CN115073565B

CN115073565B - 重组新型冠状病毒s蛋白三聚体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115073565B
Application number: CN202210665144.3A
Authority: CN
Inventors: 许文波; 侯占军; 曹蕾; 赵维佳; 李海; 郭晋源; 张燕; 任虎
Original assignee: Huasu Biotechnology Beijing Co ltd
Current assignee: Huasu Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date: 2022-06-13
Filing date: 2022-06-13
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2042-06-13
Also published as: CN115073565A

Abstract

本发明提供一种重组新型冠状病毒S蛋白三聚体及其制备方法与应用。利用本发明重组新型冠状病毒S蛋白三聚体制备的疫苗能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。通过测定中和抗体滴度，结果显示该疫苗可以产生高水平IgG，针对不同新冠毒株(武汉株、南非株、德尔塔株)中和抗体滴度高，对上述野生株和变异株均具有中和保护效果。本发明提供的重组新型冠状病毒S蛋白三聚体制备工艺，可以快速生产，满足新型冠状病毒防控需求。

Description

重组新型冠状病毒S蛋白三聚体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和免疫学领域，具体地说，涉及一种重组新型冠状病毒S蛋白三聚体及其制备方法与应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、类SARS病毒种、单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大部分编码非结构蛋白，参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白，如：S蛋白(spike protein，)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白(nucleo protein)。此外，还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b和orf14，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：N端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)、C端结构域1(CTD1)和C端结构域2(CTD2)，其中RBD主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细胞，因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。

根据WHO划分的“关切变异株”(VOC)和“关注变异株”(VOI)，其中VOC有5种，分别是在英国发现的B.1.1.7(Alpha)、在南非发现的B.1.351(Beta)、在巴西发现的P.1(Gamma)、在印度发现的B.1.617.2(Delta)以及在南非发现的B.1.1.529(Omicron)。经过密切的监测以及现有疫苗对新冠变异株保护效果的研究发现，这些变异株的S蛋白稳定遗传了多种氨基酸突变组合，可导致病毒传播力、致病性增强以及对治疗性抗体和对现有疫苗及恢复期病人血清产生不同程度的免疫逃逸现象。尽管如此，有一些氨基酸突变在多个VOC和VOI病毒株中交叉出现或同时出现，提示病毒在不断适应宿主过程中出现的适应性改变和进化规律。

重组蛋白疫苗是将病毒的目的抗原基因构建在表达载体上,再转化到细菌、酵母、哺乳动物或昆虫细胞中，在一定的诱导条件下，表达出大量的抗原蛋白，通过纯化后制备的疫苗。重组蛋白疫苗能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,并且可以快速制备。

由于哺乳动物细胞表达的培养周期较长，在细胞培养液上清中存在多种蛋白质聚合物，也会释放出细胞宿主蛋白，进而影响目标蛋白质的纯度及均一性。对于预防和/或治疗用的蛋白药物，往往需要较高的纯度来保证避免杂质带来的毒性或免疫原性。因此，亟需开发一种可高效制备纯度和活性较高的重组新型冠状病毒S蛋白的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组新型冠状病毒S蛋白三聚体及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种重组新型冠状病毒S蛋白(单体，ZYB0029)，其包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

本发明提供的重组新型冠状病毒S蛋白单体--ZYB0029，其序列是基于Beta(B.1.351lineage)突变株关键突变位点所设计的，可以使S蛋白处于稳定的融合前三聚体构象(除去跨膜区，TM)，S蛋白相对原始株SARS-CoV-2突变设计如下：

(1)涵盖Beta(B.1.351lineage)突变株S蛋白区域突变位点：L18F、D80A、D215G、Del-L241 L242 A243、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V。

(2)在S1和S2之间的Furin蛋白酶切位点处引入三个突变(S蛋白第682～685位氨基酸由RRAR突变为QQAQ)，以阻断抗原制备表达过程中及人体内Furin蛋白酶对本品酶切；以使其维持在融合前构象。

(3)在S2片段引入K986P和V987P突变，提高S蛋白的稳定性。

(4)加入T4 Foldon基序：替换S蛋白TM跨膜区，利用GS Linker连接T4 Foldon基序，使其有助于蛋白形成三聚体结构。

第二方面，本发明提供由所述重组新型冠状病毒S蛋白组成的三聚体。

第三方面，本发明提供编码所述蛋白或其蛋白三聚体的核酸分子。

第四方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第五方面，本发明提供一种组合物，其包含所述蛋白或其蛋白三聚体，以及药学上可接受的载体。

