CN112142851B - 一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG及其制备方法和应用，所述制备方法包括：1)将如SEQ ID NO.4所示的基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有融合蛋白tG编码基因的重组质粒；2)再将含有融合蛋白tG编码基因的重组质粒转染至表达细胞中；3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述表达细胞，得到高度表达的细胞株；4)发酵培养步骤3)中所述细胞株，纯化后，得到亚单位融合蛋白tG。本发明能够在大量可溶性表达tG，蛋白稳定，克服了现有技术中狂犬病毒表面G蛋白不能大规模表达等诸多问题，且制备方法简单、成本低。

Description

一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制品重组蛋白表达纯化技术领域，涉及一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG及其制备方法和应用。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus，RV)引起的一种人兽共患传染病，死亡率高达100％。临床表现为恐水、畏光、狂躁等症状。犬是狂犬病的主要宿主和传染源。狂犬病呈世界性分布。全球每年大约因狂犬病导致的死亡人数为4-7万人，但每年狂犬病的发生大多数在发展中国家，其中98％在亚洲。我国是仅次于印度年狂犬病发生率全球第二高的国家。狂犬病已成为危我国公共卫生安全的重要疫病。

狂犬病毒属于弹状病毒科(Rhabdovirdae)狂犬病毒属(Lyssavirus)成员，病毒形态呈子弹状，其头部为半球形，末端较为平整，长约180nm，直径75nm。病毒颗粒是由外壳和核心两部分组成。其中外壳是由一个紧密而完整的脂蛋白双层包膜和一个纤突组成。纤突的主要成分是糖蛋白(glycoprotein，G)，简称G蛋白，呈同源三聚体形式，具有头和茎结构，是病毒唯一的糖基化蛋白，也是主要表面抗原。G蛋白由524个氨基酸组成，未糖基化的理论分子量为67kD，不同毒株间的氨基酸序列同源性在90％左右。G蛋白的糖基化程度决定着RV的稳定性、抗原性和生物活性。研究表明，G蛋白的糖基化对免疫效果至关重要，大肠杆菌或其他原核系统缺乏糖基化修饰，在大肠杆菌中表达G蛋白仅有反应原性，而无免疫原性，不能诱导产生中和抗体，只有在糖基化功能较好的真核细胞中表达，才具有良好的免疫效果。

犬用狂犬疫苗主要由弱毒疫苗和灭活疫苗。常用的弱毒疫苗毒株有SAD株、ERA株以及Flury株，因免疫原性好，价格低廉过去常被广泛使用，但病毒在动物体内增值过程中可能存在毒力反强和致病性突变而导致动物发病。因此，2017年7月，我国农业部已全面禁止狂犬弱毒苗的生产和使用。细胞培养的灭活疫苗虽然非常安全和有效，但疫苗成本较高，价格昂贵，很难在发展中国家中使用。

G蛋白作为RV病毒表面唯一的糖基化蛋白，是重要的保护性抗原。早在1989年，Prehaud等人就利用杆状病毒表达系统，在sf细胞中表达了G蛋白，经腹腔注射和肌肉注射方法免疫小鼠，能够诱导产生高水平的中和抗体，并能抵抗狂犬病毒致死剂量的攻毒。Koraka等2014年在Vaccine上报道用HEK293细胞表达了狂犬病毒G蛋白，不仅产生了高水平的中和抗体，而且低剂量就可抵抗致死剂量的攻毒。专利“一种正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段及其潜在应用”(专利号：CN109627294A)提供了一种生产G蛋白的方法，通过对蛋白中的疏水部分修饰，用昆虫杆状病毒系统表达并制备了结构折叠正确的G蛋白，但产量很低，并且纯化复杂，因此不能大规模工业化。虽然，这些研究验证了G蛋白是一种很好的保护性抗原，但其产量很低，大规模工业化生产成本太高，无法生产应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可大规模工业化生产并且安全、稳定的含有狂犬病毒表面G蛋白的融合蛋白tG，及其制备方法和应用；

