CN106519041B

CN106519041B - 猪免疫球蛋白Fc片段和猪瘟E2融合蛋白在CHO细胞株的构建方法及其制备方法和应用

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Publication number: CN106519041B
Application number: CN201611051616.7A
Authority: CN
Inventors: 李润; 马广鹏; 孙爱娟; 李琳; 史明; 冯丽芳; 杨丽聪; 陈蕾; 程水生
Original assignee: TANGSHAN YIAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd; Beijing Zhonghai Biotech Co Ltd
Current assignee: TANGSHAN YIAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2016-11-24
Filing date: 2016-11-24
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2036-11-24
Also published as: CN106519041A

Abstract

本发明涉及生物技术领域中的疫苗生产技术，具体涉及一种利用基因工程手段构建表达重组蛋白PigFC‑pigSCFVE2的CHO细胞株、及其制备方法和应用。本发明所提供的重组融合蛋白PigFC‑pigSCFVE2，为如下A1)或A2)：A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有PigFC‑pigSCFVE2活性的蛋白质。本发明获得的可以分泌表达PigFC‑pigSCFVE2的单克隆细胞株，融合蛋白表达量较高，经抗体亲和分离纯化所获得融合蛋白能和单抗结合，免疫动物且生成中和抗体高于目前市面产品，其融合蛋白可用于猪瘟预防疫苗，降低生产成本和免疫失败损失。

Description

猪免疫球蛋白Fc片段和猪瘟E2融合蛋白在CHO细胞株的构建方法及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的疫苗生产技术，具体涉及一种利用基因工程手段构建表达重组蛋白PigFC-pigSCFVE2的CHO细胞株、及其制备方法和应用。

背景技术

猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病，具有高度传染性和致死性。猪是该病毒唯一的自然宿主。该传染病于1833年首次发现于美国俄亥俄州，百余年来其流行遍及全球。国际兽疫局将其定为A类传染病，中国《动物防疫法》将其列为一类传染病，是目前危害中国养猪业发展的主要疫病之一。中国猪瘟兔化弱毒疫苗在防治猪瘟中曾起到决定性作用，但近几年来出现免疫效果不理想。

CSFV为有囊膜病毒，40--60nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约123kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)，此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白。cSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码，ORF两侧是5’一端非翻译区(5’-UTR)和3’一端非翻译区(3’-UTR)，且5’一端无帽子结构，3’一端无poly(A)尾巴。这一大前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异蛋白酶作用下加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、c、Erns(E0)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80)，除c、E0、E1和E2为结构蛋白外，其余均为非结构蛋白。在结构蛋白中，最具有免疫防治研究价值的是E0和E2，尤其是E2蛋白是目前亚单位疫苗首选蛋白。

E2蛋白为CSFV的另一囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低、最易变异的分子。gp55常以100kDa的同源二聚体及与gp33形成75kDa的异源二聚体形式存在于病毒粒子及CSFV感染的细胞表面。在体外E2可诱导产生病毒的中和抗体，体内可诱导产生抗CSFV的攻击的抗体。Hulst用E2双相油包水乳剂免疫猪，能抵抗100LD₅₀CSFV Brescia毒株强毒的攻击。gp55的蛋白骨架由370个氨基酸(ORF编码的690-1060氨基酸残基)组成，并以其C端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。由于糖基化程度不同，E2的分子量可为51-58kDa。E2分子内的15个Cys残基在属内均保守，其中N端6个Cys残基参与抗原结构域的形成，C端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成。

用基因工程的方法制备猪瘟亚单位疫苗主要集中在E2这个抗原区域，E2抗原疫苗也是目前控制该病的重要途径之一。尽管目前市场上已有大肠杆菌和杆状病毒等表达猪瘟E2抗原基因工程亚单位疫苗的供应，但人们仍在寻求新的低成本的长效猪瘟E2抗原疫苗的制备方法。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell，简称CHO)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多人用重组蛋白药物已上市。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。