第六方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含所述的组合物。

该组合物的受试者可以为人或者其他动物。

该组合物的施用方式可以为肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。

第七方面，本发明提供一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗，其包含所述的免疫原性组合物，任选包含佐剂。

所述佐剂可以是铝佐剂、SWE佐剂等。

第八方面，本发明提供所述蛋白或其蛋白三聚体、所述组合物或所述免疫原性组合物的以下任一应用：

1)用于制备新型冠状病毒疫苗；

2)用于制备新型冠状病毒感染检测试剂或试剂盒；

3)用于诱导机体产生体液免疫和细胞免疫；

4)以所述蛋白或其蛋白三聚体作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，用于制备多克隆抗体；

5)预防新冠病毒感染和/或治疗由新型冠状病毒引发的疾病中的用途。

本发明中，所述新型冠状病毒包括但不限于SARS-CoV-2野生株、Delta变体、Beta变体、Alpha变体、Gamma变体、Omicron变体。

第九方面，本发明提供所述蛋白或其蛋白三聚体的制备方法，包括以下步骤：

1)根据目标蛋白的氨基酸序列，通过密码子对应关系和宿主表达频率，利用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法，获得并优化编码所述蛋白或其蛋白三聚体的核酸；

2)将核酸克隆入表达载体，再转化或转染宿主细胞，随宿主细胞的增殖，从而实现目标蛋白在宿主细胞中的表达；

3)从细胞培养物中分离纯化表达的目标蛋白。

其中，所述宿主细胞为大肠杆菌，酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，优选哺乳动物细胞，更优选CHO细胞。

优化后的编码重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的核酸的序列如SEQ ID NO:2所示。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)利用本发明重组新型冠状病毒S蛋白三聚体制备的疫苗能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。通过测定中和抗体滴度，结果显示该疫苗可以产生高水平IgG，针对不同新冠毒株(武汉株、南非株、德尔塔株)中和抗体滴度高，对上述野生株和变异株均具有中和保护效果。可以用于预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染和/或治疗由新型冠状病毒所致疾病。

(二)本发明提供的重组新型冠状病毒S蛋白三聚体制备工艺，可以快速生产，满足新型冠状病毒防控需求。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中预测的重组新型冠状病毒S蛋白三聚体结构。

图2为本发明较佳实施例中ZYB0029克隆酶切琼脂糖电泳图。其中，D：DL15000DNAMarker；M：DL2000 DNA Marker；1-4:ZYB0029阳性克隆。

图3为本发明较佳实施例中ZYB0029表达质粒(ZYB0029-B)图谱。

图4为本发明较佳实施例中S蛋白抗原透射电镜照片。

图5为本发明较佳实施例中S蛋白抗原2D分类结果。

具体实施方式

本发明提供一种重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的制备方法，其能够有效表达S蛋白三聚体，适合于规模化生产，可高效制备出纯度和活性较高的重组新型冠状病毒S蛋白三聚体。

本发明还提供所述重组新型冠状病毒S蛋白三聚体在制备新冠疫苗中的应用。

本发明采用如下技术方案：

1、抗原的设计

选择新冠病毒Spike蛋白全长(胞外区域)作为靶标抗原，利用CHO真核表达系统进行稳定细胞系的筛选和表达。疫苗抗原是基于VOC 202012/01(英国株)、501Y.V2(南非株)以及P.1变异株(巴西株)三种VOC变异株对引起抗体产生逃逸和现有疫苗产生抗体交叉中和保护有所下降的S蛋白突变位点所设计，为了保持新冠病毒S蛋白天然的三聚体构象，通过对特定区域进行氨基酸的突变以阻止病毒发生融合后构象改变以及维持其三聚体结构的外源基因的加入，使得S蛋白处于稳定的融合前三聚体构象。

2、化学名称和结构

重组新型冠状病毒S蛋白单体(ZYB0029)分子式：C₆₀₉₀H₉₃₂₉N₁₅₉₇O₁₈₃₃S₄₀，理论分子量：135.5kD。

三聚体分子式：C₁₈₂₇₀H₂₇₉₈₇N₄₇₉₁O₅₄₉₉S₁₂₀，理论分子量：406.6kD。

预测的三聚体结构如图1所示，ZYB0029单体由1224个氨基酸组成，包括新冠病毒(SARS-CoV-2)Spike蛋白(S蛋白)和T4噬菌体纤维蛋白结构域(Foldon)。

