CN106699900A - CHO细胞高效表达TD‑bFGF融合蛋白的构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域中的融合细胞因子生产技术，具体涉及一种利用基因工程手段构建CHO细胞高效表达bFGF融合蛋白的方法和应用。本发明所提供的融合蛋白TD‑bFGF，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或者与SEQ ID No.2所示序列具有至少75%的同一性。本发明还提供了与所述融合蛋白TD‑bFGF相关的生物材料，以及重组bFGF蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中构建方法。本发明获得的TD‑bFGF融合蛋白能透过皮肤，比市面产品活性要高，可用于化妆品皮肤药物，具有降低生产成本和提高bFGF作用的效果；构建了稳定高效表达透皮肽片段和细胞因子bFGF融合蛋白的CHO细胞株，为bFGF应用提供新的应用思路。

Description

CHO细胞高效表达TD-bFGF融合蛋白的构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中的融合细胞因子生产技术，具体涉及一种利用基因工程手段构建CHO细胞高效表达bFGF融合蛋白的方法和应用。
背景技术
药物透皮给药系统（Transdermal therapeutic system, TTS或Transdermaldelivery, TDS）是指在皮肤表面给药，药物以恒定速度（或者接近恒定速度）通过皮肤各层，进入体循环，产生全身或局部治疗作用的新型给药方式。透皮给药相对于传统的口服与皮下静脉注射方式而言，其具有方便性、可持续性和可控制性等优点，能通过简单混合涂抹或喷雾给药方式促进bFGF等大分子蛋白质药物进入动物血液循环发挥其治疗效果。
用基因工程的方法制备的bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）是具有多功能的细胞生长因子，由146个氨基酸组成，分子量为16.4KD的活性多肽，对促进成纤维细胞等多种细胞的生长发挥着重要的作用。临床研究证明，bFGF能快速愈合皮肤创伤、更新皮肤细胞组成；能促进微血管的生成；增加皮肤弹性、维护皮肤正常新陈代谢、改善皮肤微环境具有重要的意义。bFGF是在分子水平上对细胞进行修复和调整，如促进皮肤细胞的生长，预防皮肤受到各种损伤，调节细胞中色素的平衡等，再创建皮肤的最佳结构和状态，从根本上达到保健皮肤、延缓衰老的目标。但是涂抹该蛋白皮肤吸收效率低。尽管目前市场上已有大肠杆菌和酵母等表达的bFGF基因产品的供应，但人们仍在寻求新的低成本的高效bFGF制备方法。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细（ChineseHamster Ovary Cell，简称CHO）是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多人用重组蛋白药物已上市。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。
本发明将一种透皮肽片段和细胞因子bFGF蛋白融合，其氨基酸序列从N端到C端依次包括透皮肽片段、柔性肽接头和细胞因子bFGF。与现有bFGF相比，TD-bFGF融合蛋白克服了在体外使用效率低且原核表达产物的不稳定缺陷，其透皮进入体内效果更好。本发明还涉及重组透皮肽和细胞因子bFGF融合蛋白组合物在化妆品上的用途。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高现有bFGF蛋白质在大肠杆菌表达效果差、使用时活性低和透皮肽原核内毒素残留引起皮肤过敏等问题。为了解决上述技术问题，本申请人提供了一种稳定高效表达透皮肽片段和bFGF融合蛋白的CHO细胞株的构建方法。本发明分别获得的可以分泌表达TD-bFGF的单克隆细胞株，经分离纯化获得该融合蛋白。所述TD-bFGF融合蛋白能透过皮肤，比市面产品活性要高，可用于化妆品皮肤药物，具有降低生产成本和提高bFGF作用的效果。
本发明的技术方案如下
本发明设计了一种重组bFGF蛋白在中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamsterovary, CHO）中构建方法，主要包括以下几点：
(1) 将合成的透皮肽片段和bFGF的融合基因连接入真核质粒载体构建真核表达质粒；
(2) 用转染的方法将真核表达质粒转染至CHO细胞株中；
(3) 用含G418的选择培养基筛选整合入融合基因的稳定转染细胞株；
(4) 通过SDS-PAGE电泳筛选出能够高效表达融合蛋白的阳性克隆株；
(5) 进行重复低密度铺板克隆筛后获得稳定且融合蛋白表达量最高的阳性CHO单克隆细胞株；
(6) 将筛选得到的稳定表达融合蛋白阳性克隆株进行悬浮驯化与发酵；用SDS-PAGE电泳方法检测收集蛋白液中融合蛋白的表达量；
(7) 收集发酵液进行蛋白纯化，先通过HIS亲和柱纯化融合蛋白并除去大部分的杂蛋白，上样除去部分杂蛋白并将目的蛋白换液至PBS溶液中；再用缓冲液上离子柱纯化液，获得纯的目的蛋白；
(8) 经膜包置换至PBS缓冲液中，根据生物制品，利用进行评价。
本发明所提供的融合蛋白TD-bFGF，其特征在于：所述融合蛋白TD-bFGF的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或者与SEQ ID No.2所示序列具有至少75%的同一性。