IgG类的免疫球蛋白是血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天，而FC片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因，同时具有稳定蛋白的作用。本发明将该猪FC片段和猪瘟E2抗原蛋白融合，其氨基酸序列从N端到C端依次包括猪FC片段、柔性肽接头和猪瘟E2抗原蛋白质，与现有猪瘟E2相比，克服在体内半衰期短且原核表达产物免疫活性低缺陷，其体内半衰期更长、免疫效果更好，只需要1次免疫且抗原免疫用量更少减少多次疫苗注射应激反应。本发明还涉及重组PigFC-pigSCFVE2融合蛋白组合物在抗猪瘟疫苗上用途。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高猪瘟E2蛋白质在大肠杆菌表达系统中免疫效果差；或其他表达系统表达产物抗体产生时间短以及原核内毒素残留引起免疫死亡的缺陷。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种稳定高效表达猪免疫球蛋白Fc片段和猪瘟E2抗原(CSFVE2)融合蛋白在CHO细胞株的构建方法。本发明获得的可以分泌表达PigFC-pigSCFVE2的单克隆细胞株，融合蛋白表达量较高，经抗体亲和分离纯化所获得融合蛋白能和单抗结合，免疫动物产生中和抗体高于目前市面产品，其融合蛋白可用于猪瘟预防疫苗，降低生产成本和免疫失败损失。

本发明所提供的重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2，为如下A1)或A2)：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有PigFC-pigSCFVE2活性的蛋白质。

为了使A1)或A2)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A1)或A2)中的蛋白质可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A1)或A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与所述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2相关的生物材料，为下述B1)-B5)中至少一种：

B1)编码上述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组细胞系、含有B2)所述表达盒的重组细胞系、或含有B3)所述重组载体的重组细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述与所述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2相关的生物材料中，B1)所述核酸分子为如下1)-4)中任一所示的基因：

1)核酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子或cDNA分子；

2)编码序列是SEQ ID No.1第11-1907位所示的DNA分子或cDNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性，且编码所述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2的DNA分子或cDNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)中任一所述限定的DNA分子杂交，且编码所述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2的DNA分子或cDNA分子。

其中，序列表中的SEQ ID No.1由1911组成，编码序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质。

上述用于编码所述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2的核酸分子的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指核酸序列间的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.1所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

上述生物材料中，所述表达盒，是指能够在重组细胞中表达重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2的DNA，该DNA不但可包括启动PigFC-pigSCFVE2基因转录的启动子，还可包括终止PigFC-pigSCFVE2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述的含有重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2基因的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体pcDNA3.1的多克隆位点插入PigFC-pigSCFVE2基因得到的重组表达载体。所述的重组微生物具体可为哺乳细胞也可以是其他表达系统如酵母类、细菌类、藻类以及植物。哺乳细胞可具体为CHO细胞。本发明的又一个目的是提供了上述蛋白质在作为在猪瘟疫苗中的应用。所述应用包括疾病诊断和或治疗目的的应用。

术语“重组载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。所述重组载体包含本发明的多核苷酸，其连接于一个或多个调控序列，例如启动子和转录和翻译终止信号，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中产生。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组载体，所述重组载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。重组载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的重组细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段；或者，载体可以是一种当被引入重组细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入重组细胞基因组的完整DNA，或可以使用转座子。

所述载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。所述载体优选含有元件，其允许载体整合入重组细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。为了整合入重组细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10000碱基对，400至10000碱基对，和800至10000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可为任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可为非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到重组细胞的基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在重组细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入重组细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的。

术语“重组细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的。术语“重组细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。

所述重组细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体导入重组细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“重组细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。重组细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

另一方面，本发明还涉及用于产生本发明重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2并在中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamsterovary,CHO)中制备方法，包括：

