WO2022071513A1 - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する改良型ＤＮＡワクチン - Google Patents

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plasmid
nucleic acid
spike protein
cov
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啓徳 中神
竜一 森下
宏樹 林
泰典 天石
幸子 岡本
純一 峰野
久登 猪飼
順子 道端
孝緒 小松野
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国立大学法人大阪大学
タカラバイオ株式会社
アンジェス株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a DNA vaccine for inducing immunity against SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) in humans.
  • SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • Infectious diseases caused by bacteria and viruses are not limited to local infections, but are diseases that have a potential risk of spreading widely in society. It can be a social problem depending on its infectivity and the symptoms caused by the patient. There are many infectious diseases that have triggered important historical events such as smallpox, plague, and the flu (Spanish flu). These have been overcome or reduced by the development and dissemination of chemotherapeutic agents, antibiotics, vaccines, therapeutic agents, etc., and by the development of a hygienic environment. However, the risk of emerging and re-emerging infectious diseases still exists.
  • Vaccines are an effective countermeasure against infectious diseases. Smallpox, which has been feared by people due to its high case fatality rate, has been eradicated by implementing eradication measures on a global scale, and the smallpox vaccine has played a very important role in the process. There are also vaccines that are required by law to be inoculated for serious infections (diphtheria, whooping cough, tetanus, acute gray-white myelitis in Japan) and function effectively to maintain public health. are doing.
  • an influenza vaccine is produced from a large-scale influenza virus produced from chicken eggs.
  • a vaccine containing a specific component of a pathogen manufactured by a genetic engineering method for example, a protein as an active ingredient (component vaccine; for example, Patent Document 1)
  • component vaccine for example, Patent Document 1
  • the nucleic acid itself encoding the protein DNA vaccine; for example, Patent Document 2.
  • RNA vaccine for example, Patent Document 3
  • viral vector vaccine for example, Patent Document 4
  • An object of the present invention is to provide a DNA vaccine for the purpose of prevention and treatment of SARS-CoV-2 infectious disease, which is an emerging infectious disease.
  • the present inventors have conducted extensive studies on the production of a DNA vaccine capable of inducing immunity against SARS-CoV-2, which has high infectivity, in humans, and appropriate codons of the nucleic acid encoding the spike protein of the virus.
  • the present invention was completed by finding that the expression efficiency of the peaplomer in cells is remarkably improved by the modification to the above.
  • the present invention [1] DNA encoding a spike protein of coronavirus (SARS CoV-2) or a fragment thereof, wherein some or all of the codons contained thereof are optimized for expression in humans; [2] The DNA according to [1], wherein about 50% or more of the codons contained in the base sequence encoding the spike protein or a fragment thereof of SARS CoV-2 genomic RNA are converted into other codons; [3] The DNA according to [1], which encodes the total length of the spike protein; [4] The DNA according to [1], which comprises a base sequence having about 90% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, 12, 14, 16 or 18.
  • [5] The DNA according to [4] having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, 12, 14, 16 or 18; [6] A nucleic acid construct containing a promoter that functions in humans and the DNA according to any one of [1] to [5] that is functionally linked to the promoter; [7] Further, the nucleic acid construct according to [6], which contains a transcription termination sequence functionally linked to the DNA according to any one of [1] to [5]; [8] The nucleic acid construct according to [6] or [7] that is integrated into the vector; [9] The nucleic acid construct according to [8], which is integrated into a vector selected from a plasmid vector, a phage vector and a viral vector; [10] A pharmaceutical composition containing the nucleic acid construct according to any one of [6] to [9]; [11] The pharmaceutical composition according to [10] further comprising an adjuvant; [12] The pharmaceutical composition according to [10] or [11], which is a vaccine for coronavirus infection
  • a DNA capable of expressing the spike protein of SARS-CoV-2 in human cells with high efficiency a nucleic acid construct carrying the DNA, and a pharmaceutical composition containing the nucleic acid construct are provided.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful for prevention, symptom relief, or treatment of SARS-CoV-2 virus infection.
  • DNA of the present invention can express a spike protein of coronavirus (SARS-CoV-2) or a fragment thereof in humans, and is used as a DNA vaccine for inducing immunity against the virus.
  • a DNA vaccine is a vaccine in which DNA encoding an antigenic protein of a pathogen is an essential component, unlike a conventional vaccine in which a pathogen itself or a component derived from a specific pathogen is administered to a living body.
  • DNA vaccines are a technology with great expectations from the viewpoint of safety and economy in that they can be produced without handling live pathogens.
  • the DNA of the present invention is a nucleic acid encoding a spike protein of SARS-CoV-2 or a fragment thereof, and a part or all of codons contained in the DNA are optimized for expression in humans. It is a feature. Due to the above-mentioned characteristics, the DNA of the present invention can express a spike protein in a human body with high efficiency, and is suitable for producing a high-titer DNA vaccine.
  • Coronavirus is an enveloped virus with a plus-strand RNA genome and was thought to be the causative virus of relatively minor diseases such as the common cold, but the SARS coronavirus (SARS-CoV) discovered in 2003 is heavy. It has been shown to cause serious respiratory illness. Peplomers that control receptor binding and cell invasion are present in the coronavirus envelope.
  • the DNA of the present invention can efficiently express the spike protein of SARS-CoV-2 (hereinafter, may be simply referred to as spike protein) or a fragment thereof in human cells.
  • the DNA of the present invention may encode the full length of a spike protein consisting of about 1300 amino acids, or may encode a fragment consisting of a part thereof.
  • the above-mentioned "fragment” is not particularly limited as long as it has an antigenicity capable of inducing immunity against SARS-CoV-2, and is about 1/2 or more, preferably about 2/3 or more of the spike protein, more preferably. Is exemplified by fragments having a size of about 3/4 or more, more preferably about 90% or more.
  • the fragment may be any of a fragment containing the N-terminal of the full-length peplomer protein, a fragment containing the C-terminal, or a fragment containing the central region.
  • SARS-CoV peplomer fragment lacking the C-terminal 19 amino acids has improved expression in eukaryotic cells as compared to the peplomer without the deletion (Journal).
  • DNA encoding a SARS-CoV-2 peaplomer with a similar deletion introduced can also be used in the present invention.
  • a preferred embodiment of the present invention includes DNA encoding the full length of the spike protein.
  • SARS-CoV-2 spike protein of this Wuhan strain is referred to as "wild-type amino acid sequence".
  • SARS-CoV-2 spike protein encoded by the DNA of the present invention include, but are not limited to, those having an amino acid sequence of a wild-type spike protein or a fragment thereof, and various mutant viruses. It may have an amino acid sequence of a peaplomer derived from a strain or a fragment thereof.
  • the encoding DNA is also included in the present invention.
  • the "several pieces" include, for example, 2 to 15, preferably 2 to 10 pieces.
  • DNA encoding a spike protein into which a K986P / V987P mutation (2P mutation; bioRxiv, Print.2020 Jun 11), which is known to contribute to high expression can also be used in the present invention.
  • the modified spike protein is about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably about 98% with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 11, 13, 15 or 17 in the sequence listing or a fragment thereof.
  • a spike protein having an amino acid sequence having an amino acid sequence of about 99% or more or a fragment thereof is more preferably exemplified.
  • wild-type base sequences encoding the spike protein of SARS-CoV-2 that is, codons that are present in the base sequence of natural viral genomic RNA and are rarely used in humans, are those that frequently appear in humans.
  • the base sequence of the DNA of the present invention can be obtained by replacing with.
  • the DNA of the present invention about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 60% or more of the codons contained in the base sequence encoding the spike protein or a fragment thereof present on the genomic RNA of SARS-CoV-2. More than 70% is converted into codons suitable for expression in humans, and when introduced into human cells, spike proteins can be expressed with high efficiency.
  • One of the preferred embodiments of the DNA of the present invention is a DNA encoding the full length of a spike protein, eg, a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is exemplified.
  • the DNA encoding the amino acid sequence obtained by modifying (substituting, deleting, inserting or adding an amino acid) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (for example, SEQ ID NOs: 12, 14, 16 and 18). DNA of the base sequence) is provided.
  • a DNA containing a base sequence having an identity of about 98% or more, more preferably a DNA containing a base sequence having an identity of about 99% or more is also exemplified as a preferred embodiment of the present invention.
  • a nucleic acid construct suitable for expression of spike protein in human cells containing the DNA of the present invention was prepared, and the construct was introduced into human cells. It can then be confirmed by examining the state of expression of the spike protein in the cells.
  • the state of expression of the spike protein can be examined, for example, by measuring the transcription amount of the spike protein mRNA in the cell into which the nucleic acid construct is introduced, or by measuring the amount of the spike protein appearing on the cell surface.
  • Examples of the above-mentioned mRNA measurement method include an RT-PCR method and a microarray method, and examples of the spike protein measurement method include an immunological method using, for example, an anti-spike protein antibody.
  • a known method for example, an ELISA method or a method using a cell sorter can be used.
  • the nucleic acid construct of the present invention is a construct that contains the above-mentioned DNA of the present invention and is capable of transcribing mRNA corresponding to a spike protein or a fragment thereof from the DNA in a cell. Specifically, it is a nucleic acid construct containing a promoter that functions in humans and the DNA of the present invention located downstream thereof.
  • the DNA of the present invention is functionally linked to a promoter that functions in humans.
  • “functionally linked” means that the sequence that controls gene expression is present at a position capable of exerting its action on the sequence encoding the desired protein.
  • “promoter is functionally linked” means that the promoter is located upstream of the DNA at a position where transcription can be initiated from the DNA with respect to the DNA encoding the protein. ..
  • the promoter used in the nucleic acid construct of the present invention is not particularly limited as long as it can direct RNA transcription from DNA in humans, and is, for example, a promoter derived from a mammal (PGK promoter, EF1- ⁇ promoter, ⁇ ). -Globin promoter, etc.), virus-derived promoters (CMV promoter, SV40 promoter, MMLV-LTR promoter, HIV-LTR promoter, etc.), artificially constructed promoters (CAG promoter, etc.) can be used.
