TWI683826B

TWI683826B - 重組ｒｓｖ抗原

Info

Publication number: TWI683826B
Application number: TW106140291A
Authority: TW
Inventors: 黃立民; 黃任民
Original assignee: 國立臺灣大學
Priority date: 2016-11-22
Filing date: 2017-11-21
Publication date: 2020-02-01
Also published as: TW201819404A; AU2017366410A1; US11464850B2; EP3545971A1; CN110191719A; KR20190085949A; AU2017366410B2; EP3545971A4; KR102291893B1; JP6903351B2; EP3545971A9; US20190314491A1; CA3044586A1; JP2020506876A; WO2018095330A1

Abstract

提供包含重組呼吸道融合病毒(RSV)F蛋白的抗原，其中，該重組RSV F蛋白包含兩端與HRN區域和HRC區域相接的抗原性區域，該抗原性區域包含選自位點

Description

重組RSV抗原

相關申請的交叉引用

本申請主張在2016年11月22日提交的美國專利臨時申請案US 62/425,078的優先權，該臨時申請案通過引用而以其整體併入本文。

本發明涉及抗原、核酸分子、及用於引起免疫反應尤其是用於引起對抗呼吸道融合病毒(RSV)的免疫反應的疫苗組成物。

RSV已經被識別為嬰幼兒下呼吸道感染的最常見肇因。根據來自世界衛生組織的報告，RSV每年在全世界估計造成199,000例死亡，其中99%出現在發展中國家(Nair,H.,et al.,2011)。RSV也可感染全年齡段的人並造成疾病，在老年人和免疫力低下的個體中最為嚴重。大部分兒童在2歲以前至少感染一次，且由於對RSV的不完全免疫性，可能在整個生命過程中持續被再次感染(Hall,C.B.,et al.,1991).

儘管由RSV造成的疾病負擔很重，但當前可用於RSV中的預防性和治療性方法非常有限。例如，人源化單株抗體－－帕利珠單抗(Palivizumab)(SYNAGIS®；MedImmune,Inc.)，包含95%的人抗體序列和5%的鼠抗體序列。通過結合至RSV的F亞基的A抗原位點中的表位，帕利珠單抗可治療由RSV造成的下呼吸道疾病。但是，帕利珠單抗僅被許可用於高風險的嬰兒。此外，已經顯示，抗病毒劑利巴韋林(ribavirin)對RSV肺炎和細支氣管炎具有療效，而利巴韋林僅被用來治療兒科群體的RSV感染。再者，利巴韋林伴隨有眾多副作用，如失眠、呼吸困難、頭痛、噁心、肌肉痛、情緒不穩、溶血性貧血、血紅蛋白減少、過敏反應和肝臟問題。此外，由於利巴韋林對嬰兒的潛在風險，因此並不推薦用於孕婦。

在1960年代晚期，評估了福馬林滅活的RSV(FIRSV)疫苗對嬰幼兒的免疫效果。儘管FIRSV疫苗引起了高水平的血清抗體，它未能成功預防或治療由RSV造成的疾病。相反，在幼兒早期已經接受FIRSV疫苗的人在後來被RSV感染時，經歷了比未接種疫苗的個體更嚴重的下呼吸道疾病。另外，目前的研究表明，FIRSV在激發(challenge)RSV的小鼠體內誘導顯著的肺泡炎(alveolitis)和血管周炎(perivascusculitis)。

已經實施大量用於研發RSV疫苗的研究，該疫苗包括類病毒顆粒(VLPs)、亞單元、和減毒活疫苗。然而，仍未有對抗RSV感染的疫苗獲得批准。由於巨大的疾病負擔和有限的預防方法，現在比以往更需要安全且有效的RSV疫苗。

有鑒於前述，本揭露提供一種包含重組呼吸道融合病毒(RSV)F蛋白的抗原，以模擬RSV F蛋白的天然三聚體構型。

該重組RSV F蛋白包含兩端與HRN區域和HRC區域相接的抗原性區域，且其中，該抗原區域包含選自位點

、位點II、和位點IV所組成群組的一個或多個抗原性位點，條件是如果該抗原區域包含超過一個抗原位點，則該抗原位點通過鏈接基(linker)而彼此鏈接，且該鏈接基每次出現時獨立由2至20個胺基酸組成。

本揭露的具體實施例中，該抗原位點包含位點

、位點II、和位點IV。本揭露的另一具體實施例中，該HRN區域直接鏈接至位點

，且位點IV通過鏈接基鏈接該HRC區域。

根據本揭露的又一態樣，本揭露提供編碼上述重組RSV F抗原的核酸分子。

根據本揭露的另一態樣，本揭露提供包含有效量的上述抗原或核酸分子的疫苗組成物。

另一具體實施例中，在足以預防或緩解受試者體內RSV感染的條件下，將該包含一種或多種的有效量的上述抗原、編碼或表達該抗原的核酸分子或質體的疫苗組成物給藥至該受試者。該疫苗組成物以足以引起該受試者體內對抗RSV抗原如RSV F蛋白的免疫反應的量給藥。