(1)将猪免疫球蛋白Fc片段和猪瘟E2蛋白即融合基因连接入真核质粒载体构建真核表达质粒；

(2)用脂质体转染的方法将真核表达质粒转染至CHO细胞株中；

(3)用含G418的选择培养基筛选整合入融合基因分泌表达PigFC-pigSCFVE2的稳定转染细胞株；

(4)通过SDS-PAGE电泳和蛋白质免疫印迹即Western blot法筛选出能够高效表达融合蛋白的阳性克隆株；

(5)进行重复低密度铺板克隆筛后获得稳定且融合蛋白表达量最高的阳性CHO单克隆细胞株，稳定高效表达猪免疫球蛋白Fc片段和猪瘟E2蛋白的CHO单克隆细胞株，即分泌表达PigFC-pigSCFVE2融合蛋白的CHO单克隆细胞株；

(6)将筛选得到的稳定表达融合蛋白阳性克隆株进行悬浮驯化与发酵；用SDS-PAGE电泳方法检测收集蛋白液中融合蛋白的表达量高的细胞株；

(7)收集发酵液进行蛋白纯化，先通过抗体亲和柱纯化融合蛋白并除去大部分的杂蛋白，上样除去部分杂蛋白并将目的蛋白洗脱至低pH溶液中；再用缓冲液中和低pH纯化液，获得纯的目的蛋白；

(8)经膜包置换至PBS缓冲液中，依据《中国兽药典》，通过安全性、免疫原中和抗体测定和免疫攻毒试验进行评价。

所述融合蛋白在CHO细胞中分泌表达；优先在CHO-gS细胞中表达。所述融合蛋白在CHO细胞中悬浮培养表达。所述真核质粒载体优先选用pcDNA3.1质粒，但不局限于该载体，可以是任何哺乳细胞表达载体。

所述CHO细胞株的用途在于制备抗猪瘟抗原，抗原与佐剂混合免疫动物后可以起到保护动物效果，且对动物安全。

附图说明

图1：合成PigFC-pigSCFVE2酶切图片

图2：pcDNA3.1(-)酶切图片

图3：目的片段连接PCDNA3.1载体菌落PCR筛选

图4：测序正确载体酶切验证

图5：CHO细胞转染前后比较图

图6：CHO细胞株表达融合蛋白单抗筛选图

图7：融合蛋白发酵液纯化结果：其中1、2、3、4为纯化蛋白；5、6为发酵原液

图8：融合蛋白发酵液纯化图

图9-1为融合蛋白安全评价高剂量组空肠的HE染色的图；图9-2为融合蛋白安全评价高剂量组肝的HE染色的图；图9-3为融合蛋白安全评价高剂量组肾脏的HE染色的图

图10-1为攻毒后融合蛋白保护组组织解剖图；图10-2为对照组组织解剖图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

原始菌株以及载体：CHO细胞、pcDNA3.1表达载体，由本公司提供。融合基因按鼠类密码子偏好性合成，由北京梓熙生物公司合成。

酶类及其他生化试剂：内切酶、连接酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自天跟生物，其它均为国产试剂。

CHO培养基：无血清培养基，CDM4CHO培养基，牛血清培养培养基，购自Hyclone公司。

实施例1、PigFC-pigSCFVE2突变体及其编码基因的获得

为了提高野生型E2的长效性，将猪瘟E2的蛋白质序列猪FC抗体片段融合。具体的融合蛋白质具体的蛋白质位点如表1所示。

表2融合蛋白质设计

名称	PigFC-pigSCFVE2
		猪FC片段	22-242
链接肽	243-258
		E2	259-631
E2表位	可选

合成SEQ ID No.1所示的PigFC-pigSCFVE2基因，是将E2蛋白N端融合猪FC片段，其编码序列是SEQ ID No.1的第11-1907位所示，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质PigFC-pigSCFVE2。也可以在E2免疫表位融合在E2蛋白质C端，E2氨基酸残基不变得到的E2的突变体。

