CN108822191A - 猪流行性腹泻病毒s蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法和应用。该疫苗包含30～200μg重组猪流行性腹泻病毒S蛋白以及药学上可接受的ISA 201VG佐剂。其制备方法包括以下步骤：(1)重组猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的克隆；(2)重组猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达和纯化；(3)将(2)中制备的重组猪流行性腹泻病毒S蛋白制备成水相；(4)将水相与ISA 201VG佐剂按照体积比46:54的比例乳化，得到疫苗。该疫苗安全性高、免疫原性好、批次间稳定、生产成本低、免疫原性强；另一方面首次成功构建并筛选了悬浮稳定高效表达PEDV‑S蛋白的CHO细胞株，该细胞株表达PEDV‑S蛋白产量高，其产量能够达到1g/L，表达的PEDV‑S蛋白易于纯化。

Description

猪流行性腹泻病毒S蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒S蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法，以及一种悬浮稳定高效表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的CHO细胞株及构建、筛选该细胞株的方法，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要症状的肠道传染病。该病对各种年龄阶段的猪均易感，尤其是7日龄以内的哺育仔猪，感染后死亡率高达50％-90％。近几年，该病在我国的发病率、死亡率均呈上升趋势，给养猪行业造成了重大经济损失。
PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属1群，具有典型的冠状病毒形态。PEDV粒子为多型性，倾向球状，外周包裹有囊膜，囊膜上还覆有放射状纤突，直径平均约为130nm。S蛋白为伸出病毒颗粒囊膜的20nm球杆形糖蛋白，分子量约为180-220kDa，约由1383个氨基酸组成，该蛋白富含半胱氨酸，含有29个潜在N-糖基化位点，但是N-糖基化位点在病毒粒子成熟后不能被蛋白酶切割，大大降低了该病毒的细胞融合力和感染力，这也是PEDV人工细胞培养困难的重要原因之一。根据PEDV与其它冠状病毒S蛋白的保守序列的相似性，将PEDV S蛋白划分为S1(1-789aa)和S2(790-1383aa)两个结构域，其中S1位于病毒表面，主要作用在于识别受体并与宿主细胞受体相结合，并介导中和抗体的产生。S2主要负责病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，并将病毒RNA导入宿主细胞内，从而引起细胞的感染。另外，PEDV S蛋白也是诱导宿主体液免疫反应的免疫原蛋白。因此，PEDV S蛋白是目前研发基因工程亚单位疫苗的候选蛋白。
目前市场上用于预防、控制猪流行性腹泻的疫苗基本都是传统PEDV弱毒苗和灭活疫苗。但是灭活疫苗存在自身免疫保护力较弱，且存在灭活不完全，造成散毒的风险；弱毒活疫苗存在毒株毒力返强的风险。随着分子生物学技术的飞速发展和研究的不断深入，研究者开始将PEDV疫苗的研发方向转为具有潜在优势的基因工程疫苗，该疫苗具有安全、高效、副作用小、表达量高、可工业化生产等优点。近年来，有很多研究集中在PEDV S1蛋白的表达和疫苗研究(如中国专利申请号为201610348237.8的发明专利中使用昆虫杆状病毒表达S1区21-789位的蛋白)，以及将S蛋白的核心区域的串联表达(如中国专利申请号为201610256701.0的发明专利中使用大肠杆菌串联表达S蛋白的3个核心区域)。这主要是因为PEDV S蛋白过大(约1383aa)，无论是基因克隆还是蛋白表达制备，在分子生物学的技术层面上都是比较难以实现的。但是仅仅使用截短或者不完全的PEDV蛋白作为抗原，存在抗原表位不全、整体免疫原性相对全长较差等不足之处，可能导致免疫保护力度不够。另外，目前的表达系统大部分选择原核或昆虫杆状病毒表达系统，普遍存在着翻译后没有糖基化修饰或者糖基化修饰不够，从而使表达后蛋白的免疫原性不及病毒颗粒本身的蛋白，可能导致保护力度不足。
CHO细胞是1957年美国科罗拉多大学Theodore T.Puck博士从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得的，为上皮贴壁型细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，CHO细胞有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白基因的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游蛋白产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，且培养体积能达到1,000L以上，可以大规模生产。
CHO细胞类型较多，如：DG44、DXB11、CHO K1和CHO-S等。自20世纪80-90年代开始，工业上较早使用的是DHFR(二氢叶酸还原酶缺陷型)基因扩增筛选系统，宿主细胞株为DG44。当细胞培养基内含有甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)时，二氢叶酸还原酶被抑制，再通过反馈调节，使得该基因进行扩增，且其上下游100-1,000kb范围内的基因都会随之扩增，因此将目的基因插入此位点范围内即可得到扩增。现在很多单抗生产的体系依然是DG44的DHFR体系。GS(谷氨酰胺合成酶)扩增系统，其以CHO-K1为宿主细胞，是近些年发展的一种新型基因扩增筛选系统，它比DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛的认可和使用。其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏谷氨酰胺的培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵(L-methioninesulfoximine，MSX)，可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要：(1)不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株作为宿主细胞；(2)CHO-K1细胞更强壮，易于培养；(3)在培养基中无需加入谷氨酰胺，避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，且有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。
