mg/kg(参见例如美国专利No.5,589,466)。
除了上文提供的治疗方法之外，可利用任何所公开的PreF抗原来产生抗原特异性免疫诊断试剂，例如，用于血清学监测。可以从任何本文所述的抗原来设计免疫诊断试剂。例如，在所公开的抗原的情况下，使用本文公开的分离抗原来监测RSV的血清抗体的存在，例如以检测RSV感染和/或特异性结合至RSV F蛋白的融合前构象的抗体的存在。
通常，所述方法包括使来自受试者的样品(例如但不限于来自受试者的血液、血清、血浆、尿液或痰液)与本文公开的一种或多种稳定在融合前构象的RSV F蛋白抗原接触，以及检测所述样品中的抗 体与所公开的免疫原的结合。可通过本领域技术人员已知的任何方式来检测结合，包括使用特异性结合来自样品的抗体的被标记的二次抗体。标记包括放射性标记、酶标记和荧光标记。
另外，融合前RSV F结合抗体的检测也允许受试者对于用待监测的所公开抗原进行免疫化的反应。在其他实施方案中，测定融合前RSV F抗体结合抗体的效价。可通过本领域技术人员已知的任何方式来检测结合，包括使用特异性结合来自样品的抗体的被标记的二次抗体。标记包括放射性标记、酶标记和荧光标记。在其他实施方案中，使用所公开的免疫原来分离受试者中存在的抗体或从受试者获得的生物样品。
.试剂盒
也提供试剂盒。例如，用于在受试者中治疗或预防RSV感染，或用于检测受试者血清中的RSV F蛋白融合前特异性抗体的存在的试剂盒。所述试剂盒通常将包括PreF抗原、或编码、表达或包括所述抗原的核酸或病毒载体中的一种或多种。
所述试剂盒可包括容器和在所述容器上或与所述容器相伴的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。所述容器可由多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器通常容纳包括所公开的PreF抗原、或编码、表达或包括所述抗原的核酸或病毒载体中的一种或多种的组合物，其可有效用于治疗或预防RSV感染。在若干实施方案中，所述容器可具有无菌存取口(例如所述容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。所述标签或包装插页指示所述组合物用于治疗特定病状。
标签或包装插页通常还将包括例如在治疗或预防RSV感染的方法中使用PreF抗原、或编码、表达或包括所述抗原的核酸或病毒载体的说明书。包装插页通常包括照例包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症的信息和/ 或关于使用这种治疗产品的警告。说明材料可以电子形式书写(例如计算机软盘或光盘)或者可为可视的(例如视频文件)。所述试剂盒还可包括其他组件以促进关于试剂盒设计的特定应用。所述试剂盒可另外包括通常用于实施特定方法的缓冲液和其他试剂。这些试剂盒和适当内含物是本领域技术人员众所周知的。
.某些实施方案
其他实施方案公开于2013年8月8日提交的优先美国临时申请No.61/863,909的第135-158页上的章节H中，所述文献特定地以全文引用的方式并入本文中。
条款1.一种分离免疫原，其包含：
重组RSV F蛋白或其片段，其相比于天然RSV F蛋白包含至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代将所述重组RSV F蛋白稳定在融合前构象，所述重组RSV F蛋白特异性结合于RSV F融合前特异性抗体，并且其中所述抗体不会特异性结合于呈融合后构象的RSV F蛋白。
条款2.所述免疫原在20℃下在磷酸盐缓冲盐水中在生理pH下在不存在所述抗体的情况下温育至少24小时后特异性结合于所述抗体。
条款3.如条款1或条款2所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段的所述融合前构象包含特异性结合于所述融合前特异性抗体的抗原位点
Figure BDA0000844346390001841
，并且其中所述抗原位点
Figure BDA0000844346390001842
包含如SEQ ID NO：1-184中的一个所示的天然RSV F蛋白序列的残基62-69和196-209。
条款4.如条款1-3中任一项所述的免疫原，其中所述免疫原特异性结合于D25、AM22、5C4或MPE8融合前特异性抗体。
条款5.如条款1-4中任一项所述的免疫原，其中所述天然RSV F 蛋白是人类亚型A、人类亚型B或牛RSV F蛋白。
条款6.如条款1-5中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段包含F1多肽和F2多肽，并且任选地不包含pep27多肽或其部分。
条款7.如条款6所述的免疫原，其中所述F2和F1多肽分别包含RSV F位置62-69和196-209，并且其中：
所述F2多肽包含RSV F位置26-109的8-84个残基或由RSV F位置26-109的8-84个残基组成；和
所述F1多肽包含RSV F位置137-529的14-393个残基或由RSV F位置137-529的14-393个残基组成，
其中所述RSV F位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款8.如条款7所述的免疫原，其中所述F2多肽的C端残基和所述F1多肽的N端残基分别包含RSV F位置97和137；97和145；97和150；102和144；102和145；102和146；102和147；103和144；103和145；103和146；103和147；104和144；104和145；104和146；104和147；105和144；105和145；105和146；105和147；或105和150。
条款9.如条款7所述的免疫原，其中所述F2和F1多肽分别包含以下RSV F位置或由以下RSV F位置组成：26-109和137-513；26-107和137-513；26-107和145-513；26-105和137-513；26-105和145-513；26-103和145-513；26-109和137-529；26-107和137-529；26-107和145-529；26-105和137-529；26-105和145-529；26-103和145-529；46-103和147-310；46-104和146-310；50-96和149-306；51-103和146-307；51-103和139-307；50-105和146-306；或53-97和148至305-320中的一个。
条款10.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含F2多肽和F1多肽或由F2多肽和F1多肽组成，所述F2多肽和F1多肽包含分别与如SEQ ID NO：1-184中的任一个所示的天然RSV F蛋白序列的氨基酸26-103和145-310具有至少80％同一性的氨基酸序列。
条款11.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含F2多肽和F1多肽或由F2多肽和F1多肽组成，所述F2多肽和F1多肽包含分别与SEQ ID NO：124的氨基酸26-103和145-310具有至少80％同一性的氨基酸序列。
条款12.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含F2多肽和F1多肽或由F2多肽和F1多肽组成，所述F2多肽和F1多肽包含分别与SEQ ID NO：124的氨基酸26-103和145-513具有至少80％同一性的氨基酸序列。
条款13.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含F2多肽和F1多肽或由F2多肽和F1多肽组成，所述F2多肽和F1多肽包含分别与SEQ ID NO：124的氨基酸26-103和145-529具有至少80％同一性的氨基酸序列。
条款14.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含F2多肽和F1多肽或由F2多肽和F1多肽组成，所述F2多肽和F1多肽包含分别与SEQ ID NO：124的氨基酸26-103和145-551具有至少80％同一性的氨基酸序列。
条款15.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白是单链RSVF蛋白并且所述F2和F1多肽是通过异源肽连接子连接的，或直接连接的。
条款16.如条款15所述的免疫原，其中
所述F2多肽的位置105通过Gly-Ser连接子连接至所述F1多肽 的位置145；或
所述F2多肽的位置103直接连接至所述F1多肽的位置145。
条款17.如条款16或条款16所述的免疫原，其中所述异源肽连接子包含如SEQ IDNO：356-365或1443-1453中的一个所示的氨基酸序列，或者是G、S、GG、GS、SG、GGG或GSG连接子。
条款18.如前述条款中任一项所述的分离免疫原，其中所述重组RSV F蛋白是通过以下而稳定在所述RSV F蛋白融合前构象：
(a)一对半胱氨酸之间的第一二硫键；
(b)填充空腔的氨基酸取代；
(c)改装氨基酸取代；
(d)N连接的糖基化位点；
(e)(a)-(d)中的两个或更多个的组合；或
(f)(a)与(b)的组合。
条款19.如条款18所述的分离免疫原，其中所述半胱氨酸对包含第一半胱氨酸和第二半胱氨酸，并且其中
所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸在所述F1多肽的位置137-216中；
所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸在所述F1多肽的位置461-513中；或
所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸分别在所述F1多肽的位置137-216和461-513中；和
其中所述氨基酸位置对应于如SEQ ID NO：124所示的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款20.如条款18所述的免疫原，其中所述第一半胱氨酸是通过氨基酸取代在RSVF位置137-216中的一个上而引入的，并且所述第二半胱氨酸是通过氨基酸取代在RSV F位置271-460中的一个上而引入的。
条款21.如条款19或条款20所述的免疫原，其中所述半胱氨酸对包含第一半胱氨酸和第二半胱氨酸，各自包含Cα碳和C碳，并且其中：
(a)所述第一半胱氨酸是通过氨基酸取代在RSV F位置137-216或461-513中的一个上而引入的，并且所述第二半胱氨酸是通过氨基酸取代在RSV F位置26-61、77-97或271-460中的一个上而引入的；和
(b)在通过表1中提供的结构坐标所示的三维结构中，使用每个Cβ碳的最佳旋转异构体，所述第一半胱氨酸的位置的Cα碳距所述第二半胱氨酸的位置的Cα碳为2.0-8.0埃，和/或所述第一半胱氨酸的位置的Cβ碳距所述第二半胱氨酸的位置的Cβ碳为2.0-5.5埃。
条款22.如条款19或条款20所述的免疫原，其中所述半胱氨酸对包含第一半胱氨酸和第二半胱氨酸，各自包含Cα碳和C碳，并且其中：
(a)所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸是通过氨基酸取代在RSV F位置137-216或RSV F位置461-513上而引入的；或所述第一半胱氨酸是通过氨基酸取代在RSV F位置137-216上而引入的，并且所述第二半胱氨酸是通过氨基酸取代在RSV F位置461-513上而引入的；和
(b)在通过表1中提供的结构坐标所示的三维结构中，使用每个 Cβ碳的最佳旋转异构体，所述第一半胱氨酸的位置的Cα碳距所述第二半胱氨酸的位置的Cα碳为2.0-8.0埃，和/或所述第一半胱氨酸的位置的Cβ碳距所述第二半胱氨酸的位置的Cβ碳为2.0-5.5埃。
条款23.如条款18所述的免疫原，其中所述二硫键包含原体内或原体间二硫键。
条款24.如条款23所述的免疫原，其中所述非天然二硫键包含
RSV F位置155与290；151与288；137与337；397与487；138与353；341与352；403与420；319与413；401与417；381与388；320与415；319与415；331与401；320与335；406与413；381与391；357与371；403与417；321与334；338与394；288与300；60与194；33与469；54与154；59与192；46与311；48与308；或30与410之间的原体内二硫键；
RSV F位置400与489；144与406；153与461；149与458；143与404；346与454；399与494；146与407；374与454；369与455；402与141；74与218；183与428之间的原体间二硫键，并且所述重组RSV F蛋白包含位置182/183；183与428之间的G插入，并且所述重组RSV F蛋白包含位置427/428；145与460之间的C插入，并且所述重组RSV F蛋白包含位置146/147；183与423之间的AA插入，并且所述重组RSV F蛋白包含位置182/183；或330与430之间的AAA插入，并且所述重组RSV F蛋白包含位置329/330之间的CAA插入；
RSV F位置155与290之间的原体内二硫键，并且其中所述重组RSV F蛋白还包含RSV F位置74与218；141与402；146与460之间的非天然二硫键，和位置460/461；345与454之间的G插入，和位置453/454；374与454之间的C插入，和位置453/454；239与279之间的C插入，和位置238/239；330与493之间的C插入，和位置329/330；183与428之间的C插入，和位置182/183；或183与428 之间的G插入，和位置427/428之间的C插入。
条款25.如条款23所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含：
所述原体内二硫键，和以下组取代中的一个或多个：S155C和S290C；G151C和I288C；F137C和T337C；T397C和E487C；L138C和P353C；W341C和F352C；S403C和T420C；S319C和I413C；D401C和Y417C；L381C和N388C；P320C和S415C；S319C和S415C；N331C和D401C；P320C和T335C；V406C和I413C；L381C和Y391C；T357C和N371C；S403C和Y417C；L321C和L334C；D338C和K394C；I288C和V300C；E60C和D194C；Y33C和V469C；T54C和V154C；I59C和V192C；S46C和T311C；L48C和V308C；E30C和L410C；或
所述原体间二硫键，和以下组取代中的一个或多个：T400C和D489C；V144C和V406C；A153C和K461C；A149C和Y458C；G143C和S404C；S346C和N454C；K399C和Q494C；S146C和I407C；T374C和N454C；T369C和T455C；或V402C和L141C；A74C和E218C；S155C、S290C、L141C和V402C；S155C、S290C、A74C和E218C；N183C和N428C，和位置182/183之间的G插入；N183C和N427G，和位置427/428之间的C插入；S145C和460C；和位置146/147之间的AA插入；N183C和K423C，和位置182/183之间的AAA插入；A329C和S430C，和位置329/330之间的CAA插入；或
RSV F位置155与290之间的原体内二硫键和另外的非天然二硫键、S155C和S290C取代，和以下组氨基酸取代中的一个或多个：S146C和N460C，和位置460/461之间的G插入；N345C和N454G，和位置453/454之间的C插入；T374C和N454G，和位置453/454之间的C插入；S238G和Q279C，和位置238/239之间的C插入；和S493C，和位置329/330之间的C插入；N183C和N428C；和位置 182/183之间的G插入；或N183C和N427G；和位置427/428之间的C插入。
条款26.如条款23所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含
包含以SEQ ID NO：185、189、201、202、205、207、209、213、244、245、247、257-262、264-275、277-282、284、296-299、302、303、338-340中的一个的残基137-513示出的氨基酸序列的F1多肽；或
包含以SEQ ID NO：190、211、212、243、246、263、276、283、285中的一个的分别地残基26-109和137-513示出的氨基酸序列的F2多肽和F1多肽，
其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款27.如条款23所述的免疫原，其中所述非天然二硫键包含在RSV F位置155与290之间的原体内二硫键。
条款28.如条款23所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含S155C和S290C取代。
条款29.如条款23所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：185的残基26-109和137-513、残基26-103和145-513、或残基26-105和145-513的至少80％同一性。
条款30.如条款18-29中任一项所述的免疫原，其包含填充空腔的氨基酸取代，所述氨基酸取代包含在位置190、位置207、或位置190和207的F、L、W、Y、H或M取代。
条款31.如条款18-29中任一项所述的免疫原，其包含填充空腔的氨基酸取代，所述氨基酸取代包含以下中的一个：190F；190L；190W；190Y；190H；190M；190F和207L；190F和207F；190F和207W；190L和207L；190L和207F；190L和207W；190W和207L；190W和207F；190W和207W；190Y和207L；190Y和207F；190Y和207W；190H和207L；190H和207F；190H和207W；190M和207L；190M和207F；190M和207W；207L和220L；296F和190F；220L和153W；203W；83W和260W；58W和298L；或87F和90L。
条款32.如条款31所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含SEQ ID NO：191、193、196-197或248、或371-376中的一个的位置137-513，或SEQ ID NO：192、195或194中的一个的位置26-109和137-513。
条款33.如条款30所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：191的残基26-109和137-513、残基26-103和145-513、或残基26-105和145-513的至少80％同一性。
条款34.如条款18所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含在位置155和290的半胱氨酸取代之间的非天然二硫键，和在位置190、位置207或位置190和207的填充空腔的F、L、W、Y、H或M取代。
条款35.如条款18所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代。
条款36.如条款18所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：185(DS，亚型A)、371(DS-Cavl，亚型A)、372(DSCavl，亚型B)、373(DSCavl，牛)、374(DS S190F，亚型A)、375(DS， S190F，亚型B)或376(DS，S190F，牛)的分别地残基26-109和137-513、或分别地26-103和145-513、或分别地26-105和145-513的至少80％同一性。
条款37.如条款18所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白通过改装氨基酸取代而稳定在所述RSV F蛋白融合前构象，其中所述F1多肽包含如下中的一个所示的氨基酸取代：64L、79V、86W、193V、195F、198F、199F、203F、207L和214L；64L、79L、86W、193V、195F、198F、199F、203F和214L；64W、79V、86W、193V、195F、198F、199F、203F、207L和214L；79V、86F、193V、195F、198F、199F、203F、207L和214L；64V、79V、86W、193V、195F、198F、199Y、203F、207L和214L；64F、79V、86W、193V、195F、198F、199F、203F、207L和214L；64L、79V、86W、193V、195F、199F、203F、207L和214L；56I、58I、164I、171I、179L、181F、187I、291V、296I和298I；56I、58I、164I、179L、189F、291V、296I和298I；56L、58I、158W、164L、167V、171I、179L、181F、187I、291V和296L；56L、58I、158Y、164L、167V、187I、189F、291V和296L；56I、58W、164I、167F、171I、179L、181V、187I、291V和296I；56I、58I、64L、79V、86W、164I、179L、189F、193V、195F、198F、199F、203F、207L、214L、291V、296I和298I；56I、58I、79V、86F、164I、179L、189F、193V、195F、198F、199F、203F、207L、214L、291V、296I和298I；56I、58W、64L、79V、86W、164I、167F、171I、179L、181V、187I、193V、195F、198F、199F、203F、207L、214L、291V和296I；56I、58W、79V、86F、164I、167F、171I、179L、181V、187I、193V、195F、198F、199F、203F、207L、214L、291V和296I；486N、487Q、489N和491A；486H、487Q和489H；400V、486L、487L和489L；400V、486I、487L和489I；400V、485I、486L、487L、489L、494L和498L；400V、485I、486I、487L、489I、494L和498L；399I、400V、485I、486L、487L、489L、494L、497L和498L；399I、400V、485I、486I、487L、489I、494L、497L和498L；375W、391F 和394M；375W、391F和394W；375W、391F、394M、486N、487Q、489N和491A；375W、391F、394M、486H、487Q和489H；375W、391F、394W、486N、487Q、489N和491A；375W、391F、394W、486H、487Q和489H；375W、391F、394M、400V、486L、487L、489L、494L和498M；375W、391F、394M、400V、486I、487L、489I、494L和498M；375W、391F、394W、400V、486L、487L、489L、494L和498M；375W、391F、394W、400V、486I、487L、489I、494L和498M；137W和339M；137W和140W；137W、140W和488W；486N、487Q、489N、491A和488W；486H、487Q、489H和488W；400V、486L、487L、489L和488W；400V、486I、487L、489I和488W；486N、487Q、489N、491A、137W和140W；486H、487Q、489H、137W和140W；400V、486L、487L、489L、137W和140W；375W、391F、394M、137W和140W；或375W、391F、394M、137W、140W和339M取代；并且其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124所示的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款38.如条款37所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白通过改装氨基酸取代而稳定在所述RSV F蛋白融合前构象，其中所述F1多肽包含如下中的一个中所示的氨基酸取代：I64L、I79V、Y86W、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L和I214L；I64L、I79L、Y86W、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F和I214L；I64W、I79V、Y86W、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L和I214L；I79V、Y86F、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L和I214L；I64V、I79V、Y86W、L193V、L195F、Y198F、I199Y、L203F、V207L和I214L；I64F、I79V、Y86W、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L和I214L；I64L、I79V、Y86W、L193V、L195F、I199F、L203F、V207L和I214L；V56I、T58I、V164I、L171I、V179L、L181F、V187I、I291V、V296I和A298I；V56I、T58I、V164I、V179L、T189F、I291V、V296I和A298I；V56L、T58I、L158W、V164L、I167V、L171I、V179L、L181F、V187I、I291V和V296L；V56L、T58I、L158Y、V164L、I167V、 V187I、T189F、I291V和V296L；V56I、T58W、V164I、I167F、L171I、V179L、L181V、V187I、I291V和V296I；V56I、T58I、I64L、I79V、Y86W、V164I、V179L、T189F、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、I214L、I291V、V296I和A298I；V56I、T58I、I79V、Y86F、V164I、V179L、T189F、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、I214L、I291V、V296I和A298I；V56I、T58W、I64L、I79V、Y86W、V164I、I167F、L171I、V179L、L181V、V187I、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、I214L、I291V和V296I；V56I、T58W、I79V、Y86F、V164I、I167F、L171I、V179L、L181V、V187I、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、I214L、I291V和V296I；D486N、E487Q、D489N和S491A；D486H、E487Q和D489H；T400V、D486L、E487L和D489L；T400V、D486I、E487L和D489I；T400V、S485I、D486L、E487L、D489L、Q494L和K498L；T400V、S485I、D486I、E487L、D489I、Q494L和K498L；K399I、T400V、S485I、D486L、E487L、D489L、Q494L、E497L和K498L；K399I、T400V、S485I、D486I、E487L、D489I、Q494L、E497L和K498L；L375W、Y391F和K394M；L375W、Y391F和K394W；L375W、Y391F、K394M、D486N、E487Q、D489N和S491A；L375W、Y391F、K394M、D486H、E487Q和D489H；L375W、Y391F、K394W、D486N、E487Q、D489N和S491A；L375W、Y391F、K394W、D486H、E487Q和D489H；L375W、Y391F、K394M、T400V、D486L、E487L、D489L、Q494L和K498M；L375W、Y391F、K394M、T400V、D486I、E487L、D489I、Q494L和K498M；L375W、Y391F、K394W、T400V、D486L、E487L、D489L、Q494L和K498M；L375W、Y391F、K394W、T400V、D486I、E487L、D489I、Q494L和K498M；F137W和R339M；F137W和F140W；F137W、F140W和F488W；D486N、E487Q、D489N、S491A和F488W；D486H、E487Q、D489H和F488W；T400V、D486L、E487L、D489L和F488W；T400V、D486I、E487L、D489I和F488W；D486N、E487Q、D489N、S491A、F137W和F140W；D486H、E487Q、D489H、F137W和F140W；T400V、D486L、E487L、D489L、F137W 和F140W；L375W、Y391F、K394M、F137W和F140W；或L375W、Y391F、K394M、F137W、F140W和R339M；并且其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款39.如条款38所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白通过改装氨基酸取代而稳定在所述RSV F蛋白融合前构象，其中所述F1多肽包含SEQ ID NO：227-242、249-256、286-295或326-337中的一个的位置137-513。
条款40.如条款18-39中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白通过N连接的糖基化位点而稳定在所述RSV F蛋白融合前构象，其中所述N连接的糖基化位点处于F1多肽位置506、175、178、276、476、185、160、503、157中的一个，或其中两个或更多个的组合，其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款41.如条款40所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含以下中的一个：(a)I506N和K508T；(b)A177S；(c)V178N；(d)V278T；(e)Y478T；(f)V185N和V187T；(g)L160N和G162S；(h)L503N和F505S；(i)V157N；(j)或(a)-(j)中的两个或更多个的组合；并且其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款42.如条款41所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白通过N连接的糖基化位点而稳定在所述RSV F蛋白融合前构象，并且其中所述F1多肽包含SEQ ID NO：198-200、203-204、214-217中的一个的位置137-513。