具体地，ZYB0029单体是基于Beta(B.1.351lineage)突变株关键突变位点所设计的，可以使S蛋白处于稳定的融合前三聚体构象(除去跨膜区，TM)，S蛋白相对原始株SARS-CoV-2突变设计如下：

(3)在S2片段引入K986P和V987P突变，提高S蛋白的稳定性。

利用所述重组新型冠状病毒S蛋白三聚体制备的疫苗，可有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。通过测定中和抗体滴度，结果显示该疫苗可以产生高水平IgG，针对不同新冠毒株(武汉株、南非株、德尔塔株)中和抗体滴度高。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1重组新型冠状病毒S蛋白三聚体目的基因的合成与载体构建

在优化后的序列(SEQ ID NO:2)两端分别引入EcoRI、HindIII酶切位点进行合成，为方便试验顺利操作进行，质粒构建过程中使用到的工具载体ZY-CDMO(由北京昭衍生物技术有限公司自行构建，参见CN201910738072.9)经突变酶切位点及功能原件改造后，将合成的ZYB0029序列5’端带有EcoRI酶切位点，3’端带有HindIII酶切位点，插入到载体的EcoRI和HindIII之间，构建获得ZYB0029表达质粒。提取的质粒，用EcoRI/HindⅢ进行酶切鉴定，琼脂糖电泳鉴定结果显示(图2)阳性克隆可以酶切出大小约为5925bp和3748bp的目的片段。经酶切鉴定正确的克隆进行测序，测序正确的克隆命名为ZYB0029-B。ZYB0029表达质粒(即ZYB0029-B)图谱见图3，主要构建元件见表1。S蛋白抗原透射电镜照片见图4。S蛋白抗原2D分类结果见图5。

表1 ZYB0029表达载体主要构建元件描述

实施例2重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的制备

1、表达重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的重组CHO细胞的构建

将含有ZYB0029目的基因序列的表达质粒，通过电转方式导入CHO-K1宿主细胞，24-48小时后，用含蛋氨酸亚砜75μM(MSX)的筛选培养基进行有限稀释，按1×10⁴-1.5×10⁴cell/孔铺板96孔板，置37℃，5％CO₂培养箱静止培养。培养约两周后，显微镜下观察96孔培养板中细胞形状和大小，通过ELISA筛选，将高表达克隆转移至24孔板中，采用同样的方法进行6孔板的筛选和扩增，ZYB0029工程细胞株的建立共进行4个批次的稳定转染，经过96孔板、24孔板及6孔板的ELISA筛选共筛选出8株pool细胞进行下一步实验。根据蛋白表达和细胞生长状况，从6孔板中挑选8个pool细胞进行亚克隆，采用单细胞打印机及克隆成像方法，以每孔1个细胞铺96孔板，静止培养后分别于Day1(铺板当日)、Day2、Day3、Day7、Day13进行克隆成像；通过克隆成像数据挑选合格的单克隆进行ELISA筛选，将高表达单克隆转移至24孔板中。采用同样的方法进行6孔板和摇瓶的筛选和扩增。经96孔板、24孔板、6孔板和摇瓶梯度筛选后，从8株pool细胞中共筛选出28株单克隆株单克隆细胞。筛选出的28株单克隆通过SDS-PAGE检测筛选出9株单克隆进行细胞基因组测序，以确定筛选的细胞株正确表达目的基因。筛选出来的单克隆细胞，在

Advanced CHO Fed-batch medium+50μM MSX培养液中培养。当细胞数量足够时，保存于90％新鲜培养基+20％DMSO冻存液中，以1.0×10⁷vc/ml/支的细胞密度制备细胞库。