但是，本发明的发明人一开始使用CHO细胞表达PEDV-S蛋白时，发现PEDV-S蛋白的基因未经优化时，CHO细胞基本不表达PEDV-S蛋白。因此，本发明的发明人注意到在使用CHO细胞表达PEDV-S蛋白时，基因序列的优化是一个需要亟待解决的课题。
发明内容
本发明要解决的技术问题一是为了提供一种可大规模、工业化生产猪流行性腹泻病毒S蛋白、亚单位疫苗及其制备方法；二是为了克服目前难以在哺乳动物细胞中高效表达PEDV S蛋白全长的难题；三是为了克服目前灭活疫苗和弱毒疫苗在防控猪流行性腹泻方面的缺陷和风险。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白由SEQ ID NO2所示的氨基酸组成的蛋白质；或者由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原性的衍生蛋白。优选地，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白是由CHO细胞表达的含有高度糖基化的蛋白质，所述糖基化的蛋白质的分子量约占所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的33.3％。
本发明的技术方案中，优选地，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白在SDS-PAGE中的分子量为210kDa。
本发明的技术方案中，优选地，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白去除糖基化后在SDS-PAGE中的分子量为140kDa。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白亚单位的疫苗，所述疫苗包含30～200μg如权利要求1～3任一所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白以及药学上可接受的ISA 201 VG佐剂。
本发明的技术方案中，优选地，所述药学上可以接受的佐剂为水包油佐剂(如ISA28 VG佐剂等)、水包油包水佐剂(如ISA 206 VG佐剂等)、油包水佐剂(如ISA 660 VG佐剂等)、水佐剂(如铝胶佐剂、IMS 251C VG佐剂等)，优选地为ISA 201 VG佐剂。
本发明的技术方案中，所述疫苗还含有免疫增强剂；优选地，所述免疫增强剂为Quil-A；优选地，所述Quil-A的浓度为300～500μg/头份，优选地，Quil-A的浓度为400μg/头份。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种制备猪流行性腹泻病毒S蛋白亚单位疫苗的方法，该方法包括以下步骤：(1)猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因的克隆；所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因的克隆包括以下步骤：1-1)对猪流行性腹泻病毒S蛋白的核苷酸序列进行密码子优化，得到OPTI-S；1-2)将OPTI-S克隆到真核表达载体中，得到重组质粒；(2)重组猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达和纯化；所述重组猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达和纯化包括以下步骤：2-1)将含有猪流行性腹泻病毒S蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞株中；2-2)通过培养、筛选、驯化步骤2-1)中所述CHO细胞株得到高度表达的细胞株；2-3)发酵培养步骤2-2)中所述的细胞株，纯化后得到重组猪流行性腹泻病毒S蛋白；(3)将步骤(2)中制备的重组猪流行性腹泻病毒S蛋白制备成水相；(4)将水相与作为油相的ISA 201VG佐剂按照体积比46:54的比例乳化，得到疫苗。
本发明的技术方案中，优选地，所述水相还包括免疫增强剂；优选地，所述免疫增强剂为Quil-A，所述Quil-A的浓度为400μg/头份。
本发明的技术方案中，优选地，所述OPTI-S的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的技术方案中，优选地，所述真核表达载体可以为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13、pcDNA3.1优选地，所述真核表达载体为pEE12.4。
本发明的技术方案中，优选地，所述CHO细胞可以为DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株，优选地，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白在制备猪流行性腹泻病毒S蛋白重组亚单位疫苗及相关诊断试剂中的应用。
