KR101617895B1 - 재조합 ｒｓｖ 항원 - Google Patents

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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 재조합 호흡기 합포체 바이러스 (RSV) 항원 및 이의 제조 및 사용 방법을 제공하는데, 이에는 RSV 감염증을 치료 및/또는 예방하기 위한 면역원성 조성물 (예: 백신)이 포함된다.

Description

재조합 ＲＳＶ 항원 {Recombinant RSV antigens}
관련 출원에 관한 참고:
본 출원은 2007년 12월 24일자로 출원된 미국 가특허원 제61/016,524호 및 2008년 5월 27일자로 출원된 미국 가특허원 제61/056,206호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)의 초기 출원일의 이득을 청구하고 있다.
37 C.F.R. §1.71(E)에 따르는 저작권 통지:
본 특허 문헌 명세서의 일부는 저작권 보호를 받아야 하는 물질을 함유하고 있다. 저작권자는 본 특허 문헌 또는 특허 명세서가 특허 상표청 특허 파일 또는 레코드에 실려있기 때문에 제3자에 의한 그의 복사를 반대하지 않지만, 어떠하든지 간에 모든 저작권을 보유하고 있다.
본 발명은 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 호흡기 합포체 바이러스 [Respiratory Syncytial Virus (RSV)]에 대해 특이적인 면역 반응을 유도시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
인간 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)는 6개월 미만 유아와 임신 35주 이하 미숙아에게서의 하부 기도 감염증 (LRI)의 전계적으로 가장 흔한 원인이다. RSV 질병 스펙트럼에는 비염 및 이염에서부터 폐렴 및 기관지염까지 광범위한 호흡기 증상이 포함되는데, 후자 두 가지 질병은 상당한 발병률 및 사망률과 연관이 있다. RSV에 대해 유일하게 공지된 보유숙주가 인간이다. 이러한 바이러스가 오염된 코 분비물로부터 확산되는 것은 큰 호흡기 비말을 통해서 일어나기 때문에, 이것이 전파하기 위해서는 감염된 개체 또는 오염된 표면과 밀접하게 접촉해야 한다. RSV는 장난감이나 기타 물체 상에서 수 시간 동안 존속할 수 있는데, 이것은 특히 소아과 병동에서 병원내 RSV 감염이 신속하게 전파된다는 것을 설명하고 있다.
전세계적으로 매년 RSV에 대한 감염자와 사망자 수치는 각각 6천 4백만명과 160,000명인 것으로 추정되고 있다. 미국에서만 해도, RSV로 인한 입원 환자가 18,000명 내지 75,000명이고, 매년 90명 내지 1,900명이 사망한다. 온대 기후에서는, RSV가 매년 마다 겨울에 유행하는 기관지염과 폐렴을 포함한 급성 LRI의 원인인 것으로 널리 입증되어 있다. 미국에서는, 거의 모든 2세 어린이가 RSV에 감염된 적이 있었다. 그 밖에 건강한 어린이에게서 RSV 관련 LRI의 발생자 수은 생후 2년 동안 매년 1000명의 어린이당 37명인 것으로 계산되었고 (6개월 미만 유아에게서는 매년 1000명당 45명이다), 매년 1000명의 어린이당 (매년 생후 6개월 어린이 1000명당) 6명이 입원하고 있다. 심폐 질환이 있는 어린이와 미숙아에게서는 그 발생자 수가 더 많았는데, 이들은 미국에서 RSV와 관련하여 입원한 환자의 거의 절반을 차지하고 있다. 나중에 RSV에 의해 유발된 보다 중증의 LRI를 경험하고 있는 어린이는 어린이 천식 발생률이 증가하였다. 이들 연구 결과, RSV 백신이 광범위하게 요구되고 있을 뿐만 아니라 중증의 LRI 및 그의 합병증 환자를 보살피는 비용이 많이 드는 선진 공업국에서 상기 백신을 사용하는 것이 필요한 것으로 입증되었다. RSV는 또한 점차적으로, 노인에게서 인플루엔자-유사 질병 발병의 중요한 원인으로서 인식되고 있다.
건강한 집단과 위험에 처한 집단에게서 영속적이면서도 보호성 면역 반응을 생성시켜 주는 안전하고도 유효한 RSV 백신을 생산하기 위한 각종 접근 방식이 시도되어 왔었다. 그러나, 현재까지 평가된 후보 백신 중에서는, RSV 감염증을 예방하고/하거나 하부 호흡기 감염증 (LRI)을 포함한 RSV 질병을 감소 또는 예방하기 위한 백신으로서 안전하고 유효한 것으로 입증된 백신이 없었다.
<발명의 요약>
본 발명은 재조합 호흡기 합포체 바이러스 (RSV) 항원에 관한 것이다. 보다 구체적으로 언급하면, 본 발명은 삼량체성 융합전 (prefusion) 입체형태를 안정화시키기 위해 변형시킨 재조합 F 단백질을 포함한 항원에 관한 것이다. 본원에 기재된 재조합 항원은 탁월한 면역원성을 나타내고, RSV 감염 및/또는 질병에 대하여 보호하기 위한 면역원성 조성물 (예: 백신)의 구성분으로서 특히 바람직하게 이용되고 있다. 또한, 본원에는 상기 재조합 항원을 암호화하는 핵산, 이러한 항원을 함유하는 면역원성 조성물, 및 당해 항원을 생성 및 이용하는 방법이 기재되어 있다.
도 1a는 RSV F 단백질의 구조적 특징을 강조하여 도식적으로 예시한 것이다. 도 1b는 예시되는 RSV 융합전 F (PreF) 항원을 도식적으로 예시한 것이다.
도 2는 PreF의 비대칭 장 유동 분획법 (AFF-MALS) 분석의 대표적인 결과를 예시하는 선 그래프이다.
도 3은 PreF 항원에 의한 인간 혈청의 중화 억제를 도시하는 막대 그래프이다.
도 4a 및 4b는 PreF 항원에 반응하여 마우스에서 유도된 혈청 IgG 역가를 도시하는 막대 그래프이다.
도 5a 및 5b는 PreF 항원에 의해 유도된 RSV에 대해 특이적인 중화 항체의 역가를 예시하는 막대 그래프이다.
도 6a 및 6b는 마우스에서 RSV PreF 항원에 의해 제공된 시험감염에 대한 보호를 나타내는 그래프이다.
도 7은 면역 및 시험감염 후 BAL 백혈구를 평가하는 그래프이다.
<발명의 상세한 설명>
도입
RSV 감염을 예방하기 위한 백신 개발은 숙주 면역 반응이 상기 질병의 발병 기전에 일정 역할을 하는 것으로 여겨진다는 사실에 의해 복잡하게 되어 왔다. 1960년대의 초기 연구에서는, 포르말린-불활성화 RSV 백신으로 예방 접종받은 어린이들이 예방 접종받지 않은 대조군 대상체와 비교해서 이러한 바이러스에 대한 후속 노출시 보다 중증의 질병으로 인해 고통받고 있는 것으로 나타났다. 이들 초기 시험으로 인해, 백신 접종받은 어린이의 80%가 입원하였고 2명이 사망하였다. 질병의 중증도 증강은 동물 모델에서도 재현되었는데, 이는 부적당한 수준의 혈청 중화 항체, 국소 면역의 결여, 및 폐 호산구증과 IL-4 및 IL-5 사이토킨의 생성 증가를 수반하는 유형 2 조력 T-세포-유사 (Th2) 면역 반응의 과도한 유도로부터 비롯되는 것으로 여겨진다. 이와는 달리, RSV 감염에 대하여 성공적으로 보호해주는 백신은 IL-2 및 γ-인터페론 (IFN)의 생성을 특징으로 하는 Th1 편향된 면역 반응을 유도시킨다.
본 발명은 기존에 백신에 사용되어 온 RSV 항원과 부닥치게 되는 문제점을 해결시켜 주고 상기 항원의 제조 상의 특성 뿐만 아니라 면역학적 특성을 개선시켜 주는 재조합 호흡기 합포체 바이러스 (RSV) 항원에 관한 것이다. 본원에 기재된 재조합 RSV 항원은 F 단백질의 융합전 입체형태, 즉 숙주 세포 막과 융합되기에 앞서 어셈블링된 성숙한 융합 (F) 단백질의 입체형태를 안정화시키기 위해 변형시킨 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 F 단백질 유사체를 포함한다. 이들 F 단백질 유사체는, 명료하면서도 단순화시키기 위해 "PreF" 또는 "PreF 항원"으로 명명된다. 본원에 기재된 PreF 항원은 이종 삼량체화 도메인을 혼입시킴으로써 변형시킨 가용성 F 단백질 유사체가 개선된 면역원성 특징을 나타내고, 대상체에게 생체내 투여되는 경우에 안전하면서도 고도로 보호적이란 사실을 예기치 못하게 발견한 것을 근거로 예측한 것이다.
RSV F 단백질의 구조에 관한 상세 내역은 당해 분야에서 널리 허용되고 있는 용어 및 명명법을 참고로 하여 본원에 제공되고, 도 1a에 도식적으로 예시되어 있다. 예시되는 PreF 항원의 도식적 예시가 도 1b에 제공된다. 본원에 제공된 교시에 따라서 융합전 입체형태를 안정화시키기 위해 모든 RSV F 단백질을 변형시킬 수 있다는 사실을 당업자는 인지해야 할 것이다. 따라서, PreF 항원의 생성을 안내하는 원리의 이해를 돕기 위해, 예시되는 F 단백질 (그의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 서열 1 및 2에 제공되어 있다)을 참고로 하여 개개의 구조적 성분이 표시될 것이다. 유사하게, 적용 가능한 경우에는 G 단백질 항원이 예시되는 G 단백질 (그의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 서열 3 및 4에 제공되어 있다)을 기준으로 하여 기재된다.
F 단백질 폴리펩티드의 일차 아미노산 서열 (도 1a)을 참고로 하여, 다음 용어를 활용하여 PreF 항원의 구조적 특징을 서술한다.
용어 F0는 완전한 길이의 해독된 F 단백질 전구체를 지칭한다. F0 폴리펩티드는 pep27로 명명된 개재 펩티드에 의해 분리된 F2 도메인과 F1 도메인으로 세분될 수 있다. 성숙화 동안, F0 폴리펩티드는 F2와 F1 사이에 위치해 있고 pep27를 플랭킹하는 2개의 푸린 부위에서 단백질 분해적 절단을 진행하고 있다. 이에 따른 토론 목적상, F2 도메인은 아미노산 1-109의 적어도 일부와 전부 정도를 포함하고, F1 도메인의 가용성 부분은 F 단백질의 아미노산 137-526의 적어도 일부와 거의 전부를 포함한다. 상기에 나타낸 바와 같이, 이들 아미노산 위치 (및 본원에서 지정된 모든 후속 아미노산 위치)는 서열 2의 예시되는 F 단백질 전구체 폴리펩티드 (F0)를 기준으로 하여 제공된다.
융합전 F (또는 "PreF") 항원은 F 단백질의 융합전 입체형태를 안정화시키는 한 가지 이상의 변형을 포함하는 가용성 (즉, 막 결합되지 않음) F 단백질 유사체이므로, RSV 항원은 F 단백질의 융합전 입체형태의 하나 이상의 면역우성 에피토프를 보유하고 있다. 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 RSV F 단백질의 F2 도메인과 F1 도메인을 포함하지만, RSV F 단백질의 막관통 (transmembrane) 도메인은 포함하지 않는다. 예시 양태에서, F2 도메인은 F 단백질의 아미노산 26-105를 포함하고, F1 도메인은 F 단백질의 아미노산 137-516을 포함한다. 그러나, 안정화된 PreF 항원의 3차원적 입체형태가 유지되는 한은, 보다 작은 부분을 사용할 수도 있다. 유사하게, 부가의 구조적 성분을 포함하는 폴리펩티드 (예: 융합 폴리펩티드)가 상기 예시되는 F2 및 F1 도메인 대신 사용할 수도 있는데, 단 부가의 성분이 3차원적 입체형태를 붕괴시키지 않아야 하거나, 안정성, 생성 또는 프로세싱에 불리한 영향을 미치지 말아야 하거나, 또는 해당 항원의 면역원성을 저하시키지 말아야 한다. F2 및 F1 도메인은 성숙한 융합전 입체형태로의 F 단백질 유사체의 폴딩과 어셈블리를 복제하도록 설계된 N-말단에서 C-말단 배향으로 위치하고 있다. 생성을 증강시키기 위해, F2 도메인이 재조합 PreF 항원을 발현시켜야 하는 숙주 세포에서의 생성과 분비를 증강시키기 위해 선택된 이종 신호 펩티드 또는 천연 F 단백질 신호 펩티드와 같은 분비성 신호 펩티드 보다 앞설 수 있다.
PreF 항원은 한 가지 이상의 변형, 예를 들어 부가, 결실 또는 치환, 또는 1개 이상의 아미노산을 도입함으로써 (삼량체성 융합전 입체형태로) 안정화시킨다. 이러한 한 가지 안정화 변형은 이종 안정화 도메인을 포함하는 아미노산 서열의 부가이다. 예시 양태에서, 이종 안정화 도메인은 단백질 다량체화 도메인이다. 이러한 단백질 다량체화 도메인의 특히 선호되는 한 가지 예는 코일드 코일 (coiled-coil) 도메인, 예를 들어 이러한 도메인을 갖는 다중 폴리펩티드의 삼량체화를 증진시키는 이소루이신 지퍼 (zipper) 도메인이다. 예시되는 이소루이신 지퍼 도메인은 서열 11에 제시되어 있다. 전형적으로, 이종 안정화 도메인은 F1 도메인에 대한 C-말단에 위치한다.
임의로는, 다량체화 도메인을 짧은 아미노산 링커 서열, 예를 들어 서열 GG를 통하여 F1 도메인과 연결시킨다. 링커는 보다 긴 링커일 수도 있다 (예를 들어, 서열 GG를 포함한 링커, 예를 들면 아미노산 서열: GGSGGSGGS; 서열 14이다). PreF 항원의 입체형태를 붕괴시키지 않으면서 본 맥락에서 사용될 수 있는 수 많은 입체형태적 중성 링커가 당해 분야에 공지되어 있다.
또 다른 안정화 변형은 천연 F0 단백질 내의 F2 도메인과 F1 도메인 사이에 위치하는 푸린 인식 및 절단 부위를 제거하는 것이다. 푸린 인식 부위의 1개 이상의 아미노산을 결실 또는 치환시킴으로써, 위치 105-109 및 위치 133-136에 위치한 푸린 인식 부위 중의 하나 또는 둘 다를 제거하여, 프로테아제가 PreF 폴리펩티드를 그의 구성분 도메인으로 절단시킬 수 없게 할 수 있다. 임의로는, 예를 들어 링커 펩티드에 의해, 개재 pep27 펩티드를 제거하거나 치환시킬 수도 있다. 부가적으로, 또는 임의로, 융합 펩티드에 근접하여 위치한 비-푸린 절단 부위 (예를 들어, 위치 112-113에서의 메탈로프로테이나제 부위)를 제거하거나 치환시킬 수 있다.
안정화 돌연변이의 또 다른 예는 친수성 아미노산을 F 단백질의 소수성 도메인 내로 부가하거나 치환시키는 것이다. 전형적으로는, 전하를 띤 아미노산, 예를 들어 리신이 소수성 영역에 부가되거나 또는 이러한 영역 중의 중성 잔기, 예를 들어 루이신을 대체할 것이다. 예를 들어, 친수성 아미노산을 F 단백질 세포외 도메인의 HRB 코일드-코일 도메인 내의 소수성 또는 중성 아미노산에 부가하거나 이를 대체할 수 있다. 예를 들어, 전하를 띤 아미노산 잔기, 예를 들어 리신이 F 단백질의 위치 512에 존재하는 루이신을 대체할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 또한, 친수성 아미노산을 F 단백질의 HRA 도메인 내의 소수성 또는 중성 아미노산에 부가하거나 이를 대체할 수 있다. 예를 들어, 전하를 띤 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 리신을 PreF 항원의 위치 105-106 또는 그 근처 (예를 들어, 기준 서열 2의 잔기 105에 상응하는 아미노산 다음, 예를 들어 아미노산 105와 106 사이)에 삽입할 수 있다. 임의로는, 친수성 아미노산을 HRA 및 HRB 도메인 둘 다에 부가하거나 치환시킬 수 있다. 또 다른 한편으론, 하나 이상의 소수성 잔기를 결실시킬 수 있는데, 단 PreF 항원의 전반적인 입체형태에 불리한 영향을 미치지 않아야 한다.
모든 안정화 변형을 개별적으로 사용하고/하거나 PreF 항원을 생성하기 위해 본원에 기재된 기타 안정화 변형과 조합하여 사용할 수 있다. 예시 양태에서, PreF 단백질은 F2 도메인과 F1 도메인 사이에 개재 푸린 절단 부위 없이 F1 도메인에 대해 C-말단에 위치한 이종 안정화 도메인 (예: 삼량체화 도메인)을 수반하는 F2 도메인과 F1 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 특정의 양태에서, PreF 항원은 또한, 친수성 잔기를 소수성 HRA 및/또는 HRB 도메인 내로 1회 이상 부가하고/하거나 치환시킨 것을 포함한다. 임의로, PreF 항원은 하나 이상의 비-푸린 절단 부위, 예를 들어 메탈로프로테이나제 부위의 변형을 갖고 있다.
PreF 항원은 임의로, RSV G 단백질의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 부가의 폴리펩티드 성분을 포함할 수 있다. 즉, 특정의 양태에서, PreF 항원은 F 단백질 성분과 G 단백질 성분 둘 다를 포함하는 키메라 단백질이다. F 단백질 성분은 상기 언급된 PreF 항원 중의 어느 것일 수 있고, G 단백질 성분은 RSV G 단백질의 면역학적 활성 부분 (완전한 길이까지 및/또는 완전한 길이 포함 G 단백질)이 되도록 선택된다. 예시 양태에서, G 단백질 폴리펩티드는 G 단백질의 아미노산 149-229를 포함한다 (여기서, 아미노산 위치는 서열 4에 나타낸 G 단백질 서열을 참고로 하여 지정된다). 당업자는 G 단백질의 선택된 부분이 보다 큰 G 단백질 단편의 우성 면역학적 특징을 보유하고 있는 한은, G 단백질의 보다 작은 부분 또는 단편을 사용할 수 있다는 사실을 인지할 것이다. 특히, 상기와 같이 선택된 단편은 아미노산 위치 약 184 내지 198 사이에 면역학적으로 우성인 에피토프를 보유하고 있고 (예를 들어, 아미노산 180 내지 200), 면역우성 에피토프를 나타내는 안정적인 입체형태로 폴딩되고 어셈블링되기에 충분히 길다. 보다 긴 단편, 예를 들어 아미노산 약 128에서 아미노산 약 229까지, 완전한 길이 정도의 G 단백질을 사용할 수도 있다. 선택된 단편이 키메라 단백질의 맥락에서 안정적인 입체형태로 폴딩되는 한은, 이것이 숙주 세포에서 재조합적으로 생성되는 경우에 생성, 프로세싱 또는 안정성을 방해하지 않는다. 임의로는, G 단백질 성분을 짧은 아미노산 링커 서열, 예를 들어 서열 GG를 통하여 F 단백질 성분과 연결시킨다. 링커는 보다 긴 링커일 수도 있다 (예를 들어, 아미노산 서열: GGSGGSGGS; 서열 14). PreF 항원의 입체형태를 붕괴시키지 않으면서 본 맥락에서 사용될 수 있는 수 많은 입체형태적 중성 링커가 당해 분야에 공지되어 있다.
임의로는, G 단백질 성분이 RSV 질병의 동물 모델에서 증강된 바이러스성 질병을 감소 또는 예방시켜 주는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 즉, G 단백질은 PreF-G 키메라 항원을 포함한 면역원성 조성물을 허용된 동물 모델 (예: 마우스 RSV 모델) 중에서 선택된 대상체에게 투여하는 경우에, 이러한 대상체가 변형되지 않은 G 단백질을 함유하는 것을 포함한 백신을 투여한 대조군 동물과 비교해서 백신 증강된 바이러스성 질병 (예: 호산구증, 호중구증) 증상이 저하되거나 없도록 해주는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 백신 증강된 바이러스성 질병의 저하 및/또는 예방은 면역원성 조성물을 아주반트의 부재 하에 투여하는 경우에 명백할 수 있다 (그러나, 예를 들어 상기 항원을 강력한 Th1 유도성 아주반트의 존재 하에 투여하는 경우는 아니다). 부가적으로, 아미노산 치환은 인간 대상체에게 투여된 경우에는 백신 증강된 바이러스성 질병을 감소 또는 예방할 수 있다. 적합한 아미노산 치환의 특정 예는 위치 191에서의 아스파라긴을 알라닌으로 대체시키는 것이다 (아미노산 191에서의 Asn → Ala: N191A).
임의로는, 상기 언급된 어떠한 PreF 항원도 정제에 대한 보조로서 작용하는 부가의 서열을 포함할 수 있다. 한 가지 예는 폴리히스티딘 태그이다. 이러한 태그는 경우에 따라, 최종 생성물로부터 제거할 수 있다.
발현된 경우, PreF 항원은 폴리펩티드의 다량체를 포함하는 성숙한 단백질로의 분자내 폴딩과 어셈블링을 진행한다. 바람직하게, PreF 항원 폴리펩티드는 성숙하고 프로세싱된 RSV F 단백질의 융합전 입체형태와 유사한 삼량체로 어셈블링된다.
본원에 기재된 모든 PreF 항원 (PreF-G 항원 포함)은 RSV에 대하여 보호성 면역 반응을 유도시킬 목적으로 면역원성 조성물에 사용되는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 면역원성 조성물은 전형적으로, 제약상 허용 가능한 담체 및/또는 부형제, 예를 들어 완충제를 포함한다. 투여 후에 생성된 면역 반응을 증강시키기 위해, 면역원성 조성물은 전형적으로, 아주반트를 포함하기도 한다. RSV에 대하여 보호성 면역 반응을 유도시키기 위한 면역원성 조성물 (예: 백신)의 경우에는, 이러한 조성물이 바람직하게, Th1 면역 반응을 주로 유도시키는 아주반트 (Th1 편향성 아주반트)를 포함한다. 전형적으로, 이러한 아주반트는 상기 조성물이 투여되어야 하는 표적 집단에게 투여하기 적합하도록 선택된다. 따라서, 적용에 따라서, 아주반트는, 예를 들어 신생아 또는 노인에게 투여하기 적합하도록 선택된다.
