KR19990067153A - 프로스타글란딘 디 신타아제에 특이적인 단일클론항체 - Google Patents

프로스타글란딘 디 신타아제에 특이적인 단일클론항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리포칼린형 프로스타글란딘-디 신타아제(L-PGDS)를 특이적으로 인식하는 단일클론항체와 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마와 상기 단일클론항체에 의해 L-PGDS 또는 질병의 검사방법 및 상기 단일클론항체에 의해 L-PGDS 검사용 키트에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 L-PGDS에 특이적인 단일클론항체를 제공하는 것이다.

Description

프로스타글란딘 디 신타아제에 특이적인 단일클론항체
프로스타글란딘-디(Prostaglandin D)는 생체막의 자극으로 분비된 아라키돈산에 의해 동물조직내에서 합성되는 생물학적 활성물질이며 PGDS에 의해 프로스타글란딘-H(일반적으로 사이클로옥시게나제에 의해 생산되는 프로스타글란딘족의 전구체이다)로부터 생산된다.
현재, PGDS는 두가지 형태가 공지되어 있다. 첫째는 글루타치온-독립형 L-PGDS이고 둘째는 글루타치온-종속형 비장타입 PGDS이다(Shimizu 등, J. Biol. Chem., 254, 5222-5228 (1979); Urade 등, J. Biol. Chem., 260, 12410-12415 (1985) ; Christ-Hazelhof and Nugteren, Biochim. Biophys. Acta, 572, 43-51 (1979) ; Urade 등, J. Biol. Chem., 262, 3820-3825 (1987)). 전자는 뇌, 부고환, 척수, 망막 및 내귀 등의 중추신경계통에 풍부하게 존재한다(Urade 등, J. Biol. Chem., 260, 12410-12415 (1985); Ueno 등, J. Neurochem., 45, 483-489 (1985) ; Urade 등., J. Biol. Chem., 262, 3820-3825 (1987) ; Goh 등., Biochim. Biophys. Acta, 921, 302-311 (1987) ; Tachibana 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7677-7680 (1987)). 그리고 후자는 비장, 골수, 소화기관, 흉선 및 피부를 포함하는 거의 모든 주변 조직에 폭넓게 존재하는 것으로 알려져 있다(Ujihara 등., Arch. Biochem. Biophys., 260, 521-531(1988) ; Ujihara 등., J. Invest., Dermatol., 90, 448-451(1988)).
한편, β-추적물(trace)이라 불리는 단백질은 인간 CSF에서 존재하는 것으로 알려졌으나 그의 생리적인 기능은 밝혀지지 않은채로 남아있다(Causen, J. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 107, 170-172(1961)).
CFS에 특이적인 단백질로 알려져 있는 β-추적물(trace)과 뇌의 질환 또는 특정 질병들(예를들면, 다경화증, 뇌종양, 멕켈씨 증후군 및 파라프로테네미아)과의 상관관계에서 β-추적물(trace) 수준이 상기 질환에 따라 다르게 관찰되었다(Ericsson 등., Neurology, 19, 606-610 (1969) ; Olsson 등., J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 37, 302-311 (1974) ; Link, J. Neurol. Sci., 16, 103-114 (1972) ; Whistsed and Penny, Clinica Chimica Acta, 50, 111-118 (1974) ; 및 Chemke 등., Clinical Genetics, 11, 285-289 (1977)). 그러나, β-추적물(trace)과 상기의 질병 사이의 정확한 상호연관성은 밝혀지지 않았다. 왜냐하면 β-추적물(trace)의 생리적 기능이 아직 밝혀지지 않았고 β-추적물(trace)의 정확한 양(농도)을 측정할 수 있는 도구도 없기 때문이다.
최근, L-PGDS를 암호화 하는 cDNA의 핵산 서열이 보고되었고(Nagata 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4020-4024(1991)), 이에따라 유전자 재조합에 의한 L-PGDS의 생산도 가능하게 되었다. 유전자 재조합에 따라 생산된 L-PGDS의 아미노산 배열이 추정되어 상동성을 알아보기위해 인간 β-추적물(trace)의 N-말단기의 부분적인 아미노산 배열(Kuruvilla 등., Brain Research, 565, 337-340 (1991), Zahn 등., Neuroscience Letters, 154, 93-95 (1993)) 또는 정제한 인간 β-추적물(trace)의 아미노산 배열(Hoffmann 등., J. Neurochem., 61(2), 451-456 (1993))과 비교한바 있으며 더 나아가 다클론항체를 이용하여 면역학적 검사가 수행된 바 있다(Watanabe 등., Biochem. Biophys. Res. Communication, 203, 1110-1116(1994)). 이들 연구결과 β-추적물(trace)의 아미노산 배열은 L-PGDS의 아미노산 배열과 동일함이 밝혀졌다.
중추신경계에서 풍부하게 나타나는 프로스타글란딘-D는, 생리적 작용으로서, 잠을 촉진하는 등 몇가지 중추적 기능의 신경조절자로서 작용한다. 프로스타글란딘-D 신타아제는 잠을 깨우는 활동의 중요한 효소로서 생각되고 있으며(Hayashi, FASEB J., 5, 2575-2581(1991)), 이것은 적어도 컨피턴트 세포로부터 분비된 L-PGDS의 일부가 CSF에 축적된다고 믿고 있다(Watanabe 등., Biochem. biophys. Res. Communication, 203, 1110-1116 (1994)).
따라서, 중추신경계통에서 L-PGDS 분포등의 분석은 중추신경의 질병에 대한 검사에 유용하고, CFS 또는 체액에서 L-PGDS 수준은 중추신경계통의 이상으로 야기되는 그밖의 다른 질병에 대한 조기진단에 있어서 인디케이터로서도 이용될 수 있다. 또한 L-PGDS(또는 β-추적물)는 태아의 성장 진단, 임신능력 등의 시험에 사용될 수 있다. 왜냐하면 이 효소는 정액, 나팔관액 및 양막액 등의 생식기관 유래의 체액에 분포되어 있기 때문이다. 상기의 용도에 적용하기 위하여는 특이적으로 L-PGDS를 인식할 수 있는 항체가 요구된다. 그러나 상기의 요구에 부합되는 특이적 항체는 아직 개발된 바 없다.
본 발명은 중추신경액(CSF)에 풍부하게 존재하는 인간 프로스타글란딘-디 신타아제(이하, L-PGDS라 한다)에 특이적인 단일클론항체와, 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마와, 상기 단일클론항체를 이용한 질병 또는 L-PGDS의 검사방법 및 상기 단일클론항체를 이용한 L-PGDS 검사용 키트에 관한 것이다.
도 1은 SDS-PAGE의 결과를 보여주는 사진도이다.
도 2는 CSF와 정제된 L-PGDS의 웨스턴 블랏팅(Western blotting)과 SDS-PAGE를 나타낸 사진도이다.
도 3은 N-글리카나제로 처리하여 정제한 L-PGDS의 웨스턴 블랏팅의 결과를 나타낸 사진도이다.
도 4는 각 단일클론항체의 에피도프(epitope) 지도이다.
도 5는 (단일클론항체 1B7에 의한) L-PGDS의 눈금곡선(calibration curve) 이다.
도 6은 (단일클론항체 6F5에 의한) L-PGDS의 눈금곡선이다.
도 7은 (일차항체로서 단일클론항체 1B7, 이차항체로서 비오틴화된 다클론항체를 사용하여 샌드위치 ELISA 방법으로 측정한) L-PGDS의 눈금곡선이다.
도 8은 (일차항체로 단일클론항체 6F5와 이차항체로 비오틴화된 다클론항체를 사용하여 샌드위치 ELISA 방법으로 측정한) L-PGDS의 눈금곡선이다.
도 9는 (일차항체로 단일클론항체 1B7과 이차항체로 비오틴화된 다클론항체(A), 비오틴화된 7B5 (B)와 비오틴화된 10A3(C)를 사용하여 샌드위치 ELISA 방법으로 측정한) L-PGDS의 눈금곡선이다.
도 10은 (일차항체로 단일클론항체 10A3과 이차항체로 비오틴화된 다클론항체(A)와 비오틴화된 1B7(B)를 사용한 샌드위치 ELISA 방법에 의한) L-PGDS의 눈금곡선커브이다.
도 11은 (일차항체로 단일클론항체 7F5와 이차항체로 비오틴화된 다클론항체(A)와 비오틴환된 1B7(B)를 사용하여 샌드위치 ELISA 방법으로 측정한) L-PGDS의 눈금곡선이다.