上述融合蛋白TD-bFGF，与SEQ ID No.2 所示序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性。其中，SEQ ID No.2所示的蛋白质由200个氨基酸残基组成。
为了使融合蛋白TD-bFGF便于纯化或透皮效果更好，可在序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签或透皮肽链。
表1 标签的序列
上述融合蛋白TD-bFGF可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述融合蛋白TD-bFGF的编码基因，如SEQ ID No.1所示的DNA序列；和/或进行一个或多个碱基的错义突变；和/或在其5´端和/或3´端连上表1 所示的标签的编码序列得到。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了与所述重组融合蛋白透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白相关的生物材料，为下述B1）-B5）中至少一种：
B1）编码上述重组融合蛋白透皮肽片段TD 和bFGF 融合蛋白的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的重组细胞系、含有B2）所述表达盒的重组细胞系、或含有B3）所述重组载体的重组细胞系。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA 或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA 或hnRNA 等。
上述与所述重组融合蛋白透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白相关的生物材料中，B1）所述核酸分子为如下1）-4）中任一所示的基因：
1）核酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA 分子或cDNA分子；
2）编码序列是SEQ ID No.1第11-613位所示的DNA分子或cDNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA分子具有75%或75%以上同一性，且编码所述重组融合蛋白透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白的DNA分子或cDNA分子；
4）在严格条件下与1）或2）或3）中任一所述限定的DNA分子杂交，且编码所述重组融合蛋白透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白的DNA分子或cDNA分子。
上述3）中的同一性可以至少是80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性。
其中，序列表中的SEQ ID No.1长度为620 bp，编码序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质。
上述用于编码所述重组融合蛋白透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述重组融合蛋白透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述重组融合蛋白透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白的核酸分子的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且编码重组融合蛋白透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
本发明还提供一种重组bFGF蛋白在中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamsterovary,CHO）中构建方法，主要包括以下几点：
(1) 将合成的透皮肽片段和bFGF的融合基因连接入真核质粒载体构建真核表达质粒；
(2) 用脂质体转染的方法将真核表达质粒转染至CHO细胞株中；
(3) 用含G418的选择培养基筛选整合入融合基因的稳定转染细胞株；
(4) 通过SDS-PAGE电泳筛选出能够高效表达融合蛋白的阳性克隆株；
(5) 进行重复低密度铺板克隆筛后获得稳定且融合蛋白表达量最高的阳性CHO单克隆细胞株；
(6) 将筛选得到的稳定表达融合蛋白阳性克隆株进行悬浮驯化与发酵；用SDS-PAGE电泳方法检测收集蛋白液中融合蛋白的表达量；
(7) 收集发酵液进行蛋白纯化，先通过HIS亲和柱纯化融合蛋白并除去大部分的杂蛋白，上样除去部分杂蛋白并将目的蛋白换液至PBS溶液中；再用缓冲液上离子柱纯化液，获得纯的目的蛋白；
(8) 经膜包置换至PBS缓冲液中，通过创伤测定和安全试验进行评价。
所述融合蛋白在CHO细胞中分泌表达；优先在CHO-gS细胞中表达。所述融合蛋白在CHO细胞中悬浮培养表达。所述真核质粒载体优先选用PCDNA3.1质粒，但不局限于该载体，可以是任何哺乳细胞表达载体。
所述CHO细胞株的用途在于制备TD-bFGF，皮肤涂抹或喷雾后起到促进伤口愈合的作用，且对动物安全。
术语解释