2、重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的表达及纯化

(1)细胞复苏培养：通过使用直接解冻法解冻1支细胞，用1mL基础培养基重悬后将细胞加入含有24mL基础培养基的无菌一次性培养摇瓶(125mL)。初始活细胞密度为0.2×10⁶-0.7×10⁶/mL。125mL摇瓶在37.0℃、5.0％CO₂和80％相对湿度(RH)的条件下于摇床中培养4天。当活细胞密度达到2.0×10⁶-6.0×10⁶/mL且细胞存活率大于95％时，进行细胞传代。传代至一次性培养摇瓶(500ml)后体积为100-150ml，传代的接种活细胞密度应为0.5×10⁶-1.5×10⁶/mL。500mL摇瓶在37.0℃、5.0％CO₂和80％相对湿度(RH)的条件下于摇床中培养4天。当活细胞密度达到2.0-6.0×10⁶/mL且细胞存活率大于95％时，进行细胞传代。传代至一次性培养摇瓶(2000L)，工作体积在400-600ml，传代的接种活细胞密度应为0.5×10⁶-1.5×10⁶/mL。2000mL摇瓶在37.0℃、5.0％CO₂和80％相对湿度(RH)的条件下于摇床中培养4天。当活细胞密度达到2.0×10⁶-6.0×10⁶/mL且细胞存活率大于95％时，补充培养基至1200ml，继续培养3天，最终细胞密度达到4.0×10⁶-8.0×10⁶/mL。进行细胞传代。相同的基础培养基，培养条件和传代标准适用于整个摇瓶传代阶段。取工作细胞株进行复苏培养，得到细胞复苏培养物；

(2)细胞扩增培养：在摇瓶传代结束后，将摇瓶培养后的细胞置于生物反应器进行扩增培养，使用50L生物反应器(工作体积10～20L)，使用基础培养基，接种活细胞密度为0.5×10⁶-1.5×10⁶/mL。细胞于生物反应器培养4天后，当细胞密度达到2.0×10⁶～6.0×10⁶/mL，活率＞95％时，补加基础培养基，将细胞密度稀释至0.5×10⁶-1.5×10⁶/mL，完成基础培养基添加，培养体积20-35L。在生物反应器中培养2天后当细胞密度达到2.0×10⁶～6.0×10⁶/mL，活率＞95％时，准备接种到200升生物反应器。

(3)罐培养：将生物反应器中的细胞接种到200L生物反应器中，此时反应器的的工作体积60-105L，使用相同的基础培养基进行补料分批生产，接种活细胞密度应为1.5±0.3×10⁶/mL。温度控制策略为35.0±0.5℃，维持此温度至最终收获；溶氧控制在50±5％；pH控制在7.2±0.2。监测细胞液液面泡沫高度并适当补加消泡剂。每48小时添加培养基体积5％的浓缩培养基，细胞培养周期为14天，或细胞活率低于80％时终止培养。最终收获体积80-140L,细胞密度在0.5×10⁷-1.3×10⁷/mL。

(4)纯化：采用全自动深层过滤系统去除200L生物反应器细胞培养液中的细胞和细胞碎片，然后进行澄清过滤、分子筛、病毒灭活、疏水层析、超滤/渗滤、阴离子交换层析、除病毒过滤即得到蛋白原液，最终经0.2μm过滤器过滤后，放入无菌预组装冷冻袋中，在-70℃以下长期冷冻保存。

实施例3重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗的制备

将实施例2制备的S蛋白三聚体蛋白原液稀释至2倍目标抗原浓度，与佐剂(包括但不限于铝佐剂、SWE、聚肌胞、皂苷)按1:1比例(w/w)混合吸附，并于磁力搅拌器上搅拌40-120min，转速为200-300rpm，获得疫苗半成品，上清残留蛋白含量应低于总蛋白含量的10％，半成品每瓶按0.5mL装量无菌分装后即为疫苗成品。

实施例4重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗不同剂量和时间免疫学效果评价

将实施例3制备的不同抗原含量的疫苗，分别经肌肉注射免疫BALB/c小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，SPF级，雌性，6-8周龄)，免疫和取材具体时间见表2。处死的小鼠取外周血血清和脾脏，制备脾单细胞悬液，开展IFN-γ，IL-4，IL-2和IL-6ELISPOT分析。

不同时间点各组疫苗免疫小鼠脾细胞中分泌细胞因子的抗原特异性T细胞频数汇总见表3。

免疫期间，小鼠对所有疫苗产品均表现出很好的耐受性，各组小鼠体重正常，无异常表现，一般状态良好。

ELISPOT检测结果表明，SWE佐剂配伍抗原免疫小鼠可诱导非常明显的细胞免疫应答。从剂量方面看，抗原剂量3是最佳剂量。佐剂配伍抗原免疫可以更好地诱导偏向Th1的免疫反应，且减少和平衡Th2的免疫反应。免疫程序方面，采用两次免疫的方式，初次免疫后21天进行二次免疫的免疫程序已可充分激活细胞免疫应答，延长两次免疫的间隔对免疫效果无明显影响。