도 12는 L-PGDS를 사용하여 준비한 눈금곡선과 몇개의 샘플를 사용하여 준비한 L-PGDS에 대한 눈금곡선을 나타내는 그림이다.
도 13은 웨스턴 블랏팅한 결과를 나타내는 사진도이다.
도 14는 L-PGDS 측정결과를 보여준다.
도 15는 모노클로날 항체의 의해 정제된 L-PGDS의 SDS-PAGE의 결과를 보여주는 사진도이다.
본 발명의 목적은 L-PGDS을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체와, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마와 단일클론항체를 사용하여 질병 또는 L-PGDS를 검사하는 방법 및 상기 단일클론항체를 사용하여 L-PGDS 검사용 키트를 제공함에 있다.
본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 골수종 세포와 인간 CSF의 주단백질인 L-PGDS로 면역된 동물의 항체를 생산하는 세포를 융합하여 제조한 하이브리도마로부터 L-PGDS를 특이적으로 인식할 수 있는 단일클론항체를 성공적으로 수득하였다.
즉, 본 발명은 특이적으로 L-PGDS를 인식하는 단일클론항체에 관한 것이다. 상기 단일클론항체의 서브클레스는 면역글로블린 G1 또는 면역글로블린 G2를 포함한다. 또한, 본 발명은 골수종 세포와 L-PGDS로 면역된 동물로부터 얻은 항체생산세포와의 세포융합에 의해 상기의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단일클론항체에 의한 L-PGDS의 검사방법 또는 질병(예를들면, 정자감소증)을 검사하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 L-PGDS의 검사를 위한 키트에 관한 것으로서, 본 발명의 키트는 효소로 표지된 상기의 단일클론항체와 기질용액 및 비오틴화물, 효소로 표지된 아비딘과 기질로부터 얻은 상기 단일클론항체를 포함한 시약으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 상기 L-PGDS의 검사용 키트를 이용한 질병(예; 정자 감소증)의 검사방법에 관한 것이다.
이하에서, 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 단일클론항체의 생산
본발명의 L-PGDS에 대한 단일클론항체의 생산은 하기의 단계로 이루어진다.
(1) 항원의 준비, (2) 항체생산세포의 준비와 면역성 부여, (3) 항체-적정 시스템의 확립 (4) 세포융합, (5) 하이브리도마의 선택과 클로닝 및 (6) 단일클론항체의 분리.
이하에서 각 단계를 상세히 설명한다.
(1) 항원의 준비
L-PGDS는 E. coli와 CHO 세포 등의 공지된 cDNA에 의하여 통상의 방법에 따라 대량으로 생산될 수 있다(Nagata 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4020-4024 (1991)). L-PGDS의 생산에 있어서, L-PGDS의 cDNA를 함유한 재조합 DNA를 미생물 내부로 형질전환하고 효소 생산을 위해 배양하였다. 이렇게 생산된 L-PGDS는 통상의 방법에 의해 배양물로부터 정제하였다.
한편, 면역원은 완충용액에 L-PGDS를 녹이고, 보조액을 첨가하여 준비하였다. 보조액은 Freund complete adjuvant, Freund incomplete adjuvant, BCG, Hunter's Titermax(CytRx Corporation), 꽃양신 조개 구멍의 헤모시아닌 함유 오일 등에서 선택한 물질 및 이들의 혼합물이다.
(2) 항체생산세포의 준비와 면역성 부여
상기에서 얻어진 면역원을 항원으로 하여 말, 원숭이, 개, 돼지, 소, 염소, 양, 토끼, 기니피그, 햄스터, 마우스 또는 비둘기, 닭 등의 포유동물에 투여하였다. 특히 바람직하게는, 마우스, 쥐, 기니피그, 토끼 및 염소를 사용한다. 상기 항원은 통상의 면역방법에 따라 i.v, s.c, i.p 방법으로 투여한다. 면역성 부여 기간은 특별히 제한하지는 않지만 항원은 2 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 5회 투여하고 바람직하게는 몇일 내지 몇주간격, 더욱 바람직하게는 1~3주의 간격을 두는 것이 바람직하다. 최종 면역성 부여기간 후에 1 내지 10일, 바람직하게는 2 내지 5일후에 동물로부터 항체 생산세포를 얻었다. 항체 생산세포의 예는 비장세포, 임파선세포, 흉선세포 및 주변혈액세포이고, 일반적으로 비장세포가 가장 바람직하게 사용된다. 마우스의 경우, 한 마리당 0.01~1,000㎍, 바람직하게는, 1~300㎍의 항원을 투여한다.
(3) 항체-적정 시스템의 확립
항체생산세포로부터 얻은 배양액이나 면역화된 동물로부터 얻은 혈청의 항체 적정도를 측정하는 시스템의 확립이 필요하다. 그래서 면역화된 동물의 면역반응수준을 확인하고 필요한 하이브리도마를 융합세포로부터 선택할 수 있다. 예를들면, 항체는 enzyme immunoassay(EIA), radioimmunoassay(RIA), enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 및 fluorescence immunoassay(FIA)와 같은 잘 알려진 방법으로 검사될 수 있다. 항체 검사를 위한 본발명의 방법이 상기의 방법들에 의해 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는, ELISA가 가장 용이하게 사용되고 있다. 통상적으로, L-PGDS을 96-웰 플라스틱 마이크로타이터 판의 각 웰에 넣고 각 웰에 부가된 효소를 고정시킬 수 있도록 실온에 방치한다. 그 다음, 항원으로서의 L-PGDS의 비결합된 사이트를 소혈청 알부민, 태아소혈청, 스킴밀크 또는 젤라틴으로 결합시킨 다음, 항혈청을 phosphate buffer saline(이하, PBS라 한다)으로 희석하거나 융합세포주의 배양액으로 희석하고, 희석된 항혈청을 각 웰에 부가한다. 이어서, 상업적인 2차 항체를 효소 또는 형광물질 또는 비오틴으로 표지하여 각 웰에 첨가하고 염색기질을 첨가한다. 착색수준은 L-PGDS에 대한 항체의 양을 광도계 또는 형광계로 측정하여 결정한다.
(4) 세포융합
골수종세포를 마우스, 레트 및 인간 등으로부터 분리한 항체생산세포와 융합시킨다. 사용된 세포주는 항체생산세포와 융합되며 바람직하게는 융합후 약품에 저항성이 있으며 HAT배지와 같은 선택배지에서 생존된 것으로 만들어진다. 바람직하게는 8-아자구아닌에 대한 저항성이 있는 세포주가 사용된다. 왜냐하면 이러한 세포주는 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트란스퍼라제(HGPRT-)가 부족하여 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지에서 성장할 수 없기 때문이다. 상기 사용된 세포주는 바람직하게는 면역글로블린을 분비하지 않는 세포이다.
상기의 골수종세포의 예는 마우스 골수종세포주로서 하기와 같은 것이다. P3X63Ag8(ATCC TIB-9; Nature, 256, 496-497 (1978)), P3X63Ag8U.1(P3U1)(ATCC CRL-1580; Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7(1978), P3X63Ag8.653(ATCC TIB-18; European J. Immunology, 6, 511-519(1976)), P2/NSI/1-Ag4-1(ATCC CRL-1581; Nature, 276, 269-270(1978)); 레트 골수종 세포주로서는 예를들면 210.RCY.Ag1.2.3(Y3-Ag1.2.3)(ATCC CRL-1631; Nature, 277, 131-133 (1979))와; 예컨대, U-266-AR1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5429(1980), GM 1500(Nature, 288, 488(1980)) 및 KR-4(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6651(1982))와 같은 인간 골수종 세포주이다.
항체생산세포는 비장세포, 임파절세포, 흉선 및 주변혈액세포로부터 얻은 것이다. 요약하면, 항체생산세포는 하기와 같이 준비하였다. 비장, 면역된 동물로부터 채집한 혈액 또는 임프절 또는 흉선 등에서 선택한 조직들을 잘게 찢고 PBS와 같은 버퍼에 현탁시키거나 DMEM, RPMI 1640 및 E-RDF와 같은 배지에 현탁시킨다. 이 세포 현탁액을 샵 200~250 스테인레스 메쉬를 통해 여과하고 원심분리 하여 원하는 항체-생산세포를 얻는다. 그런다음 항체생산세포를 골수종세포와 융합시킨다.