这里使用的术语“同一性”指序列间的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ IDNo.1所示的DNA分子或cDNA分子、或SEQ ID No.2所示的氨基酸具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸或氨基酸序列；同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
上述生物材料中，所述表达盒是指能够在重组细胞中表达重组融合蛋白透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白基因转录的启动子，还可包括终止透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述的含有重组融合蛋白透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白基因的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体pcDNA3.1的多克隆位点插入透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白基因得到的重组表达载体。所述的重组微生物具体可为哺乳细胞也可以是其他表达系统如酵母类、细菌类（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）、藻类以及植物。哺乳细胞可具体为CHO细胞。本发明的又一个目的是提供了上述蛋白质在作为在皮肤化妆品中的应用。所述应用包括疾病诊断和或化妆品治疗目的的应用。
术语“重组载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。所述重组载体包含本发明的多核苷酸，其连接于一个或多个调控序列，例如启动子和转录和翻译终止信号，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中产生。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组载体，所述重组载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。重组载体可以是任何载体（例如，质粒或病毒），其能够方便地进行重组DNA 步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的重组细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段；或者，载体可以是一种当被引入重组细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入重组细胞基因组的完整DNA，或可以使用转座子。
所述载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。所述载体优选含有元件，其允许载体整合入重组细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。为了整合入重组细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100 至10000碱基对，400 至10000 碱基对，和800 至10000 碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可为任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可为非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到重组细胞的基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在重组细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入重组细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的。
术语“重组细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的。术语“重组细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。
所述重组细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体导入重组细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“重组细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。重组细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
所述严格条件是在2×SSC，0.1% SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1% SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
本发明有益的技术效果
本发明利用CHO表达系统的优势，建立构建稳定高效表达透皮肽片段和细胞因子bFGF融合蛋白的CHO细胞株的方法；通过筛选单克隆细胞，分别获得高效表达融合蛋白透皮肽片段和人细胞因子bFGF的CHO细胞系，为bFGF应用提供新的应用思路。
附图说明
图1：合成透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白基因酶切图片
图2：pcDNA3.1(-)酶切图片