综上所述，佐剂配伍抗原剂量3为最佳佐剂配伍，可诱导明显的Th1型免疫应答，采用两次免疫的方式，初次免疫后21天进行二次免疫的免疫程序已可充分激活细胞免疫应答。

表2动物免疫方案

表3抗原特异性T细胞频数汇总表(平均值±标准差)

实施例5重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗对小鼠抵抗新冠病毒(Beta株和Delta株)感染的保护作用

将制备的不同佐剂和不同抗原含量的疫苗，分别经肌肉注射免疫BALB/c小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，SPF级，雌性，7-8周龄)，分别在0，21d各免疫1针，剂量100ul，分别在14d和35d取血清，测量动物血清与真病毒中和抗体滴度：SARS-CoV-2VOC不同变异Beta株(GD2021，B.1.351)、Wuhan株(Hub01，lineage B)和Delta株(CQ2021，B.1.617.2)均由中国疾控中心病毒病所分离并保存。

表4统计结果表明，在中和抗体滴度指标上，加入佐剂后可以极大提高抗体滴度，针对当前流行的变异株，也可产生较高的抗体滴度。

表4 BALB/c小鼠中和抗体检测结果汇总

注：铝佐剂购自禾大公司，SWE购自赛彼科(上海)特殊化学品有限公司。

实施例6S蛋白三聚体纯化澄清过滤工艺优化

澄清过滤步骤属于层析前的样品预处理，主要包括pH调节及澄清过滤等步骤。

根据层析工艺开发条件，需对上样样品(发酵深层过滤收货液)pH进行调节，调节过程样品由于pH值发生变化会出现不溶性宿主蛋白及核酸等杂质，需要对调节后的样品进行澄清过滤，本实施例主要考察蛋白的回收率，为此开展了如下工艺研究：1)选择两种澄清膜包(3M厂家的60SP02型号深层过滤膜包和Satorius厂家的SARTOPURE GF+0.65μm玻璃纤维过滤器)，在压力控制≤1.5bar的条件下测试两种澄清介质的过滤通量及蛋白回收率。

实验结果表明，Satorius厂家生产的SARTOPURE GF+0.65μm玻璃纤维过滤器的蛋白回收率远优于3M厂家生产的60SP02型号深层过滤膜包澄清的回收率，因此选择将SARTOPURE GF+0.65μm玻璃纤维过滤器用于料液的澄清过滤(表5)。

表5澄清过滤研究结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华素生物科技（北京）有限公司

<120> 重组新型冠状病毒S蛋白三聚体及其制备方法与应用

<130> KHP221114466.7

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1224

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Cys Val Asn Phe Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr

1 5 10 15

Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser

20 25 30

Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn

35 40 45

Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys

50 55 60

Arg Phe Ala Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala

65 70 75 80

Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr

85 90 95

Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn

100 105 110

Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu

115 120 125

Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe

130 135 140

Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln

145 150 155 160

Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu

165 170 175

Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser

180 185 190

Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Gly Leu Pro Gln Gly Phe Ser

195 200 205

Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg

210 215 220

Phe Gln Thr Leu His Ile Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

225 230 235 240

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

245 250 255

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

260 265 270

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

275 280 285

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

290 295 300

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

305 310 315 320

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

325 330 335

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

340 345 350

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

355 360 365

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

370 375 380

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

385 390 395 400

Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

405 410 415

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

420 425 430

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

435 440 445

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

450 455 460

Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

465 470 475 480

Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

485 490 495

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

500 505 510

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

515 520 525

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

530 535 540

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

545 550 555 560

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

565 570 575

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

580 585 590

Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

595 600 605

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

610 615 620

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

625 630 635 640

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

645 650 655

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Gln Gln Ala Gln Ser Val Ala

660 665 670

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Val Glu Asn Ser

675 680 685

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

690 695 700

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

705 710 715 720

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

725 730 735

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

740 745 750

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

755 760 765

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

770 775 780

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

785 790 795 800

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

805 810 815

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

820 825 830

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

835 840 845

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

850 855 860

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

865 870 875 880

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

885 890 895

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

900 905 910

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

915 920 925

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

930 935 940

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

945 950 955 960

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln

965 970 975

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

980 985 990

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu

995 1000 1005

Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val

1010 1015 1020

Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala

1025 1030 1035 1040

Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu

1045 1050 1055

Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His

1060 1065 1070

Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val

1075 1080 1085

Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr

1090 1095 1100

Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr

1105 1110 1115 1120

Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

1125 1130 1135

Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp

1140 1145 1150

Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

1155 1160 1165

Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu

1170 1175 1180

Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Tyr Ile

1185 1190 1195 1200

Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu

1205 1210 1215

Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

1220

<210> 2

<211> 3672

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caatgcgtga attttaccac aagaacacag ctgcctcctg cctacaccaa cagcttcaca 60