条款43.如条款18中任一项所述的免疫原，其中稳定在所述RSV F蛋白融合前构象的所述重组RSV F蛋白包含以下中的一个所示的氨基酸取代：S238C和E92C；L193C和I59C；I59C和L297C；L297C和I292C；K176C和S190C；T189C和A177C；T58C和K191C；A424C 和V450C；L171C和K191C；K176C和S190C；K77C和I217C；K427C和D448C；G151C和N302C；G151C和V300C；T189C和V56C；L171C和K191C；L230F；L158F；L230F和L158F；L203F；V187F；Y198F；Y198W；L204F；Y53F和L188F；V187F和L203F；Y198F和L203F；L141W；L142F；L142W；V144F；V144W；V90F；L83F；V185F和T54A；I395F；V90F、V185F和T54A；L83F和V90F；L83F、V185F和T54A；L230F、V90F和I395F；I395F、V185F和T54A；L203F、V90F、L230F、L158F、S509F、I395F、V185F和T54A；I221Y；F140W；F137W；S190L和V192L；V187F、S190L和V192L；V187L、S190L和V192L；V185F、V187L、S190L和V192L；V154L、V157L、V185L和V187L；V154L、V185L和V187L；V187F；T58LA298L；T58L、V154L、V185L、V187L和A298L；Y458W；L158F和I167A；L158W和I167A；L158F；L158W；V56L、I167L和A298L；V56L、I167L和A298M；V56L和A167L；I167F；I167M；V154F；V56L、I167L、A298L和V154F；I199L、L203F；I199L、L203F、P205Q和I206T；I199L、L203F、P205E和I206K；I199L、L203F和V207F；I199L、L203F、P205Q、I206T和V207F；I199L、L203F、P205E、I206K和V207F；I199L、L203F和L83F；I199L、L203F、P205Q、I206T和L83F；I199L、L203F、P205E、I206K和L83F；I199L、L203F、S190L和V192L；I199L、L203F、P205Q、I206T、V187F和S190L、V192L；S55A、S190M、L203F、V207I和V296I；Y53F、S55A、K176I、S190L、V207I、S259L、D263L和V296I；L158F、V207M和V296I；V56L、V207M和V296I；V56L、V207I和V296I；V56I、V207M和V296I；V154L、V207M和V296I；Y198F、V207I、T219W和V296I；Y198F、V207I、T219I和V296I；Y198F、V207M、T219W和V296I；198F、V207M、T219I和V296I；Y198F、V207M、T219L和V296I；S190Y；S190W；I206F、V207M、T219V和V296I；Y198F、V207M、T219L和K226M；Y198F、V207M、T219L和K226W；Y198F、V207M、T219L和K226L；L158F、L203F、V207I和V296I；F488W；F488R；V207L；S190F；S190M；L503E、I506K和S509F；L503E、I506K、 S509F和F505W；L503E、I506K、S509F、L230F和L158F；Q279C和S238C；Q501F；E82V、V207M、N227L和V296I；E82V、V207I、N227L和V296I；L158F、Y198F、V207M、S215G、N216P和T219L；L158F、Y198F、V207M、S213G、S215G和T219L；V56L、E82V、L203F、V207M、N227L、L230F和V296I；E82V、L158F、L203F、V207M、N227L、L230F和V296I；E82V、L203F、V207M、K226M、N227L、L230F和V296I；或L203F、V207I、S180C、S186C和V296I；
其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款44.如条款18所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含
S155C和S290C取代，并且还包含以下组取代之一：L513C、514E和515C；L513C、514E、515E和516C；L512C、513E和514C；或L512C、513E、514E和515C；
S155C、S290C和S190F取代，并且还包含以下组取代之一：F488W、L513C、A514E和I515C；F488W、L513C、A514E、G515E和516C；F488W、L512C、L513E和A514C；F488W、L512C、L513E、A514E和G515C；A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L513C、A514E和I515C；A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L513C、A514E、G515E和516C；A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L512C、L513E和A514C；A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L512C、L513E、A514E和G515C；K77C、I217C、A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L513C、L514E和A515C；K77C、I217C、A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L513C、L514E和A515E；K77C、I217C、A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L512C、L513E和A514C；或K77C、I217C、A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L512C、L513E、A514E和G515C；
S155C、S290、S190F和V207L取代，并且还包含以下组取代之一：L503E和I506K；L503E、I506K和F505W；L503E、I506K、L230F和L158F；L503E、I506K、S509F、F505W、L230F和L158F；L160K、V178T、L258K、V384T、I431S和L467Q；F477K、L481Q、V482K、L503Q和I506K；L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、L467Q、F477K、L481Q、V482K、L503Q和I506K；L512C和L513C；L512C、L513C、L160K、V178T、L258K、V384T、I431S和L467Q；L512C、L513C、F477K、L481Q、V482K、L503Q和I506K；L512C、L513C、L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、L467Q、F477K、L481Q、V482K、L503Q和I506K；F505W；F505W、L160K、V178T、L258K、V384T、I431S和L467Q；F505W、F477K、L481Q、V482K、L503Q和I506K；F505W、L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、L467Q、F477K、L481Q、V482K、L503Q和I506K；L512C、L513C和F505W；L512C、L513C、F505W、L160K、V178T、L258K、V384T、I431S和L467Q；L512C、L513C、F505W、F477K、L481Q、V482K、L503Q和I506K；L512C、L513C、F505W、L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、L467Q、F477K、L481Q、V482K、L503Q和I506K；I506K、S509F、L83F和V90F；I506K、S509F、L83F、V90F、L230F和L158F；I506K、S509F、F505W、L83F、V90F、L230F、V185F和T54A；L83F、V90F、L230F和I395F；I506K、S509F、F505W、L83F、V90F、L230F、L158F、I395F、V185F和T54A；L512C和L513C；或486DEF至CPC，其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款45.如条款18所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白稳定在所述RSV F蛋白融合前并且包含如SEQ ID NO：338-433、434-544、672-682中的一个的分别地位置26-109和137-513所示的氨基酸序列的F2和F1多肽。
条款46.如条款1-18中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含以下中的一个所示的氨基酸取代：
表5b的第1-16行(较新的链间二硫键)；
表6b的第1-84行(较新的填充空腔)；
表8b的第1-54行(与DSCav-1的较新组合)；或
表8c的第1-13行(较新的填充空腔+替代暴露的疏水残基)；和
其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款47.如条款1-18中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白是单链蛋白并且包含与SEQ ID NO：698-828或1474-1478中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。
条款48.如条款1-18中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白是单链蛋白并且包含与SEQ ID NO：698-828或1474-1478中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列，任选地不具有相应SEQ ID NO中列出的蛋白质标签或前导序列。
条款49.如条款1-18中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含三聚化结构域，其进一步包含在折叠子结构域与所述重组RSV F蛋白之间的蛋白酶裂解位点。
条款50.如条款1-18中任一项所述的免疫原，其中重组RSV F蛋白包含表23的行中列出的氨基酸取代，其对应于SEQ ID NO：829-1025中的一个。
条款51.如条款1-18中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含表23的行中列出的氨基酸取代，其对应于SEQ ID NO：969-1025中的一个。
条款52.如条款1-18中任一项所述的免疫原，其中所述免疫原 包含以下氨基酸取代中的一个或多个：DSCav1-F137C和R339C；DSCav1-F137C和T337C；DSCav1-G139C和Q354C；F137C、R339C；F137C、T337C；G139C、Q354C；L260F；L260W；L260Y；L260R；L188F；L188W；L188Y；L188R；I57F；I57W；I57R；L252F；L252W；L252R；V192F；V192W；V192R；S150C和Y458C；A149C和N460C；S146C和N460C；A149C和Y458C；V220F；V220W；V220M；T219F；T219M；T219W；T219R；I221F；I221Y；I221W；Q224D和L78K；V278F、Q279F、N277D和S99K；Q361F；V402F；T400F；T400W；H486F；H486W；I217F；I217Y；I217W；F190V；K226L；T58I和A298M；F190V和K226L；F190V和T58I、A298M；K226L、T58I和A298M；T58I、A298M、F190V和K226L，并且任选地进一步包含S155C和S290C取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代。
条款53.如条款1-18中任一项所述的免疫原，其中所述免疫原包含与SEQ ID NO：829-1025中的一个的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，任选地不具有相应SEQ ID NO中列出的蛋白质标签或前导序列。
条款54.如条款53中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含三聚化结构域，其进一步包含折叠子结构域与所述重组RSV F蛋白之间的蛋白酶裂解位点。
条款55.如条款1-18中任一项所述的免疫原，其中重组RSV F蛋白包含表24的行中列出的氨基酸取代，其对应于SEQ ID NO：901-968中的一个。
条款56.如条款1-18中任一项所述的免疫原，其中所述免疫原包含与SEQ ID NO：901-968中的一个的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，任选地不具有相应SEQID NO中列出的蛋白质标签或前导序列。
条款57.如条款7所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或 其片段包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与如SEQ ID NO：1-184中的任一个中所示的以下RSV F2和F1位置具有至少80％同一性：
(a)分别地56-97和189-211；(b)分别地58-97和192-242；(c)分别地59-97和194-240；(d)分别地60-75和193-218；(e)分别地60-94和192-229；(f)分别地60-94和192-232；(g)分别地60-94和193-237；(h)分别地60-95和192-240；(i)分别地60-96和192-239；(j)分别地60-97和192-242；(k)分别地60-97和194-239；(1)分别地61-96和192-235；(m)分别地61-96和192-240；(n)分别地62-69和196-209；或(o)(a)-(m)中的任一个中列出的F2和F1位置的环状排列，其中所述RSV F2和F1位置是通过异源连接子接合的。
条款58.如条款7所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与如SEQ ID NO：1-184中的任一个中所示的以下RSV F2和F1位置具有至少80％同一性：
(a)分别地46-103和147-310；(b)分别地46-104和146-310；(c)分别地50-96和149-306；(d)分别地51-103和146-307；(e)分别地51-103和139-307；(f)分别地50-105和146-306；(g)分别地53-97和148至305-320中的一个；(h)(a)-(g)中的任一个中列出的F2和F1位置的环状排列，其中所述RSV F2和F1位置是通过异源连接子接合的或直接连接的。
条款59.如条款57或58所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段包含表20中列出的最小位点
Figure BDA0000844346390002021
免疫原中的任一个的氨基酸序列。
条款60.如条款57或58所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段包含与SEQ ID NO：1027-1218中的一个的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
条款61.如条款57或58所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段包含与SEQ ID NO：1027-1218中的一个的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，任选地不具有相应SEQ ID NO中列出的蛋白质标签或前导序列。
条款62.如条款58-61中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含
在位置155和290的半胱氨酸取代，和在位置190、位置207、或位置190和207的F、L、W、Y、H或M取代。
条款63.如条款58-61中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含S155C和S290C取代；S155C、S290C和S190F取代；或S155C、S290C、S190F和V207L取代。
条款64.如条款58-61中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：1027-1218中的任一个的F1-连接子-F2序列或F2-连接子-F1序列。
条款65.如条款57-64中任一项所述的免疫原，其中所述异源连接子包含以下或由以下组成：以SEQ ID NO：1443-1455中的任一个所示的氨基酸序列，或G、S、GG、GS、SG、GGG或GSG连接子。
条款66.如前述条款中任一项所述的免疫原，其包含所述重组RSV F蛋白或其片段的多聚体。
条款67.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白连接至骨架蛋白。
条款68.如条款1-56中任一项所述的免疫原，其中所述F1多肽包含包括从RSV位置492至位置510-529中的一个的RSV α10螺旋，并且其中所述F1多肽包含形成非天然原体间二硫键的至少两个半胱氨酸取代。
条款69.如条款68所述的免疫原，其中所述F1多肽的位置512-524包含以CCHNVNAGKSTTN(SEQ ID NO：844的残基512-524)或CCHNVNACCSTTN(SEQ ID NO：849的残基X-Y)示出的氨基酸序列；或其中所述F1多肽的位置512-529包含以CCHNVNACCSTTNICCTT(SEQ ID NO：853的残基512-529)示出的氨基酸序列。
条款70.如前述条款中任一项所述的分离免疫原，其中所述重组RSV F蛋白还包含另一个二硫键，其包含在以下F1位置的一对交联半胱氨酸：
(a)486和487；
(b)512和513；
(c)519和520；
(d)526和527；
(e)486和487，其中所述F1多肽还包含在位置486与487之间的P插入；
(f)330和493；其中所述F1多肽还包含在位置329与330之间的C插入；或
(g)330和493；其中所述F1多肽还包含在位置329与330之间的C插入，和在位置492与493之间的G插入；
其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款71.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段或表位骨架蛋白连接至三聚化结构域。
条款72.如条款71所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白的所述F1多肽的C端连接至所述三聚化结构域。
条款73.如条款71或条款72所述的免疫原，其中所述三聚化结构域是折叠子结构域。
条款74.如条款71-73中任一项所述的免疫原，其还包含在所述F1多肽与所述三聚化结构域之间的蛋白酶裂解位点。
条款75.如条款74所述的免疫原，其还包含在所述蛋白酶裂解位点与所述三聚化结构域之间的跨膜结构域。
条款76.如条款75所述的分离免疫原，其中所述RSV F蛋白通过以下而稳定在所述F蛋白融合前构象
(a)二硫键，其中连接至所述折叠子结构域的所述F2多肽和所述F1多肽包含以SEQID NO：185、189、190、201、202、205、207、209、211、212、213、244、245、247、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、277、278、279、280、281、282、284、302、303、243、246、276、283、285、296、297、298或299中的任一个的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列；
(b)填充空腔的氨基酸取代，其中连接至所述折叠子结构域的所述F2多肽和所述F1多肽包含以SEQ ID NO：191、193、196、197、248、192、195或194中的任一个的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列；
(c)改装氨基酸取代，其中连接至所述折叠子结构域的所述F2多肽和所述F1多肽包含以SEQ ID NO：249、250、251、252、253、254、255、256、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336或337中的任一个的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列；或
(d)N连接的糖基化位点，其中连接至所述折叠子结构域的所述F2多肽和所述F1多肽包含以选自SEQ ID NO：198、199、200、203、204、214、215、216或217的SEQ ID NO中的任一个的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列；
(e)二硫键和填充空腔的取代，其中连接至所述折叠子结构域的所述F2多肽和所述F1多肽包含以选自SEQ ID NO：371、372、373、374、375、376的SEQ ID NO中的任一个的分别地位置26-109和137-544所示的氨基酸序列；和
其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款77.如条款75所述的分离免疫原，其中连接至所述折叠子结构域的所述F2多肽和所述F1多肽包含以SEQ ID NO：552；553；554；555；556；557；558；559；560；561；562；563；564；565；566；567；568；569；570；571；572；573；574；575；576；577；578；579；580；581；582；583；584；585；586；587；588；589；590；591；592；593；和601；683；684；685；686；687；688；689；690；691；692；或693中的任一个的分别地位置26-109和137-548所示的氨基酸序列，
其中所述氨基酸位置对应于以SEQ ID NO：124所示的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款78.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段或表位骨架蛋白连接至蛋白质纳米粒子亚基。
条款79.如条款78所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段或表位骨架蛋白的C端连接至所述蛋白质纳米粒子亚基。
条款80.如条款78或条款79所述的免疫原，其中所述蛋白质纳米粒子亚基是铁蛋白、封装素、硫氧化还原酶(SOR)、2，4-二氧四氢 喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶纳米粒子亚基。
条款81.如条款78所述的免疫原，其中：
所述铁蛋白纳米粒子亚基包含与SEQ ID NO：350的残基517-679具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且在所述铁蛋白多肽中任选地包括C31S、C31A或C31V取代；
所述SOR亚基包含与SEQ ID NO：344或SEQ ID NO：345的残基516-825具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
所述2，4-二氧四氢喋啶合成酶亚基包含与SEQ ID NO：346或SEQ ID NO：348的残基517-670或SEQ ID NO：347的残基517-669具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；或
所述丙酮酸脱氢酶合成酶亚基包含与SEQ ID NO：349的残基516-757具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
条款82.如条款78所述的免疫原，其包含连接至铁蛋白亚基的单链RSV F蛋白，所述铁蛋白亚基包含与SEQ ID NO：827-828或1429-1442中的一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。
条款83.如条款78所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段连接至纳米粒子亚基，并且包含如表21中所列出的连接至蛋白质纳米粒子的最小位点
Figure BDA0000844346390002071
免疫原中的任一个的氨基酸序列。
条款84.如条款78所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段连接至纳米粒子亚基，其包含与SEQ ID NO：1219-1428中的一个的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
条款85.如条款78所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段连接至纳米粒子亚基并包含与SEQ ID NO：1219-1428中的一个的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，任选地不具有相 应SEQ ID NO中列出的蛋白质标签或前导序列。
条款86.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白在室温下在磷酸盐缓冲盐水中在生理pH下形成三聚体。
条款87.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中所述免疫原当在水溶液中温育时形成免疫原的均质群体，其中在如下条件之后，在所述溶液中温育的所述免疫原的至少70％、至少80％、至少90％和/或至少95％特异性结合于所述融合前特异性抗体：
(a)在50℃下，在350mM NaCl pH 7.0中温育一小时；
(b)在25℃下，在350mM NaCl pH 3.5中温育一小时；
(c)在25℃下，在350mM NaCl pH 10中温育一小时；
(d)在25℃下，在10mM摩尔渗透压浓度pH 7.0中温育一小时；
(e)在25℃下，在3000mM摩尔渗透压浓度pH 7.0中温育一小时；或
(f)在350mM NaCl pH 7.0中进行十次冷冻-解冻循环；或
(g)(a)-(f)中的两种或更多种的组合；其中
将所述免疫原在所述溶液中在不存在所述融合前特异性抗体的情况下温育。
条款88.如前述条款中任一项所述的免疫原，其中：
(a)所述重组RSV F蛋白或其片段不包括在RSV F位置481与489之间或在RSV F位置509与510之间的二硫键；
(b)所述重组RSV F蛋白或其片段不包括在RSV F位置481、489、509、510或其组合的半胱氨酸残基；
(c)(a)和(b)的组合。
条款89.如条款1-70中任一项所述的分离免疫原，其中所述F1多肽的C端连接至跨膜结构域。
条款90.如条款89所述的分离免疫原，其中跨膜结构域是RSV F跨膜结构域。
条款91.如条款89或90所述的分离免疫原，其中所述跨膜结构域的C端连接至RSVF胞质域。
条款92.如前述条款中任一项所述的分离免疫原，其中所述免疫原不是通过非特异性交联而稳定在所述融合前构象。
条款93.一种病毒样粒子，其包含如条款1-70中任一项所述的免疫原。
条款94.一种蛋白质纳米粒子，其包含如条款1-85中任一项所述的免疫原。
条款95.如条款94所述的蛋白质纳米粒子，其中所述蛋白质纳米粒子是铁蛋白纳米粒子、封装素纳米粒子、硫氧化还原酶(SOR)纳米粒子、2，4-二-氧四氢喋啶合成酶纳米粒子或丙酮酸脱氢酶纳米粒子。
条款96.如条款1-92中任一项所述的免疫原，其中单克隆抗体D25或AM22的Fab以1μM或更小的Kd特异性结合于所述免疫原、所述病毒样粒子或所述蛋白质纳米粒子。
条款97.如条款1-85中任一项所述的分离免疫原，其中所述免疫原包含D25表位，其包含在不存在单克隆抗体D25的情况下可以在结构上叠加在如通过表1中所示的原子坐标所定义的与单克隆抗体D25复合的包含SEQ ID NO：370的残基62-69和196-209的D25表位的三维结构上的三维结构，其中其坐标的均方根差(RMSD)小于
Figure BDA0000844346390002101
/残基，其中对于至少三个连续氨基酸在多肽主链原子N、Cα、C、O上测量所述RMSD。
条款98.一种核酸分子，其编码如条款1-92中任一项所述的分离免疫原。
条款99.如条款98所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码所述免疫原的前体蛋白。
条款100.如条款99所述的核酸分子，其中所述前体蛋白从N端至C端包含信号肽、F2多肽、Pep27多肽和F1多肽。
条款101.如条款100所述的核酸分子，其中所述Pep27多肽包含以SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置110-136示出的氨基酸序列，其中所述氨基酸位置对应于如SEQID NO：124所示的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款102.如条款101所述的核酸分子，其中所述信号肽包含以SEQ ID NO：1-184或370中的任一个的位置1-25示出的氨基酸序列，其中所述氨基酸位置对应于如SEQ ID NO：124所示的参考F0多肽的氨基酸序列。
条款103.如条款99-102中任一项所述的核酸分子，其被密码子优化以在人类或牛细胞中表达。
条款104.如条款99-103中任一项所述的核酸分子，其可操作地连接至启动子。
条款105.一种载体，其包含如条款104所述的核酸分子。
