WO2005100992A1

WO2005100992A1 - 脳機能障害性疾患の検査方法、それに用いるタンパク質マーカ、診断薬および診断キット

Info

Publication number: WO2005100992A1
Application number: PCT/JP2005/006304
Authority: WO
Inventors: Katsunori Fujii
Original assignee: National University Corporation Chiba University
Priority date: 2004-04-01
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2005-10-27
Also published as: JP4399593B2; JP2005292108A

Abstract

　本発明は、ヒト髄液中の１４－３－３タンパク質を指標とすることで、脳機能障害性疾患、特に、インフルエンザ脳症を検査する方法である。本発明の検査方法において、例えば、前記１４－３－３タンパク質のアイソフォームが、β、θ、γ、ζおよびεの順で強く検出された場合、インフルエンザ脳症と判定する。前記１４－３－３タンパク質の検出には、前記タンパク質に対し特異的に結合可能な抗体を使用することが好ましい。前記抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。

Description

明細書

脳機能障害性疾患の検査方法、それに用いるタンパク質マーカ、診断薬および診断キット

技術分野

[0001] 本発明は、脳機能障害性疾患の検査方法、それに用いるタンパク質マーカ、診断薬および診断キットに関する。

背景技術

[0002] インフルエンザ脳症は、インフルエンザウイルス感染に伴っておきる急性脳症であつて、インフルエンザ脳炎を含み、小児に頻発し予後不良の疾患である。脳組織および髄液中にウィルスゲノムがほとんど認められず、また治療法も確立されて、な、ことから、小児難病の一つとされてきた。

[0003] 小児神経疾患には、難治性神経疾患が数多くある力中でもインフルエンザ脳症はインフルエンザ感染に伴、小児にけ、れんや意識障害が生じ、急性増悪して死の転帰を迎える予後不良疾患である。インフルエンザ感染時には高熱を来たすため、けいれん意識障害の初期には、良性である熱性けいれん力、あるいは予後不良のィンフルェンザ脳症か臨床的に区別することが困難である。この初期の段階で明らかにインフルエンザ脳症であることを診断できれば、きわめて早期から集中治療を行い臨床的予後が改善できる可能性が考えられる。し力しながら現在まで初期にインフルェンザ脳症であることを診断できる方法は存在せず、早期診断のためのマーカ等の開発が期待されている。また、このような要請は、インフルエンザ脳症に限定されず、ミトコンドリア異常症（MELAS)、 Hemiconvulsion— Hemiplegia症候群（HH症候群)ないし急性小児片麻痺、ウィルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫等の脳機能障害性疾患においても同様に存在する。

[0004] 急性期の脳障害の指標となる髄液タンパクは、 NSE (Neuron Specific Enolas e：神経特異性エノラーゼ）、 MBP (Myelin Basic Protein)が知られて!/、るが、必ずしも病態を鋭敏に反映するとは言えず、適切な病態把握および予後判定のための信頼性の高、髄液タンパクの確立が急務とされて、る。特許文献 1 : PCT国際公開番号: WO01Z035093

非特許文献 1 : Berg D, Holzman C, Riess O. 14— 3— 3 proteinsin t he nervous system. Nat Rev Neurosci. 2003 Sep ;4 (9) : 752- 762 非特許文献 2 : Masters SC, Subramanian RR, Truong A, YangH, F ujn K, Zhang H, Fu H. Survival― promoting functions of 14— 3 - 3 proteins. Biochem Soc Trans. 2002 Aug; 30 (4) : 360- 365. 非特許文献 3 : Baxter HC, Liu WG, Forster JL, Aitken A, Fraser J R. Immunolocalisation of 14— 3— 3 isoforms in normal and scrapie —infected murine brain. Neuroscience. 2002 ; 109 (1) : 5— 14.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は、インフルエンザ脳症を初めとする脳機能障害性疾患の検査方法、それに使用するタンパク質マーカ、診断薬および診断キットの提供を、その目的とする。課題を解決するための手段

[0006] 本発明は、発明者のヒト中枢神経疾患における髄液解析に関しての研究の中で、 1

4 3— 3タンパク質の髄液中での検出が疾患診断のみならず病態解析に有用であることを解明した結果に基づくものである。

[0007] すなわち、本発明の検査方法は、脳機能障害性疾患の検査方法であって、 14- 3

- 3タンパク質の検出工程を有する検査方法である。

[0008] 本発明のタンパク質マーカは、脳機能障害性疾患の診断のためのタンパク質マー力であって、 14— 3— 3タンパク質を含むマーカである。

本発明の診断薬は、脳機能障害性疾患の診断薬であって、 14— 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な抗体を含む診断薬である。

[0009] 本発明の診断キットは、脳機能障害性疾患の診断キットであって、 14— 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な抗体を含む診断キットである。

