CN107325188A - 猪血清蛋白融合猪圆环病毒Cap2蛋白的CHO细胞株的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域中的疫苗生产技术，具体涉及一种利用基因工程手段构建表达重组蛋白Pigpsa‑PCV2cap2的CHO细胞株、及其制备方法和应用。本发明所提供的重组融合蛋白Pigpsa‑PCV2cap2，为如下A1）或A2）：A1）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；A2）在A1）的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有Pigpsa‑PCV2cap2活性的蛋白质。本发明获得的可以分泌表达Pigpsa‑PCV2cap2的单克隆细胞株，融合蛋白表达量较高，经His亲和分离纯化所获得融合蛋白能和单抗结合，免疫动物且生成中和抗体高于目前市面产品，其融合蛋白可用于猪圆环病毒预防疫苗，降低生产成本，避免内毒素残留引起死亡和免疫失败损失。

Description

猪血清蛋白融合猪圆环病毒Cap2蛋白的CHO细胞株的构建方 法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的疫苗生产技术，具体涉及一种利用基因工程手段构建表达重组蛋白Pigpsa-PCV2cap2的CHO细胞株、及其制备方法和应用。

技术背景

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子大小为14～25nm，平均直径17nm，呈对称的二十面体，无囊膜，基因组为单股环状DNA，由脱氧核糖核酸组成，在组织中的悬浮密度为1.37 cm3，沉降系数为52S，是目前发现的最小的动物病毒。PCV的复制为滚环复制方式，先经过一个双链的复制型（RF），然后由双链的复制型转录和编码蛋白。这种复制方式与鸡传染性贫血病毒（CAV）的复制方式相同。猪圆环病毒（PCVPorcinecircovirus,）是迄今发现的最小的动物病毒之一。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。最近报道还有PCV3。PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）,皮炎与肾病综合征(PNDS)的主要病原，PMWS最早发现于加拿大。1974年，德国人Tischer发现，是目前发现的最小的动物病毒。PCV对外界的抵抗力较强，在pH 3的酸性环境中很长时间不被灭活。该病毒对氯仿不敏感，在56 ℃或70 ℃处理一段时间不被灭活。在高温环境也能存活一段时间。不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞。PCV能在RK-15细胞上生长，但不能引起细胞病变，但感染的PK—15细胞内含有许多胞浆内包涵体。少数感染的细胞内含有核内包涵体。PCV不能在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK—21细胞上生长。PCV-2却具有致病性，能引起猪表现多种临床症状。PCV-1基因组全长1759bp，PCV-2全长1768 bp或1767 bp，二者序列同源性小于80%，但PCV-1毒株间的核酸序列同源性大于99%，PCV-2毒株间的核序列同源性大于96%。

PCV-1与PCV-2都有读码框ORF1，编码病毒复制蛋白。各毒株间的ORF1编码蛋白质序列间源性大于86%，在PCV各读码框编码的蛋白质中间源性最高。现已经证实，PCV有两个主要的阅读框，ORF1和ORF2，二者在长度上都大于600 bp⑵。ORF1是最大的阅读框，编码病毒的复制蛋白（Rep），分子量大小为37KDa，与病毒的复制转录有关。ORF2编码病毒的结构蛋白，可以与PCV-2的抗血清反应，LiuQ等研究表明，位于12-18位及34-41位的氨基酸残基对PCV2-ORF2是重要的。ORF2编码蛋白（Cap）的两个抗原表位分别位于所编码的氨基酸的69-83处和117-131处，这两处对Cap蛋白特异的。

用基因工程的方法制备猪圆环单位疫苗主要集中在Cap2这个抗原区域，Cap2抗原疫苗也是目前控制该病的重要途径之一。尽管目前市场上已有大肠杆菌和杆状病毒等表达Cap2抗原基因工程亚单位疫苗的供应，但人们仍在寻求新的低成本的长效猪Cap2抗原疫苗的制备方法。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell，简称CHO)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多人用重组蛋白药物已上市。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。