本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白重组亚单位疫苗在制备用于预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。
本发明的实施例中，纯化后的PEDV-S蛋白的分子量约为210kDa；但用去糖基化酶消化PEDV-S蛋白后，发现去除糖基化后的PEDV-S蛋白分子量仅约为140kDa左右，这与通过S蛋白的氨基酸序列分析的S蛋白的分子量一致，约143kDa。这个结果说明，使用我们的CHO真核表达系统表达出来的PEDV-S蛋白有大量的糖基化修饰，糖基化修饰约占整个PEDV-S蛋白分子量的33.3％。
本发明的实施例中，纯化后的PEDV-S蛋白在去糖基化后，使用PEDV猪高免血清进行Werstern blot检测时，发现去糖基化后的PDEV-S蛋白不能与之结合或者结合很弱，这说明PEDV-S蛋白的糖基化是PDEV-S蛋白保持免疫原性所必不可少的。
本发明一方面第一次明确提出了使用PEDV-S蛋白制备的亚单位疫苗，该疫苗除具有安全性高、免疫原性好、批次间稳定、生产成本低等优点外，还克服了现有技术中仅仅使用截短或者不完全的PEDV-S蛋白作为抗原，从而可能存在的抗原表位不全、整体免疫原性相对要差的缺点；另一方面第一次成功构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的CHO细胞株，该细胞株表达猪流行性腹泻病毒S蛋白产量高，其产量能够达到1g/L，表达的猪流行性腹泻病毒S蛋白易于纯化(只需要从细胞上清中就可以纯化目的蛋白，因为细胞上清中杂蛋白含量较少，因此纯化起来比较方便快捷；如果纯化时需要破碎细胞，则细胞内部的杂蛋白很多，不利于目的蛋白的纯化)，因此易于大规模生产制备猪流行性腹泻病毒S蛋白以满足工业化需求，且由该蛋白制备的亚单位疫苗免疫原性很好，能够诱导猪只产生良好的免疫反应。
附图说明
图1A-图1C表示TMHMM软件预测PEDV-S蛋白跨膜区。
图2表示pEE12.4-OPTI-S质粒图谱。
图3表示pEE12.4-OPTI-S双酶切鉴定结果。1,2表示PEDV-opti-S质粒利用EcoRI/HindIII双酶切，载体大小约7,528bp，目的片段大小约3,930bp，酶切正确；M1:DL15,000maker，M2:DL10,000maker。
图4表示SDS-PAGE检测3C5单克隆细胞株发酵表达的PEDV-S蛋白纯化结果。我们对3C5单克隆细胞株进行发酵验证，收集细胞培养上清，进行蛋白纯化，通过SDS-PAGE来检测PEDV-S的蛋白表达水平。
图5A表示SDS-PAGE和Werstern Blot检测纯化后PEDV-S蛋白去除糖基化后的结果。其中1-5为SDS-PAGE检测结果，1是Marker，2是阴性对照1×PBS，3和5是未去糖基化的PEDV-S蛋白，4是去糖基化后的PEDV-S蛋白；其中6-10为Werstern Blot检测结果，6是Marker，7是阴性对照1×PBS，8和10是未去糖基化的PEDV-S蛋白，9是去除糖基化后的PEDV-S蛋白。
图5B表示PEDV-S蛋白分子筛检测结果。
图5C表示superdex 200 PG柱标准品层析图谱，其中ferritin出峰体积为54.1ml，分子量为440kDa，aldolase出峰体积为65.4ml，分子量为158kDa，conalbumin出峰体积为73.0ml，分子量为75kDa，ovalbumin出峰体积为80.0ml，分子量为43kDa，carbonicanhydrase出峰体积为87.9ml，分子量为29kDa，ribonuclease A出峰体积为95.7ml，分子量为13.7kDa，aprotinin出峰体积为104.3ml，分子量为6.5kDa。
图6表示免疫后效价检测结果。
图7表示PEDV-S蛋白核苷酸序列优化前后比对结果，OPTI-S表示优化后的序列，PEDV-S表示优化前的序列。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。
本发明试剂及药品的来源列单如下：
本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。
本发明试剂及药品的来源列单如下：
CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；
细胞培养基和血清均购自美国Gibco公司；
真核表达载体pEE12.4购自上海林渊生物科技有限公司；
甲硫氨酸亚砜亚铵((L-methioninesulfoximine，MSX))购于Sigma公司；
BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；
糖苷酶F购自New England Biolabs(UK)Ltd；
HRP标记的羊抗猪IgG二抗购自EarthOx Life Science；
Quil-A购自Brenntag Biosector；
ISA 201 VG购自法国赛比克公司。
实施例1：猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的选择和密码子优化
PEDV-S蛋白是一个跨膜蛋白，包含有胞外区，跨膜区和胞内区，以经典毒株CV777为参考，利用TMHMM软件预测跨膜区(具体见图1所示)，以已发表的近年来在浙江省流行的PEDV-S毒株为模板(GenBank：KF840553.1)设计引物，从浙江省一猪场克隆PEDV-S胞外区(20D-1320T)序列，得到PEDV-S核苷酸序列。通过对PEDV-S核苷酸序列进行密码子优化，得到OPTI-S序列，如SEQ ID NO.1所示，该工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
优化后的序列(OPTI-S)与优化前的序列(PEDV-S)比对，发现它们同源性仅74.1％(请参见图7)。我们也使用优化前的序列(PEDV-S)进行了CHO表达，但是我们未检测PEDV-S蛋白的表达或者表达量很低，基本检测不到。因此PEDV-S蛋白的序列的优化是PEDV-S蛋白在CHO中表达的一个必不可少的步骤。
实施例2：pEE12.4-OPTI-S重组质粒构建