본원에 기재된 면역원성 조성물은 바람직하게, RSV에 대한 투여 또는 노출 후 병리학적 반응 (예를 들어, 백신 증강된 바이러스성 질병)을 유도시키지 않으면서, RSV로의 감염을 감소 또는 예방시키기 위한 백신으로서 이용된다.
몇몇 양태에서, 면역원성 조성물은 PreF 항원 (예를 들어, 서열 6으로써 예시된 예시 양태) 및 G 단백질 성분을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. G 단백질 성분은 전형적으로, G 단백질의 적어도 아미노산 149-229를 포함한다. G 단백질의 보다 작은 부분을 사용할 수 있긴 하지만, 이러한 단편은 최소한, 아미노산 184-198의 면역학적 우성 에피토프를 포함해야 한다. 또 다른 한편, G 단백질은 임의로는 보다 큰 단백질, 예를 들어 완전한 길이의 G 단백질 또는 키메라 폴리펩티드의 특정 요소로서 G 단백질의 보다 큰 부분, 예를 들어 아미노산 128-229 또는 130-230을 포함할 수 있다.
기타 양태에서, 면역원성 조성물은 G 단백질 성분을 포함하기도 하는 키메라 단백질인 PreF 항원 (예를 들어, 서열 8 및 10으로써 예시된 예시 양태)을 포함한다. 이러한 키메라 PreF (또는 PreF-G) 항원의 G 단백질 성분은 전형적으로, G 단백질의 적어도 아미노산 149-229를 포함한다. 상기 표시된 바와 같이, G 단백질의 보다 작거나 보다 큰 단편 (예를 들어, 아미노산 129-229 또는 130-230)을 사용할 수도 있는데, 단 면역우성 에피토프를 보유하고 있어야 하고, PreF-G 항원의 입체형태에 불리한 영향을 미치지 않아야 한다.
임의로, 면역원성 조성물은 또한, RSV 이외의 병원성 유기체의 하나 이상의 부가 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 병원성 유기체는 RSV 이외의 바이러스, 예를 들어 파라인플루엔자 바이러스 (PIV), 홍역, B형 간염, 폴리오바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스이다. 또 다른 한편, 병원성 유기체는 세균, 예를 들어 디프테리아, 파상풍, 백일해, 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 및 뉴모코쿠스 (Pneumococcus)일 수 있다
모든 PreF 항원 (PreF-G 항원 포함)을 암호화하는 재조합 핵산이 또한, 본 발명의 특징이다. 몇몇 양태에서는, PreF 항원을 암호화하는 핵산의 폴리뉴클레오티드 서열을 선택된 숙주 (예를 들어, CHO 세포, 기타 포유류 세포 또는 곤충 세포)에서의 발현을 위해 최적화시킨다. 따라서, 발현 벡터 (원핵성 및 진핵성 발현 벡터 포함)를 포함한 벡터가 본 발명의 특징이다. 마찬가지로, 상기 핵산 및 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본 발명의 특징이다. 이러한 핵산은 RSV에 대해 특이적인 면역 반응을 유도시키기 위해 대상체에게 투여하기 위한 면역원성 조성물의 맥락에서 사용할 수도 있다.
PreF 항원을 RSV 감염증을 예방 및/또는 치료하는 데 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 또 다른 국면은 RSV에 대하여 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 PreF 항원을 함유하는 조성물의 면역학적 유효량을 대상체 (예: 인간 또는 동물 대상체)에게 투여하는 것을 포함한다. 면역학적 유효량의 조성물을 투여하면, PreF 항원 상에 존재하는 에피토프에 대해 특이적인 면역 반응이 유도된다. 이러한 면역 반응에는 B 세포 반응 (예: 중화 항체의 생성) 및/또는 T 세포 반응 (예: 사이토킨의 생성)이 포함될 수 있다. 바람직하게는, PreF 항원에 의해 유발된 면역 반응이 RSV F 단백질의 융합전 입체형태 상에 존재하는 하나 이상의 입체형태적 에피토프에 대해 특이적인 요소를 포함한다. PreF 항원 및 조성물은 RSV와의 접촉에 따른 바이러스성 질병의 증강없이 대상체에게 투여할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 기재된 PreF 항원 및 적합하게 제형화된 면역원성 조성물이 RSV로의 감염을 감소 또는 예방시켜 주고/주거나 RSV로의 감염에 따른 병리학적 반응을 감소 또는 예방시켜 주는 Th1 편향된 면역 반응을 유도시킨다.
면역원성 조성물은 PreF 항원을 상부 기도 점막과 직접 접촉시켜 두는 각종 경로, 예를 들어 비내 경로를 통하여 투여할 수 있다. 또 다른 한편으론, 보다 전통적인 투여 경로, 예를 들어 근육내 투여 경로를 이용할 수 있다.
따라서, RSV 감염증을 치료하기 위한 (예를 들어, RSV 감염증을 예방적으로 처치하거나 예방하기 위한) 약물을 제조하는 데에 있어서의, 본원에 기재된 RSV 항원 (또는 핵산)의 용도가 또한 고려된다. 따라서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 본원에 기재된 재조합 RSV 항원 또는 면역원성 조성물 뿐만 아니라 RSV 관련 질병을 예방 또는 치료하기 위한 그의 용도를 제공한다.
PreF 항원에 관한 부가의 상세 내역, 및 그의 사용 방법이 다음의 설명과 실시예에 제시되어 있다.
용어
본 발명의 각종 양태 고찰을 촉진시키기 위해, 다음 용어 설명이 제공된다. 부가의 용어 및 설명이 본 발명의 맥락에서 제공될 수 있다.
달리 설명되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 바와 동일한 의미를 갖고 있다. 분자 생물학 분야에서의 통상의 용어 정의는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)].
달리 명백히 표시하지 않는 한, 단수 용어에는 복수 지시 대상이 포함된다. 유사하게, 단어 "또는"은 달리 명백히 표시하지 않는 한, "및"을 포함한다. 용어 "복수"는 2개 이상을 지칭한다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 제공된 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적인 수치이고, 설명하기 위해 제공된다는 사실을 추가로 인지해야 한다. 부가적으로, 물질, 예를 들어 항원의 농도 또는 수준과 관련하여 제공된 수적 한계치는 대략적인 수치이다. 따라서, 농도가 (예를 들어) 200 pg 이상인 것으로 표시된 경우, 이는 해당 농도가 대략적으로 (또는 "약" 또는 "~") 200 pg 이상인 것으로 이해해야 한다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 물질을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있긴 하지만, 적합한 방법 및 물질은 다음에 기재된다. 용어 "포함하는"은 "포함되는"을 의미한다. 따라서, 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하는" 및 "포함한다" 및 "포함한"과 같은 변형어는 언급된 화합물 또는 조성물 (예: 핵산, 폴리펩티드, 항원) 또는 단계, 또는 화합물 군 또는 단계 군의 봉입을 암시하는 것이지만, 기타 어떠한 화합물, 조성물, 단계, 또는 그의 군의 배제를 암시하는 것은 아니라는 것을 인지해야 할 것이다. 약어 "e.g.(예를 들어)"는 비-제한적 예를 표시하기 위해 본원에서 사용된다. 약어 "e.g."는 예를 들면 (for example)과 동의어이다.
호흡기 합포체 바이러스 (RSV)는 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae) 과, 뉴모비리내 (Pneumovirinae) 아과, 뉴모바이러스 (Pneumovirus) 속의 병원성 바이러스이다. RSV의 게놈은 11개 단백질을 암호화하는 음성-센스 RNA 분자이다. RNA 게놈을 바이러스성 N 단백질과 단단히 연합시키면, 바이러스성 외피 내부에 둘러싸인 뉴클레오캡시드가 형성된다. G 당단백질의 항원성 상의 차이를 근거로 하여, 인간 RSV 균주의 2개 군, 즉 A 및 B 군이 보고되었다. 현재까지 수 많은 RSV 균주가 단리되었다. 진뱅크 및/또는 EMBL 승인 번호로써 표시된 예시 균주가 WO2008114149에서 발견될 수 있는데, 이 문헌은 PreF 항원 (키메라 PreF-G 항원 포함)에서 사용하기 적합하고, PreF 항원과 병용해서 사용하기 적합한 RSV F 및 G 단백질의 핵산 및 폴리펩티드 서열을 기재할 목적으로 본원에 참고로 도입된다. RSV의 부가 균주가 단리될 것으로 예상되고, 이는 RSV 속 내에 포괄된다. 유사하게, RSV 속은 유전적 부동 (genetic drift), 또는 인공 합성 및/또는 재조합에 의해 천연 발생적 균주 (예를 들어, 기존에 확인되었거나 후속 확인된 균주)로부터 발생하는 변이체를 포괄한다.
용어 "F 단백질" 또는 "융합 단백질" 또는 "F 단백질 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질 폴리펩티드"는 RSV 융합 단백질 폴리펩티드의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 유사하게, 용어 "G 단백질" 또는 "G 단백질 폴리펩티드"는 RSV 부착 단백질 폴리펩티드의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 수 많은 RSV 융합 및 부착 단백질이 보고되었고, 이는 당업자에게 공지되어 있다. WO2008114149는 본 발명의 출원일자로 공개적으로 입수 가능한 예시 F 및 G 단백질 변이체 (예를 들어, 천연 발생적 변이체)를 나타낸다.
핵산 또는 폴리펩티드 (예를 들어, RSV F 또는 G 단백질 핵산 또는 폴리펩티드, 또는 PreF 핵산 또는 폴리펩티드)를 지칭하는 경우의 "변이체"는 기준 핵산 또는 폴리펩티드와 상이한 핵산 또는 폴리펩티드이다. 통상적으로, 변이체 핵산 또는 폴리펩티드와 기준 핵산 또는 폴리펩티드 간의 차이(들)는 지시 대상물과 비교하여 비례적으로 소수의 차이를 차지하고 있다.
폴리펩티드 또는 단백질의 "도메인"은 이러한 폴리펩티드 또는 단백질 내에 구조적으로 규정된 요소이다. 예를 들어, "삼량체화 도메인"은 폴리펩티드를 삼량체로 어셈블링하는 것을 증진시켜 주는 폴리펩티드 내의 아미노산 서열이다. 예를 들어, 삼량체화 도메인은 기타 삼량체화 도메인 (동일하거나 상이한 아미노산 서열을 수반한 부가의 폴리펩티드의 삼량체화 도메인)과의 연합을 통하여 삼량체로 어셈블링되는 것을 증진시킬 수 있다. 상기 용어는 또한, 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "천연" 및 "천연 발생적"은 자연계에서와 동일한 상태로 존재하는 요소, 예를 들어 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 즉, 상기 요소는 인공적으로 변형되지 않았다. 본 발명의 맥락에서, 예를 들어 상이한 천연 발생적 균주 또는 RSV의 단리물로부터 수득된, RSV 단백질 또는 폴리펩티드의 수 많은 천연/천연 발생적 변이체가 있다.
용어 "폴리펩티드"는 단량체가 아미드 결합을 통하여 함께 연결되는 아미노산 잔기인 중합체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 모든 아미노산 서열을 포괄하고, 이는 당단백질과 같이 변형된 서열을 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 구체적으로, 천연 발생적 단백질 뿐만 아니라 재조합적 또는 합성적으로 생성되는 단백질을 포괄한다. 폴리펩티드를 기준으로 한 용어 "단편"은 폴리펩티드의 일부 (즉, 아서열)를 지칭한다. 용어 "면역원성 단편"은 완전한 길이의 기준 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 주요 면역원성 에피토프를 보유하고 있는 폴리펩티드의 모든 단편을 지칭한다. 폴리펩티드 내에서의 배향은 일반적으로, 개개 아미노산의 아미노 부분과 카복시 부분의 배향으로써 규정된, N-말단에서 C-말단 방향으로 인용된다. 폴리펩티드는 N 또는 아미노 말단에서부터 C 또는 카복시 말단을 향해 해독된다.
"신호 펩티드"는 새로이 합성된 분비성 또는 막 단백질이, 예를 들어 내형질 세망의 막을 향하고 막을 통과하도록 지시하는 짧은 아미노산 서열 (예를 들어, 길이가 대략 18 내지 25개 아미노산이다)이다. 신호 펩티드는 폴리펩티드의 N-말단에 자주 위치하긴 하지만, 어디에서나 위치하는 것은 아니고, 해당 단백질이 막을 가로질러 간 후에는 신호 펩티다제에 의해 자주 절단 제거된다. 신호 서열은 전형적으로, 3가지 공통의 구조적 특징을 함유하고 있다: N-말단 극성 염기성 영역 (n-영역), 소수성 코어 및 친수성 c-영역.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 서열"은 길이가 10개 이상 염기인 뉴클레오티드의 중합체성 형태를 지칭한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 어느 한 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 용어에는 단일 및 이중 형태의 DNA가 포함된다. "단리된 폴리뉴클레오티드"란 그것이 유래되는 유기체의 천연 발생적 게놈에서 즉시 연속되는 양 암호화 서열 (하나는 5' 말단 상에 있고, 다른 하나는 3' 말단 상에 있다)과 즉시 연속되지는 않는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 한 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 암호화한다. 핵산의 5' 및 3' 방향은 개개의 뉴클레오티드 단위의 연결성을 기준으로 하여 규정되고, 데옥시리보스 (또는 리보스) 당 환의 탄소 위치에 따라서 지정된다. 폴리뉴클레오티드 서열의 정보를 제공하는 (암호화) 내용물은 5'에서 3' 방향으로 판독한다.
"재조합" 핵산은 천연 발생적이 아닌 서열을 갖거나 또는 2개의 분리된 서열 절편의 인공적 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는 것이다. 이러한 인공적 조합은 화학적 합성에 의해, 또는 보다 통상적으로는 단리된 핵산 절편을, 예를 들어 유전 공학적 처리 기술에 의해 인공적으로 조작함으로써 달성할 수 있다. "재조합" 단백질은 숙주 세포, 예를 들어 세균성 또는 진핵성 세포 내로 도입시킨 이종 (예를 들어, 재조합) 핵산에 의해 암호화되는 것이다. 핵산은 도입된 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현할 수 있는 신호를 갖는 발현 벡터 상에 도입될 수 있거나, 또는 핵산을 숙수 세포 염색체 내로 통합시킬 수 있다.
핵산, 폴리펩티드 또는 또 다른 세포성 성분과 관련된 용어 "이종"은 이러한 성분이 자연계에서는 정상적으로 발견되지 않는 경우에 발생되고/되거나 이것이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된다는 것을 표시한다.
(예를 들어, 병원체 또는 병원체 함유 조성물과 관련한) 용어 "정제"는 그의 존재가 바람직하지 않는 성분을 조성물로부터 제거하는 공정을 지칭한다. 정제는 상대적 용어이고, 바람직하지 못한 모든 미량의 성분이 조성물로부터 제거되어야 한다는 것을 요구하지는 않는다. 백신 생성 맥락에서, 정제에는 원심분리, 투석, 이온-교환 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피, 친화 정제 또는 침전과 같은 공정이 포함된다. 따라서, 용어 "정제된"은 절대 순도를 요구하지 않고, 이는 오히려 상대적 용어로서 간주된다. 따라서, 예를 들어 정제된 핵산 제제는 명시된 단백질이 그의 생성적 환경 하에 있는 (예를 들어, 세포 또는 생화학적 반응 챔버 내에 있는) 핵산 보다 더 증강되는 제제이다. 실질적으로 순수한 핵산 또는 단백질 제제는 목적하는 핵산이 해당 제제의 총 핵산 함량의 50% 이상을 나타내도록 정제할 수 있다. 특정 양태에서, 실질적으로 순수한 핵산은 제제의 총 핵산 또는 단백질 함량의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상을 나타낼 것이다.
"단리된" 생물학적 성분 (예를 들어, 핵산 분자, 단백질 또는 세포 소기관)은 기타 생물학적 성분, 예를 들어 기타 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질 및 세포 소기관이 천연상 발생되는 유기체 세포에서 상기 기타 생물학적 성분로부터 실질적으로 분리시키거나 정제 제거하였다. "단리"시킨 핵산 및 단백질에는 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질이 포함된다. 상기 용어에는 또한, 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 및 단백질이 포괄된다.
"항원"은 동물에게서 항체 생성 및/또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질인데, 이에는 동물 내로 주사되거나, 흡수되거나 또는 도입되는 조성물이 포함된다. 용어 "항원"에는 관련된 모든 항원성 에피토프가 포함된다. 용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. "우성 항원성 에피토프" 또는 "우성 에피토프"는 기능적으로 유의적인 숙주 면역 반응, 예를 들어 항체 반응 또는 T-세포 반응이 만들어지는 에피토프이다. 따라서, 병원체에 대한 보호성 면역 반응과 관련하여, 우성 항원성 에피토프는 숙주 면역계에 의해 인식된 경우에 병원체에 의해 유발된 질병으로부터의 보호를 가져다 주는 항원성 부분이다. 용어 "T-세포 에피토프"는 적당한 MHC 분자와 결합된 경우에 T 세포에 의해 특이적으로 결합되는 (T 세포 수용체를 통하여 이루어짐) 에피토프를 지칭한다. "B-세포 에피토프"는 항체 (또는 B 세포 수용체 분자)에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프이다.
"아주반트"는 비특이적 방식으로 면역 반응 생성을 증강시키는 작용제이다. 통상의 아주반트에는 그 위로 항원이 흡착되는 무기질 (백반, 수산화알루미늄, 인산알루미늄) 현탁물; 에멀션, 예를 들어 유중수, 및 수중유 (및 그의 변이체, 예를 들면 이중 에멀션 및 가역성 에멀션), 지질당류, 지질다당류, 면역자극성 핵산 (예: CpG 올리고뉴클레오티드), 리포솜, 톨 (Toll)-유사 수용체 작동제 (특히, TLR2, TLR4, TLR7/8 및 TLR9 작동제), 및 상기 성분의 각종 조합물이 포함된다.
"면역원성 조성물"은, 예를 들어 병원체 (예: RSV)에 대하여 특이적 면역 반응을 유도시킬 수 있는, 인간 또는 동물 대상체 (예를 들어, 실험적 상황 하의 상기 대상체)에게 투여하기에 적합한 조성물이다. 따라서, 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원 (예를 들어, 폴리펩티드 항원) 또는 항원성 에피토프를 포함한다. 면역원성 조성물은 면역 반응을 유도 또는 증강시킬 수 있는 한 가지 이상의 부가 성분, 예를 들어 부형제, 담체 및/또는 아주반트를 포함할 수도 있다. 특정의 경우에, 면역원성 조성물는 병원체에 의해 유도된 증상이나 질병으로부터 대상체를 보호시켜 주는 면역 반응을 유도시키기 위해 투여한다. 몇몇 경우에, 병원체에 의해 유발된 증상이나 질병은 대상체를 병원체 (예: RSV)에 노출시킨 후, 이러한 병원체의 복제를 억제시킴으로써 예방시킨다 (또는 저하시키거나 회복시킨다). 본 발명의 맥락에서, 용어 면역원성 조성물은 RSV에 대하여 보호성 또는 고통완화성 면역 반응을 유도시킬 목적으로 대상체 또는 대상체 집단에게 투여하도록 의도된 조성물 (즉, 백신 조성물 또는 백신)을 포괄하는 것으로 이해해야할 것이다.
"면역 반응"은 자극에 대한 면역계 세포, 예를 들어 B 세포, T 세포, 또는 단구의 반응이다. 면역 반응은 특이적 항체, 예를 들어 항원 특이적 중화 항체의 생성을 가져다 주는 B 세포 반응일 수 있다. 면역 반응은 T 세포 반응, 예를 들어 CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응일 수도 있다. 몇몇 경우에, 상기 반응은 특별한 항원에 대해 특이적이다 (즉, "항원 특이적 반응"). 항원이 병원체로부터 유래되는 경우에는, 항원 특이적 반응이 "병원체 특이적 반응"이다. "보호성 면역 반응"은 병원체의 해로운 기능이나 활성을 억제시키거나, 병원체에 의한 감염을 저하시키거나, 또는 병원체에 의한 감염으로부터 비롯되는 증상 (사망 포함)을 감소시켜 주는 면역 반응이다. 보호성 면역 반응은, 예를 들어 플라크 감소 검정 또는 ELISA-중화 검정에서 바이러스성 복제 또는 플라크 형성을 억제시키거나 또는 생체 내에서 병원체 시험감염에 대한 내성을 측정함으로써 측정할 수 있다.
"Th1" 편향된 면역 반응은 IL-2 및 IFN-γ를 생성시키는 CD4+ T 조력 세포의 존재를 특징으로 하므로, IL-2 및 IFN-γ의 분비 또는 존재를 특징으로 한다. 이와는 달리, "Th2" 편향된 면역 반응은 IL-4, IL-5 및 IL-13을 생성시키는 CD4+ 조력 세포의 수적 우세를 특징으로 한다.
"면역학적 유효량"은 조성물 (전형적으로, 면역원성 조성물)에 대한 또는 조성물 중의 항원에 대한 면역 반응을 대상체에게서 유도시키기 위해 사용되는 상기 조성물의 양이다. 통상적으로, 목적하는 결과는 대상체를 병원체에 대하여 보호시킬 수 있거나 보호시키는 데 기여하는 항원 (예: 병원체)-특이적 면역 반응을 생성시키는 것이다. 그러나, 병원체에 대하여 보호성 면역 반응을 수득하기 위해서는, 면역원성 조성물을 수 차례 투여하는 것이 요구될 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 용어 면역학적 유효량은 기존의 투여 또는 후속 투여와 조합하여 보호성 면역 반응을 획득하는 데 기여하는 분할 용량을 포괄한다.
형용사 "제약상 허용 가능한"은 지시 대상물이 대상체 (예: 인간 또는 동물 대상체)에게 투여하는 데 적합하다는 것을 표시한다. 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]에는 면역원성 조성물을 포함한 치료적 및/또는 예방적 조성물의 제약 전달을 위해 적합한 조성물 및 제형 (희석제 포함)이 기재되어 있다.
면역 반응과 같은 반응을 참고로 한 용어 "조정하다"는 상기 반응의 개시, 크기, 기간 또는 특징을 변경시키거나 다양하게 하는 것을 의미한다. 면역 반응을 조정하는 작용제는 그의 투여 후 면역 반응의 개시, 크기, 기간 또는 특징 중의 한 가지 이상을 변경시키거나, 또는 기준 작용제와 비교해서 상기 반응의 개시, 크기, 기간 또는 특징 중의 한 가지 이상을 변경시킨다.
