CN113121694A

CN113121694A - 具有与hpg i结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及其制备方法和应用

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Publication number: CN113121694A
Application number: CN201911405405.2A
Authority: CN
Inventors: 孟媛; 钟冬梅; 周全兴; 游辉; 范凌云
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN113121694B

Abstract

本发明涉及一种有利于提高亲和力和活性的具有与HPG I结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及其制备方法和应用。本发明根据部分已有的能特异地结合HPG I的抗体序列，对其中部分氨基酸序列、特别是可变区的数个氨基酸序列进行修改、突变，从而得到上述结合蛋白。通过实验验证，上述结合蛋白能特异性的结合HPG I，其特异性强，灵敏度高，活性和亲和力均达到或高于当前市场产品，可用于科研或检测领域对HPG I的特异性检测。

Description

具有与HPG I结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程和生物检测领域，尤其是涉及一种具有与HPG I结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

胃蛋白酶原(PG)是由细胞合成，并以不具有活性的酶原颗粒形式贮存在细胞内。当细胞内充满酶原颗粒时，其对新的酶原的产生具有负反馈作用。分泌进入胃腔内的胃蛋白酶原在胃酸的作用下，从分子中解离出一个小分子多肽，转变为具有生物活性的胃蛋白酶。已激活的胃蛋白酶对胃蛋白酶原也有激活作用。

根据胃蛋白酶原的生化性质和免疫原性可将其分成2个亚群，组分1～5的免疫原性相同，称为胃蛋白酶原I(PG I)，主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；组分6和7被称为胃蛋白酶原II(PG II)，除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能产生。

通常情况下，人体约有1％的胃蛋白酶原透过胃黏膜毛细血管进入血液循环，进入血液循环的胃蛋白酶原在血液中含量非常稳定。血清中PG I和PG II可以反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。当胃黏膜发生病理变化时，血清中胃蛋白酶原的含量也随之改变。因此，监测血清中胃蛋白酶原的浓度可以作为监测胃黏膜状态的手段。

血清中PG I是检测胃泌酸腺细胞功能的指标之一，胃酸分泌增多则PG I升高，分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PG I降低；PG II与胃底粘膜病变的相关性较大，PG II升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增值有关；PG I/II比值进行性降低与胃粘膜萎缩进展相关。因此，测定PG I、PG II及其比值有重要的作用，PG I和PG II可作为胃炎、胃癌等多种胃部疾病的诊断标志物，相比胃钡餐造影、胃镜等传统检测手段，具有准确、无创、安全的优势。

目前临床上用于检测HPG I(人PG I)的方法有酶联免疫吸附法、化学发光法、流式荧光发光法、时间分辨荧光免疫分析法、光激化学发光免疫分析法、胶体金等，不同方法都有各自的优缺点，但是都需要针对于HPG I的特异性单克隆抗体。目前国内用于检测HPG I的单克隆抗体大都自外国采购，用于配对检测时可选择的不多，市场上对于活性和亲和力好的单克隆抗体存在强烈的需求。

发明内容

基于此，有必要提供一种高活性和亲和力的具有与HPG I结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下。

一种具有与HPG I结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其抗原结合结构域包括下述至少一个互补决定区，或者其抗原结合结构域与下述至少一个互补决定区具有至少80％的序列同一性且与HPG I具有K_D≤8.36E-09mol/L的亲和力：