血清蛋白是血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天，同时具有稳定蛋白的作用。本发明将该猪血清片段和Cap2抗原蛋白融合，其氨基酸序列从N端到C端依次包括猪血清蛋白片段、柔性肽接头和cap2抗原蛋白质，与现有cap相比，克服在体内半衰期短且原核表达产物病毒颗粒形成低不均匀缺陷,杆病毒杂蛋白多等缺点，该融合表达PSA融合CAP蛋白病毒颗粒更大更均匀，其体内半衰期更长、免疫效果更好，抗原无杂宿主DNA蛋白质污染，免疫用量更少或减少多次疫苗注射应激反应。本发明还涉及重组Pigpsa-PCV2cap2融合蛋白组合物在抗猪圆环疫苗上用途。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高猪圆环病毒cap2蛋白质在大肠杆菌表达系统中表达病毒样颗粒蛋白形成不均匀免疫效果差及内毒素残留高引起的猪死亡缺陷；或其他表达系统表达产物抗体产生时间短以及杂蛋白残留引起免疫发热等的缺陷。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种稳定高效表达猪PSA片段和猪圆环病毒抗原(Cap2)融合蛋白在CHO 细胞株的构建方法。本发明获得的可以分泌表达Pigpsa-PCV2cap2的单克隆细胞株，融合蛋白表达量较高，经His亲和离子纯化所获得融合蛋白能和单抗结合，免疫动物产生中和抗体高于目前市面产品，其融合蛋白可用于猪圆环病毒预防疫苗，降低生产成本和免疫失败损失。

本发明所提供的重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2，为如下A1）或A2）：

A1）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A2）在A1）的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有Pigpsa-PCV2cap2活性的蛋白质。

为了使A1）或A2）中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

上述A2）中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A1）或A2）中的蛋白质可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A1）或A2）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5´端和/或3´端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2相关的生物材料，为下述B1）-B5）中至少一种：

B1）编码上述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组细胞系、含有B2）所述表达盒的重组细胞系、或含有B3）所述重组载体的重组细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述与所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2相关的生物材料中，B1）所述核酸分子为如下1）-4）中任一所示的基因：

1）核酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子或cDNA分子；

2）编码序列是SEQ ID No.1第11-2594位所示的DNA分子或cDNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有75%或75%以上同一性，且编码所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2的DNA分子或cDNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）中任一所述限定的DNA分子杂交，且编码所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2的DNA分子或cDNA分子。

其中，序列表中的SEQ ID No.1由2594组成，编码序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质。

上述用于编码所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2的核酸分子的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且编码重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指核酸序列间的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.1所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列；同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1% SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1% SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

上述生物材料中，所述表达盒，是指能够在重组细胞中表达重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2的DNA，该DNA不但可包括启动Pigpsa-PCV2cap2基因转录的启动子，还可包括终止Pigpsa-PCV2cap2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述的含有重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2基因的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体pcDNA3.1的多克隆位点插入Pigpsa-PCV2cap2基因得到的重组表达载体。所述的重组微生物具体可为哺乳细胞也可以是其他表达系统如酵母类、细菌类、藻类以及植物，哺乳细胞可具体为CHO细胞。本发明的又一个目的是提供了上述蛋白质在作为在猪圆环病毒疫苗中的应用，所述应用包括疾病诊断和或治疗目的的应用。

术语“重组载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。所述重组载体包含本发明的多核苷酸，其连接于一个或多个调控序列，例如启动子和转录和翻译终止信号，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中产生。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组载体，所述重组载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。重组载体可以是任何载体（例如，质粒或病毒），其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的重组细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段；或者，载体可以是一种当被引入重组细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入重组细胞基因组的完整DNA，或可以使用转座子。

所述载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。所述载体优选含有元件，其允许载体整合入重组细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。为了整合入重组细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10000碱基对，400至10000碱基对，和800至10000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可为任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可为非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到重组细胞的基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在重组细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入重组细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的。

术语“重组细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的。术语“重组细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。

所述重组细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体导入重组细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“重组细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。重组细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核(或真)核细胞。

另一方面，本发明还涉及用于产生本发明重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2并在中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamsterovary, CHO) 中制备方法，包括：

(1) 将猪血清蛋白片段和猪圆环cap2蛋白即融合基因连接入真核质粒载体构建真核表达质粒；

(2) 用脂质体转染的方法将真核表达质粒转染至CHO 细胞株中；

(3) 用含G418 的选择培养基筛选整合入融合基因分泌表达Pigpsa-PCV2cap2的稳定转染细胞株；

(4) 通过SDS-PAGE 电泳和蛋白质免疫印迹即Western blot 法筛选出能够高效表达融合蛋白的阳性克隆株；

(5) 进行重复低密度铺板克隆筛后获得稳定且融合蛋白表达量最高的阳性CHO 单克隆细胞株，稳定高效表达猪血清蛋白PSA片段和猪圆环病毒Cap2蛋白的CHO 单克隆细胞株，即分泌表达Pigpsa-PCV2cap2融合蛋白的CHO 单克隆细胞株；