용어 "저하시키는" 것은 상대적 용어이므로, 특정 반응이나 질병이 작용제의 투여 후에 정량적으로 감소되는 경우, 또는 특정 반응이나 질병이 기준 작용제와 비교해서 해당 작용제의 투여 후에 감소되는 경우에, 이러한 작용제는 상기 반응이나 질병을 저하시킨다. 유사하게, 용어 "예방시키는" 것은 상기 반응이나 질병의 한 가지 이상의 특징을 제거시키는 한은, 작용제가 이러한 반응이나 질병을 완전히 없애는 것을 반드시 의미하는 것은 아니다. 따라서, 감염이나 반응, 예를 들어 병리학적 반응 (예: 백신 증강된 바이러스성 질병)을 저하시키거나 예방시켜 주는 면역원성 조성물은 이러한 감염이나 반응이 측정 가능한 수준으로 감소되는 한은, 예를 들어 상기 작용제의 부재 하에서 또는 기준 작용제와 비교해서, 감염이나 반응의 약 50% 이상, 예를 들어 약 70% 이상, 또는 약 80%, 또는 심지어 약 90% (즉, 10% 이하까지) 정도로 감소되는 한은, 상기 감염이나 반응을 완전히 없앨 수는 있지만, 반드시 그렇치는 않다.
"대상체"는 살아 있는 다세포 척추동물 유기체이다. 본 발명의 맥락에서, 대상체는 실험용 대상체, 예를 들어 비-인간 동물, 예를 들면 마우스, 코튼 랫트 (cotton rat), 또는 비-인간 영장류일 수 있다. 또 다른 한편으론, 대상체가 인간 대상체일 수 있다.
PreF 항원
천연상, RSV F 단백질은 F0로 명명된, 길이가 574개 아미노산인 단일 폴리펩티드 전구체로서 발현된다. 생체 내에서, F0는 내형질 세망에서 올리고머화되고, 2개의 디설파이드 연결된 단편으로 이루어진 올리고머를 생성하기 위해 2개의 보존된 푸린 컨센서스 서열 (푸린 절단 부위), 즉 RARR109 (서열 15) 및 RKRR136 (서열 16)에서 푸린 프로테아제에 의해 단백질 분해적으로 프로세싱된다. 보다 작은 이들 단편은 F2로 명명되고, 이는 F0 전구체의 N-말단 부분으로부터 유래된다. 약어 F0, F1 및 F2는 과학 문헌에 흔히 F0, F1 및 F2로 명명된다는 것을 당업자는 인식할 것이다. 보다 큰 C-말단 F1 단편은 24개 아미노산 세포질성 미부에 인접해 있는 소수성 아미노산 서열을 통하여 막 내에 F 단백질을 정착시킨다. 3개의 F2-F1 이량체가 연합하여 성숙한 F 단백질을 형성하는데, 이는 표적 세포 막과의 접촉시 입체형태적 변화를 진행하기 위해 촉발되는 준안정 전용해성 ("융합전") 입체형태를 채택하고 있다. 이러한 입체형태적 변화는 융합 펩티드로서 알려진 소수성 서열을 노출시켜, 이를 숙주 세포 막과 연합시키고 바이러스 또는 감염된 세포의 막과 표적 세포 막과의 융합을 증진시켜 준다.
F1 단편은 HRA 및 HRB로 명명되고 융합 단백질과 막 관통 정착 도메인 각각과 인접하여 위치해 있는, 2개 이상의 헵태드 (heptad) 반복 도메인을 함유한다. 융합전 입체형태에서는, F2-F1 이량체가 구상 두부와 줄기 구조를 형성하는데, 여기서는 HRA 도메인이 구상 두부 내에 절편화 (연장된) 입체형태로 존재한다. 이와는 달리, HRB 도메인은 두부 영역으로부터 연장되는 3-가닥 코일드 코일 줄기를 형성한다. 융합전 입체형태에서부터 융합후 입체형태로 전이되는 동안, HRA 도메인은 붕괴되고, HRB 도메인과 인접하게 되어 항-평행 6 나선 다발을 형성한다. 융합후 상태에서는, 융합 펩티드와 막관통 도메인이 병렬되어 막 융합을 촉진시킨다.
상기 제공된 입체형태적 설명이 결정학적 데이터의 분자성 모델링에 기초하긴 하지만, 융합전 입체형태와 융합후 입체형태 간의 구조적 차이는 결정학에 의지하지 않고서도 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 전자 현미경사진을 이용하여 융합전 입체형태와 융합후 입체형태 (또 다른 한편으론, 전용해성 입체형태와 용해성 입체형태로 명명됨) 사이를 구별할 수 있는데, 이는 그의 기술적 교시 목적으로 본원에 참고로 도입되는 다음 문헌에 의해 입증된 바와 같다 [참고: Calder et al., Virology, 271:122-131 (2000) 및 Morton et al., Virology, 311 :275-288]. 융합전 입체형태는 또한, 그의 기술적 교시 목적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌 [참고: Connolly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:17903-17908 (2006)]에 의해 기재된 바와 같은 리포솜 연합 검정에 의해 용해성 (융합후) 입체형태와 구별될 수 있다. 부가적으로, 융합전 및 용해성 입체형태는 융합전 또는 용해성 형태의 RSV F 단백질 중의 하나 또는 다른 하나 상에 존재하지만, 기타 형태 상에는 존재하지 않는 입체형태 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체 (예: 모노클로날 항체)를 이용하여 구별할 수 있다. 이러한 입체형태 에피토프는 항원 결정기가 해당 분자의 표면 상에 우선적으로 노출되는 것에 기인할 수 있다. 또 다른 한편, 입체형태적 에피토프는 선형 폴리펩티드에서 인접하지 않는 아미노산의 병렬로부터 비롯될 수 있다.
본원에 기재된 PreF 항원은 RSV F 단백질의 융합전 입체형태를 안정화 및 유지시켜, 발현된 단백질 집단 내에서, 이러한 발현된 단백질 집단의 상당 부분이 전용해성(융합전) 입체형태가 되도록 (예를 들어, 구조적 및/또는 열역학적 모델링에 의해 예측되는 바와 같거나, 또는 상기 언급된 방법들 중의 한 가지 이상에 의해 평가된 바와 같다) 설계한다. 안정화 변형을 천연 (또는 합성) F 단백질, 예를 들어 서열 2의 예시 F 단백질 내로 도입하여, PreF 항원을 세포내 또는 세포외 환경 내로 도입한 후에 (예를 들어, 대상체에게 투여한 후, 생체 내에서), F 단백질의 융합전 입체형태의 주요 면역원성 에피토프가 유지되도록 한다.
첫 번째, 이종 안정화 도메인을 구조물의 C-말단에 놓아두어 F0 폴리펩티드의 막 정착 도메인을 대체시킬 수 있다. 이러한 안정화 도메인은 HRB 불안정성을 상쇄시켜 주어 융합전 이형태체 (conformer)를 안정화시키는 데 도움을 주는 것으로 예측된다. 예시 양태에서, 이종 안정화 도메인은 단백질 다량체화 도메인이다. 이러한 단백질 다량체화 도메인의 한 가지 특별히 바람직한 예는 삼량체화 도메인이다. 예시되는 삼량체화 도메인은 코일드-코일 도메인을 갖는 다중 폴리펩티드의 삼량체로의 어셈블링을 증진시켜 주는 상기 코일드-코일 내로 폴딩된다. 삼량체화 도메인의 한 가지 바람직한 예는 이소루이신 지퍼이다. 예시되는 이소루이신 지퍼 도메인은 문헌 [참고: Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993)]에 기재된 공학 처리시킨 효모 GCN4 이소루이신 변이체이다. 한 가지 적합한 이소루이신 지퍼 도메인의 서열이 서열 11로써 제시되긴 하지만, 코일드-코일 안정화 도메인을 형성할 수 있는 능력을 보유하고 있는 상기 서열의 변이체가 동등하게 적합하다. 또 다른 안정화 코일드-코일 삼량체화 도메인에는 TRAF2 (GENBANK® 승인 번호 Q12933 [gi:23503103]; 아미노산 299-348); 트롬보스폰딘 (Thrombospondin) 1 (승인 번호 PO7996 [gi:135717]; 아미노산 291-314); 마트릴린 (Matrilin)-4 (승인 번호 O95460 [gi: 14548117]; 아미노산 594-618); CMP (마트릴린-1) (승인 번호 NP_002370 [gi:4505111]; 아미노산 463-496); HSF1 (승인 번호 AAX42211 [gi:61362386]; 아미노산 165-191); 및 쿠빌린 (Cubilin) (승인 번호 NP_001072 [gi:4557503]; 아미노산 104-138)이 포함된다. 적합한 삼량체화 도메인은 발현된 단백질의 상당 부분을 삼량체로 어셈블링시켜 주는 것으로 예상된다. 예를 들어, 삼량체화 도메인을 갖는 재조합 PreF 폴리펩티드의 50% 이상이 삼량체로 어셈블링될 것이다 (예를 들어, AFF-MALS에 의해 평가한 바와 같음). 전형적으로, 발현된 폴리펩티드의 60% 이상, 보다 바람직하게 70% 이상, 가장 바람직하게 약 75% 이상이 삼량체로서 존재한다.
HRB를 훨씬 더 안정화시키기 위해서는, PreF의 위치 512 (천연 F0 단백질을 기준으로 함)에 위치한 루이신 잔기를 리신으로 치환시킬 수 있다 (예시되는 서열 6의 PreF 항원 폴리펩티드의 L482K). 이러한 치환으로 인해, 코일드 코일 소수성 잔기 주기성이 개선된다. 유사하게, 리신을 위치 105에 있는 아미노산 다음에 가할 수 있다.
두 번째, pep27을 제거할 수 있다. 융합전 상태의 RSV F 단백질의 구조적 모델을 분석한 결과는, pep27이 F1과 F2 사이에 제한되지 않은 대형 루프를 창출시킨다고 제안하고 있다. 이러한 루프는 융합전 상태의 안정화에 기여하지 않으므로, 푸린에 의해 천연 단백질의 절단 후에 제거시킨다.
세 번째, 푸린 절단 모티프 중의 하나 또는 둘 다를 결실시킬 수 있다. 이러한 설계를 이용하므로, 융합 단백질은 F2로부터 절단되지 않아 융합전 이형태체의 구상 두부로부터 방출되지 못하게 되고 근처 막에 대한 접근 가능성도 방지된다. 융합 단백질과 막 계면 간의 상호 작용은 융합전 상태 불안정성에 있어서 중요한 논쟁이 되는 것으로 예측된다. 융합 공정 동안, 융합 펩티드와 표적 막 간의 상호 작용으로 인해, 구상 두부 구조 내로부터 융합 펩티드가 노출되어, 융합전 상태의 불안정성과 융합후 이형태체로의 폴딩이 증강된다. 이러한 입체형태 상의 변화로 인해 막 융합 공정이 가능해 진다. 푸린 절단 부위 중의 하나 또는 둘 다를 제거하면, 막이 융합 펩티드의 N-말단 부로 접근되는 것이 방지되므로, 융합전 상태를 안정화시키는 것으로 예측된다.
임의로, 하나 이상의 비-푸린 절단 부위는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산을 치환시킴으로써 제거할 수도 있다. 예를 들어, 실험을 이용한 명맥한 증거는 특정 메탈로프로테이나제에 의한 절단에 도움이 되는 조건 하에, PreF 항원을 아미노산 110-118 부근에서 절단시킬 수 있다고 제안하고 있다 (예를 들어, 절단은 PreF 항원의 아미노산 112와 113 사이; 서열 2의 기준 F 단백질 폴리펩티드의 위치 142에서의 루이신과 위치 143에서의 글리신 사이에서 일어난다). 따라서, 이러한 영역 내의 하나 이상의 아미노산의 변형은 PreF 항원의 절단을 저하시킬 수 있다. 예를 들어, 위치 112에서의 루이신을 상이한 아미노산, 예를 들어 이소루이신 또는 트립토판으로 치환시킬 수 있다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 위치 113에서의 글리신을 세린 또는 알라닌으로 치환시킬 수 있다.
천연 F 단백질 폴리펩티드는 RSV A 또는 RSV B 균주의 모든 F 단백질, 또는 그의 변이체 (상기 정의된 바와 같음) 중에서 선택될 수 있다. 특정의 예시 양태에서, F 단백질 폴리펩티드는 서열 2로써 제시된 F 단백질이다. 이러한 발명의 이해를 촉진시키기 위해, 균주에 상관없이 모든 아미노산 잔기 위치가 예시되는 F 단백질의 아미노산 위치를 기준으로 하여 제시된다 (즉, 아미노산 잔기 위치는 예시되는 F 단백질의 아미노산 위치에 상응한다). 기타 모든 RSV A 또는 B 균주의 필적하는 아미노산 위치는, 용이하게 입수 가능하고 널리 공지된 정렬 알고리즘 (예를 들어, 디폴트 파라미터를 이용하는 BLAST)을 사용하여, 선택된 RSV 균주의 아미노산 서열을 예시 서열과 정렬시킴으로써 당업자에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 상이한 RSV 균주로부터의 F 단백질 폴리펩티드의 수 많은 부가 예가 WO2008114149에 기재되어 있다 (이는 RSV F 및 G 단백질 서열의 부가 예를 제공할 목적으로 본원에 참고로 도입된다). 부가의 변이체는 유전적 부동을 통하여 생성될 수 있거나, 또는 부위 지시된 또는 무작위 돌연변이 유발을 이용하거나 또는 기존의 둘 이상의 변이체를 재조합함으로써 인공적으로 생성될 수 있다. 이러한 부가의 변이체는 또한, 본원에 기재된 PreF (및 PreF-G) 항원 맥락에서 적합하다.
F 단백질의 F2 및 F1 도메인을 선택하는 데에 있어서, 당업자는 이에 전체 F2 및/또는 F1 도메인이 반드시 포함될 필요는 없다는 것을 인식할 것이다. 전형적으로, F2 도메인의 아서열 (또는 단편)을 선택하는 경우에는 입체형태를 고려하는 것이 중요하다. 따라서, F2 도메인은 전형적으로, 해당 폴리펩티드의 어셈블리와 안정성을 촉진시켜 주는 F2 도메인의 일부를 포함한다. 특정의 예시 변이체에서, F2 도메인은 아미노산 26-105를 포함한다. 그러나, 길이에 있어 약간의 변형을 수반한 변이체 (이는 1개 이상의 아미노산을 부가하거나 결실시킴으로써 이루어진다)가 또한 가능하다.
전형적으로, F 단백질의 면역우성 에피토프를 포함하는 안정한 입체형태를 유지시켜 주도록 F1 도메인의 적어도 아서열 (또는 단편)을 선택 및 설계한다. 예를 들어, 아미노산 262-275 [팔리비주마브 (palivizumab) 중화] 및 423-436 (Centocor's ch101F MAb)의 영역 내의 중화 항체에 의해 인식된 에피토프를 포함하는 F1 폴리펩티드 도메인의 아서열을 선택하는 것이 일반적으로 바람직하다. 부가적으로, 예를 들어 아미노산 328-355의 영역 내에 T 세포 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 가장 통상적으로는, 에피토프를 제외한 F1 소단위체의 단일 연속 부분으로서 (예를 들어, 아미노산 262 내지 436에 걸쳐 있다), 안정한 입체형태로 어셈블링된 불연속 요소로서 이들 면역우성 에피토프를 포함하는 합성 서열에 유지시킬 수 있었다. 따라서, F1 도메인 폴리펩티드는 RSV F 단백질 폴리펩티드의 적어도 약 아미노산 262-436을 포함한다. 본원에 제공된 한 가지 비-제한성 예에서, F1 도메인은 천연 F 단백질 폴리펩티드의 아미노산 137 내지 516을 포함한다. 당업자는 실행자의 재량으로 부가의 더 짧은 아서열을 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
F2 또는 F1 도메인의 아서열을 선택하는 경우에는 (또는 특정의 PreF-G 항원의 G 단백질 성분과 관련하여 다음에 논의되는 바와 같이), 입체형태적 고려 이외에도, 부가의 면역원성 에피토프의 봉입을 기준으로 하여 서열 (예: 변이체, 아서열 등)을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 정착 모티프, 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법, 예를 들어 중성 네트 또는 다명 측정 방법을 이용하여 부가의 T 세포 에피토프를 확인할 수 있다 [참고: 예를 들어, RANKPEP (www.mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html에서 입수 가능함); ProPredI (www.imtech.res.in/raghava/propredI/index.html에서 입수 가능함); Bimas (www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html에서 입수 가능함); 및 SYFPEITH (www.syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm에서 입수 가능함)]. 예를 들어, 펩티드의 "결합 역치"를 결정하고, MHC의 높은 확률 또는 특정 친화도의 항체 결합성을 제공해 주는 스코어를 지닌 것을 선별하기 위한 알고리즘을 사용한다. 이러한 알고리즘은 특별한 위치에서의 특별한 아미노산의 MHC 결합에 대한 효과, 특별한 위치에서의 특별한 아미노산의 항체 결합에 대한 효과, 또는 모티프 함유 에피토프에서 특별한 치환물의 결합에 대한 효과를 기준으로 한다. 면역원성 펩티드의 맥락 내에서, "보존된 잔기"는 펩티드 내의 특별한 위치에서의 무작위 분포로써 예상될 수 있는 것 보다 상당히 더 높은 빈도로 나타나는 것이다. 정착 잔기는 MHC 분자와의 접촉점을 제공하는 보존된 잔기이다. 이러한 예측 방법에 의해 확인된 T 세포 에피토프는 특이적 MHC 단백질에 대한 그의 결합도를 측정하고 MHC 단백질의 맥락에서 제시된 경우에 T 세포를 자극할 수 있는 그의 능력에 의해 확증할 수 있다.
바람직하게는, PreF 항원 (다음에 논의되는 바와 같은 PreF-G 항원 포함)은 발현 시스템에 상응하는 신호 펩티드, 예를 들어 포유류 또는 바이러스성 신호 펩티드, 예를 들면 RSV F0 천연 신호 서열 (예: 서열 2의 아미노산 1-25 또는 서열 6의 아미노산 1-25)을 포함한다. 전형적으로, 신호 펩티드는 재조합 발현을 위해 선택된 세포와 화합성이 되도록 선택한다. 예를 들어, 신호 펩티드 [예: 바쿨로바이러스 (baculovirus) 신호 펩티드, 또는 멜리틴 (melittin) 신호 펩티드]를 곤충 세포에서의 발현을 위해 대체시킬 수 있다. 식물 발현 시스템이 바람직한 경우에는, 이에 적합한 식물 신호 펩티드가 당해 분야에 공지되어 있다. 수 많은 예시 신호 펩티드가 당해 분야에 공지되어 있고 [참고: 예를 들어, Zhang & Henzel, Protein Sci., 13:2819-2824 (2004); 이에는 수 많은 인간 신호 펩티드가 기재되어 있다], 예를 들어 SPdb 신호 펩티드 데이터베이스에 목록으로 만들어져 있는데, 이에는 고세균, 원핵생물 및 진핵생물의 신호 서열이 포함된다 (http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/). 임의로는, 전술된 항원 모두가 정제를 촉진시키기 위한 부가의 서열 또는 태그, 예를 들어 His-태그를 포함할 수 있다.
임의로는, PreF 항원이 부가의 면역원성 성분을 포함할 수 있다. 특정의 특별히 바람직한 양태에서, PreF 항원은 RSV G 단백질 항원성 성분을 포함한다. PreF 및 G 성분을 갖는 것으로 예시되는 키메라 단백질은 다음 PreF_V1 (서열 7 및 8로써 나타냄) 및 PreF_V2 (서열 9 및 10으로써 나타냄)를 포함한다.
PreF-G 항원에서는, G 단백질의 항원성 부분 (예를 들어, 절단된 G 단백질, 예를 들면 아미노산 잔기 149-229)을 구조물의 C-말단에 가한다. 전형적으로, G 단백질 성분을 가요성 링커 서열을 통하여 F 단백질 성분에 연결시킨다. 예를 들어, 예시되는 PreF_V1 설계에서는 G 단백질을 -GGSGGSGGS- 링커 (서열 14)에 의해 PreF 성분에 연결시킨다. PreF_V2 설계에서는, 링커가 보다 짧다. -GGSGGSGGS- 링커 (서열 14)를 갖는 것 대신, PreF_V2는 링커용으로 2개의 글리신 (-GG-)을 갖는다.
존재하는 경우, G 단백질 폴리펩티드 도메인은 RSV A 또는 RSV B 균주 중에서 선택된 G 단백질의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 특정의 예시 양태에서, G 단백질은 서열 4로써 나타낸 G 단백질이거나 이러한 G 단백질과 95% 동일하다. 적합한 G 단백질 서열의 부가 예가 WO2008114149 (이는 본원에 참고로 도입된다)에서 발견될 수 있다.
G 단백질 폴리펩티드 성분은, 예를 들어 아미노산 183-197의 영역 내에 면역우성 T 세포 에피토프(들)를 보유하고 있는 G 단백질의 적어도 아서열 (또는 단편), 예를 들어 천연 G 단백질의 아미노산 151-229, 149-229 또는 128-229를 포함하는 G 단백질의 단편을 포함하도록 선택된다. 한 가지 예시 양태에서, G 단백질 폴리펩티드는 천연 G 단백질 폴리펩티드의 아미노산 잔기 149 내지 229의 전부 또는 일부를 포함하는 천연 G 단백질 폴리펩티드의 아서열 (또는 단편)이다. 당업자는 보다 길거나 보다 짧은 부분의 G 단백질을 사용할 수도 있다는 것을 용이하게 인지할 것인데, 단 이와 같이 선택된 부분은 입체형태적으로 탈안정화되지 않거나 또는 PreF-G 항원의 발현, 폴딩 또는 프로세싱을 분열시키지 않아야 한다. 임의로, G 단백질 도메인은 기존에 포르말린 불활성화 RSV 백신과 연관된 호산구증을 특징으로 하는 증강된 질병을 저하시키고/시키거나 예방하는 데에 관여하는 것으로 밝혀진 위치 191에서의 아미노산 치환을 포함한다. 천연 발생적 및 치환된 (N191A) G 단백질의 특징에 관한 철저한 설명은, 예를 들어 미국 특허공개공보 제2005/0042230호 (본원에 참고로 도입된다)에서 발견할 수 있다.
예를 들어, 천연 발생적 균주에 상응하는 서열 선택과 관련하여, 하나 이상의 도메인은 서열 면에서 RSV A 또는 B 균주, 예를 들어 A2 또는 Long로 명명된 통상의 실험실 단리물, 또는 기타 모든 천연 발생적 균주 또는 단리물 (전술된 WO2008114149에 기재된 바와 같음)에 상응할 수 있다. 이러한 천연 발생적 및 단리된 변이체 이외에도, 전술된 서열과 서열 유사성을 공유하고 있는 공학 처리시킨 변이체를 PreF (PreF-G 포함) 항원의 맥락에서 이용할 수도 있다. 당업자는 폴리펩티드 (및 일반적으로 뉴클레오티드 서열)에 관한 한은, PreF 항원 폴리펩티드 (및 다음에 기재되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열) 간의 유사성을 서열들 간의 유사성 측면에서 표현할 수 있는데, 달리 서열 동일성으로 지칭되기도 한다. 서열 동일성은 종종 동일률 (또는 유사율)로 측정되는데, 이러한 동일률이 보다 높을 수록 이들 두 서열의 일차 구조는 더 유사하다. 일반적으로, 두 아미노산 (또는 폴리뉴클레오티드) 서열의 일차 구조가 더 유사할 수록, 폴딩 및 어셈블링으로부터 생성되는 보다 고차수 구조가 보다 유사하다. PreF 폴리펩티드 (및 폴리뉴클레오티드) 서열의 변이체는 전형적으로, 1개 또는 소수의 아미노산 결실, 부가 또는 치환을 가질 것이지만, 그럼에도 불구하고 극히 높은 비율의 그의 아미노산, 및 일반적으로 그의 폴리뉴클레오티드 서열을 공유할 것이다. 보다 중요하게는, 상기 변이체가 본원에 기재된 기준 서열의 구조적 특징과, 이에 따른 입체형태적 특징을 보유하고 있다.
서열 동일율을 결정하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, PreF 항원 폴리펩티드 뿐만 아니라 이를 암호화하는 핵산에도 적용 가능하다 (예를 들어, 다음에 기재된 바와 같다). 각종 프로그램 및 정렬 알고리즘이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988; 및 Pearson and Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994; 이에는 서열 정렬 방법과 상동율 계산법이 상세히 고려되어 있다]. NCBI 기본 국소 정렬 조사 도구 (BLAST) [참고: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990]는 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx과 연계해서 사용하기 위한 몇 가지 공급원 [the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) 및 인터넷 포함]으로부터 입수 가능하다. 이러한 프로그램을 이용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 관한 설명은 인터넷 상의 NCBI 웹사이트에서 입수 가능하다.
몇몇 경우에, PreF 항원은 이것이 유래되는 천연 발생적 균주의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형 (예를 들어, 전술된 안정화 변형 이외의 변형)을 갖고 있다. 이러한 차이는 1개 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환일 수 있다. 변이체는 전형적으로, 아미노산 잔기의 약 1%, 2%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하가 상이하다. 예를 들어, 변이체 PreF 항원 (PreF-G 포함) 폴리펩티드 서열은 서열 6, 8 및/또는 10의 예시 PreF 항원 폴리펩티드 서열과 비교해서 1개, 또는 2개, 또는 5개 이하, 또는 약 10개 이하, 또는 약 15개 이하, 또는 약 50개 이하, 또는 약 100개 이하의 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 따라서, RSV F 또는 G 단백질, 또는 PreF 항원 (PreF-G 항원 포함)의 맥락에서 변이체는 전형적으로, 기준 단백질, 예를 들어 서열 2, 4, 6, 8 및/또는 10에 예시된 기준 서열 또는 본원에 기재된 예시되는 모든 PreF 항원과의 서열 동일성이 80% 또는 85% 이상, 보다 통상적으로 약 90% 이상, 예를 들어 95% 이상, 또는 심지어 98% 또는 99%이다. 본 발명의 특징으로서 포함된 부가의 변이체는 WO2008114149에 기재된 천연 발생적 변이체 중에서 선택된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 PreF 항원 (PreF-G 항원 포함)이다. 부가의 변이체는 유전적 부동을 통하여 생성될 수 있거나, 또는 부위 지시된 또는 무작위 돌연변이 유발을 이용하거나 또는 기존의 둘 이상의 변이체를 재조합함으로써 인공적으로 생성될 수 있다. 이러한 부가의 변이체는 또한, 본원에 기재된 PreF (및 PreF-G) 항원 맥락에서 적합하다. 예를 들어, 변형은 생성되는 PreF 항원의 입체형태 또는 면역원성 에피토프를 변경시키지 않는 1개 이상 아미노산 (예를 들어, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 약 10개 이하 아미노산 등)의 치환일 수 있다.
또 다른 한편 또는 부가적으로, 변형에는 1개 이상의 아미노산의 결실 및/또는 1개 이상의 아미노산의 부가가 포함될 수 있다. 실제로, 경우에 따라 하나 이상의 폴리펩티드 도메인은 어떠한 단일 균주에서 상응하지 않지만, 다중 균주로부터의 성분 아서열, 또는 심지어 RSV 바이러스 폴리펩티드의 다중 균주를 정렬시킴으로써 추론된 컨센서스 서열로부터의 성분 아서열을 포함하는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 특정 양태에서, 하나 이상의 폴리펩티드 도메인은 태그를 구성하고 있고, 후속 프로세싱 또는 정제를 촉진시켜 주는 아미노산 서열을 부가함으로써 변형시킨다. 이러한 태그는 항원성 또는 에피토프 태그, 효소적 태그 또는 폴리히스티딘 태그일 수 있다. 전형적으로, 태그는 해당 단백질의 한 말단 또는 다른 말단, 예를 들어 항원 또는 융합 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 위치시킨다.
PreF 항원을 암호화하는 핵산
본 발명의 또 다른 국면은 상기 언급된 바와 같은 PreF 항원을 암호화하는 재조합 핵산에 관한 것이다. 특정 양태에서, 이러한 재조합 핵산은 선택된 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에서 발현시키기 위해 코돈 최적화시킨다. 예를 들어, 서열 5 및 12는 PreF 항원을 암호화하는 서열의 2가지 상이한 예시적, 비-제한적 예인데, 이는 포유류 세포, 예를 들어 CHO 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화시켰다. 복제 및 발현을 촉진시키기 위해, 핵산을 벡터, 예를 들어 원핵성 또는 진핵성 발현 벡터 내로 혼입시킬 수 있다. 재조합 PreF 항원-암호화 핵산을 포함하는 숙주 세포가 또한, 본 발명의 특징이다. 바람직한 숙주 세포에는 원핵성 (즉, 세균성) 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 뿐만 아니라 수 많은 진핵성 숙주 세포, 예를 들어 진균성 (예: 효모) 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포 (예: CHO, VERO 및 HEK293 세포)가 포함된다.
복제 및 발현을 촉진시키기 위해, 핵산을 벡터, 예를 들어 원핵성 또는 진핵성 발현 벡터 내로 혼입시킬 수 있다. 본원에 기재된 핵산이 각종 벡터 [이에는, 예를 들어 세균성 플라스미드; 파아지 (phage) DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파아지 DNA의 조합물로부터 유래된 벡터, 바이러스성 DNA, 예를 들어 백시니아, 아데노바이러스, 조류 폭스 바이러스, 슈도라비에스 (pseudorabies), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스 등이 포함된다] 중의 어느 하나에 포함될 수 있긴 하지만, 가장 통상적으로 벡터는 폴리펩티드 발현 생성물을 생성시키는 데 적합한 발현 벡터일 것이다. 발현 벡터에서는, PreF 항원을 암호화하는 핵산을 전형적으로, mRNA 합성을 지시하기에 적당한 전사 제어 서열 (프로모터 및 임의로, 하나 이상의 증강인자)에 근접하고 이러한 서열을 향한 배향으로 배열한다. 즉, 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열을 적당한 전사 제어 서열에 작동적으로 연결시킨다. 이러한 프로모터의 예에는 CMV의 즉발형 프로모터, LTR 또는 SV40 프로모터, 바쿨로바이러스의 폴리헤드린 프로모터, 이. 콜라이 lac 또는 trp 프로모터, 파아지 T7 및 람다 PL 프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그의 바이러스에서의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 기타 프로모터가 포함된다. 발현 벡터는 전형적으로 또한, 해독 개시를 위한 리보솜 결합 부위와 전사 종결인자를 함유한다. 이러한 벡터는 임의로, 발현을 증폭시키는 데 적당한 서열을 포함한다. 또한, 발현 벡터는 임의로, 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형별 특징, 예를 들어 진핵 세포 배양의 경우에는 디히드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성, 또는 이. 콜라이의 경우에는 카나마이신, 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성을 제공해 주는 하나 이상의 선별성 마커 유전자를 포함한다.
발현 벡터는 또한, 예를 들어 해독 효율을 개선시키기 위한 부가의 발현 요소를 포함할 수 있다. 이들 신호에는, 예를 들어 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열이 포함될 수 있다. 몇몇 경우에는, 예를 들어 해독 개시 코돈 및 관련 서열 요소를 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열 (예: 천연 출발 코돈)과 동시에 적당한 발현 벡터 내로 삽입한다. 이러한 경우에는, 부가의 해독 제어 신호가 요구되지 않는다. 그러나, 단지 폴리펩티드-암호화 서열 또는 그의 일부 만이 삽입된 경우에는, PreF 항원을 암호화하는 핵산의 해독을 위해, ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 해독 제어 신호를 제공한다. 이러한 개시 코돈은 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열의 해독을 보장하기 위해 정확한 판독 프레임 내에 놓아둔다. 외인성 전사 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 각종 기원일 수 있다. 경우에 따라서, 사용시 세포 시스템에 적당한 증강인자를 봉입시킴으로써 발현 효율을 추가로 증가시킬 수 있다 [참고: Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bitter et al. (1987) Methods in Enzymol 153:516-544].
몇몇 경우에, PreF 항원을 암호화하는 핵산 (예: 벡터)은 숙주 세포 내로 도입되는 경우에 PreF 암호화 핵산의 발현을 증가시키고/시키거나 최적화시키기 위해 선택된 하나 이상의 부가 서열 요소를 포함한다. 예를 들어, 특정 양태에서 PreF 항원을 암호화하는 핵산은 인트론 서열, 예를 들어 인간 헤르페스바이러스 (Herpesvirus) 5 인트론 서열 [예를 들어, 서열 13 참고]을 포함한다. 인트론은 재조합 구조물에 적당하게 위치시킨 경우에 동종 및 이종 핵산의 발현을 증강시키는 것으로 반복해서 입증되었다. 또 다른 부류의 발현 증강성 서열에는 후성적 요소, 예를 들어 매트릭스 부착 영역 (또는 MAR), 또는 유사한 후성적 요소, 예를 들어 STAR 요소 [예를 들면, 문헌 (참고: Otte et al., Biotechnol. Prog. 23:801-807, 2007)에 기재된 STAR 요소]가 포함된다. 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, MAR는 표적 DNA 서열이 핵 매트릭스에 정착하는 것을 매개하여, 이종-염색질 코어로부터 바깥으로 연장되는 염색질 루프 도메인이 생성되는 것으로 여겨진다. MAR이 명백한 어떠한 컨센서스 또는 인식 가능한 서열을 함유하고 있지 않지만, 그의 가장 일관된 특징은 전반적으로 A/T 함량이 높고, C 염기가 주로 1개 가닥 상에 존재하는 것으로 여겨진다. 이들 영역은 가닥 분리되기 쉬운 굽은 이차 구조를 형성하는 것으로 여겨지고, 가닥 분리를 위한 핵형성 지점으로서 제공될 수 있는 코어-풀림 요소 (CUE)를 포함할 수 있다. 몇 가지 간단한 AT-풍부 서열 모티프가 MAR 서열과 연관이 있어 왔는데, 예를 들면 A-박스, T-박스, DNA 풀림 모티프, SATB1 결합 부위 (H-박스, A/T/C25) 및 척추동물 또는 드로소필라 (Drosophila)에 대한 컨센서스 토포이소머라제 II 부위이다. 예시되는 MAR 서열이 미국 특허공개공보 제20070178469호, 및 국제특허출원 WO 02/074969 (본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다. PreF 항원을 암호화하는 핵산의 발현을 증강시키기 위해 사용될 수 있는 부가의 MAR 서열에는 문헌 [참고: Girod et al., Nature Methods, 4:747-753, 2007]에 기재된 치킨 리소자임 MAR, MARp1-42, MARp1-6, MARp1-68, 및 MARpx-29이 포함된다 (GenBank 승인 번호 EA423306, DI107030, DI106196, DI107561, 및 DI106512가 각각 기재되어 있다). 당업자는 MAR 1-9에 대해 보고된 바와 같이, 중간 수준의 증강을 생성시키는 MAR을 선택함으로써 발현을 추가로 조정할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 경우에 따라, PreF 항원의 발현을 증가시키기 위한 또 다른 MAR 서열은, 예를 들어 MAR-파인더 (Finder) (futuresoft.org/MarFinder 웹 상에서 입수 가능하다), SMARTest (genomatix.de 웹 상에서 입수 가능하다), 또는 SMARScan I [참고: Levitsky et al,, Bioinformatics 15:582-592, 1999]와 같은 소프트웨어를 이용하여 서열 데이터베이스를 조사함으로써 확인할 수 있다. 특정 양태에서는, MAR를 PreF 항원-암호화 서열로서 동일한 핵산 (예: 벡터) 상의 숙주 세포 내로 도입한다 (예를 들어, 형질감염시킨다). 대체 양태에서는, MAR을 별개의 핵산 상으로 도입하고 (예를 들어, 트랜스로), 이는 임의로, PreF 항원-암호화 폴리뉴클레오티드 서열과 공동-통합시킬 수 있다.
재조합 PreF 항원 핵산의 생성을 통하여 당업자를 안내하기에 충분한 예시 과정이 다음 문헌에서 발견될 수 있다 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (and Supplements to 2003); 및 Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999].
PreF 항원 폴리펩티드를 암호화하는 예시 핵산은 서열 5, 7, 9, 12 및 13으로써 나타낸다. 부가의 변이체는, 예를 들어 WO2008114149에 기재된 바와 같이, 기존에 밝혀진 (또는 후속 밝혀진) 모든 RSV 균주 중에서 선택된 유사한 F 및 G 단백질 폴리펩티드 서열을 어셈블링함으로써 생성시킬 수 있다. 상기 예시 변이체와 서열 동일성을 공유하고 있는 부가의 서열 변이체가 당업자에 의해 생성될 수 있다. 전형적으로, 핵산 변이체는 아미노산 잔기의 1%, 또는 2%, 또는 5%, 또는 10%, 또는 15%, 또는 20% 이하가 상이한 폴리펩티드를 암호화할 것이다. 즉, 암호화된 폴리펩티드는 80% 또는 85% 이상, 보다 통상적으로 약 90% 이상, 예를 들어 95% 이상, 또는 심지어 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타낸다. 당업자는 PreF 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 유전자 암호의 중복성으로 인해 덜한 서열 동일성을 공유할 수 있다는 것을 즉시 이해할 것이다. 몇몇 경우에, PreF 항원은 이것이 유래되는 천연 발생적 균주의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형 (예를 들어, 전술된 안정화 변형 이외의 변형)을 갖고 있다. 이러한 차이는 1개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 각각의 부가, 결실 또는 치환일 수 있다. 변이체는 전형적으로, 뉴클레오티드 잔기의 약 1%, 또는 2%, 또는 5%, 또는 10%, 또는 15%, 또는 20% 이하가 상이하다. 예를 들어, 변이체 PreF 항원 (PreF-G 포함) 핵산은 서열 5, 7, 9, 12 및/또는 13의 예시 PreF 항원 핵산과 비교해서 1개, 또는 2개, 또는 5개 이하, 또는 약 10개 이하, 또는 약 15개 이하, 또는 약 50개 이하, 또는 약 100개 이하의 뉴클레오티드 차이를 포함할 수 있다. 따라서, RSV F 또는 G 단백질, 또는 PreF 항원 (PreF-G 항원 포함) 핵산의 맥락에서 변이체는 전형적으로, 기준 서열, 예를 들어 서열 1, 3, 5, 7, 9, 12 및/또는 13에 예시된 기준 서열 또는 본원에 기재된 예시되는 기타 모든 PreF 항원 핵산과의 서열 동일성이 80% 또는 85% 이상, 보다 통상적으로 약 90% 이상, 예를 들어 95% 이상, 또는 심지어 98% 또는 99%이다. 본 발명의 특징으로서 포함된 부가의 변이체는 WO2008114149에 기재된 천연 발생적 변이체 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 PreF 항원 (PreF-G 항원 포함)이다. 부가의 변이체는 유전적 부동을 통하여 생성될 수 있거나, 또는 부위 지시된 또는 무작위 돌연변이 유발을 이용하거나 또는 기존의 둘 이상의 변이체를 재조합함으로써 인공적으로 생성될 수 있다. 이러한 부가의 변이체는 또한, 본원에 기재된 PreF (및 PreF-G) 항원 맥락에서 적합하다.
앞서 기재된 변이체 핵산 이외에도, 서열 1, 3, 5, 7, 9, 12 및 13으로써 나타낸 예시 핵산 중의 하나 이상과 혼성화되는 핵산을 또한 사용하여 PreF 항원을 암호화할 수 있다. 당업자는 상기 논의된 서열 동일성 (%) 측정치 이외에도, 두 핵산 간의 서열 유사성의 또 다른 지표가 혼성화할 수 있는 능력이라는 것을 인지할 것이다. 두 핵산의 서열이 보다 유사할 수록, 이들을 혼성화시켜 줄 조건이 보다 엄격해진다. 혼성화 조건의 엄격도는 서열 의존성이고, 상이한 환경적 파라미터 하에 상이하다. 따라서, 특별한 엄격도를 가져다 주는 혼성화 조건은 선택되는 혼성화 방법의 종류, 및 혼성화되는 핵산 서열의 조성과 길이에 따라서 다양할 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히, Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 혼성화의 엄격도를 결정하긴 하지만, 세척 횟수 또한 엄격도에 영향을 미친다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점 (Tm) 보다 약 5℃ 내지 20℃ 정도 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭된 프로브와 혼성화되는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 하에)이다. 핵산 혼성화 조건 및 엄격도 계산은, 예를 들어 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993. 및 Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999].
본 발명의 목적상, "엄격한 조건"은 혼성화 분자와 표적 서열 간의 미스매치 정도가 25% 미만인 경우에만 혼성화가 일어나게 하는 조건을 포괄한다. "엄격한 조건"은 보다 정확한 정의를 위해 특별한 수준의 엄격도로 분류할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 "적당한 수준의 엄격도" 조건은 25% 초과의 서열 미스매치를 수반한 분자를 혼성화시키지 않는 조건이고; "중간 수준의 엄격도" 조건은 15% 초과의 미스매치를 수반한 분자를 혼성화시키지 않는 조건이며, "고도로 엄격한" 조건은 10% 초과의 미스매치를 수반한 분자를 혼성화시키지 않는 조건이다. "극히 높은 엄격도" 조건은 6% 초과의 미스매치를 수반한 분자를 혼성화시키지 않는 조건이다. 이와는 달리, "낮은 엄격도" 조건 하에 혼성화되는 핵산에는 훨씬 덜한 서열 동일성을 나타내는 핵산, 또는 핵산의 짧은 아서열에 걸쳐서만 서열 동일성을 나타내는 핵산이 포함된다. 따라서, 본 발명에 포괄되는 핵산의 각종 변이체가 실질적으로 그의 전체 길이에 걸쳐 서열 1, 3, 5, 7, 9 및/또는 12 중의 하나 이상과 혼성화될 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다.
RSV 항원 폴리펩티드의 생성 방법
본원에 기재된 PreF 항원 (PreF-G 항원, 및 적용 가능한 경우, G 항원 포함)은 재조합 단백질의 발현 및 정제를 위해 널리 정립된 과정을 이용하여 생성시킨다. 당업자를 안내하기에 충분한 과정은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 200; and Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 999]. 부가의 구체적인 상세 내역은 다음에 제공된다.
PreF 항원을 암호화하는 재조합 핵산은 벡터 및 숙주 세포의 선택에 따라서 널리 공지된 각종 과정, 예를 들어 전기천공, 리포솜 매개된 형질감염 [예를 들어, 시판용 리포솜성 형질감염 시약, 예를 들면 LIPOFECTAMINE™2000 또는 TRANSFECTIN™을 이용한다], 인산칼슘 침전, 감염, 형질감염 등에 의해 숙주 세포 내로 도입한다. PreF 항원 (PreF-G 항원 포함)을 암호화하는 예시 핵산은 서열 5, 7, 9, 12 및 13에 제공된다. 당업자는 서열 5, 7, 9, 12 및 13이 예시적이고 제한적이 아니라는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 서열 5, 7 및 9와 동일한 단백질을 암호화하지만, 유전자 암호의 중복성 (예를 들어, 서열 12에 나타낸 바와 같은 대체 코돈 최적화)에 의해서만 상이한 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 서열 6, 8 및 10으로써 나타낸다)를, 서열 5, 7 및 9의 예시 서열 대신 용이하게 사용할 수 있다. 유사하게, 서열 13에 예시된 바와 같이, 발현-증강성 요소, 예를 들어 내부적으로 위치한 인트론을 포함하는 (또는 프로모터, 증강인자, 인트론 또는 기타 유사한 요소를 부가한) 폴리뉴클레오티드 서열을 이용할 수 있다. 당업자는 이러한 변형의 조합 역시 적합하다는 것을 인식할 것이다. 유사하게, RSV A 또는 RSV B 균주 중에서 선택된 상동성 서열, 및/또는 상기 논의된 바와 같이, 상당한 서열 동일성을 공유하고 있는 기타 서열을 또한 이용하여 PreF 항원을 발현시킬 수 있다. 실제로, 앞서 언급된 모든 변이체 핵산을 숙주 세포 내로 도입하고 PreF 항원 (PreF-G 항원 포함) 및 적용 가능한 경우에는 G 폴리펩티드를 생성시키기 위해 사용하는 것이 적합할 수 있다.