互补决定区CDR-VH1是G-N-X1-F-T-X2-S-X3-M-H，其中：X1是S或T；X2是T或S；X3是W或F；

互补决定区CDR-VH2是I-H-X1-H-S-G-N-X2-N-Y-X3-E-K-F，其中：X1是A或P；X2是T或S；X3是Q、D或N；

互补决定区CDR-VH3是R-X1-T-G-X2-F-X3-Y，其中：X1是N或Q；X2是A或P；X3是E或D；

互补决定区CDR-VL1是Q-X1-V-X2-S-X3-V-A，其中：X1是T或S；X2是S或T；X3是E或D；

互补决定区CDR-VL2是S-A-X1-N-X2-Y-T-G-X3-P-D，其中：X1是S或T；X2是R或K；X3是A或V；

互补决定区CDR-VL3是Q-D-X1-S-S-P-X2-T，其中：X1是F或Y；X2是R或K。

一种检测试剂或检测试剂盒，含有上述任一实施例所述的结合蛋白。

一种核酸，含有用于编码上述任一实施例所述的结合蛋白的核酸序列。

一种表达载体，其特征在于，含有上述核酸。

一种宿主细胞，其特征在于，转染或转化有含有上述核酸或如上述表达载体。

一种具有与HPG I结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

从能够分泌抗HPG I单克隆抗体的细胞中提取RNA；

对提取的RNA使用碱基序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的两种引物进行cDNA的合成；

将上述合成的cDNA作为模板，以序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11所示的三种引物进行扩增，获得轻链基因，并以序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12所示的三种引物进行扩增，获得重链基因；

分别将所述轻链基因和所述重链基因插入表达载体中，并转化或转染宿主细胞，挑选阳性克隆进行所述结合蛋白的表达。

本发明根据部分已有的能特异地结合HPG I的抗体序列进行设计特异性的抗原结合结构域，尤其是对其中部分氨基酸序列、特别是可变区的数个氨基酸序列进行修改、突变，从而得到上述结合蛋白。通过实验验证，上述结合蛋白能特异性的结合HPG I，其活性和亲和力均达到或高于当前市场产品，可用于科研或检测领域对HPG I的特异性检测。

附图说明

图1为纯化的单克隆抗体的电泳鉴定结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

具体地，本文术语“分离的结合蛋白”是这样的蛋白，其由于衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞系统中合成的蛋白将是与其天然结合的组分“分离的”；还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得蛋白基本上不含天然结合的组分。

本文术语“抗原结合结构域的分离的结合蛋白”泛指包含CDR区(互补决定区)的一切蛋白/蛋白片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

本文所述抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域被称为“VH”。轻链的可变结构域被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。

本发明提供了一种具有与HPG I结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中抗原结合结构域具有下述氨基酸序列的至少一个互补决定区，或者抗原结合结构域与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与HPG I具有K_D≤8.36E-09mol/L的亲和力：位于重链可变区的包含如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的互补决定区(CDR-VH1)、位于重链可变区的包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的互补决定区(CDR-VH2)、位于重链可变区的包含如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的互补决定区(CDR-VH3)、位于轻链可变区的包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的互补决定区(CDR-VL1)、位于轻链可变区的包含如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的互补决定区(CDR-VL2)、以及位于轻链可变区的包含如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的互补决定区(CDR-VL3)。

具体地，如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列是G-N-X1-F-T-X2-S-X3-M-H，其中：X1是S或T；X2是T或S；X3是W或F。

如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列是I-H-X1-H-S-G-N-X2-N-Y-X3-E-K-F，其中：X1是A或P；X2是T或S；X3是Q、D或N。

如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列是R-X1-T-G-X2-F-X3-Y，其中：X1是N或Q；X2是A或P；X3是E或D。

如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列是Q-X1-V-X2-S-X3-V-A，其中：X1是T或S；X2是S或T；X3是E或D。

如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列是S-A-X1-N-X2-Y-T-G-X3-P-D，其中：X1是S或T；X2是R或K；X3是A或V。

如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列是Q-D-X1-S-S-P-X2-T，其中：X1是F或Y；X2是R或K。

本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。因此，本发明也包括该结合蛋白的“功能性衍生物”。“功能性衍生物”是指氨基酸替换的变体，一个功能性衍生物保留有可检测的结合蛋白活性，优选为能结合HPG I的抗体的活性。“功能性衍生物”可以包含“变体”和“片段”，因其具有与本发明所述的结合蛋白完全相同的CDR序列，因此具有相类似的生物活性。