2.1 PCR扩增目的片段OPTI-S
2.1.1 PCR反应
(1)引物设计及合成
上游引物:5’-CGAAGCTTGCCGCCACCATGGACGTGACCAGGTGCTCTG-3’
下游引物:5’-CGGGAATTCTCAATGGTGATGGTGATGGTGGATATAGGTCTCCAC-3’
(2)加样体系50μL，如下表所示：
PCR扩增程序：
2.1.2 PCR产物进行胶回收
(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；
(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；
(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；
(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，50℃水浴放置5min左右；
(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；
(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
(8)重复步骤(7)；
(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；
(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLElutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；
(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；
(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。
2.2 PCR产物及载体双酶切反应
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系
(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。
(3)双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.2.1中PCR产物胶回收。
2.3连接反应
(1)准备洁净的1.5mL EP管若干，置于EP管架上待用。
(2)在1.5mL EP管按照下表进行加样、混匀。
(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；
(4)取出步骤(3)中EP管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；
(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存。
1.2.4转化反应
(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；
(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；
(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；
(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。
(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；
(6)观察转化结果。
2.5质粒抽提与双酶切鉴定
2.5.1质粒抽提
(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；
(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；
(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体；
(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；
(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入30μLElutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。
2.5.2双酶切鉴定
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样：20μL反应体系：
(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。
(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确。实验结果见图3所示，其中1,2表示PEDV-opti-S质粒利用EcoRI/HindIII双酶切，载体大小约7,528bp，目的片段大小约3,930bp，酶切正确；M1:DL15,000maker，M2:DL10,000maker。
(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。
2.6无内毒素质粒大提
2.6.1无内毒素质粒提取
(1)测序正确的克隆接种至100mL含氨苄抗性的培养基中，于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养15h；
(2)将步骤(1)中培养的菌液转移至50mL离心管中，室温8,000rpm/min、离心5min，收集菌体，弃掉上清培养基；
(3)向步骤(2)的离心管中加入8mL溶液P1，用移液器充分重悬菌体；
(4)向步骤(3)的离心管中加入8mL溶液P2，立即温和颠倒离心管6-8次，室温静置5min；
(5)向步骤(4)的离心管中加入8mL溶液P4，立即上下颠倒6-8次，充分混匀至溶液出现白色絮状沉淀，室温放置10min左右。8,000rpm/min室温离心5-10min，使白色沉淀离至管底；
