CN111349166B

CN111349166B - 一种抗人ca72-4糖蛋白的重组抗体

Info

Publication number: CN111349166B
Application number: CN201811565373.8A
Authority: CN
Inventors: 崔鹏; 何志强; 孟媛; 钟冬梅; 娄文娟; 梁碧; 游辉; 马秋燕; 李蔚芝
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN111349166A

Abstract

本发明涉及一种抗人CA72‑4糖蛋白的重组抗体，该抗体为包含CA72‑4糖蛋白抗原结合结构域的分离的结合蛋白，本发明还对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。所述结合蛋白活性强，与人CA72‑4糖蛋白蛋白具有很高的亲和力，可广泛应用于CA72‑4糖蛋白蛋白的检测领域。

Description

一种抗人CA72-4糖蛋白的重组抗体

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，具体而言，涉及一种抗人CA72-4糖蛋白的重组抗体。

背景技术

CA72-4是一种高分子量的糖蛋白抗原，相对分子量220-400KD，属Lewis血型抗原。其结构中有双抗原决定簇，识别癌细胞上不同的抗原决定簇的两种单株抗体B72-3及CC49。CA72-4在多种腺癌的组织、器官中可见，表达于乳腺、结肠、胰腺、胃、肺和卵巢癌组织，但不存在于良性肿瘤、渗出物或正常组织中，血清正常值小于6U/mL。

CA72-4是一种血清肿瘤标志物。血清肿瘤标志物是肿瘤细胞在发生和增殖过程中产生的某些生化物质，主要包括蛋白质、糖类、酶类等肿瘤标志，可存在于肿瘤细胞内或释放入患者体液中。通过对患者体液肿瘤标志的分析，可在一定程度上反映肿瘤的存在与否。研究证明，胃癌患者中CA72-4的血清浓度会有不同程度的升高，这是其作为肿瘤标志物的基础。

CA72-4对胃癌具有较高的敏感性。据报道，血清CA72-4在胃癌中的阳性率为36％-94％，其特异性也较高，部分甚至达到了100％。近年来，血清中肿瘤标志物CA19-9、癌胚抗原(CEA)、CA242及CA72-4作为恶性肿瘤基因表达的产物，可存在于患者的体液、血液和细胞中，对其采用生物学或免疫学方法进行鉴别是诊断胃癌的重要指标。

CA72-4表达水平与肿瘤的大小、分期以及转移有关，是判断胃癌病理分期的可靠肿瘤标记物。CA72-4对于病情的预后具有提示意义，胃癌患者术前血清CA72-4表达水平升高与患者死亡风险升高成正相关，术后表达水平可迅速下降至正常。CA72-4对患者化疗的检测也具有重要意义，CA72-4水平下降超过70％提示化疗出现病理反应。此外，CA72-4是一种广谱肿瘤标志物，在其他胃肠道肿瘤、乳腺癌、肝癌、卵巢癌中也呈现不同的检出率。

胃癌相关性肿瘤标志物包括CA72-4、CA19-9、CEA及胃蛋白酶原(PG)等。研究表明，早期胃癌患者的胃癌相关性肿瘤标志物CA72-4、CA19-9、CEA的单项检测具有较高的灵敏度和特异性。而胃癌相关性肿瘤标志物进行联合检测时，可具有互补的作用，可明显提高胃癌检出率。据报道，血清中肿瘤标志物CA72-4、CA19-9、CEA进行联合检测时，其灵敏度和特异性均高于单项检测。

临床上用于检测水平CA72-4的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)，化学发光法，流式荧光发光法、胶体金等，不同方法都有各自的优缺点，但是都需要针对于CA72-4的特异性单克隆抗体。

目前国内用于检测CA72-4的单克隆抗体基本自外国采购，灵敏度、特异性上都存在缺陷，

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种新颖的包含CA72-4糖蛋白抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。

其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与CA72-4糖蛋白具有K_D≤1.97×10^-8mol/L的亲和力；

互补决定区CDR-VH1为G-X1-T-F-X2-D-X3-A-I-H，其中，

X1是F或Y，X2是S、Y或T，X3是N、H或Q；

互补决定区CDR-VH2为Y-F-X1-P-G-X2-D-D-F-K-X3-N-E-R，其中，

X1是S或T，X2是Q、GG或N，X3是S、Y或T；

互补决定区CDR-VH3为T-R-S-X1-N-X2-A-Y-X3-G，其中，

X1是I、V或L，X2是F、M或N，X3是F或W；

互补决定区CDR-VL1为Q-S-X1-Y-S-G-X2-Q-K-N-Y-X3-A，其中，

X1是IL、LL、II或LI，X2是N或Q，X3是I或L；

互补决定区CDR-VL2为W-A-S-X1-R-X2-S，其中，

X1是P、A或G，X2是D或E；

互补决定区CDR-VL3为Q-Q-Y-X1-S-Y-P-X2-T-X3-G，其中，

X1是S、Y或F，X2是L或I，X3是W或F。

一个重要优点在于，所述结合蛋白活性强，与人CA72-4糖蛋白具有很高的亲和力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中抗人CA72-4糖蛋白的单克隆抗体电泳图。

具体实施方式

本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。

在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。

名词定义

“包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。构架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，E.Kabat等，美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，(1983))和Chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。

当在本文中使用时，“构架”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。

通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。

本发明的示例性实施方案

本发明涉及一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与CA72-4糖蛋白具有K_D≤3.66×10^-8mol/L的亲和力；

互补决定区CDR-VH1为G-X1-T-F-X2-D-X3-A-I-H，其中，

X1是F或Y，X2是S、Y或T，X3是N、H或Q；

互补决定区CDR-VH2为Y-F-X1-P-G-X2-D-D-F-K-X3-N-E-R，其中，

X1是S或T，X2是Q、GG或N，X3是S、Y或T；

互补决定区CDR-VH3为T-R-S-X1-N-X2-A-Y-X3-G，其中，

X1是I、V或L，X2是F、M或N，X3是F或W；

互补决定区CDR-VL1为Q-S-X1-Y-S-G-X2-Q-K-N-Y-X3-A，其中，

X1是IL、LL、II或LI，X2是N或Q，X3是I或L；

互补决定区CDR-VL2为W-A-S-X1-R-X2-S，其中，

X1是P、A或G，X2是D或E；

互补决定区CDR-VL3为Q-Q-Y-X1-S-Y-P-X2-T-X3-G，其中，

X1是S、Y或F，X2是L或I，X3是W或F。

在一些实施方式中，所述抗原结合结构域与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性且与CA72-4糖蛋白具有K_D≤1.97×10^-8mol/L，K_D值也可以选择1×10^-9mol/L、2×10^-9mol/L、3×10^-9mol/L、4×10^-9mol/L、4.5×10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、6×10^-9mol/L、7×10^-9mol/L、8×10^-9mol/L、9×10^-9mol/L、1×10^-10mol/L、3×10^-10mol/L、5×10^-10mol/L、7×10^-10mol/L、9×10^-10mol/L或1×10^-8mol/L；

或者9.15×10^-10mol/L≤K_D≤1.97×10^-8mol/L；

其中，亲和力按照本发明说明书中的方法测定。

在一些实施方式中：

所述互补决定区CDR-VH1中，X1是Y；

所述互补决定区CDR-VH2中，X1是S；

所述互补决定区CDR-VH3中，X3是W；

所述互补决定区CDR-VL1中，X3是L；

所述互补决定区CDR-VL2中，X2是E；

所述互补决定区CDR-VL3中，X3是F。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是S。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是Y。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是T。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是N。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是H。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是Q。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是Q。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是GG。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是N。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是S。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是Y。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是T。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X1是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X1是V。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X1是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是F。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是M。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是N。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是IL。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是LL。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是II。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是LI。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是N。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-V L1中，X2是Q。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X1是P。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X1是A。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X1是G。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是S。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Y。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是F。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是I。

在一些实施方式中，各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

在一些实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs(例如3个轻链CDR或3个重链CDR)；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为抗体的“功能片段”，例如纳米抗体、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。

scFv(sc＝单链)，双特异抗体(diabodies)。

本发明所述的“功能片段”特别地指对于CA72-4糖蛋白具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。

这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗体片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。

抗体片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。

在一些实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

需要说明的是，除本申请上述公开的氨基酸序列外，骨架区的种属来源可以为人，以构成人源化抗体。

在一些实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。

在一些实施方式中，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。

在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在一些实施方式中，所述恒定区来源于鼠；

轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；

重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码如上所述的结合蛋白。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种载体，其包含如上所述的核酸分子。

本发明进一步包含至少一种编码如上所述的核酸分子的核构建体，例如质粒，进一步为表达质粒，在本申请的一个实施例中会介绍该载体的构建方法。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种宿主细胞，其被如上所述的载体转化。

所述宿主细胞可以为真核细胞，比如哺乳动物细胞。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种生产如上所述的结合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的结合蛋白在制备用于诊断癌症的诊断剂中的应用。

在一些实施方式中，所述癌症包括急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓源性白血病、胆管癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓源性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和尿路膀胱癌。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测测试样品中CA72-4糖蛋白的方法，其包括：

a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的CA72-4糖蛋白抗原与如上所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和

b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述CA72-4糖蛋白的存在。

在此实施方式中，所述结合蛋白可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述CA72-4糖蛋白结合；

在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合CA72-4糖蛋白的不同抗原表位；

所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述CA72-4糖蛋白抗原结合；

在此实施方式中，所述结合蛋白作为所述第二抗体的抗原，所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。

在一些实施方式中，所述放射性同位素包括¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr中的任一种。

在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包括如上所述的结合蛋白。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种抗人CA72-4糖蛋白的重组抗体的示例性制备方法。

S1.构建表达质粒：

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司；

MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司；

BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Takara公司；

pMD-18T载体购自Takara公司；

质粒提取试剂盒购自天根公司；

引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成；

分泌Anti-CA72-4 1G18单克隆抗体为已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。

S11，引物的设计与合成：

扩增重链和轻链的5’RACE上游引物：

SMARTER II A Oligonucleotide：

5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3’；

5'-RACE CDS Primer(5'-CDS)：5’>(T)₂₅VN<3’(N＝A,C,G,orT；V＝A,G,orC)；

Universal Primer A Mix(UPM):

5’>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；

Nested Universal Primer A(NUP):

5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；

mIgG CKR：5’>CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT<3’；

mIgG CHR：5’>TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC<3’。

S12，抗体可变区基因克隆及测序：

从分泌Anti-CA72-4 1G18单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，用SMARTERTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CKR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested UniversalPrimer A(NUP)和mIgG CHR引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.7KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.4KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆各4个克隆送Invitrogen公司进行测序。

S13，Anti-CA72-4 1G18抗体可变区基因的序列分析：

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为402bp，属于VkII基因家族，其前方有60bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为402bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

S14，重组抗体表达质粒的构建：

pcDNA^TM3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-CA72-41G18抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：

CA72-4 1G18-HF：

5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTC<3’；

CA72-4 1G18-HR:

5’>CCCGAATTCTCATTATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGCTCTTCTC<3’；

CA72-4 1G18-LF:

5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTA<3’；

CA72-4 1G18-LR:

5’>CCCGAATTCTCATTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAA<3’；

通过PCR扩增方法扩出0.7KB的Light Chain基因片段和1.4kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

S2.稳定细胞株筛选

S21重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

包被液稀释羊抗鼠IgG1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100uL/孔，37℃,60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120ul，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释100倍的CA724抗原(人腹水)，每孔100uL，37℃,40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记HRP的CA724单克隆抗体(1:4K)，每孔100uL，37℃,30min；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对CA72-4抗原都有活性。

S22重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50ul、DNA 100ug/管、PuvⅠ酶10ul、无菌水补至500ul，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

S23重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

S3.重组抗体生产

S31细胞扩培

胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

S32摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如图所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。

实施例2

抗体亲和力分析及活性鉴定

实施例1中得到的抗体经分析具有序列如SEQ ID NO:11所示的轻链以及12所示的重链。

经分析，重链的互补决定区(WT)：

CDR-VH1为G-F(X1)-T-F-S(X2)-D-N(X3)-A-I-H；

CDR-VH2为Y-F-T(X1)-P-G-Q(X2)-D-D-F-K-S(X3)-N-E-R；

CDR-VH3为T-R-S-I(X1)-N-F(X2)-A-Y-F(X3)-G；

轻链的互补决定区：

CDR-VL1为Q-S-IL(X1)-Y-S-G-N(X2)-Q-K-N-Y-I(X3)-A；

CDR-VL2为W-A-S-P(X1)-R-D(X2)-S；

CDR-VL3为Q-Q-Y-S(X1)-S-Y-P-L(X2)-T-W(X3)-G；

其中，X1、X2、X3均为待突变位点。

表1与抗体活性有关的突变位点

发明人将WT中的CDR位点进行上述突变，以获得活性更好的抗体。

包被液稀释羊抗鼠IgG1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的CA724单克隆抗体，100uL/孔，37℃,60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120ul，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释100倍的CA72-4抗原(人腹水)，每孔100uL，37℃,40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记HRP的CA724单克隆抗体(1:4K)，每孔100uL，37℃,30min；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。

表2抗体活性分析数据

样品浓度ng/ml	WT	突变1	突变2	突变3	突变4
						1000	1.872	2.105	1.987	1.975	1.925
333.33	1.653	1.998	1.903	1.920	1.864
						111.11	1.084	1.587	1.329	1.337	1.260
37.04	0.851	1.379	1.298	1.274	1.139
						12.35	0.431	0.502	0.512	0.478	0.452
0	0.023	0.025	0.065	0.051	0.031

从上表可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列筛选效价较好的突变位点(保证筛选得到的抗体活性与突变1相近，抗体活性±10％)，部分结果如下。

表3与抗体亲和力有关的突变位点

亲和力分析

利用AMC传感器，纯化出来的抗体用PBST稀释到10ug/ml，CA724人腹水(200U/ml)用PBST进行梯度稀释：200U/ml、100U/ml、50U/ml、25U/ml、12.5U/ml、6.25U/ml、3.13U/ml、0U/ml；

运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。(KD表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。计算时假定CA724人腹水标本1U/ML相当于2.5nmol/ML。)

表4亲和力分析数据

从表4可以看出，表3中列出的突变位点对抗体的亲和力影响不大。

为验证上述结果，以WT作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。

表5以WT为骨架进行的突变

表6亲和力分析数据

K<sub>D</sub>(M)

kon(1/Ms)

kdis(1/s)

K<sub>D</sub>(M)

kon(1/Ms)

kdis(1/s)

WT

4.08E-09

2.72E+04

1.11E-04

WT 1-5

6.03E-09

2.24E+04

1.35E-04

WT 1-1

3.09E-09

5.14E+04

1.59E-04

WT 1-6

7.84E-09

2.66E+04

2.09E-04

WT 1-2

1.97E-08

2.78E+04

5.48E-04

WT 1-7

3.48E-09

5.93E+04

2.06E-04

WT 1-3

4.08E-09

2.72E+04

1.11E-04

WT 1-8

3.57E-09

2.06E+04

7.35E-05

WT 1-4

3.23E-09

2.24E+04

7.24E-05

WT 1-9

1.19E-08

2.41E+04

2.87E-04

从表5和表6分析，在保证具有抗体活性的前提下，上述突变位点与其他位点的关联也不大。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 一种抗人CA72-4糖蛋白的重组抗体

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser

20 25

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Ser Ile Ser Ser Val Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Ala Gly Thr Lys Leu Val Leu Lys Arg

1 5

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Trp Val Lys Gln Asn Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 33

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

1 5 10 15

Tyr Val Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

20 25 30

Cys

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

35 40 45

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

65 70 75 80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 10

<211> 324

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 11

<211> 220

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Pro Arg Asp Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Val Leu

100 105 110

Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu

145 150 155 160

Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr

180 185 190

Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr

195 200 205

Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215 220

<210> 12

<211> 439

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Ala Ile His Trp Val Lys Gln Asn Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Phe Thr Pro Gly Gln Asp Asp Phe Lys Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Val Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Ile Asn Phe Ala Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser

145 150 155 160

Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu

165 170 175

Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser

180 185 190

Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys

210 215 220

Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp

260 265 270

Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe

305 310 315 320

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys

325 330 335

Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys

340 345 350

Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp

355 360 365

Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys

370 375 380

Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser

385 390 395 400

Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr

405 410 415

Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser

420 425 430

Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435

Claims

1.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原为CA72-4糖蛋白抗原，所述抗原结合结构域包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3；

互补决定区CDR-VH1为G-X1-T-F-X2-D-X3-A-I-H，其中，X1是Y；

互补决定区CDR-VH2为Y-F-X1-P-G-X2-D-D-F-K-X3-N-E-R，其中，X1是S；

互补决定区CDR-VH3为T-R-S-X1-N-X2-A-Y-X3-G，其中，X3是W；

互补决定区CDR-VL1为Q-S-X1-Y-S-G-X2-Q-K-N-Y-X3-A，其中，X3是L；

互补决定区CDR-VL2为W-A-S-X1-R-X2-S，其中，X2是E；

互补决定区CDR-VL3为Q-Q-Y-X1-S-Y-P-X2-T-X3-G，其中，X3是F；

各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

位点 CDR-VH1 X2/X3 CDR-VH2 X2/X3 CDR-VH3 X1/X2 CDR-VL1 X1/X2 CDR-VL2 X1 CDR-VL3 X1/X2 突变组合 1 S/N Q/S I/F IL/N P S/L 突变组合 2 S/ Q Q/Y I/ N IL/Q A S/I 突变组合 3 S/ H Q/T I/ M LL/N G Y/L 突变组合 4 T /N GG/S L /F LL/Q G Y/I 突变组合 5 T / Q GG/Y L / N II/N A F/L 突变组合 6 T / H GG/T L / M II/Q P F/I 突变组合 7 Y /N N/S V /F LI/N A F/I 突变组合 8 Y / Q N/Y V / N LI/Q G F/L 突变组合 9 Y / H N/T V / M IL/N P Y/I 突变组合 10 S/N N/Y I/F IL/Q A Y/L 突变组合 11 S/ Q GG/T I/ N LL/N P S/I 突变组合 12 S/ H GG/S I/ M LL/Q G S/L 突变组合 13 T /N Q/Y L /F II/N G F/L 突变组合 14 T / Q Q/S L / N II/Q P Y/L 突变组合 15 T / H Q/T L / M LI/N A S/L 突变组合 16 Y /N GG/Y V /F LI/Q P S/I 突变组合 17 Y / Q N/S V / N IL/N G Y/I 突变组合 18 Y / H N/T V / M IL/Q A F/I 突变组合 19 S/N Q/T I/F LL/N P Y/I 突变组合 20 S/ Q GG/S I/ N LL/Q A F/L 突变组合 21 S/ H GG/Y I/ M II/N G F/I 突变组合 22 T /N GG/T L /F II/Q G S/L 突变组合 23 T / Q N/S L / N LI/N A S/I 突变组合 24 T / H N/Y L / M LI/Q P Y/L 突变组合 25 Y /N N/T V /F IL/N A S/L 突变组合 26 Y / Q Q/S V / N IL/Q G S/I 突变组合 27 Y / H Q/Y V / M LL/N P Y/L 突变组合 28 S/N Q/S I/F LL/Q A Y/I 突变组合 29 S/ Q Q/Y I/ N II/N P F/L 突变组合 30 S/ H Q/T I/ M II/Q G F/I 突变组合 31 T /N GG/S L /F LI/N G F/I 突变组合 32 T / Q GG/Y L / N LI/Q P F/L 突变组合 33 T / H GG/T L / M IL/N A Y/I 突变组合 34 Y /N N/S V /F IL/Q P Y/L 突变组合 35 Y / Q N/Y V / N LL/N G S/I 突变组合 36 Y / H N/T V / M LL/Q A S/L 突变组合 37 S/N N/Y I/F II/N P F/L 突变组合 38 S/ Q GG/T I/ N II/Q A Y/L 突变组合 39 S/ H GG/S I/ M LI/N G S/L 突变组合 40 T /N Q/Y L /F LI/Q G S/I 突变组合 41 T / Q Q/S L / N IL/N A Y/I 突变组合 42 T / H Q/T L / M IL/Q P F/I 突变组合 43 Y /N GG/Y V /F LL/N A Y/I 突变组合 44 Y / Q N/S V / N LL/Q G F/L 突变组合 45 Y / H N/T V / M II/N P F/I 突变组合 46 S/N Q/T I/F II/Q A S/L 突变组合 47 S/ Q GG/S I/ N LI/N P S/I 突变组合 48 S/ H GG/Y I/ M LI/Q G Y/L 突变组合 49 T /N GG/T L /F IL/N G S/L 突变组合 50 T / Q N/S L / N IL/Q P S/I 突变组合 51 T / H N/Y L / M LL/N A Y/L 突变组合 52 Y /N N/T V /F LL/Q P Y/I 突变组合 53 Y / Q Q/S V / N II/N G F/L 突变组合 54 Y / H Q/Y V / M II/Q A F/I 突变组合 55 S/N GG/S I/F LI/N A F/I 突变组合 56 S/ Q Q/Y I/ N LI/Q P F/L

。

2.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原为CA72-4糖蛋白抗原，所述抗原结合结构域包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3；

互补决定区CDR-VH1为G-X1-T-F-X2-D-X3-A-I-H，其中，X1是F；

互补决定区CDR-VH2为Y-F-X1-P-G-X2-D-D-F-K-X3-N-E-R，其中，X1是T；

互补决定区CDR-VH3为T-R-S-X1-N-X2-A-Y-X3-G，其中，X3是F；

互补决定区CDR-VL1为Q-S-X1-Y-S-G-X2-Q-K-N-Y-X3-A，其中，X3是I；

互补决定区CDR-VL2为W-A-S-X1-R-X2-S，其中，X2是D；

互补决定区CDR-VL3为Q-Q-Y-X1-S-Y-P-X2-T-X3-G，其中，X3是W；

各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

位点 CDR-VH1 X2/X3 CDR-VH2 X2/X3 CDR-VH3 X1/X2 CDR-VL1 X1/X2 CDR-VL2 X1 CDR-VL3 X1/X2 WT S/N Q/S I/F IL/N P S/L WT 1-1 Y/N GG/S V/F LL/Q G Y/I WT 1-2 T/H N/Y L/M LI/Q G F/L WT 1-3 T/Q N/Y V/F IL/Q A Y/L WT 1-4 Y/N Q/T L/N LI/N A S/L WT 1-5 S/H Q/T V/F LL/N P Y/I WT 1-6 Y/Q N/S L/M LI/N A S/I WT 1-7 S/Q Q/T I/N II/Q G F/I WT 1-8 Y/H GG/Y V/M LI/Q P F/L WT 1-9 T/N N/Y L/N LL/N A Y/L

。

3.根据权利要求1~2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv和双特异抗体中的一种。

4.根据权利要求1~2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

5.根据权利要求1~2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。

6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD任何其中之一恒定区的序列。

7.根据权利要求5所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、或人。

8.根据权利要求7所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为乳牛。

9.根据权利要求7所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为火鸡或斗鸡。

10.根据权利要求7所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区来源于小鼠。

11.根据权利要求10所述的结合蛋白，其特征在于轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；

重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

12.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码权利要求1~11任一项所述的结合蛋白。

13.一种载体，其包含权利要求12所述的核酸分子。

14.一种宿主细胞，其被权利要求13所述的载体转化。

15.一种生产权利要求1~11任一项所述的结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

在培养基中和合适的培养条件下培养权利要求14所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。

16.权利要求1~11任一项所述的结合蛋白在制备用于CA72-4糖蛋白检测试剂中的应用。

17.如权利要求1~11任一项所述的结合蛋白在制备检测测试样品中的CA72-4糖蛋白的试剂盒中的应用，其包括：

a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的CA72-4糖蛋白抗原与权利要求1~11任一项所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，在步骤a）中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合。

19.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，在步骤a）中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述CA72-4糖蛋白结合。

20.一种试剂盒，其包括权利要求1~11任一项所述的结合蛋白。