在一些具体示例中，所述抗原结合结构域与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％，或85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性且与HPG I具有K_D≤8.36E-09mol/L，K_D值也可以选择≤8.00E-11mol/L、9.30E-11mol/L、9.50E-11mol/L、1.08E-10mol/L、2E-10mol/L、3E-10mol/L、4E-10mol/L、5E-10mol/L、6E-10mol/L、7E-10mol/L、8E-10mol/L、9E-10mol/L、1E-09mol/L、2E-09mol/L、3E-09mol/L、4E-09mol/L、5E-09mol/L、6E-09mol/L、7E-09mol/L、或8E-09mol/L的亲和力；或者8.00E-11mol/L≤K_D≤8.36E-09mol/L。

在一个优选的具体示例中，CDR-VH1中X1是T；CDR-VH2中X2是T；CDR-VH3中X2是P；CDR-VL1中X3是D；CDR-VL2中X1是S；CDR-VL3中X1是Y。

基于上述优选的具体示例，在一个更具体的示例中，CDR-VH1中X2是T；在另一个更具体的示例中，CDR-VH1中X2是S。

基于上述优选的具体示例，在一个更具体的示例中，CDR-VH1中X3是W；在另一个更具体的示例中，CDR-VH1中X3是F。

基于上述优选的具体示例，在一个更具体的示例中，CDR-VH2中X1是A；在另一个更具体的示例中，CDR-VH2中X1是P。

基于上述优选的具体示例，在一个更具体的示例中，CDR-VH2中X3是Q；在另一个更具体的示例中，CDR-VH2中X3是D；在另一个更具体的示例中，CDR-VH2中X3是N。

基于上述优选的具体示例，在一个更具体的示例中，CDR-VH3中X1是N；在另一个更具体的示例中，CDR-VH3中X1是Q。

基于上述优选的具体示例，在一个更具体的示例中，CDR-VH3中X3是E；在另一个更具体的示例中，CDR-VH3中X3是D。

基于上述优选的具体示例，在一个更具体的示例中，CDR-VL1中X1是T；在另一个更具体的示例中，CDR-VL1中X1是S。

基于上述优选的具体示例，在一个更具体的示例中，CDR-VL1中X2是S；在另一个更具体的示例中，CDR-VL1中X2是T。

基于上述优选的具体示例，在一个更具体的示例中，CDR-VL2中X2是R；在另一个更具体的示例中，CDR-VL2中X2是K。

基于上述优选的具体示例，在一个更具体的示例中，CDR-VL2中X3是A；在另一个更具体的示例中，CDR-VL2中X3是V。

基于上述优选的具体示例，在一个更具体的示例中，CDR-VL3中X2是R；在另一个更具体的示例中，CDR-VL3中X2是K。

在一些优选的示例中，所述分离的结合蛋白中包括至少3个CDRs；或者，所述分离的结合蛋白包括上述6个CDRs。

上述分离的结合蛋白优选为包含可变区和恒定区的完整抗体。

在一些优选的示例中，上述分离的结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。

在一些优选的示例中，上述分离的结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO.21-24所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO.25-28所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

在一些优选的示例中，上述分离的结合蛋白还包含抗体恒定区序列。

在一些优选的示例中，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE及IgD任何其中之一恒定区的序列。

在一些优选的示例中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在一些优选的示例中，所述恒定区来源于小鼠；轻链恒定区序列如SEQ ID NO.29所示；重链恒定区序列如SEQ ID NO.30所示。

基于上述优选的示例，在其中一个具体示例中，该分离的结合蛋白的重链可变区的序列中具有如SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列。如SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列是QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGNTFTTSFMHWAKQRPGQGLEWIGEIHAHSGNTNYQEKFKGKATLTVDTSSSTAYVDLSSLTSEDSAVYYCARNTGPFEYWGQGTTLTVSS。对应地，如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中X1是T，X2是T，X3是F；如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中X1是A，X2是T，X3是Q；如SEQ IDNO.3所示氨基酸序列中X1是N，X2是P，X3是E。可理解，在其他具体示例中，该结合蛋白的重链可变区的序列也可以采用SEQ ID NO.1～3中其他的X1、X2与X3的组合。