発明の効果 [0010] 本発明によると、例えば、インフルエンザ感染症初期に伴うけいれん、意識障害の病状の中から、インフルエンザ脳症を高率に診断することができ、集中治療に結びつけることが可能である。インフルエンザ脳症は死亡率も高ぐ本発明が臨床現場における同疾患を早期に鑑別することにより、救命率の向上および神経学的予後の改善に結びつくことが予想される。また 14— 3— 3ァイソフォームを分析することにより、疾患の診断ならびに脳障害部位の推定が可能になる。このように、本発明によれば、ィンフルェンザ脳症を初めとする脳機能障害性疾患の検査や病態解析等が可能となる。なお、本発明において、前記脳機能障害性疾患は、 Creuzfeldt— Jakob (クロイッフェルト—ヤコブ)病（CJD)を除くものである。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]図 1は、本発明の一実施例において、小児神経疾患における髄液中 14— 3— 3タンパク質の検出結果を示す図である。

[図 2]図 2は、本発明の一実施例において、髄液中 14— 3— 3タンパク質が検出された症例の頭部 MRI画像であり、障害された脳部位を示す図である。

[図 3]図 3は、本発明の一実施例において、インフルエンザ感染症のみで脳症非発生例、インフルエンザ脳症例、非インフルエンザ感染症に伴う脳症例における髄液中 1 4— 3— 3タンパク検出例を示す図である。また、同図には、年齢、インフルエンザ脳症のタイプ、髄液データ、予後を示す表も併記している。

[図 4]図 4は、本発明の一実施例において、インフルエンザ脳症例およびミトコンドリア病（MELAS)における 14— 3— 3ァイソフォームの同定を示す図である。

[図 5]図 5は、本発明の一実施例において、 14— 3— 3タンパク質の 7つのアイソフォームのアミノ酸配列を示す図である。相同性が高くまたリン酸ィ匕を受けるセリン、スレォニン残基は太線で強調した。

[図 6]図 6は、本発明の一実施例において、ミトコンドリア病（MELAS)患者における頭部 MRI画像であり、障害された脳部位を示す図である。

[図 7]図 7は、本発明の一実施例において、ミトコンドリア病（MELAS)患者における臨床経過と髄液中 14— 3 - 3タンパク質の検出状況を示す図である。図 6で示した頭部 MRI撮影時期も併記してある。 [図 8]図 8は、本発明の一実施例において、報告されている 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームの脳内分布図（マウス）を示す図である。

[図 9]図 9は、本発明の一実施例において、髄液中 14— 3— 3タンパク質が検出されるメカニズムを示す図である。発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明のタンパク質マーカにおいて、前記 14— 3— 3タンパク質力ヒト髄液中に発現するタンパク質であることが好ま、。

[0013] 本発明のタンパク質マーカにおいて、前記 14— 3— 3タンパク質が、 13、 0、 γ、 ζ および ε力なる群力選択される少なくとも一つのァイソフォームを含むことが好ましい。

[0014] 本発明のタンパク質マーカにおいて、診断対象である前記脳機能障害性疾患が、インフルエンザ脳症であることが好まし、。

[0015] 本発明のタンパク質マーカにおいて、前記インフルエンザ脳症力小児インフルェンザ脳症であり、前記 14— 3— 3タンパク質力小児髄液に発現するタンパク質であることが好ましい。

[0016] 本発明のタンパク質マーカにおいて、診断対象である前記脳機能障害性疾患が、ミトコンドリア異常症（MELAS)であり、前記 14— 3— 3タンパク質が、および ζの少なくとも一方のァイソフォームであることが好ましい。

[0017] 本発明のタンパク質マーカにおいて、診断対象である前記脳機能障害性疾患が、

Hemiconvulsion— Hemiplegia症候群（HH症候群）な!、し急性小児片麻痺、ウイルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫からなる群から選択される少なくとも一つであることが好まし、。

[0018] 本発明の診断薬において、前記 14— 3— 3タンパク質力ヒト髄液中に発現する 14

— 3— 3タンパク質であることが好まし、。

[0019] 本発明の診断薬において、前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 βヽ 0、 γ、 ζおよび ε力なる群力選択される少なくとも一つのアイソフォームに特異的に結合可能な抗体であることが好ましい。

[0020] 本発明の診断薬において、前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 13、 0、 γ、 ζおよび εのァイソフォームに共通するェピトープを認識可能な抗体であることが好まし、。

[0021] 本発明の診断薬において、診断対象である前記脳機能障害性疾患が、インフルェンザ脳症であることが好ま、。

[0022] 本発明の診断薬において、前記インフルエンザ脳症力小児インフルエンザ脳症であり、前記 14— 3— 3タンパク質力小児髄液に発現するタンパク質であることが好ましい。

[0023] 本発明の診断薬において、診断対象である前記脳機能障害性疾患が、ミトコンドリァ異常症（MELAS)であり、前記抗体が、前記 14 3— 3タンパク質のァイソフォームにおける βおよび ζの少なくとも一方のァイソフォームに特異的に結合可能な抗体であることが好ましい。