(6)将步骤(5)中上清液全部小心移入过滤器CS1中，慢慢推柄过滤器，滤液收集在干净的50mL离心管中；
(7)柱平衡：向吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(8)向步骤(6)滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中。室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP6重新放入同一个收集管中；
(9)向步骤(8)吸附柱CP6中加入10mL漂洗液PW，室温8,000rpm/min离心2min，弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(10)重复操作步骤(9)一次；
(11)向步骤(10)吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉废液；
(12)将步骤(11)吸附柱CP6重新放回收集管中，室温8,000rpm/min离心5min。将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟晾干；
(13)将步骤(12)中吸附柱放入干净的50mL离心管中，在吸附膜中央加入1-2mL缓冲液TB，室温静置5min，室温8,000rpm/min离心2min，将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，测浓度，-20℃保存。
(14)取1-2μL所得到的质粒DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳并保存电泳结果数据。
实施例3：pEE12.4-OPTI-S重组质粒转染CHO-K1细胞与单克隆筛选的建立
3.1 CHO-K1细胞转染
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)、DMEM/F12与PBS置于37℃水浴锅预热至37℃。
(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mLPBS洗细胞一次，并弃去PBS。
(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。
(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。
(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。
(6)用DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。
(7)稀释细胞至2×105个/mL，取2mL混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育过夜。
(8)取出步骤(7)细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12，2mL/孔。
(9)稀释质粒：用OPTI-MEM稀释质粒，125μL OPTI-MEM中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μL plus，混匀，室温静置5min。
(10)稀释Lipofectamine LTX：125μL OPTI-MEM中加入9μL LipofectamineLTX，然后加入2.5μL plus，轻轻混匀，室温静置5min。
(11)将步骤(10)和步骤(11)混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。
(12)将六孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养4-6h。
(13)换液：弃掉上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
3.2加压筛选
转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mLDMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。
3.3单克隆筛选
(1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7days，开始单克隆筛选。
(2)取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。
(3)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。
(4)用DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。
(5)铺板：稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4-6h。
(6)记录单个细胞的孔。
(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入100μL0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。其中3G12株、3C5株、9G12株的蛋白表达量均很高，其中3C5株表达量最高。
实施例4：CHO-K1细胞株驯化成悬浮培养
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)置于37℃水浴锅中预热至37℃。
(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mLPBS洗细胞一次，并弃去PBS。
(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。
(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散。