한편, 세포융합전에 항체생산에 알맞은 골수종세포가 선택된다. 항체생산세포 106~108cell/mL를 동물세포성장배지(예를들면, eagle's minimal essentioal medium(MEM), Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), RPMI-1640 medium, E-RDF medium)에서 골수종세포 106~108cell/mL와 1:1~1:10의 비율로 혼합한다. 세포융합을 증폭하기 위하여, 상기 세포들을 예를들어, 1:6의 비율로 혼합하고, 디메틸설폭사이드를 함유한 RPMI-1640 배지내에 융합 증폭제 존재하에 30~37℃의 온도에서 1~15분동안 배양한다. 이 융합증폭제는 평균분자량이 1,000~6,000의 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜 또는 센다이 바이러스이다. 또다른 방법으로는, 항체-생산세포를 상업적인 세포융합장치에서 전기적인 자극(예; electroporation)으로 골수종세포와 세포융합하는 것이다.
(5) 하이브리도마의 선발 및 클로닝
세포융합후 소망하는 하이브리도마를 얻기위해 세포들을 스크린 한다. 선택 배지에서 융합세포들의 선택적 성장을 위하여 하기와 같이 스크리닝 한다. 세포현탁액은 예를들면, 15% 태아소혈청을 함유한 E-RDF 배지에서 5~10배 희석하고 102~106cell/well만큼 마이크로타이타 플레이트의 각 웰에 넣은 후, 선택배지(예; HAT 배지)를 각 웰에 첨가한다. 그 다음 선택배지를 일정기간 후에 새롭게 교체할 때까지 세포배양을 수행한다.
8-아마구아닌-내성 균주와 선택배지(HAT 배지)에서 얻은 골수종세포가 만일 항체생산세포와 융합에 실패한다면 골수종세포는 시험관내 배양에서 약 7일내에 죽을 것이며 항체생산세포는 10일내에 죽을 것이다. 그러므로, 하이브리도마는 배지에서 10일후 성장을 시작한 세포들로부터 얻을 수 있다.
하이브리도마는 L-PGDS에 대한 항체의 존재하에 그들의 상청액을 검사하므로서 원하는 하이브리도마를 스크린한다. 이 스크리닝 단계는 통상적인 방법으로 수행할 수 있다. 예를들면, 각 웰에서 성장한 하이브리도마로부터 얻은 상청액(첫째 항체)을 이로써 고정된 L-PGDS과 함께 각 웰에 부가한다. 이어서, 라벨된 2차항체를 각 웰에 부가하고 배양한 다음 2차항체의 바인딩 능력을 효소면역분석법(EIA, ELISA), RIA 등으로 검사한다.
더욱 상세하게는, 하이브리도마의 스크리닝은 다음과 같이 수행한다. 면역원으로서 사용된 천연 또는 재조합 L-PGDS를 96-웰 마이크로타이터 플레이트상에 고정시킨다. 단일클론항체가 함유된 배지 상청액을 각 웰에 부가하여 고정된 항원과 반응시키면 항원-결합된 단일클론항체가 만일 있다면 다른 항체(효소로 라벨된 항-면역글로블린 항체)와 반응한다. 또 다른 방법으로서, 상기 고정된 단일클론항체를 바이오틴화된 항-면역글로블린 항체와 효소-라벨된 아비딘과 함께 반응시키고, 최종적으로, 각 웰에 효소 기질용액을 첨가하여 염색한다. 각 웰에서 배지 상청액이 염색된 하이브리도마는 고정된 천연 또는 재조합 L-PGDS를 함유한 것으로 L-PGDS와 결합할 수 있는 능력을 가진 항체를 생산한다.
이러한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마는 제한 희석액, 소프트 아가 클로닝, 피브린 겔 클로닝 및 형광 자극 세포를 포함한 통상적인 방법으로 클로닝된다.
(6) 단일클론 항체의 분리
상기 하이브리도마로부터, 단일클론항체는 세포배양방법, ascites 삼출방법 등과 같은 통상적 방법에 따라 분리할 수 있다.
첫째 세포배양방법에 있어서, 하이브리도마를 10~20% 소혈청을 함유하거나 함유하지 않은 RPMI-1640, MEM 또는 E-RDF 배지에서 통상적인 배양조건인 5% CO2하, 37℃에서 2~14일간 배양한다.
둘째 아사이트 삼출방법에 있어서는, 프리스테인(2,6,10,14-테트라메틸펜타데카인)과 같은 미네랄 오일을 골수종을 분리해낸 동물 및 이와 동종의 포유동물에 i.p로 투여한다. 그런다음 하이브리도마 1x107~1x109 세포를, 바람직하게는 5x107~1x109 세포를 동물에 i.p로 투여하여 대량으로 동물에서 성장시킨다. 1~4주후, 바람직하게는 2~3주후, 아사이트액 또는 혈청을 동물로부터 채취한다.
만일 아사이트액 또는 혈청으로부터 항체를 정제하려면 황산암모늄법, 이온 교환 크로마토그래피(예; DEAE cellulose), protein A Sepharose상의 affinity chromatography, 겔 여과법의 단독 또는 몇가지의 조합방법과 같은 통상적인 방법에 의해 정제한다.
2. 본 발명의 단일클론항체에 의한 L-PGDS 검사 방법
본 발명에 따른 L-PGDS 검사방법은 상기 단일클론항체를 사용하여 하기와 같이 수행한다.
96-웰 마이크로타이터 플레이트를 CSF, 혈청 등과 같은 희석된 샘플로 코팅하고, 0.2% 젤라틴을 함유한 PBS로 블록시킨다. 이어서, 효소로 표지된 본 발명의 단일클론항체를 각 웰에 부가하고 배양한다. 또다른 방법으로서, 비오틴으로 표지된 단일클론항체를 각 웰에 부가하고, 플레이트를 세척한 후 효소가 표지된 avidin 또는 streptoavidin을 각 웰에 부가한 다음 플레이트를 한번더 인큐베이트 한다. 그 다음, 플레이트를 세척하고 염색물질인 ABTS(2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤조티아졸린-6-설포닐산))를 각 웰에 첨가한다. L-PGDS는 측색법에 따른 색상검정에 의해 결정된다.
본 발명의 다른 구체적 방법에 있어서, 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 본 발명의 희석된 단일클론항체로 코팅하고, 0.2% 젤라틴을 함유한 PBS로 블록시킨다. 그리고나서, CSF, 혈청 등과같은 희석된 샘플을 각 웰에 부가한 후 배양한다. 플레이트를 세척한 후에 다른 효소-라벨된 단일클론항체 또는 다클론항체 용액을 각웰에 부가한 후 배양한다. 또 다른 방법으로, 비오틴으로 라벨된 단일클론항체 또는 다클론항체를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 세척한 후 효소-표지된 아비딘 또는 스트렙토아비딘을 각 웰에 첨가하고 한번더 플레이트를 인큐베이트한다. 그리고나서, 플레이트를 세척하고 ABTS(2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤조티아졸린-6-설포닐산))와 같은 염색물질로 세척한다. L-PGDS는 측색법에 따라 색상을 검색하여 결정한다. 또한, 상기방법으로 L-PGDS 검사 및 정량도 가능하다.
3. 본 발명의 단일클론항체에 의한 L-PGDS 측정을 위한 시약
본 발명의 단일클론항체는 L-PGDS의 측정을 위한 시약으로서 유용하다. 왜냐하면 그것은 L-PGDS에 특이적으로 결합하기 때문이다. 더욱이, 본 발명의 단일클론항체는 항원으로서 L-PGDS뿐만 아니라 동물의 기관, 조직, 세포, 체액 같은 생물학적 샘플에서 L-PGDS 뿐만 아니라 L-PGDS의 항원결정기와 같은 유사항원의 분포 및 존재를 결정하는데 유용한 시약이다. 그러므로, 본 발명의 항체는 상기와 같은 측정과 진단에 유용한 시약이다. 인간의 기관, 조직, 세포 및 체액에서 L-PGDS의 검사 또는 측정은 EIA, ELISA, RIA, FIA, Western blot technique 및 면역조직화학 등과 같은 질적 양적 측정으로 가능하다.
4. L-PGDS 검사용 키트
본 발명의 키트는 효소를 검사용 라벨로 사용하는 경우라면 하기의 성분을 포함한다.
(1) 효소로 라벨된 단일클론항체; (2) 기질
본 발명의 키트가 샌드위치 ELISA 방법으로 사용하는 경우라면 하기의 성분을 포함한다.
(1) 단일클론항체; (2) 효소로 라벨된 단일 또는 다클론항체; 및 (3) 기질
본 발명의 키트가 비오틴-아비딘 방법으로 사용하는 경우라면 하기의 성분을 포함한다.
(1) 비오틴화된 단일클론항체; (2) 효소로 라벨된 아비딘 또는 스트렙토아비딘 및 (3) 기질
본 발명의 키트가 샌드위치 ELISA와 바이오틴-아비딘 방법으로 사용하는 경우라면 하기의 성분을 포함한다.
