CN112745390A

CN112745390A - 一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的结合蛋白

Info

Publication number: CN112745390A
Application number: CN201911035638.8A
Authority: CN
Inventors: 崔鹏; 何志强; 孟媛; 钟冬梅; 叶庆妮; 覃婷; 游辉
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2039-10-29
Also published as: CN112745390B

Abstract

本发明涉及一种包含NT‑proBNP抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对该结合蛋白进行制备、应用等方面的研究。所述结合蛋白活性强，与NT‑proBNP具有较高的亲和力，能够实现对NT‑proBNP的高效检测，从而为心力衰竭的早期诊断提供依据。

Description

一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的结合蛋白

技术领域

本发明涉及生物技术和医学技术领域，尤其是涉及一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的分离的结合蛋白及其应用。

背景技术

脑钠肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)，一种具有强有力的利尿、扩血管和降压作用的多肽类激素。BNP在心脏含量最高，由心室分泌，心肌细胞首先合成的是含有108个氨基酸的proBNP(BNP前体)，当心肌细胞受到刺激后，proBNP在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的氨基末端B型利钠肽原(NT-proBNP)和含有32个氨基酸、具有活性的B型利钠肽(BNP)，两者等摩尔分泌释放进入血循环。

目前认为，脑钠肽(BNP)和脑钠肽原N端肽(NT-proBNP)是判断心力衰竭的生物标志物，当心脏容量负荷增加或心脏功能受损时，氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)与BNP的指标浓度会异常升高。而NT-proBNP相对BNP生物稳定性较好，半衰期较长(120min)，浓度相对较稳定，有效检测时间长，血液中含量相对比BNP高约16～20倍，因此检测相对容易，并且血浆标本在体外的稳定性长(>48h)，因而NT-proBNP是诊断心力衰竭和评价心脏功能的最佳心肌标志物。

随着生活条件的提高和社会老龄化的加剧，心力衰竭病人数量逐年增加，心力衰竭的早期诊断是当今医疗保健面临的最关键的问题。在发现一些相关早期病症的时候，准确、灵敏、高效、稳定地测定血液中NT-proBNP的量，能给早期心功能不全、心衰、呼吸困难的心源性及非心源性心衰治疗及预后监测，急性冠状动脉综合征的分级等方面提供快速、准确的早期诊断依据。

目前用于检测NT-proBNP含量的方法主要有金标定性试验、荧光免疫法、酶联免疫吸附试验(ELISA)和磁微粒化学发光法(CMIA)，这些测量方法都需要使用与NT-proBNP特异性结合的蛋白。长期以来，杂交瘤技术生产的鼠单克隆抗体被广泛的应用于科研、临床诊断和治疗，但由于杂交瘤方式生产需采用小鼠腹腔诱生，受小鼠个体影响大，生产不稳定、批间差异大、含小鼠自身抗体纯化难度大，而本发明涉及的结合蛋白采用重组技术，可完全解决上述问题。目前常用的NT-proBNP结合蛋白存在活性差、亲和力低等问题，无法较好的应用于NT-proBNP的检测，因此本领域对于活性好、亲和力高的NT-proBNP结合蛋白具有强烈的需求。

鉴于上述技术问题，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对其进行制备、应用等方面的研究。

所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区，或与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性；

互补决定区CDR-VH1为G-Y-X1-F-T-X2-Y-Y-I-X3，其中，X1是F、V或T，X2是E或D，X3是Q、H或N；

互补决定区CDR-VH2为W-I-X1-P-E-X2-F-N-X3-E-Y-N-E-X4-F-K-G，其中，

X1是Q、H或N，X2是E或D，X3是I、V或L，X4是K或R；

互补决定区CDR-VH3为A-X1-D-X2-D-W-X3-G-D，其中，

X1是R或K，X2是P、A或G，X3是D或E；

互补决定区CDR-VL1为R-X1-S-Q-S-X2-X3-H-X4-N-G-N-T-Y-L-H，其中，

X1是S或T，X2是I或L，X3是L、V或I，X4是R或K；

互补决定区CDR-VL2为K-X1-S-X2-R-F-S，其中，

X1是I、V或L，X2是D或E；

互补决定区CDR-VL3为X1-Q-X2-T-H-X3-P-P-T，其中，

X1是T或S，X2是S或T，X2是I、V或L；

优选的，上述结合蛋白与NT-proBNP具有K_D≤1.26×10^-9mol/L的亲和力。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的NT-proBNP结合蛋白活性强，与人NT-proBNP具有很高的亲和力，且与市面上常见的NT-proBNP抗体相比，具有较优的亲和力，能够实现对NT-proBNP的高效检测，从而为心力衰竭和心血管疾病的早期诊断提供依据。并且，无需利用小鼠腹腔诱生杂交瘤细胞来生产该结合蛋白，生产难度小的同时抗体功能更加稳定。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1所提供的抗NT-proBNP抗体电泳图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。