为了解决该问题，本发明人在充分分析、研究目前所能得到的狂犬病毒的资料的基础上，并通过结构分析G蛋白的整体结构，首先在设计上，为了使目的蛋白，更易在表达后形成三聚体结构，提出了在G蛋白的C端增加一个38aa的亮氨酸拉链肽，同时为了不影响G蛋白的结构，在G蛋白和亮氨酸拉链之间添加了GGGGSGGGGS的柔性肽。其次为了更好的CHO系统表达，我们重新将编码狂犬病G蛋白的密码子进行优化，提出了一种能稳定高效表达狂犬病毒G蛋白抗原及其在CHO系统中构建和表达方法。本发明获得的可以分泌表达亚单位融合蛋白tG的单克隆细胞株，表达产量高，经一步亲和层析即可获得大量的纯融合蛋白tG。所述亚单位融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种亚单位融合蛋白tG，所述亚单位融合蛋白tG含有狂犬病毒表面囊膜蛋白G蛋白的胞外区及一段亮氨酸拉链肽；其中，所述狂犬病毒表面囊膜蛋白G的胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，所述亮氨酸拉链肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

根据本发明的技术方案，优选地，在狂犬病毒表面囊膜蛋白G蛋白和亮氨酸拉链肽之间还含有柔性连接肽。

根据本发明的技术方案，优选地，所述柔性连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGS。

根据本发明的技术方案，优选地，所述亚单位融合蛋白tG的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

根据本发明的技术方案，优选地，所述亚单位融合蛋白tG包括在如SEQ ID NO.1所示中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有免疫原性的衍生的蛋白质。

根据本发明的技术方案，优选地，在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有检测或纯化标签，其中，所述标签选自poly-Arg、poly-His、flag、c-myc、HA中的一种。这里，为了使所述亚单位tG蛋白便于纯化，本领域的技术人员通过常规的技术手段，可在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接如表一所示的标签，本实施例中具体以Poly-His为例，将其连接于如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的羧基末端处。

表一 标签及其氨基酸序列

根据本发明的技术方案，优选地，所述亚单位融合蛋白tG编码的基因序列如SEQID NO.4所示。

根据本发明的技术方案，优选地，所述亚单位融合蛋白tG包括在SEQ ID NO.1中的氨基酸序列中经过颠倒G蛋白和亮氨酸拉链肽的顺序的衍生的蛋白质，如将亮氨酸拉链肽放置在氨基端。

根据本发明的技术方案，优选地，所述狂犬病病毒G蛋白是狂犬病毒胞外区1M-455N氨基酸序列，包括在SEQ ID NO.2中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有免疫原性的衍生的蛋白质。

根据本发明的技术方案，优选地，所述狂犬病毒G蛋白的毒株来自于CVS株、SAD株、Flury株、LEP株、HEP株、ERA株、CTN-1株、SAG株、SRV9株。

根据本发明的技术方案，优选地，所述狂犬病亚单位融合蛋白的表达系统包括但不限于哺乳动物细胞。

根据本发明的技术方案，优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种制备亚单位融合蛋白tG的方法，所述制备方法包括以下步骤：1)将如SEQ ID NO.4所示的基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有融合蛋白tG编码基因的重组质粒；2)再将含有融合蛋白tG编码基因的重组质粒转染至表达细胞中；3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述表达细胞，得到高度表达的细胞株；4)发酵培养步骤3)中所述细胞株，纯化后，得到亚单位融合蛋白tG。

本发明的技术方案中，优选地，狂犬病毒的亚单位融合蛋白tG编码基因如SEQ IDNO.4所示。

本发明的技术方案中，优选地，所述真核表达载体可以为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13、pcDNA3.1，pcDNA3.3；更优选地，所述真核表达载体为pEE12.4。

本发明的技术方案中，优选地，步骤2)中，所述表达细胞为哺乳动物细胞；更优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。

本发明的技术方案中，优选地，所述CHO细胞可以为DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株；更优选地，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种亚单位融合蛋白tG在制备用于诊断、预防和治疗狂犬病毒疫苗中的应用。

本发明构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达狂犬病毒G蛋白的亚单位融合蛋白tG的CHO细胞株，该细胞株产量高(产量高达0.8g/L)、易于纯化(如图3所示，只需一步亲和层析就能使目的蛋白纯度达到90％以上，远远满足亚单位疫苗和诊断试剂的需求)、易于大规模生产。因此，解决了G蛋白不能大规模表达问题，降低了生产成本。另外，由于生产用的CHO细胞株在培养时可控制性高、质控容易、生产蛋白批次间稳定，生物安全高(没有病毒，不存在散毒的风险)。

