JPH1090262A - １４−３−３タンパク質の測定法 - Google Patents
１４−３−３タンパク質の測定法Info
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- JPH1090262A JPH1090262A JP26375896A JP26375896A JPH1090262A JP H1090262 A JPH1090262 A JP H1090262A JP 26375896 A JP26375896 A JP 26375896A JP 26375896 A JP26375896 A JP 26375896A JP H1090262 A JPH1090262 A JP H1090262A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトや動物の血清、血漿、脳脊髄液等の体液
中ならびに組織抽出液中に含まれる１４−３−３タンパ
ク質を迅速かつ経済的に検出または測定する。 【解決手段】 ヒトモノクローナル抗体、マウスモノク
ローナル抗体、マウスポリクローナル抗体又はウサギポ
リクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法またはイムノ
ブロッティグ法により、ヒトや動物の血清、血漿、脳脊
髄液等の体液中ならびに組織抽出液中に含まれる１４−
３−３タンパク質を迅速かつ経済的に検出または測定す
る。
中ならびに組織抽出液中に含まれる１４−３−３タンパ
ク質を迅速かつ経済的に検出または測定する。 【解決手段】 ヒトモノクローナル抗体、マウスモノク
ローナル抗体、マウスポリクローナル抗体又はウサギポ
リクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法またはイムノ
ブロッティグ法により、ヒトや動物の血清、血漿、脳脊
髄液等の体液中ならびに組織抽出液中に含まれる１４−
３−３タンパク質を迅速かつ経済的に検出または測定す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、１４−３−３タン
パク質を認識する抗体を用いた簡便かつ高感度な１４−
３−３タンパク質の測定法に関するものである。
パク質を認識する抗体を用いた簡便かつ高感度な１４−
３−３タンパク質の測定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】１４−３−３タンパク質は真核細胞生物
間で進化論的にその構造が良く保存された細胞質中のタ
ンパク質であり、特に脳中に高濃度の存在が知られてい
る。また、動物の１４−３−３タンパク質には９つのア
イソフォームが知られており、これらは、チロシン水酸
化酵素およびトリプトファン水酸化酵素の活性化、プロ
テインキナーゼＣの阻害等に代表される神経系や細胞内
の情報伝達に重要な生理的役割を担っている。１４−３
−３タンパク質の幾つかのアイソフォームは、癌原遺伝
子および癌遺伝子の生産物と関連があり、細胞の形質転
換および細胞分裂の調節に中心的な役割を担っていると
考えられている。これらのことから、種々の体液中ある
いは組織抽出液中に含まれる１４−３−３タンパク質の
濃度を測定することにより、癌の診断が可能であろうこ
とは容易に推測される。また、１４−３−３タンパク質
は前述のように、脳細胞中の含有量が他と比較して際立
って多く、脳細胞の可溶性総タンパク質の約１％を占め
るため、脳細胞のよいマーカーとなる。従って、脳脊髄
液等の体液中の１４−３−３タンパク質濃度を測定する
ことにより、プリオン（prion）の感染によって脳細胞
が破壊される脳神経系の疾患（ヒトではクロイツフェル
ト−ヤコブ病［Creutzfeldt-Jakob disease］、ウシで
は狂牛病、ヒツジではスクレイピー［scrapie］の名で
知られる）の診断が可能であろうことは容易に推測され
る。
間で進化論的にその構造が良く保存された細胞質中のタ
ンパク質であり、特に脳中に高濃度の存在が知られてい
る。また、動物の１４−３−３タンパク質には９つのア
イソフォームが知られており、これらは、チロシン水酸
化酵素およびトリプトファン水酸化酵素の活性化、プロ
テインキナーゼＣの阻害等に代表される神経系や細胞内
の情報伝達に重要な生理的役割を担っている。１４−３
−３タンパク質の幾つかのアイソフォームは、癌原遺伝
子および癌遺伝子の生産物と関連があり、細胞の形質転
換および細胞分裂の調節に中心的な役割を担っていると
考えられている。これらのことから、種々の体液中ある
いは組織抽出液中に含まれる１４−３−３タンパク質の
濃度を測定することにより、癌の診断が可能であろうこ
とは容易に推測される。また、１４−３−３タンパク質
は前述のように、脳細胞中の含有量が他と比較して際立
って多く、脳細胞の可溶性総タンパク質の約１％を占め
るため、脳細胞のよいマーカーとなる。従って、脳脊髄
液等の体液中の１４−３−３タンパク質濃度を測定する
ことにより、プリオン（prion）の感染によって脳細胞
が破壊される脳神経系の疾患（ヒトではクロイツフェル
ト−ヤコブ病［Creutzfeldt-Jakob disease］、ウシで
は狂牛病、ヒツジではスクレイピー［scrapie］の名で
知られる）の診断が可能であろうことは容易に推測され
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、１４−３−
３タンパク質に対する抗体を用いることにより１４−３
−３タンパク質の測定方法を提供し、ヒトおよび動物の
癌ならびにプリオンの感染による脳神経系の疾患等の診
断を可能とするためになされたものである。
３タンパク質に対する抗体を用いることにより１４−３
−３タンパク質の測定方法を提供し、ヒトおよび動物の
癌ならびにプリオンの感染による脳神経系の疾患等の診
断を可能とするためになされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決するために鋭意研究を重ね、１４−３−３タンパ
ク質に対する抗体としてヒトモノクローナル抗体ＡＥ−