  • PGK promoter EF1- ⁇ promoter, ⁇ ).
  • -Globin promoter, etc. virus-derived promoters
  • CMV promoter virus-derived promoters
  • SV40 promoter SV40 promoter
  • MMLV-LTR promoter MMLV-LTR promoter
  • HIV-LTR promoter etc.
  • artificially constructed promoters CAG promoter, etc.
  • the nucleic acid construct of the present invention comprises a transcription termination sequence downstream of the DNA of the present invention.
  • Transcription termination sequences include, for example, poly (A) addition signals that function in humans.
  • the poly (A) addition signal that can be used in the nucleic acid construct of the present invention is not particularly limited, but for example, a poly (A) addition signal sequence derived from the SV40 virus and a poly (A) addition derived from the bovine growth hormone gene. A signal sequence or an artificially synthesized poly (A) addition signal can be mentioned.
  • the nucleic acid construct of the present invention may be loaded with an expression control factor other than those described above, for example, an enhancer sequence or the like.
  • expression control factors are also functionally linked to the DNA of the present invention or other factors used in combination, and are also functionally linked to the DNA of the present invention or other factors used in combination. As long as the position of the expression control factor in the nucleic acid construct of the present invention is not particularly limited.
  • the nucleic acid construct of the present invention may contain a plurality of molecules of the DNA of the present invention.
  • each of the plurality of DNAs may be functionally linked to a separate promoter, or expression of a peaplomer or a fragment thereof from the plurality of DNAs is polycistronically achieved by one promoter. May be.
  • Known elements such as an internal ribosome entry site (IRES) or peptides that are automatically cleaved after translation (P2A peptide, T2A peptide, etc.) can be used for the expression of polycistronic proteins.
  • the plurality of DNAs may be the same molecule and have mutations in different molecules (eg, a combination of DNA encoding the full length of the spike protein and DNA encoding the spike protein fragment, DNA encoding the spike protein of the wild-type amino acid sequence). Alternatively, it may be a combination of DNA encoding a modified spike protein, etc.).
  • the nucleic acid construct of the present invention can be used in the form of a DNA fragment, for example, the DNA fragment can be administered to a human to express a spike protein, but it can also be mounted on various vectors and used.
  • the vector on which the nucleic acid construct of the present invention can be mounted include, but are not limited to, a plasmid vector, a phage vector, a virus vector, an artificial chromosome vector, and the like.
  • an appropriate vector may be selected according to the mode of use of the nucleic acid construct of the present invention, and a known available vector or a newly designed vector can be used.
  • the promoter and other expression control factors in the nucleic acid construct of the present invention those held by the vector can be used.
  • the nucleic acid construct of the present invention can be prepared by connecting the DNA of the present invention at an appropriate position with respect to the promoter of the expression vector carrying the promoter.
  • the promoter or expression control factor that the vector does not originally have into the vector together with the DNA of the present invention.
  • the nucleic acid construct of the present invention may be used in a plasmid vector or a viral vector suitable for transient expression (adenoviral vector, adeno-associated virus vector, etc.). It should be installed.
  • adenoviral vector adeno-associated virus vector, etc.
  • an episomal vector capable of replicating in human cells or a viral vector having the ability to integrate the loaded gene into the chromosome retroviral vector, lentiviral vector, etc.
  • the vector on which the nucleic acid construct of the present invention is mounted may contain other elements in addition to the nucleic acid construct.
  • the other elements include, but are not limited to, those necessary for maintaining the function as a vector (for example, an origin of replication, a packaging sequence of a virus vector, etc.).
  • Reporter genes indicating that the vector has been introduced into the target cells eg, fluorescent protein genes, enzyme genes, cell surface protein genes, etc.
  • drug resistance useful for eliminating host cells that do not carry the vector during vector production may be loaded on the vector.
  • the nucleic acid construct of the present invention can be produced by a method well known to those skilled in the art, depending on its shape. Nucleic acid constructs in the form of nucleic acid fragments can be mass-produced without the use of living cells using known nucleic acid amplification methods such as PCR or various isothermal nucleic acid amplification methods. If it is a nucleic acid construct loaded on a vector, the vector can be replicated and amplified in a host to which the vector is compatible.
  • the plasmid is replicated in a host (eg, Escherichia coli) capable of replicating the vector, and then the plasmid is extracted and purified from the host cell by a known method.
  • a host eg, Escherichia coli
  • An isolated plasmid can be obtained.
  • purification of a plasmid from Escherichia coli can be carried out by combining operations such as ribonuclease treatment, column chromatography, and ultrafiltration from the crude plasmid preparation obtained by the alkaline SDS method.
  • many of the viral vectors used in the field of genetic engineering are well known to those skilled in the art, and many cells suitable for the host are commercially available.
  • the viral vector By creating host cells (virus-producing cells) retaining the components necessary for viral vector production and culturing them, the viral vector can be produced intracellularly or in the culture supernatant. Therefore, the nucleic acid construct of the present invention mounted on a viral vector can also be produced without difficulty.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a composition that contains the nucleic acid construct of the present invention and can be administered to humans.
  • the composition is characterized by containing a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the nucleic acid construct of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may have a shape corresponding to the route of administration thereof, and is usually produced as an injection, an infusion, or other form of a parenteral preparation.
  • Carriers that can be included in the parenteral preparation include, for example, an aqueous solution for injection such as an isotonic solution containing physiological saline, glucose or other adjuvants (D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). Can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition of the present invention further comprises, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalconium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, eg, procaine hydrochloride). Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives, antioxidants, etc. may be contained. Further, the pharmaceutical composition of the present invention may be produced as a solid preparation that can be used by dissolving it in an appropriate aqueous solvent at the time of use by using a freeze-drying method or the like.
  • a typical use of the pharmaceutical composition of the present invention is a DNA vaccine preparation against a coronavirus infection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain, for example, an adjuvant as an active ingredient in addition to the nucleic acid construct of the present invention.
  • an adjuvant as an active ingredient in addition to the nucleic acid construct of the present invention.
  • Known classical adjuvants include aluminum hydroxide, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, and Bordetella pertussis adjuvant, as well as liposomes, double-stranded RNA poly (I: C), and CpG oligonucleotides. It is known to have an adjuvant effect.
  • a component that promotes the invasion of the nucleic acid construct of the present invention into cells may be added to the pharmaceutical composition of the present invention.
  • a component for example, a cationic polymer, a cationic lipid, a cationic liposome, which are known nucleic acid introduction promoters, can be used.
  • the nucleic acid construct of the present invention may be encapsulated in liposomes (including modified liposomes), virus-like particles (VLP), hollow AAV capsid particles (for example, International Publication No. 2012/144446), and the like. ..
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be given directivity to a specific cell or tissue.
  • the nucleic acid constructs of the invention incorporated into a viral vector capable of infecting human cells can be actively incorporated into infectable cells.
  • the spike protein expressed from the nucleic acid construct of the present invention or a fragment thereof is recognized as an antigen in the human body.
  • immunity to SARS-CoV-2 is induced in humans, and prevention of infection with the virus and / or reduction of symptoms of the virus infection is achieved.
  • the dose and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention are not particularly limited and may be appropriately adjusted according to the effect to be exhibited.
  • the route of administration is not particularly limited, but it is preferably administered parenterally from the viewpoint of exerting its effect. It is usually administered by injection drip or other means into tissues (for example, intramuscularly), intravenously, intradermally, subcutaneously, intraperitoneally and the like.
  • Example 1 Preparation of DNA Encoding SARS-CoV-2 Spike Protein Information on the SARS-CoV-2 gene of the Wuhan strain is published in GeneBank under the accession number NC_045512. Information on the amino acid sequence of the SARS-CoV-2 spike protein (SEQ ID NO: 1) and the nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) can be obtained from the GeneBank. The DNA of the sequence (SEQ ID NO: 2) corresponding to the base sequence of the viral genomic RNA encoding the spike protein was chemically synthesized.
  • the recognition sequence of the restriction enzyme NheI is restricted by sandwiching 4 bases of 5'-CACC-3'on the 5'side of the start codon of SEQ ID NO: 2 and adjacent to the stop codon (TAA) on the 3'side.
  • the recognition sequences of the enzymes XbaI were added respectively.
  • Example 2 Preparation of Spike Protein Expression plasmid
  • the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 prepared in Example 1 are restricted enzymes NheI and XbaI (both manufactured by Takara Bio Co., Ltd.). ) For double digestion. The obtained DNA fragment was inserted between the NheI and XbaI sites of the plasmid vector pVAX1 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) to prepare a recombinant plasmid.
  • a plasmid to which the open reading frame of the SARS-CoV-2 spike protein was ligated in the direction of being transcribed and translated by the cytomegalovirus (CMV) promoter of pVAX1 was selected, and the plasmid containing the DNA of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was selected.
  • the one containing the DNA of the base sequence of WT and SEQ ID NO: 3 was named plasmid CO, respectively.
  • the T7 promoter which is an element mounted on pVAX1
  • the polyadenylation sequence derived from the bovine growth hormone factor gene is placed in the 3 of the open reading frame. It has each on the'side.
  • the entire base sequence of plasmid CO is shown in SEQ ID NO: 4.
  • Escherichia coli HST08 strain (manufactured by Takara Bio Inc.) transformed with plasmid WT or plasmid CO was cultured in a liquid medium containing kanamycin. From the obtained Escherichia coli cells, a plasmid was purified using NucleoBond XtraMidi (manufactured by Machrai Nagel) and used in the following experiments.
  • Example 3 Preparation of mRNA quantification primer A primer pair for quantifying mRNA of SARS-CoV-2 spike protein transcribed in cells into which either plasmid WT or plasmid CO was introduced was prepared.
  • a pair of CoV-S1-WT-Q1_F (SEQ ID NO: 5) and CoV-S1-WT-Q1_R (SEQ ID NO: 6) (hereinafter referred to as primer vs. WT-1) is used. Synthesized.