附图说明

图1表示pEE12.4-OPTI-tG质粒图谱。

图2表示pEE12.4-OPTI-tG双酶切鉴定结果：M是DNA Marker：DL10000 Marker；1是pEE12.4-OPTI-tG双酶切电泳结果。

图3表示亚单位融合蛋白tG纯化后SDS-PAGE检测结果：1是亚单位融合蛋白tG，2是Marker。

图4A为superose 6 increase 10/300 GL柱标准品层析图谱，其中thyrogobulin出峰体积为13.1ml，分子量669kDa，ferritin出峰体积为14.95ml，分子量为440kDa，aldolase出峰体积为16.15ml，分子量为158kDa，ovalbumin出峰体积为17.1ml，分分子量为44kDa，ribonuclease A出峰体积为18.9ml，分子量为13.7kDa，aprotinin出峰体积为20ml，分子量为6.5kDa；图4B为tG分子筛检测结果。

图5表示tG蛋白纯化后Western-blot检测结果：1是Marker，2是tG蛋白。

图6为G蛋白三维结构模式图，chain A,B,C分别为G蛋白单体，共同组成三聚体。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。

本发明试剂及药品的来源列单如下：

CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；

细胞培养基和血清均购自美国gibco公司；

真核表达载体pEE12.4购自上海林渊生物科技有限公司；

Lipofectamine LTX购自美国Thermo Fisher公司；

甲硫氨酸亚砜亚铵((L-methioninesulFoximine，MSX))购于Sigma公司；

BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；

实施例1 G蛋白表达及设计

1.1狂犬病毒G蛋白的选择

狂犬病毒表面囊膜蛋白G蛋白是由其抗原位点位于胞外1M-455N个氨基酸的胞外区，其中1-19个氨基酸是为信号肽，20-445位氨基酸为成熟氨基酸胞外区。G蛋白在结构上是一个同源三聚体，虽然G蛋白作为重要的保护性抗原，早在80年代就有深入研究报道，但到目前还没有报道在真核表达系统中能大规模表达及纯化得到该蛋白，这或许是单独表达G蛋白结构不稳定造成，本发明为了解决这个重要的技术问题，在G蛋白的羧基端引入了一段易形成三聚体的拉链肽，以保证G蛋白的结构折叠正确和蛋白稳定，同时为了提高表达及利于在CHO细胞中筛选，我们对编码的tG融合蛋白进行密码子优化。

1.2狂犬病毒G蛋白密码子优化

本实验室以狂犬病毒的标准毒株CVS-11，参考(GenBank：GQ918139)为模板，分析发现基因组序列3320-4894核苷酸编码狂犬病毒G蛋白序列。进一步分析1M-19G为G蛋白的分泌信号肽，20K-455N可能为G蛋白的胞外区。由于狂犬病毒G蛋白的三维结构尚未解析，我们通过Swiss-Model同源预测分析，最后选择的G蛋白从氨基酸20位到氨基酸455位，即包含G蛋白抗原决定簇氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示，我们预测该段氨基酸序列在一定条件下可形成三聚体，如图6所示。进一步为了使G蛋白稳定表达更易形成三聚体结构，我们在G蛋白胞外区羧基端添加了亮氨酸拉链肽序列。氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，最后我们将编码融合蛋白tG氨基酸优化，优化后序列的基因序列如SEQ ID NO.4所示，该序列合成工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

实施例2：pEE12.4-OPTI-tG重组质粒构建

2.1 PCR扩增目的片段OPTI-tG

2.1.1 PCR反应

(1)引物设计及合成

上游引物:5’-ACGAAGCTTGCCGCCACCATGGTGCCTCAGGTGC-3’

下游引物:5’-GCGAATTCTTAATGGTGATGGTGATGGTGTGTGCGATTGC-3’