本揭露提供一種重組RSV F蛋白和編碼該重組RSV F 蛋白的核酸分子。另外，本揭露提供一種包含有效量的該抗原或該核酸分子的疫苗組成物。本揭露的抗原、核酸分子和疫苗組成物可誘發對於RSV為特異性的抗體反應，且保護該受試者不被RSV感染且不造成副作用。再者，與野生型RSV F蛋白相比，本揭露的重組RSV F蛋白的長度更短，且可導致更好的表達水平。因此，本揭露的抗原、核酸分子和疫苗組成物相對容易大規模生產，且更有助於增加抗體鑒定的特異性，並避免不必要的反應如過敏。

通過閱讀下述具體實施例的詳細說明並參照附圖，可更完整地理解本揭露，其中：第1A至1C圖分別顯示HR

24、HR

和HR

-3

重組蛋白的示意圖。

第2A至2I圖是HR

24、HR

、HR

-3

重組蛋白和HBc的SDS-PAGE分析結果。第2A、2C、2E、和2G圖分別顯示對經純化的HR

24、HR

、HR

-3

重組蛋白以及HBc的考馬斯亮藍染色；第2B、2D、和2F圖分別顯示使用抗His抗體對經純化的HR

24、HR

、和HR

-3

重組蛋白的西方墨點轉漬；第2H圖顯示使用兔多株抗HBc抗體對經純化的HBc的西方墨點轉漬；以及，第2I圖顯示分別使用鼠單株抗RSV抗體對經純化的HBc和HR

24重組蛋白的西方墨點轉漬。

第3A和3B圖分別顯示經純化的HBc和HR

24重組蛋白的TEM圖像。

第4圖顯示鼻內(IN)免疫接種程序表。使用候選疫苗在第0、3、和6周對多組小鼠免疫接種3次，並令小鼠在第9周接受RSV激發。也包括一組為在RSV前使用福馬林固定的RSV(FIRSV)經肌肉(i.m)進行免疫接種。在RSV激發前2天，從使用相同投藥方案的各組別收集小鼠血清、BALF和脾臟。

第5A至5E圖顯示接受3劑與HBc或CpG混合或不混合的HR

24、HR

、或HR

-3

的鼻內給藥的小鼠體內的HR

24特異性抗體反應。在進行RSV激發前2天，從各組收集小鼠血清。第5A、5B、5C、和5E圖分別顯示從血清測量的HR

24特異性總IgG、IgG1、IgG2a、和IgA反應；以及，第5D圖顯示從BALF測量的HR

24特異性分泌性IgA(sIgA)反應。

第6A和6B圖顯示鼠體重在進行RSV激發後的改變。在進行RSV激發後，監控對照組或接受4劑鼻內給藥的接種疫苗的小鼠的體重改變5天。體重改變以相對於第0天體重減輕的百分比表示。

第7圖顯示肺組織病理學。在進行RSV激發5天後，收集對照組或接種疫苗的小鼠的肺組織，進行組織學分析。

第8圖顯示肺部病毒負荷。在進行RSV激發5天後，收集對照組或接種疫苗的小鼠的肺組織，通過以RSV N基因為靶標的qRT-PCR進行肺部病毒負荷分析。

使用下述具體實施例來例示性說明本揭露。基於本揭露內容和說明，該領域技術人員可設想本揭露的其它優點。本揭露也可如不同的具體實施例中所揭示的予以實施或應用。可對上述實施例作成修飾及/或變更，以在不同態樣和應用中實施本揭露，而不抵觸本揭露的精神和範疇。

本文中，除非語境中明確排除，單數形式“一”和“該”包括複數個對象。因此，例如，所提及的“一抗原”包括抗原的混合物；所提及的“一醫藥學上可接受的載劑”包括兩種或多種此類載劑的混合物等等。如此，術語“一”、“一個或多個”、以及“至少一個”可在本文中互換地使用。

此外，本文中使用的“及/或”被用於對兩種特定特徵或成分中的一或二者的詳細說明。因此，本文中，在語句“A及/或B”中使用的術語“及/或”意圖包括“A及B”、“A或B”、“(僅有)A”和“(僅有)B”。