  • the mRNA transcribed from plasmid CO is referred to as a pair of CoV-S1-CO-Q3_F (SEQ ID NO: 7) and CoV-S1-CO-Q3_R (SEQ ID NO: 8) (hereinafter referred to as primer vs. CO-3). )
  • primer vs. CO-3 CoV-S1-CO-Q3_F
  • primer vs. CO-3 CoV-S1-CO-Q3_R
  • Example 4 Confirmation of mRNA transcription from recombinant plasmid 1.6 ⁇ 10 5 HEK293T in wells of cell culture plates containing DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin streptomycin. The cells were seeded. The cells were then transformed with 300 ng of plasmid WT, plasmid CO, or pVAX1 using TransIt-293 (Mirus). Cells that were not transformed with the plasmid (mock) were also prepared. These cells were cultured at 37 ° C. under the condition of 5% CO 2 .
  • FBS fetal bovine serum
  • RNA from cells on the second day of culture using NucleoSpin RNA plus (manufactured by Machray Nagel)
  • PrimeScript RT Master Mix (manufactured by Takara Bio Inc.)
  • TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (manufactured by Takara Bio Inc.) were used according to their instruction manuals.
  • Table 1 shows the Ct values measured with the combination of RNA derived from each cell and each primer set.
  • Example 5 Confirmation of peplomer expression
  • HEK293T cells transformed with plasmid WT, plasmid CO, or pVAX1 were prepared by the same procedure as in Example 4.
  • Two groups of cells transformed with the plasmid WT were prepared.
  • the cells on the second day of culture were subjected to analysis with a flow cytometer (BD FACS CantoII; manufactured by BD Bioscience), and the SARS-CoV-2 peplomer positive rate was calculated.
  • BD FACS CantoII flow cytometer
  • the spike protein is a combination of a mouse anti-spike monoclonal antibody (Anti-SARS-CoV-2 Spike, Mouse-Mono (1A9); manufactured by GeneTex) and a PE-labeled anti-mouse IgG antibody (Mouse Immunoglobulins / RPE; manufactured by Agilent). Was detected.
  • Table 2 shows the proportion of peplomer-positive cells in each cell.
  • the proportion of spike protein-positive cells was similar to the background (percentage in pVAX1-introduced cells), but with plasmid CO, expression of spike protein was confirmed in more than 40% of cells. rice field.
  • Example 6 Confirmation of peplomer expression (2) Ability to express spike proteins using HEK293T cells for the plasmid CO prepared in Example 2 and the newly prepared 3 lots of plasmid CO (referred to as ⁇ 1>, ⁇ 2>, and ⁇ 3>, respectively). was verified.
  • Transformation was performed under two conditions: condition A (addition of 200 ng of plasmid to 1.6 ⁇ 10 5 HEK293T cells) and condition B (addition of 500 ng of plasmid to 0.8 ⁇ 10 5 HEK293T cells).
  • condition A addition of 200 ng of plasmid to 1.6 ⁇ 10 5 HEK293T cells
  • condition B addition of 500 ng of plasmid to 0.8 ⁇ 10 5 HEK293T cells.
  • Table 3 shows the proportion of peplomer-positive cells in each cell and the average fluorescence intensity of PE. Histograms of spike protein expression levels in cells obtained by transformation under conditions B, pVAX1, plasmid CO ⁇ 1>, ⁇ 2>, and ⁇ 3> are shown in FIGS. 1 to 4, respectively.
  • plasmid CO was able to stably induce the expression of pedplomer in the introduced cells regardless of the production lot.
  • the positive rate of peplomer expression and the average fluorescence intensity of PE were both correlated with the amount of plasmid used.
  • Example 7 Confirmation of immune induction by recombinant plasmid (1)
  • the plasmid CO prepared in Example 2 was evaluated for its ability to induce immunity with or without an adjuvant.
  • a 96-well plate coated with Recombinant 2019-nCoV Picke S1 + S2 Protein (ECD, His tag; manufactured by Beta Life Science) is blocked with a blocking solution [PBS-T containing 5% skim milk (PBS-T contains 0.05% Tween 20). After blocking with phosphate buffered saline)], serum diluted 8-fold with the blocking solution was added, and the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C. The next day, the wells were washed, HRP (horse radical peroxidase) -labeled anti-rat antibody (manufactured by GH Healthcare) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 3 hours.
  • HRP horse radical peroxidase
  • Example 8 Confirmation of immune induction by recombinant plasmid (2)
  • Six SD rats were administered 666.6 ⁇ g of plasmid CO and 66.7 ⁇ l of ALUM adjuvant per animal.
  • the administration was carried out 3 times every 2 weeks, and blood was collected at the 4th, 6th, and 8th weeks from the start of the administration, and the amount of anti-spiky protein antibody in the serum was measured.
  • the antibody was measured in the same manner as in Example 7 except that a test using Recombinant 2019-nCoV Peplomer protein (RBD; manufactured by Beta Life Science Co., Ltd.) was added as an antigen.
  • RBD Recombinant 2019-nCoV Peplomer protein
  • both the antibody that binds to S1 + S2 and the antibody that binds to RBD were produced in the rat, and both antibodies were already detected in the serum 4 weeks after the start of administration. It became clear that the antibody titer increased over the 8th week.
  • the antibody produced by plasmid CO can recognize the spike protein having the D614G mutation. confirmed.
  • Example 9 Confirmation of Cell-mediated Immunity Induction Cells of plasmid CO using T cell ELISPOT Kits (INF- ⁇ and IL-4; manufactured by U-CyTech Bioscience) according to the procedure described in the instruction manual of the kit. The effect on sexual immunity was investigated.
  • a 96-well plate (manufactured by Millipore) with a PVDF membrane on the bottom was coated with the anti-IFN ⁇ capture antibody or anti-IL4 capture antibody attached to the kit. The plate was washed with a blocking solution. 3 ⁇ 10 5 spleen cells prepared by conventional methods from rats immunized with plasmid CO, together with Recombinant 2019-nCoV Spike S1 + S2 Protein or Recombinant 2019-nCoV Peplomer protein (RBD), were seeded in the wells of the plate. It was kept warm at ° C for 48 hours.
  • Example 10 Evaluation of Toxicity Lung, liver, kidney and heart tissues were collected from rats 7 weeks after immunization with plasmid CO, and HE-stained tissue section specimens were prepared. As a result of observation under a microscope, no evidence of toxicity was observed. In addition, measurements of various biochemical markers in the serum of the same rat did not give any values that deviated from the normal range.
  • Example 11 Preparation of a plasmid carrying a DNA encoding a modified spike protein
  • SARS-CoV-2 mutant strains variants reported by the World Health Organization (WHO)
  • the amino acid sequences of the spike proteins are shown. I verified it.
  • B. 1.1.7 system B. 1.351 system, P.I. 1 system, B. The 1.617.2.
  • Each amino acid sequence (named 4GP, SA, BR, IN, respectively) has mutations derived from each strain, K986P / V987P mutations known to contribute to high expression of spike proteins, and 19 amino acids at the C-terminal. Contains a deletion of.
  • a DNA base sequence suitable for human expression which encodes these amino acid sequences, was designed.
  • Table 4 shows the newly designed amino acid sequence information, each amino acid sequence and the sequence number of the DNA base sequence encoding the amino acid sequence.
  • the positions of amino acids in Table 4 are based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • 70% or more of the codons of the base sequences encoding other than the above-mentioned modified portions in these DNAs are suitable for expression in humans. Has been converted to something else.
  • the DNA of the base sequences of SEQ ID NOs: 12, 14, 16 and 18 was chemically synthesized. Then, by substituting the open reading frame region of the SARS-CoV-2 peplomer loaded on the plasmid CO with these DNAs, a plasmid capable of expressing the modified peplomer was prepared.
  • the obtained plasmids were named plasmid 4GP, plasmid SA, plasmid BR, and plasmid IN, respectively.
  • Escherichia coli HST08 strain was transformed with each plasmid and cultured in a liquid medium containing kanamycin. From the obtained Escherichia coli cells, a plasmid was purified using NucleoBond XtraMidi (manufactured by Machrai Nagel) and used in the following experiments.
  • Example 12 Confirmation of Modified Spike Protein Expression HEK293T cells were transformed with plasmid CO and plasmid 4GP, SA, BR, and IN, respectively, and cultured by the same procedure as in Example 4. The cells on the second day of culture were subjected to analysis with a flow cytometer (BD FACS CantoII), and the expression of SARS-CoV-2 spike protein was examined (4 groups each).
  • anti-S1 antibody SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody (Labit Mab; manufactured by SinoBiological)
  • anti-S2 antibody Anti-SARS-CoV-2 Spike, Mouse-Mon. (1A9) was used in combination with an anti-rabbit secondary antibody and an anti-mouse secondary antibody (both fluorescently labeled), respectively.
  • FIGS. 6 and 7 The results of analysis of spike protein-positive cells in cells transformed with each plasmid using an anti-S1 antibody and an anti-S2 antibody are shown in FIGS. 6 and 7, respectively.
  • the horizontal axis shows the ratio of spike protein-positive cells to all cells
  • the vertical axis shows the average fluorescence intensity of the label-derived fluorescence measured in the test
  • CO, 4GP, SA, BR, and IN are plasmid CO, respectively. 4, GP, SA, BR and IN administration groups are shown. As shown in FIGS.
  • Example 13 Confirmation of Immune Induction by Modified Peplomer
  • the plasmid 4GP was evaluated for immune induction by the method described in Example 7. It was shown that the production of anti-peplomer antibody was higher in the rats in the plasmid 4GP-administered group than in the plasmid CO-administered group 2 weeks after the administration. Further, when the state of antibody production was investigated by continuing the breeding, no difference in the amount of antibody production between the two plasmids was observed. This was thought to be due to the saturation of production.