６、マウスモノクローナル抗体ＹＳ１８０、ＹＳ３３
７、ＹＳ３８３、ＹＳ４６０、ＹＳ６４４、ＹＳ７０
１、ＹＳ９０３およびウサギポリクローナル抗体などを
用いて、これらの抗体の酵素標識方法ならびに抗体の組
み合わせの選択等を行った結果、１４−３−３タンパク
質の高感度な測定方法を開発して本発明を完成するに至
った。即ち、本発明は、１４−３−３タンパク質を認識
する抗体を一種以上用いることを特徴とする１４−３−
３タンパク質測定法に係わるものであり、該抗体として
は、ヒト、マウス及びウサギ由来のモノクローナル又は
ポリクローナル抗体を使用することが好ましい。特に、
本発明は、ヒトモノクローナル抗体、マウスのモノクロ
ーナル抗体およびポリクローナル抗体、並びにウサギポ
リクローナル抗体によって構成される群から選んだ一種
以上の抗体を有効成分として含有する１４−３−３タン
パク質測定法を提供するものである。
を解決するために鋭意研究を重ね、１４−３−３タンパ
ク質に対する抗体としてヒトモノクローナル抗体ＡＥ−
６、マウスモノクローナル抗体ＹＳ１８０、ＹＳ３３
７、ＹＳ３８３、ＹＳ４６０、ＹＳ６４４、ＹＳ７０
１、ＹＳ９０３およびウサギポリクローナル抗体などを
用いて、これらの抗体の酵素標識方法ならびに抗体の組
み合わせの選択等を行った結果、１４−３−３タンパク
質の高感度な測定方法を開発して本発明を完成するに至
った。即ち、本発明は、１４−３−３タンパク質を認識
する抗体を一種以上用いることを特徴とする１４−３−
３タンパク質測定法に係わるものであり、該抗体として
は、ヒト、マウス及びウサギ由来のモノクローナル又は
ポリクローナル抗体を使用することが好ましい。特に、
本発明は、ヒトモノクローナル抗体、マウスのモノクロ
ーナル抗体およびポリクローナル抗体、並びにウサギポ
リクローナル抗体によって構成される群から選んだ一種
以上の抗体を有効成分として含有する１４−３−３タン
パク質測定法を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明のヒトモノクローナル抗体
の作製は、例えば特願平６−１７４７７５号（ヒト肺癌
細胞に対する抗体およびそれを利用するヒト肺癌検査
法）に記載した方法により行うことが可能であり、ま
た、マウスモノクローナル抗体の作製は、例えば特願平
８−１８０３１号（抗１４−３−３蛋白質マウスモノク
ローナル抗体およびそれを利用するヒト肺癌検査法）に
記載した方法により行うことができる。ポリクローナル
抗体の作製は、通常の方法にて行うことができる。本発
明の測定系としては、例えば、酵素免疫測定法、特にサ
ンドイッチ酵素免疫測定法、イムノブロット法、ラテッ
クス凝集法等を例示できる。また、検体としては、ヒト
および動物由来の血清、血漿、リンパ液、脳脊髄液等の
体液あるいは癌等の組織の抽出液などを用いることがで
きる。特に好適な態様である、一次抗体及び二次抗体の
両方に１４−３−３タンパク質を認識する抗体を使用す
るサンドイッチ酵素免疫測定法による測定の手順の一例
を以下に示す。
の作製は、例えば特願平６−１７４７７５号（ヒト肺癌
細胞に対する抗体およびそれを利用するヒト肺癌検査
法）に記載した方法により行うことが可能であり、ま
た、マウスモノクローナル抗体の作製は、例えば特願平
８−１８０３１号（抗１４−３−３蛋白質マウスモノク
ローナル抗体およびそれを利用するヒト肺癌検査法）に
記載した方法により行うことができる。ポリクローナル
抗体の作製は、通常の方法にて行うことができる。本発
明の測定系としては、例えば、酵素免疫測定法、特にサ
ンドイッチ酵素免疫測定法、イムノブロット法、ラテッ
クス凝集法等を例示できる。また、検体としては、ヒト
および動物由来の血清、血漿、リンパ液、脳脊髄液等の
体液あるいは癌等の組織の抽出液などを用いることがで
きる。特に好適な態様である、一次抗体及び二次抗体の
両方に１４−３−３タンパク質を認識する抗体を使用す
るサンドイッチ酵素免疫測定法による測定の手順の一例
を以下に示す。
【０００６】１．９６穴イムノプレートに５０ｍＭ炭酸
緩衝液（ｐＨ９．６）で通常１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／
ｍｌ（好ましくは３０μｇ／ｍｌ）の濃度に希釈した一
次抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体ＹＳ９０
３）を加え、３７℃で１時間静置することにより、抗体
をコートする。
緩衝液（ｐＨ９．６）で通常１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／
ｍｌ（好ましくは３０μｇ／ｍｌ）の濃度に希釈した一
次抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体ＹＳ９０
３）を加え、３７℃で１時間静置することにより、抗体
をコートする。
【０００７】２．０．０５％ツイーン２０を含有するリ
ン酸緩衝化生理食塩水（以下ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎと略
記）で３回洗浄する。
ン酸緩衝化生理食塩水（以下ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎと略
記）で３回洗浄する。
【０００８】３．１％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと
略記）を含有するＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（以下ＰＢＳ／Ｔ
ｗｅｅｎ／ＢＳＡと略記）でブロッキングを３７℃で１
時間行う。
略記）を含有するＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（以下ＰＢＳ／Ｔ
ｗｅｅｎ／ＢＳＡと略記）でブロッキングを３７℃で１
時間行う。
【０００９】４．ブロッキング溶液を捨てた後、１４−
３−３タンパク質の標準溶液あるいは検体を各穴に加
え、３７℃で１時間反応させる。