条款106.如条款105所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
条款107.如条款106所述的病毒载体，其中所述病毒载体是牛副流感病毒载体、人类副流感病毒载体、新城疫病毒载体、仙台病毒 载体、麻疹病毒载体、减毒RSV载体、副粘病毒载体、腺病毒载体、α病毒载体、委内瑞拉马脑炎载体、塞姆利基(Semliki)森林病毒载体、辛德毕斯病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、弹状病毒载体、水疱性口炎病毒载体、小核糖核酸病毒载体或疱疹病毒载体。
条款108.如条款106所述的载体，其中所述载体是细菌载体。
条款109.如条款108所述的细菌载体，其中所述细菌载体是分枝杆菌载体、沙门氏菌载体、志贺氏菌载体、单增李斯特菌载体或乳杆菌载体。
条款110.如条款98-109中任一项所述的核酸分子或载体，其包含如SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：384、SEQ ID NO：385或SEQ ID NO：386所示的核苷酸序列。
条款111.一种分离的宿主细胞，其包含如条款105-110中任一项所述的载体。
条款112.一种免疫原性组合物，其包含有效量的如条款1-110中任一项所述的免疫原、病毒样粒子、蛋白质纳米粒子、核酸分子或载体；和药学上可接受的载体。
条款113.如条款112所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
条款114.如条款113所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是明矾、水包油组合物、MF59、AS01、AS03、AS04、MPL、QS21、CpG寡核苷酸、TLR7激动剂、TLR4激动剂或其中两种或更多种的组合。
条款115.如条款113所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂促进Th1免疫反应。
条款116.如条款112中任一项所述的免疫原性组合物，其还包 含特异性结合所述免疫原的RSV F融合前特异性抗体。
条款117.如条款112中任一项所述的免疫原性组合物，其包含基于RSV F蛋白A和B亚型的重组RSV F蛋白或其片段的混合物。
条款118.如条款117所述的免疫原性组合物，其中
所述人类A亚型RSV F蛋白包含S155C、S290C和S190F取代，并且所述人类B亚型RSVF蛋白包含S 155C、S290C和S190F取代；或
所述人类A亚型RSV F蛋白包含S155C、S290C、S190F和V207L取代，并且所述人类B亚型RSV F蛋白包含S155C、S290C、S190F和V207L取代。
条款119.一种在受试者中产生对RSV F的免疫反应的方法，其包括对所述受试者施用有效量的如条款112-118中任一项所述的免疫原性组合物以产生所述免疫反应。
条款120.如条款119所述的方法，其中所述免疫反应包含Th1免疫反应。
条款121.一种用于在受试者中治疗或预防RSV感染的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如条款112-120中任一项所述的免疫原性组合物，从而在所述受试者中治疗或预防RSV感染。
条款122.如条款119-121中任一项所述的方法，其包括所述免疫原性组合物的初免-加强施用。
条款123.如条款122所述的方法，其中所述初免和加强包括施用基于RSV F蛋白A和B亚型的重组RSV F蛋白或其片段或核酸分子或蛋白质纳米粒子的混合物。
条款124.一种用于检测或分离受试者中的RSV F结合抗体的方 法，其包括：
提供有效量的如条款1-110中任一项所述的免疫原、病毒样粒子、蛋白质纳米粒子、核酸分子或载体；
使来自所述受试者的生物样品与所述重组RSV F蛋白或所述蛋白质纳米粒子在足以形成所述重组RSV F蛋白或所述蛋白质纳米粒子与所述RSV F结合抗体之间的免疫复合物的条件下接触；和
检测所述免疫复合物，从而检测或分离所述受试者中的所述RSV F结合抗体。
条款125.如条款119-124中任一项所述的方法，其中所述受试者处于RSV感染的风险下或具有RSV感染。
条款126.如条款125所述的方法，其中所述RSV感染是人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV感染。
条款127.如条款119-126中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类或兽医受试者。
条款129.一种试剂盒，其包含如条款1-110中任一项所述的免疫原、病毒样粒子、蛋白质纳米粒子、核酸分子或载体；和使用所述试剂盒的说明书。
如本文所用，提及：
“SEQ ID NO：1-184中的任一个”是指“SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、 SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ IDNO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ IDNO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ IDNO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ IDNO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ IDNO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ IDNO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ IDNO：143、 SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183或SEQ ID NO：184”。
“SEQ ID NO：698-828”是指“SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQ ID NO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：740、SEQ ID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ ID NO：750、SEQ ID NO：751、SEQ ID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQ ID NO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：756、SEQID NO：757、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：760、SEQ ID NO：761、SEQ ID NO：762、SEQ ID NO：763、SEQ ID NO：764、SEQ ID NO：765、SEQ ID NO：766、SEQ ID NO：767、SEQID NO：768、 SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：770、SEQ ID NO：771、SEQ ID NO：772、SEQ ID NO：773、SEQ ID NO：774、SEQ ID NO：775、SEQ ID NO：776、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：778、SEQID NO：779、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：781、SEQ ID NO：782、SEQ ID NO：783、SEQ ID NO：784、SEQ ID NO：785、SEQ ID NO：786、SEQ ID NO：787、SEQ ID NO：788、SEQ ID NO：789、SEQID NO：790、SEQ ID NO：791、SEQ ID NO：792、SEQ ID NO：793、SEQ ID NO：794、SEQ ID NO：795、SEQ ID NO：796、SEQ ID NO：797、SEQ ID NO：798、SEQ ID NO：799、SEQ ID NO：800、SEQID NO：801、SEQ ID NO：802、SEQ ID NO：803、SEQ ID NO：804、SEQ ID NO：805、SEQ ID NO：806、SEQ ID NO：807、SEQ ID NO：808、SEQ ID NO：809、SEQ ID NO：810、SEQ ID NO：811、SEQID NO：812、SEQ ID NO：813、SEQ ID NO：814、SEQ ID NO：815、SEQ ID NO：816、SEQ ID NO：817、SEQ ID NO：818、SEQ ID NO：819、SEQ ID NO：820、SEQ ID NO：821、SEQ ID NO：822、SEQID NO：823、SEQ ID NO：824、SEQ ID NO：825、SEQ ID NO：826、SEQ ID NO：827或SEQ ID NO：828中的任一个”。
“SEQ ID NO：1474-1478”是指“SEQ ID NO：1474、SEQ ID NO：1475、SEQ ID NO：1476、SEQ ID NO：1477或SEQ ID NO：1478中的任一个”。
“SEQ ID NO：829-1025”是指“SEQ ID NO：829、SEQ ID NO：830、SEQ ID NO：831、SEQ ID NO：832、SEQ ID NO：833、SEQ ID NO：834、SEQ ID NO：835、SEQ ID NO：836、SEQ IDNO：837、SEQ ID NO：838、SEQ ID NO：839、SEQ ID NO：840、SEQ ID NO：841、SEQ ID NO：842、SEQ ID NO：843、SEQ ID NO：844、SEQ ID NO：845、SEQ ID NO：846、SEQ ID NO：847、SEQ IDNO：848、SEQ ID NO：849、SEQ ID NO：850、SEQ ID NO：851、SEQ ID NO：852、SEQ ID NO：853、SEQ ID NO：854、SEQ ID NO：855、SEQ ID NO：856、SEQ ID NO：857、SEQ ID NO：858、SEQ IDNO：859、SEQ ID NO：860、SEQ ID NO：861、SEQ ID NO：862、SEQ ID NO：863、SEQ ID NO：864、SEQ ID NO：865、SEQ ID NO： 866、SEQ ID NO：867、SEQ ID NO：868、SEQ ID NO：869、SEQ IDNO：870、SEQ ID NO：871、SEQ ID NO：872、SEQ ID NO：873、SEQ ID NO：874、SEQ ID NO：875、SEQ ID NO：876、SEQ ID NO：877、SEQ ID NO：878、SEQ ID NO：879、SEQ ID NO：880、SEQ IDNO：881、SEQ ID NO：882、SEQ ID NO：883、SEQ ID NO：884、SEQ ID NO：885、SEQ ID NO：886、SEQ ID NO：887、SEQ ID NO：888、SEQ ID NO：889、SEQ ID NO：890、SEQ ID NO：891、SEQ IDNO：892、SEQ ID NO：893、SEQ ID NO：894、SEQ ID NO：895、SEQ ID NO：896、SEQ ID NO：897、SEQ ID NO：898、SEQ ID NO：899、SEQ ID NO：900、SEQ ID NO：901、SEQ ID NO：902、SEQ IDNO：903、SEQ ID NO：904、SEQ ID NO：905、SEQ ID NO：906、SEQ ID NO：907、SEQ ID NO：908、SEQ ID NO：909、SEQ ID NO：910、SEQ ID NO：911、SEQ ID NO：912、SEQ ID NO：913、SEQ IDNO：914、SEQ ID NO：915、SEQ ID NO：916、SEQ ID NO：917、SEQ ID NO：918、SEQ ID NO：919、SEQ ID NO：920、SEQ ID NO：921、SEQ ID NO：922、SEQ ID NO：923、SEQ ID NO：924、SEQ IDNO：925、SEQ ID NO：926、SEQ ID NO：927、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：929、SEQ ID NO：930、SEQ ID NO：931、SEQ ID NO：932、SEQ ID NO：933、SEQ ID NO：934、SEQ ID NO：935、SEQ IDNO：936、SEQ ID NO：937、SEQ ID NO：938、SEQ ID NO：939、SEQ ID NO：940、SEQ ID NO：941、SEQ ID NO：942、SEQ ID NO：943、SEQ ID NO：944、SEQ ID NO：945、SEQ ID NO：946、SEQ IDNO：947、SEQ ID NO：948、SEQ ID NO：949、SEQ ID NO：950、SEQ ID NO：951、SEQ ID NO：952、SEQ ID NO：953、SEQ ID NO：954、SEQ ID NO：955、SEQ ID NO：956、SEQ ID NO：957、SEQ IDNO：958、SEQ ID NO：959、SEQ ID NO：960、SEQ ID NO：961、SEQ ID NO：962、SEQ ID NO：963、SEQ ID NO：964、SEQ ID NO：965、SEQ ID NO：966、SEQ ID NO：967、SEQ ID NO：968、SEQ IDNO：969、SEQ ID NO：970、SEQ ID NO：971、SEQ ID NO：972、SEQ ID NO：973、SEQ ID NO：974、SEQ ID NO：975、SEQ ID NO：976、SEQ ID NO：977、SEQ ID NO：978、SEQ ID NO：979、SEQ IDNO：980、SEQ ID NO：981、SEQ ID NO：982、SEQ ID NO：983、SEQ ID NO：984、SEQ ID NO：985、SEQ ID NO： 986、SEQ ID NO：987、SEQ ID NO：988、SEQ ID NO：989、SEQ ID NO：990、SEQ IDNO：991、SEQ ID NO：992、SEQ ID NO：993、SEQ ID NO：994、SEQ ID NO：995、SEQ ID NO：996、SEQ ID NO：997、SEQ ID NO：998、SEQ ID NO：999、SEQ ID NO：1000、SEQ ID NO：1001、SEQID NO：1002、SEQ ID NO：1003、SEQ ID NO：1004、SEQ ID NO：1005、SEQ ID NO：1006、SEQ IDNO：1007、SEQ ID NO：1008、SEQ ID NO：1009、SEQ ID NO：1010、SEQ ID NO：1011、SEQ IDNO：1012、SEQ ID NO：1013、SEQ ID NO：1014、SEQ ID NO：1015、SEQ ID NO：1016、SEQ IDNO：1017、SEQ ID NO：1018、SEQ ID NO：1019、SEQ ID NO：1020、SEQ ID NO：1021、SEQ IDNO：1022、SEQ ID NO：1023、SEQ ID NO：1024或SEQ ID NO：1025中的任一个”。
“SEQ ID NO：969-1025”是指“SEQ ID NO：969、SEQ ID NO：970、SEQ ID NO：971、SEQ ID NO：972、SEQ ID NO：973、SEQ ID NO：974、SEQ ID NO：975、SEQ ID NO：976、SEQ IDNO：977、SEQ ID NO：978、SEQ ID NO：979、SEQ ID NO：980、SEQ ID NO：981、SEQ ID NO：982、SEQ ID NO：983、SEQ ID NO：984、SEQ ID NO：985、SEQ ID NO：986、SEQ ID NO：987、SEQ IDNO：988、SEQ ID NO：989、SEQ ID NO：990、SEQ ID NO：991、SEQ ID NO：992、SEQ ID NO：993、SEQ ID NO：994、SEQ ID NO：995、SEQ ID NO：996、SEQ ID NO：997、SEQ ID NO：998、SEQ IDNO：999、SEQ ID NO：1000、SEQ ID NO：1001、SEQ ID NO：1002、SEQ ID NO：1003、SEQ ID NO：1004、SEQ ID NO：1005、SEQ ID NO：1006、SEQ ID NO：1007、SEQ ID NO：1008、SEQ ID NO：1009、SEQ ID NO：1010、SEQ ID NO：1011、SEQ ID NO：1012、SEQ ID NO：1013、SEQ ID NO：1014、SEQ ID NO：1015、SEQ ID NO：1016、SEQ ID NO：1017、SEQ ID NO：1018、SEQ ID NO：1019、SEQ ID NO：1020、SEQ ID NO：1021、SEQ ID NO：1022、SEQ ID NO：1023、SEQ ID NO：1024或SEQ ID NO：1025中的任一个”。
“SEQ ID NO：901-968”是指“SEQ ID NO：901、SEQ ID NO：902、SEQ ID NO：903、SEQID NO：904、SEQ ID NO：905、SEQ ID NO：906、 SEQ ID NO：907、SEQ ID NO：908、SEQ ID NO：909、SEQ ID NO：910、SEQ ID NO：911、SEQ ID NO：912、SEQ ID NO：913、SEQ ID NO：914、SEQID NO：915、SEQ ID NO：916、SEQ ID NO：917、SEQ ID NO：918、SEQ ID NO：919、SEQ ID NO：920、SEQ ID NO：921、SEQ ID NO：922、SEQ ID NO：923、SEQ ID NO：924、SEQ ID NO：925、SEQID NO：926、SEQ ID NO：927、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：929、SEQ ID NO：930、SEQ ID NO：931、SEQ ID NO：932、SEQ ID NO：933、SEQ ID NO：934、SEQ ID NO：935、SEQ ID NO：936、SEQID NO：937、SEQ ID NO：938、SEQ ID NO：939、SEQ ID NO：940、SEQ ID NO：941、SEQ ID NO：942、SEQ ID NO：943、SEQ ID NO：944、SEQ ID NO：945、SEQ ID NO：946、SEQ ID NO：947、SEQID NO：948、SEQ ID NO：949、SEQ ID NO：950、SEQ ID NO：951、SEQ ID NO：952、SEQ ID NO：953、SEQ ID NO：954、SEQ ID NO：955、SEQ ID NO：956、SEQ ID NO：957、SEQ ID NO：958、SEQID NO：959、SEQ ID NO：960、SEQ ID NO：961、SEQ ID NO：962、SEQ ID NO：963、SEQ ID NO：964、SEQ ID NO：965、SEQ ID NO：966、SEQ ID NO：967或SEQ ID NO：968中的任一个”。
“SEQ ID NO：1027-1218”是指“SEQ ID NO：1027、SEQ ID NO：1028、SEQ ID NO：1029、SEQ ID NO：1030、SEQ ID NO：1031、SEQ ID NO：1032、SEQ ID NO：1033、SEQ ID NO：1034、SEQ ID NO：1035、SEQ ID NO：1036、SEQ ID NO：1037、SEQ ID NO：1038、SEQ ID NO：1039、SEQ ID NO：1040、SEQ ID NO：1041、SEQ ID NO：1042、SEQ ID NO：1043、SEQ ID NO：1044、SEQ ID NO：1045、SEQ ID NO：1046、SEQ ID NO：1047、SEQ ID NO：1048、SEQ ID NO：1049、SEQ ID NO：1050、SEQ ID NO：1051、SEQ ID NO：1052、SEQ ID NO：1053、SEQ ID NO：1054、SEQ ID NO：1055、SEQ ID NO：1056、SEQ ID NO：1057、SEQ ID NO：1058、SEQ ID NO：1059、SEQ ID NO：1060、SEQ ID NO：1061、SEQ ID NO：1062、SEQ ID NO：1063、SEQ ID NO：1064、SEQ ID NO：1065、SEQ ID NO：1066、SEQ ID NO：1067、SEQ ID NO：1068、SEQ ID NO：1069、SEQ ID NO：1070、SEQ ID NO：1071、SEQ ID NO： 1072、SEQ ID NO：1073、SEQ ID NO：1074、SEQ ID NO：1075、SEQ ID NO：1076、SEQ ID NO：1077、SEQ ID NO：1078、SEQ ID NO：1079、SEQ ID NO：1080、SEQ ID NO：1081、SEQ ID NO：1082、SEQ ID NO：1083、SEQ ID NO：1084、SEQ ID NO：1085、SEQ ID NO：1086、SEQ ID NO：1087、SEQ ID NO：1088、SEQ ID NO：1099、SEQ ID NO：1100、SEQ ID NO：1101、SEQ ID NO：1102、SEQ ID NO：1103、SEQ ID NO：1104、SEQ ID NO：1105、SEQ ID NO：1106、SEQ ID NO：1107、SEQ ID NO：1108、SEQ ID NO：1109、SEQ ID NO：1110、SEQ ID NO：1111、SEQ ID NO：1112、SEQ ID NO：1113、SEQ ID NO：1114、SEQ ID NO：1115、SEQ ID NO：1116、SEQ ID NO：1117、SEQ ID NO：1118、SEQ ID NO：1119、SEQ ID NO：1120、SEQ ID NO：1121、SEQ ID NO：1122、SEQ ID NO：1123、SEQ ID NO：1124、SEQ ID NO：1125、SEQ ID NO：1126、SEQ ID NO：1127、SEQ ID NO：1128、SEQ ID NO：1129、SEQ ID NO：1130、SEQ ID NO：1131、SEQ ID NO：1132、SEQ ID NO：1133、SEQ ID NO：1134、SEQ ID NO：1135、SEQ ID NO：1136、SEQ ID NO：1137、SEQ ID NO：1138、SEQ ID NO：1139、SEQ ID NO：1140、SEQ ID NO：1141、SEQ ID NO：1142、SEQ ID NO：1143、SEQ ID NO：1144、SEQ ID NO：1145、SEQ ID NO：1146、SEQ ID NO：1147、SEQ ID NO：1148、SEQ ID NO：1149、SEQ ID NO：1150、SEQ ID NO：1151、SEQ ID NO：1152、SEQ ID NO：1153、SEQ ID NO：1154、SEQ ID NO：1155、SEQ ID NO：1156、SEQ ID NO：1157、SEQ ID NO：1158、SEQ ID NO：1159、SEQ ID NO：1160、SEQ ID NO：1161、SEQ ID NO：1162、SEQ ID NO：1163、SEQ ID NO：1164、SEQ ID NO：1165、SEQ ID NO：1166、SEQ ID NO：1167、SEQ ID NO：1168、SEQ ID NO：1169、SEQ ID NO：1170、SEQ ID NO：1171、SEQ ID NO：1172、SEQ ID NO：1173、SEQ ID NO：1174、SEQ ID NO：1175、SEQ ID NO：1176、SEQ ID NO：1177、SEQ ID NO：1178、SEQ ID NO：1179、SEQ ID NO：1180、SEQ ID NO：1181、SEQ ID NO：1182、SEQ ID NO：1183、SEQ ID NO：1184、SEQ ID NO：1185、SEQ ID NO：1186、SEQ ID NO：1187、SEQ ID NO：1188、SEQ ID NO：1189、SEQ ID NO：1190、SEQ ID NO：1191、SEQ ID NO： 1192、SEQ ID NO：1193、SEQ ID NO：1194、SEQ ID NO：1195、SEQ ID NO：1196、SEQ ID NO：1197、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：1200、SEQ ID NO：1201、SEQ ID NO：1202、SEQ ID NO：1203、SEQ ID NO：1204、SEQ ID NO：1205、SEQ ID NO：1206、SEQ ID NO：1207、SEQ ID NO：1208、SEQ ID NO：1209、SEQ ID NO：1210、SEQ ID NO：1211、SEQ ID NO：1212、SEQ ID NO：1213、SEQ ID NO：1214、SEQ ID NO：1215、SEQ ID NO：1216、SEQ ID NO：1217或SEQ ID NO：1218中的任一个”。
“SEQ ID NO：1429-1442”是指“SEQ ID NO：1429、SEQ ID NO：1430、SEQ ID NO：1431、SEQ ID NO：1432、SEQ ID NO：1433、SEQ ID NO：1434、SEQ ID NO：1435、SEQ ID NO：1436、SEQ ID NO：1437、SEQ ID NO：1438、SEQ ID NO：1439、SEQ ID NO：1440、SEQ ID NO：1441或SEQ ID NO：1442中的任一个”。
“SEQ ID NO：1219-1428”是指“SEQ ID NO：1219、SEQ ID NO：1220、SEQ ID NO：1221、SEQ ID NO：1222、SEQ ID NO：1223、SEQ ID NO：1224、SEQ ID NO：1225、SEQ ID NO：1226、SEQ ID NO：1227、SEQ ID NO：1228、SEQ ID NO：1229、SEQ ID NO：1230、SEQ ID NO：1231、SEQ ID NO：1232、SEQ ID NO：1233、SEQ ID NO：1234、SEQ ID NO：1235、SEQ ID NO：1236、SEQ ID NO：1237、SEQ ID NO：1238、SEQ ID NO：1239、SEQ ID NO：1240、SEQ ID NO：1241、SEQ ID NO：1242、SEQ ID NO：1243、SEQ ID NO：1244、SEQ ID NO：1245、SEQ ID NO：1246、SEQ ID NO：1247、SEQ ID NO：1248、SEQ ID NO：1249、SEQ ID NO：1250、SEQ ID NO：1251、SEQ ID NO：1252、SEQ ID NO：1253、SEQ ID NO：1254、SEQ ID NO：1255、SEQ ID NO：1256、SEQ ID NO：1257、SEQ ID NO：1258、SEQ ID NO：1259、SEQ ID NO：1260、SEQ ID NO：1261、SEQ ID NO：1262、SEQ ID NO：1263、SEQ ID NO：1264、SEQ ID NO：1265、SEQ ID NO：1266、SEQ ID NO：1267、SEQ ID NO：1268、SEQ ID NO：1269、SEQ ID NO：1270、SEQ ID NO：1271、SEQ ID NO：1272、SEQ ID NO：1273、SEQ ID NO：1274、SEQ ID NO： 1275、SEQ ID NO：1276、SEQ ID NO：1277、SEQ ID NO：1278、SEQ ID NO：1279、SEQ ID NO：1280、SEQ ID NO：1281、SEQ ID NO：1282、SEQ ID NO：1283、SEQ ID NO：1284、SEQ ID NO：1285、SEQ ID NO：1286、SEQ ID NO：1287、SEQ ID NO：1288、SEQ ID NO：1289、SEQ ID NO：1290、SEQ ID NO：1291、SEQ ID NO：1292、SEQ ID NO：1293、SEQ ID NO：1294、SEQ ID NO：1295、SEQ ID NO：1296、SEQ ID NO：1297、SEQ ID NO：1298、SEQ ID NO：1299、SEQ ID NO：1300、SEQ ID NO：1301、SEQ ID NO：1302、SEQ ID NO：1303、SEQ ID NO：1304、SEQ ID NO：1305、SEQ ID NO：1306、SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1310、SEQ ID NO：1311、SEQ ID NO：1312、SEQ ID NO：1313、SEQ ID NO：1314、SEQ ID NO：1315、SEQ ID NO：1316、SEQ ID NO：1317、SEQ ID NO：1318、SEQ ID NO：1319、SEQ ID NO：1320、SEQ ID NO：1321、SEQ ID NO：1322、SEQ ID NO：1323、SEQ ID NO：1324、SEQ ID NO：1325、SEQ ID NO：1326、SEQ ID NO：1327、SEQ ID NO：1328、SEQ ID NO：1329、SEQ ID NO：1330、SEQ ID NO：1331、SEQ ID NO：1332、SEQ ID NO：1333、SEQ ID NO：1334、SEQ ID NO：1335、SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1337、SEQ ID NO：1338、SEQ ID NO：1339、SEQ ID NO：1340、SEQ ID NO：1341、SEQ ID NO：1342、SEQ ID NO：1343、SEQ ID NO：1344、SEQ ID NO：1345、SEQ ID NO：1346、SEQ ID NO：1347、SEQ ID NO：1348、SEQ ID NO：1349、SEQ ID NO：1350、SEQ ID NO：1351、SEQ ID NO：1352、SEQ ID NO：1353、SEQ ID NO：1354、SEQ ID NO：1355、SEQ ID NO：1356、SEQ ID NO：1357、SEQ ID NO：1358、SEQ ID NO：1359、SEQ ID NO：1360、SEQ ID NO：1361、SEQ ID NO：1362、SEQ ID NO：1363、SEQ ID NO：1364、SEQ ID NO：1365、SEQ ID NO：1366、SEQ ID NO：1367、SEQ ID NO：1368、SEQ ID NO：1369、SEQ ID NO：1370、SEQ ID NO：1371、SEQ ID NO：1372、SEQ ID NO：1373、SEQ ID NO：1374、SEQ ID NO：1375、SEQ ID NO：1376、SEQ ID NO：1377、SEQ ID NO：1378、SEQ ID NO：1379、SEQ ID NO：1380、SEQ ID NO：1381、SEQ ID NO：1382、SEQ ID NO：1383、SEQ ID NO：1384、SEQ ID NO： 1385、SEQ ID NO：1386、SEQ ID NO：1387、SEQ ID NO：1388、SEQ ID NO：1389、SEQ ID NO：1390、SEQ ID NO：1391、SEQ ID NO：1392、SEQ ID NO：1393、SEQ ID NO：1394、SEQ ID NO：1395、SEQ ID NO：1396、SEQ ID NO：1397、SEQ ID NO：1398、SEQ ID NO：1399、SEQ ID NO：1400、SEQ ID NO：1401、SEQ ID NO：1402、SEQ ID NO：1403、SEQ ID NO：1404、SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407、SEQ ID NO：1408、SEQ ID NO：1409、SEQ ID NO：1410、SEQ ID NO：1411、SEQ ID NO：1412、SEQ ID NO：1413、SEQ ID NO：1414、SEQ ID NO：1415、SEQ ID NO：1416、SEQ ID NO：1417、SEQ ID NO：1418、SEQ ID NO：1419、SEQ ID NO：1420、SEQ ID NO：1421、SEQ ID NO：1422、SEQ ID NO：1423、SEQ ID NO：1424、SEQ ID NO：1425、SEQ ID NO：1426、SEQ ID NO：1427或SEQ ID NO：1428中的任一个”。