  • Example 14 Analysis of Antibodies Produced by Modified Peplomer
  • the immunoinducible ability was evaluated using plasmid CO and plasmid SA.
  • Three groups of 3 to 8 SD rats purchased from Japan Marie Co., Ltd.) were prepared.
  • a mixture of 666.6 ⁇ g / 333.3 ⁇ L of pVAX (control), plasmid CO, or plasmid SA and 66.7 ⁇ L of ALUM adjuvant (manufactured by InVivogen) was prepared, and 400 ⁇ L (rats) per rat in each group. 200 ⁇ L each was administered to the left and right tibialis anterior muscles. Rats were bred in an environment with free access to food and water.
  • the antibody titers of the antibodies contained in the above four sera against various SARS-CoV-2 spike proteins were measured.
  • the spike protein a spike protein having an amino acid sequence derived from Wuhan strain, Alpha strain, Beta strain, and Gamma strain (all manufactured by ACRO Biosystems; with His-Tag) was used.
  • the 96-well plate coated with the above-mentioned spike protein was blocked with a blocking solution [PBS-T containing 5% skim milk], serum diluted 50-fold with the blocking solution was added, and the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C. The next day, the wells were washed, HRP-labeled anti-rat antibody (manufactured by GH Healthcare) was added, and the cells were allowed to stand at room temperature for 3 hours.
  • Fig. 8 The results are shown in Fig. 8.
  • the horizontal axis indicates the type of plasmid administered to the rat prepared with serum (AG0302 means plasmid CO, AG0304 means plasmid SA, and Normal means the plasmid-non-administered group).
  • Wuhan, UK, SA, and BR showing the types of spike proteins in the figure mean spike proteins of Wuhan strain, Alpha strain, Beta strain, and Gamma strain, respectively.
  • the sera of rats treated with plasmid CO and plasmid SA produced antibodies capable of reacting with all the spike proteins used.
  • the antibody produced in the rat to which the plasmid SA was administered showed an antibody titer equivalent to or slightly higher than that produced by the plasmid CO against the peaplomers of the Wuhan strain and the Alpha strain, and also showed the same or slightly higher antibody titer to the Beta strain and Gamma strain. There was a tendency to show higher reactivity to the strain spike protein.
  • SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence of SARS-CoV-2 spike protein SEQ ID NO: 2; A nucleotide sequence corresponding to the wild-type RNA coding SARS-CoV-2 spike protein SEQ ID NO: 3; A codon-modified DNA sequence coding SARS-CoV-2 spike protein SEQ ID NO: 4; A full length nucleotide sequence of plasmid CO SEQ ID NO: 5; Primer CoV-S1-WT-Q1_F SEQ ID NO: 6; Primer CoV-S1-WT-Q1_R SEQ ID NO: 7; Primer CoV-S1-CO-Q3_F SEQ ID NO: 8; Primer CoV-S1-CO-Q3_R SEQ ID NO: 9; Primer GAPDH_F SEQ ID NO: 10; Primer GAPDH_R SEQ ID NO: 11; An amino acid sequence of modified SARS-CoV-2 spike protein (4GP) SEQ ID NO: 12; A nucleotide sequence coding modified

Abstract

コロナウイルス（ＳＡＲＳ　ＣｏＶ－２）のスパイクタンパク質又はその断片をコードするＤＮＡであって、前記ＤＮＡの配列に含まれるコドンの一部もしくは全部がヒトでの発現について至適化されている、ＤＮＡが提供される。

Description

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する改良型ＤＮＡワクチン
　本発明は、ヒトにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）に対する免疫を誘導するためのＤＮＡワクチンに関する。
　細菌やウイルスにより引き起こされる感染症は局地的な感染にとどまらず、社会に広く蔓延する潜在的なリスクを持つ疾患である。その感染力や患者に引き起こされる症状によっては社会的問題となることもある。天然痘、ペスト、インフルエンザ（スペイン風邪）等、歴史上重要なイベントの引き金ともなった感染症も少なくない。これらは化学療法剤、抗生物質、ワクチン、治療薬等の開発・普及によって、また衛生的環境の整備によって克服され、もしくはその脅威を減じられてきた。しかしながら、新興・再興感染症のリスクは現在も存在し続けている。
　ワクチンは有効な感染症対策である。高い致死率から人々に恐れられてきた天然痘は世界規模での根絶策の実施によって根絶されたが、その過程で天然痘ワクチンの果たした役割は非常に大きい。重篤な感染症に関しては法律によって接種を受けることが義務づけられたワクチンも存在しており（日本においてはジフテリア、百日咳、破傷風、急性灰白白髄炎）、公衆衛生を維持するうえで有効に機能している。
　古典的なワクチンとしては病原体の自然的あるいは人工的な弱毒株や化学的、物理的処理により不活化した病原体が知られている。例えば、インフルエンザワクチンは鶏卵を用いて大規模に製造されたインフルエンザウイルスを原料として製造される。
　近年では遺伝子工学的手法で製造された病原体の特定成分、例えばタンパク質を有効成分とするワクチン（コンポーネントワクチン；例えば特許文献１）の他、前記タンパク質をコードする核酸自体（ＤＮＡワクチン；例えば特許文献２、ＲＮＡワクチン；例えば特許文献３）、前記の核酸を搭載したウイルスベクター（ウイルスベクターワクチン；例えば特許文献４）についての研究が進められている。
　前記のとおり、病原体自体を大量に製造することなくワクチンを製造する技術が開発されつつある。しかし実用に足る性能を備えたワクチンを創製するためには試行錯誤を重ね、対象となる病原体やその成分に応じてワクチンを設計することが求められている。
国際公開第２０１８／０７４５５８号パンフレット 国際公開第２０１４／０３４７３５号パンフレット 国際公開第２０１８／０７５９８０号パンフレット 国際公開第２０１８／１８９５２２号パンフレット
　本発明の目的は、新興感染症であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防、治療を目的とするＤＮＡワクチンを提供することにある。
　本発明者らは、ヒトにおいて、高い感染力を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導することができるＤＮＡワクチンの製造について鋭意研究を重ね、前記ウイルスのスパイクタンパク質をコードする核酸のコドンを適切に改変することにより、細胞内におけるスパイクタンパク質の発現効率が顕著に向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、
［１］コロナウイルス（ＳＡＲＳ　ＣｏＶ－２）のスパイクタンパク質又はその断片をコードするＤＮＡであって、含まれるコドンの一部もしくは全部がヒトでの発現について至適化されている、ＤＮＡ；
［２］ＳＡＲＳ　ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡの、スパイクタンパク質又はその断片をコードする塩基配列に含まれるコドンの約５０％以上が他のコドンに変換されている、［１］記載のＤＮＡ；
［３］スパイクタンパク質の全長をコードする、［１］記載のＤＮＡ；
［４］配列番号３、１２、１４、１６または１８に示される塩基配列と約９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む、［１］記載のＤＮＡ；
［５］配列番号３、１２、１４、１６または１８に示される塩基配列を有する［４］記載のＤＮＡ；
［６］ヒトにおいて機能するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結された［１］～［５］いずれか記載のＤＮＡ、を含有する核酸構築物；
［７］さらに、［１］～［５］いずれか記載のＤＮＡに機能的に連結された転写終結配列を含有する［６］記載の核酸構築物；
［８］ベクターに組み込まれてなる［６］又は［７］記載の核酸構築物；
［９］プラスミドベクター、ファージベクターおよびウイルスベクターから選択されるベクターに組み込まれてなる［８］記載の核酸構築物；
［１０］［６］～［９］いずれか記載の核酸構築物を含有する医薬組成物；
［１１］さらにアジュバントを含む［１０］記載の医薬組成物；
［１２］コロナウイルス感染症のワクチンである、［１０］又は［１１］記載の医薬組成物；
［１３］［１２］記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、コロナウイルス感染症の予防、症状の軽減、または治療方法；
［１４］スパイクタンパク質のＣ末端欠失断片をコードする、［１］記載のＤＮＡ；
［１５］Ｋ９８６Ｐ及び／又はＶ９８７Ｐ変異を含むスパイクタンパク質又はその断片をコードする、［１］記載のＤＮＡ
等を提供する。
　本発明により、ヒト細胞内において高効率でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を発現することができるＤＮＡ、当該ＤＮＡを保持する核酸構築物、当該核酸構築物を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症の予防、症状の軽減、または治療に有用である。