图3：目的片段连接PCDNA3.1载体菌落PCR筛选
图4：测序正确载体酶切验证
图5：CHO细胞株表达融合蛋白表达筛选图
图6：纯化融合蛋白对细胞增值效果图
图7：融合蛋白对刀创伤小鼠伤口愈合效果
图8：小鼠剪掉皮肤后涂抹融合bFGF对皮肤再生愈合效果
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
原始菌株以及载体：CHO细胞、pcDNA3.1表达载体，由本公司提供。融合基因由北京佳华戴维生物技术公司合成。
酶类及其他生化试剂：内切酶、连接酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自天跟生物，其它均为国产试剂。
CHO培养基：无血清培养基，CDM4CHO培养基，牛血清培养培养基，购自Hyclone公司。
实施例1、透皮肽片段TD 和人bFGF 融合蛋白突变体及其编码基因的获得
为了提高野生型bFGF 的透皮效果，将bFGF的蛋白质序列透皮肽透皮肽片段TD片段融合。具体的融合蛋白质具体的蛋白质位点如表2所示。
表2 融合蛋白质设计
合成SEQ ID No.1所示的透皮肽片段和bFGF融合蛋白基因，是将bFGF蛋白N端融合片段，其编码序列是SEQ ID No.1的所示，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质透皮肽片段和bFGF融合蛋白。也可以将其他透皮肽融合在bFGF蛋白质C端，bFGF氨基酸残基不变得到的bFGF的突变体。
实施例2、bFGF 表达的制备
一、重组透皮肽片段TD和bFGF融合蛋白重组表达载体的构建
利用NheI和XhoI双酶切PET32TD-bFGF载体得到SEQ ID No.1所示的DNA合成DNA核酸分子，600bp左右片段是目标片段，含有TD-bFGF的编码基因的DNA片段或突变编码基因的DNA片段进行回收纯化。结果如图1。
将纯化后的含有TD-bFGF的编码基因的DNA片段分别与NheI和XhoI双酶切真核表达载体pcCND3.1(-)酶切，效果如图2，合成基因于载体段连接（连接体系为0.5μL pcCND3.1(-)；4.5μL TD-bFGF 酶切片段，2xT4快速连接酶，室温3小时）。连接产物转化DH5α感受态细胞，获得阳性重组菌，用PCR 鉴定阳性克隆结果如图3。提取阳性载体NheI和XhoI双酶切验证，结果如图4，阳性验证正确的送去测序验证，将测序结果正确的是用SEQ ID No.1第1-620位所示的TD-bFGF的编码基因替换pcCND3.1(-)的NheI和XhoI识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcCND3.1(-)-TD-bFGF；对测序正确菌株接种于100mL含氨苄LB培养基250mL三角瓶中，37℃条件下，220rpm摇床培养过夜，用天跟无内毒试剂盒抽提载体。pvul酶切后用胶回收试剂盒回收酶切产物，回收产物准备转染哺乳细胞CHO用。
二、融合表达细胞CHO的获得
经过pvul酶切后纯化产物，收集CHO 细胞。
1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上；转染时，细胞要达到90-95%的融合；
2、溶液1：240μL无血清培养基 + 10 μL lipofectamine 2000/孔（总体积250 μL）（温育5min）；
3、溶液2：200 μL无血清培养基 + 50 μL（4 μg）质粒 per well（总体积250 μL）；
4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min；
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2mL无血清培养基；
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀；在37℃，5%的CO2中保温5-6小时；
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48-72h检测转染水平。
如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。
克隆筛选
待细胞生长两天贴壁后，换液（D001+10% FBS）加压，加G418浓度为1.2-1.8 mg/mL。有大量死细胞直接换液不加压，待克隆长出。细胞单克隆长至合适大小，准备挑克隆。将所有克隆挑至96孔板中。置培养箱中培养，待克隆长至铺满80%孔底，取上清SDS-PAGE 胶筛选表达量高的细胞株留下继续筛选。
细胞悬浮驯化
选择7个初筛蛋白表达高的克隆细胞，将细胞转移至T75 培养瓶中培养，连续培养2个月，挑选最终适应悬浮培养高产的细胞株作为工程菌株。筛选结果如图5。
稳定细胞株的10L发酵流加培养
装液量为5L，转速为100rpm，pH控制为7.2，培养温度为37℃。准备1L种子液，密度为3.0×105个/mL，加入发酵罐中，每天计数，观察细胞状态。当发酵第5天左右细胞密度达到106左右，每天补加补料培养基400mL连续补加6天，此时蛋白浓度达到最大，停止补加补料培养基，1天后停止发酵。发酵过程中用O2维持发酵罐30%溶氧水平，CO2和NaHCO3控制pH 7.2，细胞发酵变化如表3所示。
表3 CHO细胞发酵生产融合蛋白的发酵参数
重组蛋白的纯化
