CN104628851B - 一种抗狂犬病毒的基因工程抗体、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域,公开了一种抗狂犬病毒的基因重组抗体、其制备方法和应用。本发明提供的基因工程抗体由重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区、重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区组装而成;该重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区融合有亮氨酸拉链;该重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区融合有亮氨酸拉链。本发明提供的基因工程抗体具有较高的狂犬病毒中和能力;且结构简单,易于构建,可实现在原核系统中的高效表达,因而更易于实现其工业化大生产。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,特别涉及一种抗狂犬病毒的基因工程抗体、其制备方法和应用。
背景技术
狂犬病是由动物传播的100%致死性传染病,该病流行于100多个国家和地区,在全球范围内,每年有高达55000人因狂犬病死亡,而我国的狂犬病病例在2000份左右。当被携带有狂犬病毒的动物严重咬伤或抓伤时,即狂犬病毒III级暴露时,世界卫生组织建议用暴露后预防(PEP)的方法防治狂犬病。暴露后预防的方法包括伤口清洗,疫苗注射和伤口处抗体浸润注射。
随着基因工程技术的发展,注射抗狂犬病毒的抗体逐渐成为中和狂犬病毒的重要方法。现在在市面上用于侵润注射的抗体为抗狂犬病毒马血清(Equine rabies immuneglobulin,ERIG)和抗狂犬病毒人血清(Human rabies immune globulin,HRIG),二者均能有效的中和狂犬病毒。据报道,用抗狂犬病毒人血清(HRIG)治疗,病人要承担约1000美元的费用,价格过于昂贵,在狂犬病流行的亚非拉地区,人们承担不起,并且抗狂犬病人血清的来源十分有限,大大限制了其应用。相比HRIG,抗狂犬病毒马血清(ERIG)的价格虽有降低,但是其供应量仍不足,并且由马血清导致的过敏反应和血液污染,也限制了其进一步应用。
理论上,单克隆抗体(mAb)更适合工业化生产,有望能克服狂犬病免疫血清的不足。但是针对狂犬病毒的单克隆抗体或者说具有中和狂犬病毒活性的单克隆抗体的研究报道相对较少。这是因为在研究过程中发现,一方面狂犬病毒糖蛋白很难在体外表达纯化,即抗原难以获得;另一方面表达狂犬病毒的真核细胞系常常不能稳定传代,且该技术成本过于昂贵,不适合大规模工业生产。
基因工程抗体又称重组抗体,是指利用重组DNA及蛋白工程技术对编码抗体的基因按照不同需要进行加工改造和重新装置,经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子,是对抗体获得的重要革新。据报道,一系列的抗狂犬病毒基因工程抗体正在研制当中,如植物表达的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),Duan等人研发的单链抗体(singledomain fragment variable,scFv)等。但目前还没有基因工程抗体上市,所以仍然需要对重组工程抗体进行研究,以获得中和活性高的抗狂犬病毒的重组工程抗体。
发明内容
有鉴于此,本发明的发明目的在于提供一种抗狂犬病毒的基因工程抗体、其制备方法和应用。本发明提供的抗狂犬病毒的基因工程抗体能够更有效地中和狂犬病毒的能力,能够应用于制备防治狂犬病毒的药物,也可以应用于制备检测狂犬病毒的试剂。
为了实现本发明的发明目的,本发明采用如下的技术方案:
本发明提供了一种抗狂犬病毒的基因工程抗体,其由重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区、重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区组装而成;
该重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区融合有亮氨酸拉链;
该重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区融合有亮氨酸拉链。
本发明的发明人致力于研究抗狂犬病毒的基因工程抗体,报道了多个具有中和活性的抗狂犬病毒的基因工程抗体,例如,公开号为CN102643343A的专利申请文件中所述的单链抗体Fv57。单链抗体(scFv)仅由重链可变区(VH),轻链可变区(VL)和连接肽组成,因此scFv不仅保留了抗体的可变区(Fv)即狂犬病毒G蛋白的结合位点,而且分子量仅为其母体的IgG抗体的1/6,因此可以用原核系统表达,从而大大降低了成本。在研究过程中,发明人发现单链抗体Fv57仍无法克服单链抗体的先天性缺陷,即稳定性过低,从而导致其无法像其母体免疫球蛋白G(IgG)抗体那样100%保护被狂犬病毒感染的小鼠。为克服scFv稳定性低这一弱点,在公开号为CN102643343A的专利申请文件中还公开了二硫键稳定单链抗体ds-scFv,即dsFv57,通过将框架区(FR)内特定位置的氨基酸突变为半胱氨酸,在单链抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间添加额外的二硫键,从而大大增加了dsFv57的稳定性,相对单链抗体动物保护力得以提高,但是dsFv57的动物保护力仍无法达到100%,这是因为,重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组装方式在ds-scFv和单链抗体scFv中一致,而和其母体IgG中是不同的。在IgG抗体中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的作用是非共价的,VH和VL通过自身的疏水作用形成Fv,并由轻链恒定区(CL)和重链恒定区Ⅰ(CHⅠ)之间定疏水作用和二硫键得以稳定;而在单链抗体Fv57和单链抗体dsFv57中,重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的作用是共价的,通过连接肽将重链可变区VH的氨基端和轻链可变区VL的羧基端共价连接而成或VL的氨基端和VH的羧基端共价连接而成,这种共价的连接方式在一定程度上阻碍了重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组装成正确构象的Fv,因而无法像母体IgG抗体一样动物保护力达到100%。另一方面,在母体IgG抗体中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)并不存在二硫键,因此突变而来的半胱氨酸改变了可变区的氨基酸序列,鉴于蛋白质的一级结构决定了它的性质,因此这也是单链抗体dsFv57的动物保护力仍无法达到100%原因之一。