进一步，该分离的结合蛋白的重链的序列中具有如SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。如SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列是QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGNTFTTSFMHWAKQRPGQGLEWIGEIHAHSGNTNYQEKFKGKATLTVDTSSSTAYVDLSSLTSEDSAVYYCARNTGPFEYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK。对应地，如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中X1是T，X2是T，X3是F；如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中X1是A，X2是T，X3是Q；如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列中X1是N，X2是P，X3是E。可理解，在其他具体示例中，该结合蛋白的重链的序列也可以采用SEQID NO.4～6中其他的X1、X2与X3的组合。

基于上述优选的示例，在其中一个具体示例中，该分离的结合蛋白的轻链可变区的序列中具有如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列。如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列是SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQTVSSDVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNKYTGVPDRFT GSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPKTFGGGTTLEIK。对应地如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中X1是T，X2是S，X3是D；如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列中X1是S，X2是K，X3是V；如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列中X1是F，X2是K。可理解，在其他具体示例中，该结合蛋白的轻链可变区的序列也可以采用SEQ ID NO.4～6中其他的X1、X2与X3的组合。

进一步，该分离的结合蛋白轻链的序列中具有如SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列。

如SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列是SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQTVSSDVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNKYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPKTFGGGTTLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPRDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。对应地如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中X1是T，X2是S，X3是D；如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列中X1是S，X2是K，X3是V；如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列中X1是F，X2是K。可理解，在其他具体示例中，该结合蛋白的轻链的序列也可以采用SEQID NO.4～6中其他的X1、X2与X3的组合。

本发明提供的分离的结合蛋白可以应用在制备用于检测HPG I的检测试剂或检测试剂盒中。如一种检测试剂或检测试剂盒，其含有上述任一实施例的分离的结合蛋白作为检测用的活性试剂。

本发明进一步提供了一种用于表达分离的结合蛋白的核酸，其含有用于编码上述任一实施例的分离的结合蛋白的抗原结合结构域的核酸序列。该核酸序列可以用于构建表达载体，如一种表达载体，其含有上述核酸序列。该核酸序列或表达载体也可以转染宿主细胞，如一种宿主细胞，其转染或转化有上述表达载体或上述核酸序列。

在本文中，核酸序列包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。

在一些实施方案中，本发明包括含有编码该结合蛋白的核酸序列的表达载体，其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是编码序列以允许编码序列的表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。

在本文中，载体可以指包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。

本发明的核酸或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明的一部分。所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的编码使所述肽表达产物分泌或整合到膜上的信号肽的核酸序列，本发明的核酸片段，以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。

本发明的表达载体用于转化宿主细胞。这种转化细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的多肽的培养细胞或细胞系。本发明的转化细胞包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽抱杆菌等)。宿主细胞也包括来自多细胞生物如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，优选来自哺乳动物的细胞，例如CHO细胞。所述转化细胞能够复制本发明的核酸片段。当重组制备本发明的肽组合时，所述表达产物可以输出到培养基中或携带在所述转化细胞的表面。

此外，本发明还提供了一种用于制备分离的结合蛋白的引物组合物，其包括碱基序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.12所示的六种引物，具体如下表1所示。

表1引物组合物

对应于上述引物组合物，本发明进一步还提供了一种分离的结合蛋白的制备方法，其包括如下步骤：

从能够分泌抗HPG I分离的结合蛋白的细胞中提取RNA；

分别将轻链基因和重链基因插入表达载体中，并转化或转染宿主细胞，挑选阳性克隆进行分离的结合蛋白的表达。

本发明根据部分已有的能特异地结合HPG I的抗体序列，对其中部分氨基酸序列、特别是可变区的数个氨基酸序列进行修改、突变，从而得到上述分离的结合蛋白。通过实验验证，上述分离的结合蛋白能特异性的结合HPG I，其活性和亲和力均达到或高于当前市场产品，可用于科研或检测领域对HPG I的特异性检测。