实施例2、E2表达抗原的制备

一、重组PigFC-pigSCFVE2重组表达载体的构建

利用NheI和XhoI双酶切PMD18-PigFC-pigSCFVE2载体得到SEQ ID No.1所示的DNA合成DNA核酸分子，2000bp左右片段是目标片段，含有PigFC-pigSCFVE2的编码基因的DNA片段或突变编码基因的DNA片段进行回收纯化。结果如图1。

将纯化后的含有PigFC-pigSCFVE2的编码基因的DNA片段分别与NheI和XhoI双酶切真核表达载体pcCND3.1(-)酶切，效果如图2，合成基因于载体段连接(连接体系为0.5μlpcCND3.1(-)；4.5μl PigFC-pigSCFVE2酶切片段，2xT4快速连接酶，室温3小时)。连接产物转化DH5α感受态细胞，获得阳性重组菌，用PCR鉴定阳性克隆结果如图3。提取阳性载体NheI和XhoI双酶切验证，结果如图4，阳性验证正确的送去测序验证，将测序结果正确的是用SEQID No.1第1-1911位所示的PigFC-pigSCFVE2的编码基因替换pcCND3.1(-)的NheI和XhoI识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcCND3.1(-)-PigFC-pigSCFVE2；对测序正确菌株接种于100ml含氨苄LB培养基250ml三角瓶中，37℃条件下，220rpm摇床培养过夜，用天根无内毒试剂盒抽提载体。pvul酶切后用胶回收试剂盒回收酶切产物，回收产物准备转染哺乳细胞CHO用。

二、融合表达细胞CHO获得的获得

经过pvul酶切后纯化产物，收集CHO细胞。

1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上；转染时，细胞要达到90-95％的融合；

2、溶液1：240μl无血清培养基+10μl lipofectamine 2000/孔(总体积250μl)(温育5min)；

3、溶液2：225μl无血清培养基+25μl(4μg)质粒per well(总体积250μl)；

4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min；

5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml无血清培养基；

6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀；在37℃，5％的CO2中保温5-6小时；

7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48-72h检测转染水平。

如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。

转染前和转染后的细胞形态如图5所示：

三、克隆筛选

待细胞生长两天贴壁后，换液(D001+10％FBS)加压，加G418浓度为1.2-1.8mg/mL。有大量死细胞直接换液不加压，待克隆长出。细胞单克隆长至合适大小，准备挑克隆。将所有克隆挑至96孔板中。置培养箱中培养，待克隆长至铺满80％孔底，取上清SDS-PAGE胶筛选表达量高的细胞株留下继续筛选。

四、细胞悬浮驯化

选择7个初筛蛋白表达高的克隆细胞，将细胞转移至T75培养瓶中培养，连续培养2个月，挑选最终适应悬浮培养高产的细胞株作为工程菌株。单抗WB筛选结果如图6。

五、稳定细胞株的10L发酵流加培养

装液量为5L，转速为100rpm，pH控制为7.2，培养温度为37℃。准备1L种子液，密度为2.0×10⁶个/mL，加入发酵罐中，每天计数，观察细胞状态，当发酵第5天左右细胞密度达到5.0×10⁶左右每天补加补料培养基400mL连续补加6天，此时蛋白浓度达到最大，停止补加补料培养基，1天后停止发酵。发酵过程中用O₂维持发酵罐30％溶氧水平，CO₂和NaHCO₃控制pH 7.2，细胞发酵变化如表3所示。