为了本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。

术语“氨基酸”表示天然存在或非天然存在的羧基α-氨基酸。术语“氨基酸”用在本申请中可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(三字母密码：A1a，单字母密码：A)，精氨酸(Arg，R)，天冬酰胺(Asn，N)，天冬氨酸(Asp，D)，半胱氨酸(Cys，c)，谷氨酰胺(G1n，Q)，谷氨酸(G1u，E)，甘氨酸(G1y，G)，组氨酸(His，H)，异亮氨酸(I1e，I)，亮氨酸(Leu，L)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，苯丙氨酸(Phe，F)，脯氨酸(Pro，P)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，和缬氨酸(Va1，V)。非天然存在的氨基酸包括但不限于α-氨基己二酸，氨基丁酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，高亮氨酸，高精氨酸，羟基脯氨酸，正亮氨酸，吡啶基丙氨酸，肌氨酸等等。

术语“包括抗原结合结构域的分离的结合蛋白”、“分离的结合蛋白”、“结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体、抗体最小识别单位和抗体，以及这些抗体和片段的单链衍生物。“抗体”此用语包括多克隆抗体、单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

当在本文中使用时，“骨架”、“构架”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。

通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区由三个被称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。

当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。

本发明提供的一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的分离的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区，或与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性：

互补决定区CDR-VH1为G-Y-X1-F-T-X2-Y-Y-I-X3，其中，

X1是F、V或T，X2是E或D，X3是Q、H或N；

互补决定区CDR-VH2为W-I-X1-P-E-X2-F-N-X3-E-Y-N-E-X4-F-K-G，其中，

X1是Q、H或N，X2是E或D，X3是I、V或L，X4是K或R；

互补决定区CDR-VH3为A-X1-D-X2-D-W-X3-G-D，其中，

X1是R或K，X2是P、A或G，X3是D或E；

互补决定区CDR-VL1为R-X1-S-Q-S-X2-X3-H-X4-N-G-N-T-Y-L-H，其中，

X1是S或T，X2是I或L，X3是L、V或I，X4是R或K；

互补决定区CDR-VL2为K-X1-S-X2-R-F-S，其中，

X1是I、V或L，X2是D或E；

互补决定区CDR-VL3为X1-Q-X2-T-H-X3-P-P-T，其中，

X1是T或S，X2是S或T，X2是I、V或L。

本领域公知，据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。因此，本发明也包括该结合蛋白的“功能性衍生物”。“功能性衍生物”是指氨基酸替换的变体，一个功能性衍生物保留有可检测的结合蛋白活性，优选为能结合NT-proBNP的抗体的活性。“功能性衍生物”可以包含“变体”和“片段”，其具有与本发明中所述结合蛋白相类似的生物活性。

在一些实施方式中，所述抗原结合结构域与上述氨基酸序列的互补决定区具有至少85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性。

在一些实施方式中，所述结合蛋白与NT-proBNP具有K_D≤1.26×10^-9mol/L的亲和力，K_D值也可以选择1.05×10^-10mol/L、2×10^-10mol/L、3×10^-10mol/L、4×10^-10mol/L、5×10^-10mol/L、6×10^-10mol/L、7×10^-10mol/L、8×10^-10mol/L、9×10^-10mol/L、1.26×10^-9mol/L；或者1.05×10^-10mol/L≤K_D≤1.26×10^-9mol/L。

在一些实施方式中，

所述互补决定区CDR-VH1中，X2是D；

所述互补决定区CDR-VH2中，X4是K；

所述互补决定区CDR-VH3中，X1是R；

所述互补决定区CDR-VL1中，X1是S；

所述互补决定区CDR-VL2中，X2是D；

所述互补决定区CDR-VL3中，X1是S；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是F；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是V；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是T；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是Q；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是H；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是N；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是Q；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是H；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是N；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是E；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是D；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是I；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是V；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是L；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是P；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是A；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是G；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是E；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是D；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是I；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是L；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是L；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是V；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是I；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是K；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是R；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是I；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是V；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是L；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是S；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是T；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是I；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是V；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是L；

