CN109206491A - 猪伪狂犬病毒gD蛋白的制备方法及猪伪狂犬病毒亚单位疫苗和应用 - Google Patents

猪伪狂犬病毒gD蛋白的制备方法及猪伪狂犬病毒亚单位疫苗和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备猪伪狂犬病毒gD蛋白的方法及猪伪狂犬病毒亚单位疫苗和应用，所述疫苗包括(1)猪伪狂犬病毒gD蛋白，所述gD蛋白的浓度为30～200μg/头份；(2)猪GM‑CSF蛋白，所述GM‑CSF蛋白的浓度为10～80μg/头份；(3)药学上可以接受的佐剂。制备该疫苗中gD蛋白的方法包括：1)将密码子优化后的猪伪狂犬病毒gD蛋白基因克隆到真核表达载体中得到含有猪伪狂犬病毒gD蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有猪伪狂犬病毒gD蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞中；3)通过培养、筛选、驯化2)中所述的CHO细胞株得到高度表达的细胞株；4)发酵培养3)中所述的细胞株，纯化后得到重组猪伪狂犬病毒gD蛋白。该疫苗具有可工业化生产、成本低、质控容易、免疫效果好等优点。

Description

猪伪狂犬病毒gD蛋白的制备方法及猪伪狂犬病毒亚单位疫苗 和应用
技术领域
本发明不仅涉及一种猪伪狂犬病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用，还涉及一种稳定高效分泌表达猪伪狂犬病毒gD蛋白的CHO细胞株及其制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的猪的急性传染病。该病在猪呈暴发性流行。可引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。
目前该病的预防主要通过疫苗免疫，目前市场上流行的主要是第二代基因工程基因缺失疫苗。该疫苗除了在TK基因引入了一个缺失外，在非编码必需糖蛋白的基因内引入了一个新的缺失，或插入一个报告基因，这样得到的突变株就不能产生被缺失的糖蛋白，因而免疫动物就不能产生相应的抗体，因此可以通过血清学方法将免疫接种猪与自然感染野毒的猪相区别。这也是第二代基因缺失疫苗的最显著特点。另外，有些糖蛋白的缺失，可以进一步降低毒力。第一个申请专利并注册使用的PRV基因工程疫苗OM-NIVAC-PRV就是TK基因缺失疫苗。在我国，PRV Ea TK-株基础上构建了PRV Ea TK-/gG-、TK-/gE-疫苗株。但是该疫苗的缺点也是比较突出：基因缺失疫苗能否引起潜伏感染或被激活为感染性病毒令人担忧；基因缺失疫苗在动物体内与野毒或不同的基因缺失疫苗间发生基因重组而突变成强毒株，从而成为新的传染源，这种可能性是存在的；基因缺失疫苗在接种后也存在潜伏感染和排毒的问题。
伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属，病毒粒子为圆形，直径150～180nm，核衣壳直径为105～110nm。病毒粒子的最外层是病毒囊膜，它是由宿主细胞衍生而来的脂质双层结构。囊膜表面有长约8～10nm呈放射状排列的纤突。伪狂犬病毒基因组是线状双链DNA分子，大小约150kb，平均G+C含量高达74％，具有典型的疱疹病毒基因组结构特征，由独特长区段、独特短区段及位于US两侧的末端重复序列(TR)和内部重复序列(IR)组成。目前已发现11种PRV糖蛋白，其中，gB、gC、gD均为刺激机体产生中和抗体的蛋白，所产生的抗体无论是在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和PRV的能力，因此，gB、gC、gD是研制PRV亚单位疫苗的首选糖蛋白。亚单位疫苗的优点：不含有核酸物质因此比较安全；接种后不会产生持续感染或潜伏感染；产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。但是亚单位疫苗也有明显的缺陷：生产成本高，免疫原性不及弱毒疫苗及灭活疫苗，应用受到限制。
CHO细胞是1957年美国科罗拉多大学Theodore T.Puck博士从一成年雌性仓鼠卵巢中分离获得的，为上皮贴壁型细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，CHO细胞有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，且培养体积能达到1,000L以上，可以大规模生产。
CHO细胞类型较多，如：DG44、DXB11、CHO-K1和CHO-S等。自20世纪80-90年代开始，工业上较早使用的是DHFR(二氢叶酸还原酶缺陷型)基因扩增筛选系统，宿主细胞株为DG44。当细胞培养基内含有甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)时，二氢叶酸还原酶被抑制，再通过反馈调节，使得该基因进行扩增，且其上下游100-1,000kb范围内的基因都会随之扩增，因此将目的基因插入此位点范围内即可得到扩增。现在很多单抗生产的体系依然是DG44的DHFR体系。GS(谷氨酰胺合成酶)扩增系统，其以CHO-K1为宿主细胞，是近些年发展的一种新型基因扩增筛选系统，它比DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛的认可和使用。其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏谷氨酰胺的培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵(L-methioninesulfoximine，MSX)，可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要：(1)不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株作为宿主细胞；(2)CHO-K1细胞更强壮，易于培养；(3)在培养基中无需加入谷氨酰胺，避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，且有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。