经过发明人大量的创造性劳动,发现抗狂犬病毒的单链抗体在重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)共价连接之后,在一定程度上阻止了Fv正确构象的形成,因此,模拟重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)在IgG抗体中的非共价结合方式是解决现有的抗狂犬病毒的单链抗体中和活性低的方法之一。在本发明中,发明人试图创新性将亮氨酸拉链应用于抗狂犬病毒的基因工程的构建,具体为单链抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的二聚化。具体地说,以单链抗体Fv57为例,用连接肽将亮氨酸拉链FOS连接到重链可变区(VH)后形成57VH-FOS,将亮氨酸拉链JUN连接到轻链可变区(VL)后形成57VL-JUN,通过亮氨酸拉链FOS和亮氨酸拉链JUN的高效且特异性结合的性质,那么重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)也将高效的、特异性的、非共价的二聚化形成Fv,这种二聚化的Fv与IgG里在CH1和CL的帮助下重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)非共价作用形成Fv是一样的,因此会有更高的中和活性。实验结果证实,相比原单链抗体,本发明提供的抗狂犬病毒的基因工程抗体产生了更高的中和活性,差异显著(P<0.05)。
在本发明中,亮氨酸拉链为出现在DNA结合蛋白质和其它蛋白质中的一种结构基元(motif),当来自同一个或不同多肽链的两个两用性的α-螺旋的疏水面(常常含有亮氨酸残基)相互作用形成一个圈对圈的二聚体结构时就形成了亮氨酸拉链。
在本发明中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中,亮氨酸拉链可以连接在抗狂犬病毒抗体的重链可变区的碳端或氮端。在本发明中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中,亮氨酸拉链可以连接在抗狂犬病毒病毒的轻链可变区的碳端或氮端。本领域技术人员可以根据实际情况选择亮氨酸拉链连接在重链可变区或轻链可变区的碳端或氮端。
优选地,在本发明提供的基因工程抗体中,融合在重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的亮氨酸拉链为JUN亮氨酸拉链或FOS亮氨酸拉链。在本发明的一些实施例中,该亮氨酸拉链具体为FOS亮氨酸拉链。
在本发明中FOS亮氨酸拉链具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;JUN亮氨酸拉链具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
优选地,在本发明提供的基因工程抗体中,融合在重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的亮氨酸拉链为JUN亮氨酸拉链或FOS亮氨酸拉链。在本发明的一些实施例中,该亮氨酸拉链具体为JUN亮氨酸拉链。
在本发明中,融合在重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的亮氨酸拉链和融合在重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的亮氨酸拉链可以相同也可以不同。但是因为FOS亮氨酸拉链和JUN亮氨酸拉链的相互作用要比FOS亮氨酸拉链和FOS亮氨酸拉链,JUN亮氨酸拉链和JUN亮氨酸的相互作用至少高1000倍,因此优选地,融合在重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的亮氨酸拉链和融合在重组抗狂犬病病毒的链可变区的亮氨酸拉链不相同。
在本发明中,亮氨酸拉链的选择、以及组合形式不受本发明的限制,本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的亮氨酸拉链、及其组合,这也属于本发明的发明构思。
优选地,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中,抗狂犬病毒抗体的重链可变区具有如I、II或III所示的氨基酸序列:
I具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;
II具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有75%同源性的序列;
III具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中,抗狂犬病毒抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
优选地,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中,抗狂犬病毒抗体的轻链可变区具有如i、ii或iii所示的氨基酸序列:
i具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;
ii具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有75%同源性的序列;
iii具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中,抗狂犬病毒抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中,抗狂犬病毒抗体的重链可变区与亮氨酸拉链可以直接相连,也可通过连接肽相连。
优选地,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中,抗狂犬病毒抗体的重链可变区与亮氨酸拉链通过连接肽相连。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中,连接肽为含有半胱氨酸的连接肽,含有半胱氨酸的连接肽可以稳定基因工程抗体。在本发明的另外一些实施例中,该连接肽具有如式I所示结构:
(C)mG(C)m
式I;
所述m为任意整数,优选为m<5。
在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中,连接肽为不含半胱氨酸的连接肽。在本发明的另外一些实施例中,该连接肽具有如式II所示结构:
(GGGGS)n
式II;
所述n为任意整数,优选为n<5。
在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中,不含半胱氨酸的连接肽具有如式III所示结构:
PKPSTPPGSS
式III。
在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中,不含半胱氨酸的连接肽具有如式IV所示结构:
AKTTAPSVYPLA