(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。
(6)用100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)悬浮细胞，计数。
(7)稀释细胞至5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。
(8)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。
(9)每隔24h计数细胞密度及活力。
(10)待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养。
(11)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)，EX-CELL 302置于CO2细胞培养箱中预热至37℃。
(12)从37℃培养箱中取出细胞转移至50mL离心管中，常温200g离心5min。
(13)将DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)和EX-CELL 302按1：1混合同时加入对应浓度MSX后混匀，重新悬浮细胞，计数。
(14)稀释细胞至5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。
(15)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。
(16)每隔24h计数细胞密度及活力。
(17)第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×106个细胞/mL，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×105个/mL。
(18)经驯化，3G12株、3C5株都满足要求，这表明3G12株、3C5株都驯化成功。
实施例5：细胞摇瓶发酵(以3C5株为实验对象进行发酵)
(1)传代培养基的配制：60％的CD-CHO+40％的Ex-cell 302置于37℃水浴锅中预热至37℃。
(2)从CO2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。
(3)稀释细胞至2.5-3.5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。
(4)每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当葡萄糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。
(5)补料(约第四天)：补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。
(6)第5天开始，将CO2恒温摇床温度调整至32℃。
(7)第九天，补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。
(8)第十二天，收获细胞上清。
实施例6：蛋白纯化
收集细胞培养液，4℃，8,000g离心30min，取上清，过0.8μm滤膜，上样，预留80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。
柱平衡：用超纯水平衡2～3CV(column volume柱体积)，排出乙醇保存液；然后用Buffer A(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl)平衡2～3CV，4～7mL/min。
上样：若5mL预装柱一个，1mL/min进行上样(根据预装柱体积调节上样流速，保留时间5min)，收集Flow through(FT)，取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。
洗涤：用4％buffer B(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，20mM imidazole)洗柱，流速为4mL/min，把未结合上柱的蛋白和结合能力较弱的杂蛋白冲洗干净，至OD280nm基线平稳为止。
洗脱：50％buffer B(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，250mM imidazole)洗脱目的蛋白，至基线洗平，2mL/min,收集：10mL/管；收集样品混合后(Elutethrough-ET)取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。
洗涤：100％buffer B(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，500mM imidazole)，4mL/min，不收集，冲洗2-3个柱体积，至UV基线洗平。超纯水平衡2～3CV。保存HisTrapexcel柱可用20％乙醇保存液平衡2～3CV。
透析换液：将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1×PBS透析至少1,000倍，取80μl留样检测。
除菌过滤：在生物安全柜中，过0.22μm低蛋白结合针头滤器，或大量蛋白溶液过灭菌的0.22μm滤膜的Nalgene的滤器，过滤好的蛋白溶液样品存放于-80℃冰箱。
蛋白浓度和纯度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，再根据纯化时取用的上清体积和纯化后所得蛋白总量计算蛋白的得率，如本实施例中取用的细胞上清为250ml，纯化后所得蛋白体积为250ml，浓度为1050μg/ml，经过计算蛋白得率约为1g/L；采用HPLC方法检测纯度，纯度都能达到90％或以上。如图4所示(6％的分离胶)，经SDS-PAGE检测，3C5株表达产量能达到约1g/L，适合大规模生产所需。