本发明的发明人一开始使用CHO细胞表达gD蛋白时，发现gD蛋白的基因未经密码子优化时，CHO细胞基本不表达gD蛋白。因此，本发明的发明人注意到在使用CHO细胞表达gD蛋白时，密码子优化是一个必须的过程。
发明内容
本发明要解决的技术问题：一是提供一种可大规模工业化生产的猪伪狂犬病毒的亚单位疫苗的制备方法和应用；二是克服现有第二代基因工程基因缺失疫苗在使用过程中存在的缺陷，如基因缺失疫苗在接种后存在潜伏感染和排毒的问题；三是克服现有亚单位疫苗普遍存在的生产成本高、免疫原性不及弱毒疫苗及灭活疫苗的缺陷。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种制备猪伪狂犬病毒gD蛋白的方法，所述制备方法包括以下步骤：1)将密码子优化后的猪伪狂犬病毒gD蛋白基因克隆到真核表达载体中，得到含有猪伪狂犬病毒gD蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有猪伪狂犬病毒gD蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞中，得到CHO细胞株；3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述CHO细胞株得到高度表达的细胞株；4)发酵培养步骤3)中所述高度表达的细胞株，纯化后得到重组猪伪狂犬病毒gD蛋白。
本发明的技术方案中，优选地，所述密码子优化后的猪伪狂犬病毒gD蛋白编码基因如SEQ ID NO.1所示。
本发明的技术方案中，所述真核表达载体可以为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13、pcDNA3.1优选地，所述真核表达载体为pEE12.4。
本发明的技术方案中，所述CHO细胞可以为DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株，优选地，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
本发明的技术方案中，优选地，所述步骤4)中，发酵培养步骤3)中所述高度表达的细胞株时使用的培养基是CD-CHO和Ex-cell 302的混合培养基，所述混合培养基中CD-CHO和Ex-cell 302的体积比为6:4。
根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种猪伪狂犬病毒亚单位疫苗，该亚单位疫苗包括：(1)猪伪狂犬病毒gD蛋白，所述gD蛋白的浓度为30～200μg/头份；(2)猪GM-CSF蛋白，所述GM-CSF蛋白的浓度为10～80μg/头份；(3)药学上可以接受的佐剂。
本发明的技术方案中，优选地，所述猪伪狂犬病毒gD蛋白的浓度为50μg/头份～100μg/头份。
本发明的技术方案中，优选地，所述猪GM-CSF蛋白浓度为20μg/头份～40μg/头份。
本发明的技术方案中，所述药学上可以接受的佐剂可以为水佐剂(如铝胶佐剂)、水包油佐剂、油包水佐剂、水包油包水佐剂，优选地所述药学上可以接受的佐剂为ISA201VG。
本发明的技术方案中，优选地，所述ISA 201VG佐剂与抗原相的重量比为1:1，所述抗原相为所述猪伪狂犬病毒gD蛋白和所述猪GM-CSF蛋白。
根据本发明的第三方面，本发明再提供了一种猪伪狂犬病毒gD蛋白和猪伪狂犬病毒重组亚单位疫苗在制备及相关诊断试剂中的应用。
本发明提供的猪伪狂犬病毒亚单位疫苗能够诱导猪产生良好的免疫反应，免疫效果与现有的市场苗相当甚至更好，该疫苗不仅具有亚单位疫苗本身所具有的优点，如不含有核酸物质，因此比较安全；接种后不会产生持续感染或潜伏感染；产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。还克服了现有亚单位疫苗普遍存在的免疫原性不及弱毒疫苗及灭活疫苗的缺陷。另外还克服了现有第二代基因工程基因缺失疫苗在使用过程中存在的缺陷，如基因缺失疫苗在接种后存在潜伏感染和排毒的问题。
本发明构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达猪伪狂犬病毒gD蛋白的CHO细胞株，该细胞株表达gD蛋白产量高(产量高达2-3g/L)、易于纯化(如图4所示，细胞培养上清中的目的蛋白纯度都能达到70％以上，只要简单的过一个镍柱纯化就能使目的蛋白纯度达到90％以上，远远满足亚单位疫苗制备的需求)、易于大规模生产。因此，不仅解决了亚单位疫苗存在的另一个缺陷，即生产成本高的问题，还解决了大规模工业化生产猪伪狂犬病毒亚单位疫苗的问题。另外，由于生产该亚单位疫苗中核心成分gD蛋白时使用的是细胞株，该细胞株在培养时可控制性高、质控容易、定量简单，因此使用该方法生产的亚单位疫苗还具有以下优点：可大规模工业化生产、供量充足、质控容易；批次间稳定；生产中生物安全控制容易(没有病毒，不存在散毒的风险)。
附图说明
图1表示pEE12.4-OPTI-gD质粒图；
图2表示pEE12.4-OPTI-gD双酶切鉴定结果：1：SpeI/EcoRI双酶切，骨架大小约7197bp，片段大小约2632bp，酶切正确；M:DL10,000；