式IV。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的重组基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区包括抗狂犬病毒抗体的重链可变区、连接肽和亮氨酸拉链,三者依次相连,其中亮氨酸拉链可以连接在连接肽的碳端或氮端。在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的重组基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区,从氮端到碳端依次连接有抗狂犬病毒抗体的重链可变区、连接肽和亮氨酸拉链,其具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中,抗狂犬病毒抗体的轻链可变区与亮氨酸拉链可以直接相连,也可通过连接肽相连。
优选地,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中,抗狂犬病毒抗体的轻链可变区与亮氨酸拉链通过连接肽相连。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中,连接肽为含有半胱氨酸的连接肽,含有半胱氨酸的连接肽可以稳定基因工程抗体。在本发明的另外一些实施例中,该连接肽具有如式I所示结构:
(C)mG(C)m
式I;
所述m为任意整数,优选为m<5。
在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中,连接肽为不含半胱氨酸的连接肽。在本发明的另外一些实施例中,该连接肽具有如式II所示结构:
(GGGGS)n
式II;
所述n为任意整数,优选为n<5。
在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中,不含半胱氨酸的连接肽具有如式III所示结构:
PKPSTPPGSS
式III。
在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中,不含半胱氨酸的连接肽具有如式IV所示结构:
AKTTAPSVYPLA
式IV。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的重组基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区包括抗狂犬病毒抗体的轻链可变区、连接肽和亮氨酸拉链,三者依次相连,其中亮氨酸拉链可以连接在连接肽的碳端或氮端。在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的重组基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区,从氮端到碳端依次连接有抗狂犬病毒抗体的轻链可变区、连接肽和亮氨酸拉链,其具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
本发明中的连接肽的选择不受本发明提供的连接肽的限制,本领域技术人员可以根据实际情况选择连接肽。
优选地,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病抗体的重链可变区还融合有标签肽,标签肽连接在亮氨酸拉链的氨基端或羧基端。在本发明的一些实施例中,该标签肽选自HIS标签、HA标签、FLAG标签或MYC标签。在本发明的另外一些实施例中,该标签具体为HA标签,其具有如式V所示结构:
YPYDVPDYA
式V。
优选地,本发明提供的基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区还融合有标签肽,标签肽连接在亮氨酸拉链的氨基端或羧基端。在本发明的一些实施例中,该标签肽选自HIS标签、HA标签、FLAG标签或MYC标签。在本发明的另外一些实施例中,该标签具体为HIS标签,其具有如其具有如式VI所示结构:
HHHHHH
式VI。
在本发明中标签肽的添加有助于重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区、重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的鉴定和纯化。另外,标签肽的添加还可以用于验证重组抗狂犬病毒的重链可变区、重组抗狂犬病毒的轻链可变区是否组装成功,此时,两者的标签肽必须为不同的标签肽。然而,标签肽并不是不可替代的。能分别特异性识别重组抗狂犬病毒的重链可变区、重组抗狂犬病毒的轻链可变区的方法均符合要求,例如通过置备多克隆抗体的方式,制备出分别能特异性结合重组抗狂犬病毒的重链可变区、重组抗狂犬病毒的轻链可变区的多克隆抗体,那么就可以不添加标签肽。
在本发明中,本发明提供的重组抗狂犬病毒中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中的标签肽可以与亮氨酸拉链直接相连也可以通过连接肽相连。在本发明的一些实施例中,本发明提供的重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中,标签肽与亮氨酸拉链通过连接肽相连。该连接肽与连接抗狂犬病毒抗体的重链可变区和亮氨酸拉链的连接肽可以相同也可不同,本领域技术人员可以根据实际情况选择是否需要连接肽以及连接肽的种类。
在本发明中,本发明提供的重组抗狂犬病毒中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中的标签肽可以与亮氨酸拉链直接相连也可以通过连接肽相连。在本发明的一些实施例中,本发明提供的重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中,标签肽与亮氨酸拉链通过连接肽相连。该连接肽与连接抗狂犬病毒抗体的轻链可变区和亮氨酸拉链的连接肽可以相同也可不同,本领域技术人员可以根据实际情况选择是否需要连接肽以及连接肽的种类。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的重组基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区包括抗狂犬病毒抗体的重链可变区、连接肽1、亮氨酸拉链、连接肽2、标签肽,五者依次相连。在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的重组基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区,从氮端到碳端依次连接有抗狂犬病毒抗体的重链可变区、连接肽1、亮氨酸拉链、连接肽2、标签肽,其具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体中,在本发明的一些实施例中,本发明提供的重组基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区包括抗狂犬病毒抗体的轻链可变区、连接肽1、亮氨酸拉链、连接肽2、标签肽,五者依次相连。在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的重组基因工程抗体中,重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区,从氮端到碳端依次连接有抗狂犬病毒抗体的轻链可变区、连接肽1、亮氨酸拉链、连接肽2、标签肽,其具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的基因工程抗体由具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区和具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区组装而成,命名为zipFv57。