在一些实施方案中，所公开的重组RSV F蛋白可以包括与以下中的任一个具有至少80％(例如至少90％、至少95％、或至少98％、或100％)同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：212、SEQID NO：213、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：220、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：222、SEQ ID NO：223、SEQID NO：224、SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：234、SEQID NO：235、SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：238、 SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：245、SEQID NO：246、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQID NO：257、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：262、SEQ ID NO：263、SEQ ID NO：264、SEQ ID NO：265、SEQ ID NO：266、SEQ ID NO：267、SEQID NO：268、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：270、SEQ ID NO：271、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：278、SEQID NO：279、SEQ ID NO：280、SEQ ID NO：281、SEQ ID NO：282、SEQ ID NO：283、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：285、SEQ ID NO：286、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：289、SEQID NO：290、SEQ ID NO：291、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：293、SEQ ID NO：294、SEQ ID NO：295、SEQ ID NO：296、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：300、SEQID NO：301、SEQ ID NO：302、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：304、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：306、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：310、SEQ ID NO：311、SEQID NO：312、SEQ ID NO：313、SEQ ID NO：314、SEQ ID NO：315、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：320、SEQ ID NO：321、SEQ ID NO：322、SEQID NO：323、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：333、SEQID NO：334、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：336、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：344、SEQID NO：345、SEQ ID NO：346、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：350、SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：372、SEQ ID NO：373、SEQ ID NO：374、SEQ ID NO：375、SEQID NO：376、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：378、 SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：380、SEQ ID NO：381、SEQ ID NO：382、SEQ ID NO：390、SEQ ID NO：391、SEQ ID NO：392、SEQ ID NO：393、SEQID NO：394、SEQ ID NO：395、SEQ ID NO：396、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：400、SEQ ID NO：401、SEQ ID NO：402、SEQ ID NO：403、SEQ ID NO：404、SEQID NO：405、SEQ ID NO：406、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：410、SEQ ID NO：411、SEQ ID NO：412、SEQ ID NO：413、SEQ ID NO：414、SEQ ID NO：415、SEQID NO：416、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：419、SEQ ID 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IDNO：1342、SEQ ID NO：1343、SEQ ID NO：1344、SEQ ID NO：1345、SEQ ID NO：1346、SEQ IDNO：1347、SEQ ID NO：1348、SEQ ID NO：1349、SEQ ID NO：1350、SEQ ID NO：1351、SEQ IDNO：1352、SEQ ID NO：1353、SEQ ID NO：1354、SEQ ID NO：1355、SEQ ID NO：1356、SEQ IDNO：1357、SEQ ID NO：1358、SEQ ID NO：1359、SEQ ID NO：1360、SEQ ID NO：1361、SEQ IDNO：1362、SEQ ID NO：1363、SEQ ID NO：1364、SEQ ID NO：1365、SEQ ID NO：1366、SEQ IDNO：1367、SEQ ID NO：1368、SEQ ID NO：1369、SEQ ID NO：1370、SEQ ID NO：1371、SEQ IDNO：1372、SEQ ID NO：1373、SEQ ID NO：1374、SEQ ID NO：1375、SEQ ID NO：1376、SEQ IDNO：1377、SEQ ID NO：1378、SEQ ID NO：1379、SEQ ID NO：1380、SEQ ID NO：1381、SEQ IDNO：1382、SEQ ID NO：1383、SEQ ID NO：1384、SEQ ID NO：1385、SEQ ID NO：1386、SEQ IDNO：1387、SEQ ID NO：1388、SEQ ID NO：1389、SEQ ID NO：1390、SEQ ID NO：1391、SEQ IDNO：1392、SEQ ID NO：1393、SEQ ID NO：1394、SEQ ID NO：1395、SEQ ID NO：1396、SEQ IDNO：1397、SEQ ID NO：1398、SEQ ID NO：1399、SEQ ID NO：1400、SEQ ID NO：1401、SEQ IDNO：1402、SEQ ID NO：1403、SEQ ID NO：1404、SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQ IDNO：1407、SEQ ID NO：1408、SEQ ID NO：1409、SEQ ID NO：1410、SEQ ID NO：1411、SEQ IDNO：1412、SEQ ID NO：1413、SEQ ID NO：1414、SEQ ID NO：1415、SEQ ID NO：1416、SEQ IDNO：1417、SEQ ID NO：1418、SEQ ID NO：1419、SEQ ID NO：1420、SEQ ID NO：1421、SEQ IDNO：1422、SEQ ID NO：1423、SEQ ID NO：1424、SEQ ID NO：1425、SEQ ID NO：1426、SEQ IDNO：1427、SEQ ID NO：1428、SEQ ID NO：1429、SEQ ID NO：1430、SEQ ID NO：1431、SEQ IDNO：1432、SEQ ID NO：1433、SEQ ID NO：1434、SEQ ID NO：1435、SEQ ID NO：1436、SEQ IDNO：1437、SEQ ID NO：1438、SEQ ID NO：1439、SEQ ID NO： 1440、SEQ ID NO：1441、SEQ IDNO：1442、SEQ ID NO：1456、SEQ ID NO：1457、SEQ ID NO：1458、SEQ ID NO：1459、SEQ IDNO：1460、SEQ ID NO：1461、SEQ ID NO：1462、SEQ ID NO：1463、SEQ ID NO：1464、SEQ IDNO：1465、SEQ ID NO：1466、SEQ ID NO：1467、SEQ ID NO：1468、SEQ ID NO：1474、SEQ IDNO：1475、SEQ ID NO：1476、SEQ ID NO：1477或SEQ ID NO：1478(“序列组F”)，其中所述重组RSV F多肽特异性结合于RSV F融合前特异性抗体(例如D25)和/或包括RSV F融合前特异性抗原位点(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390002341
)。在若干实施方案中，在20℃下在pH 7.4的PBS中温育24小时后，所述免疫原特异性结合于所述抗体或包括所述抗原位点。在一些实施方案中，所述重组RSV F多肽包括来自序列组F的序列中的一个，并且还包括至多20个(例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)，其中所述重组RSV F多肽特异性结合于RSV F融合前特异性抗体(例如D25)和/或包括RSV F融合前特异性抗原位点(例如抗原位点
Figure BDA0000844346390002342
)。本领域普通技术人员应理解，上文列出的序列可包括前导序列、纯化标签、除去纯化标签的蛋白酶裂解位点、三聚化结构域、蛋白质纳米粒子亚基结构域或与所述重组RSV F蛋白无关的其他序列。在若干实施方案中，本文提供的免疫原包括上述序列之一的重组RSV F蛋白，但不包括前导序列、纯化标签、除去纯化标签的蛋白酶裂解位点、三聚化结构域、蛋白质纳米粒子亚基结构域或与所述重组RSV F蛋白无关的其他序列。也提供编码这些蛋白质序列的核酸分子，以及使用所述重组RSV F蛋白在受试者中产生还针对RSV的免疫反应，或在受试者中预防或治疗RSV感染的方法。
III.实施例
提供以下实施例以说明某些实施方案的特定特征，但权利要求的范围不应限制为所示例的那些特征。
实施例1
结合于人类抗体的呼吸道合胞病毒融合前F三聚体的结构
呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)糖蛋白的融合前构象是人类血清中的大部分RSV中和抗体的靶标，但其亚稳定性阻碍表征。为了克服这种障碍，鉴定了不结合F的融合后构象并且有效性比预防性抗体帕利珠单抗
Figure BDA0000844346390002351
大10倍以上的抗体。与F糖蛋白复合的这些抗体之一D25的共晶体结构揭示，D25将F锁定在其融合前状态。融合前和融合后F构象的比较限定了介导RSV入侵所需的重排。D25-F糖蛋白结构揭示了在具融合前特异性和四级特性的F糖蛋白的顶部的新的易攻击位点，即抗原位点
Figure BDA0000844346390002352
融合前RSV F三聚体结构以及抗原位点
Figure BDA0000844346390002353
的定义应能够设计改进的疫苗抗原并指导用于被动预防RSV诱导疾病的新方法。
呼吸道合胞病毒(RSV)是普遍存在的，几乎所有的儿童在3岁前都受到感染(Glezen等，Am.J.Dis.Child.，140，543(1986))。在美国，RSV细支气管炎是造成婴儿住院治疗的主要原因和整个儿童期哮喘和喘鸣的主要原因(Shay等，JAMA，282，1440(1999)；Hall等，N.Engl.J.Med.，360，588(2009))。在全球范围内，RSV每年造成66,000-199,000例五岁以下的儿童死亡(Nair等，Lancet，375，1545(2010))，并且在一月龄至一岁的婴儿中造成7％的死亡，这多于除疟疾外的任何其他单一病原体(Lozano等，Lancet，380，2095(2013))。唯一可用的干预是被动施用得到许可的单克隆抗体帕利珠单抗
Figure BDA0000844346390002354
其识别RSV融合(F)糖蛋白(Johnson等，J.Infect.Dis.，176，1215(1997)；Beeler和van WykeCoelingh，J.Virol.，63，2941(1989))并且降低严重疾病的发病率(The IMpact-RSV StudyGroup，Pediatrics，102，531(1998))。表明RSV F特异性抗体可以保护免于疾病的临床证据已经促使搜寻更好的抗体(Collarini等，J.Immunol.，183，6338(2009)；Wu等，J.Mol.Biol.，368，652(2007)；Kwakkenbos等，Nat.Med.，16，123(2010))和共同努力开发有效的疫苗(Graham，Immunol.Rev.，239，149(2011))。
所述RSV F糖蛋白促进病毒和细胞膜的融合(Walsh和Hruska，J.Virol.，47，171(1983))；它是具有亚稳态融合前构象的I型融合蛋白，其储存折叠能量，所述能量在结构重排形成高稳定性融合后构象期间释放。已发现三个抗原位点(I、II和IV)诱导中和活性(Arbiza等，J.Gen.Virol.，73，2225(1992)；Lopez等，J.Virol.，72，6922(1998)；López等，J.Virol.，64，927(1990))，并且如通过结构和生物物理研究所确定，都存在于F的融合后形式上(McLellan等，J.Virol.，85，7788(2011)；Swanson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，108，9619(2011))。然而，人类血清对融合后F的吸收不能除去大多数的F特异性中和活性，这表明融合前形式可能带有新颖的中和抗原位点(Magro等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，109，3089(2012))。尽管作出了巨大的努力，但尚未获得可溶性融合前RSV F的均质制剂。因此，融合前F结构的确定和新颖F特异性抗原位点的鉴定已经变成开发新型预防性和治疗性抗体和疫苗的趋同优先任务。与这些目标相一致，鉴定了可中和RSV，但不结合融合后F的F特异性抗体，并且限定了由这些抗体识别的RSV F的结构。结果揭示了RSV F的融合前构象，一类显著有效抗体的中和机制，和应该充当改进的基于抗体疗法的靶标的融合前特异性抗原位点的原子水平细节，并且提供开发有效疫苗抗原的基础。
两种人类抗体D25和AM22被测定为相比于帕利珠单抗(图1A)对于中和RSV F有效约50倍，并且其也不结合于稳定在融合后构象的RSV F的可溶形式(McLellan等，J.Virol.，85，7788(2011))(图1B)。D25和AM22在先前已公开(Kwakkenbos等，Nat.Med.，16，123(2010)；美国专利公开2010/0239593；美国专利公开2012/0070446)。缺乏结合于RSV F的融合后形式的D25和AM22表明这些抗体可能识别亚稳态融合前构象。
结构努力的重点放在人类抗体AM22和D25上。使用96孔微量滴定板表达形式(Pancera等，PLoS One.2013；8(2)：e55701，2013，以引用的方式并入本文中)来筛选这些抗体与从Ni2+-NTA ELISA板上 的细胞上清液捕获的一组RSV F糖蛋白变体的结合。测试了结合于F糖蛋白构建体(RSV F(+)Fd)的抗体，其包含与次要纤维蛋白三聚化结构域的C端融合的RSV F残基1-513(Frank等，J.Mol.Biol.，308，1081(2001))。然而，通过将纯化的RSV F(+)Fd与纯化的D25或AM22抗体混合未形成复合物。已确定，可溶性F糖蛋白的纯化触发亚稳态融合前状态(Chaiwatpongsakorn等，J.Virol.，85，3968(2011))；为克服这种不稳定性，将表达RSV F(+)Fd的细胞与抗原结合片段(Fab)或免疫球蛋白一起温育(后者在铰链区中具有HRV3C蛋白酶裂解位点(McLellan等，Nature 480，336，(2011)))以将F俘获在融合前状态。可选地，将表达RSV F(+)Fd的细胞与单独的编码抗体重链和抗体轻链的DNA表达盒共转染(图5)。从编码D25 Fab的DNA与编码RSV F(+)Fd的DNA的共转染获得D25-F糖蛋白复合物的最佳表达；从可溶性Fab的添加也观察到合理的复合物产率。
对于单独地或与RSV F(+)Fd复合的Fab D25和AM22筛选结晶化。关于Fab D25自身的六方晶体获得
Figure BDA0000844346390002371
分辨率的X射线衍射数据，并且通过分子置换解析结构并修正为R晶体/R游离为24.5/25.7％(表9)。关于与RSV F(+)Fd复合的Fab D25的立方晶体获得
Figure BDA0000844346390002372
分辨率的数据，并且通过分子置换使用未结合的D25结构和先前确定的融合后RSV F结构的部分(McLellan等，J.Virol.，85，7788(2011)；Swanson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，108，9619(2011))作为搜索模型，以及来自金衍生物的线索，来解析这种结构。复合物的结构被修正为R晶体/R游离为21.3/26.7％(图1C)(表9)。
一个D25 Fab结合于RSV F糖蛋白的一个分子的复合物存在于立方晶格的不对称单元中。三重晶格对称定位两种其他D25-RSV F复合物以产生
Figure BDA0000844346390002373
的大规模RSV F三聚体界面。对于残基26至513(残基98-136除外)观测连续的电子密度，所述残基包括通过F0前体的蛋白水解裂解除去的27个氨基酸的片段以形成成熟F糖蛋白的F2和F1亚基(分别对应于N端和C端片段)。在天冬酰胺残基27、70和500处以电子密度检测N连接的糖基化的三个位点(图2A)。
总的来说，D25结合的RSV F结构由堆叠在7链反平行开放末端筒的任一末端的两个叶组成，其中两条链(β2和β7)在所述两个叶之间延伸，氢键键合超过
Figure BDA0000844346390002381
并且形成两个叶和中心筒的整体部分。含有F2N端和F1C端的膜近端叶由三层β夹层和三个螺旋(α8、α9和α10)组成。螺旋α10形成螺旋的一部分，其似乎延伸至病毒膜中并且附接血纤维蛋白三聚化结构域。距病毒膜约
Figure BDA0000844346390002382
的膜远端叶由围绕三链反平行折叠和β发夹(β3+β4)堆叠的七个螺旋组成。大规模原体间接触似乎稳定化三聚体结构，特别是F1亚基(也称为融合肽)的疏水性N端，其由来自邻近原体的膜近端叶三重β-夹层支撑。包含在三聚体的另外的中空空腔内的融合肽通过原体之间的圆柱形开口(直径为约
Figure BDA0000844346390002383
)连接至表面暴露的α2和α3螺旋；这种开口在触发期间可用作融合肽的离开路径。
D25结合的F糖蛋白的结构类似于相关副流感病毒5(PIV5)F糖蛋白的融合前结构(Welch等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，109，16672(2012)；Yin等，Nature，439，38(2006))(图6和图7)。D25结合形式的RSV F因此似乎呈融合前构象(图2)。为了确定融合前F与融合后F之间的结构重排，将D25结合形式的RSV F与最近确定的其融合后构象进行比较(McLellan等，J.Virol.，85，7788(2011)；Swanson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，108，9619(2011))。
RSV F的融合前构象和融合后构象揭示总体形状的急剧变化，从高度为
Figure BDA0000844346390002384
的相对紧凑的椭圆形结构变为伸长约50％的锥形(
Figure BDA0000844346390002385
Figure BDA0000844346390002386
)(图2A)。虽然构象发生这种显著变化，但大多数的F糖蛋白二级和三级结构保持在融合前和融合后状态，其中215个残基显示两种结构之间的Cα偏差小于
Figure BDA0000844346390002387
(图2A、2B)。两个区域出现惊人的构象变化。在膜远端叶中，融合肽和五个二级结构元件(α2、α3、β3、β4和α4)与α5螺旋接合以形成长度超过
Figure BDA0000844346390002388
的单一延伸的融合后螺旋(α5后)，其在N端被融合肽封端(有助于清晰起见，融合后结构的二级结构元件用“后”下标标记)。在膜近端叶中，三重β夹层的唯一平行链(β22)(其在融合前结构中氢键键合至β1)被拆开，允许融 合前α10螺旋与α5后螺旋接合。总之，α5后和αl0后螺旋并置F1N端和C端以形成呈融合后构象的I型融合蛋白的螺旋状-螺旋结构(Colman和Lawrence，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，4，309(2003))。总的来说，α10螺旋的部分在融合前构象与融合后构象之间移动超过
Figure BDA0000844346390002391
Figure BDA0000844346390002392
相比于先前报道的流感血球凝集素(Wilson等，Nature，289，366(1981))、埃博拉GP(Lee等，Nature，454，177(2008))和PIV5F(Welch等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，109，16672(2012))的蛋白酶裂解的融合前I型结构，RSV融合肽的位置与血球凝集素最相似(图7)，其令人惊讶地得出，PIV5和RSV都是副粘病毒。RSV F融合肽埋藏在中空三聚体空腔的中心，并且相距最后可见的F2残基
Figure BDA0000844346390002393
以上。这表明在F0前体被弗林样宿主蛋白酶裂解后发生融合肽的大幅度结构重排以产生F1/F2。另外，在膜近端叶和膜远端叶中在融合前构象与融合后构象之间出现剧烈的结构重排，提供对于稳定化RSV F的融合前构象的难度的见解。不同于可以仅通过将GCN4-三聚化基序附接至C端而稳定在融合前状态的PIV5F和人类偏肺病毒F(Yin等，Nature，439，38(2006)；Wen等，Nat.Struct.Mol.Biol.，19，461(2012))，融合前RSV F构象需要膜近端叶(通过附接次要纤维蛋白三聚化结构域来实现(Frank等，J.Mol.Biol.，308，1081(2001)))与膜远端叶(其通过D25抗体的结合发生)的稳定化。
D25抗体识别RSV F糖蛋白的膜远端顶端(图1C)。它结合于四级表位，其中D25-重链与一个原体相互作用(涉及RSV上
Figure BDA0000844346390002394
的埋藏相互作用表面积)并且D25-轻链结合于相同的原体
Figure BDA0000844346390002395
和邻近的原体
Figure BDA0000844346390002396
(图3A)。通过D25的6个互补决定环中的5个进行RSV F接触，其中重链第3CDR(CDR H3)与α4螺旋(F1残基196-210)相互作用并且与链β2与螺旋α1之间的环中的F2残基63、65、66和68形成分子间氢键。虽然D25表位的二级结构元件大部分保持不变，但其相对定向基本上改变，其中α4螺旋相对于融合前和融合后构象中的链β2旋转约180°(图3B)。这种结构重排解释了D25 不能结合融合后F分子并且表明D25通过稳定化三聚体F糖蛋白复合物的融合前构象而抑制膜融合。虽然来自人类RSV A和B亚型的F蛋白在序列上高度相关(447/472或94.7％的包含成熟F2/F1胞外域的氨基酸在已知亚型之间是相同的)，但六个天然观察位置的RSV-序列变化(F2中的残基67和74，和F1中的残基200、201、209和213)位于由D25结合的区域中(图3C)。类似地，在与人类RSV F亚型A的成熟胞外域不相同的牛RSV F中的56个氨基酸中，在这个相同区域中存在13个(图3C)。因此，在融合前RSV F结构的顶端的D25表位可在免疫压力下并且充当亚型特异性免疫性的决定子(Chambers等，J.Gen.Virol.，73，1717(1992))。例如，基于序列分析，假定F糖蛋白中的环区域存在于可能在免疫压力下的副粘病毒科内(Chambers等，J.Gen.Virol.，73，1717(1992))。已经证实，通过F1残基200与216之间的定点突变可以影响RSV亚群特异性单克隆抗体的结合(Connor等，J.Med.Virol.，63，168(2001))，并且包含F1残基205-225的肽可在兔中引起中和活性，但未限定特异性表位(Corvaisier等，Arch.Virol.，142，1073(1997))。
为了理解D25表位相对于由其他RSV-中和抗体识别的表位的关系，测试D25结合于RSV感染细胞的竞争(图4A)。值得注意的是，AM22与D25竞争RSV F结合，这表明它们识别相同的抗原位点。为了进一步限定由这些抗体识别的位点，在Fab-RSV F复合物上进行阴性染色EM。Fab D25-RSV F复合物的EM图像类似于Fab D25-RSV F的晶体结构，Fab AM22-RSV F的EM图像也是如此(图4B)。总之，这些结果表明抗体D25和AM22识别相同或高度相关的抗原位点，其被称为“抗原位点
Figure BDA0000844346390002402
”。
为了表征识别抗原位点
Figure BDA0000844346390002401
的抗体，研究其功能特性。除了其特别的效能和融合前特异性(图1A)之外，所有三种抗体当连接后添加时强烈抑制融合(图4C)，并且所有三种都不能阻断细胞-表面连接(图4D)，表明RSV F受体结合于F上不被这三种抗体阻断的区域。相关人类偏肺病毒F蛋白上的受体结合域是RGD基序(Cseke 等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，106，1566(2009))，其对应于RSV F残基361-363，它们位于中央筒的环顶端，在融合前RSV F三聚体不被D25结合阻断的一侧上。虽然这些抗体不防止连接，但已知包含抗原位点
Figure BDA0000844346390002411
的F2和F1的区域促进肝素结合(Feldman等，J.Virol.，74，6442(2000)；Crim等，J.Virol.，81，261(2007))，并且有可能这个区域可促进与G糖蛋白和F的其他区域一致的葡糖胺聚糖上的硫酸肝素部分的非特异性连接。最后，AM22和D25抗体在Fab和免疫球蛋白上下文中类似地中和(图8)，表明亲合力不如它对于一些流感病毒抗体一样起主导作用(Ekiert等，Nature，489，526(2012))。总的来说，D25和AM22共有结合特异性和中和表型，并且表明这些特性可能是识别抗原位点
Figure BDA0000844346390002412
的抗体的特征。相比之下，识别RSV F上与中和活性相关的其他抗原位点(位点I、II和IV)的抗体都不共有相似的中和效能特性和融合前F特异性(图9A-9B)。
虽然抗原位点
Figure BDA0000844346390002413
通过多种机制被部分屏蔽免于免疫识别，所述机制包括构象掩蔽(它仅存在于亚稳态融合前状态中)、四级组装(位点被RSV原体共用)、抗原变化(它是RSV F的最可变部分之一)，和聚糖屏蔽(连接至Asn70的N连接的聚糖处于融合前F三聚体的顶部)，但所有三种融合前-特异性抗体似乎靶向类似的表位。在融合前F三聚体顶端的抗原位点