表3CHO细胞发酵生产PigFC-pigSCFVE2融合蛋白发酵参数

六、重组蛋白的纯化

收集发酵液，5000rpm离心8min获得上清液，用0.22μm的膜过滤。第一步选用buffer A：20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.2，电导18.128ms/cm平衡纯化柱子，用发酵液上样，buffer A淋洗平衡，buffer B：4.5mM柠檬酸钠，25mM柠檬酸PH3.0，电导1.27ms/cm洗脱。洗脱液用0.2M PB中和低pH纯化液，膜包换液到PBS中，经SDS-PAGE检测达到电泳纯。整个纯化工艺步骤衔接较好，上一步层析的洗脱液只需要稍微的调节便可作为下一步处理液。减少中间处理步骤，便于工业化操作和减少中间操作带来的污染。纯化结果如图7和图8。

七、亚单位疫苗的制备

将防腐剂、蛋白保护液、稳定剂等一种或几种成分与分离纯化的Fc融合蛋白混合，将混合物pH值调至生理值，即pH7.0～7.5，加入佐剂组成猪瘟E2亚单位疫苗。佐剂可以选用铝胶、卡伯波971、皂角甙、脂质体、CpG-ODN、纳米佐剂、油乳佐剂等，可选择加入细胞因子如猪干扰素、猪白细胞介素2等，其中PigFC-pigSCFVE2蛋白的有效成分浓度不低于100-500μg/mL，每剂量100-500μg。

八、重组融合蛋白安全性实验

取健康3周龄仔猪和5月龄猪(购置自唐山某猪场)各20头(雌雄各半)，分别随机分2个组，每组10头，共4组(3周1组、3周2组、5月3组、5月4组)。按照如下方法进行单剂量1次注射、单剂量2次注射，和超剂量1次注射。接种安全性实验。

单剂量一次免疫组：3周1组和5月3组按颈部肌肉注射接种1ml疫苗(100μg融合蛋白含量/头)，连续观测2周。

单剂量2次重复免疫组：在单剂量组接种2周后以相同方法剂量再接种一次，继续观测2周。

超剂量一次免疫组：3周2组和5月4组按颈部肌肉注射接种2ml疫苗(500μg融合蛋白含量/头)，连续观测2周。

实验期间，每天观测实验动物临床症状变化，包括精神、采食、活动、呼吸、饮水、注射部位炎症反应、排泄状况，每天体温检测，记录动物异常情况，如死亡，如果有死亡需解剖，观测病理变化，分析原因。

经过2周和连续观测，对注射重组融合疫苗前后的临床症状进行比较，发现单剂量接种和单剂量重复接种组以及超剂量接种组，均饮食正常，精神无不良变化，呼吸及排泄未见异常，注射部位未发现发炎现象，实验期间没有遇到动物有任何不良反应，无死亡猪出现，注射后每天检测动物体温，发现个别组中猪有体温升高现象，但不超过3天，大部分猪体温维持39℃左右。我们对高剂量猪的肝脏肠道肾组织进行免疫组化，发现组织质地均匀，未见病理变化如图9-1、9-2、9-3，及本发明中制备的疫苗蛋白即使以高剂量注射，也无明显副作用，是一种安全免疫蛋白。

九、重组融合蛋白动物免疫实验

将本发明实施制备的PigFC-pigSCFVE2蛋白按照本文7所述制备方法制备疫苗，使其有效抗原量为50μg/mL、100μg/、500μg/mL 3个梯度，按照兽用生物制品规程要求进行成品疫苗的检验，用合格制品进行动物试验。选择4～6周猪瘟抗原及抗体双阴性，蓝耳病原、圆环病原阴性的猪25头雌雄各半，购置自唐山某猪场，分别随机分5个组，每组5头，共5组如表4(PigFC-pigSCFVE2 50μg/ml；PigFC-pigSCFVE2 100μg/ml；PigFC-pigSCFVE2 500μg/ml；疫苗对照组，阴性对照组)。融合蛋白免疫程序按表5方法进行，使用肌肉注射方式进行攻毒，毒株为猪瘟病毒石门系强毒株(AV1411株)，攻击剂量1mL，攻毒后，每天观测实验动物临床症状变化，包括精神、采食、活动、呼吸、饮水、注射炎症反应、排泄状况，每天体温检测，记录动物异常情况，如死亡需解剖，记录病例变化。