(2)加样体系50μL，如下表所示：

PCR扩增程序：

2.1.2 PCR产物进行胶回收

(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；

(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；

(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；

(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；

(8)重复步骤(7)；

(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；

(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；

(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。

2.2 PCR产物及载体双酶切反应

(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系

(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。

双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.2.1中PCR产物胶回收。

2.3连接反应

(1)准备洁净的1.5mL EP管若干，做好标记，置于EP管架上待用。

(2)在1.5mL EP管按照下表进行加样、混匀。

(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；

(4)取出步骤(3)中EP管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；

(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存。

2.4转化反应

(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；

(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；

(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；

(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；

(6)观察转化结果。

2.5质粒抽提与双酶切鉴定

2.5.1质粒抽提

(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；

(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；

(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体；

(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；

(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(8)向吸附柱中心加入500μL buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入30μL Elutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。

2.5.2双酶切鉴定

(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样：20μL反应体系

(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。

(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图2：酶切鉴定构建正确。

(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。

实施例3：pEE12.4-OPTI-tG重组质粒转染CHO-K1细胞与单克隆筛选的建立

3.1CHO-K1细胞转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)、DMEM/F12与PBS置于37℃水浴锅预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mLPBS洗细胞一次，并弃去PBS。

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。

(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。

(6)用DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至2×10⁵个/mL，取2mL混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育过夜。

(8)取出步骤(7)细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12，2mL/孔。

(9)稀释质粒：用OPTI-MEM稀释质粒，125μL OPTI-MEM中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μL plus，混匀，室温静置5min。

(10)稀释Lipofectamine LTX：125μL OPTI-MEM中加入9μL Lipofectamine LTX，然后加入2.5μL plus，轻轻混匀，室温静置5min。

(11)将步骤(10)和步骤(11)混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。

(12)将六孔板置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养4-6h。

(13)换液：弃掉上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

3.2加压筛选

转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mLDMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。

3.3单克隆筛选

(1)加压筛选至阴性对照细胞存货约10-20％左右时，约7days，开始单克隆筛选。

(2)取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(3)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。

(4)用DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。

(5)铺板：稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4-6h。

(6)记录单个细胞的孔。

(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入100μL0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。

实施例4：CHO-K1细胞株驯化成悬浮培养

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)置于37℃水浴锅中预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mLPBS洗细胞一次，并弃去PBS。

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。

(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散。

(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。

(6)用100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(8)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(9)每隔24h计数细胞密度及活力。

(10)待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养。

(11)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)，EX-CELL 302置于CO₂细胞培养箱中预热至37℃。

(12)从37℃培养箱中取出细胞转移至50mL离心管中，常温200g离心5min。

(13)将DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)和EX-CELL 302按1：1混合，重新悬浮细胞，计数。

(14)稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(15)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(16)每隔24h计数细胞密度及活力。

(17)第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×10⁶个细胞/mL，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×10⁵个/mL。

(18)经驯化，10D7株、12B7株、15B11株都满足要求，这表明，10D7株、12B7株、15B11株都驯化成功。

实施例5：细胞摇瓶发酵

(1)传代培养基的配制：60％的CD-CHO+40％的Ex-cell 302置于37℃水浴锅中预热至37℃。

(2)从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

(3)稀释实施例4得到的，将10D7株细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

(4)每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当血糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

(5)补料(约第四天)：补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。

(6)第5天开始，将CO₂培养箱温度调整至32℃。

(7)第九天，补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。

(8)第十二天，收获细胞上清液。

实施例6:稳定表达tG蛋白重组CHO-S细胞系构建及驯化

按照实施例1-5的操作方法，本发明人也很容易的构建了表达tG蛋白的稳定细胞系，因此，可以预见常见的工程化的哺乳动物细胞系。很容易采用该方法构建重组表达tG的稳定细胞株，从而大规模生产该蛋白。因此，也在本发明保护范围内。

实施例7：蛋白纯化

收集实施例5的细胞培养液(每批均约100ml)，4℃，8,000g离心30min，取上清，过0.8μm滤膜，上样，预留80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。

柱平衡：用超纯水平衡2～3CV(column volume柱体积)，排出乙醇保存液；然后用平衡buffer平衡5～10CV。

上样：取5ml规格的GE excel预装柱连接AKTA，1ml/min上样，收集Flow through(FT)，取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。