Figure BDA0000844346390002414
的位置应该容易接近，即使在密集的病毒粒子表面上，这可解释如下观察结果：由自然RSV感染诱导的人类血清中的大部分中和活性是针对RSV F的融合前形式(Magro等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，109，3089(2012))，但不能排除其他融合前特异性抗原位点。抗体对抗原位点
Figure BDA0000844346390002415
的高效能表明它们可被开发用于新生儿中RSV诱导疾病的被动预防。此外，基于疫苗的融合前特异性抗体诱导可通过RSV F的融合前形式的稳定化来辅助，或许通过经由具有二硫键的RSV F变体的基于结构的设计连接F结构的移动和固定部分来促进。注意到，融合前稳定化F含有所有先前表征的中和表位以及抗原位点
Figure BDA0000844346390002416
D25-RSV F结构的定义因此提供预防RSV诱导疾病的多种新方法的基础。
材料和方法
病毒和细胞。如先前所述制备并保持病毒储备液(Graham等，J.Med.Virol.，26，153(1988))。如先前所报道构建表达RSV的绿色荧光蛋白(GFP)RSV-GFP(Hallak等，Virology.271，264(2000))。用于基于流式细胞术的中和和融合测定法的RSV-GFP储备液的效价是2.5×107pfu/ml。用于连接测定法的RSV A2储备液的效价是1.02×108pfu/ml。将HEp-2细胞保持在含有10％胎牛血清(10％EMEM)的伊格尔最低必需培养基(Eagle′sminimal essential medium)中并补充以谷氨酰胺、青霉素和链霉素。
抗体表达质粒的产生。将编码抗体重链和轻链可变区的DNA进行密码子优化以用于人类表达并合成。将AM22和D25重链和轻链可变区亚克隆到含有同框人类恒定结构域的pVRC8400表达质粒中(对于重链为IgG1并且对于轻链为K)。通过将HRV3C蛋白酶位点(GLEVLFQGP；SEQ ID NO：355)或终止密码子插入铰链区中来制造AM22和D25重链表达质粒的变体。
抗体和Fab片段的表达和纯化。通过在37℃下将重链和轻链质粒短暂共转染到悬浮的HEK293F细胞中持续4-5天来表达抗体。使细胞上清液通过蛋白A琼脂糖，并且将结合的抗体用PBS洗涤并用IgG洗脱缓冲液洗脱到1/10体积的1M Tris-HCl pH 8.0中。通过用Lys-C消化IgG来产生AM22和D25 Fab。通过添加完全蛋白酶抑制剂混合片剂来抑制消化，并且使Fab和Fc混合物返回通过蛋白A琼脂糖以除去Fc片段。通过尺寸排阻色谱法进一步纯化流过柱的Fab。
RSV中和测定法。通过流式细胞术中和测定法来测量抗体介导的中和(Chen等，J.Immunol.Methods，362，180(2010))。简言之，将HEp-2细胞用RSV-GFP感染并且通过流式细胞术在感染后18小时监测感染作为GFP表达的函数。通过曲线拟合和非线性回归来分析数据(GraphPad Prism，GraphPad Software Inc.，San Diego CA)。
融合后RSV F结合测定法。如(McLellan等，J.Virol.，85，7788(2011))中所述制备呈融合后构象的纯化的可溶性RSV F蛋白。如先前所述(McLellan等，J.Mol.Biol.，409，853(2011))使用动力学ELISA来测试单克隆抗体与融合后RSV F的结合。简言之，在室温下将96孔Ni2+-NTA涂覆板(ThermoFisher Scientific)涂以100μl融合后RSV F(1μg/ml)持续一小时。向每个孔中添加100μl稀释抗体并且在室温下温育一小时。通过将板与100μl HRP结合的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)或HRP结合的抗人类IgG(Santa Cruz Biolotechnology，Inc，Santa Cruz，CA)在室温下温育1小时来检测结合抗体。然后，向每个孔中添加100μl的Super AquaBlue ELISA底物(eBioscience，San Diego CA)并且立即使用Dynex Technologies微板读取器在405nm下(Chantilly，VA)读取板。在多个步骤之间，用PBS-T洗涤板。
未结合的D25 Fab的结晶化和X射线数据收集。使用Cartesian Honeybee结晶机器人来筛选结晶条件，并且通过蒸气扩散方法在静置液滴中在20℃下通过混合0.2μl的D25Fab与0.2μl的贮存溶液(22％(w/v)PEG 4000、0.1M乙酸钠pH 4.6)使初始晶体生长。通过以2∶1比率组合蛋白质和贮存溶液而在悬滴中手动再生晶体。在27.5％(w/v)PEG 4000、0.1M乙酸钠pH 4.5和15％(v/v)2R，3R-丁二醇中将晶体在液氮中快速冷冻。在SER-CAT束线ID-22(Advanced Photon Source，Argonne National Laboratory)下在
Figure BDA0000844346390002431
的波长下收集
Figure BDA0000844346390002432
的X射线衍射数据。
未结合的D25 Fab的结构测定和修正。利用HKL2000套组(Otwinowski和Minor，inMethods Enzymol.(Academic Press，第276卷，第307-326页，1997))将X射线衍射数据整合并标度，并且使用PHASER(McCoy等，J.Appl.Crystallogr.，40，658(2007))使用来自PDBID：3GBM(Ekiert等，Science，324，246(2009))和3IDX(Chen等，Science，326，1123(2009))的Ig结构域作为搜索模型来获得分子置换解决方案。使用COOT(Emsley等，ActaCrystallogr D Biol Crystallogr，66，486(2010))进行手动模型构建，并且用PHENIX(Adams等，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，66，213(2010))进行单独的位点、TLS参数和单独的B因子的修正。D25可变域的电子密度是优异的，但恒定结构域的电子密度不良，这可能是由于肘角度的灵活性。最终数据收集和修正统计呈现于表8中。
与D25 Fab复合的RSV F(+)Fd的表达和纯化。从具有三个天然存在的取代(P102A、I379V和M447V)的A2菌株(登录号P03420)获得RSV F(+)Fd蛋白构建体以增强表达。合成具有C端T4次要纤维蛋白三聚化基序(Frank等，J.Mol.Biol.，308，1081(2001))、凝血酶位点、6x His标签和StreptagII的哺乳动物密码子优化的编码RSV F残基1-513的基因，并且亚克隆到源自pLEXm的哺乳动物表达载体中(Aricescu等，Acta Crystallogr D BiolCrystallogr，62，1243(2006))。将表达RSV F(+)Fd、D25轻链和D25重链的质粒(铰链区中具有或不具有终止密码子)同时转染至悬浮的HEK293GnTI-/-细胞中(Reeves等，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.，99，13419(2002))。可选地，仅RSV F(+)Fd质粒可被转染，其中在转染后3小时向GnTI-/-细胞添加纯化的D25Fab。在4-5天后，将细胞上清液采集，离心，过滤并浓缩。最初使用由20mM Tris-HCl pH 7.5、200mM NaCl和250mM咪唑pH 8.0组成的洗脱缓冲液，经由Ni2+-NTA树脂(Qiagen，Valencia，CA)纯化复合物。然后将复合物浓缩并按照制造商的说明(Novagen，Darmstadt，Germany)经由StrepTactin树脂进一步纯化。在用凝血酶蛋白酶(Novagen)温育过夜以除去His和Strep标签后，向复合物中添加过量的D25 Fab，然后在Superose6凝胶过滤柱(GE Healthcare)上用2mM Tris-HCl pH 7.5、350mM NaCl和0.02％NaN3的流动缓冲液纯化。将洗脱的复合物用相等体积的水稀释并浓缩至约5mg/ml。使用类似的程序来表达并纯化AM22Fab复合物。
与D25 Fab复合的RSV F(+)Fd的结晶化和X射线数据收集。通过蒸气扩散方法在静置液滴中在20℃下通过将0.1μl结合于D25Fab的RSV F(+)Fd与0.1μl贮存溶液(40％(w/v)PEG 400、5％(w/v) PEG 3350和0.1M乙酸钠pH 5.5)混合而使初始晶体生长(Majeed等，Structure，11，1061(2003))。在悬滴中手动再生晶体，并且使用含有30％(w/v)PEG 400、3.75％(w/v)PEG 3350、0.1M HEPES pH 7.5和1％(v/v)1，2-丁二醇的贮存溶液使在
Figure BDA0000844346390002451
下衍射的晶体生长。将晶体从液滴直接转移至低温流，并且在SER-CAT束线ID-22下在
Figure BDA0000844346390002452
Figure BDA0000844346390002453
的波长下远程收集X射线衍射数据。
与D25 Fab复合的RSV F(+)Fd的结构测定和修正。利用HKL2000套组(Otwinowski和Minor，in Methods Enzymol.(Academic Press，第276卷，第307-326页，1997))将X射线衍射数据整合并标度，并且通过PHASER(McCoy等，J.Appl.Crystallogr.，40，658(2007))使用未结合的D25 Fab结构和来自融合后RSV F结构的残基29-42、49-60、78-98、219-306、313-322、333-343和376-459(PDB ID：3RRR，McLellan等，J.Virol.，85，7788(2011))作为搜索模型来获得分子置换解决方案。将来自NaAuCl4衍生物的六个位点定位至已知反应性侧链(F残基Met97/His159、Met264/Met274、His317和Met396；D25重链残基Met19/His82和His59)。使用COOT(Emsley等，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，66，486(2010))进行手动模型构建，其中首先构建二级结构元件。用PHENIX(Adams等，Acta Crystallogr D BiolCrystallogr，66，213(2010))进行单独的位点、TLS参数和单独的B因子的修正，在修正期间使用未结合的D25 Fab结构和融合后RSV F结构的部分作为参考模型。构建成熟蛋白中的所有RSV F残基，F2C端至Met97的那些残基除外。最终数据收集和修正统计呈现于表9中。
RSV F竞争结合测定法。在RSV感染的HEp-2细胞上进行抗体的竞争结合。使HEp-2细胞感染3MOI(感染复数)的RSV持续18-20小时。在感染后，使用细胞解离溶液(Cellstripper，Mediatech Inc.，Herndon，VA)分离细胞，并用PBS洗涤。将细胞在PBS中以每孔5×104个接种在96孔U型底板中。将单克隆抗体AM22、D25和101F稀释，起始于浓度100μg/ml，并且添加至HEp-2细胞。在30分钟后，将 100ul的Alexa 488结合的D25以1μg/ml的浓度添加并在4℃下温育一小时。将细胞用PBS洗涤一次，然后用0.5％多聚甲醛固定。通过流式细胞仪(LSR II仪器，Becton Dickinson，San Jose，CA)测量D25-Alexa 488在细胞上的结合。通过使用FlowJo软件8.5版(Tree Star，San Carlos，CA)分析数据。
阴性染色电子显微镜分析。将样品吸附至新鲜辉光放电碳包覆栅格，用水短暂冲洗，并且用新鲜制备的0.75％甲酸铀酰染色。在FEI T20显微镜上用Eagle CCD相机记录图像。利用Bsoft(Heymann和Belnap，J.Struct.Biol.，157，3(2007))和EMAN(Ludtke等，J.Struct.Biol.，128，82(1999))进行图像分析和2D平均化。
RSV病毒/细胞融合抑制测定法。如先前所述(McLellan等，J.Virol.，84，12236(2010))测量抗体抑制RSV病毒/细胞融合的能力。简言之，将HEp-2细胞接种在96孔板中，在37℃下培养24小时，然后在测定之前在4℃下冷却一小时。将RSV-GFP添加至在4℃下预冷却的细胞，然后用冷PBS洗涤细胞以除去未结合的病毒。将连续稀释的抗体添加至冷却细胞中并且在4℃下温育1小时，然后转移至37℃持续18小时。在温育后，将细胞用胰蛋白酶消化，固定在0.5％多聚甲醛中，并通过流式细胞仪分析以测定表达GFP的细胞的频率。
RSV连接抑制测定法。如先前所述(McLellan等，J.Virol.，84，12236(2010))测量抗体抑制RSV连接至细胞的能力。简言之，将HEp-2细胞分散在培养基中，用冷PBS洗涤，接种在96孔v形底板中，并且在使用前在4℃下冷却1小时。将抗体和肝素(已知的RSV连接抑制剂)分布在连续稀释液中，然后在37℃下与RSV A2菌株病毒混合一小时。在离心后从冷却细胞中除去培养基并且将病毒或病毒和试剂的混合物添加至冷却细胞并在4℃下温育1小时。在温育后，用冷PBS洗涤细胞以除去未结合的病毒，并用0.5％多聚甲醛固定。用FITC结合的山羊抗RSV抗体检测结合在细胞上的病毒。将细胞用冷PBS洗涤并通过流式细胞术评估。利用FlowJo软件8.5版(Tree Star， San Carlos，CA)分析结合病毒的中值荧光强度。
表9.结晶数据收集和修正统计。
Figure BDA0000844346390002471
实施例2
RSV F蛋白的稳定化
本实施例说明稳定在融合前构象的示例性RSV F蛋白的设计。 与D25 Fab复合的RSV F蛋白(即，呈融合前构象)的晶体结构与融合后RSV F蛋白(例如公开于McLellan等，J.Virol.，85，7788，2011中，其中坐标以PDB登录号3RRR存放)的结构的比较显示膜近端叶和膜远端叶中的融合前构象与融合后构象之间的剧烈结构重排，对于RSV F的融合前构象的稳定化提供指导。基于融合前和融合后RSV F结构的比较，存在两个经历大的构象变化的区域，位于F1亚基的N端和C端。例如，如图2中所示，F1多肽的位置137-216和461-513在融合前和融合后F蛋白构象之间经历结构重排，而F1多肽的位置271-460保持相对不变。本实施例说明将RSV F蛋白稳定在其融合前构象的若干策略。
为了稳定化作为抗原位点
Figure BDA0000844346390002481
的组分并且涉及结合于抗体D25的F1的N端区域，已经设计了多种策略，包括引入原体内二硫键、原体间二硫键、填充空腔的氨基酸取代、改装取代、引入N连接的糖基化位点和其组合。
原体内二硫键
引入在足够近距离内的两个半胱氨酸残基以在融合前而非融合后构象中形成原体内二硫键可以将F蛋白锁定在融合前构象。分子内二硫键可以形成在三聚体内的单个F2/F1原体内，并且因此不会使三个原体交联在一起。特定来说，在融合前和融合后结构中在改变构象的区域与不改变构象的区域之间形成的二硫键将蛋白质锁定在融合前构象。一个实例是S155C/S290C突变体，其中Ser155位于改变构象的区域中，而Ser290位于不改变构象的区域中。另外，在都改变构象的两个区域，例如位于F1位置137-216内的两个残基，或位于F1位置461-513内的两个残基，或F1位置137-216内的一个残基与F1位置461-513内的第二个残基之间形成二硫键也可足以将蛋白质锁定在融合前构象。
使用上述方法，RSV F蛋白的若干对残基被测定为在融合前构象 而非融合后构象中足够紧密接近，如果在相应的残基对位置引入半胱氨酸，则形成原体内二硫键。这些残基对以及在这些位置引入半胱氨酸残基所需的SEQ ID NO：1的相应氨基酸取代示于表10中。表10也列出含有所示取代并且对应于包括信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的前体F0构建体的SEQ ID NO。
表10.用于原体内二硫键稳定化的示例性交联的半胱氨酸对
Figure BDA0000844346390002491
Figure BDA0000844346390002501
分子间二硫键
引入在足够近距离内的两个半胱氨酸残基以在融合前而非融合后构象中形成原体间二硫键可以将F蛋白锁定在融合前构象。原体间二硫键将形成在三聚体内的相邻原体之间，并且因此不会使三个原体交联在一起。特定来说，在融合前和融合后结构中在改变构象的区域与不改变构象的区域之间形成的二硫键将蛋白质锁定在融合前构象。一个实例是A153C/K461C突变体，其中Ala153位于改变构象的区域中，而Lys461在不改变构象的区域中。另外，在都改变构象的两个区域，例如位于F1位置137-216内的两个残基，或位于F1位置461-513内的两个残基，或F1位置137-216内的一个残基与F1位置461-513内的第二个残基之间形成二硫键也可足以将蛋白质锁定在融合前构象。
使用上述方法，RSV F蛋白的若干对残基被测定为在融合前构象而非融合后构象中足够紧密接近，如果在相应的残基对位置引入半胱氨酸，则形成原体间二硫键。这些残基对以及在这些位置引入半胱氨酸残基所需的相应氨基酸取代示于表11中。表11也列出含有所示取代并且对应于也包括信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的前体F0构建体的SEQ IDNO。
表11.用于原体间二硫键稳定化的示例性交联的半胱氨酸对
Figure BDA0000844346390002502
Figure BDA0000844346390002511
另外，本文所述的多种稳定化突变可以组合以产生含有一个以上稳定化突变的PreF抗原。含有形成原体内或原体间二硫键的第一和第二残基对的这些构建体的实例提供于表12中。表12也列出含有所示取代并且对应于也包括信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ IDNO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的前体F0构建体的SEQ ID NO。
表12.用于原体内和原体间二硫键稳定化的组合的示例性交联的半胱氨酸对
Figure BDA0000844346390002512
此外，可以从F蛋白序列插入(或缺失)氨基酸以调节F蛋白结构中的残基的比对，以使得特定残基对在足够近的距离内以在融合前而非融合后构象中形成原体内或原体间二硫键，如上文所讨论，其将 F蛋白稳定在融合前构象。这些修饰的实例提供于表13中。表13也列出含有所示取代并且对应于也包括信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的前体F0构建体的SEQ ID NO。
表13.使用氨基酸插入以定向F蛋白来接受原体间-原体内二硫键或其组合
Figure BDA0000844346390002521
Figure BDA0000844346390002531
填充空腔的取代
与D25 Fab复合的RSV F蛋白(即呈融合前构象)的晶体结构与融合后RSV F蛋白(例如公开于McLellan等，J.Virol.，85，7788，2011中；呈融合后构象的RSV F蛋白的结构坐标以PDB登录号3RRR存放于蛋白质数据库(PDB)中)的结构的比较鉴定了融合前构象中的若干内部空腔或凹穴，其对于F必须塌陷以转变为融合后构象。这些空腔列于表14中。因此，填充这些内部空腔通过防止转变为融合后构象而将F稳定在融合前状态。通过用具有大的侧链的氨基酸取代具有小的侧链的氨基酸来填充空腔。所述空腔可以是原体内空腔或原体间空腔。将RSV蛋白稳定在其融合前构象的RSV F填充空腔的修饰的一个实例是S190F/V207L突变体。
使用这种策略，鉴定若干填充空腔的修饰以将RSV F蛋白稳定在其融合前构象。这些修饰示于表14中。表14也列出含有所示取代并且对应于包括信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的前体F0构建体的SEQ ID NO。
表14.示例性填充空腔的氨基酸取代
空腔 A.A.取代 SEQ ID NO：
Ser190和Val207 190F和207L 191
Val207 207L和220L 193
Ser190和Val296 296F和190F 196
Ala153和Val207 220L和153W 197
Val207 203W 248
Ser190和Val207 83W和260W 192
Val296 58W和298L 195
Val90 87F和90L 194
所示空腔可通过可以突变成填充空腔的较大残基的邻接空腔的小残基提及。应理解，其他残基(除了下文提及的空腔的残基之外)也可突变以填充相同的空腔。
改装取代
另外，可例如通过增强疏水性相互作用或氢键形成来增加邻近残基的相互作用来稳定化RSV F蛋白的融合前构象。此外，可通过降低导致融合前构象的亚稳定性的邻近残基的不利或排斥相互作用来稳定化RSV F蛋白的融合前构象。这可以通过消除带相似电荷的残基簇来实现。这些修饰的实例示于表15中。表15也列出含有所示取代并且对应于包括信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ IDNO：185的位置559-568)))的前体F0构建体的SEQ ID NO。
表15.改装氨基酸取代
Figure BDA0000844346390002541
Figure BDA0000844346390002551
Figure BDA0000844346390002561
糖基化突变
另外，引入在融合前RSV F构象中将是溶剂可及的、但在融合后RSV F构象中是溶剂不可及的N连接的糖基化位点可通过防止采用融合后状态而将RSV F稳定在融合前状态。为了产生N连接的糖基化位点，可引入序列Asn-X-Ser/Thr(其中X是除Pro之外的任何氨基酸)。这可以通过用Ser/Thr氨基酸取代天然Asn残基C端的两个残基，或通过用Asn氨基酸取代天然Ser/Thr残基N端的两个残基，或通过被一个非脯氨酸氨基酸隔开的Asn和Ser/Thr残基的取代来实现。
使用这种策略，鉴定了将在融合前RSV F构象中是溶剂可及的、但在融合后RSV F构象中是溶剂不可及的N连接的糖基化位点的若干位置。这些修饰示于表16中。表16也列出含有所示取代并且对应于包括信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、三聚化结构域(折叠子结构域)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ IDNO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))的前体F0 构建体的SEQ IDNO。
表16.示例性N连接的糖基化
Figure BDA0000844346390002571
实施例3
稳定化PreF抗原的膜近端叶
如上文所讨论，与D25 Fab复合的RSV F蛋白(即，呈融合前构象)的晶体结构与融合后RSV F蛋白(例如公开于McLellan等，J.Virol.，85，7788，2011中，其中坐标以PDB登录号3RRR存放)的结构的比较显示膜远端叶中的融合前构象与融合后构象之间的剧烈结构重排。基于融合前和融合后RSV F结构的比较，存在两个经历大的构象变化的区域，位于F1亚基的N端和C端。例如，如图2中所示，F1多肽的位置137-216和461-513在融合前和融合后F蛋白构象之间经历结构重排，而F1多肽的位置271-460保持相对不变。本实施例说明将F1的C端区域(其包括RSV F蛋白的膜近端叶)稳定化的若干策略。已经鉴定了多种策略，包括引入三聚化结构域(如上文所讨论)，引入可以形成将F1的C端区域稳定化的二硫键的半胱氨酸对，和引入跨膜结构域(例如，对于包括膜结合的PreF抗原的应用)。
二硫键
用于稳定化F蛋白的膜近端叶的一种策略是引入一个或多个半 胱氨酸取代，其引入将F1的C端部分稳定化的二硫键(例如，对于包括可溶性PreF抗原的应用)。这种策略可以与本文提供的任何稳定化修饰组合，例如，实施例2中所述的那些，例如具有S155C/S290C半胱氨酸取代的F1蛋白。一种策略包括引入两个半胱氨酸残基，其在足够近的距离内以形成原体间二硫键，所述原体间二硫键连接呈融合前构象的F1蛋白的C端区域。原体间二硫键将形成在三聚体内的相邻原体之间，并且因此使三个原体交联在一起。使用上述方法，RSV F蛋白的若干对残基被测定为在融合前构象中足够紧密接近，如果在相应的残基对位置引入半胱氨酸，则形成原体间二硫键。
可被引入以产生稳定化膜近端叶的二硫键的半胱氨酸取代的实例包括在如下残基对的半胱氨酸取代：
(a)486和487
(b)486和487；其中P插入在位置486/487之间
(c)512和513
(d)493；在329/330之间的C插入
(e)493；在329/330之间的C插入，和在492/493之间的G插入
此外，取决于C端半胱氨酸对的位置，F1多肽的长度可改变。例如，F1多肽可以包括位置137-481，其从F1多肽消除α10螺旋。
含有包括在这些残基对的半胱氨酸的修饰的构建体的实例以及其他描述列于表17中。表17也列出含有所示取代并且对应于也包括信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(具有不同位置)的前体F0构建体的SEQ ID NO。
表17.稳定化F蛋白的膜近端叶的二硫键
Figure BDA0000844346390002581
Figure BDA0000844346390002591
跨膜结构域
用于稳定化F蛋白的膜近端叶的另一个策略是在F1蛋白上包括跨膜结构域，例如，对于包括膜锚定PreF抗原的应用。例如，跨膜 序列的存在可用于以跨膜蛋白形式表达以用于膜囊泡制备。所述跨膜结构域可以连接至含有任何本文提供的稳定化突变的F1蛋白，例如，在实施例2中所述的那些，例如具有S155C/S290C半胱氨酸取代的F1蛋白。另外，所述跨膜结构域可以进一步连接至RSV F1胞质尾。包括信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(位置137-513)、RSV跨膜结构域的前体F0构建体的实例以SEQ IDNO：323(不具有胞质域)和324(具有胞质域)提供。
实施例4
单链PreF抗原
本实施例说明缺乏天然弗林裂解位点以使得F蛋白原体以单一多肽链而非F2/F1异二聚体形式形成的重组RSV F蛋白。
表18列出包括F位置98-149的缺失的若干单链PreF抗原，所述缺失除去两个弗林裂解位点、pep27多肽和融合肽。F1和F2多肽的其余部分是通过连接子接合的。另外，可以使用若干策略以将单链构建体稳定在融合前构象，包括使用上文实施例2和3中所述的策略。表18也列出含有所示取代并且对应于也包括信号肽、F2多肽(位置26-109)、pep27多肽(位置110-136)、F1多肽(具有不同位置)的前体F0构建体的SEQ ID NO。
表18.单链PreF抗原
Figure BDA0000844346390002601
Figure BDA0000844346390002611
实施例5
用二硫键和三聚化结构域稳定化的RSV F蛋白
本实施例说明用二硫键和三聚化结构域稳定化的RSV F蛋白的产生。如图10中所示，位置155和290的丝氨酸残基(在带状图中由箭头指示并且以红色突出显示)在RSV F蛋白的融合前构象中而非在RSV F蛋白的融合后构象中彼此相邻。此外，这些残基的侧链朝向彼此。然而，与丝氨酸155、缬氨酸154和赖氨酸156相邻的残 基的侧链远离丝氨酸290的侧链定向。鉴于这些研究结果，构建具有S155C和S290C取代的重组RSV F蛋白。预期在这种155/290构建体中的半胱氨酸残基将形成将重组RSV F蛋白锁定在融合前构象的二硫键，但在位置154或156(并非位置155)并入半胱氨酸将不能产生稳定化二硫键。
使用标准分子生物学技术使编码天然RSV F0多肽的核酸分子突变以编码被称为RSVF(+)FdTHS S155C，S290C的RSV F蛋白，并且以SEQ ID NO：185示出：
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAP RDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185)。
RSVF(+)FdTHS S155C，S290C包括信号肽(残基1-25)、F2多肽(残基26-109)、Pep27多肽(残基110-136)、F1多肽(残基137-513)、折叠子结构域(残基514-544)和凝血酶裂解位点(LVPRGS(SEQ ID NO：185的位置547-552))和纯化标签(his标签(HHHHHH(SEQ ID NO：185的位置553-558))和Strep标签II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：185的位置559-568)))。也产生具有V154C或K156C取代而非S155C取代的对照构建体。
当在细胞中表达时，RSVF(+)FdTHS S155C，S290C被处理并且以稳定和可溶性RSVF蛋白形式表达；然而，具有154/290或156/290取代的对照构建体不能表达(可能是因为它们不能以可溶性构象折叠)(参见图10)。
将RSVF(+)FdTHS S155C，S290C构建体纯化并测试与融合前特异性抗体AM22和D25以及131-2a抗体(其结合融合前和融合后RSV F构象上存在的抗原位点I)、莫维珠单抗和帕利珠单抗(其结合融合前和融合后RSV F构象上存在的抗原位点II)和101F抗体(其结合融合前和融合后RSV F构象上存在的抗原位点IV)的抗体结合。如图11(左图)中所示，所有这些抗体都特异性结合于纯化的RSVF(+)FdTHS S155C，S290C构建体，这表明RSVF(+)FdTHSS155C，S290C保持融合前构象。结果进一步表明，这种构建体保持RSV F的融合前和融合后构象所共有的抗原位点I、II和IV。
为了证实纯化的RSVF(+)FdTHS S155C，S290C呈三聚体构象，使这种构建体通过尺寸排阻色谱柱。如图11(右图)中所示，纯化的RSVF(+)FdTHS S155C，S290C制剂以单峰洗脱，所述单峰对应于三聚体F蛋白的分子量。相比之下，缺乏S155C和S290C取代的对照构建体制剂(其预期不会稳定在融合前构象)以多个峰洗脱，这表明触发的F蛋白玫瑰花结和聚集体的存在，表明这种对照构建体在均质融合前构象中不稳定。
为了进一步证实RSVF(+)FdTHS S155C，S290C构建体稳定在融合前构象，进行电子显微镜研究(图12)并且证实RSVF(+)FdTHS S155C，S290C形成具有与RSV F的融合前构象类似形状并且显著不同于融合后F蛋白的结构的均质群体(右图，来自Martin等，J.Gen.Virol.，2006)。
进行结晶学研究以证实纯化的RSVF(+)FdTHS S155C，S290C在溶液中是均质的。晶体在水溶液中的形成是对于蛋白质在溶液中的均质性的严格测试。图15示出通过纯化的RSVF(+)FdTHS S155C，S290C在含有0.2M硫酸锂、1.64M酒石酸Na/K和0.1M CHES的水性缓冲液(pH 9.5)中形成的晶体的图像。RSVF(+)FdTHS S155C，S290C晶体在水性缓冲液中的形成证实这种蛋白质在溶液中是基本上均质的。
实施例6