本发明还提供了一种编码本发明提供的基因工程抗体的重链可变区的核酸,其包括编码抗狂犬病毒抗体的重链可变区的核酸和编码亮氨酸拉链的核酸;
该编码抗狂犬病毒抗体的重链可变区的核酸:
具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列;
该编码亮氨酸拉链的核酸:
具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的编码基因工程抗体的重链可变区的核酸具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或或具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列;
该核酸所编码的重链可变区具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码本发明提供的基因工程抗体的轻链可变区的核酸,其包括编码抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的核酸和编码亮氨酸拉链的核酸;
该编码所述抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的核酸:
具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列;
该编码所述亮氨酸拉链的核酸:
具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的编码基因工程抗体的轻链可变区的核酸具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或或具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列;
该核酸所编码的轻链可变区具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在本发明中,针对编码本发明的基因工程抗体的氨基酸序列进行了密码子优化,所得核酸更适合在原核系统中表达,优选为在大肠杆菌中表达。
本发明还提供了一种抗狂犬病毒的基因工程抗体的制备方法,该基因工程抗体其由重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区、重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区组装而成;该重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区融合有亮氨酸拉链;该重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区融合有亮氨酸拉链;
该制备方法包括以下步骤:
步骤1:分别获得编码所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的核酸、编码所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的核酸;
步骤2:分别将所述编码所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的核酸、编码所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的核酸构建至载体中,得表达重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的重组载体、表达重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的重组载体;
步骤3:分别将所述表达重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的重组载体、所述表达重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的重组载体转入到宿主细胞中,经表达,获得重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区表达产物、重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区表达产物;
步骤4:组装所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区表达产物、所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区表达产物,经纯化,即得。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的制备方法中,步骤1中的编码所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的核酸中,
该编码抗狂犬病毒抗体的重链可变区的核酸:
具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列;
该编码亮氨酸拉链的核酸:
具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的制备方法中,步骤1中的编码所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的核酸中,
该编码所述抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的核酸:
具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列;
该编码所述亮氨酸拉链的核酸:
具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列75%同源性的序列;
或具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
优选地,本发明提供的制备方法中,步骤2中的载体为质粒载体、病毒载体、动物转基因的载体或通用载体。更为优选地,该载体具体为质粒载体。在本发明的一些实施例中,该载体具体为pET20b。
优选地,本发明提供的制备方法中,步骤3中的宿主细胞为细菌、酵母、动物或植物的细胞。在本发明的一些实施例中,该宿主细胞具体为大肠杆菌。
优选地,本发明提供的制备方法中,步骤4中组装具体为:将所得重组抗狂犬病毒的重链可变区表达产物、所得重组抗狂犬病毒的轻链可变区表达产物分别变性,之后混合所得变性的重链可变区表达产物、变性的轻链可变区表达产物,经复性组装,得复性组装产物;
取所得复性组装产物,经纯化,即得重组抗狂犬病毒的基因工程抗体。