以下结合具体实施例对本发明的分离的结合蛋白及其相关应用、制备用引物组合物和制备方法以及效果作进一步详细的说明。

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司；MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司；BD SMART^TM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司；pMD-18T载体购自Takara公司；质粒提取试剂盒购自天根公司；引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。

分泌Anti-HPG I 5G10单克隆抗体的杂交瘤细胞株为已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。

1.表达质粒的构建

1.1、引物

扩增重链(Heavy Chain)和轻链(Light Chain)5’RACE(rapid-amplification ofcDNAends)引物如上表1所示。

1.2、抗体可变区基因克隆及测序

从分泌Anti-HPG I 5G10单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，用SMARTER^TMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II AOligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。

轻链基因以Universal Primer AMix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIg-kR引物进行扩增，重链基因以Universal Primer AMix(UPM)、Nested UniversalPrimer A(NUP)和mIg-HR引物进行扩增。轻链的引物对扩增出0.8KB左右的目的条带，重链的引物对扩增出1.4KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取重链及轻链基因克隆各4个克隆送Invitrogen公司进行测序。

1.3、HPG I 5G10抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的。其中轻链扩增出的基因片段中，轻链可变区(VL)基因序列为381bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；重链引物对扩增出的基因片段中，重链可变区(VH)基因序列为405bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

1.4、重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM 3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体。根据上述pMD-18T中抗体基因测序结果，设计HPG I 5G10抗体的轻链和重链基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：

HPG-I-5G10-HF：5’-CCCAAGCTTATGGAATGCAGCTGTGTCATGCTCTTCTTC-3’(SEQ IDNO.13)；

HPG-I-5G10-HR：5’-CCCGAATTCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC-3’(SEQ IDNO.14)；

HPG-I-5G10-LF：5’-CCCAAGCTTATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGG-3’(SEQ ID NO.15)；HPG-I-5G10-LR：5’-CCCGAATTCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAA-3’(SEQ ID NO.16)。

通过PCR扩增方法扩出0.75KB的轻链基因片段和1.42KB的重链基因片段。轻链和重链基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A表达载体也采用HindIII/EcoRI双酶切。将片段和载体纯化回收后重链基因和轻链基因分别连接至3.4A表达载体中，分别得到重链和轻链的重组抗体表达质粒。

2.稳定细胞株筛选

2.1、重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

重组抗体表达质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μl重组抗体表达质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

用50mM pH9.51 CB梯度稀释HPG I(购自fitzgerald，产品目录号：30R-AP038)到1ug/ml，每孔100μl，4℃过夜；次日，PBST清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入使用20％特级新生牛血清(PBS稀释)稀释细胞上清100μl/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔)，加入显色液B液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；于酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。

结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明重组抗体表达质粒瞬转后产生的抗体对HPG I有活性。

2.2、重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：PuvⅠ酶缓冲Buffer 50μl、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1抽提，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

2.3、重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25μmol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔，并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

3.重组抗体生产

3.1、细胞扩培

细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

3.2、摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的单克隆抗体进行还原性SDS-PAGE，4μg外来对照抗体作为对照。

电泳图如图1所示，在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。

4.抗体亲和力分析及活性鉴定

亲和力分析方法：

利用AMC传感器，纯化出来的单克隆抗体用PBST稀释到10μg/ml，HPG I(购自fitzgerald，产品目录号：30R-AP038)用PBST进行梯度稀释：10μg/ml、3.333μg/ml、1.111μg/ml、0.370μg/ml、0.123μg/ml、0.041μg/ml。