表4试验动物分组

分组	头数
		PigFC-pigSCFVE2 50μg/ml	5
PigFC-pigSCFVE2 100μg/ml	5
		PigFC-pigSCFVE2 500μg/ml	5
疫苗组(大华农猪瘟细胞源疫)	5
		阴性对照	5

表5融合蛋白免疫程序安排

试验结果：

抗体水平及攻毒保护情况由表6可以看出，免疫组在首免后21日部分猪只抗体转阳，42日后14日抗体水平趋平；PigFC-pigSCFVE2抗原含量50μg/ml疫苗42日抗体水平在78-86％；PigFC-pigSCFVE2抗原含量100μg/ml疫苗42日抗体水平在78-91％；PigFC-pigSCFVE2抗原含量500μg/ml疫苗42日抗体水平在86-91％；疫苗组42日抗体水平在50-86％，阴性对照抗体水平为阴性。攻毒后，融合蛋白疫苗各组猪只全部健活，能完全保护，市售疫苗组未发生死亡，阴性对照组全部死亡。

表6三种浓度疫苗效力试验抗体检测结果

临床病理分析

PigFC-pigSCFVE2蛋白亚单位疫苗免疫42天后抗体滴度达到70-80％后攻毒，攻毒后每天检测体温，上下午各测一次，从结果看，免疫猪攻毒后体温除个别温次达40℃外，其他体温基本都在39-40℃之间。对照猪攻毒后，各头猪在不同时间出现了体温升高，在40℃-41.8℃之间。免疫组猪攻毒后所有猪精神食欲都良好；未发生死亡现象。疫苗组有一头发病，但未死亡，试验结果表明PigFC-pigSCFVE2融合蛋白亚单位疫苗按50μg/头份剂量对4～6周龄仔均可提供保护。效果高于目前的市面疫苗效果。攻毒后蛋白组和对照组组织解剖比较结果见图10-1、图10-2。

而阴性对照猪在不同时间出现了临床症状：食欲下降、精神萎靡；运动功能障碍，严重者出现共济失调，卧槽不起，腹部皮下、背部、耳背、耳尖、四肢均可见大小不等的出血斑点；有出现严重腹泻、猪群扎堆现象，逐渐死亡。对死亡的猪以及攻毒后14日存活猪进行剖检，采集扁桃体、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结、肠系膜淋巴结、脾脏、肾脏、肺脏、肝脏和肠道组织器官。观察记录病理变化，见表7。

表7

注：“-”表示正常，“+”表示有病变。即：淋巴结肿大，扁桃体溃疡或化脓，脾肿大，肺实变，肾肝有出血点，肠道出血点或淤血，精神食欲差或不吃，皮肤有红斑发绀，便秘或拉稀，有眼结膜炎等

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

<110>

<120> 猪免疫球蛋白Fc片段和猪瘟E2融合蛋白在CHO 细胞株的构建方法及其制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1911