在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的制备方法中,步骤4中的纯化所用方法为亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法或分子筛色谱法。在本发明的另外一些实施例中,步骤4中的纯化所用方法具体为针对His纯化标签的亲和色谱法。在本发明的一个优选的实施方案中,步骤4中的纯化步骤包括使用针对His纯化标签的色谱柱,如Ni-NTA色谱柱,进行目的蛋白的亲和纯化,收集含目的蛋白的咪唑洗脱液;之后将含目的蛋白的咪唑洗脱液使用凝胶过滤,如分子筛,将目标蛋白和未组装的单体或多聚体分离,收集目标蛋白,即得。
在本发明提供的制备方法中,步骤4中的纯化方法不受本发明提供的方法的限制,本领域技术人员在其知识范围内也可以使用其他常规手段进行目的蛋白的纯化。
本发明还提供了一种本发明提供的基因工程抗体在制备防治狂犬病毒感染疾病的药物中的应用。
本发明还提供了一种本发明提供的基因工程抗体在制备检测狂犬病毒的试剂中的应用。
优选地,本发明提供的制备检测狂犬病毒的试剂的应用中的试剂具体为试剂盒。
本发明提供了一种抗狂犬病毒的基因工程抗体、其制备方法和应用。该基因工程抗体其由重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区、重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区组装而成;该重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区融合有亮氨酸拉链;该重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区融合有亮氨酸拉链。本发明提供的基因工程抗体具有较高的狂犬病毒中和能力。该基因工程抗体还具有结构简单,易于构建,且可实现在原核系统中的高效表达的有益效果,因而更易于实现其工业化大生产。实验结果证实,本发明提供的抗狂犬病毒的基因工程抗体产生了更高的中和活性,相比原单链抗体,差异显著(P<0.05)。
附图说明
图1示实施例1中构建57VH-FOS-HA、57VL-JUN-His过程中所得的基因片段的电泳检测结果;
图2示实施例2中含57VH-FOS-HA基因的表达载体、含57VL-JUN-His基因的表达载体的构建过程中的电泳检测结果;
图3示实施例2中宿主中目的蛋白表达的检测结果;
图4示实施例2中重组抗狂犬病毒抗体zipFv57的复性组装的检测结果;
图5示实施例2中电泳分析纯化情况检测结果;
图6示实施例2中电泳分析纯化程度和大小的检测结果;
图7示实施例2中用还原和非还原性SDS-PAGE检测目的产物的鉴定结果;
图8示实施例2中用Western-Blot检测目的产物的鉴定结果;
图9示实施例2中用Western-Blot检测目的产物的鉴定结果;
图10示实施例3中Elisa的方法检测重组抗狂犬病毒抗体zipFv57相比scFv57的结合活性检测结果;
图11示实施例4中重组抗狂犬病毒抗体zipFv57和scFv57对假病毒(CVS)-11中和结果;
图12示实施例4中重组抗狂犬病毒抗体zipFv57和scFv57对假病毒CTN中和结果;
图13示实施例4中RFFIT法检测重组抗狂犬病毒抗体zipFv57和scFv57抗体的中和活性检测结果;
图14示实施例5中重组抗狂犬病毒抗体zipFv57的稳定性检测结果;
图15示实施例6中重组抗狂犬病毒抗体zipFv57在动物水平中和活性的研究的实验结果。
具体实施方式
本发明公开了一种抗狂犬病毒的基因工程抗体、其制备方法和应用。本领域技术人员可以参考本文内容,获得该基因工程抗体,实现其应用,特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种抗狂犬病毒的基因工程抗体、其制备方法和应用中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案,下面结合实施例,进一步阐述本发明。下述实施例仅仅出于示例性目的,并非意在限制本发明的范围。应当理解的是,除非另有说明,下述各实施例中所用到的仪器设备均为本领域的常规设备;除非另有说明,所使用的培养基均为市售可得的常规培养基,本领域技术人员均熟知其中的成分及含量。为了简便起见,在本文中有可能使用各种通用的缩写,本领域技术人员完全能够理解其含义。
实施例1:编码重组抗狂犬病毒抗体zipFv的基因的获得
1.zipFv57基因的密码子优化
根据发明人在Molecular Immunology上发表的《Negative effects of adisulfide bond mismatch in anti-rabies G protein single-chain antibodyvariable fragment FV57》中所述的FV57VL85S抗体(在本发明中标记为scFv57)序列,获得抗狂犬病毒抗体的轻链可变区(标记为57VL)、抗狂犬病毒抗体的重链可变区(57VH)的氨基酸序列。所得抗狂犬病毒抗体的重链可变区,即57HL,具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;所得抗狂犬病毒抗体的轻链可变区,即57VL,具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。选择大肠杆菌偏爱的密码子对编码该氨基酸序列的核酸序列进行优化,所得编码抗狂犬病毒抗体的重链可变区的基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列;所得编码抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的基因具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
根据FOS亮氨酸拉链的氨基酸序列(如SEQ ID NO:7所示)和JUN亮氨酸拉链的氨基酸序列(如SEQ ID NO:8所示),获得连接了HA标签的FOS亮氨酸拉链氨基酸序列(标记为FOS-HA)、连接了His标签的JUN亮氨酸拉链氨基酸序列(标记为JUN-His)。选择大肠杆菌偏爱的密码子对编码该氨基酸序列的核酸序列进行优化。
根据密码子优化、组合,可得带标签的,融合亮氨酸拉链的重链可变区基因(即目的基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示(标记为57VH-FOS-HA),全长534bp。
根据密码子优化、组合,可得带标签的,融合亮氨酸拉链的轻链可变区基因(即目的基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示(标记为57VL-JUN-His),全长492bp。
2.利用SOE PCR法合成人源化拉链抗体zipFv57的、连接HA标签的融合FOS亮氨酸拉链的重链可变区(57VH-FOS-HA)基因
上游引物F1(其含NdeI(用于将基因构建入原核表达载pET20b中)),下游引物R1,以pBV20-scFv57(由本研究组制备)为模板,克隆出scFv的重链可变区,如图1中的泳道1。
上游引物F2,下游引物R2(其含Xho I(酶切位点前设终止密码子)),以编码氨基酸序列为PGH–CGG-FOS-GGC–HA的基因(上海捷锐生物工程有限公司合成)为模板,克隆出连接有HA标签的FOS亮氨酸拉链(FOS-HA),如图1中的泳道4。
