TWI399541B - 檢測一胃癌預後程度的方法 - Google Patents

檢測一胃癌預後程度的方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI399541B
TWI399541B TW098117727A TW98117727A TWI399541B TW I399541 B TWI399541 B TW I399541B TW 098117727 A TW098117727 A TW 098117727A TW 98117727 A TW98117727 A TW 98117727A TW I399541 B TWI399541 B TW I399541B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
gastric cancer
content
tumor
patients
cells
Prior art date
Application number
TW098117727A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201042258A (en
Inventor
Hsueh Fen Juan
Chiung Nien Chen
Chien Wei Tseng
King Jen Chang
Original Assignee
Univ Nat Taiwan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Nat Taiwan filed Critical Univ Nat Taiwan
Priority to TW098117727A priority Critical patent/TWI399541B/zh
Priority to US12/612,904 priority patent/US20100304419A1/en
Publication of TW201042258A publication Critical patent/TW201042258A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI399541B publication Critical patent/TWI399541B/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

檢測一胃癌預後程度的方法
本發明係關於一種偵測預後程度的方法，特別是關於一種檢測一胃癌預後程度的方法。
根據世界衛生組織(WHO)估計，胃癌是全世界排名第四個最普遍被診斷的癌症，而且是所有癌症死亡率排名第二高，被視為國際間重要的健康危機。胃癌的分類可分為早期胃癌(early gastric cancer)及進行性胃癌(advanced gastric cancer)，臨床表現症狀則是模糊且不具特異性。在過去，約有80%罹患胃癌的病人常在診斷出胃癌時，已處於進行性胃癌的情況，且可能在手術後再度遭遇腫瘤復發的情況。過去研究發現，晚期與末期的病患之五年存活率不到35%。因此，胃癌早期偵測以延長病人的存活率是非常重要的。其中，血清學上的腫瘤標記(tumor marker)則是一種簡便、節省成本的檢測方法，非常適用於早期無徵狀患者的胃癌檢測方面。
目前來說，胃癌診斷上有一些腫瘤標記陸續被發現，例如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、CA19-9(carbohydrate antigen)、CA72-4(carbohydrate antigen 72-4)，但許多研究指出此些腫瘤標記對胃癌診斷上的敏感度(sensitivity)及專一性(specificity)都不高，往往造成診斷上的誤判及困難。因此，具有高敏感度及專一性的生物標記，對於加強胃癌病患的早期偵測及診斷都具有極大的價值。
14-3-3是一種酸性蛋白，大小約25-30kDa，主要存在於腦部和神經系統中，也在心、肝、腎、小腸和睾丸等組織中表達，也有少數存在於細胞膜、細胞核以及高爾基體、線粒體、葉綠體等細胞器中。在哺乳類動物中具有至少七種亞型，分別是β、γ、ε、σ、ζ、τ、η，而其中β及γ的磷酸型則分別被命名為α、δ亞型。14-3-3β的功能廣泛，包含代謝，細胞週期的控制，訊息傳導，細胞凋亡，蛋白運送，轉錄，壓力反應及惡性轉型等。目前已知它和超過兩百種的受質結合，涵蓋細胞內幾乎所有的反應。根據目前研究，雖然已知14-3-3β與數種疾病如阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、巴金森氏症(Parkinson’s disease)有關，但與人類癌症較為相關的主要僅有14-3-3σ，與乳癌、胃癌等各種上皮癌症(epithelial cancer)的發生有關。
然而，習知胃癌偵測之相關生物標記對胃癌診斷上的敏感度及專一性都不高，往往造成診斷上的誤判及困難。因此，極需一種具有高敏感度及專一性的生物標記，以應用於檢測胃癌病患的胃癌預後程度。
緣此，本發明之一目的即是提供一種檢測一胃癌預後程度的方法。
本發明之另一目的即是提供一種化合物抑制生物樣品表現14-3-3β之有效性的方法。
本發明之又一目的即是提供一種檢測套組，係包含一有效量之14-3-3β抗體，用於檢測胃癌有發展為腫瘤侵入或遠處轉移之危險性。