实施例7：纯化后的PEDV-S蛋白检测
7.1纯化后PEDV-S蛋白去除糖基化及SDS-PAGE检测和Werstern Blot检测
(1)取9μl纯化后的PEDV-S蛋白(约3μg)于200μl EP管中，加入1μl 10×糖蛋白变性缓冲液(商品化酶自带试剂)；
(2)100℃煮沸10min，使蛋白变性；
(3)加入2μl 10×G7缓冲液(商品化酶自带试剂)，2μl 10％NP-40(商品化酶自带试剂)，1-2μl PNGaseF(糖苷酶F)，补水使反应体系至20μl；
(4)37℃温育1h；
(5)反应结束后，加入5μl 5×loading buffer，煮沸10min，待用；
(6)使用SDS-PAGE检测去除糖基化后的蛋白，结果如图5A(8％的分离胶)所示：纯化后的PEDV-S蛋白的分子量约为210kDa；但用去糖基化酶消化PEDV-S蛋白后，发现去除糖基化后的PEDV-S蛋白分子量仅约为140kDa左右，这与通过S蛋白的氨基酸序列分析的S蛋白的分子量一致，约143kDa。这个结果表明，使用我们的CHO真核表达系统表达出来的PEDV-S蛋白有大量的糖基化修饰，糖基化修饰约占整个PEDV-S蛋白分子量的33.3％。因此，在考虑表达S蛋白或者S蛋白截短体或S蛋白的核心区域并用于疫苗制备时，表达系统的的糖基化修饰一定要考虑到，否则会影响疫苗的免疫原性和免疫效果。
(7)使用Werstern Blot检测去糖基化后蛋白，其中一抗使用的是PEDV猪高免血清(1:100倍稀释后室温孵育1h)，二抗使用的是羊抗猪二抗(1:5000倍稀释后室温孵育1h)，最后使用ECL显色，结果如图5A(8％的分离胶)所示，去糖基化后的PEDV-S蛋白不能与PEDV猪高免血清结合或者结合很弱，这说明，PEDV-S蛋白的糖基化是PEDV-S蛋白保持免疫原性所必不可少的。
7.2纯化后的PEDV-S蛋白分子筛分析
7.2.1 superdex 200PG柱平衡
用超纯水平衡2个柱体积，排出乙醇保存液；然后用流动相平衡2个柱体积，流速为1mL/min，压力控制在0.5MPa以内。
7.2.2进样
用进样环进样PEDV-S蛋白2mL(浓度3.153mg/mL)，流速为1mL/min，控制压力为0.5MPa。
1.6.3运行
进样完成后，改inject状态为load状态，运行，流速为1mL/min，出峰后进行样品收集，0.5mL/管。
分子筛结果如图5B所示：从PEDV-S蛋白分子筛出峰结果与标准品柱层析图谱(图5C)对比，可以看出，峰1的出峰体积48.47ml，分子量大于440kDa，为纯化后的PEDV-S蛋白的三聚体；峰2的出峰体积为57.22ml，分子量在158kDa与440kDa之间，为PEDV-S蛋白单体；其他峰对应蛋白的分子量均小于158kDa，均为杂蛋白。
从图中可以看出，峰1面积(302.6616)占总面积(438.5518)的百分比为69％，这说明纯化后的PEDV-S蛋白在未进一步优化缓冲体系前就有69％为三聚体，这符合预测分析(PEDV-S蛋白在PEDV病毒粒子中是以三聚体的形式存在)。
实施例8疫苗制备与免疫实验
8.1疫苗制备(以制备2ml/头份，共200ml疫苗为例说明)
所用制备疫苗的耗材和材料都需预先经过无菌处理，制备过程是在生物安全柜或其他可以保证整个制备过程都无菌的仪器或环境中完成。
(1)油相(ISA 201 VG佐剂)的准备：根据水相和油相体积比为46:54，量取油相体积为108ml置于预先准备好的试剂瓶中，封口，置于33℃水浴锅中预热约30min。
(2)水相准备：根据水相和油相体积比为46:54，水相总体积为92ml。
根据猪流行性腹泻病毒S蛋白的浓度以及疫苗中S蛋白的浓度，计算S蛋白取用的体积；若水相中还加入免疫增强剂Quil-A，则根据Quil-A的原始浓度以及疫苗中Quil-A的含量计算Quil-A取用的体积；用PBS或其他缓冲液将水相总体积补充至92ml，混匀后置于33℃水浴锅中预热约30min。例如PEDV-S蛋白为5mg/ml，Quil-A的原始浓度为10mg/ml，具体配置如下表所示。
(3)搅拌：将预热好的油相加到预先准备好的烧杯中，调整好搅拌机的高度和速度，再将预热好的水相迅速加到油相中，继续搅拌10～20min。一般根据制备体积选择搅拌速度和搅拌时间，如制备200ml疫苗，一般选择350rpm/min搅拌10min即可，又如制备1500ml疫苗，一般选择600rpm/min搅拌20min即可。
(4)稳定：将(3)中搅拌好的疫苗置于20℃水浴锅中静置1h，然后置于4℃冰箱中过夜。
(5)分装：稳定好的疫苗根据需要分装并写上标签。
8.2根据中国专利申请号为201610348237.8的发明专利制备PEDV-S1蛋白，然后按照8.1的方法制备疫苗，该疫苗与8.1制备的疫苗2中除了蛋白为PEDV-S1蛋白外，其他成分和浓度完全一样，即该疫苗中PEDV-S1蛋白浓度为100μg/头份，Quil-A浓度为400μg/头份，佐剂与水相的体积比为54:46。
8.3免疫实验
筛选28-35日龄仔猪40头(PEDV、TGEV和RV抗原阴性，PEDV抗体阴性)，随机分成5组，每组5头，一组作为空白对照组，六组免疫PEDV-S蛋白亚单位疫苗(8.1制备的疫苗1～疫苗6)，一组免疫PEDV-S1蛋白亚单位疫苗(8.2制备的疫苗)。空白对照组每次肌肉注射2ml生理盐水，免疫组每次肌肉注射2ml相应的疫苗，初免三周后加强免疫一次，免疫前、二免前和二免后14天采集血清，使用西班牙Ingenasa猪流行性腹泻病毒间接ELISA抗体检测试剂盒检测抗体效价。
结果如图6所示：
(1)在一免后21天疫苗2(含PEDV-S蛋白)免疫组平均S/P值能达到1.1左右，且在二免后14天平均S/P值能达到1.7；而PEDV-S1蛋白免疫组在一免后21天平均S/P值只有0.7左右，二免后14天平均S/P值只有1.2左右。这说明，PEDV-S全长的免疫原性较PEDV-S1的免疫原性要好。
(2)不同浓度的PEDV-S蛋白制备的疫苗(即疫苗1～疫苗3)在免疫后，在一免后S/P值随着浓度的增加而增加，但是疫苗1的S/P值也能达到1.1以上，比PEDV-S1蛋白免疫组的S/P值要高，但在二免后三组疫苗的S/P基本一致，都在1.7±0.1之间；这说明，疫苗中PEDV-S蛋白浓度的高低对二次免疫来说基本没有影响，在一免时略有影响，但是能够达到保护的作用。