进一步地，在一些实施方式中，各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

在一些实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs。

在一些实施方式中，本申请所述结合蛋白可以包含3个CDRs、4个CDRs、5个CDRs、6个CDRs，可选的，所述CDRs可以是选自重链CDR区域和/或轻链CDR区域的任意组合。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。

在一些实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

在一些实施方式中，骨架区的种属来源可以为人，以构成人源化抗体。

在一些实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。

在一些实施方式中，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。

在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在一些实施方式中，所述恒定区来源于鼠。

在另一些实施方式中，本发明的恒定区可以来源于人，以构成人源化的抗体。

在一些实施方式中，所述

轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；

重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。

本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的结合蛋白。

其中，术语核酸包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。

本发明还提供了一种载体，所述载体包含上述的核酸分子。

其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是编码序列以允许编码序列的表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。

在本文中，载体可以指包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含影响指定靶细胞中表达的必要调节元件。

所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的编码使所述肽表达产物分泌或整合到膜上的信号肽的核酸序列，本发明的核酸片段，以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不被整合到宿主细胞基因组中。载体可以进一步携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述核酸分子或上述载体。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为真核细胞，进一步的为哺乳动物细胞；

在一些实施方式中，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仑鼠肾细胞或NS0小鼠骨髓瘤细胞。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

本发明的表达载体用于转化宿主细胞。这种转化细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的多肽的培养细胞或细胞系。本发明的转化细胞包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽抱杆菌等)。所述转化细胞能够复制本发明的核酸片段。当重组制备本发明的肽组合时，所述表达产物可以输出到培养基中或携带在所述转化细胞的表面。

本发明还提供了一种生产上述结合蛋白的方法，包括如下步骤：

在培养基中培养上述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的结合蛋白。

所述方法可以是例如，用编码至少一部分结合蛋白的核酸载体转染宿主细胞，在合适的条件下培养该宿主细胞使其表达该结合蛋白。宿主细胞也可以用一个或多个表达载体转染，该表达载体可以单独或结合地包含编码至少一部分结合蛋白的DNA。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离结合蛋白，所述技术包括硫酸铵沉淀，层析(如离子交换，凝胶过滤，亲合层析等)和/或电泳。

构建合适的含有目的编码和调控序列的载体可以使用本领域公知的标准连接和限制技术进行。将分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再连接。可以用任何方法向编码序列中引入突变以产生本发明的变体，这些突变可以包含缺失或插入或置换等。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测测试样品中的NT-proBNP的方法，其包括：

a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的NT-proBNP抗原与如上所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和

b)检测所述免疫复合物的存在。

在一些实施方案中，步骤a)所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合；

在一些实施方案中在步骤a)所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述NT-proBN抗原结合。

在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合NT-proBNP的不同抗原表位。

在一些实施方案中，所述结合蛋白可以标记有显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方案中，所述的第二抗体可以标记有显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂选自荧光标记、酶、金属离子、同位素或荧光微球。

在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。

在一些实施方式中，所述放射性同位素包括¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr中的任一种。

在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。

在一些实施方案中，本发明还提供了一种试剂或试剂盒，其包含上述结合蛋白。

在一些实施方案中，所述试剂或试剂盒还包含缓冲剂、稳定剂、稀释剂或载体中的一种或多种。

在一些实施方案中，本发明提供用于检测心力衰竭或心脏功能评价受试者中的NT-proBNP蛋白存在的试剂盒。

术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在一些实施方案中，生物样品包含细胞、组织或体液。

在一些实施方案中，本发明还提供了上述的结合蛋白在制备用于检测心力衰竭或评价心脏功能的产品中的应用.

下文提供了一些实例用于示例性说明本发明，而不是限制本发明的范围。

实施例1

1.表达质粒构建

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。分泌Anti-NT-proBNP 7A5单克隆抗体的杂交瘤细胞株为我司已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。

1.1、引物

扩增Heavy Chain和Light Chain 5’RACE引物：

SMARTER II A Oligonucleotide：

5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3’；

5'-RACE CDS Primer(5'-CDS)：5’>(T)₂₅VN<3(N＝A，C，G，orT；V＝A，G，orC)；

Universal Primer A Mix(UPM)：

5’>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；

Nested Universal Primer A(NUP)：5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；

mIg-kR：5’>ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATG<3’；

mIg-HR：5’>TTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAG<3’。

1.2抗体可变区基因克隆及测序

从分泌Anti-NT-proBNP 7A5单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取RNA，用SMARTERTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIg-kR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal PrimerA(NUP)和mIg-HR引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.75KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.43KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆4个克隆送Invitrogen公司进行测序。

1.3 Anti-NT-proBNP 7A5抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为339bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为351bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

1.4重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM 3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-NT-proBNP 7A5抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：

proBNP-7A5-HF:5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCC<3’；

proBNP-7A5-HR:5’>CCCGAATTCTCATTATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAG<3’；

proBNP-7A5-LF:5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGAGACAGACACAATCCTGCTATGGGTGC<3’；

proBNP-7A5-LR:5’>CCCGAATTCTCATTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGG<3’；

通过PCR扩增方法扩出0.73KB的Light Chain基因片段和1.43kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

2.筛选稳定细胞株

2.1重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

包被液稀释重组NT-proBNP抗原到1ug/ml，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100uL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。

(2)重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50ul、DNA 100ug/管、PuvⅠ酶10ul、无菌水补至500ul，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔，并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

3.生产重组抗体

3.1细胞扩培

保种的稳定细胞株复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

3.2摇瓶生产

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。

3.3重组抗体纯化

用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条为约28KD的轻链(序列如SEQ ID NO:11所示)，另一条为约50KD的重链(序列如SEQ ID NO:12所示)。

实施例2

2.1位点突变抗体

实施例1得到的抗体经分析具有序列如SEQ ID NO:11以及12所示的轻链和重链，其具备一定的结合NT-proBNP蛋白的能力，亲和力较好，为进一步筛选亲和力更好的抗体，申请人对该抗体的轻链CDR及重链CDR进行突变。

经分析，重链的互补决定区(WT)：

CDR-VH1为G-Y-F(X1)-F-T-E(X2)-Y-Y-I-Q(X3)；

CDR-VH2为W-I-Q(X1)-P-E-D(X2)-F-N-V(X3)-E-Y-N-E-R(X4)-F-K-G；

CDR-VH3为A-K(X1)-D-A(X2)-D-W-E(X3)-G-D；

轻链的互补决定区(WT)：

CDR-VL1为R-T(X1)-S-Q-S-I(X2)-L(X3)-H-R(X4)-N-G-N-T-Y-L-H；

CDR-VL2为K-V(X1)-S-E(X2)-R-F-S；

CDR-VL3为T(X1)-Q-T(X2)-T-H-V(X3)-P-P-T；

其中，X1、X2、X3、X4均为突变位点。

表1与抗体活性有关的突变位点

基于上述分析得到的WT的CDR序列，对表1中的相应位点进行上述突变。

2.2位点突变抗体活性检测

包被液稀释重组NT-proBNP抗原(菲鹏生物产品)到1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的重组NT-proBNP抗体，100uL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。部分结果如下：

表2抗体活性分析数据

样品浓度ng/ml	200	40	8	1.6	0.32	0
							WT	2.178	1.854	1.079	0.281	0.074	0.032
突变1	2.359	2.085	1.243	0.354	0.165	0.042
							突变2	2.137	1.837	0.989	0.306	0.074	0.046
突变3	2.079	1.779	0.833	0.291	0.097	0.047
							突变4	0.506	0.065	-	-	-	-
突变5	0.35	0.031	-	-	-	-
							突变6	0.28	0.027	-	-	-	-

从上表可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列筛选效价较好的突变位点，部分突变后的位点如表3所示，其相应结合蛋白的亲和力分析结果如表4所示。

表3与抗体亲和力有关的突变位点

2.3亲和力分析

利用AMC传感器，纯化出来的抗体用PBST稀释到10ug/ml，NT-proBNP抗原(菲鹏生物产品)用PBST进行梯度稀释：208.3nmol/ml、104.2nmol/ml、52.1nmol/ml、26nmol/ml、13nmol/ml、0nmol/ml；

运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。(K_D表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。)

表4亲和力分析数据

从表4可以看出，表3中列出的突变位点对抗体的亲和力影响不大。

为验证上述结果，以WT作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。

表5以WT为骨架进行的突变

表6亲和力分析数据

从表5和表6分析，在保证具有抗体活性的前提下，上述突变位点对应的突变序列都具有一定的亲和力。

2.4稳定性考核

将以上抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈明显下降越势，说明抗体稳定性好，下表为WT考核21天的酶免活性检测OD结果。

表7稳定性分析数据

样品浓度(ng/ml)	40	8	0
				4℃，21天样品	1.897	1.125	0.087
-80℃，21天样品	1.911	1.088	0.064
				37℃，21天样品	1.859	1.101	0.073

进一步地，将基于突变1的不同抗体进行活性分析，各组抗体的线性均可达99.6％以上，且CV值低于10％，不同温度保存的抗体活性未见统计学差异。这说明上述抗体均具有优秀的稳定性，且位点的突变对稳定性无影响。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的结合蛋白

<130> PA19031919

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg

20

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Gln Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Arg His Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Trp Ile Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Arg

1 5 10 15

Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

35 40 45

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

65 70 75 80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 10

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

145 150 155 160

Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg

165 170 175

Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

180 185 190

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

195 200 205

Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly

210 215 220

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

245 250 255

Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu

260 265 270

Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe

275 280 285

Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn

290 295 300

Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

305 310 315 320

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

325 330

<210> 11

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Leu His Arg

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Glu Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Thr Gln Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Gln

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

145 150 155 160

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

180 185 190

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

195 200 205

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 12

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Arg His Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Phe Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Tyr Ile Gln Trp Ile Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Gln Pro Glu Asp Phe Asn Val Glu Tyr Asn Glu Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Arg Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ala Asp Trp Glu Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp

180 185 190

Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser

245 250 255

Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp

260 265 270

Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln

275 280 285

Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser

290 295 300

Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro

340 345 350

Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met

355 360 365

Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn

370 375 380

Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn

405 410 415

Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu

420 425 430

His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

435 440 445

Claims

1.一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区，或与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性；

互补决定区CDR-VH2为W-I-X1-P-E-X2-F-N-X3-E-Y-N-E-X4-F-K-G，其中，X1是Q、H或N，X2是E或D，X3是I、V或L，X4是K或R；

互补决定区CDR-VH3为A-X1-D-X2-D-W-X3-G-D，其中，X1是R或K，X2是P、A或G，X3是D或E；

互补决定区CDR-VL1为R-X1-S-Q-S-X2-X3-H-X4-N-G-N-T-Y-L-H，其中，X1是S或T，X2是I或L，X3是L、V或I，X4是R或K；

互补决定区CDR-VL2为K-X1-S-X2-R-F-S，其中，X1是I、V或L，X2是D或E；

互补决定区CDR-VL3为X1-Q-X2-T-H-X3-P-P-T，其中，X1是T或S，X2是S或T，X2是I、V或L，

优选的：

所述互补决定区CDR-VH1中，X2是D；

所述互补决定区CDR-VH2中，X4是K；

所述互补决定区CDR-VH3中，X1是R；

所述互补决定区CDR-VL1中，X1是S；

所述互补决定区CDR-VL2中，X2是D；

所述互补决定区CDR-VL3中，X1是S；

优选地，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是F；

优选地，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是V；

优选地，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是T；

优选地，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是Q；

优选地，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是H；

优选地，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是N；

优选地，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是Q；

优选地，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是H；

优选地，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是N；

优选地，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是E；

优选地，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是D；

优选地，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是I；

优选地，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是V；

优选地，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是L；

优选地，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是P；

优选地，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是A；

优选地，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是G；

优选地，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是E；

优选地，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是D；

优选地，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是I；

优选地，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是L；

优选地，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是L；

优选地，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是V；

优选地，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是I；

优选地，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是K；

优选地，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是R；

优选地，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是I；

优选地，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是V；

优选地，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是L；

优选地，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是S；

优选地，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是T；

优选地，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是I；

优选地，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是V；

优选地，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是L；

进一步地，各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

优选的，所述结合蛋白与NT-proBNP具有K_D≤1.26×10^-9mol/L的亲和力。

2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs；

优选的，所述结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种；

优选的，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FRL2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FRH3及FR-H4。

3.根据权利要求1-2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列；

优选的，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列；

优选的，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人；

优选的，所述恒定区来源于鼠；

轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；

重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码权利要求1～3任一项所述的结合蛋白。

5.一种载体，其包含权利要求4所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的载体；

优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞；

更优选的，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仑鼠肾细胞或NS0小鼠骨髓瘤细胞。

7.一种生产权利要求1-3任一项所述结合蛋白的方法，其特征在于，包括制备权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的载体的步骤；

优选包括如下步骤：

在合适的培养条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。

8.一种试剂或试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所述的结合蛋白；

优选的，所述试剂或试剂盒还包含缓冲剂、稳定剂、稀释剂或载体中的一种或多种。

9.一种检测测试样品中的NT-proBNP的方法，其包括：

a)在合适的反应条件下，使所述测试样品中的NT-proBNP抗原与权利要求1-3任一项所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；

b)检测所述免疫复合物的存在。

优选的，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合；

优选的，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述NT-proBNP抗原结合。

10.如权利要求1-3任一项所述的结合蛋白在制备用于检测心力衰竭或评价心脏功能的产品中的应用。