agaggcgtgt actaccctga caaggtgttc agaagcagcg tgctgcactc cacccaagac 120

ctgtttctgc ctttcttcag caacgtgacc tggttccacg ccatccacgt gagcggcacc 180

aacggcacca agagattcgc caaccctgtg ctgcctttca acgacggcgt gtacttcgct 240

agcaccgaga agagcaacat catcagaggc tggatcttcg gcaccaccct ggatagcaag 300

acacagagcc tgctgattgt gaacaacgcc accaacgtgg tgatcaaggt gtgcgagttt 360

cagttctgca acgacccttt cctgggcgtg tattatcaca agaacaacaa gagctggatg 420

gagagcgagt tcagagtcta cagcagcgcc aacaactgca ccttcgagta cgtgagccaa 480

cctttcctga tggacctgga gggcaagcaa ggcaacttca agaacctgag ggagttcgtg 540

ttcaagaaca tcgacggcta cttcaagatc tacagcaagc acacccctat caacctggtg 600

agaggcctgc ctcaaggctt cagcgccctg gagcctctgg tggacctgcc tatcggcatc 660

aacatcacaa gatttcagac cctgcacatc agctacctga cccctggaga cagcagcagc 720

ggctggaccg ccggcgctgc cgcctattac gtgggctacc tgcagcctag aaccttcctg 780

ctgaagtaca acgagaacgg caccatcacc gatgccgtgg actgcgccct ggaccctctg 840

agcgagacca agtgcaccct gaagagcttc accgtggaga agggcatcta tcagacaagc 900

aacttcagag tgcagcctac cgagagcatc gtgagattcc ctaacatcac caacctgtgc 960

cctttcggcg aggtgttcaa cgccacaaga ttcgctagcg tgtacgcctg gaacagaaaa 1020

agaatcagca actgcgtggc cgactacagc gtgctgtaca acagcgctag cttcagcacc 1080

ttcaagtgtt acggcgtgag ccctaccaag ctgaacgacc tgtgcttcac caacgtgtac 1140

gccgacagct tcgtgatcag aggcgacgag gtgagacaga tcgcccctgg acagaccggc 1200

aacatcgccg actacaacta caagctgcct gacgacttca ccggctgcgt gatcgcttgg 1260

aacagcaaca acctggacag caaggtgggc ggcaactaca actacctgta cagactgttc 1320

agaaagagca acctgaagcc tttcgagaga gacatcagca ccgagatcta ccaagccggc 1380

agcacccctt gcaacggcgt gaagggcttc aactgctact tccctctgca gagctacggc 1440

tttcagccta cctacggcgt gggctatcag ccttacagag tggtcgtgct gagcttcgag 1500

ctgctgcacg cccctgccac cgtgtgcggc cctaagaaga gcaccaacct ggtgaagaac 1560

aagtgcgtga acttcaactt taacggactg accggcaccg gcgtgctgac cgagagcaac 1620

aagaagttcc tcccttttca gcagttcggc agagacatcg ccgacaccac agacgccgtc 1680

agagaccctc agaccctgga gatcctggac atcacccctt gcagcttcgg cggcgtgagc 1740

gtgatcaccc ctggcaccaa cacaagcaac caagtggccg tgctgtacca aggcgtgaac 1800

tgcaccgagg tgcctgtggc catccacgcc gatcagctga cccctacctg gagagtgtac 1860

agcaccggca gcaacgtgtt tcagacaaga gccggctgcc tgatcggcgc cgagcacgtg 1920

aacaacagct acgagtgcga catccctatc ggcgccggca tctgcgctag ctatcagaca 1980

cagaccaaca gccctcagca agctcagagc gtggctagcc aaagcatcat cgcctacacc 2040

atgagcctgg gcgtggagaa cagcgtggcc tacagcaaca acagcatcgc catccctacc 2100

aacttcacca tcagcgtgac caccgagatc ctgcctgtga gcatgaccaa gacaagcgtg 2160

gactgcacca tgtacatctg cggcgacagc accgagtgca gcaacctgct cctgcagtac 2220