対照の細胞におけるスパイクタンパク質の発現を示す図である。 本発明の核酸構築物を導入された細胞におけるスパイクタンパク質の発現を示す図である。 本発明の核酸構築物を導入された細胞におけるスパイクタンパク質の発現を示す図である。 本発明の核酸構築物を導入された細胞におけるスパイクタンパク質の発現を示す図である。 本発明の核酸構築物を投与されたラットにおける抗スパイクタンパク質抗体の産生を示す図である。 本発明の核酸構築物を導入された細胞におけるスパイクタンパク質陽性率および蛍光強度を示す図である。 本発明の核酸構築物を導入された細胞におけるスパイクタンパク質陽性率および蛍光強度を示す図である。 本発明の核酸構築物を投与されたラットで産生された抗体とスパイクタンパク質との反応を示す図である。
１．本発明のＤＮＡ
　本発明のＤＮＡは、ヒトにおいてコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイクタンパク質又はその断片を発現させることができ、前記ウイルスに対する免疫を誘導するＤＮＡワクチンとして使用される。ＤＮＡワクチンは、病原体そのものや特定の病原体由来成分を生体に投与する従来のワクチンとは異なり、病原体の抗原性タンパク質をコードするＤＮＡを必須の構成成分とするワクチンである。ＤＮＡワクチンは、生きた病原体を取扱うことなく製造することができる点で、安全性ならびに経済性の観点から大きな期待が寄せられている技術である。
　本発明のＤＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はその断片をコードする核酸であって、前記ＤＮＡに含まれるコドンの一部もしくは全部がヒトでの発現について至適化されていることを特徴とする。前記の特徴により、本発明のＤＮＡはヒト体内において高い効率でスパイクタンパク質を発現することができ、高力価のＤＮＡワクチンの製造に好適である。
　コロナウイルスはプラス鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスであり、鼻風邪のような比較的軽微な疾患の原因ウイルスと考えられていたが、２００３年に発見されたＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）は重篤な呼吸器疾患を引き起こすことが明らかとされた。コロナウイルスのエンベロープには受容体への結合と細胞侵入を司るスパイクタンパク質が存在している。本発明のＤＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が有するスパイクタンパク質（以下、単にスパイクタンパク質と記載することがある）もしくはその断片をヒト細胞内で効率よく発現させることができる。
　本発明のＤＮＡは、約１３００個のアミノ酸からなるスパイクタンパク質の全長をコードするものであってもよく、又はその一部からなる断片をコードするものであってもよい。前記の「断片」としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導しうる抗原性を備えていれば特に限定はなく、スパイクタンパク質の約１／２以上、好ましくは約２／３以上、より好ましくは約３／４以上、さらに好ましくは約９０％以上のサイズの断片が例示される。また、該断片は、全長スパイクタンパク質のＮ末端を含む断片、Ｃ末端を含む断片、または中央領域を含む断片のいずれであってもよい。Ｃ末端の１９個のアミノ酸を欠失したＳＡＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質の断片は、真核細胞内において前記欠失を有しないスパイクタンパク質に比べて発現量が向上することが示唆されており（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，Ｖｏｌ．８６，ｐ２２６９－２２７４）、同様の欠失を導入したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするＤＮＡも本発明に使用することができる。本発明の好適な態様としては、スパイクタンパク質の全長をコードするＤＮＡが挙げられる。
　ＧｅｎｅＢａｎｋにＮＣ＿０４５５１２のアクセッション番号で、武漢（Ｗｕｈａｎ）で単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の情報が公開されている。本明細書では、このＷｕｈａｎ株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列を「野生型のアミノ酸配列」と記載する。本発明のＤＮＡがコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質としては、野生型スパイクタンパク質又はその断片のアミノ酸配列を有するものが例示されるが、これに限定されるものではなく、種々の変異ウイルス株に由来するスパイクタンパク質又はその断片のアミノ酸配列を有するものであってもよい。前記アミノ酸配列に１個以上、例えば１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失（例えばアミノ酸配列内部におけるアミノ酸の欠失）、挿入、および／または付加が生じた改変スパイクタンパク質又はその断片をコードするＤＮＡも本発明に包含される。ここで、「数個」には、例えば２～１５個、好ましくは２～１０個が包含される。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者から分離された変異体ウイルスが有していた、Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質（Ｐａｔｈｏｇｅｎ，２０２０，Ｖｏｌ．９，３２４）をコードするＤＮＡや、コロナウイルススパイクタンパク質の高発現に寄与することが知られているＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ変異（２Ｐ変異；ｂｉｏＲｘｉｖ，Ｐｒｅｐｒｉｎｔ．２０２０　Ｊｕｎ　１１）を導入したスパイクタンパク質をコードするＤＮＡも本発明に使用することができる。前記の改変スパイクタンパク質としては、配列表の配列番号１、１１、１３、１５または１７に示されるアミノ酸配列またはそれらの断片と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上、さらに好ましくは約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質又はその断片が例示される。
　本発明において、ヒトでの発現についてのコドンの至適化は、例えばヒトでの使用頻度の低いコドンをヒトでの使用頻度の高いコドンに変換することにより達成される。コドンの変換は公知の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，第３０巻，ｅ４３，２００２年；国際公開第２００４／０５９５５６号パンフレット；国際公開第２００７／１０２５７８号パンフレット等)を参照して実施することができる。また、ヒトにおけるコドンの使用頻度に関する情報が公開されている（http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=9606）。これを参照し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をコードする野生型塩基配列、すなわち天然のウイルスゲノムＲＮＡの塩基配列に存在するヒトでの使用頻度が低いコドンを、ヒトにおける出現頻度の高いものに置き換えることにより本発明のＤＮＡの塩基配列を得ることができる。本発明のＤＮＡでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡ上に存在する、スパイクタンパク質又はその断片をコードする塩基配列に含まれるコドンの約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上がヒトでの発現に適したコドンに変換されており、ヒト細胞に導入された際には高い効率でスパイクタンパク質を発現することができる。本発明のＤＮＡの好適な態様の一つはスパイクタンパク質の全長をコードするＤＮＡであり、例えば配列番号３に示される塩基配列を有するＤＮＡが例示される。また、別の態様として、配列番号１のアミノ酸配列を改変（アミノ酸の置換、欠失、挿入または付加）して得られたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（例えば配列番号１２、１４、１６および１８の塩基配列のＤＮＡ）が提供される。さらに、配列番号３、１２、１４、１６または１８の塩基配列と約９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ、好ましくは約９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ、より好ましくは約９８％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ、さらに好ましくは約９９％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡも本発明の好適な態様として例示される。
　コドンの変換によるヒトでのスパイクタンパク質発現効率の向上は、本発明のＤＮＡを含む、ヒト細胞内でのスパイクタンパク質の発現に適した核酸構築物を作製したうえ、当該構築物をヒト細胞に導入し、次いで当該細胞におけるスパイクタンパク質の発現の状態を調べることにより確認することができる。前記の、スパイクタンパク質の発現の状態は、例えば、前記の核酸構築物が導入された細胞におけるスパイクタンパク質ｍＲＮＡの転写量の測定や、細胞表面に出現するスパイクタンパク質の量の測定により調べることができる。前記のｍＲＮＡ測定方法としては例えばＲＴ－ＰＣＲ法やマイクロアレイ法が、またスパイクタンパク質の測定方法としては例えば抗スパイクタンパク質抗体を使用する免疫学的方法が、それぞれ挙げられる。さらに、スパイクタンパク質を免疫学的に測定する際には公知の方法、例えばＥＬＩＳＡ法やセルソーターを使用する方法を利用することができる。
２．本発明の核酸構築物
　本発明の核酸構築物は、前記の本発明のＤＮＡを含み、かつ細胞内において当該ＤＮＡからスパイクタンパク質又はその断片に対応するｍＲＮＡを転写できる構築物である。具体的には、ヒトにおいて機能するプロモーターと、その下流に位置する本発明のＤＮＡとを含有する核酸構築物である。
　本発明の核酸構築物において、本発明のＤＮＡはヒトにおいて機能するプロモーターに機能的に連結されている。ここで「機能的に連結されている」とは、遺伝子発現を制御する配列が所望のタンパク質をコードする配列に対してその作用を与えうる位置に存在することを言う。例えば、「プロモーターが機能的に連結されている」とは、タンパク質をコードするＤＮＡに対して、当該ＤＮＡから転写を開始させ得る位置、すなわち当該ＤＮＡの上流にプロモーターが配置されていることを言う。
　本発明の核酸構築物に使用されるプロモーターとしては、ヒトにおいてＤＮＡからのＲＮＡ転写を指示し得るものであれば特に限定はなく、例えば、哺乳動物由来のプロモーター（ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１－αプロモーター、β－グロビンプロモーター等）、ウイルス由来のプロモーター（ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＭＬＶ－ＬＴＲプロモーター、ＨＩＶ－ＬＴＲプロモーター等）、人工的に構築されたプロモーター（ＣＡＧプロモーター等）が使用できる。本発明には構成的なプロモーター、または誘導性プロモーターのいずれもが使用できる。後者を使用する場合には、通常は適切な誘導物質が併用される。
　好適な態様においては、本発明の核酸構築物は、本発明のＤＮＡの下流に転写終結配列を備えている。転写終結配列としては、例えばヒトにおいて機能するポリ（Ａ）付加シグナルが挙げられる。本発明の核酸構築物に使用できるポリ（Ａ）付加シグナルとしては、特に限定するものではないが、例えば、ＳＶ４０ウイルス由来のポリ（Ａ）付加シグナル配列、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリ（Ａ）付加シグナル配列、または人工的に合成されたポリ（Ａ）付加シグナルを挙げることができる。さらに、本発明の核酸構築物に、前記したもの以外の発現制御因子、例えばエンハンサー配列等を搭載してもよい。これらの発現制御因子も、本発明のＤＮＡもしくは併用されるその他の因子に対して機能的に連結されており、本発明のＤＮＡもしくは併用されるその他の因子に対して機能的に連結されている限り、本発明の核酸構築物における該発現制御因子の位置は特に限定されない。