洗杂：分别用含20mM咪唑，50mM咪唑的洗脱buffer洗脱杂蛋白，收集：5mL/管；收集样品混合后取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。。

洗脱：用500mM咪唑的洗脱buffer洗脱杂蛋白，收集：5mL/管；收集样品混合后(Elutethrough-ET)取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。

透析换液：将含有目的蛋白的洗脱液倒入透析袋内，用1×PBS透析至少1,000倍，取80μl留样检测。

除菌过滤：在生物安全柜中，过0.22μm低蛋白结合针头滤器，或大量蛋白溶液过灭菌的0.22μm滤膜的Nalgene的滤器，过滤好的蛋白溶液样品存放于-80℃冰箱。纯化后的蛋白经SDS-PAGE检测纯度高达80％以上，如图3所示。

蛋白浓度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，该批蛋白浓度分别为2mg/ml，体积均约为40ml；经过计算(蛋白得率＝蛋白浓度*蛋白体积/所取发酵上清体积)，蛋白得率均约为800mg/L。

实施例8：分子筛柱层析

8.1 superose 6 increase 10/300 GL柱平衡

用超纯水平衡2个柱体积，排出乙醇保存液；然后用流动相平衡2个柱体积，流速为0.3mL/min，压力控制在0.5MPa以内。

8.2进样

用进样环进样tG蛋白0.5mL(浓度2mg/mL)，流速为0.3mL/min，控制压力为0.5MPa。

8.3运行

进样完成后，改inject状态为load状态，运行，流速为0.3mL/min，出峰后进行样品收集，0.5mL/管。

分子筛结果如图4B所示：从tG蛋白分子筛出峰结果与标准品柱层析图谱(图4A)对比，可以看出，大部分目的蛋白的出峰体积14.04ml左右，分子量约440kDa，为可能为纯化后的tG蛋白中的三聚体，由于表达蛋白tG是糖基化蛋白，在CHO系统中糖基化修饰程度不同导致蛋白分子量有一定的差异，进而呈现出大小不一的的三聚体蛋白；另一方面，由于分子筛标准蛋白大小与G蛋白三聚体大小差别较大，导致分子量分析的结果与标准蛋白可能存在一定的差异。

从图中可以看出，峰1面积占总面积的百分比为72.6％，这说明纯化后的G蛋白在未进一步优化缓冲体系前就有72.6％为三聚体，这符合预测分析。

实施例9：tG蛋白的western-blot鉴定及稳定性验证

9.1 SDS-PAGE检测

将实例7纯化后的蛋白进行western-blot检测，转膜时间为1h，所用抗体为兔抗G蛋白多克隆抗体(购自EpiGentek)，稀释比为1:4000，孵育时间为1h，二抗为HRP标记的-羊抗兔多克隆抗体(购自全式金生物)结果如图5所示：从图中结果可以看出，纯化后的tG蛋白能与抗体发生有效结合。

9.2稳定性验证

将实施例7纯化后的蛋白(0.8mg/ml)，分成16份，每份0.5ml；8份置于4℃冰箱中，于存放1周，2周，3周，4周，8周，12周，16周，20周分别取样一份，连续取样8次；八份置于-20℃冰箱中，于存放1周，2周，3周，4周，8周，12周，16周，20周取样一份分别取样一份，连续取样8次；每次取样后用BCA检测蛋白浓度，结果如下表所示：

从BCA蛋白浓度的变化来看，两组实验过程中蛋白基本保持稳定。

实施例10 G蛋白亚单位疫苗的制备

10.1疫苗制备

水相准备：根据疫苗中G蛋白含量，使用PBS(或生理盐水)将tG蛋白稀释适当浓度，即为水相；

油相准备：根据制备疫苗总量，按照抗原相和佐剂重量比为1:1，体积比为46:54，量取适量ISA 201VG佐剂；

乳化：将水相和油相都预热到33℃，将水相缓缓加到油相中，200-500rpm搅拌20-30min，于20℃静置1h置于4℃过夜；

分装、贮存：根据需要进行分装，检合格后于4℃保存备用。

10.2疫苗检测

物理性状采用眼观的方法观察外观(是否是乳白色乳剂)；

采用清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，观察(除第1滴外)，疫苗应为云雾状扩散，判定为水包油包水剂型；

将疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应≤0.5mL，判为稳定；

使用粘度仪对疫苗进行粘度检测，应在20-50cp，判为合格。

10.3 G蛋白亚单位疫苗对犬的安全性实验

按照上述10.1的方法，连续制备3批疫苗，批号为20181221a，20181221b，20181221c取健康2～4月龄犬16只，分别随机分4个组，每组4只，按照如下方法进行安全性实验。

单剂量一次免疫组：每组4只按肌肉注射接种100μL(批号：20181221a，25μg/只)，连续观察2周。

单剂量二次免疫组：每组4只按肌肉注射接种100μL(批号：20181221b，25μg/只)，连续观察2周。2周后以相同方法剂量再接种一次，继续观察2周。

超剂量一次免疫组：每组4只按肌肉注射接种1mL(批号：20181221c，250μg/只，10倍正常免疫剂量)，连续观察2周。

对照组：每组4只按肌肉注射接种100μL(PBS配制的疫苗)，连续观察2周。

实验期间，每天观察犬的精神，采食、活动、饮水、注射部位炎症变化和排泄情况等临床变化，记录犬的异常情况。

经过连续观察，对注射tG蛋白的犬的临床症状进行比较，单剂量，二次免疫剂量，超剂量免疫组和对照组，均饮食正常，精神无不良变化，排泄正常，注射部位未发现发炎现象，无死亡犬出现，接种犬没有遇到任何不良反应。说明，本发明制备的疫苗蛋白即使是以高剂量注射免疫(250μg)，也无明显副作用，是一种安全的免疫蛋白。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

序列表

<110> 浙江海隆生物科技有限公司

<120> 一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG及其制备方法和应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 4

<211> 503

<212> PRT

<213> tG蛋白氨基酸序列(PRT)

<400> 1

MVPQVLLFVLLLGFSLCFGKFPIYTIPDELGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSEFSYMELKVGYISAIKVNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVRTTKESLIIISPSVTDLDPYDKSLHSRVFPGGKCSGITVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRPRTPCDIFTNSRGKRASNGNKTCGFVDERGLYKSLKGACRLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSDETKWCPPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEIIPSKGCLKVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDDHVLIPEMQSSLLQQHMELLKSSVIPLMHPLADPSTVFKEGDEAEDFVEVHLPDVYKQISGVDLGLPNGGGGSGGGGSNGTGRMKQIEDKIENITSKIYNITNEIARIKKLIGNRT

<210> 4

<211> 455

<212> PRT

<213> G胞外区蛋白氨基酸序列(PRT)

<400> 2

MVPQVLLFVLLLGFSLCFGKFPIYTIPDELGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSEFSYMELKVGYISAIKVNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVRTTKESLIIISPSVTDLDPYDKSLHSRVFPGGKCSGITVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRPRTPCDIFTNSRGKRASNGNKTCGFVDERGLYKSLKGACRLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSDETKWCPPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEIIPSKGCLKVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDDHVLIPEMQSSLLQQHMELLKSSVIPLMHPLADPSTVFKEGDEAEDFVEVHLPDVYKQISGVDLGLPN

<210> 4

<211> 38

<212> PRT

<213> 亮氨酸拉链肽的氨基酸序列(PRT)

<400> 3

NGTGRMKQIEDKIENITSKIYNITNEIARIKKLIGNRT

<210> 4

<211> 1509

<212> DNA

<213> 编码tG的核苷酸序列(DNA)