图3表示表达PRV-gD蛋白的CHO-K1单克隆细胞株发酵上清培养基蛋白检测：1为Marker；2为1μg的阳性对照蛋白；3为3H8株单独利用Ex-cell302培养基发酵时的发酵上清检测结果；4为3H8株利用60％的CD-CHO和40％的Ex-cell 302混合培养基时的发酵上清检测结果；5为5G3株单独利用Ex-cell302培养基发酵时的发酵上清检测结果；6为5G3株利用60％的CD-CHO和40％的Ex-cell 302混合培养基时的发酵上清检测结果；7为7G11株单独利用Ex-cell302培养基发酵时的发酵上清检测结果；8为7G11株利用60％的CD-CHO和40％的Ex-cell 302混合培养基时的发酵上清检测结果；9为7D2株单独利用Ex-cell302培养基发酵时的发酵上清检测结果；10为7D2株利用60％的CD-CHO和 40％的Ex-cell 302混合培养基时的发酵上清检测结果；11为4C2株单独利用Ex-cell302培养基发酵时的发酵上清检测结果；12为4C2株利用60％的CD-CHO和 40％的Ex-cell 302混合培养基时的发酵上清检测结果；13为6A3株单独利用Ex-cell302培养基发酵时的发酵上清检测结果；14为6A3株利用60％的CD-CHO和40％的Ex-cell 302混合培养基时的发酵上清检测结果；
图4表示蛋白纯化结果：M为Marker；上清为细胞发酵(培养)上清检测结果；流穿为细胞上清流穿后检测结果；20mM为20mM咪唑洗脱后检测结果；250mM为250mM咪唑洗脱后检测结果；500mM为500mM咪唑洗脱后检测结果；
图5表示免疫后猪只抗体效价检测结果；
图6表示密码子优化前PRV-gD蛋白核苷酸序列与密码子优化后的PRV-gD蛋白核苷酸序列比对结果：OPTI-PRV gD表示密码子优化后的PRV-gD蛋白核苷酸序列；PRV gD表示密码子优化前的PRV-gD蛋白核苷酸序列。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本发明试剂及药品的来源列单如下：
CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；
细胞培养基和血清均购自美国gibco公司；
真核表达载体pEE12.4购自上海林渊生物科技有限公司；
Lipofectamine LTX购自美国Thermo Fisher公司；
甲硫氨酸亚砜亚铵((L-methioninesulfoximine，MSX))购于Sigma公司；
BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；
ISA 201VG购自法国赛比克公司。
实施例1：猪伪狂犬病毒gD蛋白密码子优化及pEE12.4-OPTI-gD重组质粒构建
通过对猪伪狂犬病毒gD蛋白核苷酸序列进行密码子优化，得到OPTI-gD序列，如SEQ ID NO.1所示，该工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
将优化后的序列与优化前的序列(如SEQ ID NO.2所示)进行比对，发现有214个核苷酸不同，约21％(214/1020)的核苷酸不同。具体见图6所示。
实施例2：pEE12.4-OPTI-gD重组质粒构建
2.1PCR扩增目的片段OPTI-gD
2.1.1PCR反应
(1)引物设计及合成
上游引物:5’-CGGAAGCTTATG GCTGACGTGGATGCTGTGCCTG-3’
下游引物:5’-GGCGAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATG-3’
(2)加样体系50μL，如下表所示：
PCR扩增程序：
2.1.2PCR产物进行胶回收
(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；
(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；
(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；
(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；
(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
(8)重复步骤(7)；
(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；
(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；
(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；
(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。
2.2PCR产物及载体双酶切反应
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系
(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。
双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.2.1中PCR产物胶回收。
2.3连接反应
(1)准备洁净的1.5mL EP管若干，做好标记，置于EP管架上待用。
(2)在1.5mL EP管按照下表进行加样、混匀。
(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；
(4)取出步骤(3)中EP管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；
(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存。
2.4转化反应
(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；
(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；
(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；
(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。
(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；
(6)观察转化结果。
2.5质粒抽提与双酶切鉴定
2.5.1质粒抽提