运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69的GLY溶液及10mM pH1.7的GLY进行传感器再生，输出数据，K_D表示平衡解亲常数即亲和力。

活性鉴定方法：

包被液CB稀释HPGI(fitzgerald,30R-AP038)到3μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的HPGI单克隆抗体，100μl/孔，37℃,30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔)，加入显色液B液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。

5.突变分析

实验发现，不同的突变体虽然都具备结合HPG I的能力，但是亲和力和抗体活性会有不同。因此，本实施例设计实验对该单克隆抗体的轻链CDR-VL和重链CDR-VH进行突变分析。

重链的互补决定区如下：

CDR-VH1是G-N-X1(S)-F-T-X2(T)-S-X3(W)-M-H；

CDR-VH2是I-H-X1(A)-H-S-G-N-X2(S)-N-Y-X3(D)-E-K-F；

CDR-VH3是R-X1(N)-T-G-X2(A)-F-X3(D)-Y。

轻链的互补决定区如下：

CDR-VL1是Q-X1(T)-V-X2(T)-S-X3(E)-V-A；

CDR-VL2是S-A-X1(T)-N-X2(R)-Y-T-G-X3(A)-P-D；

CDR-VL3是Q-D-X1(F)-S-S-P-X2(K)-T。

其中，X1、X2和X3均为突变位点。

在突变后应用上述提供的方法对抗体活性进行检测，部分结果如下。

表2与抗体活性有关的突变位点

表3抗体活性分析数据

样品μg/ml	10	3.333	1.111	0.370	0.123	0.041
							突变1	2.453	2.485	2.191	1.668	1.157	0.775
突变2	2.107	1.834	0.969	0.621	0.394	0.251
							突变3	0.966	0.773	0.396	0.173	*	*
突变4	0.503	0.362	0.195	*	*	*
							突变5	0.725	0.433	*	*	*	*
WT	2.237	1.924	0.991	0.632	0.401	0.271

“*”表示没有活性。从上表3可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列筛选亲和力较好的突变位点，部分结果如下。

表4与抗体亲和力有关的突变位点

表5亲和力分析数据

从表5的结果可以看出，表4中列出的突变位点对抗体的亲和力影响不大。

为验证上述结果，以WT作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。

表6以WT为骨架进行的突变

表7亲和力分析数据

	K<sub>D</sub>(M)
		WT	6.82E-09
WT1-1	7.23E-09
		WT1-2	6.33E-09
WT1-3	7.84E-09
		WT1-4	8.36E-09
WT1-5	6.49E-09
		WT1-6	6.94E-09
WT1-7	8.14E-09
		WT1-8	6.81E-09

从表6和表7分析，在保证具有抗体活性的前提下，上述突变位点与其他位点的关联也不大。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 具有与HPG I结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及其制备方法和应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Asn Xaa Phe Thr Xaa Ser Xaa Met His

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile His Xaa His Ser Gly Asn Xaa Asn Tyr Xaa Glu Lys Phe

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Xaa Thr Gly Xaa Phe Xaa Tyr

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Xaa Val Xaa Ser Xaa Val Ala

1 5

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Ala Xaa Asn Xaa Tyr Thr Gly Xaa Pro Asp

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Asp Xaa Ser Ser Pro Xaa Thr

1 5

<210> 7

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagcagtggt atcaacgcag agtacuuuuu 30

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> v is a, c or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

tttttttttt tttttttttt ttttvn 26

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagcagtggt atcaacgcag agt 23

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctaacactca ttcctgttga agctcttgac aat 33

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcatttacca ggagagtggg agaggc 26

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cccaagctta tggaatgcag ctgtgtcatg ctcttcttc 39

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cccgaattct catttaccag gagagtggga gaggc 35

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cccaagctta tgaagttgcc tgttaggctg ttgg 34

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cccgaattcc taacactcat tcctgttgaa gctcttgaca a 41