따라서, 재조합 PreF 항원-암호화 핵산을 포함하는 숙주 세포가 또한, 본 발명의 특징이다. 바람직한 숙주 세포에는 원핵성 (즉, 세균성) 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 뿐만 아니라 수 많은 진핵성 숙주 세포, 예를 들어 진균성 [예: 효모, 예를 들면 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스 (Picchia pastoris)] 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 포유류 세포 (예: CHO 및 HEK293 세포)가 포함된다. 재조합 PreF 항원 핵산은, 예를 들어 벡터 (예: 발현 벡터)를 통하여 숙주 세포 내로 도입한다 (예를 들어, 형질도입, 형질전환 또는 형질감염시킨다). 상기 언급된 바와 같이, 벡터는 가장 전형적으로, 플라스미드이지만, 이러한 벡터는, 예를 들어 바이러스성 입자, 파아지 등일 수도 있다. 적당한 발현 숙주의 예에는 세균성 세포, 예를 들어 이. 콜라이, 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 및 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium); 진균성 세포, 예를 들어 삭카로마이세스 세레비지애, 피치아 파스토리스, 및 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라 (Drosophila) 및 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda); 포유류 세포, 예를 들어 3T3, COS, CHO, BHK, HEK 293 또는 보웨스 (Bowes) 흑색종; 식물 세포, 예를 들어 해조류 세포 등이 포함된다.
숙주 세포는 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 데 적당한 바대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양할 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 전형적으로, 발현을 위해 선별된 숙주 세포의 경우에 앞서 사용된 것이고, 이는 당업자 및 본원에 인용된 참고 문헌, 예를 들어 문헌 [참고: Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York, 및 이에 인용된 참고 문헌]에서 명백할 것이다. 본 발명의 핵산에 상응하는 발현 생성물은 또한, 비-동물 세포, 예를 들어 식물, 효모, 진균, 세균 등에서 생성시킬 수 있다. 삼브룩 (Sambrook), 베르거 (Berger) 및 아우스벨 (Ausubel) 이외에도, 세포 배양에 관한 상세 내역이 다음 문헌에서 발견될 수 있다 [참고: Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL].
세균성 시스템에서는, 발현된 생성물에 대해 의도된 용도에 따라서 수 많은 발현 벡터를 선택할 수 있다. 예를 들어, 다량의 폴리펩티드 또는 그의 단편이 항체 생성에 필요한 경우에는, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 고 수준 발현을 지시하는 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 벡터에는 다작용성 이. 콜라이 클로닝 및 발현 벡터, 예를 들어 관심있는 암호화 서열, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 아미노-말단 해독 개시 메티오닌에 대한 서열 및 촉매적 활성 베타 갈락토시다제 융합 단백질을 생성시키는 베타-갈락토시다제의 후속 7개 잔기와의 동일 프레임 내에서 벡터에 연결시킬 수 있는 BLUESCRIPT (공급처: Stratagene); pIN 벡터 [참고: Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509]; 아미노-말단 메티오닌을 히스티딘 태그와의 동일 프레임 내에서 연결시키는 pET 벡터 (공급처: Novagen, Madison WI) 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
유사하게, 효모, 예를 들어 삭카로마이세스 세레비지애에서는, 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH와 같은 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 수 많은 백테가 목적하는 발현 생성물의 생성을 위해 이용될 수 있다 [참고: Berger, Ausubel, and, e.g., Grant et al. (1987; Methods in Enzymology 153:516-544)]. 포유류 숙주 세포에서는, 플라미드에 의거한 시스템과 바이러스에 의거한 시스템 둘 다를 포함한 수 많은 발현 시스템을 활용할 수 있다.
숙주 세포는 임의로, 삽입된 서열의 발현을 조정시킬 수 있거나 또는 발현된 단백질을 목적하는 방식으로 프로세싱할 수 있는 그의 능력에 대해 선택된다. 이러한 단백질 변형에는 글리코실화 (뿐만 아니라 예를 들어, 아세틸화, 카복실화, 인산화, 지질화 및 아실화)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 전구체 형태를 절단하여 성숙한 형태의 단백질로 만드는 (예를 들어, 푸린 프로테아제에 의함) 해독후 프로세싱을 숙주 세포의 맥락에서 임의로 수행한다. 상이한 숙주 세포, 예를 들어 3T3, COS, CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38 등은 이러한 해독 후 활성에 대해 특이적인 세포성 기구와 특징적 기전을 갖고 있고, 도입된 외래 단백질의 정확한 변형과 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다.
본원에 기재된 재조합 PreF 항원을 장기간 고 수율로 생성하기 위해, 안정한 발현 시스템을 전형적으로 사용한다. 예를 들어, PreF 항원 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 세포주를, 바이러스성 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선별성 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포 내로 도입한다. 벡터를 도입한 후, 세포를 강화 배지에서 1 내지 2일 동안 성장시킨 다음, 선별성 배지로 전환시킨다. 선별성 마커의 목적은 선별에 대한 내성을 부여하는 것이고, 그의 존재로 인해, 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포를 성장시키고 회수할 수 있게 된다. 예를 들어, 안정적으로 형질전환된 세포의 내성 군 또는 집락은 세포 유형에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식시킬 수 있다. PreF 항원을 암호화하는 핵산으로 형질전환시킨 숙주 세포는 임의로, 세포 배양물로부터 발현된 단백질을 발현 및 회수하는 데 적합한 조건 하에 배양한다.
적합한 숙주 세포주를 형질도입하고 이러한 숙주 세포를 적당한 세포 밀도로 성장시킨 후, 적당한 수단 (예: 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 상기 선별된 프로모터를 유도시키며, 세포를 부가의 기간 동안 배양한다. 임의로는, 배지가 프로테이나제에 의한 발현된 단백질의 분해를 감소시켜 주는 성분 및/또는 첨가제를 포함한다. 예를 들어, PreF 항원을 생성하기 위해 세포를 배양하는 데 사용된 배지는 세포내 또는 세포외 (예: 매트릭스) 프로테이나제에 의한 바람직하지 못한 절단을 감소 또는 없애주는 프로테아제 억제제, 예를 들어 킬레이트제 또는 소분자 억제제 (예: AZ11557272, AS111793 등)를 포함할 수 있다.
이어서, 분비된 폴리펩티드 생성물을 배양 배지로부터 회수한다. 또 다른 한편으론, 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 붕괴시키며, 이로써 생성되는 조 추출물은 추가의 정제를 위해 유지시켰다. 단백질의 발현에 이용된 진핵성 또는 미생물 세포는 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 붕괴, 또는 세포 용해제의 사용, 또는 당업자에게 널리 공지되어 있는 기타 방법을 포함한 통상적인 모든 방법에 의해 붕괴시킬 수 있다.
발현된 PreF 항원은 당해 분야에 널리 공지된 수 많은 방법, 예를 들어 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 여과, 한외여과, 원심분리, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 (예를 들어, 본원에 언급된 태그화 시스템을 이용한다), 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 단백질 리폴딩 단계를 경우에 따라, 성숙한 단백질의 형상을 완료시키는 데 사용할 수 있다. 최종적으로, 고 성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 최종 정제 단계에 이용할 수 있다. 상기 언급된 참고 문헌 이외에도, 각종 정제 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있는데, 이에는 예를 들어 문헌 [참고: Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; and Bollag et al (1996) Protein Methods, 2 nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, U.K.; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3 rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; and Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ]에 제시된 방법이 포함된다.
특정 예에서는, 원핵성 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포에서의 도입 및 발현에 적합한 벡터를 통하여 핵산을 세포 내로 도입한다. 예를 들어, PreF 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 각종 시판용 또는 독점적 벡터, 예를 들어 pET 시리즈의 발현 벡터 (예: pET9b 및 pET2d) 내로 도입할 수 있다. 암호화 서열의 발현은 IPTG에 의해 유도 가능하여, 이로써 고 수준의 단백질 발현이 이루어진다. PreF 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 파아지 T7 프로모터 하에 전사시킨다. 대체 벡터, 예를 들어 열-유도성 람다 pL 프로모터를 포함하는 pURV22가 또한 적합하다.
발현 벡터를 적합한 세균성 숙주 내로 도입한다 (예를 들어, 전기천공에 의해 이루어진다). 이. 콜라이의 수 많은 적합한 균주가 입수 가능하고, 이는 당업자에 의해 선택될 수 있다 [예를 들어, 로제타 (Rosetta) 및 BL21 (DE3) 균주가 PreF 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 벡터의 발현에 바람직한 것으로 입증되었다].
보다 전형적으로는, PreF 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 진핵성 세포 (예: 곤충 또는 포유류 세포)로의 도입 및 이러한 세포에서의 발현에 적합한 발현 벡터 내로 혼입시킨다. 바람직하게는, 이러한 핵산을 선별된 벡터/숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화시킨다 (예를 들어, 서열 5, 7, 9 및 12에 예시된 서열을 CHO 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화시킨다). 한 가지 예시 양태에서는, PreF 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 pEE14 벡터 (Lonza Biologicals 회사에 의해 개발됨)와 같은 벡터 내로 도입한다. 폴리펩티드는 구성성 프로모터, 예를 들어 즉발형 CMV (시토메갈로바이러스) 프로모터 하에 발현시킨다. 이러한 폴리펩티드를 발현하는 안정적으로 형질감염된 세포의 선별은 글루타민 공급원의 부재 하에서 성장할 수 있는 형질감염된 세포의 능력에 기초하여 이루어진다. pEE14를 성공적으로 통합시킨 세포는 외인성 글루타민의 부재 하에서 성장할 수 있는데, 이는 pEE14 벡터가 GS (글루타민 합성효소) 효소를 발현하기 때문이다. 선별된 세포를 클론적으로 확장시키고, 목적하는 PreF 폴리펩티드의 발현에 관하여 명확히 규명할 수 있다.
또 다른 예에서는, PreF 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 바쿨로바이러스 발현 시스템 (BEVS)을 이용하여 곤충 세포 내로 도입한다. 곤충 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 바쿨로바이러스는 시판용 벡터, 키트 및/또는 시스템, 예를 들어 BD 바쿨로골드 (BaculoGold) 시스템 (공급처: BD BioScience)을 이용하여 생성시킬 수 있다. 간략하게 언급하면, 상기 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 pAcSG2 전이 벡터 내로 삽입한다. 이어서, 숙주 세포 SF9 [스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)]를, 바쿨로바이러스 아우토그라파 칼리포르니카 핵 다각체병 바이러스 [Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)]의 선형화 게놈 DNA를 함유하는 BD 바쿨로골드 및 pAcSG2-키메라 플라스미드에 의해 공동-형질감염시킨다. 형질감염시킨 후, pACSG2 플라스미드와 바쿨로바이러스 게놈 간에 상동 재조합이 발생하여 재조합 바이러스를 생성시킨다. 한 가지 예에서는, PreF 항원을 폴리헤드린 프로모터 (pH)의 조절성 제어 하에 발현시킨다. 기타 프로모터, 예를 들어 기본 (Ba) 및 p10 프로모터를 이용하여 유사한 전이 벡터를 생성시킬 수 있다. 유사하게는, 대체 곤충 세포를 이용할 수 있는데, 예를 들면 Sf9와 밀접한 관계가 있는 SF21, 및 캐비지 루퍼 (cabbage looper), 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni)로부터 유래된 하이 파이브 (Hi Five) 세포주가 있다.
(선별된 프로모터 및/또는 증강인자 또는 기타 조절성 요소에 따라서) 형질감염 및 발현 유도시킨 후, 이와 같이 발현된 폴리펩티드를 회수하고 (예를 들어, 정제 또는 강화시킨다), 재생시켜 항원성 활성 융합전 입체형태로 폴딩되도록 한다.
면역원성 조성물 및 방법
또한, 상기 언급된 PreF 항원 (예를 들어, 서열 6, 8 및 10으로써 예시된 바와 같음)과 제약상 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
특정의 양태, 전형적으로 PreF 항원이 G 단백질 성분 (예: 서열 6)을 포함하지 않는 양태에서는, 면역원성 조성물이 단리된, 재조합 및/또는 정제된 G 단백질을 포함할 수 있다. 수 많은 적합한 G 단백질이 당해 분야에 보고되었고, 이에는 완전한 길이의 재조합 G 단백질 및 G 단백질의 일부 (예를 들어, 아미노산 128-229 또는 130-230)와 융합 파트너 (예: 티오레독신), 또는 발현 및/또는 정제를 촉진시켜 주는 신호 및/또는 리더 서열로 구성된 키메라 단백질이 포함된다. PreF 항원과 혼합하여 사용하는 것으로 예시되는 G 단백질은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: WO2008114149, 미국 특허 제5,149,650호, 미국 특허 제6,113,911호, 미국 특허공개공보 제20080300382호, 및 미국 특허 제7,368,537호; 각각이 본원에 참고로 도입된다]. 키메라 PreF-G 단백질과 관련하여 나타낸 바와 같이, G 단백질의 보다 작은 단편, 예를 들어 아미노산 149 내지 229 사이 부분, 또는 대략 128 내지 대략 229 사이 부분이 PreF (G 없음)와 G를 포함하는 혼합물 맥락에서 바람직하게 이용될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 중요한 고려 사항은, 예를 들어 아미노산 183-197의 영역 내에 포함된 면역우성 에피토프의 존재이다. 또 다른 한편으론, 완전한 길이의 G 단백질을 상기 조성물에 이용할 수 있다.
제약상 허용 가능한 담체 및 부형제는 널리 공지되어 있고, 당업자에 의해 선별될 수 있다. 예를 들어, 담체 또는 부형제는 바람직하게, 완충제를 포함할 수 있다. 임의로, 담체 또는 부형제는 용해도 및/또는 안정성을 안정화시키는 한 가지 이상 성분을 함유하기도 한다. 가용화제/안정화제의 예에는 세정제, 예를 들어 라우렐 사르코신 및/또는 트윈이 포함된다. 또 다른 가용화제/안정화제에는 아르기닌, 및 유리 형성 폴리올 (예: 슈크로스, 트레할로스 등)이 포함된다. 수 많은 제약상 허용 가능한 담체 및/또는 제약상 허용 가능한 부형제는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Remington 's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5th Edition (975)].
따라서, 적합한 부형제 및 담체는 선택된 투여 경로에 의해 대상체에게 전달하기에 적합한 제형을 생성시키도록 당업자가 선택할 수 있다.
적합한 부형제에는 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 솔비톨, 트레할로스, N-라우로일사르코신 나트륨 염, L-프롤린, 비 세정제 설포베타인, 구아니딘 히드로클로라이드, 우레아, 트리메틸아민 옥사이드, KCl, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ 및 기타 2가 양이온 관련 염, 디티오트레이톨, 디티오에리트롤, 및 β-머캅토에탄올이 비제한적으로 포함된다. 기타 부형제는 세정제 [Tween80, Tween20, 트리톤 (Triton) X-OO, NP-40, 엠피겐 (Empigen) BB, 옥틸글루코시드, 라우로일 말토시드, 쯔비터젠트(Zwittergent) 3-08, 쯔비터젠트 3-0, 쯔비터젠트 3-2, 쯔비터젠트 3-4, 쯔비터젠트 3-6, CHAPS, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 도데실 설페이트, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 포함]일 수 있다.
임의로는, 면역원성 조성물이 아주반트를 포함하기도 한다. RSV에 대하여 보호성 면역 반응을 유도시킬 목적으로 대상체에게 투여하기에 적합한 면역원성 조성물의 맥락에서는, Th1 편향된 면역 반응을 유도시켜 주는 아주반트를 선택한다.
전형적으로는, 해당 조성물이 투여되는 대상체 또는 대상체 집단에게서 Th1 편향된 면역 반응을 증강시켜 주는 아주반트를 선택한다. 예를 들어, 면역원성 조성물을 RSV 감염에 걸리기 쉬운 (또는 감염 위험이 증가된) 특별한 연령 군의 대상체에게 투여해야 하는 경우에는, 이러한 대상체 또는 대상체 집단에게 안전하면서도 유효한 아주반트를 선택한다. 따라서, 노인 대상체 (예를 들어, 65세 초과 대상체)에게 투여하기 위한 RSV PreF 항원을 함유하는 면역원성 조성물을 제형화하는 경우에는, 노인 대상체에게 안전하면서도 유효한 아주반트를 선택한다. 유사하게, RSV PreF 항원을 함유하는 면역원성 조성물을 신생아 또는 유아 대상체 (예를 들어, 신생아부터 2세까지의 대상체)에게 투여하고자 하는 경우에는, 신생아 및 유아에게 안전하면서도 유효한 아주반트를 선택한다.
부가적으로, 면역원성 조성물을 투여시키는 투여 경로를 통하여 투여하는 경우에, Th1 면역 반응을 증강시켜 주는 아주반트를 전형적으로 선택한다. 예를 들어, PreF 항원을 함유하는 면역원성 조성물을 비내 투여용으로 제형화하는 경우에는, 프로테오솜 (proteosome) 및 프로톨린 (protollin)이 바람직한 Th1-편향성 아주반트이다. 이와는 달리, 면역원성 조성물을 근육내 투여용으로 제형화하는 경우에는, 3D-MPL, 스쿠알렌 (예: QS21), 리포솜 및/또는 오일 및 수 에멀션 중의 하나 이상을 포함한 아주반트를 선택하는 것이 바람직하다.
PreF 항원과 병용해서 사용하기에 적합한 한 가지 아주반트는 비독성 세균성 지질다당류 유도체이다. 지질 A의 적합한 비독성 유도체의 특정 예는 모노포스포릴 지질 A 또는 보다 특히, 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)이다. 3D-MPL은 MPL이란 상표명으로 시판되고 있고 (시판처: GlaxoSmithKline Biologicals N.A.), 문헌 전반에 걸쳐 MPL 또는 3D-MPL로서 지칭된다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,436,727호; 제4,877,611호; 제4,866,034호 및 제4,912,094호]. 3D-MPL은 주로, IFN-γ (Th1) 표현형을 수반하는 CD4+ T 세포 반응을 증진시킨다. 3D-MPL은 GB2220211 A에 기재된 방법에 따라서 생성시킬 수 있다. 화학적으로는, 이것이 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A와 3, 4, 5 또는 6 아실화 쇄의 혼합물이다. 본 발명의 조성물에서는 소립자 3D-MPL을 사용할 수 있다. 소립자 3D-MPL은 이것이 0.22 ㎛ 필터를 통하여 멸균-여과될 수 있게 하는 입자 크기를 갖는다. 이러한 제제는 WO94/21292에 기재되어 있다.
지질다당류, 예를 들어 3D-MPL은 면역원성 조성물의 인간 용량당 1 내지 50 ㎍의 양으로 사용할 수 있다. 이러한 3D-MPL은 약 25 ㎍의 수준, 예를 들어 20 내지 30 ㎍, 적합하게는 21 내지 29 ㎍ 또는 22 내지 28 ㎍ 또는 23 내지 27 ㎍ 또는 24 내지 26㎍, 또는 25 ㎍으로 사용할 수 있다. 또 다른 양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 3D-MPL을 약 10 ㎍의 수준, 예를 들어 5 내지 15 ㎍, 적합하게는 6 내지 14 ㎍, 예를 들어 7 내지 13 ㎍ 또는 8 내지 12 ㎍ 또는 9 내지 11 ㎍, 또는 10 ㎍으로 포함한다. 추가의 양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 3D-MPL을 약 5 ㎍의 수준, 예를 들어 1 내지 9 ㎍ 또는 2 내지 8 ㎍, 적합하게는 3 내지 7 ㎍ 또는 4 내지 ㎍, 또는 5 ㎍으로 포함한다.
기타 양태에서, 지질다당류는 미국 특허 제6,005,099호 및 EP 특허 제0 729 473 B1호에 기재된 바와 같은 β(1-6) 글루코사민 이당류일 수 있다. 당업자는 이들 참고 문헌의 교시를 기준으로 하여 각종 지질다당류, 예를 들어 3D-MPL을 용이하게 생성시킬 수 있을 것이다. 그럼에도 불구하고, 이들 각각의 참고 문헌은 본원에 참고로 도입된다. 전술된 면역자극제 (구조상 LPS 또는 MPL 또는 3D-MPL과 유사하다) 이외에도, 상기 MPL 구조에 대해 부분-일부인 아실화 단당류 및 이당류 유도체가 또한 적합한 아주반트이다. 기타 양태에서는, 아주반트가 지질 A의 합성 유도체인데, 이들 중의 몇몇이 TLR-4 작동제로서 기재되고, 이에는 OM174 (2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실디히드로겐포스페이트) [참고: WO 95/14026]; OM 294 DP (3S,9R)-3--[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디히드로게노포스페이트) [참고: WO 99/64301 및 WO 00/0462]; 및 OM 197 MP-Ac DP (3S,9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디히드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트) [참고: WO 01/46127]가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
사용될 수 있는 기타 TLR4 리간드는 WO 98/50399 또는 미국 특허 제6,303,347호에 기재된 것과 같은 알킬 글루코사미니드 포스페이트 (AGP) (상기 문헌에는 AGP의 제조 방법이 또한 기재되어 있다), 적합하게는 RC527 또는 RC529, 또는 미국 특허 제6,764,840에 기재된 바와 같은 AGP의 제약상 허용 가능한 염이다. 몇몇 AGP는 TLR4 작동제이고, 몇몇은 TLR4 길항제이다. 둘 다 아주반트로서 유용한 것으로 여겨진다.
TLR-4를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 [참고: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5] 기타 적합한 TLR-4 리간드는, 예를 들어 그램-음성 세균으로부터의 지질다당류 및 그의 유도체, 또는 그의 단편, 특히 LPS (예: 3D-MPL)의 비독성 유도체이다. 기타 적합한 TLR 작동제는 열 쇽 단백질 (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 또는 90; 계면활성제 단백질 A, 히알루로난 올리고당류, 헤파란 설페이트 단편, 피브로넥틴 단편, 피브리노겐 펩티드 및 b-데펜신-2, 및 무라밀 디펩티드 (MDP)이다. 한 가지 양태에서, TLR 작동제는 HSP 60, 70 또는 90이다. 기타 적합한 TLR-4 리간드는 WO 2003/011223 및 WO 2003/099195에 기재된 바와 같고, 예를 들어 WO2003/011223의 페이지 4-5 또는 WO2003/099195의 페이지 3-4에 기재된 화합물 I, 화합물 II 및 화합물 III, 특히 WO2003/011223에 ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680, 및 ER804764로서 기재된 화합물이다. 예를 들어, 한 가지 적합한 TLR-4 리간드는 ER804057이다.