３−３タンパク質の標準溶液あるいは検体を各穴に加
え、３７℃で１時間反応させる。
【００１０】５．ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
【００１１】６．例えば、アルカリフォスファターゼや
ペルオキシダーゼ等の酵素により標識した二次抗体（例
えば、アルカリフォスファターゼ標識のマウスモノクロ
ーナル抗体ＹＳ４６０）を加え、３７℃で１時間反応さ
せる。
ペルオキシダーゼ等の酵素により標識した二次抗体（例
えば、アルカリフォスファターゼ標識のマウスモノクロ
ーナル抗体ＹＳ４６０）を加え、３７℃で１時間反応さ
せる。
【００１２】７．ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
【００１３】８．酵素の基質である発色試薬（例えば、
酵素標識抗体の酵素がアルカリフォスファターゼの場合
にはパラニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ））
を用いて発色させる。
酵素標識抗体の酵素がアルカリフォスファターゼの場合
にはパラニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ））
を用いて発色させる。
【００１４】９．酵素反応を停止したのち吸光度を測定
し、濃度が既知の１４−３−３タンパク質を用いて測定
した標準定量曲線を基に、検体中の１４−３−３タンパ
ク質濃度を求める。
し、濃度が既知の１４−３−３タンパク質を用いて測定
した標準定量曲線を基に、検体中の１４−３−３タンパ
ク質濃度を求める。
【００１５】次に本発明のイムノブロット法での手順の
一例を以下に示す。
一例を以下に示す。
【００１６】１．１４−３−３タンパク質標準溶液およ
び検体溶液を適当に希釈後、電気泳動（例えば、ＳＤＳ
存在下でのポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動な
ど）を行う。検体としては、血清、リンパ液等の体液あ
るいは組織抽出液などを用いることができる。
び検体溶液を適当に希釈後、電気泳動（例えば、ＳＤＳ
存在下でのポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動な
ど）を行う。検体としては、血清、リンパ液等の体液あ
るいは組織抽出液などを用いることができる。
【００１７】２．電気泳動後、ポリビニリデンジフルオ
リド膜（ＰＶＤＦ膜）にタンパク質を通常の方法で転写
する。
リド膜（ＰＶＤＦ膜）にタンパク質を通常の方法で転写
する。
【００１８】３．抗体の非特異的吸着を抑えるため、Ｐ
ＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより室温で３０分間ブロッキングを
行う。
ＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより室温で３０分間ブロッキングを
行う。
【００１９】４．例えば、アルカリフォスファターゼや
ペルオキシダーゼ等の酵素により標識した抗体（例え
ば、アルカリフォスファターゼ標識のマウスモノクロー
ナル抗体ＹＳ４６０）の溶液によりＰＶＤＦ膜を覆い、
室温で３０分間反応させる。
ペルオキシダーゼ等の酵素により標識した抗体（例え
ば、アルカリフォスファターゼ標識のマウスモノクロー
ナル抗体ＹＳ４６０）の溶液によりＰＶＤＦ膜を覆い、
室温で３０分間反応させる。
【００２０】５．液を捨てる。
【００２１】６．ＰＢＳにより１０分間洗浄する操作を
３回繰り返す。
３回繰り返す。
【００２２】７．酵素の発色基質（例えば、抗体の酵素
標識に用いた酵素がアルカリフォスファターゼの場合に
はベクターレッド（ベクター社製）など）を加えて発色
させる。
標識に用いた酵素がアルカリフォスファターゼの場合に
はベクターレッド（ベクター社製）など）を加えて発色
させる。
【００２３】８．デンシトメーター等により染色された
バンドを走査し、ピーク面積を測定する。標準１４−３
−３タンパク質の濃度とそのピーク面積の関係から検体
中の１４−３−３タンパク質濃度を求める。
バンドを走査し、ピーク面積を測定する。標準１４−３
−３タンパク質の濃度とそのピーク面積の関係から検体
中の１４−３−３タンパク質濃度を求める。
【００２４】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
発明は、これら実施例に限定されるものではない。尚、
ハイブリドーマＡＥ−６は平成５年１１月２５日付で生
命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託さ
れている（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９８１）。又、マウスモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、Ｙ
Ｓ３８３及びＹＳ６４４は、工業技術院生命工学工業技
術研究所に、夫々平成７年１２月２６日（ＦＥＲＭ Ｐ
−１５３７４）、平成７年１２月２６日（ＦＥＲＭ Ｐ
−１５３７５）付で寄託されている。又、ＹＳ１８０、
ＹＳ３３７、ＹＳ４６０、ＹＳ７０１及びＹＳ９０３の
５種類のハイブリドーマは、同研究所に、平成８年９月
１３日付で寄託され、受託番号として、夫々、ＦＥＲＭ
Ｐ−１５８５４、ＦＥＲＭ Ｐ−１５８５５、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５８５６、ＦＥＲＭ Ｐ−１５８５７及びＦ
ＥＲＭ Ｐ−１５８５８が付与されている。
発明は、これら実施例に限定されるものではない。尚、
ハイブリドーマＡＥ−６は平成５年１１月２５日付で生
命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託さ
れている（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９８１）。又、マウスモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、Ｙ