[0024] 本発明の診断薬にぉ、て、診断対象である前記脳機能障害性疾患が、 Hemicon vulsion— Hemiplegia症候群 (HH症候群）な、し急性小児片麻痺、ウィルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫からなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。

[0025] 本発明の診断キットにおいて、前記抗体が、モノクローナル抗体であることが好ましい。

[0026] 本発明の診断キットにおいて、前記 14— 3— 3タンパク質力ヒト髄液中に発現する

14 - 3 - 3タンパク質であることが好ま U、。

[0027] 本発明の診断キットにおいて、前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質において、 β、 θ、 γ、 ζおよび ε力もなる群力も選択される少なくとも一つのァイソフォームに特異的に結合可能な抗体であることが好ま、。

[0028] 本発明の診断キットにおいて、前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のアイソフォームにおいて、 13、 0、 γ、 ζおよび εのァイソフォームに共通するェピトープを認識可能な抗体であることが好ま、。

[0029] 本発明の診断キットにおいて、前記抗体が、モノクローナル抗体であることが好ましい。

[0030] 本発明の診断キットにおいて、前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な一次抗体と、前記一次抗体に特異的に結合可能であり、かつ識別標識を備える二次抗体を含むことが好ましい。前記識別標識が、色素標識、酵素標識および蛍光標識力なる群力選択される少なくとも一つであることが好まし、。また、前記一次抗体は、ゥサギ由来抗体であり、二次抗体は、ャギ由来抗体であることが好ましい。

[0031] 本発明の診断キットにおいて、診断対象である前記脳機能障害性疾患が、インフルェンザ脳症であることが好まし、。

[0032] 本発明の診断キットにぉ、て、前記インフルエンザ脳症力小児インフルエンザ脳症であり、前記 14— 3— 3タンパク質力小児髄液に発現するタンパク質であることが好ましい。

[0033] 本発明の診断キットにおいて、診断対象である前記脳機能障害性疾患が、ミトコンドリア異常症 (MELAS)であり、前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のアイソフォームにおける βおよび ζの少なくとも一方のァイソフォームに特異的に結合可能な抗体であることが好ましい。

[0034] 本発明の診断キットにおいて、診断対象である前記脳機能障害性疾患が、 Hemic onvulsion— Hemiplegia症候群（HH症候群）な!、し急性小児片麻痺、ウィルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫からなる群カゝら選択される少なくとも一つであることが好ましい。

[0035] 本発明の検査方法において、前記検出工程が、ヒト髄液中の 14— 3— 3タンパク質を検出する工程であることが好ましい。

[0036] 本発明の検査方法において、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 β、 θ、 γ、 ζおよび ε力なる群力選択される少なくとも一つのァイソフォームを検出することが好ましい。

[0037] 本発明の検査方法にお!、て、検査対象である前記脳機能障害性疾患が、インフルェンザ脳症であることが好ましい。この場合、前記 14— 3— 3タンパク質のアイソフォームにおいて、 βヽ 0、 γ、 ζおよび εの順で強く検出された場合、インフルエンザ脳症と判定することが好ましい。また、前記インフルエンザ脳症力小児インフルェンザ脳症であり、前記 14— 3— 3タンパク質力小児髄液に発現するタンパク質であることが好ましい。

[0038] 本発明の検査方法において、前記検査工程において、 14— 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な抗体を使用することが好ましい。

[0039] 本発明の検査方法において、検査対象である脳機能障害性疾患が、ミトコンドリア異常症であり、前記検査工程において、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおける βおよび ζを検出した場合に、ミトコンドリア異常症と判断することが好ましい。

[0040] 本発明の検査方法にお!ヽて、診断対象である前記脳機能障害性疾患が、 Hemic onvulsion— Hemiplegia症候群（HH症候群）な!、し急性小児片麻痺、ウィルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫からなる群カゝら選択される少なくとも一つであることが好ましい。

[0041] 以下、本発明の実施形態を具体的に説明する。

[0042] 14 3— 3タンパク質はそのアミノ酸配列の差異から 7つのアイソフォーム、 β、 γ、

ζ、 0、 ε、 σ、が知られている。それぞれのァイソフォームはアポトーシスシグナル、増殖分化、細胞内輸送、細胞周期調節などの異なる機能を持つとされるが詳細は不明である。

[0043] 14— 3— 3タンパク質の 7つのアイソフォームの脳内における分布は、マウスの研究カゝら j8、 ζ、 Ύ、 r?は神経細胞体と神経核に、 εは中枢神経灰白質に、 r?は小脳核、視床下部核、神経細胞体、神経核に含まれることが報告されている。