<400> 4

ATGGTGCCTCAGGTGCTGCTGTTCGTGCTGCTGCTGGGCTTTTCTCTGTGCTTCGGCAAGTTTCCTATCTACACCATCCCAGACGAGCTGGGCCCATGGTCCCCCATCGATATCCACCATCTGAGCTGCCCAAACAATCTGGTGGTGGAGGATGAGGGCTGTACAAACCTGAGCGAGTTCTCTTACATGGAGCTGAAGGTCGGCTATATCTCCGCCATCAAGGTGAACGGCTTCACATGCACCGGCGTGGTGACCGAGGCTGAGACATACACCAATTTTGTGGGCTATGTGACCACAACCTTCAAGAGGAAGCACTTTCGGCCAACACCCGACGCCTGTAGAGCCGCTTACAACTGGAAGATGGCTGGCGATCCCCGCTATGAGGAGAGCCTGCACAATCCTTACCCAGACTATCATTGGCTGAGGACCGTGCGGACAACCAAGGAGTCTCTGATCATCATCTCCCCCAGCGTGACAGACCTGGATCCTTACGACAAGTCCCTGCACAGCAGGGTGTTTCCTGGCGGCAAGTGCTCTGGCATCACAGTGTCCAGCACCTACTGTTCCACAAACCATGATTATACCATCTGGATGCCTGAGAATCCCAGACCTCGCACCCCATGCGACATCTTCACAAACAGCAGAGGCAAGCGCGCCTCTAACGGCAATAAGACATGTGGCTTTGTGGATGAGCGGGGCCTGTATAAGAGCCTGAAGGGAGCTTGCAGGCTGAAGCTGTGCGGCGTGCTGGGACTGAGGCTGATGGACGGAACCTGGGTGGCTATGCAGACCTCTGACGAGACAAAGTGGTGCCCCCCTGATCAGCTGGTGAATCTGCACGACTTCAGGTCCGATGAGATCGAGCATCTGGTGGTGGAGGAGCTGGTGAAGAAGCGGGAGGAGTGTCTGGATGCCCTGGAGTCCATCATGACAACCAAGTCCGTGTCCTTCAGGAGGCTGAGCCACCTGAGAAAGCTGGTGCCAGGCTTCGGCAAGGCTTACACCATCTTTAACAAGACACTGATGGAGGCCGACGCTCATTATAAGAGCGTGAGAACCTGGAATGAGATCATCCCCTCTAAGGGATGCCTGAAAGTGGGAGGCCGCTGTCACCCTCATGTGAACGGCGTGTTCTTTAATGGCATCATCCTGGGCCCAGACGATCACGTGCTGATCCCCGAGATGCAGTCTTCCCTGCTGCAGCAGCACATGGAGCTGCTGAAGAGCTCTGTGATCCCTCTGATGCATCCACTGGCCGATCCCTCCACCGTGTTCAAGGAGGGCGACGAGGCTGAGGATTTTGTGGAGGTGCATCTGCCAGACGTGTACAAGCAGATCAGCGGCGTGGATCTGGGCCTGCCCAACGGAGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGATCCAATGGCACCGGCCGCATGAAGCAGATCGAGGACAAGATCGAGAACATCACCTCTAAGATCTATAACATCACAAATGAGATCGCTAGAATCAAGAAGCTGATCGGCAATCGCACA

Claims (10)

1.一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG，其特征在于，所述亚单位融合蛋白tG含有狂犬病毒表面囊膜蛋白G蛋白的胞外区及一段亮氨酸拉链肽；在狂犬病毒表面囊膜蛋白G蛋白和亮氨酸拉链肽之间还含有柔性连接肽，所述柔性连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGS，其中，所述狂犬病毒表面囊膜蛋白G的胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，所述亮氨酸拉链肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述亚单位融合蛋白tG为三聚体，所述亚单位融合蛋白tG的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的亚单位融合蛋白tG，其特征在于，在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有检测或纯化标签，其中，所述标签选自poly-Arg、poly-His、flag、c-myc、HA中的一种。

3.根据权利要求1～2任一所述的狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG，其特征在于，所述亚单位融合蛋白tG编码的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种如权利要求1～3任一所述的亚单位融合蛋白tG的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1)将如SEQ ID NO.4所示的基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有融合蛋白tG编码基因的重组质粒；

2)再将含有融合蛋白tG编码基因的重组质粒转染至表达细胞中；

3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述表达细胞，得到高度表达的细胞株；

4)发酵培养步骤3)中所述细胞株，纯化后，得到亚单位融合蛋白tG。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述真核表达载体为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13、pcDNA3.1、pcDNA3.3、pEE12.4。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述真核表达载体为pEE12.4。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述表达细胞为哺乳动物细胞。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。

10.根据权利要求1-3所述的任一亚单位融合蛋白tG在制备用于诊断、预防和治疗狂犬病毒疫苗中的应用。

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