(1) 단일클론항체; (2) 비오틴화된 단일클론 또는 다클론항체; (3) 효소로 표지된 아비딘 또는 스트렙토아비딘 및 (4) 기질
상기 성분에서 "단일클론항체"는 본 발명의 단일클론항체를 의미하고, "다클론항체"는 L-PGDS로 면역된 동물로부터 추출한 혈청에 포함된 항체를 의미하며, 이는 하기의 방법에 따라 제조한다.
(1) 항원의 준비
L-PGDS는 E. coli와 CHO세포 등을 이용하여 이의 공지된 cDNA로 통상의 방법에 따라 다량 생산할 수 있다(Nagata 등., proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4020~4024 (1991)). L-PGDS의 생산을 위해, L-PGDS의 cDNA를 포함한 재조합 DNA를 구축하여 미생물 내부에서 형질전환한 후 이 형질전환체를 배지에서 배양하여 효소를 생산한다. 생산된 L-PGDS는 통상의 방법에 따라 배양물로부터 정제한다.
상기에서 얻어진 L-PGDS를 완충용액에 녹이고, 이에 보조액을 부가하여 면역원을 만든다. 보조액의 예는 Freund complete adjuvant, Freund incomplete adjuvant, BCG, Hunter's Titermax(CytRx Corporation), 헤모시아닌 함유 오일 마개구멍 꽃양산 조개 등에서 선택된 단일물질 또는 이들의 혼합물이다.
(2) 면역성 부여 및 혈액의 준비
상기에서 얻어진 면역원을 말, 원숭이, 개, 돼지, 소, 염소, 양, 토끼, 기니피그, 햄스터 및 마우스 또는 비둘기와 닭 같은 조류에 투여한다. 바람직하게는, 마우스, 래트, 기니피그, 토끼 및 염소를 사용한다. 선택된 동물에 i.v., s.c., 또는 i.p 등의 방법으로 면역원을 투여한다. 면역성 부여기간은 특별히 제한하지는 않지만 면역원은 2 내지 10번, 바람직하게는 2 내지 5번 투여하고 투여기간은 수일에서 수주이며 바람직하게는 1~3주 간격이 바람직하다.
면역된 동물로부터 채취한 혈액에서 분리된 항체타이터는 상기 실험예(3) 1.단일항체의 생산의 방법에 따라 결정한다. 높은 항체타이터를 가진 혈액 샘플을 4℃하에 방치하고 다클론항체를 포함한 혈청을 원심분리한다.
만일 혈청으로부터 다클론항체의 정제가 필요하다면 황산암모늄법, DEAE cellulose, protein A Sepharose상의 affinity chromatography, 분자량과 구조에 따라 분자를 분리하는 여과법을 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 다양한 질병들이 L-PGDS의 검사를 위한 본 발명의 키트를 사용하여 진단될 수 있다. 예를들면, 정자감소증은 단일클론항체를 사용한 본 발명의 키트에 의해 신속하고 정확하게 진단될 수 있다.
본 발명의 단일클론항체는 또한 L-PGDS의 정제에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 단일클론항체는 아가로즈, 셀룰로오즈, 아크릴아마이드 겔 및 일반적으로 유용한 자력으로 만든 친화성 담체와 결합시킨 후 세척한다. L-PGDS는 컬럼으로부터 적절한 용매 또는 완충용액을 사용하여 고율로 용이하게 용출하여 정제될 수 있다.
이하, 본원 발명은 실시예를 들어 좀더 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 모노클로날 항체의 생산
실험예 1. 항원의 준비
유전공학기술에 의해 항원으로서 L-PGDS를 준비하였다. E.coli내 항원의 발현과 정제를 위해 A GST 유전자 융합 시스템(Pharmacia)을 사용하였다. GST 단백질과 L-PGDS을 융합시키기위해 하기의 절차를 수행하였다.
하기의 방법에 따른 중합효소 연쇄반응(polymerlase chain reaction; PCR)으로 L-PGDS의 N-말단기 부위를 암호화 하는 cDNA를 증폭하여 185bp의 산물을 얻었다.
사용된 프라이머 염기서열
Ec23ALA: 염기서열 ID NO:1
78NMUTA: 염기서열 ID NO:2
PCR 반응은 Taq 폴리머레이즈(Takara Shuzo Co., Ltd), 제한효소 EcoR1과 XhoI 그리고 T4 DNA 리가아제(Takara Shuzo Co., Ltd)를 사용하여 수행하였고, 1사이클 반응은 94℃에서 5초, 45℃에서 3초, 72℃에서 5초동안 수행하며, 이를 28차례 반복하였다.
이들 프라이머의 결합으로, 152에서 327 위치(시그널 염기서열을 제외한 완숙한 단백질의 아미노산 염기서열상의 N-terminal(알라닌)과 81번위치(세린)사이의 부분적 아미노산 서열에 해당하는 구아닌(G)에서 사이토신(C)까지) 사이의 부분 염기서열은 증폭되었고 EcoRI site가 5'-terminal에 도입되었다. 상기의 PCR 산물은 238위치에 XhoI site를 가졌기 때문에 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 절단되어 서브클로닝되었다. 본래의 L-PGDS(Nagata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4020-4024(1991))의 cDNA에 상응하는 N-terminal 부위의 서브클로된 산물에 의해 재배치되어 재조합 DNA가 얻어졌다. 상기 재조합 DNA는 GST융합 단백질에 대해 선택된 벡터 pGEX-2T(Pharmacia)의 EcoRI site내에 삽입되었다.
이와는 달리, 521bp산물은 아래와 같이 수행된 PCR에 의해 L-PGDS의 전체 성숙한 단백질을 암호화하는 cDNA 부위를 증폭하여 얻었다.
사용된 프라이머 염기서열은
전진(forward) 프라이머: 염기서열 ID NO:3
역전(reverse) 프라이머: 염기서열 ID NO:4
PCR은 한 사이클을 94℃에서 5초, 45℃에서 3초, 72℃에서 5초에서 Taq 폴리머레이즈(Takara Shuzo)를 사용하여 수행하고 28차례 반복하였다. 이들 프라이머의 결합으로, 152와 656사이 위치(시그널 염기서열이 제외된 성숙한 단백질의 아미노산 염기서열상의 N-terminal(알라닌)과 81위치(세린)사이의 부분적 아미노산 서열에 상응하는 구아닌(G)에서 사이토신(C)까지)가 증폭되었고, 5'-terminal에 BamHI site가 도입되었고, 3'-terminal에 EcoRI site가 도입되었다. 증폭된 DNA는 GST융합 단백질을 위한 벡터 pGEX-2T(Pharmacia)의 EcoRI/BamHI내에 삽입되었다.
GST-L-PGDS융합 단백질의 발현벡터는 통상의 방법으로 E.coli DH5α 또는 JM09내에서 형질전환시켰다. 형질전환체에 의해 생산된 융합단백질은 친화 크로마토그래피 비드(Phamarcia)상의 선택적 흡수와 대규모 제조법에 의한 트롬빈의 용출에 의해 확인하였다. 상기 방법으로, 형질전환체 100mL 배양으로부터 약 2mg의 L-PGDS를 얻었다. 2개의 독립적인 클론(E.coli DH5α/pGDS2와 E.coli DH5α/pGDS7)에 의해 생산된 단백질은 10 ~ 20% gradient gel상의 SDS-PAGE로 분석하였다. 실험결과는 도 1에 나타냈다. 도 1에서, 레인 1은 분자량 마커의 밴드를 나타내고; 레인 2 에서 5는 상기 클론들 중의 하나이며, 레인 6에서 9는 다른 클론을 나타낸다. 레인 2와 6은 각 클론의 homogenate이고, 레인 3과 7은 affinity column상에 흡수되지 않은 분획들이며, 레인 4와 8은 트롬빈으로 용출된 분획들이고 레인 5와 9는 글루타치온을 함유한 완충용액으로 용출된 분획들이다. 레인 2와 6내서, 약 45kDa 분자량에 상응하는 밴드가 융합단백질이고 이 밴드는 GST-비결합 분획들(레인 3과 7)내에서 거의 관찰되지 않았다. 글루타치온으로 용출된 분획(레인 5와 9)은 융합 단백질 밴드와 트롬빈에 의해 용출되지 않은 GST 밴드(분자량 25kDa)를 나타낸다.
상기 SDS-PAGE의 결과에 따라, GST와 함께 용출된 L-PGDS는 분자량 45kDa의 융합 단백질의 형태로 E.coli내에서 생산되었다. 트롬빈으로 용출된 분자량 20kDa의 단백질(레인 4와 8)은 L-PGDS로 추측되었다.
실험예 2. 항체 생산세포의 준비
상기 실험예1에서 얻은 L-PGDS 500㎍을 포함하는 0.5mL 용액을 Freund complete adjuvant 0.5mL와 혼합하고 3 내지 5분동안 유화시켰다. 항원으로, 상기의 100㎕의 유화액을 BALB/C 마우스의 꼬리에 s.c.로 투여하였다. 첫번째 면역부여후 3주후에, 상기의 항원 유화액과 동량의 Freund incomplete adjuvant를 함유한 다른 항원을 마우스에 i.p.로 추가 투여하였다. 두번째 면역후 3주후에 항원 100㎍(100㎕ 항원/200㎕ PBS)을 각 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다. 마지막 면역 후 3일후에 면역화된 마우스의 비장을 취하여 E-RDF 배지내에서 파쇄하여 세포 현탁액을 만들었다.
실험예 3. 세포융합
현탁된 1 x 108 비장세포를 Oi와 Herzenberg의 방법(세포 면역학에서 선택된 방법. 351-371, W. H. Freeman ＆ Co., USA press, 1980)에 따라 50%(w/v) PEG(분자량 1,500, Boehringer Mannheim)에 P3-X63-Ag8-U1(P3-U1) 또는 P3-X-63-Ag8. 653를 함유한 1 x 107 마우스 골수종 세포와 세포융합시켰다.
실험예 4. 융합세포의 선발
상기 Oi 등이 제시한 방법에 따라, 소망하는 융합세포를 1.36mg/㎗의 하이포크산틴, 19.1㎍/㎗의 아미노프테린, 387㎍/㎗ 티미딘, 10% 태아소혈청 및 5% 오리겐 HCF(IGEN)을 함유한 E-ROF 배지, 즉 HAT 배지(예를들면, E-RDF 배지)에서 선발하였다.
실험예 5. 단일클론항체의 선발
15웰내의 항체-양성 세포를 최소한 두차례 반복 희석하여 클로닝하였다. 그 결과, 6개 클론을 배양하여 L-PGDS에 대한 특이적 단일클론항체 생산을 위한 균주로 하기와 같이 제공되었다.
1 x 107 하이브리도마 세포를 10% 태아소혈청과 함께 50㎖ E-RDF를 함유한 225cm2의 플라스크내에서 5% CO2와 함께 4일동안 37℃에서 배양하였다. 결과로 생산된 6개의 세포주중 5개를 선별하였다. 실험결과는 하기 표 1과 같다.
항원 총 웰의수 세포성장 웰의수 항체 양성 웰의 수 항체 확립 웰의 수
hPGDS 960 778 15 6
주; hPGDS는 인간 리포칼린형 프로스타글란딘-디 신타아제이다.
상기 표 1에서 "성장 웰의 갯수"는 HAT 선택배지내에서 선별 배양되어 성장한 융합세포의 웰 갯수의 평균이다. "항체 양성 웰의 갯수"는 상기 실시예 1에서 준비한 항체를 사용한 ELISA에 의해 확인된 항체가 생성된 웰의 갯수이다. 그리고 "항체 확립 웰의 갯수"는 클로닝결과 특정 항체를 생산하는 하이브리도마가 확인된 웰의 갯수이다. 선별된 5개 세포주는 각각 1B7, 6F5, 7F5, 9A6 및 10A3으로 나타냈다. 이들 세포주에 의해 생산된 항체들도 상기와 같이 구분하였다. 세포주 1B7, 7F5, 9A6, 10A3는 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology(Higashi 1-1-3, Tsukuba City, Ibaragi Pref., Japan)에 각각 FERM BP-5709(원기탁일: 1995년 9월 21일), FERM BP-5710(원기탁일: 1995년 9월 21일), FERM BP-5711(원기탁일: 1996년 6월 6일), FERM BP-5712(원기탁일: 1996년 6월 6일), FERM BP-5713(원기탁일: 1996년 6월 6일)로 기탁하였다.
실험예 6. 단일클론항체의 생산
상기 실험예 5.에서 선별된 각 세포주 1B7, 6F5, 7F5, 9A6 및 10A3를 마우스들에게 i.p.로 투여하고, 남은 세포주 6B9를 마우스들에게 i.p로 투여하였다. 요약하면, 1mL 프리스테인을 각 마우스에 대해 i.p로 투여하고 2주후, 1 x 108 하이브리도마 세포를 마우스의 복막내부에 접종한 후 2주 경과하여 마우스로부터 나타난 병리적 증상을 수집하였다. 수집된 병리적 증상을 통상적인 방법에 따라 프로테인 A에 친화력이 있는 affinity Column 크로마토그라피에 적용시켰다. 실험결과, 3 내지 10mg/mL의 L-PGDS에 대한 항체가 얻어졌다. 이형체 키트(RPN19, AMERSHAM)를 사용하여 1B7, 6F5의 항체는 형태상 IgG1 서브클레스에 속하고 λ light chain을 가진다는 것을 확인하였다.
실시예 2: 단일클론항체의 성질
실험예1. ELISA에 의한 Specificity 검증
96-웰의 마이크로타이터 플레이트를 다양한 형태의 L-PGDS로 코팅하고 0.2% 젤라틴이 함유된 PBS로 블록킹시켰다. 블록킹시킨 후 상기 실시예 1(단일클론항체선별)에서 얻은 항체 6개를 각각 각 웰에 대해 50㎕의 항체용액을 첨가한 후 ELISA내의 특이적 반응을 검사하였다. 실험결과는 표 2에 나타냈다.
antigen 1B7 6B9 6F5 7F5 9A6 10A3
E.Coli antigen O O O O O O
E.Coli lysate X X X X X X
CHO antigen O O O O X O
CSF antigen O O O X X X
주; O: 재활성이 관찰됨, X: 재활성이 관찰되지 않음
상기 표2에 표시된 항원들은 하기와 같다.
E.coli antigen은 E.coli에서 발현되어 affinity chromatopraphy에 의해 정제되었고, E.coli lysate는 L-PGDS cDNA를 포함하지 않는 벡터(음성 대조군)이며, CHO antigen은 CHO 세포내에서 발현되고 통상의 방법으로 정제된 것이며, CSF antigen은 통상적인 방법에 의해 CSF로부터 정제된 것이다.
또한, 상기 표 2의 결과에 의하면 최소한 3개의 항체 1B7, 6B9, 6F5가 특이적으로 L-PGDS 자체를 인식한다는 것을 알 수 있었다.
실험예 2. 웨스턴 블랏팅에 의한 specificity 검정
상기 항원들을 16% 아이소크라틱 겔상의 SDS-PAGE에 전기영동한 후 5종류의 항체를 사용하여 웨스턴 블랏팅 분석을 실시하였다. 실험결과는 표3에 나타냈다.
antigen 1B7 6B9 6F5 9A6 10A3
E.Coli antigen O O O O O
E.Coli lysate X X X X X
CHO antigen O O O X O
주; O: 표시가 관찰됨, X:표시가 관찰되지않음
웨스턴 블랏팅후에 염색에 의해 얻어진 면역 결과를 나타내는 시그널은, 프로스타글라틴 D 신타아제의 분자량(약 20 내지 30kDa)에 상응하는 위치에서 검출되었다. 그러므로, 상기 시그널을 나타내는 항원은 프로스타글란틴 D 신타아제에 특이적임을 알 수 있었다.
도 2는 CSF 항체와 CSF자체를 사용한 웨스턴블랏 분석의 결과를 나타낸다.
각 레인 A는 CSF 2㎕가 적용된 것을 나타낸다. 각 레인 B는 CSF로부터 정제된 L-PGDS(CSF 항원) 50ng가 적용된 것을 나타낸다. 은 염색은 CSF 내의 수많은 단백질들을 나타낸다. 그리고 정제된 L-PGDS는 약 27kD의 분자량에 해당하는 폭넓은 밴드를 나타낸다. 각 단일클론항체는 웨스턴 블랏팅에 사용되었다. 실험결과, 모든 단일클론항체(1B7, 6B9, 6F5, 7F5, 9A6, 10A3)들은 오로지 정제된 L-PGDS(레인 B)에 상응하는 단일 프로테인(레인 A)에 대해서만 재활성이 있다는 것으로 밝혀졌고, 이들 항체들은 CSF내의 다른 오염물질에 대해서는 재활성이 없고 특이적으로 L-PGDS을 인식하는 것으로 확인되었다. 부가하여, 정제된 L-PGDS를 N-글리카나제로 처리하여 웨스턴 블랏분석에 적용시켰다. 그 결과는 도 3에 나타냈다. 각 레인 A는 글리카나아제로 처리된 샘플을 나타내고 각 레인 B는 글리카나제로 처리되지 않은 샘플을 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이 1B7, 6B9, 6F5, 7F5 및 10A3의 경우에는 글리카나제로 처리된 전과 후의 밴드 농도에 있어서 분명한 차이는 없었다. 다만, 9A6의 경우에는 밴드의 강도가 클리카나제 처리후에 크게 증가하였다. 이는 9A6가 글리코실레이션 부위 또는 그 주변을 인식함을 의미한다.
다음에는, 각 단일클론항체의 이형체를 마우스 단일클론항체 키트(RPN29, Amersham)를 사용하여 측정하였다. 실험결과는 표 4에 나타냈다. 또한, E.coli 항원과 CSF 항원에 대한 이들의 Kd값을 Friguet 등의 방법(J. Immunol. Methods, 77, 305-319)에 따라 측정하였다. 그 결과는 표 4에 나타냈다.
monoclonal antibody immunoglobulin subclass dissociation constant(nM)E.coli antigen CSF antigen
1B7 IgG1(λ) 5.4 3.9
6B9 IgG1(κ) >1000 >1000
6F5 IgG1(λ) 13.2 10.3
7F5 IgG1(κ) 0.65 4.1
9A6 IgG2a(κ) 7.42 >1000
10A3 IgG1(κ) 0.53 3.9
상기 표4에서 볼 수 있듯이, 1B7, 6F5, 7F5, 10A3는 E.coli항원과 CSF 항원에 대해 높은 친화력을 보여주었고 이들 모노클로날 항체는 native L-PGDS 분자의 표면을 인식함을 확인할 수 있었다. 9A6은 E.coli항원에 대해서는 높은 친화력을 보여주지만 CSF 항체에 대해서는 재활성을 거의 나타내지 않았다. 이 결과는, 도 3의 결과와 함께 9A6가 글리코실레이션 또는 그 주변을 인식함을 시사하였다. 6B9는 도 2에보는 바와같이, 웨스턴 블랏팅에서 재활성을 나타냈지만 E.coli 항원 또는 CSF 항원에 대해서는 재활성이 없었다. 이 결과는 6B9가 L-PGDS의 변성된 분자를 인식함을 시사하였다. 또, L-PGDS의 부분적 N-terminal 아미노산 서열을 단계적으로 절단하여 돌연변이주를 준비하고 이를 단일클론항체의 에피토프 지도작성을 위한 항원으로 사용하였다.
이 실험에 사용된 PCR 프라이머는 하기에서 보인 바와 같으며 그 결과는 도 4에 나타냈다. 실험에 사용된 항원은 트롬빈으로 처리하지 않고, 1% SDS내에서 열탕처리한 GST와 함께 융합단백질을 형성하여 회수한 L-PGDS산물을 제외하고는 근본적으로 실시예 1과 동일한 방법으로 준비하였다.
전진 프라이머 A(아미노산 1~7): SEQ ID NO: 3.
전진 프라이머 B(아미노산 7~12): SEQ ID NO: 5.
전진 프라이머 C(아미노산 13~18): SEQ ID NO: 6.
전진 프라이머 D(아미노산 30~35): SEQ ID NO: 7.
전진 프라이머 E(아미노산 52~57): SEQ ID NO: 8.
전진 프라이머 F(아미노산 68~73): SEQ ID NO: 9.
전진 프라이머 G(아미노산 85~90): SEQ ID NO: 10.
전진 프라이머 H(아미노산 99~105): SEQ ID NO: 11.
전진 프라이머 I(아미노산 118~123): SEQ ID NO: 12.
전진 프라이머 J(아미노산 52~57): SEQ ID NO: 13.
전진 프라이머 K(아미노산 52~57): SEQ ID NO: 14.
역전 프라이머 (아미노산 163~168): SEQ ID NO: 4.
도4는 7F5 및 10A3는 Ala1~Val6; 9A6, Gln13~Asn29;6F5, Tyr85~Val98; 1B7 및 6B9, Gly118~Pro133을 나타낸다.
실험예 3. 칼리브레이션 커브의 준비
상기 E.coli 항원은 L-PGDS에 대한 칼리브레이션 커브 작성을 위해 사용되었다. 사용된 단일클론항체는 상기에서 사용된 1B7과 6F5이었다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 희석된 E.coli 항원으로 코팅하고 0.2% 젤라틴이 함유된 PBS로 차단하였다. 차단후, 비오틴화된 단일클론항체 1B7 또는 6F5를 각 웰에 부가하고 인큐베이트 하였다. 그리고나서, 플레이트를 세척하고 스트렙토아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 접합체를 각 웰에 부가한 후 인큐베이트 하였다. 플레이트를 세척하고 ABTS(2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤조티아졸린-6-설포닐산)) 염색기질을 각 웰에 부가한 후, L-PGDS는 측색법에 의해 색상을 측정하므로서 결정했다. 그 결과, 1B7 및 6F5 각각을 도5 및 도6에 나타냈다.
이어서, 샌드위치 ELISA 측정법으로 L-PGDS의 눈금곡선을 측정하였다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 희석된 단일클론항체 1B5 또는 6F5로 코팅하고 0.2% 젤라틴이 함유된 PBS로 차단하였다. 차단후 희석된 E.Coli 항원을 각 웰에 부가하고 인큐베이트 하였다. 그후, 플레이트를 세척하고 비오틴화된 다클론항체를 각 웰에 부가한 후 인큐베이트 하였다. 그리고나서, 플레이트를 세척하고 스트렙토아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 접합체를 각 웰에 첨가한 다음 인큐베이트 하였다. 각 플레이트를 세척하고 ABTS(2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤조티아졸린-6-설포닐산)) 염색기질을 각 웰에 부가한 후 L-PGDS는 측색법에 의해 색상을 측정하므로서 결정했다. 그 결과는 1B7과 6F5 각각을 도7 및 도8에 나타내었다. 도5~8로부터 샌드위치 ELISA 방법을 사용하여 10배 더 민감한 결과를 얻을 수 있었다.
본 발명의 다른 실시예는, 샌드위치 ELISA 방법 및 비오틴화된 다클론 또는 단일클론 항체를 눈금커브의 준비를 위해 사용했다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 희석된 단일클론항체 1B7, 10A3 또는 일차항체로서 7F5로 코팅하고, 0.2% 젤라틴을 함유한 PBS로 차단하였다. 이어서, 희석된 E.coli 항원을 각 웰에 첨가하고 인큐베이트 하였다. 그러고 나서, 플레이트를 세척하고 비오틴화된 다클론항체 또는 비오틴화된 단일클론항체 1B7, 7F5 또는 10A3을 2차 항체로서 각 웰에 첨가하고 인큐베이트 하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고 스트렙토아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 접합체를 각 웰에 첨가한 후 인큐베이트 하였다. 각 웰을 세척하고 ABTS(2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤조티아졸린-6-설포닐산)) 염색기질을 각 웰에 첨가한 후, L-PGDS는 측색법에 의해 색상을 측정하므로서 결정했다. 그 결과는 도9~도11에 나타냈다.
도9는 일차항체로 1B7 단일클론항체를 사용한 눈금커브이며 커브 A는 2차항체로서 비오틴화된 다클론항체를 사용한 눈금커브이고, 커브 C는 2차항체로서 비오틴화된 10A3을 사용한 눈금커브이다.
도10은 1차항체로서 10A3 단일클론항체를 사용한 결과 눈금커브이고, 커브 A는 2차항체로서 비오틴화된 다클론항체를 사용한 눈금커브이며, 커브 B는 2차항체로서 비오틴화된 1B7을 사용한 눈금커브이다.
도11은 1차 항체로서 7F5 단일클론항체를 사용한 눈금커브이고, 커브 A는 2차항체로서 비오틴화된 다클론항체를 사용한 눈금커브이고, 커브 B는 비오틴화된 1B7을 2차 항체로 사용한 눈금커브이다.
도9~도11은 1차항체로서 10A3 또는 7F5를 사용하고 2차항체로서 비오틴화된 다클론항체 또는 비오틴화된 단일클론항체 1B7을 사용하여 높은 민감도를 나타낸 것을 보인 것이다.
실시예 3. 다양한 인간조직으로부터 분리된 L-PGDS의 검사
실험예 1. CSF에서 L-PGDS의 검사
96-웰 마이크로타이터 플레이트를 희석된 단일클론항체 1B7 또는 6F5로 코팅하고 0.2% 젤라틴을 함유한 PBS로 차단하였다. 희석된 인간 CSF를 각 웰에 첨가하고 인큐베이트 하였다. 이와별도로, 면역시킨 동물인 토끼로부터 준비한 다클론항체를 단백질 A상의 affinity column 크로마토그래피를 수행하여 정제한 다음 NHS-LC-Biotinylation 키트(PIERCE)와 비오틴화시켰다. 상기 마이크로타이터 플레이트를 세척하고 바이오틴화된 다클론항체를 각 웰에 부가한 다음 인큐베이트 하였다. 다음에, 스트렙토아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 접합체를 각 웰에 부가하고 인큐베이트 하였다. 플레이트를 세척하고 ABTS(2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤조티아졸린-6-설포닐산)) 염색기질을 각 웰에 부가했다. L-PGDS는 측색법에 의해 색상을 측정하므로서 결정했다. 실험결과는 표5에 나타내었다.
Sample No. 1 2 3 4 5
L-PGDS(㎍/mL) 23 31 20 10 18
실험예 2. 혈액에서 L-PGDS의 검사
인간혈액을 원심분리하여 얻은 혈청으로부터 L-PGDS는 희석된 혈청을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에서와 동일한 방법으로 결정하였다. 실험결과는 표6에 나타내었다.
Sample No. 1 2 3 4 5
L-PGDS(㎍/mL) 0.45 0.29 0.21 0.41 0.26
실험예 3. 양막액에서 L-PGDS의 검사
인간 양막액에서 L-PGDS 검사는 희석된 양막액을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실험예 1에서와 동일한 방법으로 결정하였다. 실험결과는 표7에 나타내었다.
Sample No. 1 2 3 4 5
L-PGDS(㎍/mL) 5.5 1.2 1.3 2.9 1.8
실험예 4. 정액 상청액에서 L-PGDS의 검사
인간 정액 플라즈마에서 L-PGDS는 희석된 인간정액 플라즈마를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실험예 1의 방법과 동일한 방법으로 결정하였다. 그 결과는 표8에 나타내었다.
Sample No. 1 2 3 4 5
L-PGDS(㎍/mL) 4.1 12 23 10 8.3
실험예 5. 여포액에서 L-PGDS의 검사
인간 여포액에서 L-PGDS는 희석된 인간여포액을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실험예 1의 방법과 동일한 방법으로 결정하였다. 실험결과는 표9에 나타내었다.
Sample No. 1 2 3 4 5
L-PGDS(㎍/mL) 0.21 0.11 0.11 0.15 0.13
실험예 6. 인간소변에서 G-PGDS의 검사
인간 소변에서 L-PGDS의 검사는 희석된 소변을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실험예 1의 방법과 동일한 방법으로 결정하였다. 실험결과는 표10에 나타내었다.
Sample No. 1 2 3 4 5
L-PGDS(㎍/mL) 1.07 0.65 2.45 1.62 0.32
실험예 7. 다양한 체액에서 L-PGDS의 검출
상기 실시예 2의 실험예 3에서와 동일한 방법의 샌드위치 ELISA 시스템(7F5 단일클론항체 X 비오틴화된 1B7 단일클론항체)을 사용하여 인간 CSF, 혈청 및 소변에서의 L-PGDS를 정량하였다. 실험결과(평균(±SE))는 이전의 자료들과 비교하였다. 이 분석에서, TMBLUE(Intergen-CDP)를 ABTS의 대신 염색기질로 사용하였다.
측정평균치는 표 11A에 나타내었고 이전자료들은 표 11B에 나타내었다. 양막액과 정액 플라즈마에서 L-PGDS수준은 동일한 수단으로 결정되었고, 그 결과(평균±SE)는 표 11A에 나타내었다.
sample number of samples means(±SE)(㎍/mL)
CSF 38 12.07±1.26
serum 12 0.27±0.01
urine 10 1.56±0.30
amniotic fluid 52 2.55±0.22*
seminal plasma 32 13.01±1.72
*는 하루동안 분비된 양(㎎)이다.
sample number of sample means(±SD)(㎎/mL) literature
CSF 12 40 Pepe,A.J.and Hochwald,G.M.(1967) Proc. Soc. Exp. Biol. 126, 630-633
CSF 59 26(±6) Link,H. and Olsson, J.E.(1972) Acta Neurol. Scadinav. 48, 57-68
CSF 35 27(±1.5) Olsson, J.E, Link,H.,and Muller, R.(1976) J.Neurol. Sci. 27, 233-245
CSF 192 33(±11) Felgenhauer,K., Schadlich, H.J.,and Nekic,M.(1987) Klin.Wochenschr.65, 746-768
serum 25 3.9(±0.16) Olsson,J.E., Link,H.,and Nosslin,B.(1973) J.Neurochem. 21, 1153-1159
urine 15 3.6~53.9* Whitsd,H.and Penny,R.(1974) Clin.Chim.Acta 50, 119-128
*는 하루동안 분비된 양(㎎)이다(평균이 아님)
상기 표에서 보듯이, 현재 평균은 기존의 문헌의 평균보다 낮았다. 특히, 혈청은 많은 오염물질을 함유한 것으로 간주된다. 이 차이점은 L-PGDS가 기존의 방법에서 낮은 특이성 때문에 과대평가되어졌기 때문이며 본 발명의 분석시스템에서 높은 특이성을 명확하게 알 수 있다.
도12는 이들의 측정을 나타낸 눈금커브를 나타낸 것이다.
커브 A는 CSF 또는 재조합 L-PGDS로부터 순수분리된 L-PGDS의 눈금커브이며, 이들은 표준용액으로서 사용된 실시예 1의 실험예 1에서 준비되어진 것이다. 커브 B, C, D, E 및 F는 각각 CSF, 정액 플라즈마, 소변, 양막액 및 혈청을 사용하여 준비된 눈금커브이다. 도12에서 볼 수 있듯이, 샘플의 눈금커브는 거의 눈금커브 A와 평행하다. 따라서 본 발명 분석방법에 의하여 L-PGDS는 샘플의 오염과 관계없이 결정될 수 있다.
본 발명의 분석시스템에서 부가적인 실험을 수행하였다. 인간 CSF, 혈청, 소변 및 정액 플라즈마 각각의 L-PGDS 농도를 약 20ng/mL으로 맞추어 희석하였다. CSF로부터 정제된 L-PGDS(CSF 항원)를 각 샘플에 15ng/mL 농도로 첨가하였다. 실험결과 표 12에서 볼 수 있듯이 각 샘플에서 우수한 회수율(98.5~104.6%)을 얻었음을 나타냈다.
샘플 희석도(-배) L-PGDS(ng/mL) 회수율(%)
초기농도 부가 회수농도
CSF 1 350 20.69 15.00 35.65 99.7
CSF 2 600 21.17 15.00 36.31 100.9
serum 1 15 20.71 15.00 36.21 103.3
serum 2 15 18.67 15.00 33.96 101.9
urine 1 40 20.86 15.00 36.55 104.6
urine 2 40 18.56 15.00 33.34 98.5
seminal plasma 1 500 16.82 15.00 31.70 99.2
seminal plasma 2 1000 19.51 15.00 34.93 102.8
실시예 4
샘플 5(정액 플라즈마)의 L-PGDS는 단일클론항체 1B7을 이용하여 웨스턴 블럿팅에 의하여 결정하였다. 실험결과는 도 13에 나타내었다. 도 13에서 볼 수 있듯이, 이 L-PGDS는 특이적으로 검사되어, 단일클론항체가 다른 오염물질의 존재하에서도 L-PGDS에만 반응하는 것을 알 수 있다.
그리고, 상기 실시예2에서 확립된 샌드위치 ELISA 시스템(단일클론항체 1B7 X 비오틴화된 다클론항체)을 이용하여 건강한 정상인(40 인)과 정자감소증 환자(10인)로부터 채취한 정액 플라즈마 1mL에서 L-PGDS를 정량 분석하였다. 정액 1mL당 정충의 수는 마클러 카운팅 쳄버(Makler Counting Chamber)에서 결정했다. 실험결과는 표 13에 나타내었다.