(6) 将筛选得到的稳定表达融合蛋白阳性克隆株进行悬浮驯化与发酵；用SDS-PAGE电泳方法检测收集蛋白液中融合蛋白的表达量高的细胞株；

(7) 收集发酵液进行蛋白纯化，先通过His亲和柱纯化融合蛋白并除去大部分的杂蛋白，并将目的蛋白用缓冲液稀释后用SP柱子纯化；洗脱纯化液放置在病毒颗粒包被液中形成病毒样颗粒，即获得纯的目的蛋白；

(8) 依据《中国兽药典》，通过安全性、免疫原中和抗体测定和免疫攻毒试验进行评价。

所述融合蛋白在CHO 细胞中分泌表达；优先在CHO-gS细胞中表达。所述融合蛋白在CHO 细胞中悬浮培养表达。所述真核质粒载体优先选用pcDNA3.1质粒，但不局限于该载体，可以是任何哺乳细胞表达载体。

所述CHO 细胞株的用途在于制备抗猪圆环病毒抗原，抗原与佐剂混合免疫动物后可以起到保护动物效果，且对动物安全。

附图说明

图1：连接PCDNA3.1合成Pigpsa-PCV2cap2酶切图片

图2：测序报告

图3：表达蛋白和his纯化蛋白电泳图

图4：HIS纯化吸光图

图5：离子纯化his粗蛋白吸光图

图6：目的蛋白电镜100nm下结果

图7：单个融合蛋白1nm电镜结果

图8：纯化蛋白琼扩结果

图9：融合蛋白保不同剂量和佐剂免疫中和抗体比较

图10：融合蛋白免疫猪后对攻毒生存状态

图11：对照组猪发病状态。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

原始菌株以及载体：CHO细胞由北京佳华戴维生物技术有限公司保存、圆环病毒cap2原始基因由唐山怡安生物工程有限公司分离提供，分离的cap2基因序列和猪血清蛋白基因序列重新按鼠类密码子偏好性合成。

酶类及其他生化试剂：质粒提取试剂盒购自天跟生物，其它均为国产试剂。

CHO培养基：无血清培养基，CDM4CHO培养基，牛血清培养培养基，购自Hyclone公司。

实施例1、Pigpsa-PCV2cap2突变体及其编码基因的获得

为了提高分离的野生型Cap2的长效性，将分离的猪圆环Cap2的蛋白质序列与猪血清Psa片段融合。具体的融合蛋白质具体的蛋白质位点如表2所示。

表2 融合蛋白质设计

名称	Pigpsa-PCV2cap2
		猪血清片段片段	1-607
链接肽	608-622
		Cap2	623-860

合成SEQ ID No.1所示的Pigpsa-PCV2cap2基因，是将Cap2蛋白N端融合猪Psa片段，其编码序列是SEQ ID No.1的第11-2594位所示，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质Pigpsa-PCV2cap2。

实施例2、Pigpsa-PCV2cap2表达抗原的制备

2.1重组Pigpsa-PCV2cap2重组表达载体的获得

由基因合成公司合成基因后直接构建在PCDNA3.1载体上，结果如图1和图2，构建成功菌株，接种于100ml含氨苄LB培养基250ml三角瓶中，37℃条件下，220rpm摇床培养过夜，用天根无内毒试剂盒抽提载体。pvul酶切后用胶回收试剂盒回收酶切产物，回收产物准备转染哺乳细胞CHO用。

2.2融合表达细胞CHO获得的获得

经过pvul酶切后纯化产物，收集CHO 细胞。

2.2.1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上；转染时，细胞要达到90-95%的融合；

2.2.2、溶液1：240μl 无血清培养基 + 10 μl lipofectamine 2000/孔（总体积250 μl）（温育5min）；

2.2.3、溶液2：225 μl无血清培养基 + 25 μl（10μg）质粒 per well（总体积250 μl）；

2.2.4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min；

2.2.5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基；

2.2.6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀；在37℃，5%的CO2中保温5-6小时；

2.2.7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48-72h检测转染水平。

如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。

3克隆筛选

待细胞生长两天贴壁后，换液（D001+10% FBS）加压，加G418 浓度为1.2-1.8mg/mL。有大量死细胞直接换液不加压，待克隆长出。细胞单克隆长至合适大小，准备挑克隆。将所有克隆挑至96孔板中。置培养箱中培养，待克隆长至铺满80%孔底，取上清SDS-PAGE 胶筛选表达量高的细胞株留下继续筛选。