本揭露提供一種包含重組RSV F蛋白的抗原。該重組RSV F蛋白包含兩端與HRN區域和HRC區域相接的抗原區域，且該抗原區域包含選自由位點

、位點II、和位點IV所組成群組的一個或多個抗原位點。

本文中，RSV具有由三個連續基因(SH-G-F)編碼的三種表面糖蛋白：小疏水性糖蛋白(SH)、依附糖蛋白(G)和融合糖蛋白(F)。RSV疫苗研發的主要靶標抗原是RSV F和G，因為這些抗原各自能生成中和抗體以及T細胞反應。由於在RSV隔離群中可觀的保守性，F尤其引人注目。歷史上，存在兩種已知的發現於RSV F的融合前和融合後兩種構型上與中和(NT)活性相關聯的主要抗原性位點。它們最初通過結合至鼠科動物單株抗體(mAb)的1129(位點II)而被界定(Beeler,J.A.et al.,1989；Arbiza,J.,et al.,1992)和101F(位點IV)(Wu,S.J.,et al.,2007)。位點II作為帕利珠單抗的靶標而為人所知，帕利珠單抗可減少高風險嬰兒群體的重度RSV疾病。McLellan等人(McLellan,J.S.,et al.,2013)分離了鼠抗體，5C4，它有效中和RSV但顯示不結合至融合後的F蛋白。5C4與從經免疫接種的PBMCs、D25和AM22分離的其它兩種抗體分享這些性質，該抗體在中和RSV方面已經顯示了比帕利珠單抗大100倍的效力(McLellan,J.S.,et al.,2013)。D25和AM22以位點

為靶標，該位點是位於融合前RSV F三聚體表面上的亞穩態抗原性位點(Spits,H.,et al.,2010；Beaumont,T.,et al.,2012)。F蛋白的融合前晶體結構和融合後晶體結構暗示，雖然在兩種結構上都發現了位點II和位點IV，位點

似乎是對融合前形式有特異性(McLellan,J.S.,et al.,2013)。

RSV F的融合肽區域位於F1亞基的胺基端(Collins,P.L.,et al.,1996)，而該跨膜段含有兩個區域：4,3-疏水性七元重複序列(HR)、令人聯想到捲曲螺旋結構的序列基序(Chambers,P.,et al.,1990；Singh,M.,et al.,1999)。這些區域分別指示為HRN和HRC，且通過約270個胺基酸的中介結構域分隔。HRN和HRC形成三聚體的髮夾樣結構，且該HRC區域以與由HRN區域形成的捲曲螺旋反平行的方式封裝(Baker,K.A.,et al.,1999)。

本揭露的具體實施例中，該HRN區域和HRC區域分別包含胺基酸序列，該等序列分別與SEQ ID NO：1(MAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS)和SEQ ID NO：2(NFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK)的胺基酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%的一致性且具有與SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2相同的功能。本揭露的另一具體實施例中，該抗原區域內包含的抗原位點可選自由位點

、位點II、和位點IV所組成的群組。該位點

、位點II、和位點IV分別包含胺基酸序列，該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO：3(KNYIDKQLLPIVNK)、SEQ ID NO：4(NSELLSLINDMPITNDQKKLMSN)、和SEQ ID NO：5(KNRGIIKTFS)的胺基酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%的一致性且具有與SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、和SEQ ID NO：5相同的功能。本揭露的另一具體實施例中，如果該抗原區域包含超過一個抗原位點，則該抗原位點通過鏈接基而彼此鏈接，且該鏈接基每次出現時獨立由2至20個胺基酸組成。

本文中，術語“序列一致性”或，例如，包含“80%的序列一致”是指，在整個比較窗口中，序列以一個核苷酸對一個核苷酸或一個胺基酸對一個胺基酸為基準的一致性程度。因此，可通過下述計算“序列一致性的百分比”：比較在比較窗口內兩個最適宜地對準的序列，確定兩個序列中出現一致的核酸鹼基(如，A、T、C、G、I)或一致的胺基酸殘基(如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置數，得到匹配位置數，該匹配位置數除以比較窗口內位置的總數(即，窗口尺寸)，結果再乘以100，得到序列一致性的百分比。所包括的是與本文中揭示的任何參考序列(參見如序列表)具有至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核苷酸和多肽，典型地，該多肽變體保持該參考多肽的至少一種生物學活性或功能。

本揭露的具體實施例中，該抗原區域包含直接鏈接至HRN區域的至少一個位點

。

本揭露的另一具體實施例中，HRN區域通過鏈接基鏈接至HRC區域(參見如第1B圖)。再一具體實施例中，該重組RSV F蛋白包含胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：6(MAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSGSGSGSEFGGSGNFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKLEHHHHHH)的胺基酸序列的一致程度為至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%且具有與SEQ ID NO：6相同的功能。