[0044] 本発明において、検査対象またはマーカとなるのは、例えば、血液、尿、髄液中に含まれる 14— 3— 3タンパク質である。この中で、ヒト髄液中の 14— 3— 3タンパク質が好ましい。前述のように、このタンパク質は、 7つのアイソフォームを持つことがしられているが、インフルエンザ脳症において、例えば、ヒト髄液中に発現するのは、 β、 0、 γ、 ζ、 εであり、かっこの順に強く検出される。したがって、このアイソフォームの発現パターンの検査により、より正確にインフルエンザ脳症であるカゝ否かを判断できる。さらに、ァイソフォームの発現パターン分析により、脳のどの部位に障害が生じているかを予測することができ、この結果、脳症に対する適切な処置をとることができる。 [0045] 14 3— 3タンパク質の 7つのアイソフォームのアミノ酸配列はすでに同定されておりその相違を示す（図 5)。その中でもセリン、スレオニン残基はリン酸ィ匕を受ける部位であり、ァイソフォーム間で相同性が高ぐまたリン酸ィ匕を受けることにより 14— 3— 3 タンパク質自身の機能変化が予想されるため、同部位を特に太線で強調した。

[0046] 前記 14— 3— 3タンパク質の検出方法は、特に制限されないが、抗体を用いた検出方法が好ましい。前記抗体は、特に制限されないが、例えば、ゥサギ、ャギ、マウス、ラット、ブタ、ヒッジ、ィヌなどの各種の動物由来のものが使用できる。また、抗体の作製は、 14— 3— 3タンパク質を用い、一般の方法で前記動物を免疫することにより実施できる。前記抗体としては、モノクローナル抗体が好ましい。

[0047] 前記抗体を用いた検出方法は、特に制限されないが、検出精度と操作方法の簡便性力 ELISA法が好ましい。 ELISA法は、検出対象タンパク質 (本発明では、 14— 3— 3タンパク質、若しくはその β、 θ、 _Ύ、 ζ、 εのァイソフォーム）に特異的に結合する一次抗体と、この一次抗体に特異的に結合し、かつ酵素標識 (ラベル)を有する二次抗体を使用する方法である。前記識別標識としては、後述のように酵素標識の他に、色素標識、蛍光標識や ABC法を使用してもよい。 ESISA法は、特に制限されず、後述の実施例のように、髄液を SDS— PAGEで電気泳動したあと、ウェスタンブロッテイングによりタンパク質を-トロセルロース膜に転写し、これに一次抗体および二次抗体を添加し、前記二次抗体の識別標識を検出することにより実施することができる。この他に、ポリスチレンビーズなどの固相に一次抗体を結合させ、これに髄液を供給して 14— 3— 3タンパク質を結合させ、この状態で、 BZF分離を行い、そして、 1 4- 3 - 3タンパク質に特異的に結合し、かつ標識を有する二次抗体を添加して前記タンパク質に結合させ、前記標識を検出するサンドイッチ法であってもよい。また、本発明において、 14— 3— 3タンパク質の検出方法として、ィムノクロマト法を用いた検出方法を採用してもよい。

[0048] 酵素標識の具体例として、 Hoarse Raddish Peroxidase (HRP)を用いる方法がある。これにより蛍光発色させることが可能となり、 14— 3— 3タンパク質を可視化同定することが可能である。

[0049] なお、本発明において、前記抗体は、 13、 θ、 γ、 ζおよび εのァイソフォームのそれぞれに特異的に結合する抗体であってもよいし、これらのァイソフォームに共通するェピトープを認識するものであってもよ、。

[0050] 本発明における「モノクロナール抗体」とは、単一免疫 B細胞より分泌される単一の免疫グロブリン力もなる抗体群を意味し、同じく本発明における「ゥサギ由来の抗体」とは、ゥサギに 14— 3 - 3タンパク質 (ァイソフォーム）を免疫接種することにより血清中から回収される免疫グロブリン抗体を意味し、同じく本発明における「ャギ由来の抗体」とは、ャギに 14— 3 - 3タンパク質 (ァイソフォーム）を免疫接種することにより血清中から回収される免疫グロブリン抗体を意味する。

[0051] 同じく本発明における「酵素標識」とは、二次抗体の標識に HRP (Horseradish p eroxidase,西洋わさび過酸化酵素）や AP (alkaline phoaphtase、アルカリフォスターゼ)などの酵素を用いて、酵素反応の結果生じた沈殿物の色素を検出する方法を意味する。

[0052] 同じく本発明における「蛍光標識」とは、二次抗体の標識に FITC (fluorescein is othiocyanate：緑色蛍光を発する）やローダミン（rhodamine：赤色蛍光を発する）などを用いて、それぞれに対応する波長の励起光を当てて蛍光を発検出する方法を意味する。

[0053] 同じく本発明における「ABC法」とは、二次抗体の標識にピオチン (biotin)を用いる力このピオチンにアビジンと酵素の複合体を結合させることで、抗体 1分子あたりに結合する酵素の量が増し、高感度に検出できる方法を意味する。