(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；
(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；
(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体；
(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；
(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入30μL Elutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。
2.5.2双酶切鉴定
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样：20μL反应体系
(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。
(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图2：酶切鉴定构建正确。
(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。
2.6无内毒素质粒大提
2.6.1无内毒素质粒提取
(1)测序正确的克隆接种至100mL含氨苄抗性的培养基中，于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养15h；
(2)将步骤(1)中培养的菌液转移至50mL离心管中，室温8,000rpm/min、离心5min，收集菌体，弃掉上清培养基；
(3)向步骤(2)的离心管中加入8mL溶液P1，用移液器充分重悬菌体；
(4)向步骤(3)的离心管中加入8mL溶液P2，立即温和颠倒离心管6-8次，室温静置5min；
(5)向步骤(4)的离心管中加入8mL溶液P4，立即上下颠倒6-8次，充分混匀至溶液出现白色絮状沉淀，室温放置10min左右。8,000rpm/min室温离心5-10min，使白色沉淀离至管底；
(6)将步骤(5)中上清液全部小心移入过滤器CS1中，慢慢推柄过滤器，滤液收集在干净的50mL离心管中；
(7)柱平衡：向吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(8)向步骤(6)滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中。室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP6重新放入同一个收集管中；
(9)向步骤(8)吸附柱CP6中加入10mL漂洗液PW，室温8,000rpm/min离心2min，弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(10)重复操作步骤(9)一次；
(11)向步骤(10)吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉废液；
(12)将步骤(11)吸附柱CP6重新放回收集管中，室温8,000rpm/min离心5min。将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟晾干；
(13)将步骤(12)中吸附柱放入干净的50mL离心管中，在吸附膜中央加入1-2mL缓冲液TB，室温静置5min，室温8,000rpm/min离心2min，将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，测浓度，-20℃保存。
(14)取1-2μL所得到的质粒DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳并保存电泳结果数据。
实施例3：pEE12.4-OPTI-gD重组质粒转染CHO-K1细胞与单克隆筛选的建立
3.1CHO-K1细胞转染
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)、DMEM/F12与PBS置于37℃水浴锅预热至37℃。
(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mLPBS洗细胞一次，并弃去PBS。
(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。
(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。
(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。
(6)用DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。
(7)稀释细胞至2×105个/mL，取2mL混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育过夜。
(8)取出步骤(7)细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12，2mL/孔。
(9)稀释质粒：用OPTI-MEM稀释质粒，125μL OPTI-MEM中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μL plus，混匀，室温静置5min。
(10)稀释Lipofectamine LTX：125μL OPTI-MEM中加入9μL Lipofectamine LTX，然后加入2.5μL plus，轻轻混匀，室温静置5min。
(11)将步骤(10)和步骤(11)混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。
(12)将六孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养4-6h。