本揭露的另一具體實施例中，該抗原區域包含三個位點

(參見如第1C圖)。再另一具體實施例中，該重組RSV F蛋白包含胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：7(MAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSGSGSASSNIKENKCNAAKNYIDKQLLPIVNKGGGSSNIKENKCNAAKNYIDKQLLPIVNKGGEFSNIKENKCNAAKNYIDKQLLPIVNKKLGGSGNFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKLE)的胺基酸序列的一致程度為至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%且具有與SEQ ID NO：7相同的功能。

本揭露的另一具體實施例中，該抗原區域包含位點II和位點IV。本揭露的另一具體實施例中，該HRN區域通過鏈接基鏈接至位點II，且位點IV通過鏈接基鏈接至HRC區域(參見如第1A圖)。再一具體實施例中，該重組RSV F蛋白包含胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：8(MAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSGSGSNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQGGGSCTASNKNRGIIKTFSNGGGSGNFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK)的胺基酸序列的一致程度為至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%且具有與SEQ ID NO：8相同的功能。

本揭露的具體實施例中，該鏈接基每次出現時獨立由2至20個胺基酸組成，且該鏈接基可獨立包括，但不限於，GSGS、GGGS、GGSG、SGSG和GG中的任一胺基酸序列。

本揭露的具體實施例中，該抗原特異性地結合至5C4、D25、或AM22融合前特異性抗體。

根據本揭露的又一態樣，本揭露提供一種編碼上述抗原的核酸分子。

本揭露的具體實施例中，該核酸分子經密碼子優化以用於在原核細胞內表達。另一具體實施例中，該原核細胞是大腸桿菌細胞。再另一具體實施例中，該核酸分子包含核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：9的核酸序列的一致程度為至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%。

本揭露的具體實施例中，該核酸分子經密碼子優化以用於在真核細胞中表達。另一具體實施例中，該真核細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞。再一具體實施例中，該哺乳動物是人。

根據本揭露的另一態樣，本揭露提供一種包含有效量的上述抗原或核酸分子的疫苗組成物。

一具體實施例中，該疫苗組成物可用來誘導受試者體內對RSV的免疫反應。因此，在若干具體實施例中，可將治療有效量的包含一種或多種本揭露的抗原、或編碼或表達該抗原的核酸分子或質體的疫苗組成物給藥至受試者，以引起對RSV的免疫反應。

另一具體實施例中，在足以預防或緩解受試者體內RSV感染的條件下，將治療有效量的包含一種或多種本揭露的抗原、或編碼或表達該抗原的核酸分子或質體的疫苗組成物給藥至有此需要的受試者。該疫苗組成物以足以引起受試者體內對抗RSV抗原如RSV F蛋白的免疫反應的量給藥。本揭露的具體實施例中，本揭露的疫苗組成物可經鼻內或經肌肉給藥至受試者。

本揭露的具體實施例中，該疫苗組成物可進一步包含醫藥學上可接受的載劑及/或佐劑。

本文中，“醫藥學上可接受的載劑”包括可適用於本揭露疫苗組成物的給藥的任何和全部溶劑、分散介質、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。可用於本揭露的醫藥學上可接受的載劑可包括，但不限於，防腐劑、懸浮劑、增粘劑、等滲劑、緩衝劑、和濕潤劑。

本揭露的另一具體實施例中，可用於本揭露的佐劑包括，但不限於，CpG寡核苷酸和類B肝核心病毒顆粒(HBc VLP)。

另一具體實施例中，給藥至受試者的疫苗組成物包含其含量比為10：1至1：10的抗原與佐劑的混合物。

本揭露的另一具體實施例中，該疫苗組成物促進Thl免疫反應。

已經使用多個實施例來例示性說明本揭露。下述實施例不應視為限制本揭露的範疇。

[實施例]

實施例1：重組RSV嵌合體F蛋白表達載體的構建

合成了具有用於大腸桿菌(Escherichia coli(E.coli))表達的最佳密碼子的RSV F蛋白的全長度cDNA序列(Genomics BioSci & Tech)。使用這一序列作為PCR模板，擴增了RSV F蛋白的4種基因片段，包括含有HRN和位點

的核苷酸457至633(SEQ ID NO：10)、含有位點II的核苷酸760至849(SEQ ID NO：11)、含有位點IV的核苷酸1264至1314(SEQ ID NO：12)、以及含有該C端α-螺旋(HRC)的核苷酸1426至1560(SEQ ID NO：13)。