Ｓ３８３及びＹＳ６４４は、工業技術院生命工学工業技
術研究所に、夫々平成７年１２月２６日（ＦＥＲＭ Ｐ
−１５３７４）、平成７年１２月２６日（ＦＥＲＭ Ｐ
−１５３７５）付で寄託されている。又、ＹＳ１８０、
ＹＳ３３７、ＹＳ４６０、ＹＳ７０１及びＹＳ９０３の
５種類のハイブリドーマは、同研究所に、平成８年９月
１３日付で寄託され、受託番号として、夫々、ＦＥＲＭ
Ｐ−１５８５４、ＦＥＲＭ Ｐ−１５８５５、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５８５６、ＦＥＲＭ Ｐ−１５８５７及びＦ
ＥＲＭ Ｐ−１５８５８が付与されている。
【００２５】実施例１ サンドイッチ酵素免疫測定法による１４−３−３タンパ
ク質の測定に適した抗体の組み合わせを見出すために、
１４−３−３タンパク質に対する７種類のマウスモノク
ローナル抗体を用いて次のような実験を行った。
ク質の測定に適した抗体の組み合わせを見出すために、
１４−３−３タンパク質に対する７種類のマウスモノク
ローナル抗体を用いて次のような実験を行った。
【００２６】先ず、７種類のマウスモノクローナル抗体
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に純粋な
標品まで精製し、それぞれについて非標識の抗体とビオ
チン標識した抗体を用意した。抗体のビオチン標識は、
Ｎ−ヒドロキシサクシニミドビオチンを用いる公知の方
法により行った。
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に純粋な
標品まで精製し、それぞれについて非標識の抗体とビオ
チン標識した抗体を用意した。抗体のビオチン標識は、
Ｎ−ヒドロキシサクシニミドビオチンを用いる公知の方
法により行った。
【００２７】５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）により
２μｇ／ｍｌに希釈した７種類の非標識のモノクローナ
ル抗体を９６穴イムノプレートの別々の穴へ７０μｌず
つ分注し、３７℃で１時間静置してそれぞれの抗体をコ
ートした。このようにして７種類のモノクローナル抗体
を別々の穴にコートした後、各穴を３００μｌのＰＢＳ
／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、続いて、３００μｌのＰＢ
Ｓ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡを加えて３７℃にて１時間静置
してブロッキングを行った。ブロッキング後の各穴へ、
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡにより５μｇ／ｍｌの濃度
に希釈した１４−３−３タンパク質溶液を５０μｌずつ
加えて３７℃で１時間静置後、穴を３００μｌのＰＢＳ
／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。
２μｇ／ｍｌに希釈した７種類の非標識のモノクローナ
ル抗体を９６穴イムノプレートの別々の穴へ７０μｌず
つ分注し、３７℃で１時間静置してそれぞれの抗体をコ
ートした。このようにして７種類のモノクローナル抗体
を別々の穴にコートした後、各穴を３００μｌのＰＢＳ
／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、続いて、３００μｌのＰＢ
Ｓ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡを加えて３７℃にて１時間静置
してブロッキングを行った。ブロッキング後の各穴へ、
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡにより５μｇ／ｍｌの濃度
に希釈した１４−３−３タンパク質溶液を５０μｌずつ
加えて３７℃で１時間静置後、穴を３００μｌのＰＢＳ
／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。
【００２８】次に、７種類の非標識抗体を別々にコート
した穴の各非標識抗体ごとの群に対してそれぞれ７種類
のビオチン標識抗体との組み合わせ（即ち、合計７×７
＝４９通りの組み合わせ）が得られるように、ＰＢＳ／
Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡにより１μｇ／ｍｌに希釈した７種
類のビオチン標識抗体を５０μｌずつ添加し、３７℃で
１時間静置した。各穴を３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅ
ｎで３回洗浄した後、ＰＢＳで１００倍に希釈したベク
タステインＡＢＣ−ＰＯキット（ベクター社製）を５０
μｌずつ分注して３７℃にて３０分間静置した。静置
後、各穴を３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄
し、０．３ｍｇ／ｍｌの２，２’−アジノ−ビス（３−
エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウ
ム塩（ＡＢＴＳ）と０．００３％過酸化水素を含む１０
０μｌの基質溶液を加えて室温にて３０分間の酵素反応
を行った。反応液に１００μｌのシュウ酸を加えて酵素
反応を停止した後、４１５ｎｍの吸光度を測定した。測
定結果を表１に示した。
した穴の各非標識抗体ごとの群に対してそれぞれ７種類
のビオチン標識抗体との組み合わせ（即ち、合計７×７
＝４９通りの組み合わせ）が得られるように、ＰＢＳ／
Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡにより１μｇ／ｍｌに希釈した７種
類のビオチン標識抗体を５０μｌずつ添加し、３７℃で
１時間静置した。各穴を３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅ
ｎで３回洗浄した後、ＰＢＳで１００倍に希釈したベク