　さらに、本発明の核酸構築物は本発明のＤＮＡを複数分子含むものであってもよい。この場合、前記複数のＤＮＡはそれぞれが別個のプロモーターと機能的に連結されていてもよく、あるいは複数のＤＮＡからのスパイクタンパク質又はその断片の発現がひとつのプロモーターによってポリシストロニックに達成されるものであってもよい。ポリシストロニックなタンパク質の発現には、公知の要素、例えば内部リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ；ＩＲＥＳ）または翻訳後に自動切断されるペプチド（Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド等）を利用することができる。前記の複数のＤＮＡは同一の分子でもよく、異なる分子（例えば、スパイクタンパク質全長をコードするＤＮＡとスパイクタンパク質断片をコードするＤＮＡの組み合わせ、野生型アミノ酸配列のスパイクタンパク質をコードするＤＮＡと変異を有するもしくは改変されたスパイクタンパク質をコードするＤＮＡの組み合わせ、等）であってもよい。
　本発明の核酸構築物は、ＤＮＡ断片の形状で使用すること、例えば該ＤＮＡ断片をヒトに投与してスパイクタンパク質を発現させることもできるが、種々のベクターに搭載して使用することもできる。本発明の核酸構築物を搭載可能なベクターとしては、限定するものではないが、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター等が挙げられる。前記のベクターは、本発明の核酸構築物の使用の態様に応じて適切なものを選択すればよく、入手可能な公知のベクター、あるいは新たに設計したベクターを使用することができる。なお、本発明の核酸構築物におけるプロモーターやその他の発現制御因子にはベクターが保持していたものを利用することができる。例えば、プロモーターを保持する発現ベクターの、当該プロモーターに対して適切な位置に本発明のＤＮＡを接続することにより、本発明の核酸構築物を作製することができる。もちろん、ベクターが元来有していないプロモーターや発現制御因子を本発明のＤＮＡとともにベクターに組み込むことも可能である。
　ヒトにおいて一過的にスパイクタンパク質を発現させることが求められる場合には、例えばプラスミドベクターや一過性発現に適したウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等）に本発明の核酸構築物を搭載すればよい。長期にわたりスパイクタンパク質を発現させることが望まれる場合には、ヒト細胞内で複製可能なエピゾーマルベクターや、搭載された遺伝子を染色体に組み込む能力を有するウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）を利用することができる。
　本発明の核酸構築物が搭載されたベクターは、当該核酸構築物に加えて、その他の要素を含んでいてもよい。前記その他の要素としては、例えば、ベクターとしての機能の維持に必要なもの（例えば複製開始点やウイルスベクターのパッケージング配列等）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。標的細胞にベクターが導入されたことを示すレポーター遺伝子（例えば蛍光タンパク質遺伝子、酵素遺伝子、細胞表面タンパク質遺伝子等）、またはベクター製造の際にベクターを保持しない宿主細胞を排除するのに有用な薬剤耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等）がベクターに搭載されていてもよい。
　本発明の核酸構築物は、その形状に応じて、当業者に周知の方法で製造することができる。核酸断片の形状である核酸構築物は、公知の核酸増幅法、例えばＰＣＲ法または各種の等温核酸増幅法を利用して、生細胞を使用することなく大量に製造することができる。ベクターに搭載された核酸構築物である場合、当該ベクターが適合する宿主内でベクターを複製および増幅させて製造することができる。プラスミドベクターに搭載された本発明の核酸構築物の場合は、当該ベクターが複製できる宿主（例えば大腸菌）内でプラスミドの複製を促し、次いで宿主細胞から公知の方法でプラスミドを抽出および精製することにより、単離されたプラスミドを得ることができる。例えば、大腸菌からのプラスミドの精製は、アルカリＳＤＳ法により得た粗プラスミド調製物から、リボヌクレアーゼ処理、カラムクロマトグラフィー、限外ろ過等の操作を組み合わせて実施することができる。また、遺伝子工学分野で利用されているウイルスベクターの多くはその製造方法も当業者に周知であり、宿主に適した細胞も数多く市販されている。ウイルスベクター産生に必要なコンポーネントを保持させた宿主細胞（ウイルス産生細胞）を作成し、これを培養することにより、細胞内もしくは培養上清中にウイルスベクターを産生させることができる。したがって、ウイルスベクターに搭載された本発明の核酸構築物も困難なく製造することができる。
３．本発明の医薬組成物
　本発明の医薬組成物は、前記の本発明の核酸構築物を含有する、ヒトに投与可能な組成物である。当該組成物は、本発明の核酸構築物の他、薬学的に許容される担体を含有することを特徴とする。本発明の医薬組成物はその投与経路に応じた形状であればよく、通常は、注射剤、点滴剤、またはその他の形状の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖またはその他の補助薬（Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）を含む等張液のような注射用の水性液が挙げられる。本発明の医薬組成物は、さらに、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を含有していてもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、凍結乾燥法等を利用して、用時に適切な水性溶媒に溶解して使用することのできる固形の製剤として製造されてもよい。
　本発明の医薬組成物の代表的用途は、コロナウイルス感染症に対するＤＮＡワクチン製剤である。ワクチンとしての性能を向上させる、すなわち投与時の免疫応答を活性化させる観点からは、本発明の医薬組成物は、本発明の核酸構築物に加えて、有効成分として、例えばアジュバントを含んでいてもよい。古典的なアジュバントとしては水酸化アルミニウム、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント等が知られており、さらにリポソーム、二本鎖ＲＮＡであるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド等もアジュバント効果を持つことが知られている。
　本発明の核酸構築物の細胞への侵入を促進する成分を本発明の医薬組成物に添加してもよい。前記成分として、例えば、公知の核酸導入促進剤であるカチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性リポソーム等を使用することができる。また、本発明の核酸構築物をリポソーム（修飾リポソームを含む）、ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ　ｌｉｋｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ；ＶＬＰ）、または中空ＡＡＶカプシド粒子（例えば国際公開第２０１２／１４４４４６号パンフレット）等に封入してもよい。このような物質との組み合わせにより、本発明の医薬組成物に特定の細胞または組織への指向性を付与することもできる。例えば、ヒト細胞に感染する能力を有するウイルスベクターに組み込まれた本発明の核酸構築物は、当該ウイルスベクターが感染可能な細胞に能動的に取り込まれることができる。
　本発明の医薬組成物がヒトに投与されると、ヒト体内では本発明の核酸構築物より発現されたスパイクタンパク質又はその断片が抗原として認識される。その結果、ヒトにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫が誘導され、当該ウイルスの感染の予防及び／又は当該ウイルス感染症の症状の軽減が達成される。本発明の医薬組成物の投与量および投与回数には特に限定はなく、発揮される効果に応じて適宜調整すればよい。投与経路にも特に限定はないが、その効果を発揮させる観点からは、非経口的に投与されることが好ましい。通常は注射点滴、またはその他の手段により組織内（例えば筋肉内）、静脈内、皮内、皮下、腹腔内等へ投与される。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
実施例１　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするＤＮＡの作製
　Ｗｕｈａｎ株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子に関する情報はＧｅｎｅＢａｎｋにＮＣ＿０４５５１２のアクセッション番号で公開されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）、ならびに前記アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２）に関する情報は前記ＧｅｎｅＢａｎｋから取得することができる。スパイクタンパク質をコードするウイルスゲノムＲＮＡの塩基配列に対応する配列（配列番号２）のＤＮＡを化学的に合成した。この際、配列番号２の開始コドンの５’側に５’－ＣＡＣＣ－３’の４塩基を挟んで制限酵素ＮｈｅＩの認識配列を、３’側には終止コドン（ＴＡＡ）に隣接して制限酵素ＸｂａＩの認識配列をそれぞれ付加した。
　次に、配列番号２中の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のオープンリーディングフレームのコドンをヒトでの発現に適したものに変換したＤＮＡを設計した。終止コドンを除く全１２７３個のコドンのうちの９６７個を、アミノ酸の置換を生じさせることなく別のコドンに変換することにより、配列番号３に示す塩基配列を得た。次いで、前記塩基配列のＤＮＡを化学的に合成した。このＤＮＡの、開始コドンの５’側には５’－ＣＡＣＣ－３’の４塩基を挟んで制限酵素ＮｈｅＩの認識配列を、３’側は終止コドン（ＴＡＡ）に隣接して制限酵素ＸｂａＩの認識配列を、それぞれ付加した。なお、前記の５’－ＣＡＣＣ－３’の配列は直前のＮｈｅＩ認識配列中の２塩基（ＧＣ）とともにＫｏｚａｋ配列を形成する。
実施例２　スパイクタンパク質発現プラスミドの作製
　実施例１で作製した、配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡ、ならびに配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡをそれぞれ制限酵素ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ（どちらもタカラバイオ社製）で二重消化した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＶＡＸ１（サーモフィッシャーサイエンテフィック社製）のＮｈｅＩおよびＸｂａＩサイト間に挿入し、組換えプラスミドを作製した。ｐＶＡＸ１のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより転写、翻訳される向きにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のオープンリーディングフレームが接続されたプラスミドを選択し、配列番号２の塩基配列のＤＮＡを含むものをプラスミドＷＴ、配列番号３の塩基配列のＤＮＡを含むものをプラスミドＣＯ、とそれぞれ命名した。なお、これらのプラスミドには、ｐＶＡＸ１に搭載されている要素であるＴ７プロモーターをオープンリーディングフレームの５’側（ＣＭＶプロモーターの下流）に、ウシ成長ホルモン因子遺伝子由来ポリアデニル化配列をオープンリーディングフレームの３’側に、それぞれ有している。プラスミドＣＯの全塩基配列を配列番号４に示す。
　プラスミドＷＴまたはプラスミドＣＯでそれぞれ形質転換した大腸菌ＨＳＴ０８株（タカラバイオ社製）をカナマイシンを含有する液体培地中で培養した。得られた大腸菌菌体から、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ　ＸｔｒａＭｉｄｉ（マッハライ・ナーゲル社製）を使用してプラスミドを精製し、以下の実験に使用した。
実施例３　ｍＲＮＡ定量用プライマーの作製