本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段係為利用14-3-3β蛋白質作為腫瘤標記以偵測胃癌的方法，其步驟包括：提供一生物樣品；檢測該生物樣品中14-3-3β含量；其中，該生物樣品中14-3-3β含量高於正常個體取得樣品之測定量，代表該胃癌之預後狀況不良。
本發明所採用之技術手段更包括一種檢測化合物抑制生物樣品表現14-3-3β之有效性的方法，其步驟包括：使一化合物與一表現14-3-3β之生物樣品接觸；檢測14-3-3β在該生物樣品的表現量；其中，當接觸後該生物樣品之14-3-3β表現量低於未接觸前的表現量，則顯示該化合物對於抑制生物樣品表現14-3-3β是有效。
另外，基於上述方法可發展出一種檢測套組，包含一有效量之14-3-3β抗體，用於檢測胃癌有發展為腫瘤侵入或遠處轉移之危險性。
經由本發明所採用之技術手段，證實了14-3-3β不僅是與胃癌相關的一個重要腫瘤基因，在胃癌診斷上相較於CEA(敏感度=33%)，14-3-3β具有更高的敏感度(敏感度=83%)，且14-3-3β在預後存活率分析上也具有較佳的準確性，故14-3-3β比CEA更適於作為胃癌診斷上的工具。同時，以14-3-3β作為血清學上的腫瘤標記，具有簡便、節省成本的優點，也適用於早期無徵狀患者的胃癌檢測，以及手術後之預後情況分析。
本發明所檢測抑制14-3-3β的化合物，可以用數種已熟知的組合資料庫方法獲得。這些資料庫包含胜肽、類胜肽(peptoid)肽模擬物(peptidomimetics)、核酸，對14-3-3β表現具抑制效果之小分子或其他藥物。當在活體外實行本發明之方法，胃癌細胞可衍生自胃癌細胞系。適合的胃癌細胞系之實例包括AGS細胞株、KATO III細胞株、TSGH細胞株、SC-M1細胞株、及N87細胞株。個體體內之14-3-3β表現量可在活體內或活體外測定，例如，14-3-3β量可在體外藉得自個體之生物樣本而測定，如投藥化合物前及後之腫瘤固體組織樣本、排泄物、血液或消化液。測定個體中14-3-3β表現量之其它方法係描述於此中。化合物治療胃癌的能力可在活體內藉投藥化合物至罹患胃癌之動物並測定此化合物對腫瘤大小，生長或轉移潛力之影響而確認。
本發明所採用的具體實施例，將藉由以下之實施例及附呈圖式作進一步之說明。
 定義
發明所使用的「腫瘤標記」，係指與惡性腫瘤細胞相關之特殊蛋白質，由癌症細胞本身釋放到血液中或為癌症細胞誘發其他細胞釋放出的特殊蛋白質，在癌症發生時逐漸地在人體血液中升高。
本發明所使用的「預後」，係指預測疾病的可能病程和結局。其既包括判斷疾病的特定後果(如康復、某種症狀、體徵和併發症等其它異常的出現或消失及死亡)。
本發明所使用的「胃癌」，係指由人體胃部的黏膜細胞不正常的繁殖與增生所形成，例如胃腺癌(adenocarcinoma)即是最常見的胃部惡性腫瘤。
本發明所使用的「早期胃癌(Early gastric cancer)」，係侷限於胃黏膜層或黏膜下層侵潤的胃腺癌。
本發明所使用的「進行性胃癌(Advanced gastric cancer)」，係指癌細胞侵犯已超過黏膜下層，侵入胃壁肌肉層、或穿出胃壁肌肉層(固有肌肉層)，甚至侵犯到胃周圍的局部淋巴結。
本發明所使用的「腫瘤浸潤」，是指惡性腫瘤細胞在質和量方面異常地分佈於組織間隙的現象，如腫瘤細胞粘連、酶降解、移動、基質內增殖等一系列過程的表現。
本發明所使用的「腫瘤遠處轉移」，係指腫瘤細胞從原始發生的部位經由侵入循環系統，轉移到身體其他部位繼續生長的過程，也稱作惡性轉移。
本發明所使用的「血管侵犯」，係只有當腫瘤細胞及紅血球同時發現在平滑肌層中的血管中皮層覆蓋的空間。
本發明所使用的「器官侵犯」，係當腫瘤直接侵入至少一個周邊結構例如十二指腸、食管、肝臟、結腸系膜或橫隔膜。
本發明所使用的「切除手術」，係指以外科手術進行胃部腫瘤組織切除，切除之範圍是根據腫瘤發生之位置、大小、肉眼觀型態及無殘留癌細胞為目的
本發明所使用的「化學治療」，係指用化學抗癌藥物抑制癌細胞的生長，作為治療癌症的方式。
本發明所使用的「放射線治療」，係指使用放射線對抗快速生長分裂的癌細胞，作為直接或輔助治療癌症的方式。
本發明所使用的「分期」，係指依據胃癌之原始腫瘤大小(T)，局部淋巴腺轉移的有無(N)，以及遠處轉移的與否(M)，分為0(原位癌)、I(又可分成IA、IB)、II、III(又可分成IIIA、IIIB)、IV五個等級。
本發明所使用的「癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)」是只存在胚胎時期的胚胎抗原，可溶於酸性的醣蛋白其醣質含量40%~60%，正常參考值為＜5.0ng/ml。大部分是由惡性腫瘤所分泌，為癌症存在的標記，如大腸癌、直腸、胃癌、乳癌、胰臟癌、肺癌，在臨床上可作為大腸直腸癌的診斷、鑑別、治療或復發的工具。
本發明所使用的「分離的」，係指多肽或蛋白質，是基本上從其自然環境成分中分離出。較佳分離的多肽或蛋白質是一種與其天然環境成分相比至少百分之九十五重量以上的相同的多肽或蛋白質構成，最佳是該分離的多肽或蛋白質為同質組合物，通過基於分子量和等電點的二維電泳常規分離，其能夠被分辨成單個的點。通過常規的二維電泳分離對本發明所屬技術領域中通常知識者是習知的。