下游引物R1和上游引物F2有27bp的重叠区;最后以F1为上游引物,以R2为下游引物,上文所述的scFv57的重链可变区和FOS-HA互为模板,克隆出57VH-FOS-HA基因,构建重组载体、经转化,所得重组菌株,标记为57VH-FOS-HA重组菌株。其中各个引物的核苷酸序列信息见表1。
表1扩增编码重组抗狂犬病毒抗体zipFv的重链可变区的核酸所用引物
引物名称 | 核苷酸序列 |
上游引物F1 | 具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列 |
下游引物R1 | 具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列 |
上游引物F2 | 具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列 |
下游引物R2 | 具有如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列 |
3.利用SOE PCR法合成人源化拉链抗体zipFv57的、连接His标签的融合JUN亮氨酸拉链的轻可变区(57VL-JUN-His)基因
上游引物F3含NdeI(用于将基因构建入原核表达载pET20b中),下游引物R3,以pBV20-scFv57(由本研究组制备)为模板,克隆出scFv57的轻链可变区,如图1中的泳道2。
上游引物F4,下游引物R4含Xho I(酶切位点前设终止密码子),以编码氨基酸序列为PGH-CGG-JUN-GGC-His的基因(上海捷锐生物工程有限公司合成)为模板,克隆出连接有His标签的JUN亮氨酸拉链(JUN-His),如图1中的泳道5;泳道3为DNA质量标准Trans2K PlusDNA Marker(购自北京全式金生物技术有限公司)。
下游引物R3和上游引物F4有21bp的重叠区;最后以F3为上游引物,以R4为下游引物,上文所述的scFv57的轻链可变区和JUN-His互为模板,克隆出57VL-JUN-His基因。
PCR体系:10×反应缓冲液5μL,1μL(5–50ng)质粒模板DNA,一对引物各2μL,dNTP 1μL,0.5μL Pfu Turbo DNA聚合酶(2.5U/μL),总体积50μl。其中各个引物的核苷酸序列信息见表2。
表2扩增编码重组抗狂犬病毒抗体zipFv的轻链可变区的核酸所用引物
引物名称 | 核苷酸序列 |
上游引物F3 | 具有如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列 |
下游引物R3 | 具有如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列 |
上游引物F4 | 具有如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列 |
下游引物R4 | 具有如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列 |
实施例2:重组抗狂犬病毒抗体zipFv的表达、复性组装和纯化
1.含57VH-FOS-HA基因的表达载体的构建:
将测序正确的实施例1制备获得的57VH-FOS-HA基因以NdeI和Xho I双酶切后,与经同样双酶切的表达载体pET20b(购自上海天呈科技有限公司),如图2的泳道2,用T4连接酶连接,然后转化E.coli top10,小提质粒,将酶切鉴定结果正确的克隆送测序,挑选与目的序列一致的克隆,对应的重组表达质粒标记为pET20b-57VH-FOS-HA。
2.含57VL-JUN-His基因的表达载体的构建:
将测序正确的实施例1制备获得的57VL-JUN-His基因以NdeI和Xho I双酶切后,与经同样双酶切的表达载体pET20b(购自上海天呈科技有限公司),如图2的泳道3,用T4连接酶连接,然后转化E.coli top10,小提质粒,将酶切鉴定结果正确的克隆送测序,挑选与目的序列一致的克隆,对应的重组表达质粒标记为pET20b-57VL-JUN-His。
3.在宿主中表达目的基因:
将测序正确的重组质粒pET20b-57VH-FOS-HA和pET20b-57VL-JUN-His分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。用含氨苄青霉素的LB琼脂平板筛选。挑取新鲜单菌落接种于5mL LB培养基(含氨苄青霉素50μg/ml)中,37℃振荡培养过夜。次日接种100μL过夜培养物于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中。37℃振荡培养约3小时,至OD600≈0.6-0.8时,加入IPTG(在LB培养液中的终浓度为0.5mM/ml),诱导表达5-6小时,离心收集细菌。电泳鉴定目的蛋白的表达,如图3所示,其中泳道1为蛋白质质量标准,为Precision Plus ProteinTMStandards All blue(购自伯乐医学产品上海有限公司);泳道2为57VH-FOS-HA;泳道3为57VL-JUN-His。
4.培养和扩增表达宿主:
将蛋白表达量高的克隆pET20b-57VH-FOS-HA和pET20b-57VL-JUN-His,分别扩增培养,将过夜培养物按1︰50的比例接种于新鲜的LB培养液中,37℃振荡培养约3小时,至OD600≈0.6-0.8时,加入IPTG(在LB培养液中的终浓度为0.5mM/mL),诱导表达5-6小时,取大量表达的细菌培养液,4000rpm离心30分钟,收集细胞沉淀,弃上清。
5.目的表达产物分离:
分别将细胞沉淀轻悬于细菌裂解液(50mM Tris-HCl,pH8.0)中;冰浴下超声破碎30min;在4℃以10000g离心30min;沉淀用8M尿素,50mM Tris-HCl(pH 8.0),8‰(V:V)β-巯基乙醇搅拌溶解,4℃,12h左右。在4℃以10000g离心30min,取上清。
6.zipFv57的复性组装:
取含目标蛋白的上清液,取少量样品进行SDS-PAGE电泳,估计其蛋白浓度,将含同物质量的57VH-FOS-HA和57VL-JUN-His的上清液混合,控制总蛋白浓度浓度在50-300μg/mL左右,用复性液和组装液G+(50mM Tris-HCl(pH=8.2),10%(v/v)甘油,1%(m/v)甘氨酸,0.5mM EDTA,50mM NaCl,500μM GSH(还原型谷胱甘肽)、500μM GSSG(氧化型谷胱甘肽))和复性液和组装液G-(50mM Tris-HCl(pH=8.2),10%(v/v)甘油,0.5mM EDTA,50mM NaCl))分别透析。复性组装后,用非还原性SDS-PAGE鉴定是否组装成功。检测结果如图4,其中的泳道4为复性组装产物(zipFv57),泳道2为复性组装前57VH-FOS-HA,泳道3为复性组装前57VL-JUN-His,泳道1为蛋白质质量标准,为Precision Plus ProteinTM Standards All blue(购自伯乐医学产品上海有限公司)。
7.目的产物纯化:
超滤浓缩复性液,取上清,以0.45μm的微孔滤膜过滤后,用镍柱进行亲和层析。首先用复性液和组装液G-缓冲液平衡镍柱,再在此缓冲液基础上加50-500mM咪唑进行梯度洗脱,收集各梯度洗脱液,电泳分析纯化情况,电泳分析结果见图5,其中泳道2为柱前,泳道3为流穿,泳道4为100mM洗脱液,泳道1为蛋白质质量标准,为Precision Plus ProteinTMStandards All blue(购自伯乐医学产品上海有限公司)。收集100mM咪唑梯度洗脱液,用分子筛perdex200(GE)进行凝胶过滤,收集对应zipFv57分子量大小的蛋白峰的流出液,电泳分析纯化程度和大小,结果如图6,泳道2为柱前,泳道3和4为多聚体,泳道5为zipFv57且分子量大小正确,泳道1为蛋白质质量标准,为Precision Plus ProteinTM Standards Allblue(购自伯乐医学产品上海有限公司)。
8.目的产物鉴定:
取出目标蛋白,进行还原和非还原性SDS-PAGE,分析分子量的大小,如图7,泳道2为非还原条件下的zipFv57,泳道3为还原条件下的zipFv57,分子量大小正确;进行还原和非还原条件下的Western-Blot,且在两种条件下,分别用His单抗和HA单抗做为一抗,HRP鼠单抗做为二抗,分析目标产物是否为异源二聚体,从而鉴定是否组装成功。结果如图8,泳道1为非还原条件下的zipFv57,泳道2为还原条件下的zipFv57,如图所示,在还原和非还原条件下,zipFv57均能被HA单抗显色;结果如图9,泳道1为非还原条件下的zipFv57,泳道2为还原条件下的zipFv57,如图所示,在还原和非还原条件下,zipFv57均能被His单抗显色。因此证明zipFv57为由57VH-FOS-HA和57VL-JUN-His组装而成的异源二聚体,本实施例成功获得了抗狂犬病毒的基因工程抗体,并将其标记为zipFv57。
实施例3:重组抗狂犬病毒抗体zipFv57的特异性抗原结合活性检测
通过Elisa的方法检测zipFv57相比scFv57的结合活性。
将狂犬病毒(aG株,吉林迈丰生物药业有限公司惠赠)包被96孔板,每孔加100μL,scFv57(本实验室保存,其制备方法具体见发明人在Molecular Immunology上发表的《Negative effects of a disulfide bond mismatch in anti-rabies G proteinsingle-chain antibody variable fragment FV57》中FV57VL85S抗体的制备方法)做阳性对照,用一个带有组氨酸标签的无关蛋白作为阴性对照,每组所用蛋白的浓度相同。用3%BSA-PBS进行封闭,37℃下孵育1h。加入用PBS稀释的实施例2中制备的抗体zipFv57,每孔100μL,37℃1h。加入HRP标记的抗His-Tag抗体,每孔100μL,37℃下孵育1h;用TMB显色液(购自天根生化科技有限公司)显色,37℃,15min,用H2SO4终止反应后,在450nm波长下测定OD值,结果见图10。
从图10中可以看出,zipFv57可以与狂犬病毒结合,而无关蛋白不能与狂犬病毒结合,表明此zipFv57能特异性结合狂犬病毒糖蛋白,且在相同浓度下,zipFv57的OD450为1.15,scFv57的OD450为0.55,因此zipFv57比scFv57的结合能力高109%,表明此抗体的拉链结构相对于单链抗体结构,具有更有效的结合狂犬病毒的能力。
实施例4:重组抗狂犬病毒抗体zipFv57中和活性(PNA法)的研究
通过假病毒中和试验(PNA法)检测zipFv57相比scFv57的中和活性。
采用PNA法通过假病毒检测抗体中和活性,因此实验方法安全。在PNA中用(CVS)-11和CTN假病毒,因为(CVS)-11是国际上普遍应用在实验室的标准毒株,CTN为我国流行株,灭活的CTN株用来生产疫苗。
其具体方法为将携带luciferase报告基因的CTN和(CVS)-11假病毒(本实验室保存),100μL样品即实施例2中制备的zipFv57和scFv57(zipFv57和scFv57浓度相同,scFv57为本实验室保存,其制备方法具体见发明人在Molecular Immunology上发表的《Negativeeffects of a disulfide bond mismatch in anti-rabies G protein single-chainantibody variable fragment FV57》中FV57VL85S抗体的制备方法)经20倍系列稀释后与50μL CTN或(CVS)-11假病毒在37℃中孵育1小时,后每孔加入100μL含10000个BHK-21细胞,37℃培养48h后,每孔移出180μL的培养基,留下大约40μL/孔,加入40μL/孔luciferase试剂,室温放置2min至细胞完全裂解,充分混合后取出加入到96孔板中,用VICTOR X2MultilabelPlate Reader(PerkinElmer,USA)读出luciferase数值。抗体中和假病毒的能力用剩余luciferase比值来表示,剩余luciferase比值=抗体加假病毒组luciferase值/只加假病毒组的luciferase值,因假病毒CTN和(CVS)-11拥有luciferase报告基因,当抗体中和并阻止假病毒进入宿主细胞,那么luciferase数值将会降低,因此抗体对假病毒中和活性越高,那么剩余luciferase比值会越低。
结果见如图11所示,其为zipFv57和scFv57对假病毒(CVS)-11中和结果,其中1代表zipFv57,2代表scFv57;由图可知在各个稀释梯度下,zipFv57的剩余luciferase比值均比scFv57低。如图12所示,其为zipFv57和scFv57对假病毒CTN中和结果,其中1代表zipFv57,2代表scFv57;由图可知,在各个稀释梯度下,zipFv57的剩余luciferase比值均比scFv57低。因此证明zipFv57比scFv57对狂犬病毒(CVS)-11和CTN的中和能力高。
通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT法)检测zipFv57相比scFv57的中和活性
RFFIT法进行检测抗体中和活性,因使用狂犬活毒,安全性上不及PNA法,但实验结果更加真实和精确。
其具体方法为将标准血清(购自中国药品生物制品检定所)先经56℃灭活30分钟,样品zipFv57、scFv57或标准血清经三倍稀释后与感染量为80%荧光灶的CVS病毒(CVS-11,购自中国药品生物制品检定所)在37℃中和1小时(血清量为100μL,病毒量为50μL),每孔中再加入100μL含50000个BSR细胞(106/mL,于含10%灭活小牛血清的DMEM中),37℃培养24小时后,倾出培养液。用含Ca2+、Mg2+的PBS浸洗1遍,加入预冷至-20℃的80%冷丙酮,50μL/孔,-20℃固定7分钟(或室温30分钟)。稍干后加入工作浓度的抗狂犬病毒核蛋白的荧光抗体(40μL/孔,invitrogen),37℃避光孵育60分钟后,倾出液体,PBS浸洗2遍,第一次30秒,第二次1-5分钟,倾出液体。滴甘油于孔中(每孔一滴),镜检观察病变率。ED50计算为:[(50-低于50%的病变率)÷(高于50%的病变率-低于50%的病变率)×log稀释度+log低于50%病变率的稀释度]的反对数。样品的单位含量为:标准品的单位含量×样品的ED50÷标准品的ED50÷样品的浓度。