ggcagcttct gcacacagct gaacagagcc ctgaccggca tcgccgtgga gcaagacaag 2280

aacacccaag aggtgttcgc ccaagtgaag cagatctaca agacccctcc tatcaaggac 2340

ttcggcggct tcaacttcag ccaaatcctg cctgacccta gcaagcctag caagaggagc 2400

ttcatcgagg acctgctgtt caacaaggtg accctggccg acgccggctt catcaagcag 2460

tacggcgact gcctgggcga catcgccgct agagacctga tctgcgctca gaagttcaac 2520

ggcctgaccg tgctgcctcc tctgctgacc gacgagatga tcgctcagta cacaagcgcc 2580

ctgctggccg gcacaattac ctccggatgg acattcggcg ccggcgccgc tctgcagatc 2640

cctttcgcca tgcagatggc ctacagattc aacggcatcg gcgtgacaca gaacgtgctg 2700

tacgagaatc agaagctgat cgccaatcag ttcaacagcg ccatcggcaa gatccaagac 2760

agcctgagca gcaccgctag cgccctgggc aagctgcaag acgtggtgaa tcagaacgcc 2820

caagccctga acaccctggt gaagcagctg agcagcaact tcggcgccat cagcagcgtg 2880

ctcaacgaca tcctgagcag actggaccct cctgaggccg aggtgcagat cgacagactg 2940

atcaccggca gactgcagag cctgcagacc tacgtgacac agcagctgat cagagccgcc 3000

gagatcagag ctagcgccaa cctggccgcc accaagatga gcgagtgcgt gctgggacag 3060

agcaagagag tggacttctg cggcaagggc taccacctga tgagcttccc tcagagcgcc 3120

cctcacggcg tggtgttcct gcacgtgacc tacgtgcctg cccaagagaa gaacttcacc 3180

accgcccctg ccatctgcca cgacggcaag gcccacttcc ctagagaggg cgtgttcgtg 3240

agcaacggca cccactggtt cgtgacacag agaaacttct acgagcctca gatcatcacc 3300

accgacaaca ccttcgtgag cggcaactgc gacgtggtga tcggcatcgt gaacaacacc 3360

gtgtacgacc ctctgcagcc tgagctggac agcttcaagg aggagctgga caagtacttc 3420

aagaaccata caagccctga cgtggacctg ggcgatatca gcggcatcaa cgctagcgtg 3480

gtgaacattc agaaggagat cgatagactg aacgaggtgg ccaagaacct gaacgagagc 3540

ctgatcgacc tgcaagagct gggcaagtac gagcagtaca tcaagggcag cggctacatc 3600

cctgaggccc ctagagacgg ccaagcctac gtgagaaagg acggcgagtg ggtgctgctg 3660

agcaccttcc tg 3672

Claims

1.重组新型冠状病毒S蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.由权利要求1所述重组新型冠状病毒S蛋白组成的三聚体。

3.编码权利要求1所述蛋白或其蛋白三聚体的核酸分子。

4.含有权利要求3所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

5.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述蛋白或其蛋白三聚体，以及药学上可接受的载体。

6.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包含权利要求5所述的组合物。

7.重组新型冠状病毒蛋白疫苗，其特征在于，其包含权利要求6所述的免疫原性组合物，任选包含佐剂。

8.权利要求1所述蛋白或其蛋白三聚体、权利要求5所述的组合物或权利要求6所述的免疫原性组合物的以下任一应用：

1)用于制备新型冠状病毒疫苗；

2)用于制备新型冠状病毒感染检测试剂或试剂盒。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒包括SARS-CoV-2野生株、Delta变体、Beta变体、Alpha变体、Gamma变体、Omicron变体。

10.权利要求1所述蛋白或其蛋白三聚体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据目标蛋白的氨基酸序列，通过密码子对应关系和宿主表达频率，利用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法，获得并优化编码权利要求1所述蛋白或其蛋白三聚体的核酸；

3)从细胞培养物中分离纯化表达的目标蛋白；

其中，所述宿主细胞为大肠杆菌，酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为CHO细胞。