使用PreF抗原诱导中和免疫反应
本实施例说明PreF抗原在受试者中诱导RSV中和免疫反应的用途。
将八周龄的不含病原体的CB6F1/J小鼠(Jackson Labs)分成5组，每组10只，并且用以下方案免疫化：
1)活RSVA2(RSV)，5×106pfu，经鼻内；
2)福尔马林灭活的明矾沉淀的RSV(FI-RSV)，经肌肉内(IM)；
3)20μg稳定化融合前RSV F(RSVF(+)FdTHS S155C，S290C；融合前F)于50μgpolyI：C中，IM；
4)20μg融合后RSV F三聚体(融合后RSV)于50μg polyI：C中，IM；和
在时间0时使第1组(活RSV)感染一次，并且在第0周和第3周对所有其他组进行免疫化。在第5周、在第2次IM注射后第两周或在RSV感染后第五周获得血清。通过以下方法测定中和活性：将血清分配为四倍稀释液(从1∶10到1∶40960)，与相等体积的来自菌株A2(A亚型)或18537(B亚型)和Katushka荧光蛋白的表达重组mKate-RSV的原型F基因混合，并且在37℃下温育一小时。接着，将50μl的每种血清稀释液/病毒混合物添加至已经在30μl MEM(最低必需培养基)中以1.5×104的密度接种在384孔黑色光学底板的每个孔的HEp-2细胞中，并且温育20-22小时，然后在588nm激发和635nm发射下进行分光光度分析(SpectraMaxParadigm，Molecular Devices，Sunnyvale，CA 94089)。使用GraphPad Prism(GraphPadSoftware Inc.，San Diego CA)通过曲线拟合和非线性回归来计算每种样品的IC50。通过Student T检验测定P值。基本上如先前所述(参见例如Chen等，J.Immunol.Methods.，362：180-184，2010，以引用的方式并入本文中)进行用于测量RSV中和的上述方法，不同之处在于 通过荧光板读取器而非流式细胞仪来读出。
使用这种测定法，通常高于约100EC50的抗体反应将被视为具保护性的。如图13和图14中所示，施用稳定在融合前构象的RSV F蛋白(RSV F(RSVF(+)FdTHS S155C，S290C)的小鼠所产生的针对RSV A的中和免疫反应相比于施用呈融合后构象的RSV F蛋白的小鼠所产生的中和免疫反应大约15倍，并且针对RSV B的反应相比于施用呈融合后构象的RSV F蛋白的小鼠所产生的反应大约5倍。图13示出在初始免疫化后第5周的结果，并且图14示出在免疫化后第7周的结果。所引起的平均IC50值也示于图13和图14中。RSV A和B亚群之间的中和差异并不惊人，因为RSVF(+)FdTHS S155C，S290C构建体是源自来自RSV A亚群的F蛋白。预期用源自RSV B菌株的相应构建体进行免疫化将产生对RSV B具更大特异性的中和血清(参见图41)。
此外，证实稳定化融合前F可以在明矾以及polyI：C中配制并且保持由针对抗原位点
Figure BDA0000844346390002651
的抗体反应所赋予的免疫原性。将BALB/c小鼠用20μg的源自A亚型的DS S155C/S290C形式的稳定化融合前F免疫化并且用明矾(氢氧化铝凝胶10mg/ml，Brenntag，Frederikssund，Denmark)或polyI：C配制。在第0周和第3周对小鼠接种，并且在第5周时间点(在第二次注射后第2周)，获得血清用于中和测定法(参见图42)。结果显示用稳定在融合前构象的RSV F蛋白进行免疫化产生针对RSV的保护性免疫反应。
实施例7
用所公开的抗原治疗受试者
本实施例描述可用于治疗具有RSV感染或处于具有RSV感染的风险下的受试者的方法，其通过施用所公开的PreF抗原、或编码、表达或包括PreF抗原的核酸或病毒载体中的一种或多种来实现。在特定实施例中，所述方法包括筛选具有RSV感染、认为具有RSV感 染或处于具有RSV感染的风险下(例如由于免疫性受损、生理状况或暴露于RSV)的受试者。可以检查具有未知感染状况的受试者以确定他们是否具有感染，例如使用血清学试验、身体检查、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射学筛查或本领域普通技术人员已知的其他诊断技术。在一些实施例中，选择具有RSV感染或处于获得RSV感染的风险下的受试者。选择发现(或已知)具有RSV感染并且从而可通过施用所公开的PreF抗原、或编码、表达或包括PreF抗原的核酸或病毒载体治疗的受试者以接受所述PreF抗原、或编码、表达或包括PreF抗原的核酸或病毒载体。也可选择处于患上RSV感染风险下的受试者，例如，免疫功能低下的老年人和非常年轻的人如婴儿。
选择用于治疗的受试者可以被施用治疗量的所公开的PreF抗原。包括PreF抗原的免疫原性组合物可以每剂0.1μg/kg体重至约1mg/kg体重、例如0.1μg/kg体重至约1μg/kg体重、每剂0.1μg/kg体重至约10μg/kg体重、每剂1μg/kg体重至100μg/kg体重、每剂100μg/kg体重至500μg/kg体重、或每剂500μg/kg体重至1000μg/kg体重或甚至更大的剂量施用。在一些实施方案中，约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100μg的PreF抗原包括在以单一剂量施用至受试者的免疫原性组合物中。所述免疫原性组合物可以若干剂量施用，例如连续地、每天一次、每周一次或每月一次。施用模式可以是本领域中使用的任何模式，例如经鼻施用。施用至受试者的药剂的量可以由临床医生确定，并且可取决于所治疗的特定受试者。本文提供特定的示例性量(但本公开不限于这些剂量)。
实施例8
用二硫键、填充空腔的取代和三聚化结构域稳定化的RSV F蛋白
本实施例说明用二硫键和三聚化结构域稳定化的RSV F蛋白的产生。
图16示出通过工程改造的二硫键突变S155C和S290C(称为 “DS”)、填充空腔的突变S190F和V207L(称为“Cav1”)和附接至F蛋白的F1多肽的C端的异源三聚化结构域而稳定化的重组RSV F蛋白的设计。所描绘的三维结构是D25结合的RSV F结构，并且显示具有以粉红色和棕褐色着色的分子表面显示的两个原体，和以飘带显示的第三原体。示出在融合前构象和融合后构象之间移动超过
Figure BDA0000844346390002671
的F1的N端和C端残基。插图示出残基S155C与S290C之间的工程改造的二硫键，以及填充空间的空腔突变S190F和V207L。T4噬菌体次要纤维蛋白三聚化结构域的模型示于融合前三聚体的底部。
使用实施例1和5中所述的方法表达和纯化在人类RSV亚型A中包括S155C、S290C、S190F和V207L(Cav1)取代以及附接的C端异源折叠子结构域的RSV F蛋白，并且其被称为RSV_A F(+)FdTHS DSCav1。
RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的抗原性表征示于图17中。使用OctetRED 384TM仪器(ForteBio，Melno Park，CA)测量可溶性D25、AM22、5C4、101F、莫维珠单抗和帕利珠单抗Fab与固定化RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的缔合和解离速率。提供每种抗体的平衡解离常数。
通过尺寸排阻色谱法阐明RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的纯度(图18)。使在凝血酶裂解后以除去标签的纯化蛋白通过16/70 Superose 6尺寸排阻柱。洗脱体积与糖基化三聚体一致。
图19中示出通过DS、Cav1或DSCav1突变稳定化的RSV_A F(+)FdTHS变体的抗原性和物理特性，包括来自短暂表达的质粒的产率、针对各种抗原位点的抗原性，和在各种温度(350mM NaCl pH 7.0，在50℃、70℃或90℃下)、pH(350mM NaCl pH 3.5或pH 10，在25℃下)和摩尔渗透压浓度(10mM或3000mM摩尔渗透压浓度，pH 7.0，在25℃下)下温育1小时后或达到10次冷冻-解冻循环(在350mM NaCl pH 7.0中)的D25结合的保持(以分数量提供)。DSCaV1 变体保持抗原位点
Figure BDA0000844346390002681
识别，具有改进的物理稳定性，如通过在暴露于温度、pH、摩尔渗透压浓度和冷冻-解冻的极值后相比于DS或Cav1变体的D25反应性的较高保持来判断。
为了研究DSCav1突变体的结构特性，使用X射线结晶学测定RSV_A F(+)FdTHSDSCav1的三维结构。图20示出RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的
Figure BDA0000844346390002682
晶体结构的飘带图。较暖的颜色和较粗的飘带对应于增加的B因子。虽然存在稳定化突变，但在三聚体顶端的抗原位点
Figure BDA0000844346390002683
保持显著灵活性。图21示出RSV_A F(+)FdTHS DSCav1的结构与D25结合的RSV F的结构的比较。图22突出显示了RSV_A F(+)FdTHS DSCav1结构中的稳定化突变。对应于半胱氨酸残基155与290之间的二硫键(左边)以及填充空腔的Phe190残基(右边)的所观测电子密度指示晶体中存在这些修饰。
为了测定RSV_A F(+)FdTHS DSCav1构建体的免疫原性，用这种构建体接种小鼠和非人类灵长类动物并且对于从接种动物获得的血清测试RSV中和(图23和图24)。如上文实施例6中所述，将小鼠免疫化，并且测试所得血清的中和活性。简言之，将每组十只CB6小鼠用与50μg poly I：C佐剂混合的10μg所示RSV F蛋白免疫化。在第0周和第3周进行免疫化，并且对于来自第5周和第7周的血清测试RSV亚型A(RSV_A)和B(RSV_B)的中和。平均值由水平红线指示。在第0周和第4周向体重为8.76-14.68kg的印度源普通猕猴动物肌肉内注射免疫原。每隔一周采集血液，持续至多6周。利用与500μg的poly I：C佐剂混合的50μg所示RSVF蛋白对每组四只RSV原生恒河猴进行肌肉内免疫化。在第0周和第4周进行免疫化，并且对于来自第6周的血清测试RSV亚型A(左边)和B(右边)的中和。平均值由水平红线指示。总而言之，这些结果显示RSV_A F(+)FdTHS DSCav1构建体在小鼠和非人类灵长类动物中成功地产生中和反应。
实施例9
用于呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白疫苗的基于结构的设计
摘要。呼吸道合胞病毒(RSV)是造成五岁以下儿童住院治疗的主要原因。为了诱导针对RSV的保护性体液反应，努力重点放在抗原位点
Figure BDA0000844346390002691
(对融合(F)糖蛋白的融合前状态具特异性的亚稳态位点)上，因为这个位点是由自然感染引起的高效RSV中和抗体的主要靶标。使用基于结构的设计来工程改造F的稳定化形式，其针对pH和温度的极值保持抗原位点
Figure BDA0000844346390002692
六种稳定化F晶体结构提供关于引入的半胱氨酸残基和填充疏水性空腔的原子水平细节并且揭示微细不同的“融合前”F构象。在小鼠和非人类灵长类动物中，用RSV F的位点
Figure BDA0000844346390002693
稳定化变体免疫化引起的RSV特异性中和活性是由呈融合后状态的RSV F引起的RSV特异性中和活性的3-15倍。呈现病毒易攻击超位点的原子水平设计因此可对疫苗开发具有改革性影响。
引言。呼吸道合胞病毒(RSV)据估计造成1月龄至1岁儿童中死亡率的6.7％并且在老年人中在与流感病毒感染造成的死亡率相当的水平下造成过高死亡率。虽然RSV感染不诱导完全保护性免疫，但针对RSV融合(F)糖蛋白的抗体可以在人类中预防严重疾病，如通过用F定向抗体帕利珠单抗
Figure BDA0000844346390002697
进行被动预防所证明。
帕利珠单抗的成功经验已经刺激了旨在诱导保护性RSV F定向抗体的疫苗努力。这些努力已经因RSV F的结构多样性而复杂化，所述RSV F是呈现如下至少两种构象的I型融合蛋白：亚稳态融合前状态和稳定的融合后状态。两种状态共有被中和抗体(包括帕利珠单抗)靶向的表位，并且融合后RSV F被开发作为疫苗候选物。如本文所述，发现由自然感染引起的RSV中和抗体的主导靶标主要存在于RSV F的融合前构象上，并且抗体如AM22和D25(参见例如U.S.12/600,950和U.S.12/898,325)(相比于帕利珠单抗基本上更有效)靶向抗原位点
Figure BDA0000844346390002695
所述抗原位点
Figure BDA0000844346390002696
是对融合前F具特异性的亚稳态位点，其位于融合前RSV F三聚体的膜远端顶端。
为了增强这些有效抗体的诱导，设计RSV F的工程改造的可溶性变体以稳定地暴露抗原位点
Figure BDA0000844346390002701
这些变体在抗原性和结晶学上被表征，并且在小鼠和非人类灵长类动物中测试免疫原性。结果提供对于设计、抗原性、结构和免疫原性之间的相互作用的见解，并且显示保存和呈现适当的抗原靶标的基于结构的工程改造可以如何对保护性体液反应的诱导具有革命性影响。
本文所述的基于结构的疫苗策略包括四步策略：(1)鉴定由具有有效中和活性的抗体靶向的病毒易攻击超位点，(2)测定与代表性抗体复合的超位点的结构，(3)工程改造在不存在识别抗体的情况下超位点的稳定呈现，和(4)通过用呈现超位点的工程改造抗原进行免疫化来引起高效价保护性反应(图26)。
RSV F抗原的工程改造
抗原位点
Figure BDA0000844346390002702
由于其被非常有效的RSV中和抗体识别而被选择作为靶标超位点；其与D25抗体复合的结构描述于本文中(图26B)。为了工程改造稳定呈现位点
Figure BDA0000844346390002703
的RSV F的变体，对由D25结合的RSV F的结构进行分析。在机理上，存在多种方式来稳定化蛋白质构象。对于组合有附接至RSV F胞外域的C端(McLellan等，J.Virol.85，7788(2011))的T4噬菌体次要纤维蛋白三聚化结构域(“折叠子”)(Efimov等，J Mol Biol 242，470(1994)；Boudko等，European journal of biochemistry/FEBS 269，833(2002))的这些测试其稳定化位点
Figure BDA0000844346390002704
而不损害其识别的机制。
引入预测在目标构象中形成二硫键、但在可选构象中远隔的半胱氨酸对是稳定化所选结构的一种方法。丝氨酸残基155和290的β碳在D25结合的RSV F结构中相隔
Figure BDA0000844346390002705
(参见实施例1)并且在融合后结构中相隔
Figure BDA0000844346390002706
(McLellan等，J.Virol.85，7788(2011)；描述于上文并且参见图27和图32)。S155C-S290C双重突变体，被称为“DS”，形成稳定的RSV F三聚体，以1.4mg/L表达，保持抗原位点
Figure BDA0000844346390002707
并 且如通过阴性染色EM所判断是均质的(描述于上文；也参见图31、图33)。其他半胱氨酸修饰，例如在可与融合前和融合后状态相容的RSV F区域之间的那些(例如S403C和T420C)，不会稳定化抗原位点
Figure BDA0000844346390002711
(图31)。也测试了多种潜在的亚基间双重半胱氨酸修饰；然而所测试的亚基间双重半胱氨酸取代都不表达超过0.1mg/L。
填充空腔的疏水性取代提供稳定化所选构象的另一种方法。对D25结合的RSV F结构分析RSV F的D25结合构象所特有的疏水性空腔，其邻接在融合前和融合后F状态中不同的区域。在融合前结构的膜远端“顶部”中鉴定多个这样的空腔，其接近D25的结合位点，并且模拟疏水性改变以填充这些空腔。S190F和V207L改变采用具有最小冲突的普遍侧链构象，而K87F、V90L、V220L和V296F改变显示较小空间相容性。评估用变化对填充这些空腔。被称为“Cav1”的S190F-V207L对(图27)形成稳定的RSV F三聚体，以2.2mg/L表达，并且保持抗原位点
Figure BDA0000844346390002712
(图31)。同时，K87F-V90L、S190F-V296F和V207L-V220L变体显示增强的D25识别保持，但RSV F三聚体产率小于0.1mg/l(图31)。
朝向融合前RSV F中心的其他空腔接近融合肽、三聚体轴和包含残基Asp486、Glu487和Asp489的酸性补片。模拟多种填充空腔的改变，包括F137W、F140W和F488W，并且分析这些改变与D486H、E487Q和D489H的组合(图31)。在所测试的六种组合中，仅两种(F488W和D486H-E487Q-F488W-D489H)以纯化RSV F三聚体大于0.1mg/l的水平表达并保持D25识别。D486H-E487Q-F488W-D489H变体被称为“TriC”，形成稳定的RSV F三聚体，以0.8mg/l表达，并保持抗原位点
Figure BDA0000844346390002713
(图31、图27)。
此外测试了使融合后构象失稳对于抗原位点
Figure BDA0000844346390002714
保存的影响。预测引入与F的融合前而非融合后构象相容的N连接的聚糖的V178N似乎不会稳定化抗原位点
Figure BDA0000844346390002715
V185E或I506K也是如此，其将谷氨酸或赖氨酸置于融合后六螺旋束的内部(图31)。这些突变可能导致RSVF的一些中间构象，其被“触发”，但不能采用融合后构象。总的来说，构建超过100种的RSV F变体，其以96孔转染格式表达(Pancera等，PLoS ONE 8，e55701(2013))，并且通过ELISA测试与D25和莫维珠单抗的结合。十五种构建体与D25结合相容，其中六种在4℃下保持D25识别持续至少7天，并且这些中的三种可纯化为保持抗原位点
Figure BDA0000844346390002721
的均质三聚体(图31)。总的来说，在96孔上清液中在4℃下持续至少7天的D25结合保持与来自大规模表达和纯化的纯化三聚体的产率之间观测到强烈相关性(图34)。
位点
Figure BDA0000844346390002722
稳定性的组合优化
DS、Cav1和TriC变体显示多种物理和抗原特性。DS变体对于pH和温度极值的稳定性最小，但更永久地稳定在三聚体状态，而对于Cav1和TriC观测到从三聚体到聚集体的恒定相互转化。为了评估通过组合DS、Cav1和TriC是否可获得RSV F的更加最佳变体，进行所有组合。
组合一般改进针对物理极值的D25反应性保持。因此，例如，所有组合都显示对于在50℃或pH 10.0下温育的改进的稳定性。然而，在Cav1-TriC和DS-Cav1-TriC中也观测到由TriC展现的对于冷冻-解冻的低耐受性。总的来说，DS-Cav1组合在三聚体产率和对于温度、pH、摩尔渗透压浓度和冷冻-解冻的极值的物理稳定性方面似乎最佳(图31、图35)，并且如通过阴性染色EM判断是均质的(图33)。
结晶学分析
为了提供原子水平反馈，测定RSV F的位点
Figure BDA0000844346390002723
稳定化变体的晶体结构(图28)。DS、Cav1、DS-Cav1和DS-Cav1-TriC变体在类似的1.5M酒石酸盐pH 9.5条件中都结晶，并且这些立方晶体分别在
Figure BDA0000844346390002724
和
Figure BDA0000844346390002725
分辨率的分辨率下衍射X射线(图40)。通过使用D25结合的RSV F结构作为搜索模型来获得分子置换解决方案，并且这些揭示在不对称单元中的单一RSV F原体，其中三聚 体F轴沿着结晶三重对齐。也从1.7M硫酸铵pH 5.5条件获得Cav1的四方晶体和DS-Cav1的立方晶体，并且这些分别在
Figure BDA0000844346390002732
和
Figure BDA0000844346390002731
的分辨率下衍射(图40)。分子置换揭示出四方晶格在不对称单元中具有完整的RSV F三聚体，并且与酒石酸盐立方晶格高度相关。总的来说，这些结构揭示工程改造的RSV F变体基本上呈D25结合构象(工程改造的RSV F变体相比于D25结合构象具有
Figure BDA0000844346390002733
的Cα均方根差并且相比于融合后构象具有约
Figure BDA0000844346390002734
的Cα均方根差)。
虽然DS变体的结构(图28，最左栏)与可溶性三聚体一样稳定，其中在155和290的半胱氨酸取代残基确实形成在很大程度上防止触发为融合后状态的二硫键，但RSV F三聚体的许多膜远端部分(包括抗原位点
Figure BDA0000844346390002735
)是无序的(残基63-72和169-216)或呈不同构象。因此，例如，DS结构中的残基160-168延伸α2螺旋而非形成转折并且如在D25结合的F结构中起始α3螺旋(图28B，最左图)。DS结构与D25结合的RSV F结构之间的差异的一种非限制性解释是结晶化DS呈不结合D25的构象。总的来说，DS变体保持RSV F的融合前状态的许多特征，包括在三聚体空腔内部的融合肽。
相比于DS，Cav1结构(图28，第2栏和第3栏)在膜远端顶端中更有序，其中α3螺旋、β3/β4发夹和α4螺旋明确限定。含有S190F取代的残基137-202当与D25结合的F结构相比时具有
Figure BDA0000844346390002736
的Cα-rmsd。较高程度的结构次序可能是由于S190F突变，其填充在D25结合的F结构中观察到的空腔，并且增加的范德华力接触残基Ile57、Lys176、Val192、Glu256、Ser259和Leu260。Cav1中的其他填充空腔的突变V207L相比于D25结合的F结构改变
Figure BDA0000844346390002737
其中α4螺旋的C端部分扭结接近Pro205并且在两种结晶化条件中采用不同构象(图28B，从左边开始第2个和第3个图)。
四方晶格中的Cav1结构的惊人特征是F2的C端，其在D25结合的F结构中无序，但在Cav1中，与融合肽并排地通入三聚体空腔中。有趣的是，C端终止于Ala107而非Arg109，如在弗林位点 (Arg106-Ala107-Arg108-Arg109)裂解后所预期。在Cav1结构中，Arg106的正电荷被有序的硫酸根离子抵消(图28C)。在生物学上，F2C端的内部位置在触发融合前F构象时可能起作用。
来自两种四方晶型的DS-Cav1结构(图28，从右边开始第2栏和第3栏)与Cav1结构的比较仅揭示轻微差异(在硫酸铵条件中生长的Cav1与DS-Cav1之间的残基的Cαrmsd为
Figure BDA0000844346390002741
立方晶格中的447个残基的Cαrmsd为
Figure BDA0000844346390002742
)。在RSV F顶端存在最大差异，包括抗原位点
Figure BDA0000844346390002743
并且特别是在残基64-73和203-216处。值得注意的是，对于所有的位点
Figure BDA0000844346390002744
稳定化变体，在这个顶端区域中的原子迁移率(B因子)最高，或许指示固有的位点
Figure BDA0000844346390002745
灵活性。然而，有趣的是，位点
Figure BDA0000844346390002746
当被D25结合时具有低原子迁移率，揭示D25稳定化总体和局部RSV F构象的能力。
DS-Cav1-TriC三重组合的结构(图28，最右栏)与其他含Cav1的RSV F变体结构也高度相似。然而，电子密度的一种差异对应于在膜近端区的弱密度的膨胀，其对应于T4-次要纤维蛋白三聚化结构域的尺寸(Stetefeld等，Structure 11，339(2003))，这在含有这种结构域的其他结晶化RSV F结构(包括D25结合结构)中不可见。堆叠中的小的结构差异可能允许这种结构域的部分有序(并且也可造成其对于DS-Cav1-TriC晶体相对于其他立方变体的衍射极限增加)，而非DS-Cav1-TriC稳定化RSV F与这种三聚化结构域之间的相互作用差异。
在残基486-489的TriC变化方面，关键的F488W取代直接相对于RSV F三聚体的邻近原体的F488W取代堆叠。Trp488的吲哚侧链指向三聚体顶端并且还与融合肽的140Phe的侧链形成环堆叠相互作用(图28C，最右图)。这种融合肽相互作用未在任何含Phe488结构中观察到，可能抑制融合肽从融合前三聚体空腔的提取，从而提供F488W变化稳定化RSV F的融合前状态的能力的结构基本原理(图31)。
抗原位点
Figure BDA0000844346390002751
稳定化RSV F的免疫原性
为了评估位点
Figure BDA0000844346390002752
稳定化对于诱导RSV保护性体液反应的影响，用各种形式的RSV F对CB6小鼠免疫化，在第0周和第3周对每只小鼠注射10μg RSV F与50μg poly I：C佐剂，并且测量第5周血清预防HEp-2细胞的RSV感染的能力。DS、Cav1和TriC各自引起中和活性的高效价(几何平均50％有效浓度(EC50)为1826-2422)。这种水平是由融合后F(504 EC50)引起的水平的约3倍，并且是保护阈值的约20倍。相比之下，DS-Cav1引起3937 EC50的中和活性，是融合后F的大致7倍并且是保护阈值的40倍(图29A)。(当帕利珠单抗
Figure BDA0000844346390002753
以15mg/kg的浓度给与时，谷血清水平为约40μg/ml，其保护婴儿免于严重疾病。在中和测定法中，40μg/ml的含帕利珠单抗的血清得到100的EC50。这种效价也与用RSV激发的小鼠和棉鼠中针对下呼吸道感染的完全保护相关。)
为了定量在融合前RSV F上不同位点之间的抗体诱导，利用抗原位点
Figure BDA0000844346390002754
闭塞形式的RSV F。用20μg被抗原位点
Figure BDA0000844346390002755
定向抗体(包含约10μg的RSV F和约10μg的抗体的抗原结合片段)结合的RSV F免疫化的CB6小鼠对于AM22和D25复合物分别产生911和1274EC50的第5周几何平均中和效价，是10μg/ml的融合后的大致双倍并且与20μg/ml的融合后所引起的相当(图29A)。这些研究结果表明，利用稳定在融合前状态的RSV F变体、尤其是DS-Cav1进行免疫化所引起的非常高的效价是由于靶向抗原位点
Figure BDA0000844346390002756
的抗体。
为了研究位点
Figure BDA0000844346390002757
诱导的普遍性，用DS-Cav1、DS和融合后形式的RSV F对恒河猴进行免疫化，在第0周和第4周向每只恒河猴注射与500μg poly I：C佐剂混合的50μg RSV F并且测量第6周血清抑制RSV感染的能力。如通过D25结合所测量，配制的蛋白质保持预期抗原概况(图38)。DS和DS-Cav1分别引起1222和2578 EC50的几何平均效价，大致是融合后F(287EC50)的5倍和10倍(图29B)，从而证实不同形式的RSV F免疫原在小鼠与灵长类动物之间的相对 免疫原性的保守，以及DS-Cav1在灵长类动物免疫系统中产生高RSV保护效价的能力。
RSV F保护性反应的优化
通过设计、物理和抗原特性、原子水平结构和免疫原性之间的相互作用产生的信息矩阵(图26C)提供进一步优化的基础(Nabel，Science 326，53(2009))。例如，为了获得工程改造的RSV F的各种抗原性和物理特性与RSV保护性反应的诱导之间的关系的见解，可以将特性(图31)与免疫原性(图29)相关联。这些相关性表明位点
Figure BDA0000844346390002761
对于物理极值的稳定性(而非三聚体产率和D25亲和力)增加应增加在免疫化后引起的保护效价(图30A)，从而提供对于进一步优化的设计见解。类似地，RSV F的各种构象状态或区域(图28)与免疫原性(图29)之间的相关性提供对于得到最大保护性反应的RSV F的构象的设计见解。在这种情况下，结果指示增强呈D25结合构象的抗原位点
Figure BDA0000844346390002762
的结构拟态应产生改进的保护效价(图30B)。
除了提供改进方向之外，信息矩阵也可提供关于这种改进可能发生的程度的估算。也就是说，一旦物理稳定性或结构拟态与保护性反应之间已经建立了相关性，就可以最大化物理稳定性(例如至100％D25结合保持)或结构拟态(例如至D25结合构象的确切拟态)以得到所引起的保护性反应相对于所述特定参数的最大改进的概念。这些结果(图30A、B)表明，额外的结构拟态将可能不会对免疫原性具有很大影响，但抗原位点
Figure BDA0000844346390002763
的额外物理稳定化可能基本上改进保护效价的抗原性质。独立参数如佐剂、多聚化或免疫化方案可能允许所引起反应的改进，并且这些参数可能进行独立分析和优化(抗原位点的灵活性可通过允许位点复合更广泛多种抗体而增加其免疫原性。我们注意到，在上下文中，抗原位点
Figure BDA0000844346390002764
的原子迁移率因子在RSV F胞外域中是最高的)。
以实验方式混合参数也可提供见解。例如，为了确定RSV F诱 导血清的焦点，可以通过抗原方式询问免疫原性(图30C)。为了测量由不同形式的RSV F诱导的血清的抗原性，将不同形式的RSV F偶联至Octet生物传感器尖端，并且测量已经添加有不同形式的RSV F的所诱导血清以及“预吸收”血清的反应性(图30C)。关于传感器上的DS-Cav1，融合后F、DS和DS-Cav1免疫化恒河猴的生物传感器反应显示增加的反应(图30C，左图)；关于传感器上的融合后F，相同血清的生物传感器反应显示降低的反应(图30C，右图)；并且关于在传感器上已经预吸收融合后F和DS-Cav1的血清，来自融合后F、DS和DS-Cav1免疫化恒河猴的反应与所诱导的保护效价交尾(图30C，左图)。总的来说，所诱导的EC50效价不与针对融合前或融合后形式的RSV F测量的抗原反应交尾，但的确与以融合前和融合后RSV F定向反应之间的差异形式或比率形式(p＝0.005)测量的融合前特异性反应水平相关(图30D)(对于“融合前”形式的RSV F，使用RSV F的DS-Cav1稳定化变体)。这些结果表明，在融合前相对于融合后构象中，关于RSV F免疫原的免疫反应的性质基本上更好，研究结果可能与针对靶向抗原位点
Figure BDA0000844346390002771
的融合前特异性抗体所观测到的优异中和效能相关(通过使用结构上限定的探针，如在图39中关于D25和莫维珠单抗键合的RSV F所示，应该有可能将所诱导的反应去卷积)。
不希望受理论束缚，含有由源自多种生殖系基因的抗体所靶向的多种表位的抗原位点可能是理想的疫苗靶标，因为这些“超位点”具有诱导多谱系中和抗体的高度可能性。RSV F上的抗原位点
Figure BDA0000844346390002772
是抗原超位点的一个实例，它也是病毒易攻击位点。从关于本文所述的RSV的努力中学到许多教训，例如研究自然人类免疫反应和选择适当靶位点的重要性，这些可能是普遍适用的。总的来说，通过将基于结构的设计的重点放在易攻击超位点上，结构疫苗学可能是在开发针对病毒病原体的疫苗时实现样式改变转变的边缘。
材料和方法
病毒和细胞。如先前所述制备并保持病毒储备液(Graham等，J.Med.Virol.26，153(1988))。如先前所报道构建并提供表达RSV的绿色荧光蛋白(GFP)RSV-GFP(Hallak等，Virology 271，264(2000))。用于基于流式细胞术的中和和融合测定法的RSV-GFP储备液的效价是2.5×107pfu/ml。用于连接测定法的RSV A2储备液的效价是1.02×108pfu/ml。将HEp-2细胞保持在含有10％胎牛血清(10％EMEM)的伊格尔最低必需培养基中并补充以谷氨酰胺、青霉素和链霉素。