実施例

[0054] 以下、本発明の実施例について説明する力本発明は、下記の実施例になんら制限されない。

[0055] ヒト髄液中の 14— 3— 3タンパク質を検出するために、まず採取された髄液を遠心分離し（3000g、 10分間）、髄液中に含まれる細胞成分を除去した。なお、この細胞成分の除去は、任意であり、実施してもよいし、しなくてもよい。上清を採取し Microc on YM— 10 (Millipore社製、 USA)を用いて遠心分離（13000g)を行うことにより髄液を 10倍に濃縮させた (この濃縮は任意である)。濃縮した髄液は SDSサンプルノッファーを加えて 95度で 5分間加熱した。その後髄液タンパク 30 g量を 12. 5% SDS— PAGEで電気泳動し、ウェスタンブロッテイング（15V、 120分）を行うことにより-トロセルロース膜に髄液タンパクを転写した。転写後 5%ミルク TBS— T液に浸して、常温で 15分間振盪し-トロセルロース膜上のタンパクを固定した。 1次抗体としてゥサギ抗 14— 3— 3 j8抗体（sc— 629, Santa Cruz Biotechnology社， USA)を 1： 100濃度で 4°Cで一晩反応させ、さらに 2次抗体として HRP標識ャギ抗ゥサギ IgG 抗体（sc— 2004、 Santa Cruz Biotechnology社， USA)を 1： 2500濃度で常温にて 1時間反応させた。なお、本発明において、抗体は、希釈してもよいし、希釈しなくてもよい。 14— 3— 3タンパク質は ECLキット（Amersham Bioscience社， USA) を用いてバンドとして可視化した。また、 14— 3— 3タンパク質が検出された場合には、そのアイソフォームを検出するためそれぞれの 14 3— 3タンパク質のァイソフォーム特異抗体、 anti- β antibodies (sc— 628, Santa Cruz Biotechnology, USA), anti— y antibodies (sc- 731 , Santa

Cruz Biotechnology, USA), anti- ζ antibodies (sc- 1019, Santa Cruz Biotechnology, USA), anti- ε antibodies (sc- 1020,

Santa Cruz Biotechnology, USA), anti- η antibodies (sc- 1728b, Santa Cruz Biotechnology, USA), anti- Θ antibodies (sc- 732, Santa

Cruz Biotechnology, USA), and anti- σ antibodies (sc- 7681 , Santa Cruz

Biotechnology, USA),ないし、 Anti- Human 14-3-3

Protein Rabbit IgG Affinity Purify (18649, IBL, Japan), Anti-Human 14—3—3 β Protein Rabbit IgG

Affinity Purify (18641 , IBL, Japan), Anti-Human 14—3—3 y Protein (63A1) Mouse IgG

MoAb (10037, IBL, Japan), Anti-Human 14—3—3 y Protein Rabbit IgG Affinity Purify (18647,

IBL, Japan), Anti-Human 14—3—3 ε Protein Rabbit IgG Affinity Purify (18643, IBL, Japan), Anti-Human

14-3-3 ζ

Protein Rabbit IgG Affinity Purify (18644, IBL, Japan), Anti-Human 14—3—3 η Protein Rabbit lgG

Affinity Purify (18645, IBL, Japan), Anti-Human 14—3—3 σ Protein (69) Rabbit lgG Affinity Purify (18640, IBL, Japan), Anti-Human 14—3—3 σ Protein (C) Rabbit lgG Affinity Purify (18642, IBL, Japan), Anti-Human 14—3—3 σ Protein (N) Rabbit lgG Affinity Purify (18646, IBL, Japan), Anti-Human 14—3—3 τ Protein (33A) Mouse lgG

MoAb (10017, IBL, Japan)を用いて、それぞれのァイソフォーム同定を行った。この一連の作業を、インフルエンザ感染症、インフルエンザ脳症、非インフルエンザ感染の急性脳症の 3群のみならず、小児神経疾患全般につ、ても検討した。

[0056] 図 1は、小児神経疾患の中で髄液中に 14— 3— 3タンパク質が検出された具体例を示す。この結果から、髄液中 14— 3— 3タンパク質は、インフルエンザ脳症 (IAE)、ミトコンドリア異常症（MELAS)、 Hemiconvulsion— Hemiplegia症候群（HH症候群)ないし急性小児片麻痺、ウィルス性および細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症、悪性リンパ腫で検出されることがわ力つた。

[0057] 図 2は髄液中に 14— 3— 3タンパク質が検出された例の頭部 MRI写真を示す。 HH 症候群 (急性小児片麻痺)、インフルエンザ脳症、脊髄小脳変性症でそれぞれ障害されている脳部位を矢印で示した。これらの結果から、矢印で示された患者の脳障害部位が髄液中の 14— 3— 3タンパク質検出の責任病巣であることがわ力つた。また、これらの障害部位と 14— 3— 3タンパク質ァイソフォームが関連することも推測できる

[0058] 図 3は、インフルエンザ感染症のみで脳症非発生例、インフルエンザ脳症例、非ィンフルェンザ感染症に伴う脳症例の臨床的特徴および髄液データである。この結果から、インフルエンザ脳症が小児で発生しやすいこと、一般に行われる髄液検査だけではインフルエンザ脳症かどうか区別できな、こと、インフルエンザタイプ Bでもインフルェンザ脳症を発症しうることが判明した。