　プラスミドＷＴまたはプラスミドＣＯのそれぞれを導入された細胞で転写されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のｍＲＮＡを定量するためのプライマー対を作製した。プラスミドＷＴから転写されるｍＲＮＡについては、ＣｏＶ－Ｓ１－ＷＴ－Ｑ１＿Ｆ（配列番号５）およびＣｏＶ－Ｓ１－ＷＴ－Ｑ１＿Ｒ（配列番号６）の対（以下、プライマー対ＷＴ－１と記載する）を合成した。また、プラスミドＣＯから転写されるｍＲＮＡについては、ＣｏＶ－Ｓ１－ＣＯ－Ｑ３＿Ｆ（配列番号７）およびＣｏＶ－Ｓ１－ＣＯ－Ｑ３＿Ｒ（配列番号８）の対（以下、プライマー対ＣＯ－３と記載する）を合成した。さらに内部標準として測定するヒトＧＡＰＤＨ遺伝子ｍＲＮＡに対するプライマーＧＡＰＤＨ＿Ｆ（配列番号９）およびＧＡＰＤＨ＿Ｒ（配列番号１０）の対（以下、プライマー対ＧＡＰＤＨと記載する）を合成した。
実施例４　組換えプラスミドからのｍＲＮＡ転写の確認
　１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン・ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭを入れた細胞培養用プレートのウェルに、１．６×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。次いで、ＴｒａｎｓＩｔ－２９３（Ｍｉｒｕｓ社製）を使用して、前記細胞を３００ｎｇのプラスミドＷＴ、プラスミドＣＯ、又はｐＶＡＸ１で形質転換した。プラスミドで形質転換しない細胞（ｍｏｃｋ）も準備した。これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。
　培養２日目の細胞からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ　ｐｌｕｓ（マッハライ・ナーゲル社製）を使用してＲＮＡを精製した後、実施例３で作製したプライマー対を使用したＲＴ－ＰＣＲにより、細胞内で転写されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のｍＲＮＡを定量した。ＲＴ－ＰＣＲには、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）及びＴＢ　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（Ｔｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）を、それらの使用説明書のとおりに使用した。表１に、各細胞に由来するＲＮＡおよび各プライマーセットの組み合わせで測定されたＣｔ値を示す。
　表１に示されるように、プラスミドＷＴとプライマー対ＷＴ－１の組み合わせ、プラスミドＣＯとプライマー対ＣＯ－３の組み合わせでのみ有意な量のスパイクタンパク質ｍＲＮＡが検出された。また、プラスミドＷＴで形質転換された細胞とプラスミドＣＯで形質転換された細胞のｍＲＮＡ転写量をΔΔＣｔ法で比較すると、後者の方が４６倍高いという結果であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例５　スパイクタンパク質発現の確認（１）
　実施例４と同様の操作により、プラスミドＷＴ、プラスミドＣＯ、またはｐＶＡＸ１で形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を調製した。なお、プラスミドＷＴで形質転換された細胞は２群調製した。培養２日目の細胞をフローサイトメーター（ＢＤ　ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ；ＢＤバイオサイエンス社製）での分析に供し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質陽性率を算出した。スパイクタンパク質は、マウス抗スパイクモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ，　Ｍｏｕｓｅ－Ｍｏｎｏ（１Ａ９）；ＧｅｎｅＴｅｘ社製）とＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＲＰＥ；Ａｇｉｌｅｎｔ社製）とを組み合わせて検出した。
　各細胞でのスパイクタンパク質陽性細胞の割合を表２に示す。プラスミドＷＴで形質転換された細胞ではスパイクタンパク質陽性細胞の割合はバックグラウンド（ｐＶＡＸ１導入細胞での割合）と同程度であったが、プラスミドＣＯでは４０％を超える細胞においてスパイクタンパク質の発現が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例６　スパイクタンパク質発現の確認（２）
　実施例２で作製されたプラスミドＣＯ、ならびに新たに調製した３ロットのプラスミドＣＯ（それぞれ＜１＞、＜２＞、＜３＞とする）について、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用してスパイクタンパク質を発現させる能力を検証した。
　条件Ａ（１．６×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に２００ｎｇのプラスミド添加）、条件Ｂ（０．８×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に５００ｎｇのプラスミド添加）の２つの条件で形質転換を行ったことを除き、実施例５と同様の操作で細胞の調製ならびにスパイクタンパク質の発現測定を実施した。各細胞でのスパイクタンパク質陽性細胞の割合とＰＥの平均蛍光強度を表３に示す。また、条件Ｂ、ｐＶＡＸ１、プラスミドＣＯ＜１＞、＜２＞、＜３＞での形質転換で得られた細胞におけるスパイクタンパク質発現量のヒストグラムをそれぞれ図１～４に示す。これらより明らかなとおり、プラスミドＣＯはその製造ロットに左右されず、導入された細胞において安定してスパイクタンパク質の発現を誘導することができた。また、スパイクタンパク質発現の陽性率、およびＰＥの平均蛍光強度はともに、使用されたプラスミド量との間に相関があった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例７　組換えプラスミドによる免疫誘導の確認（１）
　実施例２で作製されたプラスミドＣＯについて、アジュバントあり、またはアジュバントなしでの免疫誘導能を評価した。
　ＳＤラット(日本クレア株式会社より購入）６匹ずつの２群を準備し、１匹あたりに６６６．６μｇ／４００μＬのプラスミドＣＯ、または１匹あたりに６６６．６μｇ／２００μＬのプラスミドＣＯ及び２００μＬのＡＬＵＭアジュバント（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ社製）をそれぞれ各群のラットの前脛骨筋（左右）に投与した。ラットは餌および水が自由に摂取できる環境で飼育した。また、対照群として３匹のラットを準備し、無処置のまま同条件で飼育した。投与２週間後に、ラットの尾静脈より血液を採取し、血清を調製した。血清中の抗スパイクタンパク質抗体を以下に示す操作で測定した。
　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　２０１９－ｎＣｏＶ　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１＋Ｓ２　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＣＤ，　Ｈｉｓ　ｔａｇ；ベータライフサイエンス社製）をコートした９６ウェルプレートをブロッキング溶液［５％スキムミルクを含有するＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ－Ｔは０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）］でブロッキング後、ブロッキング溶液で８倍希釈した血清を加えて４℃で一晩静置した。翌日、ウェルを洗浄し、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識抗ラット抗体（ＧＨヘルスケア社製）を添加して室温で３時間静置した。ウェルをＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ウェルに３，３’－５，５’－テトラメチルベンジジン（シグマ－アルドリッチ社製）を添加して室温で３０分間静置した後、０．５Ｎの硫酸をウェルに加えて発色反応を停止させた。各ウェルについて４５０ｎｍの吸光度を測定し、血清中の抗スパイクタンパク質抗体を評価した。
　結果を図５に示す。プラスミドＣＯ投与群ではＡＬＵＭアジュバントの有無にかかわらずスパイクタンパク質に結合する抗体が産生されていたが、アジュバントを併用した群で抗体価が高くなる傾向があった。
実施例８　組換えプラスミドによる免疫誘導の確認（２）
　ＳＤラット６匹に、１匹当たり６６６．６μｇのプラスミドＣＯと６６．７μｌのＡＬＵＭアジュバントを投与した。投与は２週間おきに３回実施し、投与開始から４週目、６週目、８週目に血液を採取し、血清中の抗スパイクタンパク質抗体量の測定を実施した。抗体の測定は、抗原としてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　２０１９－ｎＣｏＶ　Ｓｐｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＢＤ；ベータライフサイエンス社製）を使用する試験を加えた他は実施例７と同様の操作で行った。この結果、Ｓ１＋Ｓ２に結合する抗体、およびＲＢＤ（受容体結合ドメイン）に結合する抗体のどちらもがラット内で産生されていること、両抗体は投与開始４週目の血清中で既に検出され、８週目にかけて抗体価の上昇が見られること、が明らかとなった。
　さらに、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　２０１９－ｎＣｏＶ　Ｓｐｉｋｅ（Ｓ１－Ｄ６１４Ｇ；Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）をコートしたプレートで同様の測定を実施することにより、プラスミドＣＯにより産生された抗体がＤ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質を認識することも確認された。
実施例９　細胞性免疫誘導の確認
　Ｔ　ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＰＯＴ　Ｋｉｔｓ（ＩＮＦ－γ及びＩＬ－４；Ｕ－ＣｙＴｅｃｈバイオサイエンス社製）を使用して、同キットの説明書に記載された操作に従ってプラスミドＣＯの細胞性免疫への効果を調べた。
　ＰＶＤＦ膜を底に備えた９６ウェルプレート（ミリポア社製）を、キットに添付された抗ＩＦＮγ捕捉抗体もしくは抗ＩＬ４捕捉抗体でコートした。プレートをブロッキング溶液で洗浄した。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　２０１９－ｎＣｏＶ　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１＋Ｓ２　ＰｒｏｔｅｉｎまたはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　２０１９－ｎＣｏＶ　Ｓｐｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＢＤ）とともに、プラスミドＣＯで免疫されたラットから常法によって調製された脾臓細胞３×１０５個を前記プレートのウェルに播種し、３７℃で４８時間保温した。保温終了後にＰＢＳ－Ｔでウェルを洗浄し、ビオチン化抗ラットＩＦＮγ抗体またはビオチン化抗ラットＩＬ４抗体を添加して４℃で２時間放置した。次に、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを添加して１時間静置し、さらにＨＲＰ基質溶液を添加してＨＲＰの活性を検出した。この結果、Ｓ１＋Ｓ２での刺激、またはＲＢＤでの刺激のそれぞれによって、免疫されたラットの脾臓細胞からのインターフェロン－γ（ＩＮＦγ）の産生が著しく増加すること、また、インターロイキン－４（ＩＬ４）の産生も若干増加することが示された。以上の結果から、プラスミドＣＯがＴｈ１型の細胞性免疫を誘導することが明らかとなった。
実施例１０　毒性の評価
　プラスミドＣＯでの免疫後７週目のラットから肺、肝臓、腎臓及び心臓の組織を採取し、ＨＥ染色した組織切片標本を作製した。顕微鏡下で観察した結果、毒性を示す所見は認められなかった。また、同ラットの血清中の各種生化学マーカー測定からも、正常範囲を逸脱するような値は得られなかった。
実施例１１　改変されたスパイクタンパク質をコードするＤＮＡを搭載したプラスミドの作製