收集发酵液，5000rpm 离心8min获得上清液，用0.22μm 的膜过滤。第一步选用 bufferA：20mM PBS，0.1M NaCl，20MM咪唑，pH7.2，平衡纯化柱子，用发酵液上样，buffer A 淋洗平衡，buffer B：20mM PBS，0.1M NaCl，250MM咪唑洗脱。洗脱液用0.2M PBS中换液，膜包换液到PBS中，上离子株继续纯化（可选）经SDS-PAGE 检测达到电泳纯。整个纯化工艺步骤衔接较好，上一步层析的洗脱液只需要稍微的调节便可作为下一步处理液。减少中间处理步骤，便于工业化操作和减少中间操作带来的污染。
融合细胞因子喷雾剂制备
将防腐剂、蛋白保护液、稳定剂等一种或几种成分与分离纯化的TD-bFGF融合蛋白混合，将混合物pH值调至生理值，即pH7.0～7.5，其中TD-bFGF蛋白的有效成分浓度不低于10-100μg/mL。见表4。
表4 融合细胞因子喷雾剂配方
组份 含量% 商品名
双PEG-18 甲基醚二甲基硅烷 3 DowcomingR 2501
甘油 5 丙三醇
防腐剂 0.5 乳酸菌素nisin
重组融合蛋白安全性实验
１、重组TD-bFGF急性毒性实验：小鼠40只静脉和肌肉注射后全部存活，40只小鼠体型正常，运动快速、活泼有力、皮毛波密而有光泽、眼睛鲜红、呼吸正常，7天中小鼠体重增长正常，以1×105U/kg量药后，7天中无死亡，结果表现重组TD-bFGF对小鼠基本无毒。
２、重组TD-bFGF皮肤过敏试验：白色豚鼠只，随机组，分别为给药组、对照组、大肠杆菌阳性药物组进行实验，结果显示，TD-bFGF给药组未见豚鼠出现皮肤过敏反应，即重组TD-bFGF皮肤过敏试验为阴性。
３、重组TD-bFGF对狗的长期毒性试验：将实验比格犬分高剂量组1×105U/kg、低剂量组2×1010U/kg、生理盐水对照组肌肉注射给药。临床推荐用量为以4×102U/kg。连续给药3个月，观察结果表明，动物的一般状况及血液、生化、病理等观察指标中，给药组和对照组间、高剂量组与低剂量组间统计学处理均无显著性差异。即说明重组TD-bFGF肌注对狗无药物毒性反应。
４、重组TD-bFGF肌肉注射对大鼠的长期毒性试验：实验选用30只SD大鼠，随机分为高、中、低、对照4组，按8×104U/kg、4×104U/kg、2×104U/kg、生理盐水，每天给药，连续3个月。结果显示，实验动物的数十项观察指标在各组间无显著差异，并均在正常范围。因此可认为，重组TD-bFGF对大鼠基本无毒。
5、重组bFGF皮肤愈合实验：以脊柱为界将老鼠背部后边创伤，分为对照组和给药组，背部去毛后切1cm伤口和剪掉1 cm直径皮肤分别喷涂生理盐水和1×102 U/mL重组bFGF液体0.1mL喷涂液，记录受试后伤口愈合的情况，并连续每日1次连续给药一周。观察结果，表明小鼠全部存活，无一死亡，图6、图7表明重组TD-bFGF喷雾液对皮肤伤口有促进作用，对鼠无毒。而对照组伤口有感染扩大趋势。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
<110>
<120> CHO细胞高效表达TD-bFGF融合蛋白的构建方法和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 620
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
SEQ ID No.1
1 GCTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGG
61 TTCCACTGGTGACGCTTGTTCTTCCTCACCTTCGAAACATTGCGGTGGCGGAGGATCCGG
121 GGGGGGGTCTCATCACCATCACCATCACGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTACCCGCCTT
181 GCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGACCCCAAGCGGCT
241 GTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGAGTTGACGGGGT
301 CCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGT
361 GTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGATGGAAGATTACT
421 GGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAATCCAATAACTA
481 CAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAACGAACTGGGCA
541 GTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTTCTTCCAATGTC
601 TGCTAAGAGCTGATAAGCTT
<210> 2
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
SEQ ID No.2
1 METGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeuLeuTrpValProGlySerThrGly
21 AspAlaCysSerSerSerProSerLysHisCysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer
41 HisHisHisHisHisHisAlaAlaGlySerIleThrThrLeuProAlaLeuProGluAsp