(13)换液：弃掉上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
3.2加压筛选
转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mLDMEM/F12(含10％血清和25μM MSX)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。
3.3单克隆筛选
(1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7days，开始单克隆筛选。
(2)取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清和25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。
(3)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。
(4)用DMEM/F12(含10％血清和25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。
(5)铺板：稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4-6h。
(6)记录单个细胞的孔。
(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入100μL0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清和25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。
实施例4：CHO-K1细胞株驯化成悬浮培养
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)置于37℃水浴锅中预热至37℃。
(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mLPBS洗细胞一次，并弃去PBS。
(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。
(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散。
(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。
(6)用100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)悬浮细胞，计数。
(7)稀释细胞至5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。
(8)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。
(9)每隔24h计数细胞密度及活力。
(10)待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养。
(11)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)，EX-CELL 302置于CO2细胞培养箱中预热至37℃。
(12)从37℃培养箱中取出细胞转移至50mL离心管中，常温200g离心5min。
(13)将DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)和EX-CELL 302按1：1混合，重新悬浮细胞，计数。
(14)稀释细胞至5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。
(15)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。
(16)每隔24h计数细胞密度及活力。
(17)第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×106个细胞/mL，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×105个/mL。
(18)经驯化，3H8，5G3，7G11，7D2、4C2和6A3单克隆细胞株均满足要求，表明驯化成功。
实施例5：细胞摇瓶发酵
(1)优化发酵培养基：单独利用Ex-cell302或60％的CD-CHO和40％的Ex-cell302混合的培养基对上述6种细胞进行摇瓶发酵验证。单独利用Ex-cell302发酵的细胞编号为3H8，5G3，7G11，7D2，4C2，6A3；利用60％的CD-CHO和40％的Ex-cell302混合培养基发酵的单克隆细胞株编号为3H8-C，5G3-C，7G11-C，7D2-C，4C2-C，6A3-C。
(2)从CO2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。
(3)稀释细胞至2.5-3.5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。
(4)每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当血糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。
(5)补料(约第四天)：补充79.6g/L CD Efficient Feed C AGT，添加基础培养基的10％。
(6)第5天开始，将CO2培养箱温度调整至32℃。
(7)第九天，补充79.6g/L CD Efficient Feed C AGT，添加基础培养基的10％。
(8)第十二天，收获细胞上清。