4、细胞悬浮驯化

选择初筛蛋白表达高的克隆细胞，将细胞转移至T75 培养瓶中培养，连续培养2 个月，挑选最终适应悬浮培养高产的细胞株作为工程菌株。

5、稳定细胞株的10L发酵流加培养

装液量为5L，转速为100rpm，pH控制为7.2，培养温度为37℃。准备1L种子液，密度为2.0×106个/mL，加入发酵罐中，每天计数，观察细胞状态，当发酵第5天左右细胞密度达到3.5×105左右每天补加补料培养基400mL连续补加7天，此时蛋白浓度达到最大，停止补加补料培养基，1天后停止发酵。发酵过程中用O2维持发酵罐30%溶氧水平，CO2和NaHCO3控制pH7.2，细胞发酵变化如表3所示。

表3 CHO细胞发酵生产Pigpsa-PCV2cap2融合蛋白发酵参数

6、重组蛋白的纯化

收集发酵液，8000rpm 离心5min获得上清液，用0.22μm 的膜过滤。第一步选用 bufferA：20mM PB，0.2M NaCl，pH7.2，20mM咪唑平衡纯化柱子，用发酵液上样，buffer A冲洗平衡，buffer B：20mM PB，0.2M NaCl，pH7.2，250mM咪唑洗脱，即初步纯化目的蛋白结果如图图3和图4。

精纯 离子交换色谱纯化 采用 AKTA 纯化制备型液相色谱系统（层析介质为SPSepharose 4Fast Flow），以2.5ml/min的流速过滤样品。穿透后，用缓冲溶液（0.01mol/L磷酸缓冲液（pH值6.0），0.01mol/L DTT。0.05mol/L NaCl）洗脱杂蛋白，用缓冲溶液（0.01mol/L磷酸缓冲液（pH值6.0），0.01 mol/L DTT， l mol/L NaCI）洗脱目的蛋白，并收集洗脱产物，再加入终浓度为lmol/L的硫酸铵，结果如图5。检测蛋白浓度，蛋白含量检测 用BCA法测定蛋白含量。蛋白含量应不低于0.5mg/ml。无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。 内毒素测定按凝胶法进行测定，纯化蛋白电镜结果如图6和图7。

7、亚单位疫苗的制备

将防腐剂、蛋白保护液、稳定剂等一种或几种成分与分离纯化的融合蛋白混合，将混合物pH值调至生理值，即pH7.0～7.5，加入佐剂组成猪圆环亚单位疫苗。佐剂可以选用铝胶、卡伯波971、皂角甙、脂质体、CpG-ODN、纳米佐剂、油乳佐剂201或206等，可选择加入细胞因子如猪干扰素、猪白细胞介素6等，其中Pigpsa-PCV2cap2蛋白的有效成分浓度不低于25-100μg/mL，每剂量25-100μg。具体方法： 佐剂制备先将水性佐剂在配苗罐中经115℃高压灭菌30～40分钟，冷却至室温备用； 将检验合格的Psa Cap2融合蛋白病毒样颗粒原液适当稀释后混匀； 取抗原 9份与水性佐剂1份，使每头份疫苗含PsaCap2蛋白含量不低于25μg，以600r/min搅拌30分钟，在终止搅拌前加入终浓度为0.005%的硫柳汞，充分混匀，即得疫苗。制备好的疫苗进行琼扩检验，以原始蛋白为阳性，制备的疫苗解离后的融合蛋白为检测样，PBS为阴性对照，结果都能检测出条带如图8，说明该融合蛋白可以用再疫苗方向。

8、重组融合蛋白安全性实验

用14～21日龄抗原阴性和PCV2 ELISA抗体阴性的健康易感仔猪15头（购置自唐山某猪场）雌雄各半，分别随机分3个组，每头肌肉注射疫苗2ml，连续观察14日，每组5头，共3组。按照表4方法进行单剂量1次注射、单剂量2次注射在单剂量组接种2周后以相同方法剂量再接种一次，超剂量1次注射和对照组。

表4重组蛋白安全设计

分组	设计	融合疫苗中蛋白含量
			单剂量一次免疫组	按颈部肌肉注射接种2ml疫苗	100μg融合蛋白含量/头
单剂量2次重复免	在单剂量组接种2周后以相同方法剂量再接种一次	100μg融合蛋白含量/头
			超剂量一次免疫组	按颈部肌肉注射接种2ml疫苗	500μg融合蛋白含量/头
对照组	直接注射生理盐水	0μg融合蛋白含量/头

实验期间，每天观测实验动物临床症状变化，包括精神、采食、活动、呼吸、饮水、注射炎症反应、排泄状况，每天体温检测，记录动物异常情况，如死亡，如果有死亡需解剖，观测病例变化，分析原因。经过连续观测，对注射重组融合疫苗前后的临床症状进行比较，发现单剂量接种和单剂量重复接种组以及超剂量组，均饮食正常，精神无不良变化，呼吸及排泄未见异常，注射部位无发炎现象，高剂量组体温开始有升高现象，实验期间没有遇到动物有任何不良反应，无死亡猪出现，注射后每天检测动物体温，我们对高剂量猪的肝脏肠道肾组织进行免疫组化，发现组织质地均匀没有病例改变，及本发明中制备的疫苗蛋白即使以高剂量注射，也无明显副作用，是一种安全免疫蛋白。

9、重组融合蛋白动物保护实验

仔猪免疫攻毒法 用14～21日龄PCV2抗原阴性和PCV2 ELISA抗体阴性的健康易感仔猪25头，分成7组，每组5头如表5，第1组每头颈部肌肉注射疫苗lml Pigpsa-PCV2cap25μg/ml（含佐剂A），第2组每头颈部肌肉注射疫苗lmlPigPsa-PCV2Cap50μg/ml（含佐剂A）,第3组每头颈部肌肉注射疫苗lmlPigpsa-PCV2cap25μg/ml（含佐剂B），第4组每头颈部肌肉注射疫苗lmlPigPsa-PCV2Cap50μg/ml（含佐剂B）,第5组作疫苗对照组，第6组作攻毒对照，第7组作空白对照隔离饲养。免疫后28日对所有猪称重，第1、2、3、4、5、6组备用PCV2 DN株（106.0TCID50 /ml）滴鼻1 m1、肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒后第4、7日，分别在每头猪两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白 （KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种 lml （4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10 ml/头；攻毒后第11、19日再次分别腹腔接种巯基乙酸培养基，10 ml/头。攻毒后连续观察25日，于第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。攻毒对照猪应至少4头发病，免疫猪应至少4头保护免疫和操作流程如表6。

表5 试验动物分组

分组	头数
		佐剂A Pigpsa-PCV2cap25μg/ml	5
佐剂A Pigpsa-PCV2cap2 50μg/ml	5
		佐剂B Pigpsa-PCV2cap25μg/ml	5
佐剂B Pigpsa-PCV2cap2 50μg/ml	5
		疫苗组	5
对照组	5
		阴性对照	5

表6融合蛋白免疫程序安排

实验内容	取样和检测
		免疫组首次免疫	采血5～10ml/头，分离血清；首免。
免后7天采血	免疫对照组采血5～10ml/头，分离血清，测抗体。
		免后14天采血	免疫对照组采血5～10ml/头，分离血清，测抗体。
免后21 天采血	免疫对照组采血5～10ml/头，分离血清，测抗体。
		28天攻毒	PCV2 DN株（106.0TCID50 /ml）滴鼻1 m1、肌肉注射2ml
观察25天	4、7日，分别在每头猪两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白 （KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种 lml （4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10 ml/头；攻毒后第11、19日再次分别腹腔接种巯基乙酸培养基，
		屠宰剖检	称重，剖检观察病变。

免疫后抗体水平及攻毒保护情况由图8可以看出，所以免疫后在首免后7日部分猪抗体转阳，21日后逐渐降低；在Pigpsa-PCV2cap2抗原含量25μg/ml佐剂B中抗体水平达到最优；从结果看，免疫猪攻毒后体温除个别温次超过40℃外，其他体温基本都在38-40℃之间。对照猪攻毒后，各头猪在不同时间出现了体温升高，在40℃-41.8℃之间。免疫组猪攻毒后所有猪精神食欲都良好；未发生死亡现象如图10。疫苗组没有发病，试验结果表明Pigpsa-PCV2cap2融合蛋白亚单位疫苗按25µg/头份剂量对4～6周龄仔均可提供很好保护，效果高于目前的市面疫苗效果。而阴性对照猪在不同时间出现了临床症状：食欲下降、精神萎靡、行动迟缓、皮肤苍白、被毛蓬乱、呼吸困难，咳嗽为特征的呼吸障碍如图11。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

<110>

<120>猪血清蛋白融合猪圆环病毒Cap2蛋白的CHO细胞株的构建方法及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2601