61 GlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHisPheLysAspProLysArgLeuTyrCysLys
81 AsnGlyGlyPhePheLeuArgIleHisProAspGlyArgValAspGlyValArgGluLys
101 SerAspProHisIleLysLeuGlnLeuGlnAlaGluGluArgGlyValValSerIleLys
121 GlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMETLysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLys
141 CysValThrAspGluCysPhePhePheGluArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyr
161 ArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrValAlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeu
181 GlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAlaIleLeuPheLeuProMETSerAlaLysSer

Claims (11)

1.一种融合蛋白TD-bFGF，其特征在于：所述融合蛋白TD-bFGF的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；或者与SEQ ID No.2所示序列具有至少75%的同一性。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白TD-bFGF，其特征在于，所述同一性为至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白TD-bFGF，其特征在于，在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上选自如下组的标签：Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II、c-myc、MPG、VP22、TD34、TD、Tat48-60和/或Tat47-57。
4.与所述融合蛋白TD-bFGF相关的生物材料，为下述B1）-B5）中至少一种：
B1）编码上述融合蛋白TD-bFGF的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的重组细胞系、含有B2）所述表达盒的重组细胞系、或含有B3）所述重组载体的重组细胞系。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子是DNA，例如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子或是RNA，例如mRNA或hnRNA。
6.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，B1）所述核酸分子为如下1）-4）中任一所示的基因：
1）核酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子或cDNA分子；
2）编码序列是SEQ ID No.1第11-613位所示的DNA分子或cDNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA分子具有75%以上同一性，且编码所述融合蛋白TD-bFGF的DNA分子或cDNA分子；
4）在严格条件下与1）或2）或3）中任一所述限定的DNA分子杂交，且编码所述融合蛋白TD-bFGF的DNA分子或cDNA分子。
7.权利要求1-4任意一项所述融合蛋白TD-bFGF的制备方法，包括：
(1) 将合成的透皮肽片段和bFGF的融合基因连接入真核质粒载体构建真核表达质粒；
(2) 用转染的方法将真核表达质粒转染至CHO细胞株中；
(3) 用含G418的选择培养基筛选整合入融合基因的稳定转染细胞株；
(4) 通过SDS-PAGE电泳筛选出能够高效表达融合蛋白的阳性克隆株；
(5) 进行重复低密度铺板克隆筛后获得稳定且融合蛋白表达量最高的阳性CHO单克隆细胞株；
(6) 将筛选得到的稳定表达融合蛋白阳性克隆株进行悬浮驯化与发酵；用SDS-PAGE电泳方法检测收集蛋白液中融合蛋白的表达量；
(7) 收集发酵液进行蛋白纯化，先通过HIS亲和柱纯化融合蛋白并除去大部分的杂蛋白，上样除去部分杂蛋白并将目的蛋白换液至PBS溶液中；再用缓冲液上离子柱纯化液，获得纯的目的蛋白；
(8) 经膜包置换至PBS缓冲液中，通过创伤测定和安全试验进行评价。
8.权利要求1-3任意一项所述融合蛋白TD-bFGF在制备皮肤涂抹或喷雾制剂中的应用。
9.权利要求1-3任意一项所述融合蛋白TD-bFGF在制备化妆品中的应用。
10.一种皮肤涂抹或喷雾制剂，其特征在于，含有权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白TD-bFGF。
11.含有权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白TD-bFGF与其他蛋白质融合方法。
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