[0059] 図 3は、インフルエンザ感染症のみで脳症非発生例、インフルエンザ脳症例、非ィンフルェンザ感染症に伴う脳症例における髄液中 14— 3 - 3タンパク質の検出を示すウェスタンブロットの結果であり、この結果から、髄液中 14— 3— 3タンパク質はインフルェンザ脳症に特異的に検出され、インフルエンザ脳症の診断に有用であることがわかった。

[0060] 図 4は、インフルエンザ脳症例およびミトコンドリア異常症（MELAS)例における 14

3— 3タンパク質のァイソフォームの同定に成功したウェスタンブロットの結果であり、この結果から、 14— 3— 3タンパク質の 7つのアイソフォームの中で、 j8、 γ、 ζ、 0 、 εの 5つがインフルエンザ脳症で陽性であることがわかる。またこの 5つのアイソフォームの中でもインフルエンザ脳症では、 0、 γ、 ζ、 εの順に強く検出されることがわかる。一方、ミトコンドリア病（MELAS)では |8、 ζの 2つが陽性であり、ほぼ同程度に検出されることがわ力つた。

[0061] 図 6は、ミトコンドリア異常症 (MELAS)患者における病期における頭部 MRI画像である。障害部位は矢印で示してある。この結果から、病期によって障害される脳部位が変化して、ることがわかる。

[0062] 図 7は、ミトコンドリア異常症 (MELAS)患者における臨床症状と髄液中 14— 3— 3 タンパク質の検出変化を示したものである。 MRIは図 6で示されたものを病期に当てはめてある。この結果から、髄液中 14— 3— 3タンパク質は障害が進行するたびに髄液中で検出されること、中でも脳卒中発作時にもっとも強く検出されること、これらは頭部 MRIで後頭葉と側頭葉が中心であったこと、これらは臨床上の急性期と一致して出現し安定すると消退することがわ力つた。

[0063] 図 8は、 Baxterらによって報告されたマウスの脳における 14 3— 3タンパク質の脳内分布を示す。これらより 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームが脳の一部に限局して存在しており、髄液中に検出される 14- 3- 3タンパク質のァイソフォームと一致することが予想できる。

[0064] 図 9は、髄液中 14— 3— 3タンパク質の検出メカニズムである。これ〖こよると、髄液中 14— 3— 3タンパク質が検出されるメカニズムには、急性期の脳破壊に付随して検出されるものと、慢性期のアポトーシス刺激に付随して髄液中に放出されるものの、 2種類があることがわかる。前者にはインフルエンザ脳症などが、後者には脊髄小脳変性症などが疾患として該当する。

[0065] 本研究成果の要点は、以下のとおりである。 1. 14— 3— 3タンパク質はインフルエンザ脳症の患者髄液で全例に検出され、インフルェンザ感染症の高熱に伴う熱性けいれん等の意識障害では 1例も検出されなかつた。このことは、髄液中 14— 3— 3タンパク質の検出力インフルエンザ脳症の早期診断に有用であることを明確に示して、る。

2. 14— 3— 3タンパク質は同様にインフルエンザ感染症以外に伴う急性脳症でも検出されず、急性脳症の中でもインフルエンザ脳症を明確に診断するために有用であつた o

3.インフルエンザ脳症患者群の髄液からは、 14— 3— 3ァイソフォームとして |8、 γ、 ζ、 0、 εが検出され、ヒトの脳が広範囲に障害されていることが明らかになった。

4. 5つのアイソフォームの中でも、 β、 θ、 γ、 ζ、 εの順に強く検出されることは、ィンフルェンザ脳症で特異的なアイソフォーム出現パターンであると考えられる。

5.これら 5つの 14— 3— 3ァイソフォームの出現パターンの同定は、障害された脳部位の同定が可能になり、また髄液中に 14— 3— 3タンパク質が検出されるメカニズムの解明に有用である。

6.ミトコンドリア病（MELAS)では、髄液中 14— 3— 3タンパク質は臨床上の症状出現時期に一致して見られ、病体把握に有用であった。

7.インフルエンザ脳症患者群の髄液からは、 14— 3— 3ァイソフォームとして、 ζ が検出され、頭部 MRIからはヒトの脳では側頭葉と後頭葉が障害されていることが明らかになつた。

[0066] 本発明により、髄液中 14— 3— 3タンパク質を早期に検出するキットが製造できる。

例えば、 14— 3— 3タンパク質の抗原を検出するためのキットにより、発症早期に採取された髄液を反応させて、陽性例をインフルエンザ脳症と診断できる。

産業上の利用可能性

[0067] 本発明によれば、インフルエンザ脳症を初めとする脳機能障害性疾患の検査や病態解析が可能となる。特に、本発明は、小児インフルエンザ脳症の検査に有用であるが、本発明は、これに限定されず、その他の脳機能障害性疾患の検査等にも有用である。