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

SEQ ID No.1

1 GCTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGG

61 TTCCACTGGTGACATCTGCCCCGCCTGCGAGAGCCCCGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCC

121 CCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCCAGGTGACCTGCGTGGTGGT

181 GGACGTGAGCCAGGAGAACCCCGAGGTGCAGTTCAGCTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT

241 GCACACCGCCCAGACCAGGCCCAAGGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTGAG

301 CGTGCTGCCCATCCAGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAGGTGAA

361 CAACAAGGACCTGCCCGCCCCCATCACCAGGATCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGACCAG

421 GGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCCACGCCGAGGAGCTGAGCAGGAGCAAGGTGAG

481 CATCACCTGCCTGGTGATCGGCTTCTACCCCCCCGACATCGACGTGGAGTGGCAGAGGAA

541 CGGCCAGCCCGAGCCCGAGGGCAACTACAGGACCACCCCCCCCCAGCAGGACGTGGACGG

601 CACCTACTTCCTGTACAGCAAGTTCAGCGTGGACAAGGCCAGCTGGCAGGGCGGCGGCAT

661 CTTCCAGTGCGCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCATCAG

721 CAAGACCCCCGGCAAGGGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGG

781 CAGCAGGCTGAGCTGCAAGGAGGACTACAGGTACGCCATCAGCAGCACCAACGAGATCGG

841 CCCCCTGGGCGCCGAGGGCCTGACCACCACCTGGAAGGAGTACAACCACGGCCTGCAGCT

901 GGACGACGGCACCGTGAGGGCCATCTGCACCGCCGGCAGCTTCAAGGTGACCGCCCTGAA

961 CGTGGTGAGCAGGAGGTACCTGGCCAGCCTGCACAAGAGGGCCCTGCCCACCAGCGTGAC

1021 CTTCGAGCTGCTGTTCGACGGCACCAGCCCCGCCATCGAGGAGATGGGCGACGACTTCGG

1081 CTTCGGCCTGTGCCCCTTCGACACCATCCCCGTGGTGAAGGGCAAGTACAACACCACCCT

1141 GCTGAACGGCAGCGCCTTCTACCTGGTGTGCCCCATCGGCTGGATGGGCGTGATCGAGTG

1201 CACCGCCGTGAGCCCCACCACCCTGAGGACCGAGGTGGTGAAGACCTTCAAGAGGGAGAA

1261 GCCCTTCCCCCACAGGGTGGACTGCGTGACCACCATCGTGGAGAAGGAGGACCTGTTCTA

1321 CTGCAAGCTGGGCGGCAACTGGACCTGCGTGAAGGGCAACCCCGTGACCTACACCGGCGG

1381 CCAGGTGAAGCAGTGCAGGTGGTGCGGCTTCGACTTCAAGGAGCCCGACGGCCTGCCCCA

1441 CTACCCCATCGGCAAGTGCATCCTGGCCAACGAGACCGGCTACAGGGTGGTGGACACCAC

1501 CGACTGCAACAGGGACGGCGTGGTGATCAGCACCGAGGGCGAGCACGAGTGCCTGATCGG

1561 CAACACCACCGTGAAGGTGCACGCCCTGGACGGCAGGCTGGCCCCCATGCCCTGCAGGCC

1621 CAAGGAGATCGTGAGCAGCGCCGGCCCCGTGAGGAAGACCAGCTGCACCTTCAACTACAC

1681 CAAGACCCTGAGGAACAAGTACTACGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCAGTACATGCT

1741 GAAGGGCGAGTACCAGTACTGGTTCGACCTGGACGTGACCGACCACCACACCGACTACTT

1801 CGCCGAGTTCGTGGTGCTGGTGGTGGTGGCCCTGCTGGGCGGCAGGTACGTGCTGTGGCT

1861 GATCGTGACCTACATCGTGCTGACCGAGCAGCTGGCCGCCGGCTAAGCTT

<210> 2

<211> 631

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

SEQ ID No.2

1 METGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeuLeuTrpValProGlySerThrGly

21 AspIleCysProAlaCysGluSerProGlyProSerValPheIlePheProProLysPro

41 LysAspThrLeuMETIleSerArgThrProGlnValThrCysValValValAspValSer

61 GlnGluAsnProGluValGlnPheSerTrpTyrValAspGlyValGluValHisThrAla

81 GlnThrArgProLysGluGluGlnPheAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuPro

101 IleGlnHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluPheLysCysLysValAsnAsnLysAsp

121 LeuProAlaProIleThrArgIleIleSerLysAlaLysGlyGlnThrArgGluProGln

141 ValTyrThrLeuProProHisAlaGluGluLeuSerArgSerLysValSerIleThrCys

161 LeuValIleGlyPheTyrProProAspIleAspValGluTrpGlnArgAsnGlyGlnPro

181 GluProGluGlyAsnTyrArgThrThrProProGlnGlnAspValAspGlyThrTyrPhe

201 LeuTyrSerLysPheSerValAspLysAlaSerTrpGlnGlyGlyGlyIlePheGlnCys

221 AlaValMETHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerIleSerLysThrPro

241 GlyLysGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerArgLeu

261 SerCysLysGluAspTyrArgTyrAlaIleSerSerThrAsnGluIleGlyProLeuGly

281 AlaGluGlyLeuThrThrThrTrpLysGluTyrAsnHisGlyLeuGlnLeuAspAspGly

301 ThrValArgAlaIleCysThrAlaGlySerPheLysValThrAlaLeuAsnValValSer

321 ArgArgTyrLeuAlaSerLeuHisLysArgAlaLeuProThrSerValThrPheGluLeu

341 LeuPheAspGlyThrSerProAlaIleGluGluMETGlyAspAspPheGlyPheGlyLeu

361 CysProPheAspThrIleProValValLysGlyLysTyrAsnThrThrLeuLeuAsnGly

381 SerAlaPheTyrLeuValCysProIleGlyTrpMETGlyValIleGluCysThrAlaVal

401 SerProThrThrLeuArgThrGluValValLysThrPheLysArgGluLysProPhePro

421 HisArgValAspCysValThrThrIleValGluLysGluAspLeuPheTyrCysLysLeu

441 GlyGlyAsnTrpThrCysValLysGlyAsnProValThrTyrThrGlyGlyGlnValLys

461 GlnCysArgTrpCysGlyPheAspPheLysGluProAspGlyLeuProHisTyrProIle

481 GlyLysCysIleLeuAlaAsnGluThrGlyTyrArgValValAspThrThrAspCysAsn

501 ArgAspGlyValValIleSerThrGluGlyGluHisGluCysLeuIleGlyAsnThrThr

521 ValLysValHisAlaLeuAspGlyArgLeuAlaProMETProCysArgProLysGluIle

541 ValSerSerAlaGlyProValArgLysThrSerCysThrPheAsnTyrThrLysThrLeu

561 ArgAsnLysTyrTyrGluProArgAspSerTyrPheGlnGlnTyrMETLeuLysGlyGlu

581 TyrGlnTyrTrpPheAspLeuAspValThrAspHisHisThrAspTyrPheAlaGluPhe

601 ValValLeuValValValAlaLeuLeuGlyGlyArgTyrValLeuTrpLeuIleValThr

621 TyrIleValLeuThrGluGlnLeuAlaAlaGly

Claims

1.一种重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2，为如下A1)：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2，其特征在于，在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上选自如下组的标签：Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II、c-myc。

3.与氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2相关的生物材料，为下述B1)-B5)中至少一种：

B1)编码上述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子是DNA，或是RNA。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述DNA核酸分子是cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述RNA核酸分子是mRNA或hnRNA。

6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于，B1)所述核酸分子为如下1)-2)中任一所示的基因：

1)核酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子或cDNA分子；

2)编码序列是SEQ ID No.1第11-1907所示的DNA分子或cDNA分子。

7.权利要求1-2任意一项所述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2的制备方法，包括：

(2)用脂质体转染的方法将真核表达质粒转染至CHO细胞株中；

(7)收集发酵液进行蛋白纯化，先通过抗体亲和柱纯化融合蛋白并除去大部分的杂蛋白，上样除去部分杂蛋白并将目的蛋白用低pH洗脱液洗脱到纯化溶液中；再用缓冲液中和低pH纯化液，获得纯的目的蛋白；

(8)经膜包置换至PBS缓冲液中，根据兽药药典，利用进行安全性、免疫原中和抗体和攻毒评价。

8.权利要求1-2任意一项所述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2在制备诊断、预防和治疗猪瘟疫苗中的应用。