(9)SDS-PAGE检测单克隆细胞株PRV-gD蛋白的表达水平。如图3所示，泳道1为Marker，泳道2为1μg的阳性对照蛋白，其他为利用上述两种不同培养基发酵的单克隆细胞株培养上清。其中6A3-C(利用60％的CD-CHO和40％的Ex-cell 302混合培养基发酵，其中60％和40％为体积比)的猪伪狂犬病毒gD蛋白产量最高，初步估算，其表达产量高达2-3g/L，适合大规模生产所需。其中60％的CD-CHO和40％的Ex-cell 302混合培养基比单独使用Ex-cell 302培养基发酵产量要高。
实施例6：蛋白纯化
(1)取GE excle填料4ml，用BufferA(20mM NaH2PO4，500mM NaCl，0.05％Tween 20，pH 7.4)平衡5个柱体积；
(2)将4ml填料加入到细胞上清中，于滚瓶机上4℃混匀1h；
(3)将填料和细胞上清转移到空层析柱中，流穿细胞上清；
(4)洗涤：用含20mM咪唑的BufferA洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。
(5)洗脱：用含250mM咪唑的BufferA洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。
(6)洗涤：用含500mM咪唑的BufferA洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。
(7)透析换液：将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1×PBS透析至少1,000倍，取80μl留样检测。
(8)图4所示为6A3单克隆细胞株上清猪伪狂犬病毒gD蛋白纯化检测结果。
(9)蛋白浓度和纯度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，6A3、4C2和7D2单克隆细胞株蛋白得率约为1.5-3g/L；采用HPLC方法检测纯度，纯度都能达到90％以上。
实施例7猪GM-CSF蛋白制备
猪GM-CSF蛋白的制备具体参照本申请人申请的申请号为201710343196.8的发明专利申请文件的制备方法。
实施例8：疫苗制备与免疫实验
8.1疫苗制备
将适量CHO-K1细胞表达的猪伪狂犬病毒gD蛋白和猪GM-CSF蛋白加入到ISA201VG佐剂中(抗原相和佐剂重量比为1:1，其中，抗原相为CHO-K1细胞表达的猪伪狂犬病毒gD蛋白和猪GM-CSF蛋白)，乳化、质检合格后置于4℃保存；具体疫苗信息如下表所示：
8.2免疫实验
筛选4-5周龄小猪65头(PRV抗原抗体阴性)，随机分成10组，每组5头，一组为对照组，对照组猪肌肉注射1ml PBS；一组作为市场苗免疫对照组，免疫市场苗(基因缺失苗)，在一免3周后加强免疫一次；剩余11组作为亚单位疫苗免疫组，免疫组猪依次分别肌肉注射8.1制备的疫苗1-疫苗11，免疫2次，间隔3周加强免疫一次。分别在免疫前、二免前和二免后14天采集血清，检测抗体效价。结果如图5所示：1)从疫苗1-疫苗4的效价变化来看，随着gD蛋白浓度的增加，效价有所增加，但是增加的幅度不大；2)从疫苗2、疫苗5-疫苗8的效价变化来看，含有猪GM-CSF蛋白的疫苗(疫苗5-疫苗8)无论是在一免后还是在二免后，效价的高度明显比不含有猪GM-CSF蛋白的疫苗(疫苗2)要高且都能达到或高于市场苗免疫后的效价水平，但是随着猪GM-CSF蛋白浓度的增加，效价增加的幅度并不明显；3)从疫苗1与疫苗9、或疫苗3与疫苗10、或疫苗4与疫苗11的效价变化来看，含有猪GM-CSF蛋白的疫苗(疫苗9、疫苗10、疫苗11)的效价明显要比不含猪GM-CSF蛋白的疫苗(疫苗1、疫苗3、疫苗4)的效价要高；3)总体来说，12组疫苗免疫后都能产生良好的抗体效价，且在二免后效价都能达到28000或以上，11组亚单位疫苗在二免后的抗体效价水平与市场苗相当或更高，另外，含有猪GM-CSF蛋白的疫苗的效价明显要比不含猪GM-CSF蛋白的疫苗的效价要高，这说明加入猪GM-CSF蛋白后能够明显提高该亚单位疫苗的免疫效果。
8.3ELISA检测抗体效价
(1)包被：用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5)稀释纯化的gD蛋白至2μg/ml，在酶标板上每孔加入100μl，封口膜封好后4℃冰箱放置过夜；
(2)洗涤：从冰箱取出酶标板后，放入洗板机中洗涤，洗涤液用PBST；
(3)封闭：每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；
(4)样品准备：按已知的信息和需要用量，用封闭液将血清进行适度稀释；
(5)洗涤：同(2)；
(6)加样：加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37℃孵育1h；
(7)洗涤：同(2)；
(8)加二抗：每孔加入适度稀释的HRP标记的二抗100μl，37℃孵育0.5h；
(9)洗涤：同(2)；
(10)显色：避光条件下每孔加入100μl的TMB显色液，37℃孵育10min；
(11)终止：每孔加入50μl终止液(2M H2SO4)，终止反应；
(12)检测：于450nm波长测定样品OD值，分析数据；
(13)结果分析：判断抗体阳性的标准：P/N≥2.1，OD450≥0.1。
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。
序 列 表
<110> 浙江海隆生物科技有限公司
<120> 猪伪狂犬病毒gD蛋白的制备方法及猪伪狂犬病毒亚单位疫苗和应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1020
<212> DNA
<213> 密码子优化后的PRV gD基因序列
<400> 1
atggctgacg tggatgctgt gcctgctcca accttcccac ctccagctta cccatatacc 60
gagagctggc agctgacact gaccacagtg ccctctcctt ttgtgggacc agctgacgtg 120
taccacacaa ggccactgga ggatccatgc ggagtggtgg ctctgatctc tgacccccag 180