부가의 TLR 작동제가 또한, 아주반트로서 유용하다. 용어 "TLR 작동제"는 직접적인 리간드로서 또는 내인성 또는 외인성 리간드의 생성을 통하여 간접적으로, TLR 신호 전달 경로를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. 이러한 천연 또는 합성 TLR 작동제를 대체 또는 부가의 아주반트로서 사용할 수 있다. 아주반트 수용체로서의 TLR의 역할에 관한 간단한 고찰이 문헌 [참고: Kaisho & Akira, Biochimica et Biophysica Acta 1589:1-13, 2002]에 제공된다. 이들 잠재적 아주반트에는 TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9에 대한 작동제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 한 양태에서 아주반트 및 면역원성 조성물은 TLR-1 작동제, TLR-2 작동제, TLR-3 작동제, TLR-4 작동제, TLR-5 작동제, TLR-6 작동제, TLR-7 작동제, TLR-8 작동제, TLR-9 작동제, 또는 그의 조합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 아주반트를 추가로 포함한다.
본 발명의 한 양태에서는, TLR-1을 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제를 사용한다. 적합하게는, TLR-1을 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제가 트리-아실화 리포펩티드 (LP); 페놀-가용성 모둘린 (modulin); 미코박테륨 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) LP; S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi)로부터의 세균성 지단백질 및 OspA LP의 아세틸화 아미노 말단을 모방하는 트리히드로클로라이드 (Pam3Cys) LP 중에서 선택된다.
대체 양태에서는, TLR-2를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제를 사용한다. 적합하게는, TLR-2를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제가 지단백질, 펩티도글리칸, 엠. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis), 비. 부르그도르페리 (B. burgdorferi) 또는 티. 팔리둠 (T. pallidum)으로부터의 세균성 리포펩티드; 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)를 포함한 종으로부터의 펩티도글리칸; 리포테이코산, 만누론산, 네이세리아 포린스 (Neisseria porins), 세균성 핌브리애 (bacterial fimbriae), 예르시나 (Yersina) 독력 인자, CMV 비리온, 홍역 적혈구응집소, 및 효모로부터의 자이모산 (zymosan) 중의 하나 이상이다.
대체 양태에서는, TLR-3을 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제를 사용한다. 적합하게는, TLR-3을 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제가 이중 가닥 RNA (dsRNA), 또는 바이러스성 감염과 연관된 분자 핵산 패턴인 폴리이노신산-폴리시티딜산 (폴리 IC)이다.
대체 양태에서는, TLR-5를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제를 사용한다. 적합하게는, TLR-5를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제가 세균성 플라겔린 (flagellin)이다.
대체 양태에서는, TLR-6을 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제를 사용한다. 적합하게는, TLR-6을 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제가 미코박테리아성 지단백질, 디-아실화 LP, 및 페놀-가용성 모둘린이다. 부가의 TLR6 작동제가 WO 2003/043572에 기재되어 있다.
대체 양태에서는, TLR-7을 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제를 사용한다. 적합하게는, TLR-7을 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제가 단일 가닥 RNA (ssRNA), 록소리빈 (loxoribine), 위치 N7 및 C8에서의 구아노신 유사체, 또는 이미다조퀴놀린 화합물, 또는 그의 유도체이다. 한 양태에서는, TLR 작동제가 이미퀴모드이다. 추가의 TLR7 작동제가 WO 2002/085905에 기재되어 있다.
대체 양태에서는, TLR-8을 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제를 사용한다. 적합하게는, TLR-8을 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제가 단일 가닥 RNA (ssRNA), 항바이러스 활성을 지닌 이미다조퀴놀린 분자, 예를 들어 레시퀴모드 [resiquimod (R848)]이고, 레시퀴모드는 또한, TLR-7에 의해 인식될 수 있다. 사용될 수 있는 기타 TLR-8 작동제에는 WO 2004/071459에 기재된 것들이 포함된다.
대체 양태에서는, TLR-9를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제를 사용한다. 한 양태에서는, TLR-9를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제가 HSP90이다. 또 다른 한편으론, TLR-9를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 작동제가 세균성 또는 바이러스성 DNA, 특히 CpG 모티프로서 알려진 서열 맥락에서 비메틸화 CpG 뉴클레오티드를 함유하는 DNA이다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드는 주로, Th1 반응을 유도시킨다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 널리 공지되어 있고, 예를 들어 WO 96/02555, WO 99/33488 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호에 기재되어 있다. 적합하게는, CpG 뉴클레오티드가 CpG 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 면역원성 조성물에 사용하기 적합한 올리고뉴클레오티드는, 3개 이상, 적합하게 6개 이상 뉴클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 디뉴클레오티드 CpG 모티프를 임의로 함유하는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이다. CpG 모티프는 시토신 뉴클레오티드에 이어 구아닌 뉴클레오티드이다. 본 발명의 CpG 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 데옥시뉴클레오티드이다. 구체적 양태에서, 이러한 올리고뉴클레오티드 중의 뉴클레오티드간은 포스포로디티오에이트, 또는 적합하게 포스포로티오에이트 결합이긴 하지만, 포스포디에스테르 및 기타 뉴클레오티드간 결합도 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 본 발명의 범위 내에는 혼합 뉴클레오티드간 연쇄를 수반한 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로디티오에이트를 제조하는 방법은 미국 특허 제5,666,153호, 제5,278,302호 및 WO 95/26204에 기재되어 있다.
PreF 항원과 함께 면역원성 조성물에 그 자체로서 사용되거나 또는 3D-MPL과 병용해서 사용될 수 있는 기타 아주반트, 또는 본원에 기재된 또 다른 아주반트는 사포닌, 예를 들어 QS21이다.
사포닌은 다음 문헌에 교시되어 있다 [참고: Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)]. 사포닌은 식물 및 해양 동물계에 광범위하게 분포되어 있는 스테로이드 또는 트리테르펜 글리코시드이다. 사포닌은 진탕시 발포되는 수중 콜로이드성 용액을 형성하고, 콜레스테롤을 침전시키는 것으로 언급된다. 사포닌이 세포 막 근처에 있으면, 이는 막을 집단방출시킬 수 있는 막 내의 공극-유사 구조를 창출시킨다. 적혈구 용혈이 이러한 현상의 한 예이고, 이는 전부는 아니지만 특정 사포닌의 특성이다.
사포닌은 전신 투여용 백신에서의 아주반트로서 공지되어 있다. 이러한 아주반트 및 개개 사포닌의 용혈 특성은 당해 분야에서 광범위하게 연구되어 왔다 [Lacaille-Dubois and Wagner, 상기 참고]. 예를 들어, 퀼 (Quil) A [남아메리카산 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나 (Quillaja Saponaria Molina)의 나무껍질로부터 유래됨], 및 그의 분획이 문헌 [참고: US 5,057,540 and "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (l-2):l-55; and EP 0 362 279 Bl]에 기재되어 있다. 퀼 A의 분획을 포함하는 미립자 구조 [면역 자극성 복합체 (ISCOMS)로 명명됨]는 용혈성이고, 백신 제조에 사용되어 왔다 [참고: Morein, B., EP 0 109 942 Bl; WO 96/11711; WO 96/33739]. 용혈성 사포닌 QS21 및 QS17 (퀼 A의 HPLC 정제된 분획)이 강력한 전신 아주반트로서 보고되었고, 그의 생성 방법은 미국 특허 제5,057,540호 및 EP 0 362 279 B1 (본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다. 전신 백신접종 연구에 사용되어 온 기타 사포닌에는 기타 식물 종, 예를 들어 집소필라 (Gypsophila) 및 사포나리아 (Saponaria)로부터 유래된 것이 포함된다 [참고: Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992].
QS21은 퀼라자 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터 유래된 HPLC 정제된 비독성 분획이다. QS21의 생성 방법은 미국 특허 제5,057,540호에 기재되어 있다. QS21을 함유하는 비-반응원성 아주반트 제형이 WO 96/33739에 기재되어 있다. 전술된 참고 문헌은 본원에 참고로 도입된다. 상기 면역학적 활성 사포닌, 예를 들어 QS21을 면역원성 조성물의 인간 용량당 1 내지 50 ㎍의 양으로 사용할 수 있다. 유리하게, QS21은 약 25 ㎍의 수준, 예를 들어 20 내지 30 ㎍, 적합하게는 21 내지 29 ㎍ 또는 22 내지 28 ㎍ 또는 23 내지 27 ㎍ 또는 24 내지 26㎍, 또는 25 ㎍으로 사용할 수 있다. 또 다른 양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 QS21을 약 10 ㎍의 수준, 예를 들어 5 내지 15 ㎍, 적합하게는 6 내지 14 ㎍, 예를 들어 7 내지 13 ㎍ 또는 8 내지 12 ㎍ 또는 9 내지 11 ㎍, 또는 10 ㎍으로 포함한다. 추가의 양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 QS21을 약 5 ㎍의 수준, 예를 들어 1 내지 9 ㎍ 또는 2 내지 8 ㎍, 적합하게는 3 내지 7 ㎍ 또는 4 내지 6 ㎍, 또는 5 ㎍으로 포함한다. QS21 및 콜레스테롤을 포함하는 상기 제형은 해당 항원과 함께 제형화하는 경우에 성공적인 Th1 자극성 아주반트인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 예를 들어, PreF 폴리펩티드는 바람직하게, QS21과 콜레스테롤의 조합물을 포함하는 아주반트와 함께 면역원성 조성물에 이용할 수 있다.
임의로는, 아주반트가 무기질 염, 예를 들어 알루미늄 또는 칼슘 염, 특히 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및 인산칼슘을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 3D-MPL을 알루미늄 염 (예: 수산화알루미늄 또는 "백반")과 조합하여 함유하는 아주반트가 인간 대상체에게 투여하기 위한, PreF 항원을 함유하는 면역원성 조성물에서 제형화하는 데에 적합하다.
PreF 항원과 제형화하는 데에 사용하기 적합한 Th1 편향성 아주반트의 또 다른 부류에는 OMP에 의거한 면역자극성 조성물이 포함된다. OMP에 의거한 면역자극성 조성물은, 예를 들어 비내 투여하기 위한 점막 아주반트로서 특히 적합하다. OMP에 의거한 면역자극성 조성물은 그램-음성 세균, 비제한적으로 예를 들어 네이세리아 종 [참고: 예를 들어, Lowell et al., J. Exp. Med. 167:658, 1988; Lowell et al., Science 240:800, 1988; Lynch et al., Biophys. J. 45:104, 1984; Lowell, in "New Generation Vaccines" 2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, page 193, 1997; 미국 특허 제5,726,292호; 미국 특허 제4,707,543호]으로부터의 외부 막 단백질 (OMP; 몇몇 포린스 포함) 제제 속인데, 이는 세균성 또는 바이러스성 항원과 같은 면역원에 대한 담체로서 또는 이러한 면역원에 대한 조성물 중에 유용하다. 몇몇 OMP에 의거한 면역자극성 조성물은 "프로테오솜"으로서 지칭될 수 있는데, 이는 소수성이고 인간에게 사용하는 데 안전하다. 프로테오솜은 약 20 nm 내지 약 800 nm의 소포 또는 소포-유사 OMP 클러스터로 자가 어셈블링될 수 있는 능력과, 단백질 항원 (Ag), 특히 소수성 부분을 갖는 항원을 비공유적으로 혼입시키거나, 협조하거나, 이와 연합하거나 (예를 들어, 정전기적으로 또는 소수적으로 연합함) 또는 협동할 수 있는 능력을 갖고 있다. 하나 이상의 OMP의 다중-분자 막상 구조 또는 용융된 구상-유사 OMP 조성물을 포함한, 소포성 또는 소포-유사 형태의 외부 막 단백질 성분을 생성시키는 모든 제조 방법이 프로테오솜의 정의 내에 포함된다. 프로테오솜은, 예를 들어 당해 분야에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,726,292호 또는 미국 특허 제5,985,284호]. 프로테오솜은 OMP 포린스를 생성시키기 위해 사용되어 온 세균 (예: 네이세리아 종)으로부터 유래되는 내인성 지질다당류 또는 지올리고당류 (각각 LPS 또는 LOS)를 함유할 수도 있는데, 이는 일반적으로 총 OMP 제제의 2% 미만일 것이다.
프로테오솜은 주로, 세정제에 의해 용액 중에 유지된, 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis)로부터의 화학적으로 추출된 외부 막 단백질 (OMP) (주로 포린스 A 및 B 뿐만 아니라 부류 4 OMP)로 구성된다 [참고: Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206]. 프로테오솜은, 예를 들어 투석여과 또는 전통적 투석 공정에 의해, 바이러스성 공급원으로부터 유래된 정제된 단백질 또는 재조합 단백질과 같은 각종 항원 (본원에 기재된 PreF 폴리펩티드를 포함한다)과 함께 제형화할 수 있다. 세정제를 점진적으로 제거하면, 직경이 대략 100 내지 200 nm인 미립자 소수성 복합체가 형성될 수 있다 [참고: Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206].
본원에서 사용된 바와 같은 "프로테오솜: LPS 또는 프로톨린"은, 예를 들어 외적 부가에 의해, OMP-LPS 조성물 (이는 면역자극성 조성물로서 기능할 수 있다)을 제공하기 위해 한 가지 이상 종류의 지질다당류와 혼합된 프로테오솜 제제를 지칭한다. 따라서, OMP-LPS 조성물은 (1) 그램-음성 세균, 예를 들어 네이세리아 메닝기티디스로부터 제조된 프로테오솜의 외부 막 단백질 제제 [예: 프로주반트 (Projuvant)], 및 (2) 하나 이상의 지질당류의 제제를 포함하는, 프로톨린의 기본 성분 중의 2가지로 구성될 수 있다. 지질올리고당류는 내인성일 수 있거나 (예를 들어, OMP 프로테오솜 제제와 함께 천연상 함유될 수 있다), 외적으로 제조된 지질올리고당류로부터의 OMP 제제 (예를 들어, OMP 제제와 상이한 배양이나 미생물로부터 제조된다)와 혼합 또는 조합할 수 있거나, 또는 그의 조합물일 수 있다. 이와 같이 외적으로 부가된 LPS는 OMP 제제가 만들어진 것과 동일한 그램-음성 세균으로부터 유래될 수 있거나 또는 상이한 그램-음성 세균으로부터 유래될 수 있다. 프로톨린이 또한, 지질, 당지질, 당단백질, 소분자 등, 및 그의 조합물을 임의로 포함한다는 것을 이해해야 한다. 프로톨린은, 예를 들어 미국 특허공개공보 제2003/0044425호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
상기 언급된 바와 같은, 상이한 아주반트의 조합물을 PreF 항원과 함께 조성물에 사용할 수도 있다. 예를 들어, 앞서 언급한 바와 같이, QS21을 3D-MPL과 함께 제형화할 수 있다. QS21:3D-MPL의 비는 전형적으로, 대략 1:10 내지 10:1, 예를 들어 1:5 내지 5:1, 종종 실질적으로 1:1일 것이다. 전형적으로, 상기 비는 2.5:1 내지 1:1 범위의 3D-MPL: QS21이다. 또 다른 조합 아주반트 제형은 3D-MPL과 알루미늄 염, 예를 들어 수산화알루미늄이 포함된다. 조합하여 제형화하는 경우, 이러한 조합물은 항원-특이적 Th1 면역 반응을 증강시킬 수 있다.
몇몇 경우에, 아주반트 제형은 수중유 에멀션, 또는 무기질 염, 예를 들어 칼슘 또는 알루미늄 염, 예를 들면 인산칼슘, 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄을 포함한다.
수중유 에멀션의 한 가지 예는 수성 담체 중의 대사 가능한 오일, 예를 들어 스쿠알렌, 토콜, 예를 들어 토코페롤 (예: 알파-토코페롤), 및 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 80 또는 트윈 80을 포함하고, 어떠한 부가의 면역자극제(들)를 함유하지 않는데, 특히 비독성 지질 A 유도체 (예: 3D-MPL) 또는 사포닌 (예: QS21)을 함유하지 않는다. 수성 담체는, 예를 들어 인산염 완충 식염수일 수 있다. 부가적으로, 수중유 에멀션은 스판 (span) 85 및/또는 레시틴 및/또는 트리카프릴린을 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 항원 또는 항원 조성물과, 수중유 에멀션 및 임의로 하나 이상의 추가의 면역자극제를 포함하는 아주반트 조성물을 포함하는 백신 조성물이 제공되는데, 상기 수중유 에멀션은 0.5 내지 10 mg 대사 가능한 오일 (적합하게는, 스쿠알렌), 0.5 내지 11 mg 토콜 (적합하게는, 토코페롤, 예를 들어 알파-토코페롤) 및 0.4 내지 4 mg 유화제를 포함한다.
한 가지 구체적 양태에서, 아주반트 제형은 에멀션, 예를 들어 수중유 에멀션의 형태로 제조된 3D-MPL을 포함한다. 몇몇 경우에, 이러한 에멀션은 WO 94/21292에 기재된 바와 같이, 직경이 0.2 ㎛ 미만인 작은 입자 크기를 갖고 있다. 예를 들어, 3D-MPL의 입자는 0.22 마이크로미터 막을 통하여 멸균성 여과되기에 충분히 작을 수 있다 (유럽 특허 제0 689 454호에 기재된 바와 같다). 또 다른 한편, 3D-MPL은 리포솜성 제형으로 제조할 수 있다. 임의로, 3D-MPL (또는 그의 유도체)를 함유하는 아주반트는 또한, 부가의 면역자극성 성분을 포함한다.
예를 들어, PreF 폴리펩티드 항원을 수반한 면역원성 조성물을 유아에게 투여하기 위해 제형화하는 경우에는, 유아 대상체에게서 비교적 비-반응원성이고 유효하도록 아주반트의 투여량을 결정한다. 일반적으로, 유아용 제형에서의 아주반트의 투여량은 성인 (예를 들어, 65세 이상 성인)에게 투여하기 위해 설계된 제형에 사용된 투여량 보다는 적다. 예를 들어, 3D-MPL의 양은 전형적으로, 1회분 용량당 1 내지 200 ㎍, 예를 들어 10 내지 100 ㎍, 또는 10 내지 50 ㎍의 범위이다. 유아 용량은 전형적으로, 하한치가 상기 범위 보다 낮은데, 예를 들면 약 1 ㎍ 내지 50 ㎍, 예를 들어 약 2 ㎍, 또는 약 5 ㎍, 또는 약 10 ㎍, 내지 약 25 ㎍, 또는 내지 약 50 ㎍이다. 전형적으로, QS21을 제형에 사용하는 경우에는, 상기 범위와 동등한 수준이다 (그리고, 상기 표시된 비에 따른다). 성인과 노인 집단의 경우에는, 상기 제형이 전형적으로, 유아 제형에서 전형적으로 발견되는 것 보다 더 많은 아주반트 성분을 포함한다. 수중유 에멀션을 이용하는 특별한 제형에서는, 이러한 에멀션이 부가의 성분, 예를 들어 콜레스테롤, 스쿠알렌, 알파 토코페롤, 및/또는 세정제, 예를 들어 트윈 80 또는 스판 85를 포함할 수 있다. 예시 제형에서는, 이러한 성분이 다음 양으로 존재할 수 있다: 약 1 내지 50 mg 콜레스테롤, 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 알파 토코페롤 및 0.3 내지 3% 트윈 80. 전형적으로, 스쿠알렌:알파 토코페롤의 비는 1 이하인데, 이는 이것이 보다 안정한 에멀션을 제공하기 때문이다. 몇몇 경우에는, 제형이 안정화제를 함유할 수도 있다. 백반이, 예를 들어 3D-MPL과 조합해서 존재하는 경우, 그 양은 전형적으로, 1회분 용량당 약 100 ㎍ 내지 1 mg, 예를 들어 약 100 ㎍, 또는 약 200 ㎍ 내지 약 750 ㎍, 예를 들어 약 500 ㎍이다.
면역원성 조성물은 전형적으로, 면역보호량 (또는 그의 분할 용량)의 항원을 함유하고, 통상적인 기술에 의해 제조할 수 있다. 인간 대상체에게 투여하기 위한 것을 포함한 면역원성 조성물의 제조는 일반적으로, 문헌 [참고: Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978]에 기재되어 있다. 리포솜 내에서의 피막화는, 예를 들어 문헌 [참고: Fullerton, 미국 특허 제4,235,877호]에 기재되어 있다. 거대분자에 대한 단백질의 접합은, 예를 들어 문헌 [참고: Likhite, 미국 특허 제4,372,945호 및 Armor et al., 미국 특허 제4,474,757호]에 기재되어 있다.
전형적으로, 면역원성 조성물의 각 용량 중의 단백질 양은 전형적 대상체에게서 유의적인 부작용을 유발시키지 않으면서 면역보호 반응을 유도시키는 양으로서 선택된다. 이러한 맥락에서 면역보호가 반드시 감염에 대한 완전한 보호를 의미하지는 않고; 이는 증상 또는 질병, 특히 바이러스와 연관된 중증 질병에 대한 보호를 의미한다. 항원의 양은 특이적 면역원이 이용되는지에 따라서 다양할 수 있다. 일반적으로, 각 인간 용량은 단백질을 1 내지 1000 ㎍, 예를 들어 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 예를 들어 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 예를 들어 약 1 ㎍, 약 2 ㎍, 약 5 ㎍, 약 10 ㎍, 약 15 ㎍, 약 20 ㎍, 약 25 ㎍, 약 30 ㎍, 약 40 ㎍, 또는 약 50 ㎍ 포함할 것으로 예상된다. 면역원성 조성물에 이용된 양은 대상체 집단 (예: 유아 또는 노인)을 기준으로 하여 선택된다. 특별한 조성물에 대한 최적의 양은 대상체에게서 항체 역가 및 기타 반응을 관찰하는 것을 포함한 표준 연구에 의해 확인할 수 있다. 초기 백신접종 후, 약 4주 내에 대상체를 추가면역시킬 수 있다.