Claims

請求の範囲

[I] 脳機能障害性疾患の診断のためのタンパク質マーカであって、 14— 3— 3タンパク質を含むマーカ。

[2] 前記 14— 3— 3タンパク質力ヒト髄液中に発現するタンパク質である請求項 1記載のマーカ。

[3] 前記 14— 3— 3タンパク質力 β、 θ、 γ、 ζおよび εからなる群から選択される少なくとも一つのァイソフォームを含む請求項 1記載のマーカ。

[4] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、インフルエンザ脳症である請求項 1記載のマーカ。

[5] 前記インフルエンザ脳症力小児インフルエンザ脳症であり、前記 14— 3— 3タンパク質が、小児髄液に発現するタンパク質である請求項 4記載のマーカ。

[6] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、ミトコンドリア異常症 (MELAS)であり、前記 14— 3— 3タンパク質が、 j8および ζの少なくとも一方のァイソフォームである請求項 1記載のマーカ。

[7] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、 Hemiconvulsion— Hemiplegia症候群 (HH症候群)ないし急性小児片麻痺、ウィルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫からなる群力選択される少なくとも一つである請求項 1記載のマーカ。

[8] 脳機能障害性疾患の診断薬であって、 14— 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な抗体を含む診断薬。

[9] 前記 14— 3— 3タンパク質力ヒト髄液中に発現する 14— 3— 3タンパク質である請求項 8記載の診断薬。

[10] 前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 j8、 0、 γ、 ζおよび ε力なる群力選択される少なくとも一つのァイソフォームに特異的に結合可能な抗体である請求項 8記載の診断薬。

[I I] 前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 j8、 0、 γ、 ζおよび εのァイソフォームに共通するェピトープを認識可能な抗体である請求項 8記載の診断薬。

[12] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、インフルエンザ脳症である請求項 8記載の診断薬。

[13] 前記インフルエンザ脳症力小児インフルエンザ脳症であり、前記 14— 3— 3タンパク質が、小児髄液に発現するタンパク質である請求項 12記載の診断薬。

[14] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、ミトコンドリア異常症 (MELAS)であり、前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおける βおよび ζの少なくとも一方のァイソフォームに特異的に結合可能な抗体である請求項 8記載の診断薬。

[15] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、 Hemiconvulsion— Hemiplegia症候群 (HH症候群)ないし急性小児片麻痺、ウィルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫からなる群力選択される少なくとも一つである請求項 8記載の診断薬。

[16] 前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項 8記載の診断薬。

[17] 脳機能障害性疾患の診断キットであって、 14— 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な抗体を含む診断キット。

[18] 前記 14— 3— 3タンパク質力ヒト髄液中に発現する 14— 3— 3タンパク質である請求項 17記載の診断キット。

[19] 前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質において、 β、 θ、 γ、 ζおよび εからなる群力選択される少なくとも一つのァイソフォームに特異的に結合可能な抗体である請求項 17記載の診断キット。

[20] 前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 j8、 0、 γ、 ζおよび εのァイソフォームに共通するェピトープを認識可能な抗体である請求項 7記載の診断キット。

[21] 前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項 17記載の診断キット。

[22] 前記抗体が、前記 14 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な一次抗体と、前記一次抗体に特異的に結合可能であり、かつ識別標識を備える二次抗体を含む請求項

17記載の診断キット。

[23] 前記識別標識が、色素標識、酵素標識および蛍光標識からなる群から選択される少なくとも一つである請求項 22記載の診断キット。

[24] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、インフルエンザ脳症である請求項 17記載の診断キット。

[25] 前記インフルエンザ脳症力小児インフルエンザ脳症であり、前記 14— 3— 3タンパク質が、小児髄液に発現するタンパク質である請求項 24記載の診断キット。

[26] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、ミトコンドリア異常症 (MELAS)であり、前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおける βおよび ζの少なくとも一方のァイソフォームに特異的に結合可能な抗体である請求項 17記載の診断やット。

[27] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、 Hemiconvulsion— Hemiplegia症候群 (HH症候群)ないし急性小児片麻痺、ウィルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫からなる群力選択される少なくとも一つである請求項 17記載の診断キット。

[28] 脳機能障害性疾患の検査方法であって、 14— 3— 3タンパク質の検出工程を有する検査方法。

[29] 前記検出工程が、ヒト髄液中の 14— 3— 3タンパク質を検出する工程である請求項 2 8記載の検査方法。

[30] 前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 β、 θ、 γ、 ζおよび ε力なる群から選択される少なくとも一つのァイソフォームを検出する請求項 28記載の検査方法。

[31] 検査対象である前記脳機能障害性疾患が、インフルエンザ脳症である請求項 28記載の検査方法。

[32] 前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 β、 θ、 γ、 ζおよび εの順で強く検出された場合、インフルエンザ脳症と判定する請求項 31記載の検査方法。

[33] 前記インフルエンザ脳症力小児インフルエンザ脳症であり、前記 14— 3— 3タンパク質が、小児髄液に発現するタンパク質である請求項 31記載の検査方法。