タステインＡＢＣ−ＰＯキット（ベクター社製）を５０
μｌずつ分注して３７℃にて３０分間静置した。静置
後、各穴を３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄
し、０．３ｍｇ／ｍｌの２，２’−アジノ−ビス（３−
エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウ
ム塩（ＡＢＴＳ）と０．００３％過酸化水素を含む１０
０μｌの基質溶液を加えて室温にて３０分間の酵素反応
を行った。反応液に１００μｌのシュウ酸を加えて酵素
反応を停止した後、４１５ｎｍの吸光度を測定した。測
定結果を表１に示した。
【００２９】
【表１】
【００３０】実施例２ 実施例１の結果をもとに、１４−３−３タンパク質のサ
ンドイッチ酵素免疫測定法に用いる２種類のマウスモノ
クローナル抗体の組み合わせてとして、イムノプレート
にコートするモノクローナル抗体にはＹＳ９０３抗体
を、また、標識するモノクローナル抗体にはＹＳ４６０
抗体を選択し、両抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫測
定法によって濃度を系統的に変化させた一連の標準１４
−３−３タンパク質溶液の測定を行った。測定の結果を
図１に示した。但し、本実施例においては、反応のステ
ップ数を減らして測定の迅速化を図るために、ビオチン
標識したＹＳ４６０抗体の代りにアルカリフォスファタ
ーゼ標識したＹＳ４６０抗体を用いた。
ンドイッチ酵素免疫測定法に用いる２種類のマウスモノ
クローナル抗体の組み合わせてとして、イムノプレート
にコートするモノクローナル抗体にはＹＳ９０３抗体
を、また、標識するモノクローナル抗体にはＹＳ４６０
抗体を選択し、両抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫測
定法によって濃度を系統的に変化させた一連の標準１４
−３−３タンパク質溶液の測定を行った。測定の結果を
図１に示した。但し、本実施例においては、反応のステ
ップ数を減らして測定の迅速化を図るために、ビオチン
標識したＹＳ４６０抗体の代りにアルカリフォスファタ
ーゼ標識したＹＳ４６０抗体を用いた。
【００３１】図１から、これらの抗体を用いたサンドイ
ッチ酵素免疫測定法により数ｎｇ／ｍｌ〜数百ｎｇ／ｍ
ｌの間に測定範囲を有する高感度な測定系が確立され
た。
ッチ酵素免疫測定法により数ｎｇ／ｍｌ〜数百ｎｇ／ｍ
ｌの間に測定範囲を有する高感度な測定系が確立され
た。
【００３２】実施例３ 実施例２に記載のサンドイッチ酵素免疫測定法により、
肺癌組織および正常肺組織の抽出液中に含まれる１４−
３−３タンパク質量を測定した。先ず、組織をハサミで
細切し、３倍量の緩衝液（１ｍＭのＰＭＳＦおよび１ｍ
ＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）を加え、グラス−テフロン
ホモゲナイザーで１０往復ホモゲナイズした。このホモ
ゲネートを更に６０Ｗで２分間ソニケーションした後、
１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して上清を得た。
この上清を肺癌組織および正常肺組織の抽出液として測
定を行い、表２の結果を得た。
肺癌組織および正常肺組織の抽出液中に含まれる１４−
３−３タンパク質量を測定した。先ず、組織をハサミで
細切し、３倍量の緩衝液（１ｍＭのＰＭＳＦおよび１ｍ
ＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）を加え、グラス−テフロン
ホモゲナイザーで１０往復ホモゲナイズした。このホモ
ゲネートを更に６０Ｗで２分間ソニケーションした後、
１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して上清を得た。
この上清を肺癌組織および正常肺組織の抽出液として測
定を行い、表２の結果を得た。
【００３３】
【表２】
【００３４】表２に示す結果から、抽出液中に含まれる
タンパク質の濃度は癌組織と正常組織とで同等であるの
に対し、１４−３−３タンパク質の濃度は癌組織抽出液
中の濃度が正常組織抽出液中の濃度に比べて数倍〜数十
倍高いことが明らかになった。また、この現象は肺癌の
主要な組織型である扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌および
大細胞癌に共通の現象であることも明らかになった。
タンパク質の濃度は癌組織と正常組織とで同等であるの
に対し、１４−３−３タンパク質の濃度は癌組織抽出液
中の濃度が正常組織抽出液中の濃度に比べて数倍〜数十
倍高いことが明らかになった。また、この現象は肺癌の
主要な組織型である扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌および
大細胞癌に共通の現象であることも明らかになった。
【００３５】実施例４ 健常人の血清中および血漿中に含まれる１４−３−３タ
ンパク質を実施例２に記載のサンドイッチ酵素免疫測定
法により測定するための条件を確立した。血清および血
漿を希釈しないで原液のまま本測定系へ添加すると、多
くの酵素免疫測定系においてしばしば観察されるよう
に、本法においても血清および血漿により測定が阻害さ
れる。しかし、この血清および血漿による測定の阻害
は、測定系へ添加する血清および血漿を希釈することに
より通常解消されることが知られている。そこで、先
ず、種々の倍率に希釈した健常人の血清中および血漿中
に含まれる１４−３−３タンパク質の濃度を測定したと
ころ、表３に示したように測定感度以下の濃度であっ
た。次に、種々の倍率に希釈した健常人の血清および血
漿に濃度が既知の標準１４−３−３タンパク質を終濃度
が１０ｎｇ／ｍｌになるように添加し、実施例２の測定
法により１４−３−３タンパク質濃度の測定を行い、添
加した１４−３−３タンパク質の回収率を調べた。
ンパク質を実施例２に記載のサンドイッチ酵素免疫測定
法により測定するための条件を確立した。血清および血