선택된 아주반트에 상관없이, 최종 제형 중의 농도는 표적 집단에게 안전하면서도 유효하도록 계산한다는 것을 인지해야 한다. 예를 들어, 인간에게서 RSV에 대하여 면역 반응을 유도시키기 위한 면역원성 조성물은 유아 (예를 들어, 초기 투여 연령이 생후 1년 사이, 예를 들어 0 내지 6개월인 유아)에게 투여하는 것이 바람직하다. RSV에 대하여 면역 반응을 유도시키기 위한 면역원성 조성물은 또한, 노인에게 투여하는 것이 바람직하다 (예를 들어, 단독으로 투여하거나 또는 COPD와 연관된 기타 병원체의 항원과 병용해서 투여한다). 아주반트의 선택은 이러한 상이한 적용에 있어서 상이할 수 있고, 각 상황에 대한 최적의 아주반트 및 농도는 당업자에 의해 실험적으로 결정할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
특정의 양태에서, 면역원성 조성물은 RSV로의 감염을 감소 또는 예방시켜 주는 백신이다. 몇몇 양태에서, 면역원성 조성물은 RSV로의 감염에 따른 병리학적 반응을 감소 또는 예방시켜 주는 백신이다. 임의로, PreF 항원을 함유하는 면역원성 조성물은 RSV 이외의 병원성 유기체의 하나 이상의 부가의 항원과 함께 제형화한다. 예를 들어, 이러한 병원성 유기체는 기도의 병원체 (예: 호흡기 감염을 유발시키는 바이러스 또는 세균)일 수 있다. 특정의 경우, 면역원성 조성물은 RSV 이외의 병원성 바이러스, 예를 들어 기도의 감염증을 유발시키는 바이러스, 예를 들면 인플루엔자 또는 파라인플루엔자로부터 유래된 항원을 함유한다. 기타 양태에서, 복수의 감염성 유기체에 대하여 대상체를 보호시키는 데에 요구되는 접종 횟수를 감소시키거나 투여를 촉진시켜 주는 부가의 항원을 선택한다. 예를 들어, 이러한 항원은 특히, 인플루엔자, B형 간염, 디프테리아, 파상풍, 백일해, 해모필루스 인플루엔자, 폴리오바이러스, 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 또는 뉴모코쿠스 중의 하나 이상으로부터 유래될 수 있다.
따라서, PreF 항원 또는 이를 암호화하는 핵산을 RSV에 대한 노출 또는 RSV에 의한 감염증을 치료 (이러한 노출이나 감염 후에 치료적으로 처치하거나 노출이나 감염 이전에 예방적으로 처치한다)하기 위한 약물을 제조하는 데 사용하는 것이 또한, 본 발명의 특징이다. 마찬가지로, 대상체에게서 RSV에 대하여 면역 반응을 유도시키는 방법이 본 발명의 특징이다. 이러한 방법은 PreF 항원을 포함하는 조성물의 면역학적 유효량을 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 통상적으로, 상기 조성물은 Th1 편향된 면역 반응을 유도시키는 아주반트를 포함한다. 이 조성물은 RSV와의 접촉에 따른 바이러스성 질병의 증강없이 RSV에 대해 특이적인 면역 반응을 유도시키도록 제형화한다. 즉, RSV로의 감염을 감소 또는 예방시켜 주고/주거나 RSV로의 감염에 따른 병리학적 반응을 감소 또는 예방시켜 주는 Th1 편향된 면역 반응을 야기시키도록 상기 조성물을 제형화한다. 상기 조성물을 각종 상이한 경로에 의해 투여할 수 있고, 가장 통상적으로는 면역원성 조성물을 근육내 또는 비내 투여 경로에 의해 전달한다.
면역원성 조성물은 전형적으로, 면역보호량 (또는 그의 분할 용량)의 항원을 함유하고, 통상적인 기술에 의해 제조할 수 있다. 인간 대상체에게 투여하기 위한 것을 포함한 면역원성 조성물의 제조는 일반적으로, 문헌 [참고: Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978]에 기재되어 있다. 리포솜 내에서의 피막화는, 예를 들어 문헌 [참고: Fullerton, 미국 특허 제4,235,877호]에 기재되어 있다. 거대분자에 대한 단백질의 접합은, 예를 들어 문헌 [참고: Likhite, 미국 특허 제4,372,945호 및 Armor et al., 미국 특허 제4,474,757호]에 기재되어 있다.
전형적으로, 면역원성 조성물의 각 용량 중의 단백질 양은 전형적 대상체에게서 유의적인 부작용을 유발시키지 않으면서 면역보호 반응을 유도시키는 양으로서 선택된다. 이러한 맥락에서 면역보호가 반드시 감염에 대한 완전한 보호를 의미하지는 않고; 이는 증상 또는 질병, 특히 바이러스와 연관된 중증 질병에 대한 보호를 의미한다. 항원의 양은 특이적 면역원이 이용되는지에 따라서 다양할 수 있다. 일반적으로, 각 인간 용량은 단백질을 1 내지 1000 ㎍, 예를 들어 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 예를 들어 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 예를 들어 약 1 ㎍, 약 2 ㎍, 약 5 ㎍, 약 10 ㎍, 약 15 ㎍, 약 20 ㎍, 약 25 ㎍, 약 30 ㎍, 약 40 ㎍, 또는 약 50 ㎍ 포함할 것으로 예상된다. 면역원성 조성물에 이용된 양은 대상체 집단 (예: 유아 또는 노인)을 기준으로 하여 선택된다. 특별한 조성물에 대한 최적의 양은 대상체에게서 항체 역가 및 기타 반응을 관찰하는 것을 포함한 표준 연구에 의해 확인할 수 있다. 초기 백신접종 후, 약 4 내지 12주 내에 대상체를 추가면역시킬 수 있다. 예를 들어, PreF 항원을 함유하는 면역원성 조성물을 유아 대상체에게 투여하는 경우, 초기 및 후속 접종은 이러한 기간 동안에 투여된 기타 백신과 동시에 투여할 수 있다.
다음 실시예는 특정의 특별한 특징 및/또는 양태를 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 발명을 본원에 기재된 특별한 특징이나 양태로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
<실시예>
실시예 1: 예시되는 PreF 항원
F의 융합전 입체형태에 대해 생성된 면역 반응이 막 융합에 관여한 결합, 입체형태적 이동 및 기타 사건을 방해함으로써, 보호성 반응의 효능을 증가시킬 수도 있는 항체를 우선적으로 포함한다는 예측을 기준으로 하여, 천연 RSV F 단백질의 융합전 입체형태를 안정화시키기 위해 이러한 단백질과 비교해서 PreF 항원을 변형시켰다.
도 1a 및 1b는 RSV F0 및 예시되는 PreF 재조합 항원의 특징으로 도식적으로 예시한 것이다. 도 1a는 RSV F0 단백질을 나타낸 것이다. F0는 574개 아미노산으로 이루어진 예비-단백질이다. F0 전-단백질은 해독 후 단백질 분해적으로 프로세싱되고 글리코실화된다. 신호 펩티다제에 의해 나중에 제거되는 신호 펩티드는 F0 예비-단백질의 해독이 내형질 세망 (RE)을 표적으로 하도록 한다. 이어서, RE 내의 신생 펩티드를 다중 부위에서 N-글리코실화시킨다 (삼각형으로 표시됨). F0의 푸린 절단으로 F2 펩티드 도메인과 F1 펩티드 도메인이 생성되는데, 이를 함께, F2-F1 이종-이량체의 삼량체 (즉, 3 x F2-F1)로서 폴딩 및 어셈블링한다. 그의 천연 상태에서는 F 단백질이 C-말단 영역 내의 막관통 나선에 의해 막에 정착된다. F0 폴리펩티드의 또 다른 특징에는 15개의 시스테인 잔기, 4개의 특징적인 중화 에피토프, 2개의 코일드-코일 영역, 및 1개의 지질화 모티프가 포함된다. 도 1b는 예시되는 PreF 항원의 특징을 예시한 것이다. PreF 항원을 구축하기 위해, F 단백질의 융합전 입체형태를 안정화시킴으로써, 숙주 세포와 결합하여 융합되기에 앞서 RSV 바이러스로써 제시된 바와 같은 F 단백질의 주 면역원성 에피토프를 보유하도록 F0 폴리펩티드를 변형시켰다. F0 폴리펩티드와 비교하여 다음 안정화 돌연변이를 PreF 항원 내로 도입하였다. 첫째, 안정화 코일드-코일 도메인을 F0 폴리펩티드의 세포외 도메인의 C-말단에 놓아두어, F0의 막 정착 도메인을 대체시켰다. 둘째, pep27 펩티드 (천연 단백질 중에서 F2 도메인과 F1 도메인 사이에 위치함)를 제거하였다. 셋째, 양 푸린 모티프를 제거하였다. 대체 양태 (PreF_V1 및 PreF_V2로 명명됨)에서는 RSV G 단백질의 면역학적 활성 부분 (예: 아미노산 149-229)을 C-말단 도메인에 가하였다.
실시예 2: CHO 세포로부터 PreF 재조합 단백질의 생성 및 정제
예시되는 PreF 항원을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열을, PreF 항원을 생성시키기 위해 숙주 CHO 세포 내로 도입하였다. 이와 같이 도입된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 일시적으로 형질감염시킨 숙주 세포 또는 확장된 안정한 집단을 목적하는 바를 위해 허용 가능한 규모로 성장시키기에 적합한 조건 하 및 배지에서 성장시켰다 [참고: 예를 들어, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York 및 이에 인용된 참고 문헌]. 전형적으로, 세포를 5% CO2 및 37℃ 하의 진탕 플라스크내의 혈청 무함유 배지에서 성장시키고, 2 내지 3일 간격으로 계대접종하거나, 또는 20%로 유지시킨 pO2 및 29℃ 하의 생물 반응기에서 성장시켰다.
재조합 PreF 항원을 회수하기 위해, 세포 배양물을 원심분리시키고, 세포 배양 상등액을 추가의 사용시 까지 80℃ 하에 저정하였다. 추가의 분석을 위해, 세포 배양 상등액의 2 리터 분취액을 정제수로 2배 희석시키고, NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정하였다. 상등액을 14 ml/분의 속도로, 20 mM 피페라진 pH 9.5에서 평형시킨 Q 세파로스 FF 이온 교환 칼럼 (60 ml, 11.3 cm) 상으로 부하하였다. 이 칼럼을 출발 완충액으로 세척한 후, 20 칼럼 용적에서 0 내지 0.5 M NaCl의 NaCl 구배를 이용하여 용출을 수행하였다 (분획 크기 10 ml). 분획을 은 염색 및 웨스턴 블롯에 의해 SDS PAGE 겔 상에서 분석하였다. 이어서, 상당한 PreF 단백질을 함유하는 분획을 추가의 프로세싱에 앞서 풀링하였다.
이와 같이 풀링된 Q 단계 용출액 (약 130 ml)을 대상으로 하여, 펠리콘 (Pelllicon) XL PES 바이오맥스 100 (MWCO 10,000 Da) 막 카세트가 장착된 벤취-규모 TFF 시스템 (공급처: Millipore)을 이용하여 10 mM 인산염, pH 7.0로 완충제 교환시켰다. 이로써 생성되는 물질은 pH가 7.0이고, 전도도가 1.8 mS/cm였다. 100 ml의 상기 샘플을 5 ml/분으로, 10 mM PO4(Na) 완충제 pH 7.0으로 평형시킨 10 ml 히드록시 아파타이트 유형 II (HA TII) 겔 (XK 16, 높이=5cm) 상으로 부하하였다. 칼럼을 출발 완충액으로 세척한 후, 20 칼럼 용적에서 10 mM 내지 200 mM PO4(Na) pH 7.0 구배를 이용하여 용출을 수행하였다. 분획을 은 염색 및 쿠마시 블루를 이용하여 SDS PAGE 겔 상에서 다시 분석하고, 양성 분획을 풀링하였다.
친화 크로마토그래피 후, 상기 풀링된 분획을 농축시키고, 비바스핀 (Vivaspin) 20 농축기 단위, 10,000 Da MWCO을 이용하여 DPBS (pH 약 7.4)로 완충제 교환시켰다. 최종 생성물은 약 13 ml였다. 단백질 농도는 로우리 (Lowry) 검정에 의해 평가한 결과 195 ㎍/ml였다. 순도는 95% 초과였다. 이와 같이 정제된 PreF 항원 제제를 필터 멸균시키고, 사용에 앞서 -20℃ 하에 저장하였다.
실시예 3: CHO 세포에서 생성된 PreF 재조합 단백질의 특징화
CHO 세포에서 생성된 PreF 재조합 단백질을 비대칭 장 유동 분획법 (AFF-MALS)에 의해 명확히 규명하였고, RSV F 및 G 단백질 성분을 포함한 키메라 항원과 비교하였다. AFF-MALS는 최소 매트릭스 상호 작용을 수반한 액체 유동으로 그의 분자 크기에 따라서 단백질 종을 분리시켜 줄 수 있고, 정확한 분자량 결정을 위해 다중-각 광 산란에 의한 추가의 분석을 허용시켜 준다. 도 2a는 정제된 FG 물질의 65% 초과가 그의 최종 PBS 완충액 내에 고 분자량 올리고머 (1000-100 000 KDa)로서 발견되는 반면 3%는 여전히 단량체성 형태라는 것을 도시하고 있다.
도 2b는 정제된 PreF 단백질이 그의 삼량체성 형태로 폴딩되어 PBS 완충액 내에 73% 비율을 차지한다는 것을 도시하고 있다. 이 물질의 10%가 1000 내지 20 000 KDa 올리고머로서 발견되었다. 이들 결과는 CHO 세포에서 발현된 재조합 PreF 단백질이 천연 상태에 대해 예측된 바와 같이 삼량체로서 폴딩된다는 것을 나타낸다.
인산염 완충 용액 중에서의 정제된 PreF 단백질의 가용성 특성을 확인할 목적과, FG 단백질을 이용한 생체내 평가에서 비교하기 위한 응집체를 생성시킬 목적으로, 상기 정제된 PreF 단백질을 또한 글루타르알데히드와 가교 결합시켰다 (하기 실시예 7 참고). 글루타르알데히드 가교 결합성은 단백질의 4차 구조를 잘 평가해주는 것으로 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Biochemistry, 36:10230-10239 (1997); Eur. J. Biochem., 271:4284-4292 (2004)].
단백질을 4℃ 하에 4시간 동안 1%, 2% 및 5%의 글루타르알데히드 가교 결합제와 항온 배양하고, NaBH4를 부가함으로써 반응을 차단시켰다. PBS 완충액에서 칼럼 탈염시킴으로써 과량의 글루타르알데히드를 제거하였다. 이로써 생성되는 단백질을 280 nm 하에서의 흡광도에 의해 정량화하고, 변성 및 환원성 조건 하에 SDS PAGE에 의해 평가하였다. 대다수의 정제된 재조합 PreF이 PBS 용액 중에서 삼량체로서 유주하는 것으로 결정되었다. SDS PAGE에 의해 확인된 바와 같이, 대다수의 삼량체성 단백질을 고 분자량 응집체로 전환시키기 위해서는, 항온 배양 온도를 23℃로 상승시키는 것이 필요하였다.
실시예 4: PreF 항원에 의한 시험관내 중화 억제
자원자로부터 수득한 인간 혈청을 대상으로 하여, ELISA에 의해 RSV A에 대한 반응성을 알아보기 위해 스크리닝하였고, 이를 각 혈청 샘플에 대해 정립된 선행 RSV 중화 잠재적 적정에 기초한 관련 희석도 하에서 중화 억제 (NI) 검정에 사용하였다. 간략하게 언급하면, 혈청을 50% 199-H 배지, 0.5% FBS, 2 mM 글루타민, 50 ㎍/ml 젠타마이신 (공급처: Invitrogen)을 수반한 DMEM 중의 25 ㎍/ml 농도로 억제제 단백질 (RixFG로 명명된, 미국 특허 제5,194,595호에 기재된 키메라 FG에 거의 상응하는 대조군 단백질 또는 PreF)과 혼합하고, 회전성 휠 상에서 37℃ 하에 1.5 내지 2시간 동안 항온 배양하였다. 20 ㎕의 일련의 혈청 및 단백질 희석물을, 환저 96-웰 판에서 각 혈청 샘플에 대한 억제 범위를 최적화하도록 적정시킨 RSV A와 혼합하였다. 이로써 생성되는 혼합물을, pH를 유지하기 위해 5% CO2 및 33℃ 하에 20분 동안 항온 배양하였다.
이어서, 혈청-억제제-바이러스 혼합물을 기존에 Vero 세포-시딩된 평저 96-웰 판에 놓아두고, 33℃ 하에 2시간 동안 항온 배양한 후, 160 ㎕의 배지를 부가하였다. 판을 NI 역가 탐지를 위한 면역형광 검정때까지 5% CO2 및 33℃ 하에 5 내지 6일 동안 추가로 항온 배양하였다. 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 1% 파라포름알데히드를 이용하여 1시간 동안 고정시킨 후, 판을 2% 밀크/PBS 및 차단 완충액으로 차단시켰다. 염소 항-RSV 항체 (공급처: Biodesign Internation; 1:400)를 세정없이 각 웰에 가하고, 실온 하에 2시간 동안 항온 배양하였다. 샘플을 PBS로 2회 세척하고, 차단 완충액 중의 항-염소 IgG-FITC (공급처: Sigma; 1:400)를 웰에 가하였다. 판을 실온 하에 2시간 동안 다시 항온 배양하고, 판독에 앞서 상기와 같이 2회 세척하였다. ≥1 형광성 합포체가 탐지되는 경우에, 웰은 양성으로 간주되었다. 스페아르만-카르버 (Spearman-Karber) (SK) 방법을 이용하여 50% 조직 배양 감염 용량 (TCID50)을 계산하였고, NI 비율은 다음과 같이 계산하였다: [(0 ㎍의 Neut 역가/ml 억제제 - 25 ㎍의 Neut 역가/ml 억제제)/0 ㎍의 Neut 역가/ml 억제제] X 100. 도 3에 제시된 예시 결과는 PreF가 시험된 21명 공여자 중의 16명에게서 NI에 있어 FG에 비해 탁월하다는 것을 나타낸다.
실시예 5: PreF 항원은 면역원성이다
PreF 항원의 면역원성을 입증하기 위해, preF (6.5, 3.1, 0.63, 0.13, 및 0.025 ㎍/ml)과 인간 용량의 1/20로 3D MPL 및 QS21을 함유하는 Th1 아주반트 ("AS0lE")를 이용하거나 또는 preF (1, 0.2 및 0.04 ㎍/ml)과 인간 용량의 1/10로 3D MPL 및 백반을 함유하는 Th1 아주반트 ("AS04C")를 이용하여, 마우스를 2주 간격으로 2회 근육내 면역시키고, 3주 후에 혈청을 수집하였다.
항원-특이적 IgG 항체 역가를 표준 과정에 따라서 ELISA에 의해 풀링된 혈청 샘플 상에서 결정하였다. 간략하게 언급하면, 96-웰 판을 정제된 불활성화 RSV A, RSV B 및 상동성 preF 단백질로 피복시키고, 4℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 혈청 샘플을 출발 농도 200 ng/ml에서 정제된 마우스 IgG (공급처: Sigma, ON)과 함께, 초기 농도 1:50에서 출발하여 차단용 완충액에서 일련으로 희석시키고, 실온 하에 2시간 동안 항온 배양하였다. 결합된 항체는 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 항-마우스 IgG (공급처: Sigma, ON)으로 탐지하였다. 3,3A,5,5A-테트라메틸벤지딘 (TMB, BD Opt EIATM, BD Biosciences, ON)을 HRP에 대한 기질로서 사용하였다. 50 ㎕의 1 M H2SO4를 각 웰에 가하여 반응을 중지시켰다. 각 웰에 대한 흡광도 값을 몰레쿨라 디바이스 (Molecular Devices) 미소판 판독기 (공급처: Molecular Devices, USA)를 이용하여 450 nm 하에서 탐지하였다.
도 4a 및 4b에 상세된 대표적 결과는 preF 항원을 이용한 면역 후에 RSV A 및 RSV B 둘 다에 대하여 강력한 역가가 유도된다는 것을 나타내고 있다.
실시예 6: PreF는 중화 항체를 유도시킨다
중화 항체의 존재 및 양은 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 면역시킨 마우스의 혈청 샘플에서 평가하였다. 면역시킨 동물로부터 풀링된 혈청을 96-웰 판에서 RSV 배지 중의 1:8의 출발 희석물로부터 일련으로 희석시켰다 (20 ㎕/웰). 대조군 웰은 RSV 배지 만을 함유하였거나, 염소 항-RSV 항체를 1:50으로 함유하였다 (공급처; Biodesign international). 대표적인 RSV A 또는 B 균주의 500 내지 1000 감염 용량을 상기 웰에 가하고, 판을 33℃, 5% CO2 하에 20분 동안 항온 배양한 후, 1 x 105개 세포/ml Vero 세포로 미리 시딩한 96-웰 평저 판에 혼합물을 옮겼다. 세포를 33℃, 5% CO2 하에 대략 2시간 동안 항온 배양하고 재공급한 후, 동일한 온도에서 5 내지 6일 동안 항온 배양하였다. 상등액을 제거하고, 판을 PBS로 세척하며, 부착성 세포를 1시간 동안 PBS 중의 1% 파라포름알데히드로 고정시킨 다음, 탐지를 위해 염소 항 RSV 일차 항체 및 항-염소 IgG-FITC를 이용하여 간접 면역형광 (IFA)을 수행하였다.
도 5a 및 5b 각각에 도시된 대표적 결과는 양 RSV 균주에 대한 유의적 중화 항체가 preF로 면역시킨 동물의 혈청에서 탐지된다는 사실을 입증해준다.
실시예 7: PreF는 RSV 시험감염에 대하여 보호해준다
마우스를 상기 언급된 바와 같이 2주 간격으로 2회 근육내 면역시키고, RSV A를 두 번째 주사한지 3주 후에 시험감염시켰다. RSV에 대한 보호는 시험감염 후 폐에 존재하는 바이러스를 측정함으로써 평가하였다. 간략하게 언급하면, 면역시킨 동물로부터의 폐를 마취 후 무균적으로 꺼내고, 이를 15 ml 튜브에서 2 용적의 10 ml/폐를 이용하여 RSV 배지에서 세척하였다. 이어서, 폐를 칭량하고 자동화 포터 (Potter) 균질화기 (공급처: Fisher, Nepean ON)를 이용하여 RSV 배지에서 개별적으로 균질화시키며, 4℃ 하에 2분 동안 2655 x g으로 원심분리시켰다. 상등액에 존재하는 바이러스는 96-웰 판 중의 앞서 시딩된 Vero 세포 (ATCC# CCL-81) 단층 상에서 일련으로 희석시킴으로써 (1:10에서 시작하는 8개 복제물) 적정하였고, 6일 동안 항온 배양하였다. 1% 파라포름알데히드/PBS pH 7.2에서 고정시킨 후, 염소 항-RSV 일차 항체 및 FITC 표지된 항-염소 IgG 이차 항체를 이용하여 간접 IFA에 의해 RSV를 탐지하였다.
도 6a 및 6b에 도시된 대표적 결과는 아주반트의 존재 하에 제공되는 경우 0.04 ㎍ 이상의 용량이 RSV에 대하여 강력한 보호를 유도시킨다는 사실을 입증해준다.