<210> 17

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Thr Ser

20 25 30

Phe Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile His Ala His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Gln Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Thr Gly Pro Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Thr Ser

20 25 30

Phe Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile His Ala His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Gln Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Thr Gly Pro Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp

165 170 175

Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro

180 185 190

Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile

210 215 220

Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val

260 265 270

Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala

305 310 315 320

Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro

325 330 335

Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala

340 345 350

Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu

355 360 365

Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr

370 375 380

Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr

385 390 395 400

Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe

405 410 415

Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys

420 425 430

Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Thr Val Ser Ser Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Lys Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Lys

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Thr Val Ser Ser Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Lys Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Lys

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 21

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 23

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser

1 5 10 15

Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln

20 25

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 25

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu

1 5 10 15

<210> 27

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

1 5 10 15

Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

Ala

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 30

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

Claims

1.一种具有与HPG I结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，其抗原结合结构域包括下述至少一个互补决定区，或者其抗原结合结构域与下述至少一个互补决定区具有至少80％的序列同一性且与HPG I具有K_D≤8.36E-09mol/L的亲和力：

2.如权利要求1所述的结合蛋白，其特征在于，所述互补决定区CDR-VH1中X1是T，所述互补决定区CDR-VH2中X2是T，所述互补决定区CDR-VH3中X2是P，所述互补决定区CDR-VL1中X3是D，所述互补决定区CDR-VL2中X1是S，所述互补决定区CDR-VL3中X1是Y；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中X2是T；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VH1中X2是S；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中X3是W；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VH1中X3是F；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中X1是A；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VH2中X1是P；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中X3是Q；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VH2中X3是D；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VH2中X3是N；

优选的，所述互补决定区CDR-VH3中X1是N；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VH3中X1是Q；

优选的，所述互补决定区CDR-VH3中X3是E；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VH3中X3是D；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中X1是T；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VL1中X1是S；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中X2是S；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VL1中X2是T；

优选的，所述互补决定区CDR-VL2中X2是R；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VL2中X2是K；

优选的，所述互补决定区CDR-VL2中X3是A；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VL2中X3是V；

优选的，所述互补决定区CDR-VL3中X2是R；另一个优选的，所述互补决定区CDR-VL3中X2是K。

3.如权利要求1所述的结合蛋白，其特征在于，所述互补决定区CDR-VH1中X2和X3、CDR-VH2中X1和X3、CDR-VH3中X1和X3、CDR-VL1中X1和X2、CDR-VL2中X2和X3、以及CDR-VL3中X2选自下列组合中的一种：

且所述互补决定区CDR-VH1中X1是T，所述互补决定区CDR-VH2中X2是T，所述互补决定区CDR-VH3中X2是P，所述互补决定区CDR-VL1中X3是D，所述互补决定区CDR-VL2中X1是S，所述互补决定区CDR-VL3中X1是Y。

4.如权利要求1～3中任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs；

优选的，所述结合蛋白包括6个CDRs；

更优选的，所述结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种；

进一步优选的，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO.21-24所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO.25-28所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列；

优选的，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE及IgD任何其中之一恒定区的序列；

进一步优选的，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人；

更进一步优选的，所述恒定区来源于小鼠；

再进一步优选的，轻链恒定区序列如SEQ ID NO.29所示；重链恒定区序列如SEQ IDNO.30所示。

6.一种检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1～5中任一项所述的结合蛋白。

7.一种核酸，其特征在于，含有用于编码如权利要求1～5中任一项所述的结合蛋白的核酸序列。

8.一种表达载体，其特征在于，含有如权利要求7所述的核酸。

9.一种宿主细胞，其特征在于，转染或转化有含有如权利要求7所述的核酸或如权利要求8所述的表达载体。

10.一种具有与HPG I结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

从能够分泌抗HPG I单克隆抗体的细胞中提取RNA；

将上述合成的cDNA作为模板，以序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的三种引物进行扩增，获得轻链基因，并以序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.12所示的三种引物进行扩增，获得重链基因；