gtggatagac tgctgaacga ggctgtggct cacaggcggc ctacctacag ggctcatgtg 240
gcctggtatc ggatcgctga cggctgtgcc catctgctgt acttcatcga gtatgctgac 300
tgcgatccta gacagatctt tggccgctgt agacgcagga ccacacctat gtggtggacc 360
ccatccgccg actacatgtt ccctacagag gatgagctgg gcctgctgat ggtggctcca 420
ggcaggttta acgagggcca gtatcggaga ctggtgagcg tggacggcgt gaatatcctg 480
accgatttca tggtggccct gccagaggga caggagtgcc cttttgctag ggtggaccag 540
caccggacat acaagttcgg cgcctgttgg tccgacgata gctttaagag aggcgtggat 600
gtgatgcgct tcctgacccc tttttatcag cagccccctc atcgggaggt ggtgaactac 660
tggtatcgca agaatggaag gaccctgcca agggcttacg ctgctgctac accctatgct 720
atcgacccag ctagaccttc tgctggatcc ccaaggccaa ggcctaggcc aagaccaagg 780
cctaggccaa agccagagcc tgctccagct accccagctc caccaggcag actgccagag 840
cctgctacaa gggatcacgc tgctggaggc aggccaaccc caaggcctcc aagaccagag 900
acaccacata ggcctttcgc tccacctgct gtggtgcctt ccggatggcc tcagccagcc 960
gagccatttc cacccaggac cacagctgcc cccggcgtgc atcaccatca ccatcactaa 1020
<210> 2
<211> 1020
<212> DNA
<213> 密码子优化前的PRV gD基因序列
<400> 1
atggcggacg tggacgccgt gcccgcgccg accttccccc cgcccgcgta cccgtacacc 60
gagtcgtggc agctgacgct gacgacggtc ccctcgccct tcgtcggccc cgcggacgtc 120
taccacacgc gcccgctgga ggacccgtgc ggggtggtgg cgctgatctc cgacccgcag 180
gtggaccggc tgctgaacga ggcggtggcc caccggcggc ccacgtaccg cgcccacgtg 240
gcctggtacc gcatcgcgga cgggtgtgcg cacctgctgt actttatcga gtacgccgac 300
tgcgacccca ggcagatctt tgggcgctgc cggcgccgca ccacgccgat gtggtggacc 360
ccgtccgcgg actacatgtt ccccacggag gacgagctgg ggctgctcat ggtggccccg 420
gggcggttca acgagggcca gtaccggcgc ctggtgtccg tcgacggcgt gaacatcctc 480
accgacttca tggtggcgct ccccgagggg caagagtgcc cgttcgcccg cgtggaccag 540
caccgcacgt acaagttcgg cgcgtgctgg agcgacgaca gcttcaagcg gggcgtggac 600
gtgatgcgat tcctgacgcc gttctaccag cagcccccgc accgggaggt ggtgaactac 660
tggtaccgca agaacggccg gacgctcccg cgggcctacg ccgccgccac gccgtacgcc 720
atcgaccccg cgcggccctc ggcgggctcg ccgaggccca ggccccggcc ccggcccagg 780
ccccggccga agcccgagcc cgccccggcg acgcccgcgc cccccggccg cctgcccgag 840
ccggcgacgc gggaccacgc cgccgggggg cgccccacgc cgcgaccccc gaggcccgag 900
acgccgcacc gccccttcgc cccgccggcc gtcgtgccca gcgggtggcc gcagcccgcg 960
gagccgttcc cgccccggac caccgccgcg ccgggcgtcc atcaccatca ccatcactaa 1020
<210> 3
<211> 339
<212> PRT
<213> PRV gD蛋白序列
<400> 1
Met Ala Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Thr Phe Pro Pro Pro Ala
1 5 10 15
Tyr Pro Tyr Thr Glu Ser Trp Gln Leu Thr Leu Thr Thr Val Pro Ser
20 25 30
Pro Phe Val Gly Pro Ala Asp Val Tyr His Thr Arg Pro Leu Glu Asp
35 40 45
Pro Cys Gly Val Val Ala Leu Ile Ser Asp Pro Gln Val Asp Arg Leu
50 55 60
Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro Thr Tyr Arg Ala His Val
65 70 75 80
Ala Trp Tyr Arg Ile Ala Asp Gly Cys Ala His Leu Leu Tyr Phe Ile
85 90 95
Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg Gln Ile Phe Gly Arg Cys Arg Arg
100 105 110
Arg Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Phe Pro
115 120 125
Thr Glu Asp Glu Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg Phe Asn
130 135 140
Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val Asn Ile Leu
145 150 155 160
Thr Asp Phe Met Val Ala Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys Pro Phe Ala
165 170 175
Arg Val Asp Gln His Arg Thr Tyr Lys Phe Gly Ala Cys Trp Ser Asp
180 185 190
Asp Ser Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Met Arg Phe Leu Thr Pro Phe
195 200 205
Tyr Gln Gln Pro Pro His Arg Glu Val Val Asn Tyr Trp Tyr Arg Lys
210 215 220
Asn Gly Arg Thr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Ala Ala Thr Pro Tyr Ala
225 230 235 240
Ile Asp Pro Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro Arg Pro Arg
245 250 255
Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Pro Gly Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg Asp His Ala Ala
275 280 285
Gly Gly Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro Glu Thr Pro His Arg
290 295 300
Pro Phe Ala Pro Pro Ala Val Val Pro Ser Gly Trp Pro Gln Pro Ala Glu
305 310 315 320
Pro Phe Pro Pro Arg Thr Thr Ala Ala Pro Gly Val His His His His His
325 330 335
His

Claims (10)

1.一种猪伪狂犬病毒gD蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)将密码子优化后的猪伪狂犬病毒gD蛋白基因克隆到真核表达载体中，得到含有猪伪狂犬病毒gD蛋白编码基因的重组质粒；
2)再将所述重组质粒转染至CHO细胞中，得到CHO细胞株；
3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述CHO细胞株，得到高度表达的细胞株；
4)发酵培养步骤3)中所述高度表达的细胞株，纯化后得到重组猪伪狂犬病毒gD蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述密码子优化后的猪伪狂犬病毒gD蛋白编码基因如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真核表达载体为pEE12.4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，发酵培养步骤3)中所述高度表达的细胞株时使用的培养基是CD-CHO和Ex-cell 302的混合培养基，所述混合培养基中CD-CHO和Ex-cell 302的体积比为6:4。
6.一种猪伪狂犬病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒亚单位疫苗包括：
(1)含有由权利要求1～5任一所述的方法制备的猪伪狂犬病毒gD蛋白，所述猪伪狂犬病毒gD蛋白的浓度为30～200μg/头份；
(2)猪GM-CSF蛋白，所述猪GM-CSF蛋白的浓度为10～80μg/头份；以及
(3)药学上可接受的佐剂。
7.根据权利要求6所述的猪伪狂犬病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒gD蛋白的浓度为50μg/头份～100μg/头份。
8.根据权利要求6所述的猪伪狂犬病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述猪GM-CSF蛋白浓度为20μg/头份～40μg/头份。
9.根据权利要求6所述的猪伪狂犬病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述药学上可接受的佐剂为ISA 201VG，所述ISA 201VG与抗原相的重量比为1:1，所述抗原相为所述猪伪狂犬病毒gD蛋白和所述猪GM-CSF蛋白。
10.一种根据权利要求1～9任一所述的猪伪狂犬病毒gD蛋白和猪伪狂犬病毒亚单位疫苗在制备及相关诊断试剂中的应用。
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