실시예 8: PreF 는 시험감염에 따른 폐 호산구 동원을 유도하지 않는다
면역 및 후속 시험감염에 따라 악화된 질병을 유발시킬 수 있는 PreF 항원의 잠재력을 평가하기 위해, 마우스 군 (군당 5마리 마우스)을 (a) 10 ㎍ 글루타르알데히드-처리된 preF, (b) 10 ㎍ preF 또는 (c) 아주반트 없는 10 ㎍ FG로 각각 2회씩 면역시켰다. 추가 면역시킨지 3주 후에 마우스를 RSV A로 시험감염시키고, 시험감염시킨지 4일 후에 기관지폐포성 세정 (BAL)을 수행하였다. 대식 세포/단구, 호중구, 호산구 및 림프구의 세포 형태학에 기초한 차등 계수치 (300개 세포) 뿐만 아니라 마우스당 BAL 중의 총 백혈구 침윤물을 계산하였다.
총 세포 수에 각 동물에 대한 호산구의 차등 비율을 곱하였다. 95% 신뢰 한계치를 수반한 군당 기하 평균이 제시된다. 도 7에 도시된 대표적인 결과는 preF로의 면역 및 시험감염 후에 호산구가 폐로 동원되지 않는다는 사실을 입증해준다. 더우기, 이들 결과는 계획적으로 응집시킨 형태의 preF (글루타르알데히드 처리) 또는 FG 항원 (천연상 응집됨)과 비교해서, preF 항원의 가용성 특성이 호산구를 선호하지 않는다는 사실을 제안하고 있다.
Figure 112010047578938-pct00001
Figure 112010047578938-pct00002
Figure 112010047578938-pct00003
Figure 112010047578938-pct00004
Figure 112010047578938-pct00005
SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Biologicals S.A. ID Biomedical Corporation of Quebec BAUDOUX, Guy J-M BLAIS, Normand Rheault, Patrick RUELLE, Jean-Louis <120> Recombinant Antigen <130> VU62788 <150> 61/016,524 <151> 2007-12-24 <150> 61/056,206 <151> 2008-05-27 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1697 <212> DNA <213> respiratory syncytial virus <400> 1 atggagttgc taatcctcaa agcaaatgca attaccacaa tcctcactgc agtcacattt 60 gttttgcttc tggtcaaaac atcactgaag aattttatca atcaacatgc agtgcagtag 120 caaaggctat cttagtgctc tgagaactgg ttggtatacc agtgttataa ctatagatta 180 agtaatatca aggaaaataa gtgtaatgga acagatgcta aggtaaaatt gataaacaag 240 aattagataa atataaaaat gctgtaacag aattgcagtt gctcatgcaa agcacccagc 300 aacaaacaat cgagccagaa gagaactacc aaggtttatg aattatacac tcaaaatgcc 360 aaaaaaacca atgtaacatt aagcaagaaa aggaaaagaa gatttcttgg tttttgttag 420 gtgttggatc tgcaatcgcc agtggcgttg ctgtatctaa ggtcctgcac ctgaagggga 480 agtgaacaag atcaaaagtg ctctactatc cacaaacaag gctgtagtca gttatcaaat 540 ggagttagtg tcttaaccag caaagtgtta gacctcaaaa actatataga aaacaattgt 600 tacctattgt gaacaagcaa agctgcagca tatcaaatat agcaactgta tagagttcca 660 acaaaagaac aacagactac tagagattac cagggaattt agtgttaagc aggtgtaact 720 acacctgtaa gcacttacat gttaactaat agtgaattat tgtcattatc aatgatatgc 780 ctataacaaa tgatcagaaa aagttaatgt ccaacaatgt tcaaatgtta gacagcaaag 840 ttactctatc atgtccataa taaaagagga agtcttagca tatgtgtaca attaccacta 900 tatggtgtta tagatacacc ctgttggaaa ctacacacat ccccctatgt acaaccaaca 960 caaaagaagg gtccaacatc tgtttaacaa gaactgacag aggtggtact gtgacaatgc 1020 aggatcagta tctttcttcc cacaagctga aacatgtaaa gtcaatcaaa tcgagtattt 1080 tgtgacacaa tgaacagttt aacattacca agtgaagtaa actctgcaat gttgacatat 1140 tcaaccccaa atatgattgt aaaattatga cttcaaaaac gatgtaagca gctccgttat 1200 cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaaca aatgtacagc atccaataaa 1260 aatcgtggaa tcataaagac attttctaac gggtgcgata tgtatcaaat aaaggggtgg 1320 acactgtgtc tgtaggtaac acattatatt atgtaaaaag caagaaggta aaagtctcta 1380 tgtaaaaggt gaaccaataa taaatttcta tgacccttag tattcccctc tgatgaattt 1440 gatgcatcaa tatctcaagt caacgagaag attaacagag cctagcattt attcgtaaat 1500 ccgatgaatt attacataat gtaaatgctg gtaatccacc ataaatatca tgataactac 1560 tataattata gtgattatag taatattgtt atcttaattg ctgttggact gctcttatac 1620 tgtaaggcca gaagcacacc agtcacacta agaaagatca actgagtggt ataaataata 1680 ttgcatttag taactaa 1697 <210> 2 <211> 574 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 2 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Ala Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg 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Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn 145 150 155 160 Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys 180 185 190 Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe 195 200 205 Lys Thr Thr Lys Lys Asp Leu Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu 210 215 220 Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys 225 230 235 240 Thr Asn Ile Thr Thr Thr Leu Leu Thr Asn Asn Thr Thr Gly Asn Pro 245 250 255 Lys Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly 260 265 270 Asn Leu Ser Pro Ser Gln Val Ser Thr Thr Ser Glu His Pro Ser Gln 275 280 285 Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Thr Arg Gln 290 295 <210> 5 <211> 1566 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant PreF polynucleotide <400> 5 aagcttgcca ccatggagct gctgatcctg aaaaccaacg ccatcaccgc catcctggcc 60 gccgtgaccc tgtgcttcgc ctcctcccag aacatcaccg aggagttcta ccagtccacc 120 tgctccgccg tgtccaaggg 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acctgcaagg tgcagtccaa ccgggtgttc 1020 tgcgacacca tgaactccct gaccctgcct tccgaggtga acctgtgcaa catcgacatc 1080 ttcaacccca agtacgactg caagatcatg accagcaaga ccgacgtgtc ctccagcgtg 1140 atcacctccc tgggcgccat cgtgtcctgc tacggcaaga ccaagtgcac cgcctccaac 1200 aagaaccggg gaatcatcaa gaccttctcc aacggctgcg actacgtgtc caataagggc 1260 gtggacaccg tgtccgtggg caacacactg tactacgtga ataagcagga gggcaagagc 1320 ctgtacgtga agggcgagcc tatcatcaac ttctacgacc ctctggtgtt cccttccgac 1380 gagttcgacg cctccatcag ccaggtgaac gagaagatca accagtccct ggccttcatc 1440 cggaagtccg acgagaagct gcataacgtg gaggacaaga tcgaggagat cctgtccaaa 1500 atctaccaca tcgagaacga gatcgcccgg atcaagaagc tgatcggcga ggcctgataa 1560 tctaga 1566 <210> 6 <211> 514 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant PreF Antigen <400> 6 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Thr Asn Ala Ile Thr Ala Ile Leu Ala 1 5 10 15 Ala Val Thr Leu Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 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Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp 465 470 475 480 Glu Lys Leu His Asn Val Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys 485 490 495 Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly 500 505 510 Glu Ala <210> 7 <211> 1855 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric PreF-G Antigen polynucleotide seqeunce <400> 7 aagcttgcca ccatggagct gctgatcctc aagaccaacg ccatcaccgc catcctggcc 60 gccgtgaccc tgtgcttcgc ctcctcccag aacatcaccg aagagttcta ccagtccacc 120 tgctccgccg tgtccaaggg ctacctgtcc gccctgcgga ccggctggta cacctccgtg 180 atcaccatcg agctgtccaa catcaaagaa aacaagtgca acggcaccga cgccaaggtc 240 aagctgatca agcaggaact ggacaagtac aagagcgccg tgaccgaact ccagctgctg 300 atgcagtcca cccctgccac caacaacaag aagtttctgg gcttcctgct gggcgtgggc 360 tccgccatcg cctccggcat cgccgtgagc aaggtgctgc acctggaggg cgaggtgaac 420 aagatcaaga gcgccctgct gtccaccaac aaggccgtgg tgtccctgtc caacggcgtg 480 tccgtgctga cctccaaggt gctggatctg aagaactaca tcgacaagca gctgctgcct 540 atcgtgaaca agcagtcctg ctccatctcc aacatcgaga ccgtgatcga gttccagcag 600 aagaacaacc ggctgctgga gatcacccgc gagttctccg tgaacgccgg cgtgaccacc 660 cctgtgtcca cctacatgct gacaaactcc gagctgctct ccctgatcaa cgacatgcct 720 atcaccaacg accaaaaaaa gctgatgtcc aacaacgtgc agatcgtgcg gcagcagtcc 780 tacagcatca tgagcatcat caaggaagaa gtcctggcct acgtcgtgca gctgcctctg 840 tacggcgtga tcgacacccc ttgctggaag ctgcacacct cccccctgtg caccaccaac 900 accaaagagg gctccaacat ctgcctgacc cggaccgacc ggggctggta ctgcgacaac 960 gccggctccg tgtccttctt ccctctggcc gagacctgca aggtgcagtc caaccgggtg 1020 ttctgcgaca ccatgaactc cctgaccctg ccttccgagg tgaacctgtg caacatcgac 1080 atcttcaacc ccaagtacga ctgcaagatc atgaccagca agaccgacgt gtcctccagc 1140 gtgatcacct ccctgggcgc catcgtgtcc tgctacggca agaccaagtg caccgcctcc 1200 aacaagaacc ggggaatcat caagaccttc tccaacggct gcgactacgt gtccaataag 1260 ggcgtggaca ccgtgtccgt gggcaacaca ctgtactacg tgaataagca ggaaggcaag 1320 agcctgtacg tgaagggcga gcctatcatc aacttctacg accctctggt gttcccttcc 1380 gacgagttcg acgcctccat cagccaggtc aacgagaaga tcaaccagtc cctggccttc 1440 atccggaagt ccgacgagaa gctgcataac gtggaggaca agatcgaaga gatcctgtcc 1500 aaaatctacc acatcgagaa cgagatcgcc cggatcaaga agctgatcgg cgaggctggc 1560 ggctctggcg gcagcggcgg ctccaagcag cggcagaaca agcctcctaa caagcccaac 1620 aacgacttcc acttcgaggt gttcaacttc gtgccttgct ccatctgctc caacaaccct 1680 acctgctggg ccatctgcaa gagaatcccc aacaagaagc ctggcaagaa aaccaccacc 1740 aagcctacca agaagcctac cttcaagacc accaagaagg accacaagcc tcagaccaca 1800 aagcctaagg aagtgccaac caccaagcac caccaccatc accactgata atcta 1855 <210> 8 <211> 605 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric PreF-G polypeptide <400> 8 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Thr Asn Ala Ile Thr Ala Ile Leu Ala 1 5 10 15 Ala Val Thr Leu Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 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cccctgccac caacaacaag aagtttctgg gcttcctgct gggcgtgggc 360 tccgccatcg cctccggcat cgccgtgagc aaggtgctgc acctggaggg cgaggtgaac 420 aagatcaaga gcgccctgct gtccaccaac aaggccgtgg tgtccctgtc caacggcgtg 480 tccgtgctga cctccaaggt gctggatctg aagaactaca tcgacaagca gctgctgcct 540 atcgtgaaca agcagtcctg ctccatctcc aacatcgaga ccgtgatcga gttccagcag 600 aagaacaacc ggctgctgga gatcacccgc gagttctccg tgaacgccgg cgtgaccacc 660 cctgtgtcca cctacatgct gacaaactcc gagctgctct ccctgatcaa cgacatgcct 720 atcaccaacg accaaaaaaa gctgatgtcc aacaacgtgc agatcgtgcg gcagcagtcc 780 tacagcatca tgagcatcat caaggaagaa gtcctggcct acgtcgtgca gctgcctctg 840 tacggcgtga tcgacacccc ttgctggaag ctgcacacct cccccctgtg caccaccaac 900 accaaagagg gctccaacat ctgcctgacc cggaccgacc ggggctggta ctgcgacaac 960 gccggctccg tgtccttctt ccctctggcc gagacctgca aggtgcagtc caaccgggtg 1020 ttctgcgaca ccatgaactc cctgaccctg ccttccgagg tgaacctgtg caacatcgac 1080 atcttcaacc ccaagtacga ctgcaagatc atgaccagca agaccgacgt gtcctccagc 1140 gtgatcacct ccctgggcgc catcgtgtcc tgctacggca agaccaagtg caccgcctcc 1200 aacaagaacc ggggaatcat caagaccttc tccaacggct gcgactacgt gtccaataag 1260 ggcgtggaca ccgtgtccgt gggcaacaca ctgtactacg tgaataagca ggaaggcaag 1320 agcctgtacg tgaagggcga gcctatcatc aacttctacg accctctggt gttcccttcc 1380 gacgagttcg acgcctccat cagccaggtc aacgagaaga tcaaccagtc cctggccttc 1440 atccggaagt ccgacgagaa gctgcataac gtggaggaca agatcgaaga gatcctgtcc 1500 aaaatctacc acatcgagaa cgagatcgcc cggatcaaga agctgatcgg cgaggctggc 1560 ggcaagcagc ggcagaacaa gcctcctaac aagcccaaca acgacttcca cttcgaggtg 1620 ttcaacttcg tgccttgctc catctgctcc aacaacccta cctgctgggc catctgcaag 1680 agaatcccca acaagaagcc tggcaagaaa accaccacca agcctaccaa gaagcctacc 1740 ttcaagacca ccaagaagga ccacaagcct cagaccacaa agcctaagga agtgccaacc 1800 accaagcacc accaccatca ccactgataa tcta 1834 <210> 10 <211> 598 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric PreF-G polypeptide <400> 10 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Thr Asn Ala Ile Thr Ala Ile Leu Ala 1 5 10 15 Ala Val Thr Leu Cys 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Glu Pro Ile Ile Asn Phe 435 440 445 Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser 450 455 460 Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser 465 470 475 480 Asp Glu Lys Leu His Asn Val Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser 485 490 495 Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile 500 505 510 Gly Glu Ala Gly Gly Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro 515 520 525 Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile 530 535 540 Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn 545 550 555 560 Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr 565 570 575 Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys 580 585 590 Glu Val Pro Thr Thr Lys 595 <210> 11 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isoleucine substituted GCN4 leucine zipper <400> 11 Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn 1 5 10 15 Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Ala 20 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gtgcgccagc agagctacag catcatgagc 780 atcatcaagg aggaggtgct ggcatacgtg gtgcagctgc cgctgtacgg cgtcatcgac 840 acgccctgct ggaagctgca cacgagcccg ctgtgcacga ccaacacgaa ggagggcagc 900 aacatctgcc tgacgcggac ggaccggggc tggtactgcg acaacgcggg cagcgtgagc 960 ttcttcccgc tcgcggagac gtgcaaggtg cagagcaacc gcgtcttctg cgacacgatg 1020 aacagcctga cgctgccgag cgaggtgaac ctgtgcaaca tcgacatctt caacccgaag 1080 tacgactgca agatcatgac gagcaagacc gatgtcagca gcagcgtgat cacgagcctc 1140 ggcgcgatcg tgagctgcta cggcaagacg aagtgcacgg cgagcaacaa gaaccgcggc 1200 atcatcaaga cgttcagcaa cggctgcgac tatgtgagca acaagggcgt ggacactgtg 1260 agcgtcggca acacgctgta ctacgtgaac aagcaggagg gcaagagcct gtacgtgaag 1320 ggcgagccga tcatcaactt ctacgacccg ctcgtgttcc cgagcgacga gttcgacgcg 1380 agcatcagcc aagtgaacga gaagatcaac cagagcctgg cgttcatccg caagagcgac 1440 gagaagctgc acaacgtgga ggacaagatc gaggagatcc tgagcaagat ctaccacatc 1500 gagaacgaga tcgcgcgcat caagaagctg atcggcgagg cgcatcatca ccatcaccat 1560 tga 1563 <210> 13 <211> 1685 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PreF polynucleotide sequence with intron <400> 13 atggagctgc tgatcctgaa aaccaacgcc atcaccgcca tcctggccgc cgtgaccctg 60 tgcttcgcct cctcccagaa catcaccgag gagttctacc agtccacctg ctccgccgtg 120 tccaagggct acctgtccgc cctgcggacc ggctggtaca cctccgtgat caccatcgag 180 ctgtccaaca tcaaggaaaa caagtgcaac ggcaccgacg ccaaggtgaa gctgatcaag 240 caggagctgg acaagtacaa gagcgccgtg accgaactcc agctgctgat gcagtccacc 300 cctgccacca acaacaagtt tctgggcttc ctgctgggcg tgggctccgc catcgcctcc 360 ggcatcgccg tgagcaaggt acgtgtcggg acttgtgttc cccttttttt aataaaaagt 420 tatatcttta atgttatata catatttcct gtatgtgatc catgtgctta tgactttgtt 480 tatcatgtgt ttaggtgctg cacctggagg gcgaggtgaa caagatcaag agcgccctgc 540 tgtccaccaa caaggccgtg gtgtccctgt ccaacggcgt gtccgtgctg acctccaagg 600 tgctggatct gaagaactac atcgacaagc agctgctgcc tatcgtgaac aagcagtcct 660 gctccatctc caacatcgag accgtgatcg agttccagca gaagaacaac cggctgctgg 720 agatcacccg cgagttctcc gtgaacgccg gcgtgaccac ccctgtgtcc acctacatgc 780 tgaccaactc cgagctgctg tccctgatca acgacatgcc tatcaccaac gaccagaaaa 840 aactgatgtc caacaacgtg cagatcgtgc ggcagcagtc ctacagcatc atgagcatca 900 tcaaggaaga ggtgctggcc tacgtggtgc agctgcctct gtacggcgtg atcgacaccc 960 cttgctggaa gctgcacacc tcccccctgt gcaccaccaa caccaaggag ggctccaaca 1020 tctgcctgac ccggaccgac cggggctggt actgcgacaa cgccggctcc gtgtccttct 1080 tccctctggc cgagacctgc aaggtgcagt ccaaccgggt gttctgcgac accatgaact 1140 ccctgaccct gccttccgag gtgaacctgt gcaacatcga catcttcaac cccaagtacg 1200 actgcaagat catgaccagc aagaccgacg tgtcctccag cgtgatcacc tccctgggcg 1260 ccatcgtgtc ctgctacggc aagaccaagt gcaccgcctc caacaagaac cggggaatca 1320 tcaagacctt ctccaacggc tgcgactacg tgtccaataa gggcgtggac accgtgtccg 1380 tgggcaacac actgtactac gtgaataagc aggagggcaa gagcctgtac gtgaagggcg 1440 agcctatcat caacttctac gaccctctgg tgttcccttc cgacgagttc gacgcctcca 1500 tcagccaggt gaacgagaag atcaaccagt ccctggcctt catccggaag tccgacgaga 1560 agctgcataa cgtggaggac aagatcgagg agatcctgtc caaaatctac cacatcgaga 1620 acgagatcgc ccggatcaag aagctgatcg gcgaggccgg aggtcaccac caccatcacc 1680 actga 1685 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic linker peptide <400> 14 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Furin cleavage consensus motif <400> 15 Arg Ala Arg Arg 1 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Furin cleavage consensus motif <400> 16 Arg Lys Arg Arg 1

Claims (87)

  1. 호흡기 합포체 바이러스 (RSV) F 단백질 폴리펩티드의 F2 도메인 및 F1 도메인을 포함하는 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 재조합 RSV 항원이며,
    여기서 상기 F2 도메인과 F1 도메인 사이에는 푸린 절단 부위가 없고, 상기 폴리펩티드가 F1 도메인에 대해 C-말단에 위치한 이종 삼량체화 도메인을 추가로 포함하는 것인 재조합 RSV 항원.
  2. 제1항에 있어서, F2 도메인이 서열 2의 기준 F 단백질 전구체 폴리펩티드 (F0)의 아미노산 26-105에 상응하는 아미노산을 포함하는 것인 재조합 RSV 항원.
  3. 제1항에 있어서, F1 도메인이 서열 2의 기준 F 단백질 전구체 폴리펩티드 (F0)의 아미노산 137-516에 상응하는 아미노산을 포함하는 것인 재조합 RSV 항원.
  4. 제2항에 있어서, F1 도메인이 서열 2의 기준 F 단백질 전구체 폴리펩티드 (F0)의 아미노산 137-516에 상응하는 아미노산을 포함하는 것인 재조합 RSV 항원.
  5. 제1항에 있어서, 서열 6을 포함하는 폴리펩티드인 재조합 RSV 항원.
  6. 제1항에 있어서, 신호 펩티드를 추가로 포함하는 재조합 RSV 항원.
  7. 제1항에 있어서, 이종 삼량체화 도메인이 코일드-코일(coiled-coil) 도메인을 포함하는 것인 재조합 RSV 항원.
  8. 제7항에 있어서, 이종 삼량체화 도메인이 이소루이신 지퍼(zipper)를 포함하는 것인 재조합 RSV 항원.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 1개 이상의 비-푸린 절단 부위의 결실,
    (ii) pep27 도메인의 1개 이상 아미노산의 결실, 및
    (iii) F 단백질 세포외 도메인의 소수성 도메인 내에서의 친수성 아미노산의 하나 이상의 치환 또는 부가
    를 포함하는 재조합 RSV 항원.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 RSV 항원, 및 제약상 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.
  11. 제9항의 재조합 RSV 항원, 및 제약상 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 담체 또는 부형제가 완충제를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 아주반트가 3D-MPL, QS21, 수중유 에멀션, 및 백반 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  15. 제10항에 있어서, 호흡기 합포체 바이러스 (RSV) 감염을 감소 또는 예방시키는 면역원성 조성물.
  16. 제10항에 있어서, RSV 이외의 병원성 유기체의 한 가지 이상의 부가 항원을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 RSV 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산.
  18. 제9항의 재조합 RSV 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산.
  19. 제17항에 있어서, RSV 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이, 선택된 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인 재조합 핵산.
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, F 단백질의 융합전 입체형태가 안정화되는 것인 재조합 RSV 항원.
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