本發明所使用的「正常樣品」或「正常組織」，是代表無疾病或正常的細胞、組織、血液或血清，將患者樣品的測量值與其對照，以確定14-3-3β蛋白質含量是否少量，或者在患者樣品中的含量是否過量。正常樣品的來源可以由患者本身腫瘤處鄰近的正常組織中取得。較佳地，正常樣品中關於14-3-3β蛋白質含量是與患者樣品中相應值，基本上相同的實驗條件下獲得。正常樣品可以來自與患者樣品同種組織，或不同組織類型，獲得該正常樣品的健康個體可以選擇與患者具有相符合的特徵，例如年齡、性別、種族等。基本上，在本發明的測定中，將患者樣品中14-3-3β蛋白質含量與正常樣品中相應的值比較，該正常樣品預先製成表格並提供平均範圍、平均值和標準偏差，或類似表達方式。
本發明所使用的「組織樣品」或「生物樣品」或「患者樣品」或「患者細胞或組織」，皆是指從患者的組織中獲得相似的細胞集合。組織樣品的來源可以是新鮮、冷凍及/或保存的器官或組織樣品；血液或任何血液成分；體液如腹水或組織液。
實施例1 比較人類胃癌細胞株SC-M1細胞在以抗癌藥物5-FU(5-fluorouracil)處理後之蛋白質表現差異
本發明係利用蛋白質體學方法鑑定出胃癌細胞株SC-M1在以抗癌藥物5-FU(5-fluorouracil)處理48小時後14-3-3β之表現量變化，參閱第1a~1d圖
細胞培養
本實施例所使用之人類胃癌細胞SC-M1，係以ROMI-1640培養基加上10%胎牛血清(FBS，購自Invitrogen Carlsbad,California,U.S.A.)及100U/ml青黴素(penicillin)、100μg/ml鏈黴素(streptomycin)及2.5μg/ml amphothericin(購自Hyclone,Logan,Utah,U.S.A)，在37℃、二氧化碳濃度為5%之環境下培養，每2-3天進行繼代培養。
二維電泳(2-DE)及影像分析
為了比較在抗癌藥物5-FU處理後，胃癌細胞SC-M1內蛋白質表現量的差異，將5-FU處理過的實驗組胃癌細胞SC-M1細胞及未處理的控制組細胞，以二維電泳進行分析。在進行二維電泳時，將500μg之實驗組與控制組蛋白質樣品加入65mM的二硫赤鮮醇(DTE)以及0.5%(v/v)IPG緩衝液，於室溫下處理1小時，再以14000g離心30分鐘。蛋白質點以二維電泳分離時，先進行等電點沉澱(IEF)，以18cm膠條(pH 4-7)於20℃、8000V條件下，以IPGphor(購自Amersham Pharmacia Biotech)共進行91.2KVhr。接著將膠條轉至12.5%無梯度SDS-PAGE進行二維分離。所得影像利用ImageMaster software version 6.0(購自Amersham Pharmacia Biotech)進行蛋白質偵測及定性。每個蛋白質點的強度係以膠體中蛋白質點總量進行標準化校正，以相對蛋白質點體積(%V)表示。
膠體內水解及質譜儀分析
將蛋白質由膠體中切下經由質譜儀分析。蛋白質係利用MASCOT資料庫(http://www.matrixscience.com/)進行確認。對於經確認的蛋白質，各蛋白質的[-10Log(P)]之得分必須超過閥值(p<0.05)。
在實驗組胃癌細胞SC-M1細胞以抗癌藥物5-FU處理後，利用Alamar Blue assay計算細胞的增生及存活率，發現實驗組胃癌細胞SC-M1之細胞存活率在加入5-FU後明顯降低。以5-FU處理之組別(第1a右圖)及其控制組(第1a左圖)之二維電泳影像在經過軟體分析後(Mascot searching)，確認有18個表現顯著具有差異之蛋白質點，各個蛋白質點所對應之功能性列出如下列表1所示。
從表1可發現該些蛋白質主要相關功能為抗細胞凋亡、細胞遷徙、信號傳遞、細胞骨架、細胞貼附及Ras蛋白信號傳遞，此些功能皆與腫瘤形成有關。其中14-3-3β在抗癌藥物5-FU處理之實驗組胃癌細胞SC-M1細胞中，其表現量明顯受到抑制(參閱第1b、1c圖，14-3-3β為箭頭所指處，而右方為5-FU處理之實驗組，左方為其控制組)。
蛋白質萃取
為了進一步確認14-3-3β在抗癌藥物5-FU處理之實驗組胃癌細胞SC-M1細胞中，其表現量明顯受到抑制，萃取實驗組蛋白質樣品，以西方墨點法進行確認。
將實驗組及控制組細胞樣品溶於含有7M的尿素、4M的CHAPS界面活性劑及2M的硫脲中，並以超音波震盪。以13200g離心30分鐘，以蛋白質檢測套組(購自Bio-Rad,Hercules,CA)測量其蛋白質濃度。
西方墨點法
以SDS膠體電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis )將蛋白質樣品進行分離，並轉移至PVDF膜(polyvinylidene difluoride membrane，購自Millipore Corp,Bedford,MA)上。在PBS中以5%脫脂牛奶進行阻斷步驟，將抗14-3-3β的一級鼠單株抗體(購自Abcam,Cambridge,U.K.)，以1:1000濃度在4℃下隔夜處理。再以羊抗鼠HRP連結IgG的二級抗體(購自Sigma)，以1:8000的濃度處理。最後以ECL偵測套組(購自Pierce,Boston Technology,Woburn,MA)進行顯色，並以X光底片進行曝光。
經由西方墨點法確認，其表現量之倍數關係如第1d圖所示。由圖中可看到在無抗癌藥物處理以及經過抗癌藥物5-FU處理之實驗組胃癌細胞SC-M1細胞中14-3-3β表現量差異為2.55倍(2.55±0.27,p=0.05)。可確認14-3-3β表現量在胃癌細胞SC-M1細胞加入抗癌藥物5-FU後明顯受到抑制，因此，選擇14-3-3β蛋白質作為檢測標的。
實施例2 比較胃腫瘤與正常組織之14-3-3β表現量差異