检测结果如图13所示,zipFv57的效价为1236.54IU/mg,scFv57的效价为807.69IU/mg,zipFv57比scFv57高53%。,空白血清的效价为0,这说明zipFv57能特异性的阻止狂犬病毒对BSR细胞的吸附,抑制狂犬病毒对靶细胞的感染。以上结果充分体现出此抗体的拉链结构相对于单链抗体结构,具有更有效的中和狂犬病毒的能力。
实施例5:重组抗狂犬病毒抗体zipFv57的稳定性
稳定性是影响抗体功能的最重要的生物学活性之一。用PBS与实施例2中制备的zipFv57和scFv57抗体(scFv57为本实验室保存,其制备方法具体见发明人在MolecularImmunology上发表的《Negative effects of a disulfide bond mismatch in anti-rabies G protein single-chain antibody variable fragment FV57》中FV57VL85S抗体的制备方法)在37℃共同孵育。取不同时间点的抗体样品离心,取上清。用狂犬病毒(aG株,吉林迈丰生物药业有限公司惠赠)包板,用BSA-PBS封闭,加入上述样品,孵育,洗板。加入HRP标记的抗His-Tag抗体,每孔100μL,37℃下孵育1h;用TMB显色液(购自天根生化科技有限公司)显色,用H2SO4终止反应后,在450nm波长下测定OD值,以检测抗体的相对稳定性,结果见图14,其中曲线1为zipFv57;曲线2为scFv57。结果显示,zipFv57在PBS中37℃的半衰期为73.9h比scFv57(12.7h)高4.31倍,且在96h仍有结合活性。
实施例6:重组抗狂犬病毒抗体zipFv57在动物水平中和活性的研究
通过对CVS的中和效果进行评价本发明实施例2制备获得的抗体zipFv57在动物水平的中和效果,以scFv57抗体(scFv57为本实验室保存,其制备方法具体见发明人在Molecular Immunology上发表的《Negative effects of a disulfide bond mismatch inanti-rabies G protein single-chain antibody variable fragment FV57》中FV57VL85S抗体的制备方法)作为对照。用90%致死剂量的病毒与抗体混合。选用16-18g/只的雌性昆明小鼠(n=10),于腿部四头肌注射200μL的病毒与抗体的混合液。阳性对照为具有相同效价的抗狂犬病毒人免疫球蛋白(HRIG,购自吉林省疾控中心)与90%致死剂量的病毒混合,阴性对照为90%致死剂量的病毒。检测结果如图15所示,从图中可知,在动物水平上,zipFv57的保护力为100%,而scFv57动物保护力为60%。充分说明此拉链抗体的拉链结构相对于单链抗体的结构,更利于在动物水平上清除狂犬病毒。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种抗狂犬病毒的基因工程抗体,其特征在于,其由重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区、重组抗狂犬病毒的轻链可变区组装而成;
所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区融合有亮氨酸拉链;
所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区融合有亮氨酸拉链;
所述融合在重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的亮氨酸拉链为FOS亮氨酸拉链;
所述融合在重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的亮氨酸拉链为JUN亮氨酸拉链;
所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
2.根据权利要求1所述的基因工程抗体,其特征在于,
所述编码所述抗狂犬病毒抗体的重链可变区的核酸,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
所述编码所述FOS亮氨酸拉链的核酸,其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1所述的基因工程抗体,其特征在于,
所述编码所述抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的核酸,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;
所述编码所述JUN亮氨酸拉链的核酸,其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4.一种如权利要求1所述的基因工程抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:分别获得编码所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的核酸、编码所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的核酸;
步骤2:分别将所述编码所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的核酸、编码所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的核酸构建至载体中,得表达重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的重组载体、表达重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的重组载体;
步骤3:分别将所述表达重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的重组载体、所述表达重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的重组载体转入到宿主细胞中,经表达,获得重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区表达产物、重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区表达产物;
步骤4:组装所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区表达产物、所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区表达产物,经纯化,即得。
5.如权利要求1所述的基因工程抗体在制备防治狂犬病毒感染疾病的药物中的应用。
6.如权利要求1所述的基因工程抗体在制备检测狂犬病毒的试剂中的应用。
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由半合成噬菌体抗体库制备亮氨酸拉链二聚双价双特异性SCFV抗体;陈娟;《国外医学免疫学分册》;19970905;第20卷(第5期);第101段 |
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