CN111349160B - 一种抗人胃泌素释放肽前体的重组抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含胃泌素释放肽前体抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。所述结合蛋白活性强，与人胃泌素释放肽前体蛋白具有很高的亲和力，可广泛应用于胃泌素释放肽前体蛋白的检测领域。

Description

一种抗人胃泌素释放肽前体的重组抗体
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，具体而言，涉及一种抗人胃泌素释放肽前体的重组抗体。
背景技术
胃泌素释放肽(GRP)是一种胃肠激素，主要刺激胃的G细胞分泌胃泌素、参与平滑肌细胞的收缩、促进细胞间的相互作用。GRP最初从猪胃粘膜中分离，广泛分布于哺乳动物的神经系统、胃肠道和呼吸道，在成人中仅存在于神经组织和肺的神经内分泌细胞中，且水平较低。原发性肺癌，按其病理组织学分类，主要分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)两种类型。SCLC患者存在高水平GRP的表达和分泌，但是GRP的半衰期只有两分钟，稳定性差，临床检测比较困难。
Pro-GRP是胃泌素释放肽(GRP)的前体结构，是GRP基因编码的肽类产物。GRP基因编码148个氨基酸的前体肽(-23～125)，从氨基端到羧基端依次为信号肽(从-23～-1)、GRP序列(aa1～27)、酰胺化和胰蛋白酶切位点(aa28～30)、共同的延长肽(aa31～98)，以及依据RNA不同剪接结果所形成的可变羧基端区域。因此，Pro-GRP有3种变体，其氨基酸序列长度分别为115aa、118aa和125aa，分别称为亚型1、亚型2和亚型3。Pro-GRP能够在血浆中稳定存在，半衰期长(19-28d)，可以反映GRP水平和GRP的基因表达情况，是一种新的神经内分泌源肿瘤标志物，是目前小细胞内分泌癌早期诊断的首选敏感肿瘤标志物，在肺部肿瘤诊断中更为突出。胃泌素释放肽前体水平升高与SCLC具有高度特异性，诊断SCLC的灵敏度可达72.5％。
临床上用于检测Pro-GRP的方法有ELISA、化学发光免疫分析法(CLIA)、电化学发光法等。不同方法都有各自的优缺点，但是都需要针对于Pro-GRP的特异性单克隆抗体。
国内的相关临床研究多采用国外的检测试剂盒。国内的检测试剂盒所需的Pro-GRP的单克隆抗体基本自外国采购，或者采用杂交瘤技术制备，灵敏度、特异性上都存在缺陷。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明涉及一种新颖的包含胃泌素释放肽前体抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。
所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与胃泌素释放肽前体具有KD≤1.29×10-8mol/L的亲和力；
互补决定区CDR-VH1为G-F-T-X1-S-X2-F-X3-M-H，其中，
X1是F、V或T，X2是S或T，X3是P或G；
互补决定区CDR-VH2为I-G-S-X1-S-D-T-X2-Y-Y-A-D-T-X3-R-G，其中，
X1是I、V或L，X2是S或T，X3是I、V或L；
互补决定区CDR-VH3为A-R-S-X1-R-Y-W-F-X2-Y-X3-G，其中，
X1是E或D，X2是P、A或G，X3是W或F；
互补决定区CDR-VL1为A-S-X1-S-V-D-X2-D-G-D-X3-Y-M-N，其中，
X1是N、H或Q，X2是F、W或Y，X3是T或S；
互补决定区CDR-VL2为I-Y-A-X1-S-N-X2-E-X3-G，其中，
X1是P、G或A，X2是I、V或L，X3是T或S；
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-S-N-E-X2-P-W-T-X3-G，其中，
X1是Q或N，X2是E或D，X3是F或W。
一个重要优点在于，所述结合蛋白活性强，与人胃泌素释放肽前体具有很高的亲和力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中抗人胃泌素释放肽前体的单克隆抗体电泳图。
具体实施方式
本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。
在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。
名词定义
“包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。构架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，E.Kabat等，美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，(1983))和Chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。
当在本文中使用时，“构架”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。
本发明的示例性实施方案
本发明涉及一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与胃泌素释放肽前体具有KD≤1.29×10-8mol/L的亲和力；
互补决定区CDR-VH1为G-F-T-X1-S-X2-F-X3-M-H，其中，
X1是F、V或T，X2是S或T，X3是P或G；
互补决定区CDR-VH2为I-G-S-X1-S-D-T-X2-Y-Y-A-D-T-X3-R-G，其中，
X1是I、V或L，X2是S或T，X3是I、V或L；
互补决定区CDR-VH3为A-R-S-X1-R-Y-W-F-X2-Y-X3-G，其中，
X1是E或D，X2是P、A或G，X3是W或F；
互补决定区CDR-VL1为A-S-X1-S-V-D-X2-D-G-D-X3-Y-M-N，其中，
X1是N、H或Q，X2是F、W或Y，X3是T或S；
互补决定区CDR-VL2为I-Y-A-X1-S-N-X2-E-X3-G，其中，
X1是P、G或A，X2是I、V或L，X3是T或S；
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-S-N-E-X2-P-W-T-X3-G，其中，
X1是Q或N，X2是E或D，X3是F或W。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性且与胃泌素释放肽前体具有KD≤1.29×10-8mol/L，KD值也可以选择1×10- 9mol/L、2×10-9mol/L、3×10-9mol/L、4×10-9mol/L、4.5×10-9mol/L、5×10-9mol/L、6×10- 9mol/L、7×10-9mol/L、8×10-9mol/L、9×10-9mol/L、1×10-10mol/L、3×10-10mol/L、5×10- 10mol/L、7×10-10mol/L、9×10-10mol/L或1×10-8mol/L；
或者8.32×10-10mol/L≤KD≤1.29×10-8mol/L；
其中，亲和力按照本发明说明书中的方法测定。
在一些实施方式中：
所述互补决定区CDR-VH1中，X3是G；
所述互补决定区CDR-VH2中，X2是T；
所述互补决定区CDR-VH3中，X3是W；
所述互补决定区CDR-VL1中，X3是S；
所述互补决定区CDR-VL2中，X3是S；
所述互补决定区CDR-VL3中，X3是F。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是F。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是V。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是T。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是S。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是T。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是I。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是V。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是L。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是I。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是V。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是L。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X1是E。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X1是D。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是P。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是A。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是G。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是N。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L1中，X1是H。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L1中，X1是Q。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L1中，X2是F。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L1中，X2是W。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L1中，X2是Y。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X1是P。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L2中，X1是G。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L2中，X1是A。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是I。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L2中，X2是V。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L2中，X2是L。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Q。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L3中，X1是N。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是E。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L3中，X2是D。
在一些实施方式中，各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：
Figure BDA0001918456000000061
Figure BDA0001918456000000071
在一些实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs(例如3个轻链CDR或3个重链CDR)；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs。
在一些实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。
在一些实施方式中，所述结合蛋白为抗体的“功能片段”，例如纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。
scFv(sc＝单链)，双特异抗体(diabodies)。
本发明所述的“功能片段”特别地指对于胃泌素释放肽前体具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。
这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗体片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。
抗体片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。
在一些实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
需要说明的是，除本申请上述公开的氨基酸序列外，骨架区的种属来源可以为人，以构成人源化抗体。
在一些实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。
在一些实施方式中，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。
在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在一些实施方式中，所述恒定区来源于鼠；
轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；
重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码如上所述的结合蛋白。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种载体，其包含如上所述的核酸分子。
本发明进一步包含至少一种编码如上所述的核酸分子的核构建体，例如质粒，进一步为表达质粒，在本申请的一个实施例中会介绍该载体的构建方法。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种宿主细胞，其被如上所述的载体转化。
所述宿主细胞可以为真核细胞，比如哺乳动物细胞。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种生产如上所述的结合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。
根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的结合蛋白在制备用于诊断小细胞肺癌的诊断剂中的应用。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测测试样品中胃泌素释放肽前体的方法，其包括：
a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的胃泌素释放肽前体抗原与如上所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和
b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述胃泌素释放肽前体的存在。
在此实施方式中，所述结合蛋白可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。
在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合。
在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述胃泌素释放肽前体结合；
在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合胃泌素释放肽前体的不同抗原表位；
所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。
在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述胃泌素释放肽前体抗原结合；
在此实施方式中，所述结合蛋白作为所述第二抗体的抗原，所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。
在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。
在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。
在一些实施方式中，所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr中的任一种。
在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包括如上所述的结合蛋白。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种抗人胃泌素释放肽前体的重组抗体的示例性制备方法。
S1.构建表达质粒：
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司；
MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司；
BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Takara公司；
pMD-18T载体购自Takara公司；
质粒提取试剂盒购自天根公司；
引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成；
分泌Anti-GRP 5D4单克隆抗体为已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。
S11，引物的设计与合成：
扩增重链和轻链的5’RACE上游引物：
SMARTER II A Oligonucleotide：
5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3’；
5'-RACE CDS Primer(5'-CDS)：5’>(T)25VN<3’(N＝A,C,G,orT；V＝A,G,orC)；
Universal Primer A Mix(UPM):
5’>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；
Nested Universal Primer A(NUP):
5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；
mIg-kR：5’>ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATG<3’；
mIg-HR：5’>TTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAG<3’。
S12，抗体可变区基因克隆及测序：
从分泌Anti-GRP 5D4单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，用SMARTERTMRACEcDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。LightChain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mkR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal PrimerA(NUP)和mHR引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.7KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.4KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆各4个克隆送Invitrogen公司进行测序。
S13，Anti-GRP 5D4抗体可变区基因的序列分析：
将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为393bp，属于VkII基因家族，其前方有60bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为408bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
S14，重组抗体表达质粒的构建：
pcDNATM3.4
Figure BDA0001918456000000111
vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-GRP 5D4抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：
GRP-5D4-HF：5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCC<3’；
GRP-5D4-HR:5’>CCCGAATTCTCATTATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAG<3’；
GRP-5D4-LF:5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGAGACAGACACAATCCTGCTATGGGTGC<3’；
GRP-5D4-LR:5’>CCCGAATTCTCATTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGG<3’；
通过PCR扩增方法扩出0.7KB的Light Chain基因片段和1.4KB的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
S2.稳定细胞株筛选
S21重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
包被液稀释PK2-GRP(171202)到指定浓度，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100uL/孔，37℃,30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对GRP蛋白有活性。
S22重组抗体表达质粒线性化
准备下述试剂：Buffer 50ul、DNA 100ug/管、PuvⅠ酶10ul、无菌水补至500ul，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
S23重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×106cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。
S3.重组抗体生产
S31细胞扩培
细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
S32摇瓶生产及纯化
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。
实施例2
抗体亲和力分析及活性鉴定
实施例1中得到的抗体经分析具有序列如SEQ ID NO:11所示的轻链以及12所示的重链。
经分析，重链的互补决定区(WT)：
CDR-VH1为G-F-T-T(X1)-S-S(X2)-F-P(X3)-M-H；
CDR-VH2为I-G-S-I(X1)-S-D-T-S(X2)-Y-Y-A-D-T-I(X3)-R-G；
CDR-VH3为A-R-S-E(X1)-R-Y-W-F-P(X2)-Y-F(X3)-G；
轻链的互补决定区：
CDR-VL1为A-S-N(X1)-S-V-D-F(X2)-D-G-D-T(X3)-Y-M-N；
CDR-VL2为I-Y-A-P(X1)-S-N-I(X2)-E-T(X3)-G；
CDR-VL3为Q-Q(X1)-S-N-E-E(X2)-P-W-T-W(X3)-G；
其中，X1、X2、X3均为待突变位点。
表1与抗体活性有关的突变位点
Figure BDA0001918456000000141
发明人将WT中的CDR位点进行上述突变，以获得活性更好的抗体。
包被液稀释PK2-GRP(171202)到1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的GRP单克隆抗体，100uL/孔，37℃,30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。
表2抗体活性分析数据
Figure BDA0001918456000000142
Figure BDA0001918456000000151
从上表可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列筛选效价较好的突变位点(保证筛选得到的抗体活性与突变1相近，抗体活性±10％)，部分结果如下。
表3与抗体亲和力有关的突变位点
Figure BDA0001918456000000152
Figure BDA0001918456000000161
Figure BDA0001918456000000171
Figure BDA0001918456000000181
亲和力分析
以活性鉴定相同方式酶免间接法做数据，包被做四个梯度1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml；抗体从1000ng/ml开始2倍梯度稀释至0.977ng/ml上样。得出不用包被浓度下不同抗体浓度对应的OD值。在同一包被浓度下，以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标，对数作图，根据拟合方程计算出50％最大OD值时的抗体浓度；带入公式：K＝(n-1)/(2×(n×Ab`-Ab))计算出亲和力常数的倒数，其中Ab和Ab`分别表示对应包被浓度(Ag、Ag`)下50％最大OD值时的抗体浓度，n＝Ag/Ag`；每两个包被浓度可以组合计算出一个K值，最后可得六个K值，取其平均数值，再求其倒数则为亲和力常数KD。
表4亲和力分析数据
Figure BDA0001918456000000182
Figure BDA0001918456000000191
Figure BDA0001918456000000201
从表4可以看出，表3中列出的突变位点对抗体的亲和力影响不大。
为验证上述结果，以WT作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。
表5以WT为骨架进行的突变
Figure BDA0001918456000000202
表6亲和力分析数据
K<sub>D</sub>(M) K<sub>D</sub>(M)
WT 5.77E-09 WT 1-5 4.04E-09
WT 1-1 6.31E-09 WT 1-6 7.75E-09
WT 1-2 9.51E-09 WT 1-7 3.76E-09
WT 1-3 1.29E-08 WT 1-8 3.58E-09
WT 1-4 2.96E-09 WT 1-9 5.88E-09
从表5和表6分析，在保证具有抗体活性的前提下，上述突变位点与其他位点的关联也不大。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市朋志生物科技有限公司
<120> 一种抗人胃泌素释放肽前体的重组抗体
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys
20
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
1 5 10 15
Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
1 5
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln
1 5 10 15
Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
1 5
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 9
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 10
<211> 331
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys
1 5 10 15
Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly
20 25 30
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser
35 40 45
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr
50 55 60
Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser
65 70 75 80
Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys
100 105 110
Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115 120 125
Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr
130 135 140
Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser
145 150 155 160
Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His
165 170 175
Arg Glu Asp Tyr Asn Asn Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile
180 185 190
Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn
195 200 205
Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys
210 215 220
Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu
225 230 235 240
Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe
245 250 255
Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu
260 265 270
Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
275 280 285
Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg
290 295 300
Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His
305 310 315 320
Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 11
<211> 218
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 11
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asn Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Ile Glu Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Glu Pro Trp Thr Trp Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 12
<211> 447
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Thr Ser Ser Phe
20 25 30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Gly Ser Ile Ser Asp Thr Ser Tyr Tyr Ala Asp Thr Ile
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Arg Tyr Trp Phe Pro Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
245 250 255
Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
260 265 270
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
275 280 285
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Asn Thr Leu Arg Val Val Ser
290 295 300
Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
340 345 350
Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met
355 360 365
Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn
370 375 380
Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn
405 410 415
Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
420 425 430
His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
435 440 445

Claims (24)

1.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原为胃泌素释放肽前体，其中所述抗原结合结构域包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3；与胃泌素释放肽前体具有KD≤1.29×10-8mol/L的亲和力；
互补决定区CDR-VH1为G-F-T-X1-S-X2-F-X3-M-H，其中，
X1是F、V或T，X2是S或T，X3是P或G；
互补决定区CDR-VH2为I-G-S-X1-S-D-T-X2-Y-Y-A-D-T-X3-R-G，其中，
X1是I、V或L，X2是S或T，X3是I、V或L；
互补决定区CDR-VH3为A-R-S-X1-R-Y-W-F-X2-Y-X3-G，其中，
X1是E或D，X2是P、A或G，X3是W或F；
互补决定区CDR-VL1为A-S-X1-S-V-D-X2-D-G-D-X3-Y-M-N，其中，
X1是N、H或Q，X2是F、W或Y，X3是T或S；
互补决定区CDR-VL2为I-Y-A-X1-S-N-X2-E-X3-G，其中，
X1是P、G或A，X2是I、V或L，X3是T或S；
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-S-N-E-X2-P-W-T-X3-G，其中，
X1是Q或N，X2是E或D，X3是F或W。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其特征在于，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是G；
所述互补决定区CDR-VH2中，X2是T；
所述互补决定区CDR-VH3中，X3是W；
所述互补决定区CDR-VL1中，X3是S；
所述互补决定区CDR-VL2中，X3是S；
所述互补决定区CDR-VL3中，X3是F。
3.如权利要求1所述的结合蛋白，其特征在于，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是P；
所述互补决定区CDR-VH2中，X2是S；
所述互补决定区CDR-VH3中，X3是F；
所述互补决定区CDR-VL1中，X3是T；
所述互补决定区CDR-VL2中，X3是T；
所述互补决定区CDR-VL3中，X3是W。
4.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原为胃泌素释放肽前体，其中所述抗原结合结构域包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3；
互补决定区CDR-VH1为G-F-T-X1-S-X2-F-X3-M-H，其中，X3是G；
互补决定区CDR-VH2为I-G-S-X1-S-D-T-X2-Y-Y-A-D-T-X3-R-G，其中，X2是T；
互补决定区CDR-VH3为A-R-S-X1-R-Y-W-F-X2-Y-X3-G，其中，X3是W；
互补决定区CDR-VL1为A-S-X1-S-V-D-X2-D-G-D-X3-Y-M-N，其中，X3是S；
互补决定区CDR-VL2为I-Y-A-X1-S-N-X2-E-X3-G，其中，X3是S；
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-S-N-E-X2-P-W-T-X3-G，其中，X3是F；
各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：
位点 CDR-VH1X1/X2 CDR-VH2X1/X3 CDR-VH3X1/X2 CDR-VL1X1/X2 CDR-VL2X1/X2 CDR-VL3X1/X2 突变组合1 T/S I/I E/P N/F P/I Q/E 突变组合2 T/T I/L D/P N/W P/V Q/D 突变组合3 F/S I/V E/A N/Y P/L N/E 突变组合4 F/T L/I D/A H/F G/I N/D 突变组合5 V/S L/L E/G H/W G/V N/D 突变组合6 V/T L/V D/G H/Y G/L N/E 突变组合7 T/S V/I D/G Q/F A/I Q/D 突变组合8 T/T V/L E/G Q/W A/V Q/E 突变组合9 F/S V/V D/A Q/Y A/L Q/D 突变组合10 F/T I/I E/A N/F G/L N/D 突变组合11 V/S I/L D/P H/W G/V N/E 突变组合12 V/T I/V E/P Q/Y G/I Q/E 突变组合13 T/S L/I E/P N/W A/L Q/E 突变组合14 T/T L/L D/P H/F A/V Q/D 突变组合15 F/S L/V E/A Q/W A/I N/E 突变组合16 F/T V/I D/A N/Y P/L N/D 突变组合17 V/S V/L E/G H/Y P/V N/D 突变组合18 V/T V/V D/G Q/F P/I N/E 突变组合19 F/S I/I D/G N/F P/V Q/D 突变组合20 F/T V/I E/G N/W G/V Q/E 突变组合21 V/S L/I D/A H/F A/V Q/D 突变组合22 V/T I/V E/A H/W P/L N/D 突变组合23 T/S V/V D/P Q/F G/L N/E 突变组合24 T/T L/V E/P Q/W A/L Q/E 突变组合25 F/S I/L E/P N/Y P/I Q/E 突变组合26 F/T V/L D/P H/Y A/I Q/D 突变组合27 V/S L/L E/A Q/Y A/I N/E 突变组合28 V/T I/I D/A N/F P/I N/D 突变组合29 T/S V/I E/G N/W P/V N/D 突变组合30 T/T L/I D/G N/Y P/L N/E 突变组合31 F/S I/V D/G H/F G/I Q/D 突变组合32 F/T V/V E/G H/W G/V Q/E 突变组合33 V/S L/V D/A H/Y G/L Q/D 突变组合34 V/T I/L E/A Q/F A/I N/D 突变组合35 T/S V/L D/P Q/W A/V N/E 突变组合36 T/T L/L E/P Q/Y A/L Q/E 突变组合37 V/S I/L E/P N/F G/L Q/E 突变组合38 V/T I/V D/P H/W G/V Q/D 突变组合39 T/S I/I E/A Q/Y G/I N/E 突变组合40 T/T V/L D/A N/W A/L N/D 突变组合41 F/S V/V E/G H/F A/V N/D 突变组合42 F/T V/I D/G Q/W A/I N/E 突变组合43 V/S L/L D/G N/Y P/L Q/D 突变组合44 V/T L/V E/G H/Y P/V Q/E 突变组合45 T/S L/I D/A Q/F P/I Q/D 突变组合46 T/T I/L E/A N/F P/V N/D 突变组合47 F/S I/V D/P N/W G/V N/E 突变组合48 F/T I/I E/P H/F A/V Q/E 突变组合49 V/S V/L E/P H/W P/L Q/E 突变组合50 V/T V/V D/P Q/F G/L Q/D 突变组合51 T/S V/I E/A Q/W A/L N/E 突变组合52 T/T L/L D/A N/Y P/I N/D 突变组合53 F/S L/V E/G H/Y A/I N/D 突变组合54 F/T L/I D/G Q/Y A/I N/E 突变组合55 V/S I/I D/G N/F P/I Q/D 突变组合56 V/T I/L E/G N/W P/V Q/E 突变组合57 T/S I/V D/A N/Y P/L Q/D 突变组合58 T/T L/I E/A H/F G/I N/D
。
5.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原为胃泌素释放肽前体，其中所述抗原结合结构域包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3；
互补决定区CDR-VH1为G-F-T-X1-S-X2-F-X3-M-H，其中，X3是P；
互补决定区CDR-VH2为I-G-S-X1-S-D-T-X2-Y-Y-A-D-T-X3-R-G，其中，X2是S；
互补决定区CDR-VH3为A-R-S-X1-R-Y-W-F-X2-Y-X3-G，其中，X3是F；
互补决定区CDR-VL1为A-S-X1-S-V-D-X2-D-G-D-X3-Y-M-N，其中，X3是T；
互补决定区CDR-VL2为I-Y-A-X1-S-N-X2-E-X3-G，其中，X3是T；
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-S-N-E-X2-P-W-T-X3-G，其中，X3是W；
各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：
位点 CDR-VH1X1/X2 CDR-VH2X1/X3 CDR-VH3X1/X2 CDR-VL1X1/X2 CDR-VL2X1/X2 CDR-VL3X1/X2 WT F/S I/I E/P N/F P/I Q/E WT 1-1 T/S V/V D/A H/W G/V N/D WT 1-2 V/S V/L E/A H/W G/V N/E WT 1-3 F/T V/I D/P H/Y P/V N/D WT 1-4 V/T V/L V/I H/W P/L N/D WT 1-5 T/T V/V V/L Q/W A/L Q/E WT 1-6 T/S V/V V/V H/W G/V Q/E WT 1-7 F/T L/V V/I Q/W A/V N/E WT 1-8 V/T I/V V/L N/W A/L N/D WT 1-9 T/T L/I I/V Q/F P/I Q/D
。
6.如权利要求1~5任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和双特异抗体中的一种。
7.根据权利要求1~5任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
8.如权利要求1~5任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。
9.根据权利要求8所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。
10.根据权利要求9所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
11.根据权利要求10所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为乳牛。
12.根据权利要求10所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为火鸡或斗鸡。
13.根据权利要求10所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区来源于小鼠。
14.根据权利要求13所述的结合蛋白，其特征在于，轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；
重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
15.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码权利要求1~14任一项所述的结合蛋白。
16.一种载体，其包含权利要求15所述的核酸分子。
17.一种宿主细胞，其被权利要求16所述的载体转化。
18.一种生产权利要求1~14任一项所述的结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
在培养基中和合适的培养条件下培养权利要求17所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。
19.权利要求1~14任一项所述的结合蛋白在制备用于诊断小细胞肺癌的诊断剂中的应用。
20.如权利要求1~14任一项所述的结合蛋白在制备检测测试样品中的胃泌素释放肽前体的试剂盒中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于：
a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的胃泌素释放肽前体抗原与权利要求1~14任一项所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和
b)检测所述免疫复合物的存在，所述免疫复合物的存在指示所述测试样品中所述胃泌素释放肽前体的存在。
22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，在步骤a）中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合。
23.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，在步骤a）中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述胃泌素释放肽前体结合。
24.一种检测胃泌素释放肽前体的试剂盒，其包括权利要求1~14任一项所述的结合蛋白。
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