[34] 前記検査工程において、 14— 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な抗体を使用する請求項 28記載の検査方法。

[35] 検査対象である脳機能障害性疾患が、ミトコンドリア異常症であり、前記検査工程において、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおける 13および ζを検出した場合に、ミトコンドリア異常症と判断する請求項 28記載の検査方法。

[36] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、 Hemiconvulsion— Hemiplegia症候群 (HH症候群)ないし急性小児片麻痺、ウィルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫からなる群力選択される少なくとも一つである請求項 28記載の検査方法。

[37] 脳機能障害性疾患の検査のための 14— 3 - 3タンパク質の使用。

[38] 前記タンパク質力ヒト髄液中の 14— 3— 3タンパク質である請求項 37記載の使用。

[39] 前記前記タンパク質が、 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 β、 θ、 γ 、 ζおよび ε力なる群力選択される少なくとも一つのァイソフォームである請求項 37記載の使用。

[40] 検査対象である前記脳機能障害性疾患が、インフルエンザ脳症である請求項 37記載の使用。

[41] 前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 13、 θ、 γ、 ζおよび εの順で強く検出された場合、インフルエンザ脳症と判定する請求項 40記載の使用。

[42] 前記インフルエンザ脳症力小児インフルエンザ脳症であり、前記 14— 3— 3タンパク質が、小児髄液に発現するタンパク質である請求項 40記載の使用。

[43] 前記タンパク質の検出のために、 14— 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な抗体を使用する請求項 37記載の使用。

[44] 検査対象である脳機能障害性疾患が、ミトコンドリア異常症であり、前記 14— 3— 3タンパク質のアイソフォームにおける /3および ζを検出した場合に、ミトコンドリア異常症と判断する請求項 37記載の使用。

[45] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、 Hemiconvulsion— Hemiplegia症候群 (HH症候群)ないし急性小児片麻痺、ウィルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫からなる群力選択される少なくとも一つである請求項

37記載の使用。

[46] 脳機能障害性疾患の診断薬の製造のための、 14— 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な抗体の使用。

[47] 前記 14— 3— 3タンパク質力ヒト髄液中に発現する 14— 3— 3タンパク質である請求項 46記載の使用。

[48] 前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 j8、 0、 γ、 ζおよび ε力なる群力選択される少なくとも一つのァイソフォームに特異的に結合可能な抗体である請求項 46記載の使用。

[49] 前記抗体が、前記 14 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 j8、 0、 γ、 ζおよび εのァイソフォームに共通するェピトープを認識可能な抗体である請求項 46記載の使用。

[50] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、インフルエンザ脳症である請求項 46記載の使用。

[51] 前記インフルエンザ脳症力小児インフルエンザ脳症であり、前記 14— 3— 3タンパク質が、小児髄液に発現するタンパク質である請求項 50記載の使用。

[52] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、ミトコンドリア異常症 (MELAS)であり、前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおける βおよび ζの少なくとも一方のァイソフォームに特異的に結合可能な抗体である請求項 46記載の使用

[53] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、 Hemiconvulsion— Hemiplegia症候群 (HH症候群)ないし急性小児片麻痺、ウィルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫からなる群力選択される少なくとも一つである請求項 46記載の使用。

[54] 脳機能障害性疾患の診断キットの製造のための、 14 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な抗体の使用。

[55] 前記 14— 3— 3タンパク質力ヒト髄液中に発現する 14— 3— 3タンパク質である請求項 54記載の使用。

[56] 前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質において、 β、 θ、 γ、 ζおよび εからなる群力選択される少なくとも一つのァイソフォームに特異的に結合可能な抗体である請求項 54記載の使用。

[57] 前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおいて、 j8、 0、 γ、 ζおよび εのァイソフォームに共通するェピトープを認識可能な抗体である請求項 54記載の使用。

[58] 前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項 54記載の使用。

[59] 前記抗体が、前記 14 3— 3タンパク質に特異的に結合可能な一次抗体と、前記一次抗体に特異的に結合可能であり、かつ識別標識を備える二次抗体を含む請求項

54記載の使用。

[60] 前記識別標識が、色素標識、酵素標識および蛍光標識からなる群から選択される少なくとも一つである請求項 59記載の使用。

[61] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、インフルエンザ脳症である請求項 54記載の使用。

[62] 前記インフルエンザ脳症力小児インフルエンザ脳症であり、前記 14— 3— 3タンパク質が、小児髄液に発現するタンパク質である請求項 61記載の使用。

[63] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、ミトコンドリア異常症 (MELAS)であり、前記抗体が、前記 14— 3— 3タンパク質のァイソフォームにおける βおよび ζの少なくとも一方のァイソフォームに特異的に結合可能な抗体である請求項 54記載の使用

[64] 診断対象である前記脳機能障害性疾患が、 Hemiconvulsion— Hemiplegia症候群 (HH症候群)ないし急性小児片麻痺、ウィルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、脊髄小脳変性症および悪性リンパ腫からなる群力選択される少なくとも一つである請求項 54記載の使用。