抗体和Fab片段的表达和纯化。通过在37℃下将重链和轻链质粒短暂共转染到悬浮的HEK293F细胞中持续4-5天来表达抗体(参见上文，以及McLellan等，Nat Struct MolBiol 17，248(2010)；McLellan等，J Virol 84，12236(2010))。使细胞上清液通过蛋白A琼脂糖，并且将结合的抗体用PBS洗涤并用IgG洗脱缓冲液洗脱到1/10体积的1M Tris-HCl pH8.0中。通过用Lys-C或HRV3C蛋白酶(McLellan等，Nature 480，336(2011))消化IgG来产生Fab，并且使Fab和Fc混合物返回通过蛋白A琼脂糖以除去Fc片段。通过尺寸排阻色谱法进一步纯化流过柱的Fab。
融合前稳定化RSV F构建体的筛选。融合前RSV F变体是源自RSV F(+)Fd构建体(参见实施例1)，其由具有C端T4次要纤维蛋白三聚化基序(McLellan等，Nature 480，336(2011))、凝血酶位点、6x His标签和StreptagII的RSV F残基1-513组成。如先前所述使用96孔微板格式的短暂基因表达方法来实现各种RSV F蛋白的高通量表达(Pancera等，PLoSONE 8，e55701(2013))。简言之，在转染前24小时，将HEK 293T细胞在表达培养基(补充有10％超低IgG胎牛血清和1x非必需氨基酸的高葡萄糖DMEM)中以2.5×105个细胞/毫升的密度接种在96孔微板的每个孔中，并且在37℃、5％CO2下温育20小时。将质粒DNA与TrueFect-Max(United BioSystems，MD)混合并且添加至生长的细胞，并且将96孔板在37℃、5％CO2下温育。在转染后第一天，将富集的培养基(高葡萄糖DMEM加上25％超低IgG胎牛血清、2x非必需氨基酸、1x谷氨酰胺)添加至每个孔， 并且返回温育器进行连续培养。在转染后第五天，将上清液中表达的RSV F蛋白收集并通过ELISA使用Ni2+-NTA微板测试其与D25和莫维珠单抗抗体的结合。所收集的上清液在4℃下温育一周后，重复ELISA。
RSV F构建体的大规模表达和纯化。如先前所述表达和纯化可溶性融合后RSV F(McLellan，J Virol 85，7788(2011))。通过使用TrueFect-Max(United BioSystems，MD)在Expi293F细胞中短暂转染来表达融合前变体。在转染后第5天收集培养上清液并且在10,000g下离心以除去细胞碎片。将培养上清液无菌过滤，然后进行缓冲液交换并使用切向流过滤浓缩(van Reis，J Membrane Sci 159，133(1999))。通过固定化镍和streptactin亲和色谱法纯化RSV F糖蛋白，并且将含有RSV F变体的相关级分汇集，浓缩并进行尺寸排阻色谱法(参见实施例1)。通过用凝血酶消化，接着进行尺寸排阻色谱法来除去亲和标签。使用鲎变形细胞溶解物测定法对于非人类灵长类动物免疫化中使用的糖蛋白测试内毒素，并且必要时，在免疫化之前使蛋白质通过EndoTrap Red(BioVendor)柱以除去内毒素。如通过终点发色鲎变形细胞溶解物(Limulus Amebocyte Lysate，LAL)测试试剂盒(Lonza，Basel，Switzerland)所测量，内毒素水平＜5EU/公斤体重/小时。
稳定化RSV F抗原表征。使用fortéBio Octet Red384仪器来测量RSV F与靶向抗原位点
Figure BDA0000844346390002791
(D25、AM22)、位点I(131-2a)、位点II(帕利珠单抗、莫维珠单抗)和位点IV(101F)的抗体的结合动力学。在补充有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在设定为1,000rpm的搅拌下进行所有测定法以最小化非特异性相互作用。所有溶液的最终体积是100微升/孔。在30℃下在实心黑色96孔板(Geiger Bio-One)中进行测定法。使用含StrepMAB-Immo(35μg/ml)的PBS缓冲液来装载抗小鼠Fc探针持续300秒，然后将其用于捕捉含有C端Strep标签的相关RSV F变体蛋白。每个装载步骤的典型捕捉水平为0.7至1nm，并且对于这些步骤中的每个，一排八个尖端内的可变性不超过0.1nm。然后将生物传感器尖端在PBS+1％BSA中 平衡300秒，随后测量溶液(0.002μM至1μM)中与抗原结合片段(Fab)的缔合持续300秒；然后根据所观测的解离速率使Fab解离400秒至1200秒。解离孔仅使用一次以防止污染。通过减去关于在PBS+1％BSA中温育的装载传感器所记录的测量结果来进行减去系统基线漂移的平行校正。为了除去非特异性结合反应，将具有C端Strep标签的HIV-1gp120分子装载在抗小鼠Fc探针上并与RSV Fab一起温育，并且从RSV F变体反应数据减去非特异性反应。使用Octet软件7.0版进行数据分析和曲线拟合。将实验数据与描述1∶1相互作用的结合方程拟合。使用非线性最小二乘拟合进行假设可逆结合(完全解离)的完整数据集的全局分析，其允许对于在每个实验中使用的所有浓度同时获得单组结合参数。
RSV F变体的物理稳定性。为了评估所设计的RSV F蛋白在各种应激条件下的物理稳定性，用多种药学上相关的应激如极端pH、高温、低和高摩尔渗透压浓度以及重复冷冻/解冻循环处理蛋白质。通过抗原位点
Figure BDA0000844346390002801
在处理后的保守程度来评估所处理的RSV F蛋白的物理稳定性，这是通过位点
Figure BDA0000844346390002802
特异性抗体D25结合评估的关键参数。
在pH处理中，将RSV F蛋白稀释至初始浓度为50μg/ml，利用适当缓冲液调节至pH3.5和pH 10并且在室温下温育60分钟，然后再中和至pH7.5并调节至40μg/ml。在温度处理中，将40μg/ml的RSV蛋白在具有加热盖的PCR循环仪中在50℃、70℃和90℃下温育60分钟以防止蒸发。在摩尔渗透压浓度处理中，将最初含有350mM NaCl的100μl RSV F蛋白溶液(40μg/ml)用2.5mM Tris缓冲液(pH 7.5)稀释至10mM NaCl的摩尔渗透压浓度或者用4.5MMgCl2调节至最终浓度为3.0M。将蛋白质溶液在室温下温育60分钟，然后分别通过添加5MNaCl而恢复350mM NaCl或者用2.5mM Tris缓冲液稀释，然后浓缩至100μl。通过重复的液氮冷冻和在37℃下解冻进行冷冻/解冻处理10次。使用上述方案利用Octet仪器测量抗体D25与所处理RSV F蛋白的结合。物理稳定性程度以在应激处理之前和之后的稳态D25结合水平的比率示出。
融合前稳定化RSV F蛋白的结晶化和X射线数据收集。在20℃下通过将1μl RSV F与1μl贮存溶液(1.4M酒石酸K/Na、0.1M CHES pH 9.5、0.2M LiSO4)混合而在悬滴中通过蒸气扩散方法使RSV F DS、Cav1、DSCav1和DSCav1TriC的晶体生长。将晶体直接冷冻在液氮中。此外在20℃下通过将1μl RSV F与0.5μl贮存溶液(1.7M硫酸铵、0.1M柠檬酸盐pH 5.5)混合而在悬滴中通过蒸气扩散方法使RSV F Cav1和DSCav1的晶体生长。将晶体转移至3.2M硫酸铵、0.1M柠檬酸盐pH 5.5的溶液，并且在液滴中快速冷冻。在SER-CAT束线ID-22下在
Figure BDA0000844346390002811
的波长下收集所有X射线衍射数据。
融合前稳定化的RSV F的结构测定、修正和分析。利用HKL2000套组(Otwinowski和Minor，in Methods Enzymol.(Academic Press，1997)，第276卷，第307-326页)将X射线衍射数据整合并标度，并且通过PHASER(McCoy等，Phaser crystallographicsoftware.J.Appl.Crystallogr.40，658(2007))使用D25结合的RSV F结构(PDB ID：4JHW，(参见实施例1))作为搜索模型来获得分子置换解决方案。使用COOT(Emsley等，ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 66，486(2010))进行手动模型构建，并且利用PHENIX(Adams等，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66，213(2010))进行修正。最终数据收集和修正统计呈现于图40中。使用显示高度结构相似性的残基225-455进行RSV F结构的叠加。抗原位点
Figure BDA0000844346390002813
rmsd计算是基于残基61-71和194-219，其在RSV F-D25复合物结构中的D25抗体的
Figure BDA0000844346390002814
内。
阴性染色电子显微镜分析。将样品吸附至新鲜辉光放电碳包覆栅格，用缓冲液冲洗两次，并且用新鲜制备的0.75％甲酸铀酰染色。在FEI T20显微镜上用2k x 2k EagleCCD相机在
Figure BDA0000844346390002815
的像素尺寸下记录图像。利用Bsoft(Heymann，J.Struct.Biol.157，3(2007))和EMAN(Ludtke等，J.Struct.Biol.128，82(1999))进行图像分析和2D平均化。
NHP免疫化。所有动物实验都由疫苗研究中心(NIAID，NIH)的动物护理和使用委员会考察和批准，并且所有动物都根据当地、州、联邦和机构的政策被圈养和护理在NIH的美国实验室动物护理评估委员会(AAALAC)所认可的设施中。在第0周和第4周向体重为8.76-14.68kg的印度源普通猕猴动物肌肉内注射免疫原。每隔一周采集血液，持续6周。
RSV中和测定法。将血清分配为四倍稀释液(从1∶10到1∶40960)，与相等体积的来自菌株A2和Katushka荧光蛋白的表达重组mKate-RSV的原型F基因混合，并且在37℃下温育一小时。接着，将50μl的每种血清稀释液/病毒混合物添加至已经在30μl MEM(最低必需培养基)中以1.5×104的密度接种在384孔黑色光学底板的每个孔的HEp-2细胞中，并且温育20-22小时，然后在588nm激发和635nm发射下进行分光光度分析(SpectraMax Paradigm，Molecular Devices，Sunnyvale，CA 94089)。使用GraphPad Prism(GraphPad SoftwareInc.，San Diego CA)通过曲线拟合和非线性回归来计算每种样品的IC50。通过Student T检验测定P值。
血清抗原性分析。使用fortéBio Octet Red384仪器在与动力学测量所用相同的搅拌、温度、96孔板、缓冲液和体积下测量血清对RSV F变体蛋白的反应性。在10mM乙酸盐pH5中，将RSV F DSCav1和融合后F在EDC/NHS活化混合物中经由探针活化而固定至胺偶联探针，持续300秒。使用10mM乙醇胺pH 8.5淬灭探针反应性。典型的捕捉水平为0.7至1nm，并且对于这些步骤中的每个，一排八个尖端内的可变性不超过0.1nm。然后在结合测量之前使生物传感器尖端在PBS+1％BSA缓冲液中平衡300秒。将血清在PBS+1％BSA中稀释至1/50和1/100稀释度并且评估结合300秒。通过关于每1μl动物血清使用1μg DSCav1或融合后F蛋白来进行血清耗尽。通过减去用血清温育的未装载探针的结合水平来进行减去非特异性血清结合的平行校正。通过将装载RSV F变体的探针与1或2μM D25 Fab(对于位点
Figure BDA0000844346390002821
评估)和莫维珠单抗Fab(对于位点II评估)或两种抗 体(以评估其余非位点
Figure BDA0000844346390002831
反应性)一起温育来评估位点特异性抗原性。
实施例10
稳定在融合前构象的单链RSV F蛋白
本实施例说明缺乏天然弗林裂解位点的其他重组RSV F蛋白，以使得F蛋白原体以单一多肽链而非F2/F1异二聚体形式形成。说明其他融合前稳定化的单链RSV F蛋白的示意图以图43和图44提供。
图43-45示出一系列单链构建体的设计，包括单链RSV F构建体no.9(scF no.9；BZGJ9 DSCav1；SEQ ID NO：669)。单链构建体的变量包括连接子尺寸、F1和F2终点和用于诱导单链构建体三聚化的机制。另外，可使用若干策略将单链构建体稳定在融合前构象，包括使用本文所述的策略。所示单链构建体表达于细胞中并通过尺寸排阻色谱法表征(图46)和结合至RSV F特异性抗体(图47)。
为了进一步表征RSV F构建体no.9(scF no.9；BZGJ9 DSCav1；SEQ ID NO：669)，通过X射线结晶学来解析这种蛋白质的三维结构(参见图48-51)。使用蒸气扩散方法在1.19MLi2SO4、3.33％PEG400、0.12M MgSO4、0.1M NaOAc pH 5.5的贮存溶液中使立方晶体生长。晶体生长至约120μm，然后使其在含有2M硫酸锂的贮存溶液中快速冷冻。利用超过误差2.84的强度在
Figure BDA0000844346390002832
分辨率下收集衍射数据。晶体结构示出GS连接子在构建体No.9中的位置(图49和图50)，其用于预测其他连接子尺寸的位置(图51)，并且作为其他单链构建体BZGJ9-1至9-10的设计基础(参见图55)。合成具有C端T4次要纤维蛋白三聚化基序、凝血酶位点、6xHis标签和StreptagII的单链构建体密码子优化基因并且亚克隆到源自pLEXm的哺乳动物表达载体中。将表达RSV F(+)Fd的质粒转染至悬浮的HEK293GnTI-/-细胞中。在4-5天后，将细胞上清液收集、离心、过滤并浓缩。最初使用由20mM Tris-HCl pH 7.5、200mM NaCl和250mM咪唑pH 8.0组成的洗脱缓冲液经由Ni2+-NTA树脂(Qiagen，Valencia，CA)纯化蛋白质。然后将复合物浓缩并经由StrepTactin树脂按照制造商的说明(Novagen，Darmstadt，Germany)进一步纯化。在用凝血酶蛋白酶(Novagen)温育过夜以除去His和Strep标签后，将过量的D25Fab添加至复合物中，然后在Superdex-200凝胶过滤柱(GE Healthcare)上利用2mM Tris-HCl pH 7.5、350mM NaCl和0.02％NaN3或磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.4的操作缓冲液纯化。以类似方式表达并纯化单链铁蛋白单一基因产物。
选择若干单链构建体用于在动物模型中的免疫原性测试(图53)。通过在第0周和第3周在10CB6F1/J小鼠组中在50μg Poly I：C的存在下注射10μg蛋白质而对BZGJ9DS-Cav1、BZGJ9、BZGJ11DS-Cav1(单体)、BZGJ10(单体和三聚体级分)、BZGJ8(单体)、BZGJ4DS-Cav1和BZGJ11DS-Cav1-2，4-二氧四氢喋啶合成酶(60聚体低聚体)全部测试免疫原性。对来自第5周的血清测试免疫原性。RSV F亚型A DS-Cav1和融合后蛋白的对照组也以类似方式测试和免疫化。
为了评估针对RSV亚型A和亚型B的中和，将来自免疫化动物的血清分配为四倍稀释液(从1∶10到1∶40960)，与相等体积的来自亚型A(菌株A2)或亚型B(菌株18537)和Katushka荧光蛋白的表达重组mKate-RSV的原型F基因混合，并且在37℃下温育1小时。接着，将50μl的每种血清稀释液/病毒混合物添加至已经在30μl MEM(最低必需培养基)中以1.5×104的密度接种在384孔黑色光学底板的每个孔的HEp-2细胞中，并且温育20-22小时，然后在588nm激发和635nm发射下进行分光光度分析(SpectraMax Paradigm，MolecularDevices，CA)。使用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，CA)通过曲线拟合和非线性回归来计算每种样品的IC50。通过Student t检验测定P值。
中和结果显示所有测试的单链构建体具免疫原性。
将单链构建体连接至铁蛋白以产生包括scF抗原的铁蛋白纳米粒子(图56)。简言之，将scF蛋白中包括的F1多肽的C端连接至铁蛋白，并且将重组蛋白在细胞中表达以产生scF-铁蛋白纳米粒子。一个实例是“BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-铁蛋白”蛋白(SEQ ID NO：1429)，其包括包含在RSV F位置105与145之间的GS连接子和通过异源肽连接子连接至RSVF蛋白的位置513的铁蛋白亚基的重组RSV F单链蛋白，所述异源肽连接子是通过将scFno.9中的F1多肽的C端连接至铁蛋白亚基而产生。将scF-铁蛋白纳米粒子表达，纯化，并表征温度、pH和摩尔渗透压浓度稳定性(图57)。另外，将铁蛋白纳米粒子施用至动物以证实它们具免疫原性(图58)。所测试的三种构建体是RSV F DSCav1(SEQ ID NO：371)、BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-铁蛋白(SEQ ID NO：1429)和scF no.9(也称为BZGJ9DS-Cav1，SEQ ID NO：669)。这些是与上述相同的免疫原性/中和。
若干单链序列提供于表19中列出的SEQ ID NO，以及设计方法指示。
表19.示例性单链RSV F蛋白
Figure BDA0000844346390002851
Figure BDA0000844346390002861
Figure BDA0000844346390002871
Figure BDA0000844346390002881
Figure BDA0000844346390002891
Figure BDA0000844346390002901
Figure BDA0000844346390002911
Figure BDA0000844346390002921
Figure BDA0000844346390002931
Figure BDA0000844346390002941
Figure BDA0000844346390002951
Figure BDA0000844346390002961
Figure BDA0000844346390002971
对于若干重组F蛋白计算蛋白质产率，并且示于下表27中。
表27.重组RSV F蛋白表达的产率
构建体名称 产率(mg/L) SEQ ID NO
scRSVF9aCCextxFd 12.7 708
scRSVF9aC485C494xFd 4.1 709
scRSVF9aC419C420extxFd 11.4 710
scRSVF9aC99C362xFd 2.2 711
scRSV F 9axFd 15.7 715
scRSV F 9aextxFd 29.6 716
GSJscINT_1 0.84 766
GSJscINT_3 0.9 768
实施例11
具有DSCav1突变的来自B18537菌株的RSV F蛋白的结构
本实施例说明了不同RSV亚型之间具有稳定化DSCav1取代的RSV蛋白的相似性。将所述DSCav1取代引入来自B18537菌株的RSV F蛋白中。并且使用与上述类似的方法来解析包括C端折叠子结构域的所得重组蛋白的三维结构。如图59-62中所示，DSCav1取代可成功地引入RSV F糖蛋白B亚型中以稳定化抗原位点
Figure BDA0000844346390002982
以在特异性结合于融合前特异性抗体的B亚型背景上产生DSCav1突变体。下表25提供RSV F亚型B上的DSCav1的结晶数据的总结。
表25.关于DSCav1亚型B的结晶数据
Figure BDA0000844346390002981
Figure BDA0000844346390002991
实施例12
不具有三聚化结构域的重组RSV F蛋白的设计和产生
本实施例说明被稳定在融合前构象但不包括C端三聚化结构域以保持RSV F蛋白的膜近端叶的稳定性的重组RSV F蛋白的设计和产生。
简言之，代替C端三聚化结构域，通过用半胱氨酸残基取代α10螺旋的氨基酸而将二硫键环引入F1多肽的C端中。螺旋-螺旋的RSV F胞外域的三个α10螺旋稳定化蛋白质的膜近端部分。当在细胞中表达时，在引入α10螺旋中的半胱氨酸之间形成原体间二硫键，从而将三个α10螺旋“锁定”为紧密接近并且防止膜近端结构域从融合前构象移动至融合后构象。RSV F蛋白的α10螺旋包括残基492至跨膜结构域(残基529)。
在本实施例中，具有稳定化半胱氨酸环的重组RSV F蛋白最初 以包括三聚化结构域的重组蛋白形式表达。所述三聚化结构域可以在初始表达后以蛋白水解方式除去。可以在RSV F蛋白纯化之前、之后或期间进行裂解。目前我们使用串联的Ni2+IMAC和Streptactin固定化步骤经由C端His6和StrepII标签纯化RSV F蛋白，接着在室温下凝血酶消化12小时，然后通过尺寸排阻色谱法从RSV F蛋白分离折叠子。也有可能通过离子交换来纯化裂解的RSV F蛋白。
图63-68示出如下文列出设计的不具有三聚化结构域的若干重组F蛋白的还原和非还原的PAGE分析的凝胶过滤结果和考马斯蓝染色。表22提供所示构建体的抗原性和物理特性，所述构建体包括DSCav1取代，和在α10螺旋中在位置525和526(CCTail4xFd)、512和513(CCTail5xFd)、519和520(CCTail6xFd)以及512和512(CCLongxFd)的半胱氨酸取代。每种构建体的相应SEQ ID NO示于图66中。
表22.工程改造的RSV F糖蛋白变体的抗原性和物理特性
Figure BDA0000844346390003001
Figure BDA0000844346390003011
不具有三聚化结构域或具有可裂解的三聚化结构域的若干RSV F蛋白序列提供于表23中列出的SEQ ID NO中，以及设计方法的指示。指出了名称、α10半胱氨酸环、C端折叠子或可裂解折叠子的存在或不存在、背景序列(例如，“DSCAV1”指示构建体包括DSCav1取代)、设计概念和相应的SEQ ID NO。在表23中，使用以下缩写：DSCAV1：S155C、S290C、S190F、V207L取代；Op：优化的螺旋-螺旋；OpCC：具有二硫键的优化的螺旋-螺旋；InterC：在C端螺旋处的原体间二硫键；Multi-InterC：多个原体间二硫键稳定化；ECC：增强的螺旋-螺旋稳定性；FP-CC：融合肽Cys桥；190P：190凹穴可选氨基酸；Fd(不可裂解的折叠子)、xFd(可裂解的折叠子)、N(无折叠子)；CFM：填充空腔的突变；ICFM：填充界面空腔的突变。
表23中列出的不具有或具有可裂解的三聚化结构域的重组RSV F蛋白在一定条件下在细胞中表达，其中如上文在实施例9中所述，所述蛋白质从所述细胞中分泌在细胞培养基中。每种构建体含有造成蛋白质进入分泌系统并被分泌的前导序列。然后将培养基离心并且将上清液用于结合至位点
Figure BDA0000844346390003013
特异性抗体D25和位点II特异性抗体莫维珠单抗(“莫维珠单抗”，图69A-69E)的抗原性测试。所测试的条件包括在第0天的D25和莫维珠单抗结合(条件1和2)、在第0天在70℃下温育一小时后的D25和莫维珠单抗结合(条件3和4)，和在4℃下1周后的D25和莫维珠单抗结合(条件5和6)。对照是具有折叠子结构域的DSCav1构建体。每种构建体的特异性抗原性数据提供于图69A-69E中(所测试的条件记录在标题行)。
表23.缺乏三聚化结构域或具有蛋白酶可裂解的三聚化结构域的重组RSV F蛋白
Figure BDA0000844346390003012
Figure BDA0000844346390003021
Figure BDA0000844346390003031
Figure BDA0000844346390003041
Figure BDA0000844346390003051
Figure BDA0000844346390003061
Figure BDA0000844346390003071
Figure BDA0000844346390003081
Figure BDA0000844346390003091
Figure BDA0000844346390003101
对于若干重组F蛋白计算蛋白质产率，并且示于下表26中。
表26.重组RSV F蛋白表达的产率
设计名称 产率mg/L SEQ ID NO
CS/GSJ ext2OpCC1 0.39 832
CS/GSJ ext2OpCC2 0.33 833
CS/GSJ ext2OpCC3 0.72 834
CS/GSJ ext2OpCC4 0.48 835
CS/GSJ GCN4cc1 2.85 836
CS/GSJ GCN4cc2 0.75 837
CS/GSJ CartOp 0.36 838
GSJ CClongxFd 6.3 839
GSJ CCtail1xFd 1.05 840
GSJ CCtail2xFd 0.33 841
GSJ CCtail3xFd 0.99 842
GSJ CCtail4xFd 1.53 843
GSJ CCtail5xFd 2.13 844
GSJ CCtail6xFd 1.65 845
CSGSJ7 0.66 1462
GSJ 1Cavl 13 8 913
JCB GSJ 4 8 942
JCB GSJ 5 8 943
实施例13
稳定化RSV F胞外域的膜远端部分的其他突变
本实施例说明将蛋白质稳定在其融合前构象的对RSV F进行的其他突变。
设计不具有三聚化结构域的若干RSV F蛋白序列并且提供于表24中列出的SEQ IDNO中，以及设计方法的指示。指出了名称、相对于SEQ ID NO：1026的突变、C端折叠子结构域的存在或不存在、背景序列(例如，“WT”指示野生型RSV F)、设计概念和相应SEQ ID NO。
表24中列出的具有C端三聚化结构域的重组RSV F蛋白在一定 条件下在细胞中表达，其中所述蛋白质从所述细胞中分泌在细胞培养基中。如上文在实施例9中所述，每种构建体含有造成蛋白质进入分泌系统并且被分泌的前导序列。然后将培养基离心并且将上清液用于结合至位点
Figure BDA0000844346390003112
特异性抗体D25和位点II特异性抗体莫维珠单抗(“Mota”，图69A-69E)的抗原性测试。所测试的条件包括在第0天的D25和莫维珠单抗结合(条件1和2)、在第0天在70℃下温育一小时后的D25和莫维珠单抗结合(条件3和4)，和在4℃下1周后的D25和莫维珠单抗结合(条件5和6)。对照是具有折叠子结构域的DSCav1构建体。每种构建体的特异性抗原性数据提供于图69A-69E中(所测试的条件记录在标题行)。
表24.利用折叠子结构域的新的稳定化
Figure BDA0000844346390003111
Figure BDA0000844346390003121
Figure BDA0000844346390003131
Figure BDA0000844346390003141
实施例14
最小位点
Figure BDA0000844346390003142
免疫原
RSV F的位点
Figure BDA0000844346390003143
表位定位在三聚体尖峰的顶端并且包括由三种中和抗体D25、AM22和5C4识别的区域。更具体地，如由RSV F/D25复合物的晶体结构所描绘，这个表位包含螺旋α4(残基196-210)的外表面和β2与α1之间的相邻环(残基63-68)。本实施例说明呈现仅具有最小邻接残基的位点
Figure BDA0000844346390003144
并且可用于诱导位点
Figure BDA0000844346390003145
免疫反应并且可相比于全长融合前稳定化RSV F三聚体更成本有效地产生的抗原的设计和表征。
用于设计最小位点
Figure BDA0000844346390003146
RSV F免疫原的一般概念
利用以下四种主要设计概念来设计最小位点
Figure BDA0000844346390003147
免疫原：环状排列、骨架环状排列、结构域III免疫原和多聚化。
环状排列涉及改变蛋白质结构内的天然连接，同时保持组成部分的空间定向。最小位点
Figure BDA0000844346390003148
表位组分α4和β2-α1环各自是RSV F1内的两个单独的环节段的一部分。为了产生稳定的位点
Figure BDA0000844346390003149
折叠，将两 个环节段用短的柔性氨基酸连接子以两种不同可能次序连接(C端至N端)，从而产生两个单独的折叠，其各自保存位点
Figure BDA0000844346390003151
表位(图70A)。
为了产生骨架环状排列，通过来自其他蛋白质的小的刚性节段置换环状排列的位点
Figure BDA0000844346390003152
蛋白的短的柔性连接子，所述刚性节段相比于简单的氨基酸连接子潜在地提供更大的稳定性(图70B)。
结构域III(残基50-306)是含有位点
Figure BDA0000844346390003153
表位的RSV F蛋白的具有约250个氨基酸的较大结构域(参见图70D)。围绕位点
Figure BDA0000844346390003154
的结构域III残基向位点
Figure BDA0000844346390003155
提供进一步结构稳定性，同时不会向免疫原添加显著的其他分散表面表位。结构域III含有在残基136与137之间的天然弗林裂解位点，其暴露融合肽。可以通过用氨基酸连接子置换裂解位点或通过进行环状排列以连接原始N端和C端或结构域III并且在裂解位点产生新的N端和C端而将结构域III进一步稳定化。这些方法都用于稳定化各种结构域III免疫原。
最后，将位点
Figure BDA0000844346390003156
免疫原多聚化以增强免疫原性(图70D和图70E)。三聚化用于模拟在融合前RSV F病毒尖峰中观察到的天然三聚体并且较大的限定低聚物如24聚体和60聚体用于特异性增强免疫原性。这通过在构建体之间引入二硫键，或通过使用氨基酸连接子将构建体以二聚体或三聚体形式共价连接在一起，或通过使用氨基酸连接子将构建体连接至多聚化结构域来实现。一些构建体利用这些策略的组合。所用的最小多聚化结构域是三聚体(例如GCN4)并且最大的是60聚体(例如2，4-二氧四氢喋啶合成酶)。我们也使用五聚体、12聚体和24聚体。
除了上文描绘的主要设计概念之外，通过使用若干其他方法将免疫原稳定化，所述方法包括添加二硫键、填充空腔突变、降低表面疏水性、添加带电荷的表面残基，和添加N连接的聚糖和截短可能柔性的区域。若干最小位点
Figure BDA0000844346390003157
免疫原的列表提供于表20(位点
Figure BDA0000844346390003158
非粒子免疫原)和表21(蛋白质纳米粒子上的位点
Figure BDA0000844346390003159
免疫原)，以及设计 方法的指示。指出了名称、概念、RSV F蛋白的残基、骨架或其他添加蛋白，和相应的SEQ ID NO。在表20和表21中，使用以下缩写：
Figure BDA0000844346390003161
最小位点
Figure BDA0000844346390003162
CP：环状排列；DS：二硫键；CAV：填充空腔；电荷：添加带电荷的残基；SC：单链；TD3：串联的结构域III结构域；D3：结构域III；RH：降低疏水性；Fd：T4Fd三聚化结构域；CCMPTD：鸡软骨基质蛋白三聚化结构域；MTQ-CC：MTQ螺旋状螺旋三聚化基序；CXVIII：胶原蛋白XVIII三聚化结构域；2M0E：Miz-1锌指6(2M0E)骨架；ATC酶：天冬氨酸氨甲酰转移酶(ATC酶)三聚化结构域(1GQ3)；GCN4：GCN4三聚化结构域；Fer：铁蛋白；Dps：树状微杆菌Dps；LS：风产液菌(A.aeolicus)2，4-二氧四氢喋啶合成酶；Thr：凝血酶；EH：暴露的疏水性；HCP1：铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)hcp1(1y12)。