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

SEQ ID No.1

1 AAGCTTGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCAGCGCC

61 TACAGCAGGGGCGTGTTCAGGAGGGACACCTACAAGAGCGAGATCGCCCACAGGTTCAAG

121 GACCTGGGCGAGCAGTACTTCGAGGGCCTGGTGCTGATCGCCTTCAGCCAGCACCTGCAG

181 CAGTGCCCCTACGAGGAGCACGTGAAGCTGGTGAGGGAGGTGACCGAGTTCGCCAAGACC

241 TGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGCGACAAGAGCATCCACACCCTGTTCGGCGAC

301 AAGCTGTGCGCCATCCCCAGCCTGAGGGGCCACTACGGCGACCTGGCCGACTGCTGCGAG

361 AAGGAGGAGCCCGAGAGGAACGAGTGCTTCCTGCAGCACAAGAACGACAACCCCGACATC

421 CCCAAGCTGAAGCCCGACCCCGTGGCCCTGTGCGCCGACTTCCAGGAGGACGAGCAGAAG

481 TTCTGGGGCAAGTACCTGTACGAGATCGCCAGGAGGCACCCCTACTTCTACGCCCCCGAG

541 CTGCTGTACTACGCCATCATCTACAAGGACGTGTTCAGCGAGTGCTGCCAGGCCGCCGAC

601 AAGGCCGCCTGCCTGCTGCCCAAGATCGAGCACCTGAGGGAGAAGGTGCTGACCAGCGCC

661 GCCAAGCAGAGGCTGAAGTGCGCCAGCATCCAGAAGTTCGGCGAGAGGGCCTTCAAGGCC

721 TGGAGCCTGGCCAGGCTGAGCCAGAGGTTCCCCAAGGCCGACTTCACCGAGATCAGCAAG

781 ATCGTGACCGACCTGGCCAAGGTGCACAAGGAGTGCTGCCACGGCGACCTGCTGGAGTGC

841 GCCGACGACAGGGCCGACCTGGCCAAGTACATCTGCGAGAACCAGGACACCATCAGCACC

901 AAGCTGAAGGAGTGCTGCGACAAGCCCCTGCTGGAGAAGAGCCACTGCATCGCCGAGGCC

961 AAGAGGGACGAGCTGCCCGCCGACCTGAACCCCCTGGAGCACGACTTCGTGGAGGACAAG

1021 GAGGTGTGCAAGAACTACAAGGAGGCCAAGGACGTGTTCCTGGGCACCTTCCTGTACGAG

1081 TACAGCAGGAGGCACCCCGACTACAGCGTGAGCCTGCTGCTGAGGATCGCCAAGATCTAC

1141 GAGGCCACCCTGGAGGACTGCTGCGCCAAGGAGGACCCCCCCGCCTGCTACGCCACCGTG

1201 TTCGACAAGTTCCAGCCCCTGGTGGACGAGCCCAAGAACCTGATCAAGCAGAACTGCGAG

1261 CTGTTCGAGAAGCTGGGCGAGTACGGCTTCCAGAACGCCCTGATCGTGAGGTACACCAAG

1321 AAGGTGCCCCAGGTGAGCACCCCCACCCTGGTGGAGGTGGCCAGGAAGCTGGGCCTGGTG

1381 GGCAGCAGGTGCTGCAAGAGGCCCGAGGAGGAGAGGCTGAGCTGCGCCGAGGACTACCTG

1441 AGCCTGGTGCTGAACAGGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCCGTGAGCGAGAAGGTG

1501 ACCAAGTGCTGCACCGAGAGCCTGGTGAACAGGAGGCCCTGCTTCAGCGCCCTGACCCCC

1561 GACGAGACCTACAAGCCCAAGGAGTTCGTGGAGGGCACCTTCACCTTCCACGCCGACCTG

1621 TGCACCCTGCCCGAGGACGAGAAGCAGATCAAGAAGCAGACCGCCCTGGTGGAGCTGCTG

1681 AAGCACAAGCCCCACGCCACCGAGGAGCAGCTGAGGACCGTGCTGGGCAACTTCGCCGCC

1741 TTCGTGCAGAAGTGCTGCGCCGCCCCCGACCACGAGGCCTGCTTCGCCGTGGAGGGCCCC

1801 AAGTTCGTGATCGAGATCAGGGGCATCCTGGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGC

1861 AGCGGCGGCGGCGGCAGCACCTACCCCAGGAGGAGGTACAGGAAGAGGAGGCACAGGCCC

1921 AGGAGCCACCTGGGCCAGATCCTGAGGAGGAGGCCCTGGCTGGTGCACCCCAGGCACAGG

1981 TACAGGTGGAGGAGGAAGAACGGCATCTTCAACACCAGGCTGAGCAGGACCATCGGCTAC

2041 ACCGTGAAGGCCACCACCGTGAGGACCCCCAGCTGGGCCGTGGACATGATGAGGTTCAAC

2101 ATCAACGACTTCCTGCCCCCCGGCGGCGGCAGCAACCCCCTGACCGTGCCCTTCGAGTAC

2161 TACAGGATCAGGAAGGTGAAGGTGGAGTTCTGGCCCTGCAGCCCCATCACCCAGGGCGAC

2221 AGGGGCGTGGGCAGCACCGCCGTGATCCTGGACGACAACTTCGTGACCAAGGCCACCGCC