漿を希釈しないで原液のまま本測定系へ添加すると、多
くの酵素免疫測定系においてしばしば観察されるよう
に、本法においても血清および血漿により測定が阻害さ
れる。しかし、この血清および血漿による測定の阻害
は、測定系へ添加する血清および血漿を希釈することに
より通常解消されることが知られている。そこで、先
ず、種々の倍率に希釈した健常人の血清中および血漿中
に含まれる１４−３−３タンパク質の濃度を測定したと
ころ、表３に示したように測定感度以下の濃度であっ
た。次に、種々の倍率に希釈した健常人の血清および血
漿に濃度が既知の標準１４−３−３タンパク質を終濃度
が１０ｎｇ／ｍｌになるように添加し、実施例２の測定
法により１４−３−３タンパク質濃度の測定を行い、添
加した１４−３−３タンパク質の回収率を調べた。
【００３６】
【表３】 サンドイッチ酵素免疫測定法による１４−３−３タンパク質の測定に及ぼす 健常人の血清および血漿の影響（１４−３−３タンパク質の添加回収試験） ─────────────────────────────────── 希釈後の検体中に含まれる １４−３−３ 検体 希釈倍率 １４−３−３タンパク質の タンパク質の 濃度 添加回収率 （ｎｇ／ｍｌ） （％） 血清１ ２倍 感度以下 ０ 血清１ ２０倍 感度以下 ４６ 血清１ ２００倍 ０．２ ８３ 血清１ ２０００倍 ０ ８７ 血清２ ２倍 感度以下 ０ 血清２ ２０倍 ０ ５３ 血清２ ２００倍 ０ ９１ 血漿１ ２倍 感度以下 ０ 血漿１ ２０倍 ０ ６６ 血漿１ ２００倍 ０ ８５ 血漿２ ２倍 感度以下 ０ 血漿２ ２０倍 ０ ５７ 血漿２ ２００倍 ０ ８２ ───────────────────────────────────
【００３７】表３に示した添加回収試験の結果は、１４
−３−３タンパク質のサンドイッチ酵素免疫測定系に２
倍希釈の血清あるいは血漿を添加すると測定は大きく妨
害され、正確な測定結果が得られないが、添加する血清
あるいは血漿を２０倍希釈した場合には１４−３−３タ
ンパク質の添加回収率は約５０％に達し、十分に正確な
測定が可能であることを示している。即ち、これらの試
験の結果から、健常人の血清中および血漿中に含まれる
１４−３−３タンパク質の濃度は数十ｎｇ／ｍｌ以下の
低濃度であるが、疾病により血清、血漿などの体液中の
１４−３−３タンパク質濃度が数十ｎｇ／ｍｌ以上に上
昇した場合には濃度を十分正確に測定でき、１４−３−
３タンパク質濃度の上昇を正しく把握することが可能で
ある。また、本発明の測定法を改良して高感度化すれ
ば、血清あるいは血漿の希釈倍率を上げることができ、
添加回収率を更に高めることができると考えられる。一
般に、酵素免疫測定法においては、用いる酵素と基質の
組み合わせを選択することにより高感度化の達成が可能
であり、本発明の高感度化は容易と考えられる。また、
公知の超高感度酵素免疫測定法に本発明の抗体を適用す
ることによっても、測定の高感度化は可能と考えられ
る。
−３−３タンパク質のサンドイッチ酵素免疫測定系に２
倍希釈の血清あるいは血漿を添加すると測定は大きく妨
害され、正確な測定結果が得られないが、添加する血清
あるいは血漿を２０倍希釈した場合には１４−３−３タ
ンパク質の添加回収率は約５０％に達し、十分に正確な
測定が可能であることを示している。即ち、これらの試
験の結果から、健常人の血清中および血漿中に含まれる
１４−３−３タンパク質の濃度は数十ｎｇ／ｍｌ以下の
低濃度であるが、疾病により血清、血漿などの体液中の
１４−３−３タンパク質濃度が数十ｎｇ／ｍｌ以上に上
昇した場合には濃度を十分正確に測定でき、１４−３−
３タンパク質濃度の上昇を正しく把握することが可能で
ある。また、本発明の測定法を改良して高感度化すれ
ば、血清あるいは血漿の希釈倍率を上げることができ、
添加回収率を更に高めることができると考えられる。一
般に、酵素免疫測定法においては、用いる酵素と基質の
組み合わせを選択することにより高感度化の達成が可能
であり、本発明の高感度化は容易と考えられる。また、
公知の超高感度酵素免疫測定法に本発明の抗体を適用す
ることによっても、測定の高感度化は可能と考えられ
る。
【００３８】実施例５ 実施例３で用いた組織抽出液を用いて、通常のイムノブ
ロット法により肺癌組織およびその周辺正常肺組織中の
１４−３−３タンパク質の測定を行い、図２に示す結果
を得た。この結果は、肺癌組織の抽出液に含まれる１４
−３−３タンパク質の濃度が肺癌組織周辺の正常肺組織
の抽出液に含まれる１４−３−３タンパク質の濃度と比
較して高いことを示しており、実施例３の結果を裏付け
ている。
ロット法により肺癌組織およびその周辺正常肺組織中の
１４−３−３タンパク質の測定を行い、図２に示す結果
を得た。この結果は、肺癌組織の抽出液に含まれる１４
−３−３タンパク質の濃度が肺癌組織周辺の正常肺組織
の抽出液に含まれる１４−３−３タンパク質の濃度と比
較して高いことを示しており、実施例３の結果を裏付け
ている。
【００３９】実施例６ マウスモノクローナル抗体とウサギポリクローナル抗体
を組み合わせて用いたサンドイッチ酵素免疫測定系によ
り標準１４−３−３タンパク質試料を測定し、図３に示
す結果を得た。即ち、先ず、１０μg/mlの濃度に溶解し
たマウス抗１４−３−３タンパク質モノクローナル抗体
ＹＳ４６０をイムノプレートの１穴当たりに１００μｌ
ずつ分注し、室温で２４時間静置して抗体をコートし
た。各穴を３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで２回洗浄
した後、３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡを加
え、室温で２時間静置してブロッキングを行った。ブロ
ッキング終了後の各穴に、濃度が既知の１４−３−３タ
ンパク質溶液をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡで逐次希釈
することにより調製した濃度が異なる一連の１４−３−
３タンパク質溶液を加え、室温で１時間静置した。静置