本實施例中所使用的胃組織係以40對腫瘤及正常組織作為對照。
組織及血液樣品
本發明所有人類組織樣品及血清樣品皆經由人體試驗委員會(IRB)所核准。本實施例中使用之40對腫瘤及正常組織的樣品皆是在手術後30分鐘取得後即保存於液態氮中。黏膜樣品係取自至少遠離腫瘤之邊界3公分處。
蛋白質萃取及西方墨點法分析
組織樣品在取下後立即以液態氮冷凍保存。所有組織樣品於-50℃以空氣乾燥，在液態氮中磨碎均質化。萃取其蛋白質，超音波震盪、離心及量測其蛋白質濃度。將該40對樣品之蛋白質經萃取後以前述之西方墨點法進行分析。
結果參閱第2a、2e圖所示，其中第2e圖係顯示40組腫瘤組織(T)及正常組織(N)中14-3-3β之西方墨點法結果；第2a圖係將顯示第2e圖中的電泳結果定量並經過β-actin校正後之統計結果。結果顯示出胃癌組織的14-3-3β表現量明顯地較正常組織更高(p=0.03)。
免疫組織染色
將玻片上的石蠟包埋組織再水化，並以3%過氧化氫阻斷內生性過氧化酶之活性。將樣品於馬血清中以1:20濃度比，室溫下進行阻斷20分鐘。將樣品以鼠抗人之14-3-3β單株抗體(購自Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)，以1:100之濃度於4℃下隔夜處理。將樣品以PBS清洗三次後，加入驢抗鼠IgG HRP標記二級抗體(購自Santa Cruz Biotechnology)於室溫下處理30分鐘。將切片以二氨基聯苯胺染色，清洗後以蘇木素複染，清洗後脫水，再以二甲苯處理並固定。
參閱第2b~2d圖，係分別顯示正常組織(第2b圖)、腸道形腫瘤組織(第2c圖)及混合型腫瘤組織(第2d圖)之免疫組織染色結果(放大200倍)。在腫瘤組織中，14-3-3β係在癌細胞之細胞核及細胞質中呈現陽性染色。由第2b圖中可看到正常胃部組織中表現出微量的14-3-3β，第2c、2d圖中的腸道形腫瘤組織及混合型腫瘤組織之14-3-3β表現量明顯高於正常胃部組織。故可從免疫組織染色實驗中再次確認腫瘤組織中14-3-3β表現量高於正常組織的結果。
實施例3 胃癌患者與正常人血液中14-3-3β的含量測定 血液樣品
本實施例所使用之血液樣品係經過病患之同意。血液樣品係在手術前取自145位胃癌病患、63位控制組人員(38位男性及25位女性，平均年齡在46.2歲)，包括19位經內視鏡診斷為胃炎患者，19位非胃炎性消化不良者，及25位無胃部異常的自願者。本實施例所使用之血清樣品係保存於-20℃。其中該145位胃位癌病患係在2001年7月至2006年3月間進行根治性胃切除術(其人口統計學結果參表2所示)。
在此主要根據TNM系統進行分期，進行切除的標準包括完整原生性胃腫瘤的切除，局部淋巴結切除的D2切除手術，且無巨觀腫瘤的存在，且該此些病患在手術時並未觀察到肝、肺及遠端器官之遠端轉移；未表現有其他先前的或共伴的腫瘤，而在手術進行前也未接受過化學治療或放射線治療。臨床病理因素包括年齡、性別、腫瘤種類(Borrmann分類)、腫瘤組織學分類(Lauren分類)、腫瘤侵入深度、淋巴結轉移情形、血液侵入及腫瘤大小(腫瘤的長x寬)，參考其組織學發現並紀錄於病患資料庫。手術後對病患持續追蹤3到46個月。追蹤期間係以手術後存活期作為計算。將血液中14-3-3β含量與前述臨床結果進行評估。
酵素免疫分析法(ELISA)
為量測血清中14-3-3β含量，在此利用酵素免疫分析法。以抗14-3-3β的單株抗體(4μg/ml,Abcam,Cambridge,U.K.)置於結合有卵白素(streptavidin)之96孔盤4℃下隔夜處理。將96孔盤清洗後以5%濃度的脫脂奶粉於PBS中處理2小時進行阻抗。阻抗完成後，將14-3-3β標準抗原及所有血清樣品(1:400)置於盤中處理3小時。將96孔盤清洗後再以抗14-3-3β之多株抗體(0.08μg/ml,Upstate Biotechnology,Inc.,Lake Placid,NY)處理2小時。為偵測抗原-抗體複合體，加入100μ1之羊抗兔HRP連結IgG多株抗體(0.04μg/ml)處理1小時。將96孔盤清洗後加入四甲基聯苯胺(TMB,Bionova Biotechnology,Dartmouth,NS,Canada)處理30分鐘。直到加入2M硫酸中止反應。14-3-3β及未知樣品之蛋白質濃度可利用ELISA讀取器量測450及570nm吸光值得到。
CEA血清分析
血清中癌胚抗原(CEA)含量可利用放射免疫檢定套組ELSA2-CEA(CIS bio international,France)測得。在此係利用一種固相雙位放射免疫檢定法，以單株抗體辨認CEA分子距離較遠的抗原部位：一株結合於ELSA固相上，另一株則標記以碘125以用於追蹤。CEA濃度在控制組中為0.4-0.64ng/ml。
參閱第3a、3c圖，其中第3a圖顯示以ELISA方法分析145個胃癌患者(第I~IV期)及63個正常人血液中14-3-3β含量之結果，而第3c圖係顯示其CEA含量之結果。如圖所示，第I期胃癌病患之血液中14-3-3β含量之平均值為506ng/ml，而其中位數為424ng/ml(n=23)。與CEA結果(n=23)作比較，第I期胃癌病患之血液中14-3-3β含量明顯高於正常人(p=0.05)，而此時血液中CEA含量則無顯著差異(p=0.297)。
同時參閱第3b圖，其顯示胃癌患者具有較高及較低14-3-3β表現量與存活率之關係。將第I期胃癌病患分為兩組，以平均值(521ng/ml)作為截斷值(n=28)。如圖所示，血液中14-3-3β含量高於521ng/ml者(實線表示)相較於血液中14-3-3β含量低於521ng/ml者(虛線表示)，14-3-3β含量較高者具有較低的存活率(p=0.039)。
實施例4 各分期胃癌患者與正常人之14-3-3β及癌胚抗原(CEA)間的關 連性
為分析14-3-3β及臨床結果間的關連性，在此將病患根據臨床及病理參數，分為不同組別。學生T檢定(Student's t test)用以比較兩獨立母群的差異性。P值小於0.05時具有統計上意義。在多個群組間比較時，係利用one-way ANOVA(SAS 9.1 software)。數值變量的關聯性係利用MedCalc software version 9.0，並以p值表現其關聯係數。
接收器操作特徵曲線(receiver operating characteristic curve,簡稱ROC曲線)，是目前廣為用來評估診斷工具準確性的統計方法，要了解一個診斷工具是否優於另一工具，只要比較兩者的ROC曲線下的面積(area under the curve,AUC)，AUC值(大於0，小於1)代表強迫二選一(two-alternative-forced-choice)的情形下，診斷工具猜對有病者、無病者的機率。本實施例中用以作為14-3-3β及癌胚抗原(CEA)的質體量之診斷工具，利用敏感度(sensitivity)對專一性(l-specificity)作圖以偵測不同分期之胃癌(第I~IV期)及正常人，並計算ROC曲線下的面積。
結果參閱第4a~4e圖，其中第4a圖為第I期胃癌患者的14-3-3β(第4a圖)及CEA(第4a圖)之ROC曲線，第4a圖係顯示第I期胃癌病患14-3-3β之AUC值為0.75。而當以血清中14-3-3β含量之決定最佳診斷的截斷點cut-off point為329ng/ml作為胃癌之早期偵測指標時，其敏感度為82%，而專一性為65%。顯示出14-3-3β適於作為胃癌之早期偵測指標。而四個不同時期的胃癌中，14-3-3β之AUC值皆高於癌胚抗原(CEA)，顯示出14-3-3β測定胃癌比癌胚抗原(CEA)更準確，更適於作為診斷指標。
參閱第4f~4h圖，其分別顯示出胃癌患者在手術前血清中14-3-3β含量與淋巴結轉移數目(第4f圖)、腫瘤大小(第4g圖)、腫瘤組織中14-3-3β表現量(第4h圖)之關連性。如第4f、4g圖所示，其顯示出14-3-3β與淋巴結轉移數目(r=0.166，p=0.045)及腫瘤大小(r=0.452，p<0.001)呈現高度關連性。並且，手術前血清中14-3-3β含量與腫瘤組織中14-3-3β表現量呈現正相關性(r=0.385,p=0.033)。另外，如表3之資料所示，血清中14-3-3β含量與後期之胃癌(p=0.002)、腫瘤侵入深度(p=0.008)、腹膜侵入(p=0.045)呈現較高的關連性。相較之下，與勞倫分類(Lauren classification)(p=0.831)、器官侵入(p=0.157)及血液侵入(p=0.137)之關連性較低。此些結果皆說明了14-3-3β可能在胃癌腫瘤的侵入機轉扮演一重要角色。
實施例5
14-3-3β與癌胚抗原(CEA)在胃癌患者存活率之關連性
利用建構Kaplan-Meier無復發存活及總體存活曲線以求得血清中14-3-3β表現量及病患存活率。P值小於0.05時具有統計上意義。成對學生T檢定(Paired Student's t test)係用以比較病患在手術前及手術後血清中14-3-3β含量之變化。
參閱第5a~5c圖，係顯示出胃癌患者之14-3-3β含量與存活率之關係。如第5a~5b圖所示，分別表示出將胃癌患者測定14-3-3β含量，以具有較高敏感度(86%)及專一性(67%)之14-3-3β含量(349ng/ml)決定作為最佳診斷的截斷點，區分為較高(實線表示)及較低(虛線表示)兩群組後，比較其總體存活率(overall survival)及無復發存活率(recurrence-free survival)之關係。由圖中結果可看出，具有較高14-3-3β含量之胃癌患者，無論在第5a圖的總體存活率(p=0.038)及第5b圖的無復發存活率(p=0.037)方面，表現都比較差。
另一方面，第5c圖顯示出胃癌病人手術前與手術後血液中14-3-3β含量。如圖所示，胃癌病人在手術前14-3-3β含量較高(平均值=579ng/ml，中位數=515ng/ml)，而在手術後胃癌病人之14-3-3β含量則降低(平均值=427ng/ml，中位數=378ng/ml)，且明顯較手術前之14-3-3β含量更低。
參閱第5d~5e圖，其顯示出胃癌患者癌胚抗原(CEA)含量與胃癌患者總體存活率及無復發存活率之關係。相對而言，患者之癌胚抗原(CEA)含量高於3ng/ml者，與其總體存活率及無復發存活率並無明顯之關連性。顯示出14-3-3β比癌胚抗原(CEA)更適於作為胃癌診斷之腫瘤標記。
實施例6 在細胞中過度表現14-3-3β與腫瘤侵入、轉移及生長之關係
將人類胃癌細胞TSGH、SC-M1、N87、AGS及KATO III，以前述之方法步驟進行細胞培養以及西方墨點法分析。結果如第6a圖所示，其顯示出各種不同胃癌細胞之內生性14-3-3β表現量，其中TSGH細胞具有最高的14-3-3β表現量。
構築14-3-3β質體
自TSGH細胞中萃取出RNA，並據以得到cDNA，並以反轉錄聚合酶鏈結反應進行增殖，分別使用正向引子5’-GGTACGTAAGCTTGCCACCATGACAATGGATAAAAGT-3’以及反向引子5’-AGTCGAGAATTCTTAGTTCTCTCCCTCCCC-3’。將產物片段插入pcDNA載體(Invitrogen Inc.)中，將此pcDNA/14-3-3β載體進行人類胃癌細胞之瞬時及永久性轉染。
質體轉染
將6 x 105 個AGS細胞培養在6孔培養皿(37℃，24小時)。再以14-3-3β載體及控制組載體以Opti-MEM轉染試劑(購自Gibco)對AGS細胞進行轉染。8μg的質體DNA(pcDNA3/14-3-3β或pcDNA3)與10μl的lipofactamine 2000試劑混合，並依照使用說明進行轉染步驟。
結果如第6b圖所示，其顯示出以空白載體pcDNA3及pcDNA3/14-3-3β表現載體轉染後之14-3-3β的表現量，由結果可看出經由pcDNA3/14-3-3β表現載體轉染後，細胞中14-3-3β表現量明顯較高(大約2倍)。
以Boyden Chamber Assays進行侵入及轉移測試
分別評估人類14-3-3β表現量及控制組空白載體轉染至AGS細胞之14-3-3β表現量。轉移測試係以修正的Boyden chamber以及PVPF聚碳酸濾膜(孔徑=8μm)，而侵入測試係以塗佈基質膠(35μg，BD Biosciences)進行。轉移測試首先加入約2.5 x 104 個細胞至100μl之培養基於上層室並使細胞貼附、染色，並以光學顯微鏡(購自Olympus)在48小時後觀察及計數。
將結果整理如第6c、6d圖所示，可看出在以14-3-3β表現載體進行轉染之細胞在14-3-3β過度表現時，同時促進了胃癌細胞的侵入能力(invasion)及轉移能力(migration)。
以MTT Assay測定細胞增殖作用
MTT分析法是一種常見用於分析細胞增生(cell proliferation)、存活率(percent of viable cells)以及細胞毒性(cytotoxicity)的分析方法。其中，MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide)為一黃色染劑，它可被活細胞吸收並被粒腺體中的琥珀酸四唑還原酶(succinate tetrazolium reductase)還原成不溶水性且呈藍紫色的甲臢(formazan)，因此藉由甲臢(formazan)形成與否，即可判斷並分析細胞之增生。
將細胞(5 x 104 個)培養於24孔盤中24小時，並以14-3-3β表現載體及控制組空白載體(3μg)進行轉染24及48小時。在培養時每1ml加入100μg之MTT試劑。置於37℃下4小時之後，加入DMSO(500μl/well)以溶解所形成的甲臢(formazan)沉澱物，靜置10分鐘。以ELISA讀取儀量測波長為570nm之光學密度(OD)值，並在各實驗組分別進行四次。
將結果整理如第6e圖所示，可看出在當以14-3-3β表現載體進行細胞轉染時，胃癌細胞的增殖能力(cell growth)較佳，可推知14-3-3β的過度表現可促進胃癌細胞的增殖能力(cell growth)。
經由上述實施例所揭露之內容，可知14-3-3β的表現量在胃癌組織樣品比正常組織樣品更高，同時在血液樣品中也得到相似的結果。在比較胃癌病人與正常人的14-3-3β表現量結果來看，可觀察到胃癌病人血液中14-3-3β含量比正常人更高，並且其14-3-3β含量增加的程度也隨著胃癌分期而增加。而從胃癌的預後來看，也觀察到在手術後14-3-3β含量較高的胃癌患者，具有較差的預後情形，也就是具有較低的存活率。此些結果顯示出14-3-3β不但是一個與胃癌高度相關的蛋白質，同時也是一個可應用於胃癌早期偵測及預後的腫瘤標記。同時，基於上述方法，發展出一種包含一有效量之14-3-3β抗體之檢測套組，可用於檢測胃癌有發展為腫瘤侵入或遠處轉移之危險性。
雖然，本發明已藉由參考前述較佳實施例而揭露，熟悉本發明技術領域者可輕易的據此做些許的改變或修飾，但此將不脫離本發明申請專利範圍所界定之範疇。
第1a~1d圖係顯示出利用蛋白質體學方法鑑定出胃癌細胞株SC-M1在以抗癌藥物5-FU處理48小時後14-3-3β之表現量變化；
第2a~2e圖係顯示出以組織染色法及西方墨點法分析腫瘤組織(T)及正常組織(N)中14-3-3β之表現量；
第3a圖係顯示以ELISA方法分析胃癌患者(第I~IV期)及正常人血液中14-3-3β之含量；
第3b圖係顯示第一期胃癌患者具有較高及較低14-3-3β表現量與存活率之關係；
第3c圖係顯示胃癌患者(第I~IV期)及正常人血液中CEA之含量；
第4a~4e圖係顯示不同分期之胃癌患者(第I~IV期)與正常人之14-3-3β之ROC曲線及CEA之ROC曲線；
第4f~4h圖係顯示胃癌患者在手術前血清中14-3-3β含量與淋巴結轉移數目、腫瘤大小、腫瘤組織中14-3-3β表現量之關連性；
第5a~5c圖係顯示胃癌患者14-3-3β含量與胃癌患者總體存活率、無復發存活率及手術前後之關係；
第5d~5e圖係顯示胃癌患者CEA含量與胃癌患者總體存活率及無復發存活率之關係；
第6a~6e圖係顯示在細胞中過度表現14-3-3β與腫瘤侵入、轉移及生長之關係。

Claims (8)

  1. 一種檢測一胃腺癌個體預後程度的方法，其係由以下步驟組成：提供一血清樣品；檢測該血清樣品中14-3-3 β含量；以及比較該血清樣品中14-3-3 β含量是否低於349 ng/ml；其中預後良好是指血清中14-3-3 β含量低於349 ng/ml，該胃腺癌個體之五年總體存活率至少70%及五年無復發存活率至少60%。
  2. 如申請範圍第1項所述之方法，其中檢測該血清樣品中14-3-3 β含量是使用專一結合至14-3-3 β抗體而測定。
  3. 如申請範圍第1項所述之方法，其中檢測該血清樣品中14-3-3 β含量是使用蛋白質分析方法，係為一西方墨點法。
  4. 如申請範圍第1項所述之方法，其中該血清樣品係取自一經過胃腺癌治療之患者。
  5. 如申請範圍第4項所述之方法，其中該胃腺癌治療係為一外科切除手術。
  6. 如申請範圍第4項所述之方法，其中該胃腺癌治療係為一放射線治療。
  7. 如申請範圍第4項所述之方法，其中該胃腺癌治療係為一化學治療。
  8. 一種對於胃腺癌個體預後之血清檢測套組，係包含一有效量之14-3-3 β抗體，其中若血清中14-3-3 β含量低於349 ng/ml，則代表該胃腺癌個體之五年總體存活率至少70%及五年無復發存活率至少60%。
TW098117727A 2009-05-27 2009-05-27 檢測一胃癌預後程度的方法 TWI399541B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW098117727A TWI399541B (zh) 2009-05-27 2009-05-27 檢測一胃癌預後程度的方法
US12/612,904 US20100304419A1 (en) 2009-05-27 2009-11-05 Method for determining the prognosis of gastric cancer

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW098117727A TWI399541B (zh) 2009-05-27 2009-05-27 檢測一胃癌預後程度的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201042258A TW201042258A (en) 2010-12-01
TWI399541B true TWI399541B (zh) 2013-06-21

Family

ID=43220678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW098117727A TWI399541B (zh) 2009-05-27 2009-05-27 檢測一胃癌預後程度的方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20100304419A1 (zh)
TW (1) TWI399541B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115266962B (zh) * 2017-03-31 2024-05-31 北京谷海天目生物医学科技有限公司 蛋白标志物在制备弥漫型胃癌分子分型的产品中的应用及弥漫型胃癌分子分型的分类器
CN111349166B (zh) * 2018-12-20 2022-11-08 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗人ca72-4糖蛋白的重组抗体
CN110907647B (zh) * 2019-10-29 2022-08-30 南通大学附属医院 Clec5a基因的新用途
CN112837815A (zh) * 2021-02-04 2021-05-25 复旦大学附属中山医院 基于Lauren分型和术后残留淋巴结评估胃癌预后的模型及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1090262A (ja) * 1996-09-13 1998-04-10 Morinaga & Co Ltd １４−３−３タンパク質の測定法
US20050009094A1 (en) * 2001-06-06 2005-01-13 Mueller Werner E G Use of 14-3-3 proteins and a method for determining the same in the fluids or tissues of organisms
US20060194211A1 (en) * 2003-04-29 2006-08-31 Burczynski Michael E Methods for prognosis and treatment of solid tumors

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1090262A (ja) * 1996-09-13 1998-04-10 Morinaga & Co Ltd １４−３−３タンパク質の測定法
US20050009094A1 (en) * 2001-06-06 2005-01-13 Mueller Werner E G Use of 14-3-3 proteins and a method for determining the same in the fluids or tissues of organisms