2281 CTGACCTACGACCCCTACGTGAACTACAGCAGCAGGCACACCATCCCCCAGCCCTTCAGC

2341 TACCACAGCAGGTACTTCACCCCCAAGCCCGTGCTGGACAGGACCATCGACTACTTCCAG

2401 CCCAACAACAAGAGGAACCAGCTGTGGCTGAGGCTGCAGACCACCGGCAACGTGGACCAC

2461 GTGGGCCTGGGCACCGCCTTCGAGAACAGCATCTACGACCAGGACTACAACATCAGGGTG

2521 ACCATGTACGTGCAGTTCAGGGAGTTCAACCTGAAGGACCCCCCCCTGAACCCCCATCAT

2581 CACCATCACCATTAAGAATTC

<210> 2

<211>860

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

SEQ ID No.2

1 METLysTrpValThrPheIleSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAlaTyrSerArgGly

21 ValPheArgArgAspThrTyrLysSerGluIleAlaHisArgPheLysAspLeuGlyGlu

41 GlnTyrPheGluGlyLeuValLeuIleAlaPheSerGlnHisLeuGlnGlnCysProTyr

61 GluGluHisValLysLeuValArgGluValThrGluPheAlaLysThrCysValAlaAsp

81 GluSerAlaGluAsnCysAspLysSerIleHisThrLeuPheGlyAspLysLeuCysAla

101 IleProSerLeuArgGlyHisTyrGlyAspLeuAlaAspCysCysGluLysGluGluPro

121 GluArgAsnGluCysPheLeuGlnHisLysAsnAspAsnProAspIleProLysLeuLys

141 ProAspProValAlaLeuCysAlaAspPheGlnGluAspGluGlnLysPheTrpGlyLys

161 TyrLeuTyrGluIleAlaArgArgHisProTyrPheTyrAlaProGluLeuLeuTyrTyr

181 AlaIleIleTyrLysAspValPheSerGluCysCysGlnAlaAlaAspLysAlaAlaCys

201 LeuLeuProLysIleGluHisLeuArgGluLysValLeuThrSerAlaAlaLysGlnArg

221 LeuLysCysAlaSerIleGlnLysPheGlyGluArgAlaPheLysAlaTrpSerLeuAla

241 ArgLeuSerGlnArgPheProLysAlaAspPheThrGluIleSerLysIleValThrAsp

261 LeuAlaLysValHisLysGluCysCysHisGlyAspLeuLeuGluCysAlaAspAspArg

281 AlaAspLeuAlaLysTyrIleCysGluAsnGlnAspThrIleSerThrLysLeuLysGlu

301 CysCysAspLysProLeuLeuGluLysSerHisCysIleAlaGluAlaLysArgAspGlu

321 LeuProAlaAspLeuAsnProLeuGluHisAspPheValGluAspLysGluValCysLys

341 AsnTyrLysGluAlaLysAspValPheLeuGlyThrPheLeuTyrGluTyrSerArgArg

361 HisProAspTyrSerValSerLeuLeuLeuArgIleAlaLysIleTyrGluAlaThrLeu

381 GluAspCysCysAlaLysGluAspProProAlaCysTyrAlaThrValPheAspLysPhe

401 GlnProLeuValAspGluProLysAsnLeuIleLysGlnAsnCysGluLeuPheGluLys

421 LeuGlyGluTyrGlyPheGlnAsnAlaLeuIleValArgTyrThrLysLysValProGln

441 ValSerThrProThrLeuValGluValAlaArgLysLeuGlyLeuValGlySerArgCys

461 CysLysArgProGluGluGluArgLeuSerCysAlaGluAspTyrLeuSerLeuValLeu

481 AsnArgLeuCysValLeuHisGluLysThrProValSerGluLysValThrLysCysCys

501 ThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPheSerAlaLeuThrProAspGluThrTyr

521 LysProLysGluPheValGluGlyThrPheThrPheHisAlaAspLeuCysThrLeuPro

541 GluAspGluLysGlnIleLysLysGlnThrAlaLeuValGluLeuLeuLysHisLysPro

561 HisAlaThrGluGluGlnLeuArgThrValLeuGlyAsnPheAlaAlaPheValGlnLys

581 CysCysAlaAlaProAspHisGluAlaCysPheAlaValGluGlyProLysPheValIle

601 GluIleArgGlyIleLeuAlaGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly

621 GlySerThrTyrProArgArgArgTyrArgArgArgArgHisArgProArgSerHisLeu

641 GlyGlnIleLeuArgArgArgProTrpLeuValHisProArgHisArgTyrArgTrpArg

661 ArgLysAsnGlyIlePheAsnThrArgLeuSerArgThrIleGlyTyrThrValLysAla

681 ThrThrValArgThrProSerTrpAlaValAspMETMETArgPheAsnIleAsnAspPhe

701 LeuProProGlyGlyGlySerAsnProLeuThrValProPheGluTyrTyrArgIleArg

721 LysValLysValGluPheTrpProCysSerProIleThrGlnGlyAspArgGlyValGly

741 SerThrAlaValIleLeuAspAspAsnPheValThrLysAlaThrAlaLeuThrTyrAsp

761 ProTyrValAsnTyrSerSerArgHisThrIleProGlnProPheSerTyrHisSerArg

781 TyrPheThrProLysProValLeuAspArgThrIleAspTyrPheGlnProAsnAsnLys

801 ArgAsnGlnLeuTrpLeuArgLeuGlnThrThrGlyAsnValAspHisValGlyLeuGly

821 ThrAlaPheGluAsnSerIleTyrAspGlnAspTyrAsnIleArgValThrMETTyrVal

841 GlnPheArgGluPheAsnLeuLysAspProProLeuAsnProHisHisHisHisHisHis

Claims (9)

1.一种重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2，为如下A1）或A2）：

A1）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A2）在A1）的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有Pigpsa-PCV2cap2活性的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2，其特征在于，在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上选自如下组的标签：Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II、c-myc。

3.根据权利要求1所述的重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2，其特征在于，所述A2）中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2，其特征在于，上述A1）或A2）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5´端和/或3´端连上权利要求2所述的标签的编码序列得到。

5.与所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2相关的生物材料，为下述B1）-B5）中至少一种：

B1）编码上述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组细胞系、含有B2）所述表达盒的重组细胞系、或含有B3）所述重组载体的重组细胞系。

6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子是DNA，例如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子或是RNA，例如mRNA或hnRNA。

7.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于，B1）所述核酸分子为如下1）-4）中任一所示的基因：

1）核酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子或cDNA分子；

2）编码序列是SEQ ID No.1第11-2593所示的DNA分子或cDNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有75%或75%以上同一性，且编码所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2的DNA分子或cDNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）中任一所述限定的DNA分子杂交，且编码所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2的DNA分子或cDNA分子。

8.权利要求1-4任意一项所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2的制备方法，包括：

(1) 将猪血清蛋白Psa片段和猪圆环病毒cap2蛋白融合，基因连接入真核质粒载体构建真核表达质粒；

(2) 用脂质体转染的方法将真核表达质粒转染至CHO 细胞株中；

(3) 用含G418 的选择培养基筛选整合入融合基因分泌表达Pigpsa-PCV2cap2的稳定转染细胞株；

(4) 通过SDS-PAGE 电泳法筛选出能够高效表达融合蛋白的阳性克隆株；

(5) 进行重复低密度铺板克隆筛后获得稳定且融合蛋白表达量最高的阳性CHO 单克隆细胞株，稳定高效表达猪免血清蛋白Psa片段和猪圆环病毒cap2蛋白融合蛋白的CHO单克隆细胞株，即分泌表达Pigpsa-PCV2cap2融合蛋白的CHO 单克隆细胞株；

(6) 将筛选得到的稳定表达融合蛋白阳性克隆株进行悬浮驯化与发酵；用SDS-PAGE电泳方法检测收集蛋白液中融合蛋白的表达量高的细胞株；

(7) 收集发酵液进行蛋白纯化，先除去病毒处理后，用HIS亲和柱纯化融合蛋白并除去大部分的杂蛋白，蛋粗白用SP柱子纯化除去部分内毒素即获得纯的目的蛋白；

(8) 根据兽药药典，利用进行安全性、免疫原中和抗体和攻毒评价。

9.权利要求1-4任意一项所述重组融合蛋白Pigpsa-PCV2cap2在制备诊断、预防和治疗猪圆环疫苗中的应用。