如上文在实施例9中所述，使用导致最小位点
Figure BDA0000844346390003163
免疫原分泌到组织培养基中的系统使最小位点
Figure BDA0000844346390003164
免疫原在细胞中表达。然后将培养基离心并且通过ELISA将上清液用于关于结合至位点
Figure BDA0000844346390003165
特异性抗体D25、AN22和5C4的抗原性测试(图72A-72F)。所测试的条件包括在4℃下第0周和第1周后的D25结合(条件1和条件2)、在60℃下1小时后的D25结合(条件3)、在70℃下1小时后的D25结合(条件4)、在80℃下1小时后的D25结合(条件5)、在90℃下1小时后的D25结合(条件6)、或在100℃下1小时后的D25结合(条件7)、在4℃下两周后的AM22结合(条件8)、在4℃下第0周的5C4结合(条件9)。也示出在70℃下1小时后的D25、AM22和D25结合(条件10)的平均值。抗原性数据的总结提供于图71中，其示出落在每种设计类别内并且产生至少1.5的ELISA结果的位点
Figure BDA0000844346390003166
免疫原的数目。每种构建体的特异性抗原性数据提供于图72A-72F中(所测试的条件记录在标题行)。结果指示最小位点
Figure BDA0000844346390003167
免疫原特异性结合于融合前特异性抗体；并且因此，可用于在受试者中诱导针对抗原位点
Figure BDA0000844346390003168
的免疫反应。另外，结果指示最小位点
Figure BDA0000844346390003169
构建体可以用作用于从样品中分离并检测RSV F融合前特异性抗体的探针。
基于抗原性数据，选择14种初始构建体作为用于在用于产生免疫反应的动物模型中进行评估和用于其他物理和结构表征的代表。选择这14种的度量包括选择对于在70℃下1小时后的D25(第1周)、AM22(第2周)和D25显示ELISA平均值的构建体。为了防止每个类别选择若干非常相似的构建体，将每个类别细分成更多的类别(圆括号中的SEQ ID NO)。
类别1：单体：
位点
Figure BDA0000844346390003171
环状排列：TZ-13(354567-108)，平均值：3.18(SEQ ID NO：1040)
具有骨架的位点
Figure BDA0000844346390003172
环状排列：JG_2KN0(354567-417)，平均值：3.00(SEQ ID NO：1053)
结构域III：E-CP_RBD51-307_14mutDS-Cav1_THS(354567-273)，平均值：3.17(SEQID NO：1156)
结构域III二聚体：GSJnh4-TWIN(354567-693)，平均值：3.06(SEQ ID NO：1194)
类别2：三聚体：
位点
Figure BDA0000844346390003173
环状排列：TZ-19(354567-126)，平均值：3.08(SEQ ID NO：1106)
结构域III(两个连接)：RSVF(+)THS_s_to_hp2_foldon(354567-210)，平均值：3.08(SEQ ID NO：1170)，和MS_08(354567-447)，平均值：3.08(SEQ ID NO：1188)
结构域III二聚体：GSJnh4Fd-TWIN(354567-705)，平均值：3.01(SEQ ID NO：1212)
类别3：多价单体：
铁蛋白上的位点
Figure BDA0000844346390003181
环状排列：2m0e-resurf1-铁蛋白(354567-621)，平均值：2.81(SEQ ID NO：1276)
铁蛋白上的结构域III：GSJnh2F(354567-471)，平均值：3.10(SEQ ID NO：1220)
非铁蛋白低聚体上的单体：LS1-E-CP_RBD51-307_11mutDS-Cav1_THS(354567-315)，平均值：2.72(SEQ ID NO：1281)
其他：MP11(354567-642)，平均值：3.05(SEQ ID NO：1263)
类别4：多价三聚体：
纳米粒子上的结构域III(2)：GSJnh2Fd-F(354567-483)，平均值：2.57(SEQ IDNO：1266)，和GSJnh4Fd-F(354567-489)，平均值：2.02(SEQ ID NO：1268)
表20.最小位点
Figure BDA0000844346390003182
免疫原(并非在蛋白质纳米粒子上)
Figure BDA0000844346390003183
Figure BDA0000844346390003191
Figure BDA0000844346390003201
Figure BDA0000844346390003211
Figure BDA0000844346390003221
Figure BDA0000844346390003231
Figure BDA0000844346390003241
Figure BDA0000844346390003251
Figure BDA0000844346390003261
Figure BDA0000844346390003271
Figure BDA0000844346390003281
Figure BDA0000844346390003291
Figure BDA0000844346390003301
表21.蛋白质纳米粒子上的最小位点
Figure BDA0000844346390003302
免疫原
Figure BDA0000844346390003303
Figure BDA0000844346390003311
Figure BDA0000844346390003321
Figure BDA0000844346390003331
Figure BDA0000844346390003341
Figure BDA0000844346390003351
Figure BDA0000844346390003361
Figure BDA0000844346390003371
Figure BDA0000844346390003381
Figure BDA0000844346390003391
Figure BDA0000844346390003401
Figure BDA0000844346390003411
Figure BDA0000844346390003421
Figure BDA0000844346390003431
Figure BDA0000844346390003441
Figure BDA0000844346390003451
Figure BDA0000844346390003461
实施例15
融合前稳定化F蛋白的免疫原性
进行一系列测定法(除了上文提供的那些之外)来说明稳定在融合前构象的本文提供的重组RSV F蛋白的免疫原性。结果显示所提供的稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白可用于在多种动物模型中诱导免疫反应，并且此外这种免疫反应的诱导针对未来病毒攻击进行保护。
除非另外说明，否则在图73-84中以及在本实施例中，提及以下重组RSV F蛋白：
DS(亚型A)＝RSV A2F(+)FdTHS S155C，S290C(SEQ ID NO：185)
DS(亚型B)＝RSV B18537F(+)FdTHS S155C，S290C(SEQ ID NO：1479)
DS-Cav1(亚型A)＝RSV A2F(+)FdTHS S155C，S290C，S190F，V207L(SEQ ID NO：371)
DS-Cav1(亚型B)＝RSV B18537F(+)FdTHS S155C，S290C，S190F，V207L(SEQ IDNO：372)
融合后F(亚型A)＝RSV A2F(+)dFPTHS
图73示出，使用Ribi作为佐剂，在经肌肉内给与的铁蛋白纳米粒子的情形下提供的单链形式的DS-Cav1在单次给药后在恒河猴中2周后诱导较小但可检测的中和抗体反应。基于在一次给药后的较小但可检测的反应，预期在用第二剂量加强后，将诱导显著的中和抗体反应。这将与下文讨论的在小鼠中2次给药后用Ribi配制的铁蛋白纳米粒子上呈现的2mcg的裂解DS稳定化融合前F三聚体的免疫原性 相一致。
如图74中所示，在第0周和第3周，在用含20mcg DS F的50mcg poly ICLC免疫化的小鼠中诱导出小鼠(CB6F1/J)针对DS形式的稳定化融合前蛋白的免疫反应。在DS免疫化小鼠中，中和活性在高水平下维持12周以上。
如图75中所示，用DS(亚型A)＝RSV A2 F(+)FdTHS S155C，S290C(SEQ ID NO：185)免疫化可以在动物模型中预防RSV感染。在第0周和第3周用DS形式的稳定化F蛋白(SEQ IDNO：185)对小鼠进行IM免疫化。第19周(在最后疫苗接种后四个月)，用10e7pfu的同源RSVA2病毒对小鼠进行鼻内激发。第5天，除去肺和鼻以测量组织中的病毒载量。结果显示，用DS形式的融合前F免疫化的小鼠在肺或鼻中不具有可检测的病毒。
此外，被施用DS(亚型A)＝RSV A2 F(+)FdTHS S155C，S290C(SEQ ID NO：185)的小鼠未经历针对免疫原的2型细胞因子反应(图76)。在用对照(PBS)、野生型RSV(RSV)、福尔马林灭活的RSV(FIRSV)、DS(SEQ ID NO：185；融合前F)或稳定化融合后F构建体(融合后F)初始免疫化后的第5天，在肺和鼻中测量细胞因子含量。经历原发性感染的小鼠如所预期具有显著水平的IFN-γ和MIP-1α。FI-RSV免疫化小鼠具有显著水平的2型细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)和与疫苗增强疾病相关的反应的典型上皮损伤相关的细胞因子(IL-6)。用融合前F(DS)免疫化的小鼠具有与有效和调节反应相关的适度水平的IFN-γ和IL-10并且无疾病或体重损失。
在三剂量免疫化过程中测定来自用重组RSV F DSCaV1蛋白(SEQ ID NO：371)免疫化的非人类灵长类动物模型的血清的中和活性(图77)。在第0周和第4周用50mcg IM的基于亚型A序列并用poly ICLC配制的DS-Cav1融合前F(SEQ ID NO：371)或融合后F将每组4只恒河猴免疫化两次。在第26周，用50mcg IM的用poly ICLC配 制的DS-Cav1融合前F对两组进行加强免疫。在2个剂量的DS-Cav1后，诱导显著中和活性并且其在保护阈值以上持续5个月以上。融合后F具免疫原性并且在2个剂量后诱导可检测的中和活性，但仅短暂地高于保护阈值。用第3剂量的DS-Cav1稳定化融合前F对融合后F组进行加强免疫导致中和活性升高，高于在第2剂量后所实现的中和活性。在第3个剂量后，针对同源亚型A的中和活性稳定地保持10周以上，如红色方框区域中所突出显示。
为了证实DSCav1构建体可以用明矾配制，将纯化的DSCav1(SEQ ID NO：371)与明矾氢氧化物凝胶或明矾磷酸盐凝胶在各种比率下混合。在第0周和第3周用10mcg的用明矾(氢氧化铝凝胶或磷酸铝凝胶)配制的DS-Cav1形式的稳定化融合前F对BALB/c小鼠进行IM免疫化。蛋白质∶明矾的重量：重量比率在1∶1与1∶10之间变化。所有制剂都具免疫原性(图78)。另外，使用明矾作为DSCav1的佐剂，在非人类灵长类动物模型中证实免疫化(图79)。在第0周、第4周和第26周用纯化的DS蛋白(SEQ ID NO：185)对恒河猴进行免疫化。第0周和第4周注射包含配制poly ICLC中的DS形式的稳定化RSV融合前F(50mcg)。第26周加强免疫是50mcg的配制在磷酸铝凝胶中的DS融合前稳定化F。因此明矾是在NHP中用于稳定化融合前F的有效佐剂。
为了说明另一种免疫化方案可有效用于用DSCav1诱导有效的免疫反应，将小鼠用表达DSCav1的基于基因的载体进行免疫化，并且评估针对RSV F所产生的免疫反应(图80)。CB6F1/J小鼠在第0周和第3周用表达野生型形式的F的重组腺病毒血清5型载体免疫化或者在第0周用表达DS-Cav1形式的锚定preF膜的rAd5(非分泌的)免疫化并且在第3周用10mcg的配制在明矾中的DS-Cav1加强免疫。用含DS-Cav1的明矾加强免疫的rAd5-preF初免小鼠相比于仅给与两个剂量的蛋白质的小鼠产生同样多的中和抗体，表明通过基于基因的载体递送的融合前F具免疫原性并且可以针对后续蛋白质加强进行初免。
另外，DSCav1蛋白可有效用于加强针对野生型(WT)RSV F的免疫反应(图81)。在加强免疫前2年以上用表达WT形式的RSV F(亚型A)的重组腺病毒载体初免的非人类灵长类动物，用单个50mcg剂量的配制在明矾中的DS-Cav1亚型A或亚型B进行加强免疫。在加强免疫后的两周，中和活性通过亚型A和B DS-Cav1蛋白显著增加(图81-82)。
为了证实DS(S155C，S290C)形式的稳定化F的不同亚型间有效性，在第0周和第3周用10mcg的配制在Ribi中的DS对CB6F1/J小鼠进行IM免疫化(图83)。通过A(SEQ ID NO：185)和B(SEQ ID NO：1479)亚型蛋白诱导针对亚型A和B病毒的中和抗体。同时接受A和B的组接受了总共20mcg的蛋白质。
图84示出改变RSV F蛋白的糖基化可降低其免疫原性。在第0周和第3周用10mcg的配制在poly IC中的DS形式的稳定化融合前F对BALB/c小鼠进行免疫化。用糖苷酶处理F构建体或者制造除去N27和N70的糖基化位点的突变体形式。如果N500糖基化被突变，则不能产生F蛋白，这表明在所述位点的糖基化是表达所需的。在第5周(实心条)和第7周(阴影条)在通过F的任何糖基化变体免疫化的小鼠中检测中和活性。然而，改变糖基化相比于原始DS形式的稳定化融合前F似乎降低免疫原性。****＝P＜0.0001。
将显而易见的是，所述方法或组合物的精确细节可在不偏离所述实施方案的精神的情况下改变或修改。我们要求保护落在下文权利要求书的范围和精神内的所有这些修改和变更。

Claims (67)

1.一种分离免疫原，其包含：
重组RSV F蛋白，其相比于天然RSV F蛋白包含至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代将所述重组RSV F蛋白稳定在融合前构象，所述融合前构象包含抗原位点
Figure FDA0002717249190000011
所述抗原位点
Figure FDA0002717249190000012
包含以SEQ ID NO：1-184中的一个所示的天然RSV F蛋白序列的残基62-69和196-209，并且所述重组RSV F蛋白包含S155C和S290C取代，其形成非天然二硫键以稳定在融合前构象的所述重组RSV F蛋白；
或
所述RSV F蛋白的片段，其中所述片段包含F1多肽和F2多肽，并且不包含pep27多肽，以及其中所述片段包含S155C和S290C取代，其形成非天然二硫键以稳定在融合前构象的所述重组RSV F蛋白，所述F2和F1多肽分别包含RSV F位置26-109和137-513；以及
其中所述RSV F位置对应于以SEQ ID NO：124示出的参考F0多肽的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的免疫原，其中所述天然RSV F蛋白是RSV A、B或牛RSV F蛋白。
3.如权利要求1所述的免疫原，其中所述F2和F1多肽分别由以下RSV F位置组成：26-109和137-513。
4.如权利要求1-3中任一项所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白是单链RSV F蛋白并且所述F2和F1多肽是通过异源肽连接子连接的或直接连接的。
5.如权利要求4所述的免疫原，其中所述异源肽连接子包含如SEQ ID NO:356-365或1443-1453中的一个所示的氨基酸序列，或为G、S、GG、GS、SG、GGG或GSG连接子。
6.如权利要求1所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白进一步通过以下而稳定在所述RSV F蛋白融合前构象：
(a)填充空腔的氨基酸取代，其是填充RSV F蛋白的原体中存在的空腔或RSV F蛋白的原体之间的空腔的氨基酸取代；
(b)改装氨基酸取代，其是通过增强疏水性相互作用或氢键形成，或通过降低邻近残基的不利或排斥相互作用来增加蛋白质中的邻近残基的相互作用的氨基酸取代；
(c)N连接的糖基化位点；或
(d)(a)-(c)中的两个或更多个的组合。
7.如权利要求1所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:185的残基26-109和137-513。
8.如权利要求6所述的免疫原，其包含填充空腔的氨基酸取代，所述氨基酸取代包含在位置190、位置207、或位置190和207的F、L、W、Y、H或M取代。
9.如权利要求8所述的免疫原，其包含填充空腔的氨基酸取代，所述氨基酸取代包含以下中的一个：190F；190L；190W；190Y；190H；190M；190F和207L；190F和207F；190F和207W；190L和207L；190L和207F；190L和207W；190W和207L；190W和207F；190W和207W；190Y和207L；190Y和207F；190Y和207W；190H和207L；190H和207F；190H和207W；190M和207L；或190M和207F；190M和207W。
10.如权利要求6所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含S155C、S290C和S190F取代，或S155C、S290C、S190F和V207L取代。
11.如权利要求6所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:185(DS，A亚型)、1479(DS，B亚型)、371(DS-Cav1，A亚型)、372(DSCav1，B亚型)、373(DSCav1，牛)、374(DS，S190F，A亚型)、375(DS，S190F，B亚型)或376(DS，S190F，牛)中的一个的分别地残基26-109和137-513。
12.如权利要求11所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白包含SEQ ID NO:371(DS-Cav1，A亚型)或372(DSCav1，B亚型)的分别地残基26-109和137-513。
13.如权利要求6所述的免疫原，其中所述F1多肽包含RSVα10螺旋，其包含从RSV位置492至位置510-529中的一个，并且其中所述F1多肽包含形成非天然原体间二硫键的至少两个半胱氨酸取代。
14.如权利要求13所述的免疫原，其中所述F1多肽的位置512-524包含以CCHNVNAGKSTTN(SEQ ID NO:844的残基512-524)或CCHNVNACCSTTN(SEQ ID NO:849的残基512-524Y)示出的氨基酸序列；或其中所述F1多肽的位置512-529包含以CCHNVNACCSTTNICCTT(SEQ ID NO:853的残基512-529)示出的氨基酸序列。
15.如权利要求1所述的免疫原，其包含所述重组RSV F蛋白或其片段的多聚体。
16.如权利要求1所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段连接至三聚化结构域。
17.如权利要求16所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白的所述F1多肽的C端连接至所述三聚化结构域。
18.如权利要求16或权利要求17所述的免疫原，其中所述三聚化结构域是折叠子结构域。
19.如权利要求16至17中任一项所述的免疫原，其还包含在所述F1多肽与所述三聚化结构域之间的蛋白酶裂解位点。
20.如权利要求19所述的免疫原，其还包含所述蛋白酶裂解位点与所述三聚化结构域之间的跨膜结构域。
21.如权利要求17所述的免疫原，其中连接至所述三聚化结构域的所述重组RSV F蛋白包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:185(DS，A亚型)、1479(DS，B亚型)、371(DS-Cav1，A亚型)、372(DSCav1，B亚型)、373(DSCav1，牛)、374(DS，S190F，A亚型)、375(DS，S190F，B亚型)或376(DS，S190F，牛)中的一个的残基26-109和137-513。
22.如权利要求21所述的免疫原，其中连接至所述三聚化结构域的所述重组RSV F蛋白包含SEQ ID NO:371(DS-Cav1，A亚型)或372(DSCav1，B亚型)的残基26-109和137-513。
23.如权利要求1所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段连接至蛋白质纳米粒子亚基。
24.如权利要求23所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白或其片段的C端连接至所述蛋白质纳米粒子亚基。
25.如权利要求23或权利要求24所述的免疫原，其中所述蛋白质纳米粒子亚基是铁蛋白、封装素、硫氧化还原酶(SOR)、2,4-二氧四氢喋啶合成酶或丙酮酸脱氢酶纳米粒子亚基。
26.如权利要求25所述的免疫原，其中：
所述铁蛋白纳米粒子亚基包含SEQ ID NO:350的残基517-679，并且在所述铁蛋白多肽中任选地包括C31S、C31A或C31V取代；
所述SOR亚基包含SEQ ID NO:344或SEQ ID NO:345的残基516-825；
所述2,4-二氧四氢喋啶合成酶亚基包含SEQ ID NO:346或SEQ ID NO:348的残基517-670或SEQ ID NO:347的残基517-669；或
所述丙酮酸脱氢酶合成酶亚基包含SEQ ID NO:349的残基516-757。
27.如权利要求25所述的免疫原，其中连接至铁蛋白的所述重组RSV F蛋白包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:377-382(A、B、牛-DSCav1和DS S190F铁蛋白粒子)中的任一个的残基26-109，其中连接至铁蛋白的所述重组RSV F蛋白形成特异性结合于所述融合前特异性抗体的铁蛋白纳米粒子。
28.如权利要求25所述的免疫原，其中连接至铁蛋白的所述重组RSV F蛋白包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：
SEQ ID NO:1429的残基28-664(BZGJ9 DS-Cav1 Longlink铁蛋白)；
SEQ ID NO:1430的残基28-663(BZGJ9-9 DS-Cav1 Longlink铁蛋白)；或
SEQ ID NO:1431的残基28-665(BZGJ9-10 DS-Cav1 Longlink铁蛋白)。
29.如权利要求25所述的免疫原，其包含以下的氨基酸序列：
SEQ ID NO:1220的残基56-500(GSJnh2F)；
SEQ ID NO:1263的残基48-429(MP11)；
SEQ ID NO:1266的残基56-536(GSJnh2Fd-F)；
SEQ ID NO:1268的残基56-526(GSJnh4Fd-F)；
SEQ ID NO:1275的残基53-256(m0e-resurf1-铁蛋白)；或
SEQ ID NO:1281的残基52-437(LS1-E-CP_RBD51-307_11mutDS-Cav1_THS)。
30.如权利要求1所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白连接至纯化标签。
31.如权利要求1所述的免疫原，其中所述重组RSV F蛋白在磷酸盐缓冲盐水中在生理pH下形成三聚体。
32.如权利要求1的免疫原，其中所述免疫原当在水溶液中温育时形成免疫原的均质群体，其中在如下条件之后，在所述溶液中温育的所述免疫原的至少70％特异性结合于所述融合前特异性抗体：
(a)在50℃下，在350mM NaCl pH 7.0中温育一小时；
(b)在25℃下，在350mM NaCl pH 3.5中温育一小时；
(c)在25℃下，在350mM NaCl pH 10中温育一小时；
(d)在25℃下，在10mM摩尔渗透压浓度pH 7.0中温育一小时；
(e)在25℃下，在3000mM摩尔渗透压浓度pH 7.0中温育一小时；或
(f)在350mM NaClpH 7.0中进行十次冷冻-解冻循环；或
(g)(a)-(f)中的两种或更多种的组合；其中
将所述免疫原在所述溶液中在不存在所述融合前特异性抗体的情况下温育。
33.如权利要求1所述的免疫原，其中：
(a)所述重组RSV F蛋白或其片段不包括在RSV F位置481与489之间或在RSV F位置509与510之间的二硫键；
(b)所述重组RSV F蛋白或其片段不包括在RSV F位置481、489、509、510或其组合的半胱氨酸残基；或
(c)(a)和(b)的组合。
34.一种病毒样粒子，其包含如权利要求1至23中任一项所述的免疫原。
35.一种蛋白质纳米粒子，其包含如权利要求1至33中任一项所述的免疫原。
36.如权利要求35所述的蛋白质纳米粒子，其中所述蛋白质纳米粒子是铁蛋白纳米粒子、封装素纳米粒子、硫氧化还原酶(SOR)纳米粒子、2,4-二氧四氢喋啶合成酶纳米粒子或丙酮酸脱氢酶纳米粒子。
37.如权利要求1、34和35至36中任一项所述的免疫原、病毒样粒子或蛋白质纳米粒子，其中单克隆抗体D25或AM22的Fab以1μM或更小的Kd特异性结合于所述免疫原、所述病毒样粒子或所述蛋白质纳米粒子。
38.一种核酸分子，其编码如权利要求1至37中任一项所述的免疫原或权利要求35或36所述的蛋白质纳米粒子。
39.如权利要求38所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码所述免疫原或蛋白质纳米粒子的前体蛋白。
40.如权利要求39所述的核酸分子，其中所述前体蛋白从N端至C端包含信号肽、F2多肽、Pep27多肽和F1多肽。
41.如权利要求38所述的核酸分子，其被密码子优化以在人类或牛细胞中表达。
42.如权利要求38所述的核酸分子，其可操作地连接至启动子。
43.一种载体，其包含如权利要求42所述的核酸分子。
44.如权利要求43所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
45.如权利要求44所述的病毒载体，其中所述病毒载体是牛副流感病毒载体、人类副流感病毒载体、新城疫病毒载体、仙台病毒载体、麻疹病毒载体、减毒RSV载体、副粘病毒载体、腺病毒载体、α病毒载体、委内瑞拉马脑炎载体、塞姆利基森林病毒载体、辛德毕斯病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、弹状病毒载体、水疱性口炎病毒载体、小核糖核酸病毒载体或疱疹病毒载体。
46.如权利要求38至45中任一项所述的核酸分子或载体，其包含如SEQ ID NO:383、SEQID NO:384、SEQ ID NO:385或SEQ ID NO:386所示的核苷酸序列。
47.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求43至44中任一项所述的载体。
48.一种免疫原性组合物，其包含有效量的如权利要求1至46中任一项所述的免疫原、病毒样粒子、蛋白质纳米粒子、核酸分子或载体；和药学上可接受的载体。
49.如权利要求48所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
50.如权利要求49所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是明矾、水包油组合物、MF59、AS01、AS03、AS04、MPL、QS21、CpG寡核苷酸、TLR7激动剂、TLR4激动剂、TLR3激动剂或其中两种或更多种的组合。
51.如权利要求49所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂促进Th1免疫反应。
52.如权利要求48至51中任一项所述的免疫原性组合物，其中在磷酸盐缓冲盐水中在生理pH和4℃下温育至少24小时后，所述组合物中的所述免疫原、病毒样粒子或所述蛋白质纳米粒子的至少80％特异性结合所述融合前特异性抗体。
53.如权利要求48至52中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于通过以下方法在受试者中产生针对RSV F的免疫反应的药剂中的用途，所述方法包括对所述受试者施用有效量的所述药剂以产生所述免疫反应。
54.如权利要求53所述的用途，其中所述免疫反应包含Th1免疫反应。
55.如权利要求48至52中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于通过以下方法在受试者中治疗或预防RSV感染的药剂中的用途，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述药剂，从而在所述受试者中治疗或预防RSV感染。
56.如权利要求53或55所述的用途，所述方法包括所述免疫原性组合物的初免-加强施用。
57.如权利要求53或55所述的用途，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的抗RSV剂。
58.如权利要求1至37中任一项所述的免疫原、病毒样粒子或蛋白质纳米粒子在制备用于通过以下方法检测或分离受试者中的RSV F结合抗体的试剂的用途，所述方法包括：
提供有效量的所述试剂；
使来自所述受试者的生物样品与所述重组RSV F蛋白或所述蛋白质纳米粒子在足以形成所述重组RSV F蛋白或所述蛋白质纳米粒子与所述RSV F结合抗体之间的免疫复合物的条件下接触；和
检测所述免疫复合物，从而检测或分离所述受试者中的所述RSV F结合抗体。
59.如权利要求53、55和58中任一项所述的用途，其中所述受试者处于RSV感染的风险下或具有RSV感染。
60.如权利要求59所述的用途，其中所述RSV感染是人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV感染。
61.如权利要求53、55和58中任一项所述的用途，其中所述受试者是人类或兽医受试者。
62.如权利要求53、55和58中任一项所述的用途，其中所述受试者小于一岁、大于65岁或是孕妇。
63.如权利要求53、55和58中任一项所述的用途，其中所述受试者是育龄期妇女、学龄期儿童、2-5岁、6-12个月或小于6个月。
64.一种试剂盒，其包含如权利要求1至52中任一项所述的免疫原、病毒样粒子、蛋白质纳米粒子、核酸分子、载体、宿主细胞或免疫原性组合物；和使用所述试剂盒的说明书。
65.如权利要求1至52中任一项所述的免疫原、病毒样粒子、蛋白质纳米粒子、核酸分子、载体或免疫原性组合物用于制备在受试者中抑制或预防RSV感染的药剂的用途。
66.如权利要求1至52中任一项所述的免疫原、病毒样粒子、蛋白质纳米粒子、核酸分子、载体或免疫原性组合物用于制备在受试者中诱导针对RSV F蛋白的免疫反应的药剂的用途。
67.如权利要求1所述的免疫原，其包括通过以下稳定在融合前构象的重组RSV F蛋白：
通过S155C和S290C取代引入的半胱氨酸残基之间的非天然二硫键；和
S190F填充空腔的取代和V207L填充空腔的取代；以及
异源C末端折叠子三聚化结构域。
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