(3)不同浓度的Quil A制备的疫苗(即疫苗2、疫苗4～疫苗6)在一免后S/P值随着浓度的增加而有所增加，但是比不含Quil A的疫苗6的平均S/P值都要高0.4左右(疫苗6一免后平均S/P值约0.6，而疫苗4一免后的平均S/P值也能达到1.0以上)；在二免后，含Quil A的三组疫苗(疫苗2、疫苗4、疫苗5)的S/P基本一致，都在1.7左右，都比不含Quil A的疫苗6的平均S/P值要高0.2～0.3(疫苗6二免后平均S/P值只有1.4左右)；这说明，疫苗中Quil A对免疫有很好的增强作用，且浓度在这个范围内(300～500μg/头份)都能起到很好的增强作用，特别是在一免的时候，这对于疫苗快速产生免疫保护作用有很好的补充作用。
实施例9临床大规模免疫实验
(1)猪场和免疫情况：2017年9-11月期间先后用于三个猪场：A场1100头母猪，B场700头母猪。母猪产前40天首免，产前20天二免。每次免疫剂量2ml/头，免疫疫苗制为实施例8中的疫苗6，均为颈部肌肉注射免疫。
(2)临床观察结果
A场：管理良好，2016年度—2017年度期间，一直没有腹泻病例。母猪用了PEDV亚单位疫苗后，猪群状况正常，母猪仔猪均无腹泻。
B场：2016年度冬季腹泻发病较重，一年内估计损失死亡新生仔猪3000头。用了PEDV亚单位疫苗后，没有发生母猪仔猪腹泻病例。同样阻止了仔猪因腹泻引起的死亡。
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

Claims (13)

1.一种猪流行性腹泻病毒S蛋白，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白是由SEQID NO2所示的氨基酸组成的蛋白质；或者由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原性的衍生蛋白。
2.根据权利要求1所述的S蛋白，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白是由CHO细胞表达的。
3.根据权利要求1所述的S蛋白，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白在SDS-PAGE中的分子量为210kDa。
4.根据权利要求1所述的S蛋白，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白去除糖基化后在SDS-PAGE中的分子量为140kDa。
5.一种猪流行性腹泻病毒S蛋白亚单位的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含30～200μg如权利要求1～4任一所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白以及药学上可接受的ISA 201VG佐剂。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还含有免疫增强剂；所述免疫增强剂为Quil-A，所述Quil-A的浓度为300～500μg/头份。
7.一种制备如权利要求5-6任一所述疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)如权利要求1～4任一所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因的克隆；所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因的克隆包括以下步骤：
1-1)对所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因的核苷酸序列进行密码子优化，得到OPTI-S；和
1-2)将OPTI-S克隆到真核表达载体中，得到重组质粒；
(2)所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达和纯化；所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达和纯化包括以下步骤：
2-1)将含有猪流行性腹泻病毒S蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞株中；
2-2)通过培养、筛选、驯化步骤2-1)中所述CHO细胞株得到高度表达的细胞株；和
2-3)发酵培养步骤2-2)中所述细胞株，从细胞上清中纯化得到重组猪流行性腹泻病毒S蛋白；
(3)将步骤(2)中制备的重组猪流行性腹泻病毒S蛋白制备成水相；
(4)将所述水相与作为油相的ISA 201 VG佐剂按照体积比46:54的比例乳化，得到疫苗。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述水相还包括免疫增强剂，所述免疫增强剂为Quil-A。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述OPTI-S的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体为pEE12.4。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
12.一种根据权利要求1～4任一权利要求所述的重组猪流行性腹泻病毒S蛋白在制备猪流行性腹泻病毒S蛋白重组亚单位疫苗及相关诊断试剂中的应用。
13.一种根据权利要求5～6任一权利要求所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白重组亚单位疫苗在制备用于预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。
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