　世界保健機構（ＷＨＯ）より報告されている種々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株（ｖａｒｉａｎｔ）について、そのスパイクタンパク質のアミノ酸配列を検証した。これらの中から、Ｂ．１．１．７系統、Ｂ．１．３５１系統、Ｐ．１系統、Ｂ．１．６１７．２系統（それぞれＡｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、ＤｅｌｔａというＷＨＯ　ｌａｂｅｌが付与されている）を選択し、それぞれで確認されている変異のいくつかを野生型スパイクタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）に導入した４種のアミノ酸配列を設計した。各アミノ酸配列（それぞれ４ＧＰ、ＳＡ、ＢＲ、ＩＮと命名した）は各系統に由来する変異の他、スパイクタンパク質の高発現に寄与することが知られているＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ変異ならびにＣ末端の１９アミノ酸の欠失を含んでいる。次いで、これらのアミノ酸配列をコードする、ヒトでの発現に適したＤＮＡ塩基配列を設計した。
　表４に、新たに設計したアミノ酸配列の情報、各アミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡ塩基配列の配列番号を示す。なお、表４中のアミノ酸の位置は配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づいている。これらのＤＮＡにおける上記の改変部分以外をコードする塩基配列は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をコードするゲノムＲＮＡの配列と比較した場合、コドンの７０％以上がヒトでの発現に適したものに変換されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　配列番号１２、１４、１６、１８の塩基配列のＤＮＡを化学的に合成した。次いで、プラスミドＣＯに搭載されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のオープンリーディングフレーム領域をこれらのＤＮＡで置換することにより、改変スパイクタンパク質を発現可能なプラスミドを作製した。得られたプラスミドをそれぞれプラスミド４ＧＰ、プラスミドＳＡ、プラスミドＢＲ、プラスミドＩＮと命名した。各プラスミドで大腸菌ＨＳＴ０８株を形質転換し、カナマイシンを含有する液体培地中で培養した。得られた大腸菌菌体から、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ　ＸｔｒａＭｉｄｉ（マッハライ・ナーゲル社製）を使用してプラスミドを精製し、以下の実験に使用した。
実施例１２　改変スパイクタンパク質発現の確認
　実施例４と同様の操作により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をプラスミドＣＯならびにプラスミド４ＧＰ、ＳＡ、ＢＲ、およびＩＮでそれぞれ形質転換し、培養した。培養２日目の細胞をフローサイトメーター（ＢＤ　ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）での分析に供し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の発現を調べた（それぞれ４群）。スパイクタンパク質の検出には、抗Ｓ１抗体：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒａｂｉｔ　Ｍａｂ；ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）、および抗Ｓ２抗体：Ａｎｔｉ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ，　Ｍｏｕｓｅ－Ｍｏｎｏ（１Ａ９）を、それぞれ抗ウサギ二次抗体、および抗マウス二次抗体（どちらも蛍光標識されたもの）と組み合わせて使用した。
　各プラスミドで形質転換された細胞でのスパイクタンパク質陽性細胞を抗Ｓ１抗体、および抗Ｓ２抗体を使用して解析した結果をそれぞれ図６および図７に示す。図中、横軸は全細胞に対するスパイクタンパク質陽性細胞の割合を示し、縦軸は試験において測定された標識由来蛍光の平均蛍光強度を示し、ＣＯ、４ＧＰ、ＳＡ、ＢＲおよびＩＮはそれぞれ、プラスミドＣＯ、４ＧＰ、ＳＡ、ＢＲおよびＩＮ投与群を示す。図６および７から示されるように、検出を抗Ｓ１抗体で実施した場合と抗Ｓ２抗体で実施した場合とで結果にばらつきはあるものの、総合的に見て、プラスミド４ＧＰ、ＳＡ、ＢＲ、ＩＮで形質転換された細胞におけるスパイクタンパク質発現量はプラスミドＣＯで形質転換されたものを下回ることはないと考えられた。
実施例１３　改変スパイクタンパク質による免疫誘導の確認
　プラスミド４ＧＰについて、実施例７に記載の方法により免疫誘導の評価を行った。プラスミド４ＧＰ投与群のラットでは、投与２週間後の抗スパイクタンパク質抗体の産生がプラスミドＣＯ投与群に比べて高いことが示された。さらに飼育を継続して抗体産生の状況を調べたところ、両プラスミド間での抗体産生量の差は認められなくなった。これは産生量が飽和したことによると考えられた。
実施例１４　改変スパイクタンパク質により産生された抗体の解析
　プラスミドＣＯおよびプラスミドＳＡを使用して免疫誘導能を評価した。ＳＤラット(日本クレア株式会社より購入）３～８匹ずつの３群を準備した。６６６．６μｇ／３３３．３μＬのｐＶＡＸ（コントロール）、プラスミドＣＯ、またはプラスミドＳＡと、ＡＬＵＭアジュバント（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ社製）６６．７μＬを混合したものを調製し、各群のラット１匹あたりに４００μＬ（ラットの左右の前脛骨筋にそれぞれ２００μＬずつ）投与した。ラットは餌および水が自由に摂取できる環境で飼育した。また、未処置群として３匹のラットを準備し、プラスミドを投与しないまま同条件で飼育した。投与２週間後にラットの尾静脈より血液を採取し、血清を調製した。血清中の抗スパイクタンパク質抗体を以下に示す操作で測定した。
　上記４種の血清に含まれる抗体の、種々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する抗体価を測定した。スパイクタンパク質としてはＷｕｈａｎ株、Ａｌｐｈａ株、Ｂｅｔａ株、およびＧａｍｍａ株由来のアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質（いずれもＡＣＲＯ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製；Ｈｉｓ－Ｔａｇ付き）を使用した。前記のスパイクタンパク質をコートした９６ウェルプレートをブロッキング溶液［５％スキムミルクを含有するＰＢＳ－Ｔ］でブロッキング後、ブロッキング溶液で５０倍から段階希釈した血清を加えて４℃で一晩静置した。翌日、ウェルを洗浄し、ＨＲＰ標識抗ラット抗体（ＧＨヘルスケア社製）を添加して室温で３時間静置した。ウェルをＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ウェルに３，３’－５，５’－テトラメチルベンジジン（シグマ－アルドリッチ社製）を添加して室温で３０分間静置した後、０．５Ｎの硫酸をウェルに加えて発色反応を停止させた。各ウェルについて４５０ｎｍの吸光度を測定し、血清中の抗スパイクタンパク質抗体を評価した。
　結果を図８に示す。図中、横軸は血清を調製したラットに投与されたプラスミドの種類を示す（ＡＧ０３０２はプラスミドＣＯを、ＡＧ０３０４はプラスミドＳＡをそれぞれ意味し、Ｎｏｒｍａｌはプラスミド非投与群を意味する）。また、図中でスパイクタンパク質の種類を示したＷｕｈａｎ、ＵＫ、ＳＡ、ＢＲは、それぞれＷｕｈａｎ株、Ａｌｐｈａ株、Ｂｅｔａ株、Ｇａｍｍａ株のスパイクタンパク質を意味する。図８に示されるように、プラスミドＣＯおよびプラスミドＳＡを投与されたラットの血清には、使用されたすべてのスパイクタンパク質と反応しうる抗体が産生されていた。また、プラスミドＳＡを投与されたラットで産生された抗体は、Ｗｕｈａｎ株およびＡｌｐｈａ株のスパイクタンパク質に対してはプラスミドＣＯにより産生された抗体と同等またはやや高い抗体価を示すとともに、Ｂｅｔａ株およびＧａｍｍａ株のスパイクタンパク質に対してはより高い反応性を示す傾向がみられた。
SEQ ID NO: 1; An amino acid sequence of SARS-CoV-2 spike protein
SEQ ID NO: 2; A nucleotide sequence corresponding to the wild-type RNA coding SARS-CoV-2 spike protein
SEQ ID NO: 3; A codon-modified DNA sequence coding SARS-CoV-2 spike protein
SEQ ID NO: 4; A full length nucleotide sequence of plasmid CO
SEQ ID NO: 5; Primer CoV-S1-WT-Q1_F
SEQ ID NO: 6; Primer CoV-S1-WT-Q1_R
SEQ ID NO: 7; Primer CoV-S1-CO-Q3_F
SEQ ID NO: 8; Primer CoV-S1-CO-Q3_R
SEQ ID NO: 9; Primer GAPDH_F
SEQ ID NO: 10; Primer GAPDH_R
SEQ ID NO: 11; An amino acid sequence of modified SARS-CoV-2 spike protein (4GP)
SEQ ID NO: 12; A nucleotide sequence coding modified SARS-CoV-2 spike protein (4GP)
SEQ ID NO: 13; An amino acid sequence of modified SARS-CoV-2 spike protein (SA)
SEQ ID NO: 14; A nucleotide sequence coding modified SARS-CoV-2 spike protein (SA)
SEQ ID NO: 15; An amino acid sequence of modified SARS-CoV-2 spike protein (BR)
SEQ ID NO: 16; A nucleotide sequence coding modified SARS-CoV-2 spike protein (BR)
SEQ ID NO: 17; An amino acid sequence of modified SARS-CoV-2 spike protein (IN)
SEQ ID NO: 18; A nucleotide sequence coding modified SARS-CoV-2 spike protein (IN)

Claims (12)

  1. 　コロナウイルス（ＳＡＲＳ　ＣｏＶ－２）のスパイクタンパク質又はその断片をコードするＤＮＡであって、含まれるコドンの一部もしくは全部がヒトでの発現について至適化されている、ＤＮＡ。
  2. 　ＳＡＲＳ　ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡの、スパイクタンパク質又はその断片をコードする塩基配列に含まれるコドンの約５０％以上が他のコドンに変換されている、請求項１記載のＤＮＡ。
  3. 　スパイクタンパク質の全長をコードする、請求項１記載のＤＮＡ。
  4. 　配列番号３、１２、１４、１６または１８に示される塩基配列と約９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ。
  5. 　配列番号３、１２、１４、１６または１８に示される塩基配列を有する請求項４記載のＤＮＡ。
  6. 　ヒトにおいて機能するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結された請求項１～５のいずれかに記載のＤＮＡ、を含有する核酸構築物。
  7. 　さらに、請求項１～５のいずれかに記載のＤＮＡに機能的に連結された転写終結配列を含有する請求項６記載の核酸構築物。
  8. 　ベクターに組み込まれてなる請求項６又は７記載の核酸構築物。
  9. 　プラスミドベクター、ファージベクターおよびウイルスベクターから選択されるベクターに組み込まれてなる請求項８記載の核酸構築物。
  10. 　請求項６～９のいずれかに記載の核酸構築物を含有する医薬組成物。
  11. 　さらにアジュバントを含む請求項１０記載の医薬組成物。
  12. 　コロナウイルス感染症のワクチンである、請求項１０又は１１記載の医薬組成物。
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