샘플번호 정충의 수(x104spermatozoa/mL) 대상 L-PGDS(㎍/mL) by ELISA
1 0 정자감소증 환자 2.6
2 100 정자감소증 환자 0.8
3 100 정자감소증 환자 1.0
4 800 정자감소증 환자 3.8
5 800 정자감소증 환자 2.2
6 1000 정자감소증 환자 0.9
7 1800 정자감소증 환자 1.0
8 2000 정자감소증 환자 5.0
9 2000 정자감소증 환자 4.8
10 2000 정자감소증 환자 2.6
11 2500 건강한 사람 4.3
12 3000 건강한 사람 7.5
13 3000 건강한 사람 23.6
14 3000 건강한 사람 30.0
15 3000 건강한 사람 9.5
16 3000 건강한 사람 2.5
17 3000 건강한 사람 4.4
18 4000 건강한 사람 6.0
19 4000 건강한 사람 30.0
20 4200 건강한 사람 8.0
21 5000 건강한 사람 1.9
22 6000 건강한 사람 42.0
23 6000 건강한 사람 1.5
24 6000 건강한 사람 3.8
25 6500 건강한 사람 2.0
26 7000 건강한 사람 3.2
27 7000 건강한 사람 8.2
28 8000 건강한 사람 9.6
29 8000 건강한 사람 14.0
30 8500 건강한 사람 6.0
31 8800 건강한 사람 3.0
32 9000 건강한 사람 8.0
33 9000 건강한 사람 7.1
34 10000 건강한 사람 10.1
35 10000 건강한 사람 3.0
36 10000 건강한 사람 7.5
37 10000 건강한 사람 6.0
38 11000 건강한 사람 0.3
39 12000 건강한 사람 17.0
40 12000 건강한 사람 2.6
41 12000 건강한 사람 7.0
42 12000 건강한 사람 1.1
43 13000 건강한 사람 10.5
44 13900 건강한 사람 30.0
45 15000 건강한 사람 16.0
46 15000 건강한 사람 5.1
47 15000 건강한 사람 3.5
48 16000 건강한 사람 13.0
49 17400 건강한 사람 15.0
50 18000 건강한 사람 6.2
실험결과, 건강한 사람의 L-PGDS의 수준은 9.75±1.486㎍/mL, 정자결핍증 환자의 L-PGDS의 수준은 2.470±0.509㎍/mL 였으며, 이들 사이의 통계적 유의차는 도 14에서 보는바와 같이 P≤0.008 수준(Mann-Whitney method) 또는 P≤0.0192 수준을 나타냈다. 본 발명의 키트는 많은 샘플들을 짧은 시간에 처리할 수 있으므로 정자결핍증 진단에 유용하다.
실시예 5
CSF로부터 L-PGDS의 일단계 정제는 단일클론항체 1B7, 6F5, 9A6, 7F5와 10A3각각을 Affi-Gel Hz immunoaffinity kit(Bio-Rad)를 사용하여 담체와 커플링시키므로써 수행하였다. 먼저, 상기의 각 단일클론항체와 10mL의 겔을 커플링시키고 PBS로 평형을 맞춘다. PBS로 최소 3배로 희석한 10mL의 CSF 용액을 겔에 적용시킨다. 겔을 2M NaCl을 함유한 PBS 20mL로 세척한 후 0.1% Triton X-100을 함유한 PBS 30mL로 세척하고, 최종적으로 PBS 50mL로 세척한 후 0.1M 소디움 시트레이트(pH 3.0)로 단백질을 용출한다.
어떤 종류의 항체를 사용하든지 L-PGDS는 겔상에 효과적으로 흡수되었고 0.1M 소듐 시트레이트(pH 3.0)으로 용출되었으며 효소활성을 갖는 상기 재료의 결과는 SDS-PAGE에서 거의 동일하였다. 얻어진 단백질 수율은 약 80%였고 그 산물은 본래의 CSF에 비해 37배 높게 정제되었다. 그러한 정제의 일예를 도 15에 나타냈다.
따라서, 본 발명은 L-PGDS에 대해 특이성을 갖는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
중추신경계통에서 L-PGDS의 분포의 분석은 중추신경계통의 질병 검사에 유용하다. 그리고 CFS 또는 인체생리액의 L-PGDS 수준은 중추신경계통의 이상에 따른 다른 질병들에 대한 조기진단 및 초기관찰을 가능하게 한다. 또한, L-PGDS(β-trace) 효소는 또한 정액, 나팔관액 및 양막액 등의 생식기관의 체액에서 유래하는 생체액에 분포하기 때문에 임신능력 및 태아의 성장상태의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 L-PGDS에 대한 유전자가 심장에서 발현됨을 밝혀냄에에 따라 다른 생체액 및 혈액에서 L-PGDS의 수준 및 분포정도는 순환계 기관의 질병의 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 의하여 제공되는 단일클론항체는 L-PGDS의 유전자 발현, 조직분포, 생리학적 작용 등의 연구분야에서 시약으로서 유용하게 사용될 수 있고, 또한 순환계 기관과 생리기관 뿐만 아니라 중추신경계통에서 다양한 질병의 병리적 진단을 위한 시약으로써 유용하게 사용될 수 있다.
[SEQUENCE LISTING]
SEQ ID NO : 1
LENGTH : 22
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : GGGAAATTCAT GCACCCGAGG CC
SEQ ID NO : 2
LENGTH : 20
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : GAGGTCAGGG CGAAGCCACC
SEQ ID NO : 3
LENGTH : 29
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : CCGGATCCGC ACCCGAGGCC CAGGTCTCC
SEQ ID NO : 4
LENGTH : 30
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : ATGAATTCAC TATTGTTCCG TCATGCACTT
SEQ ID NO : 5
LENGTH : 26
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : CCGGATCCTCCGTGCAGCCCAACTTC
SEQ ID NO : 6
LENGTH : 26
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : CCGGATCCCAGCCGGACAAGTTCCTG
SEQ ID NO : 7
LENGTH : 26
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : CCGGATCCTCGAGCTGGCTCCAGGAG
SEQ ID NO : 8
LENGTH : 26
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : CCGGATCCGATGGTGGCTTCAACCTG
SEQ ID NO : 9
LENGTH : 29
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : CCGGATCCGAGACCCGAACCATGCTG
SEQ ID NO : 10
LENGTH : 25
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : CCGGATCCTACCGGAGTCCCCACTG
SEQ ID NO : 11
LENGTH : 27
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : CCGGATCCGTGGAGACTGACTACGACC
SEQ ID NO : 12
LENGTH : 26
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : CCGGATCCGGCGAGGACTTCCGCATG
SEQ ID NO : 13
LENGTH : 26
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : CCGGATCCAGGGCTGAGTTAAAGGAG
SEQ ID NO : 14
LENGTH : 29
SEQUENCE TYPE : 핵산(nucleic acid)
STRANDNESS : single
TOPOLOGY : linear
MOLECULE TYPE : 다른 핵산(other nucleic acid), 합성 DNA(synthetic DNA)
SEQUENCE : CCGGATCCGAGGATTCCATTGTCTTCCTG

Claims (9)

  1. 리포칼린형 프로스타글란딘-디 신타아제(L-PGDS)을 특이적으로 인식하는 단일클론항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체의 서브클라스는 면역글로블린 G1 또는 G2임을 특징으로 하는 단일클론항체.
  3. L-PGDS로 면역된 동물로부터 얻은 항체생산세포와 상기 청구항 1 또는 2의 단일클론항체를 생산하는 골수종 세포와의 세포융합으로 얻은 하이브리도마.
  4. 청구항 1 또는 2의 단일클론항체에 의해 검사됨을 특징으로 하는 L-PGDS의 검사방법.
  5. 청구항 1 또는 2의 단일클론항체에 의해 검사된 L-PGDS에 의해 검사함을 특징으로 하는 질병 검사방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 질병이 정자감소증임을 특징으로 하는 검사방법.
  7. 하기의 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 L-PGDS의 검사용 키트 :
    청구항 1 또는 2의 효소로 표지된 항체 및 기질용액을 함유한 시약; 청구항 1 또는 2의 효소로 표지된 단일클론항체 또는 인간 L-PGDS를 인식하는 효소로-표지된 다클론항체 및 기질용액을 함유하는 시약; 청구항 1 또는 2의 비오틴화되고 효소로 표지된 아비딘 또는 스트렙토아비딘과 기질용액을 함유한 시약; 청구항 1 또는 2의 비오틴화된 청구항 1 또는 2의 단일클론항체 또는 인간 L-PGDS를 인식하는 비이오틴화된 다클론항체, 효소-표지된 아비딘 또는 스트렙토아비딘과 기질용액을 함유한 시약.
  8. 청구항 7항 기재의 L-PGDS 검사용 키트를 사용하여 검사함을 특징으로 하는 질병의 진단방법.
  9. 제 8항에 있어서, 질병이 정자감소증임을 특징으로 하는 진단방법.
KR1019980703102A 1995-10-31 1996-10-31 프로스타글란딘 디 신타아제에 특이적인 단일클론항체 KR19990067153A (ko)

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JP96-221530 1996-08-22
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