後、各穴を３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５回洗浄
し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡで１０００倍に希釈し
たウサギ抗１４−３−３タンパク質抗血清を１００μｌ
ずつ加えて室温で１時間静置した。各穴を３００μｌの
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ
／ＢＳＡで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を１００μｌずつ分注して室温
で１時間静置した。静置後、各穴を３００μｌのＰＢＳ
／Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、ｏ−フェニレンジアミンを
基質として室温で３０分間酵素反応を行った。１Ｎ硫酸
を各穴に１００μｌづつ加えて酵素反応を停止後、４９
２ｎｍにおける吸光度を測定し、図３に示す標準曲線を
得た。この結果は、本実施例のサンドイッチ酵素免疫測
定法が数百ｐｇ／ｍｌ〜数十ｎｇ／ｍｌに定量域を有す
る高感度の１４−３−３タンパク質の測定法であり、実
施例２のサンドイッチ酵素免疫測定法と同様に１４−３
−３タンパク質の測定に有用であることを示している。
を組み合わせて用いたサンドイッチ酵素免疫測定系によ
り標準１４−３−３タンパク質試料を測定し、図３に示
す結果を得た。即ち、先ず、１０μg/mlの濃度に溶解し
たマウス抗１４−３−３タンパク質モノクローナル抗体
ＹＳ４６０をイムノプレートの１穴当たりに１００μｌ
ずつ分注し、室温で２４時間静置して抗体をコートし
た。各穴を３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで２回洗浄
した後、３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡを加
え、室温で２時間静置してブロッキングを行った。ブロ
ッキング終了後の各穴に、濃度が既知の１４−３−３タ
ンパク質溶液をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡで逐次希釈
することにより調製した濃度が異なる一連の１４−３−
３タンパク質溶液を加え、室温で１時間静置した。静置
後、各穴を３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５回洗浄
し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡで１０００倍に希釈し
たウサギ抗１４−３−３タンパク質抗血清を１００μｌ
ずつ加えて室温で１時間静置した。各穴を３００μｌの
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ
／ＢＳＡで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を１００μｌずつ分注して室温
で１時間静置した。静置後、各穴を３００μｌのＰＢＳ
／Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、ｏ−フェニレンジアミンを
基質として室温で３０分間酵素反応を行った。１Ｎ硫酸
を各穴に１００μｌづつ加えて酵素反応を停止後、４９
２ｎｍにおける吸光度を測定し、図３に示す標準曲線を
得た。この結果は、本実施例のサンドイッチ酵素免疫測
定法が数百ｐｇ／ｍｌ〜数十ｎｇ／ｍｌに定量域を有す
る高感度の１４−３−３タンパク質の測定法であり、実
施例２のサンドイッチ酵素免疫測定法と同様に１４−３
−３タンパク質の測定に有用であることを示している。
【００４０】
【発明の効果】本発明の１４−３−３タンパク質に対す
る抗体を用いた１４−３−３タンパク質の測定法によ
り、ヒトや動物の血清、血漿、脳脊髄液等の体液中なら
びに組織抽出液中に含まれる１４−３−３タンパク質を
迅速かつ経済的に測定することができ、脳神経系の疾患
や癌の診断が可能となる。
る抗体を用いた１４−３−３タンパク質の測定法によ
り、ヒトや動物の血清、血漿、脳脊髄液等の体液中なら
びに組織抽出液中に含まれる１４−３−３タンパク質を
迅速かつ経済的に測定することができ、脳神経系の疾患
や癌の診断が可能となる。
【図１】２種類のマウスモノクローナル抗体を組み合わ
せた酵素免疫測定法による標準１４−３−３タンパク質
の定量曲線。
せた酵素免疫測定法による標準１４−３−３タンパク質
の定量曲線。
【図２】肺癌組織およびその周辺正常肺組織の抽出液の
イムノブロットにより得られた電気泳動の写真のイメー
ジ。
イムノブロットにより得られた電気泳動の写真のイメー
ジ。
【図３】マウスモノクローナル抗体とウサギポリクロー
ナル抗体を組み合わせた酵素免疫測定法による標準１４
−３−３タンパク質の定量曲線。
ナル抗体を組み合わせた酵素免疫測定法による標準１４
−３−３タンパク質の定量曲線。
１ 分子量マーカー（アミドブラック１０Ｂによるタン
パク染色） ２ 標準１４−３−３タンパク質（アミドブラック１０
Ｂによるタンパク染色） ３ 患者Ａの癌組織抽出液（アミドブラック１０Ｂによ
るタンパク染色） ４ 患者Ａの癌周辺正常組織抽出液（アミドブラック１
０Ｂによるタンパク染色） ５ 患者Ｂの癌組織抽出液（アミドブラック１０Ｂによ
るタンパク染色） ６ 患者Ｂの癌周辺正常組織抽出液（アミドブラック１
０Ｂによるタンパク染色） ７ 標準１４−３−３タンパク質（イムノブロット） ８ 患者Ａの癌組織抽出液（イムノブロット） ９ 患者Ａの癌周辺正常組織抽出液（イムノブロット） １０ 患者Ｂの癌組織抽出液（イムノブロット） １１ 患者Ｂの癌周辺正常組織抽出液（イムノブロッ
ト） １２ １００ｎｇの標準１４−３−３タンパク質（イム
ノブロット） １３ １ｎｇの標準１４−３−３タンパク質（イムノブ
ロット） １４ ０．０１ｎｇの標準１４−３−３タンパク質（イ
ムノブロット）
パク染色） ２ 標準１４−３−３タンパク質（アミドブラック１０
Ｂによるタンパク染色） ３ 患者Ａの癌組織抽出液（アミドブラック１０Ｂによ