US20060194211A1 (en) * 2003-04-29 2006-08-31 Burczynski Michael E Methods for prognosis and treatment of solid tumors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chia-Hsin Chan et al, "Subcellular and Functional Proteomic Analysis of the Cellular Responses Induced by Helicobacter pylori", Molecular & Cellular P roteomics, 2006, volume 5, pages 702-713. *

Also Published As

Publication number Publication date
TW201042258A (en) 2010-12-01
US20100304419A1 (en) 2010-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yip-Schneider et al. Vascular endothelial growth factor, a novel and highly accurate pancreatic fluid biomarker for serous pancreatic cysts
US9249409B2 (en) Method for detection of cancer
Shimura et al. Urinary ADAM12 and MMP-9/NGAL complex detect the presence of gastric cancer
CN102687011B (zh) 癌症生物标志物及其应用
JP2009511028A (ja) 膀胱の移行上皮癌を検出するための非侵襲性ｉｎｖｉｔｒｏ方法
EP2948769B1 (en) Platelet biomarkers in cancer diagnosis
Fernández-Grijalva et al. Alpha 2HS-glycoprotein, a tumor-associated antigen (TAA) detected in Mexican patients with early-stage breast cancer
TWI399541B (zh) 檢測一胃癌預後程度的方法
US9128095B2 (en) Diagnosis or prognosis of lung cancer and colorectal cancer based on expression level of glutaredoxin 3
ES2364496T3 (es) Procedimiento de comprobación y control del proceso de fermentación del ácido láctico en mamíferos/ruta metabólica de fermentación aerobia de la glucosa en el organismo de mamíferos.
JP6361943B2 (ja) 補体因子ｂタンパク質に特異的に結合する抗体及び糖鎖抗原１９−９タンパク質に特異的に結合する抗体を含む膵臓癌診断用キット
KR101988120B1 (ko) 혈액 내 gastrokine 1 단백을 이용하는 위암 진단
CN109517049B (zh) Linc00266-1多肽作为实体瘤标志物的应用
ES2896056T3 (es) PD-ECGF como biomarcador de cáncer
Yang et al. Correlation of collagen triple helix repeat containing 1 overexpression with lymph node and peritoneal metastasis in epithelial ovarian cancer
AU2017239516B2 (en) Method for detection of cancer
KR101594287B1 (ko) 보체인자 b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트
KR101127225B1 (ko) 요로상피암 표지자 및 그를 이용한 요로상피암 진단방법
ES2743508T3 (es) Métodos y productos para el diagnóstico y el pronóstico de la malignidad de tumores de ovario
JP2023133869A (ja) 卵巣がん患者の予後予測用バイオマーカー
Yang et al. Overexpression of IFITM 3 predicts poor prognosis in stage IIA esophageal squamous cell carcinoma after I vor L ewis esophagectomy
JP5429723B2 (ja) 大腸癌、動脈硬化症、又はメタボリックシンドロームの検出方法
MX2008004723A (en) Non-invasive in vitro method to detect transitional cell carcinoma of the bladder