通過部分重疊PCR鏈接這4種PCR擴增子，並通過富甘胺酸鏈接基如GSGS、GGGS、GGSG、SGSG和GG連接，以形成所構建的基因(命名為HR

24)，隨後，將該基因插入以6-His在C端標記的pET28b的NcoI-XhoI限制位點內，以獲得HR

24質體。

HR

、HR

-3

和HBc質體的構建過程與HR

24質體類似，但區別如下。

對於HR

質體的構建，擴增了RSV F蛋白的以SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13表示的基因片段。隨後，將這兩種PCR擴增子插入以6-His在C端標記且通過富甘胺酸鏈接基而連接的pET28a的NcoI/BamHI和EcoRI/XhoI限制位點內，以獲得HR

質體。

對於HR

-3

質體的構建，擴增了RSV F蛋白的以SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13表示的基因片段。再者，通過PCR創建分別含有NheI/BamHI、BamHI/EcoRI、或EcoRI/HindIII限制位點的三種位點

片段。隨後，將這5種PCR擴增子插入以6-His在C端標記且通過富甘胺酸鏈接而連接的pET28a的NcoI NheI/BamHI/EcoRI/HindIII/XhoI限制位點內，以獲得HR

-3

質體。

將上述所得質體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)勝任細胞內進行蛋白質表達。HR

24、HR

、和HR

-3

重組蛋白的示意圖分別顯示於第1A至1C圖中。

實施例2：重組HBc VLP表達載體的構建

合成了具有用於大腸桿菌表達的最佳密碼子的HBc蛋白的全長度cDNA序列(Genomics BioSci & Tech)。使用這一序列作為PCR模板，擴增了HBc的核苷酸1至444(SEQ ID NO：14)，隨後將其插入以6-His在C端標記的pET28a的NcoI-XhoI限制位點，以獲得重組HBc VLP質體。將所得質體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)勝任細胞內用於蛋白質表達。

實施例1和2的PCR中使用的引子以SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：34表示，顯示於表1中。

實施例3：重組蛋白表達和純化

分別在從實施例1和2中獲得的經轉形的大腸桿菌BL21(DE3)中表達重組RSV F蛋白-6His和HBc-6His，並使用鎳親和色譜純化。通過1體積的樣品對200體積的透析緩衝液(從350mM、150mM至0mM咪唑，1×PBS中)的梯度透析，對經洗脫(使用500mM咪唑、50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl pH 8.0)的蛋白進行緩衝液交換，每一步驟進行12小時。使用離心濃縮機(10,000MWCO,Sartorius)將經透析的蛋白-6His濃縮至約1mg/mL的濃度。通過SDS-PAGE測定該蛋白的分子大小和純度。

通過使用指向為抗His標記的抗體的免疫墨點法，檢測了同一移動性的條帶，結果顯示於第2B、2D、和2F圖中。通過使用指向為抗HBc和RSV的抗體的免疫墨點法，檢測了同一移動性的條帶，結果分別顯示於第2H和2I圖中。對考馬斯藍染色的凝膠的光密度掃描顯示，純化的蛋白HR

24、HR

、HR

-3

和HBc相當於總蛋白的90%以上(第2A、2C、2E、和2G圖)，其純度足以進行免疫接種。

實施例4：HR

24和重組HBc蛋白的穿透式電子顯微鏡(TEM)圖像

在室溫下，令PBS中的8μg的純化HBc VLP在銅網格(300目)上吸附3分鐘。隨後，使用濾紙輕柔地吸乾網格。以1%乙酸雙氧鈾水溶液染色30秒後，移除過量的液體。使用JEM-1400電子顯微鏡在80kV檢查網格。

已經通過TEM證實，HBc VLP形成類病毒顆粒(第3A圖)。TEM還顯示，重組HR

24蛋白形成約50nm的經聚合的奈米顆粒(第3B圖)。

實施例5：動物免疫分析

1.RSV A2株原液的製備

從ATCC獲得RSV A2株。在HEp-2細胞ATCC中實施病毒的繁殖。使用RSV A2以0.2的m.o.i(感染複數)接種在100mm有蓋培養皿(Thermo Scientific)中生長的高達80%融合度的細胞。在37℃的CO₂培養箱內，在不含血清的達爾博克改良伊戈爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM))中進行病毒的吸附。2小時後，將培養基替換為以2%胎牛血清補充的DMEM，將給培養皿再培養48至72小時。通過以3,000rpm離心10min，從細胞碎片分離出含有該病毒的上清液。隨後通過離心濃縮機(100,000MWCO,Sartorius)濃縮病毒。

2.RSV溶菌斑試驗

通過溶菌斑試驗測定RSV病毒效價(titer)。以1×PBS洗滌12孔板中的HEp-2細胞融合單層，隨後以多種稀釋度(10^-3至10^-7)的RSV A2病毒感染該細胞。進行2小時的病毒吸附後，移除上清液，以1×PBS洗滌細胞的單層，之後以DMEM+2%胎牛血清+0.3%瓊脂糖覆蓋。於37℃在CO₂培養箱中培養5天後，細胞以10%福馬林固定，並使用0.05%結晶紫染色進行溶菌斑定量。

3.疫苗給藥和RSV激發

將無病原體的C57BL/6J雌性小鼠(6至8周齡)隨機分為若干組，通過鼻內(i.n)途徑使用候選疫苗在第0、21和42天進行免疫接種，並在第63天(第4圖)令小鼠經1×10⁶p.f.u RSV激發。候選疫苗包括：50μg HR

24；25μg HBc VLP+25μg HR

24；25μg HBc VLP+25μg HR

24+20μg CpG(TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG,SEQ ID NO.37)(基龍米克斯生物科技公司，臺灣)；25μg HBc VLP+50μg HR

24；25μg HBc VLP+50μg HR

24+20μg CpG；50μg HR

；25μg HBc VLP+50μg HR

；25μg HBc VLP+50μg HR

+20μg CpG；50μg HR

-3

；25μg HBc VLP+50μg HR

-3

；和25μg HBc VLP+50μg HR

-3

+20μg CpG。還包括對照組、僅使用25μg HBc VLP在第0、21、和42天進行鼻內途徑免疫接種的組。還包括使用1×10⁵p.f.u福馬林固定的RSV(FIRSV)進行肌肉內(i.m)免疫接種的組。

在RSV激發前，在第61天從使用相同給藥方案的各組別中收集小鼠血清、氣管肺泡灌洗液(BALF)和脾臟。對於RSV激發，在第63天使用1.5%異氟烷麻醉動物，隨後通過1×10⁶p.f.u RSV的鼻內接種令其感染。進行RSV激發後，監控小鼠的體重改變5天。最終，在第68天犧牲小鼠，收集個體的肺進行病毒負載和組織病理學實驗。

實施例6：對由候選疫苗引起的抗體反應的評估

通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測試從如實施例5中揭示的免疫接種小鼠收集的血清和BALF的抗體反應。簡而言之，在4℃，以50μL的純化HR

24(10μg/ml)塗覆96孔板過夜。以2% BSA將該板在37℃封閉1小時，使用血清樣品在試驗稀釋劑(1% BSA、0.05% Tween 20，在1×PBS中)中的逐級稀釋液(10^-2至5.12×10^-4)或BALF的逐級稀釋液(10^-1至1.28×10^-3)在室溫培養2小時。對每一樣品做稀釋物曲線，且將終點效價計算為產生最佳濃度的稀釋物的倒數，該最佳濃度比背景值(對彙集的前免疫血清進行1/50稀釋，或對彙集的對照BALF進行1/5稀釋)高0.1U。將低於50(陰性樣品)的IgG效價或低於5的分泌性IgA(sIgA)效價任意地指定為50或5。

參考第5A至5E圖，該圖顯示，投予HR

24、HR

和HR

-3

可引起血清HR

24特異性總IgG、IgG1、IgG2a和肺HR

24特異性sIgA。此外，通過使用HBc作為佐劑，HR

24、HR

、和HR

-3

可引起顯著更高的血清HR

24特異性總IgG、IgG1、IgG2a以及肺HR

24特異性sIgA，其中，在HBc/HR

24組中觀察到了最高的終點效價。此外，通過使用HBc與CpG的混合物作為佐劑，HR

24也可引起更高的血清HR

24特異性總IgG、IgG1、IgG2a、IgA以及肺HR

24特異性sIgA。

實施例7：候選疫苗在保護小鼠對抗RSV感染上的效果

為了評估投予3次該候選疫苗時的效力，使用如實施例5中揭示的激發活體RSV A2株的經免疫接種小鼠。

1.進行RSV激發後的小鼠體重改變

小鼠在激發感染後的體重改變是評價疫苗保護性效力的最重要的指標。參考第6A和6B圖，在激發2天後，使用HR

24/HBc、HR

24/HBc/CpG、HR

-3

、HR

-3

/HBc、HR

-3

/HBc/CpG、HR

/HBc或HR

/HBc/CpG進行免疫接種的小鼠的體重減輕少於對照組。更具體地，第6A圖顯示，接受與HBc混合的HR

24的組中小鼠的體重減輕為約8至11%。另外，在激發3天後，使用與HBc/CpG混合的25μg和50μg HR

24進行免疫接種的小鼠分別顯示約16%和12%的體重減輕。此外，第6B圖表明，使用HR

/HBc或HR

-3

/HBc混合物進行免疫接種的小鼠顯示約12%或10%的體重減輕。相反，接受肌肉注射FIRSV的小鼠均顯示最高的每天體重減輕，其在激發3天後顯示約25%的體重減輕。

因此，本揭露提供更好的保護以預防小鼠體重減輕，並提供從活體RSV激發後的初始體重減輕快速的恢復。這些證明，由本申請案的抗原引起的抗病毒性免疫提供保護，用於對抗活體RSV A2病毒株。

2.進行RSV激發後的肺組織病理學

對於組織學分析，將肺部樣品在10%中性緩衝福馬林中固定24小時，包埋在石蠟塊中，切割為厚度為5μm的切片，且使用蘇木精和曙紅(H&E)染色。

參考第7圖，在對照組或經HBc、HR

24、HR

、HR

-3

或FIRSV疫苗接種的小鼠體內觀察到了肺組織病理學的改變，其中，經FIRSV免疫接種的小鼠顯示嚴重水平的組織病理學。相比之下，接受HR

24/HBc、HR

/HBc或HR

-3

/HBc混合物的小鼠，進行RSV激發時，顯示了中度水平的肺部病理學。

3.通過定量RT-PCR(qRT-PCR)進行肺病毒負荷分析

由於在天然或實驗性感染過程中，病毒複製與臨床疾病之間存在正相關，因此，對肺病毒負荷的控制是評估疫苗效力的重要參數(DeVincenzo,J.P.,et al.,2005；Karron,R.A.,et al.,1997)。因此，實施以RSV N基因為靶向的qRT-PCR，以定量肺組織中的mRNA水平。

使用毛玻璃載片，製備肺提取物勻漿。通過Qiagen RNeasy試劑盒從勻漿樣品製備總RNA。實施兩個步驟的qRT-PCR。通過SuperScript III逆轉錄酶(Invitrogen)從2μg總RNA擴增第一鏈cDNA。使用以下引子對進行qRT-PCR：用於RSV子群A病毒的RSV-A-N-F730： GCAGGATTGTTTATGAATGCC(SEQ ID NO：35)和RSV-A-N-R857：TCCACAACTTGTTCCATTTC(SEQ ID NO：36)。之後進行優化，該反應含有：每一引子為200nM、1×Power SYBR Green PCR預混液(ABI)、1μL的cDNA、以及水，總量為10μL。使用ABI儀器在下述條件下實施實時PCR：95℃，10min(1×)；95℃，15秒；60℃，60秒(40×)。該DNA鏈用來證實每一PCR循環的績效，並用來促進對實驗樣品的定量分析。

參考第8圖，與對照組相比，使用HR

24、HR

24/HBc、HR

24/HBc/CpG或FIRSV進行免疫接種的小鼠的肺內觀察到了較低水平的病毒效價。與FIRSV組相比，HR

24/HBc/CpG組或HR

24(50)/HBc組中的肺病毒效價顯著更低。這些結果顯示，從經鼻內以HR

24/HBc混合物和HR

24/HBc/CpG混合物進行免疫接種的動物的肺重新獲得了顯著更低的病毒負荷。

因此，這些結果表明，本揭露的抗原可誘導對於RSV為特異性的系統性和黏膜抗體反應。使用本揭露的抗原進行免疫接種的小鼠，顯示被保護對抗RSV而不造成肺病。再者，與FIRSV相比，在小鼠模型中，本揭露的抗原並不過度刺激淋巴細胞，且提供了一種潛在的、安全的RSV候選疫苗。

另外，與野生型RSV F蛋白相比，本揭露的抗原的序列相對較短，且因此相對容易進行大規模生產。此外，與野生型RSV F蛋白相比，本揭露的抗原僅保留了關鍵抗原位點，因此更有助於增加抗體鑒定的特異性，並避免不必要的反應如過敏。

上文中，已經使用例示性優選具體實施例詳細揭示了本揭露。但應理解，本揭露的範疇並不限於所揭露的具體實施例。相反，本揭露意圖覆蓋多種修飾和類似的調整。因此，申請專利範圍的範疇應根據最廣泛的詮釋而定，從而涵蓋所有此類修飾和類似的調整。

<110> 國立臺灣大學

<120> 重組RSV抗原

<130> 114066

<150> US 64/425,078

<151> 2016-11-22

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> PRT

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 1

<210> 2

<211> 45

<212> PRT

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 2

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 3

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 4

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 5

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組RSV F蛋白HRO

<400> 6

<210> 7

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組RSV F蛋白HRO-3O

<400> 7

<210> 8

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組RSV F蛋白HRO24

<400> 8

<210> 9

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組RSV F蛋白

<400> 9

<210> 10

<211> 177

<212> DNA

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 10

<210> 11

<211> 90

<212> DNA

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 11

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 12

<210> 13

<211> 135

<212> DNA

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 13

<210> 14

<211> 462

<212> DNA

<213> B肝病毒

<400> 14

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRN-NcoI-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<400> 15

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRC-XhoI-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(29)

<400> 16

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRN-A1-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(48)

<400> 17

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRN-A1-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(48)

<400> 18

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A1-A2-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(43)

<400> 19

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A1-A2-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(43)

<400> 20

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A2-HRC-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(48)

<400> 21

<210> 22

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A2-HRC-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(48)

<400> 22

<210> 23

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-N-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(59)

<400> 23

<210> 24

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-C-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(60)

<400> 24

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRN-BamHI-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(31)

<400> 25

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRC-EcoRI-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(32)

<400> 26

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-NheI-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<400> 27

<210> 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-BamHI-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(34)

<400> 28

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-BamHI-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<400> 29

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-EcoRI-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(33)

<400> 30

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-EcoRI-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(26)

<400> 31

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-HindIII-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(28)

<400> 32

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBc148-NcoI-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<400> 33

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBc148-XhoI-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(30)

<400> 34

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RSV-A-N-F730

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<400> 35

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RSV-A-N-R857

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 36

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG

<400> 37

Claims

一種包含重組呼吸道融合病毒(RSV)F蛋白的抗原，其中，該重組RSV F蛋白包含兩端與HRN區域和HRC區域相接的抗原性區域，且其中，該HRN區域和HRC區域分別包含與SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的胺基酸序列的一致程度為至少80%且形成三聚體結構的胺基酸序列；該抗原性區域包含選自位點
、位點II、和位點IV所組成群組的一個或多個抗原性位點，該位點
、位點II、和位點IV分別包含與SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、和SEQ ID NO：5的胺基酸序列的一致程度為至少80%且維持SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、和SEQ ID NO：5之抗原特異性的胺基酸序列；如果該抗原性區域包含超過一個抗原性位點，則該抗原性位點通過鏈接基彼此鏈接；以及該鏈接基每次出現時，獨立由2至20個胺基酸組成，其中，該鏈接基包含GSGS、GGGS、GGSG、SGSG和GG中任一種的胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述的抗原，其中，該抗原性區域包含直接鏈接至該HRN區域的至少一個位點
。
如申請專利範圍第1項所述的抗原，其中，該抗原性區域包含位點II和位點IV。
如申請專利範圍第3項所述的抗原，其中，該HRN區域通過鏈接基鏈接至位點II，且位點IV通過該鏈接基鏈接至該HRC區域。
如申請專利範圍第4項所述的抗原，其中，該重組RSV F蛋白包含與SEQ ID NO：8的胺基酸序列的一致程度為至少80%且具有與SEQ ID NO：8相同功能的胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述的抗原，其中，該抗原性區域包含3個位點
。
如申請專利範圍第6項所述的抗原，其中，該重組RSV F蛋白包含與SEQ ID NO：7的胺基酸序列的一致程度為至少80%且具有與SEQ ID NO：7相同功能的胺基酸序列。
一種包含重組呼吸道融合病毒(RSV)F蛋白的抗原，其中，該重組RSV F蛋白包含HRN區域和HRC區域，且其中，該HRN區域通過鏈接基鏈接至該HRC區域；該HRN區域和該HRC區域分別包含與SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的胺基酸序列的一致程度為至少80%且形成三聚體結構的胺基酸序列；以及該鏈接基每次出現時，獨立由2至20個胺基酸組成，其中，該鏈接基包含GSGS、GGGS、GGSG、SGSG和GG中任一種的胺基酸序列。
如申請專利範圍第1或8項所述的抗原，其中，該抗原特異性地結合至5C4、D25、或AM22融合前特異性抗體。
一種核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗原。
如申請專利範圍第10項所述的核酸分子，其密碼子經優化以用於在原核細胞內表達。
如申請專利範圍第11項所述的核酸分子，其中，該原核細胞是大腸桿菌細胞。
如申請專利範圍第12項所述的核酸分子，其中，該核酸分子包含與SEQ ID NO：9的核酸序列的一致程度為至少80%的核酸序列。
如申請專利範圍第10項所述的核酸分子，其密碼子經優化以用於在真核細胞內表達。
如申請專利範圍第14項所述的核酸分子，其中，該真核細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第15項所述的核酸分子，其中，該哺乳動物細胞是人類細胞。
一種疫苗組成物，包含有效量的如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗原。
如申請專利範圍第17項所述的疫苗組成物，進一步包含醫藥學上可接受的載劑及/或佐劑。
如申請專利範圍第18項所述的疫苗組成物，其中，該佐劑是CpG寡核苷酸或類B肝核心病毒顆粒。
如申請專利範圍第19項所述的疫苗組成物，其促進Thl免疫反應。