るタンパク染色） ４ 患者Ａの癌周辺正常組織抽出液（アミドブラック１
０Ｂによるタンパク染色） ５ 患者Ｂの癌組織抽出液（アミドブラック１０Ｂによ
るタンパク染色） ６ 患者Ｂの癌周辺正常組織抽出液（アミドブラック１
０Ｂによるタンパク染色） ７ 標準１４−３−３タンパク質（イムノブロット） ８ 患者Ａの癌組織抽出液（イムノブロット） ９ 患者Ａの癌周辺正常組織抽出液（イムノブロット） １０ 患者Ｂの癌組織抽出液（イムノブロット） １１ 患者Ｂの癌周辺正常組織抽出液（イムノブロッ
ト） １２ １００ｎｇの標準１４−３−３タンパク質（イム
ノブロット） １３ １ｎｇの標準１４−３−３タンパク質（イムノブ
ロット） １４ ０．０１ｎｇの標準１４−３−３タンパク質（イ
ムノブロット）
Claims (5)
- 【請求項１】 １４−３−３タンパク質を認識する抗体
を一種以上用いることを特徴とする１４−３−３タンパ
ク質測定法。 - 【請求項２】 抗体が、ヒトモノクローナル抗体、マウ
スモノクローナル抗体、マウスポリクローナル抗体また
はウサギポリクローナル抗体であることを特徴とする請
求項１に記載の１４−３−３タンパク質測定法。 - 【請求項３】 ヒトモノクローナル抗体がハイブリドー
マＡＥ−６由来のヒトモノクローナル抗体であり、マウ
スモノクローナル抗体がハイブリドーマＹＳ１８０、Ｙ
Ｓ３３７、ＹＳ３８３、ＹＳ４６０、ＹＳ６４４、ＹＳ
７０１もしくはＹＳ９０３由来のマウスモノクローナル
抗体であることを特徴とする請求項２に記載の１４−３
−３タンパク質測定法。 - 【請求項４】 １４−３−３タンパク質を認識する抗体
を一次抗体及び二次抗体として使用するサンドイッチ酵
素免疫測定法であることを特徴とする請求項１、２また
は３に記載の１４−３−３タンパク質測定法。 - 【請求項５】 イムノブロット法であることを特徴とす
る請求項１、２または３に記載の１４−３−３タンパク
質測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26375896A JPH1090262A (ja) | 1996-09-13 | 1996-09-13 | １４−３−３タンパク質の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26375896A JPH1090262A (ja) | 1996-09-13 | 1996-09-13 | １４−３−３タンパク質の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1090262A true JPH1090262A (ja) | 1998-04-10 |
Family
ID=17393880
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26375896A Pending JPH1090262A (ja) | 1996-09-13 | 1996-09-13 | １４−３−３タンパク質の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1090262A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005100992A1 (ja) * | 2004-04-01 | 2005-10-27 | National University Corporation Chiba University | 脳機能障害性疾患の検査方法、それに用いるタンパク質マーカ、診断薬および診断キット |
| US20100304419A1 (en) * | 2009-05-27 | 2010-12-02 | National Taiwan University | Method for determining the prognosis of gastric cancer |
| CN110726843A (zh) * | 2018-07-16 | 2020-01-24 | 科美诊断技术股份有限公司 | 检测14-3-3eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒及其应用 |
-
1996
- 1996-09-13 JP JP26375896A patent/JPH1090262A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005100992A1 (ja) * | 2004-04-01 | 2005-10-27 | National University Corporation Chiba University | 脳機能障害性疾患の検査方法、それに用いるタンパク質マーカ、診断薬および診断キット |
| US20100304419A1 (en) * | 2009-05-27 | 2010-12-02 | National Taiwan University | Method for determining the prognosis of gastric cancer |
| TWI399541B (zh) * | 2009-05-27 | 2013-06-21 | Univ Nat Taiwan | 檢測一胃癌預後程度的方法 |
| CN110726843A (zh) * | 2018-07-16 | 2020-01-24 | 科美诊断技术股份有限公司 | 检测14-3-3eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒及其应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20040917 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20041019 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20050322 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |