JP2000180447A - 急性心筋梗塞の判定方法及び判定用試薬 - Google Patents
急性心筋梗塞の判定方法及び判定用試薬Info
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- JP2000180447A JP2000180447A JP10352970A JP35297098A JP2000180447A JP 2000180447 A JP2000180447 A JP 2000180447A JP 10352970 A JP10352970 A JP 10352970A JP 35297098 A JP35297098 A JP 35297098A JP 2000180447 A JP2000180447 A JP 2000180447A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 急性心筋梗塞を判定する方法及び判定する
ための試薬を提供する。 【解決手段】 ヒトの血液中のＣＤ３６抗原を、抗ＣＤ
３６抗体からなる試薬を用いて検出し、その検出値が健
常人よりも高い場合に、そのヒトは急性心筋梗塞に罹患
していると判定することができる。
ための試薬を提供する。 【解決手段】 ヒトの血液中のＣＤ３６抗原を、抗ＣＤ
３６抗体からなる試薬を用いて検出し、その検出値が健
常人よりも高い場合に、そのヒトは急性心筋梗塞に罹患
していると判定することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、急性心筋梗塞（ac
ute myocardial infarction）の判定方法及び判定用試
薬に関する。
ute myocardial infarction）の判定方法及び判定用試
薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】急性心筋梗塞は、心筋を支配する冠状動
脈が閉塞し、その支配下にある心筋が壊死する疾患であ
る。世界保健機関（ＷＨＯ）は、胸痛、心電図異常
および後述する心筋逸脱酵素の上昇、の全てを有する
者を本疾患に罹患しているとする判定基準を示してい
る。本疾患は近年の食生活等の欧米化により、日本にお
いて急激に増加している。
脈が閉塞し、その支配下にある心筋が壊死する疾患であ
る。世界保健機関（ＷＨＯ）は、胸痛、心電図異常
および後述する心筋逸脱酵素の上昇、の全てを有する
者を本疾患に罹患しているとする判定基準を示してい
る。本疾患は近年の食生活等の欧米化により、日本にお
いて急激に増加している。
【０００３】急性心筋梗塞は、主な症状である激しい胸
痛及び呼吸困難を伴い突然に発症し、心筋の梗塞巣の大
きさによっては、発症と同時に心停止に至ることもある
極めて経過の早い疾患である。
痛及び呼吸困難を伴い突然に発症し、心筋の梗塞巣の大
きさによっては、発症と同時に心停止に至ることもある
極めて経過の早い疾患である。
【０００４】本疾患はその経過の早さから、発症後１〜
２時間で患者が死亡することも多く、迅速かつ的確な本
疾患の判定とそれに対応した適切な処置を施すことが救
命のためには重要である。
２時間で患者が死亡することも多く、迅速かつ的確な本
疾患の判定とそれに対応した適切な処置を施すことが救
命のためには重要である。
【０００５】急性心筋梗塞の判定は、激しい胸痛に代表
される症状、心電図検査、心エコー図検査及び血中に存
在する急性心筋梗塞の生化学的マーカーの測定等を総合
的に判断して行われている。この中で生化学的マーカー
の測定は、他の疾患との類症鑑別や梗塞巣の大きさの推
定には欠かせない、非常に重要な項目である。
される症状、心電図検査、心エコー図検査及び血中に存
在する急性心筋梗塞の生化学的マーカーの測定等を総合
的に判断して行われている。この中で生化学的マーカー
の測定は、他の疾患との類症鑑別や梗塞巣の大きさの推
定には欠かせない、非常に重要な項目である。
【０００６】従来、急性心筋梗塞の生化学的マーカーと
しては心筋逸脱酵素、心筋構造蛋白及び心筋細胞質蛋白
が知られている。
しては心筋逸脱酵素、心筋構造蛋白及び心筋細胞質蛋白
が知られている。
【０００７】心筋逸脱酵素として具体的には、クレアチ
ンキナーゼ−ＭＢ（creatine kinase−ＭＢ；ＣＫ−Ｍ
Ｂ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspa
rtateaminotransferase；ＡＳＴ）、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ（lactate dehydrogenase；ＬＤ）、ホスホグリセ
リン酸ムターゼ（phosphoglyceric acid mutase；ＰＧ
ＡＭ）等が知られている。
ンキナーゼ−ＭＢ（creatine kinase−ＭＢ；ＣＫ−Ｍ
Ｂ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspa
rtateaminotransferase；ＡＳＴ）、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ（lactate dehydrogenase；ＬＤ）、ホスホグリセ
リン酸ムターゼ（phosphoglyceric acid mutase；ＰＧ
ＡＭ）等が知られている。
【０００８】また、心筋構造蛋白としてはミオシン軽鎖
（myosin light chain；ＭＬＣ）、トロポニンＴ（trop
oninＴ；ＴｎＴ）、トロポニンＩ（troponinＩ；Ｔｎ
Ｉ）等が、また心筋細胞質蛋白としては、ミオグロビン
（myoglobin；Ｍｂ）、心筋型脂肪酸結合蛋白（heart-t
ype fatty acid-binding protein；Ｈ−ＦＡＢＰ）等が
知られている（臨床検査 40，503-583 1996）。
（myosin light chain；ＭＬＣ）、トロポニンＴ（trop
oninＴ；ＴｎＴ）、トロポニンＩ（troponinＩ；Ｔｎ
Ｉ）等が、また心筋細胞質蛋白としては、ミオグロビン
（myoglobin；Ｍｂ）、心筋型脂肪酸結合蛋白（heart-t
ype fatty acid-binding protein；Ｈ−ＦＡＢＰ）等が
知られている（臨床検査 40，503-583 1996）。
【０００９】これらの生化学的マーカーは、急性心筋梗
塞発症後の経過において、それぞれ特徴的な血中への出
現および消失パターンを有している。例えば、Ｍｂは急
性心筋梗塞発症後速やかに血中へ出現するが、その消失
も速く、発症後時間が経過した患者のマーカーとしては
適当ではない。また、ＣＫ−ＭＢ及びＴｎＴは血中への
出現が遅く、これらマーカーの測定による発症後直ぐの
本疾患の判定は難しい。
塞発症後の経過において、それぞれ特徴的な血中への出
現および消失パターンを有している。例えば、Ｍｂは急
性心筋梗塞発症後速やかに血中へ出現するが、その消失
も速く、発症後時間が経過した患者のマーカーとしては
適当ではない。また、ＣＫ−ＭＢ及びＴｎＴは血中への
出現が遅く、これらマーカーの測定による発症後直ぐの
本疾患の判定は難しい。
【００１０】各マーカーのこのような急性心筋梗塞発症
後の異なる挙動により、１つのマーカーのみでの正確な
急性心筋梗塞の判定は困難である。そこで、実際の臨床
の場では、複数のマーカーを測定し、それらの値を総合
的に判断して急性心筋梗塞の判定が行われている。
後の異なる挙動により、１つのマーカーのみでの正確な
急性心筋梗塞の判定は困難である。そこで、実際の臨床
の場では、複数のマーカーを測定し、それらの値を総合
的に判断して急性心筋梗塞の判定が行われている。
【００１１】一般にこれらの生化学的マーカーの測定
は、各マーカーに特異的な抗体を用いる免疫学的方法を
利用した市販の試薬により行われている。
は、各マーカーに特異的な抗体を用いる免疫学的方法を
利用した市販の試薬により行われている。
【００１２】一方、ＣＤ３６抗原（以下、本抗原という
こともある）は、その構造や機能により多種に分類され
ているＣＤ抗原の一種である。すなわち、ＣＤ３６抗原
は、国際的なＣＤ（cluster of differentiation）分類
（ＣＤ classification）により分類されたＣＤ抗原の
一種であり、心筋、血小板および単球などの細胞におい
て発現している糖蛋白である。
こともある）は、その構造や機能により多種に分類され
ているＣＤ抗原の一種である。すなわち、ＣＤ３６抗原
は、国際的なＣＤ（cluster of differentiation）分類
（ＣＤ classification）により分類されたＣＤ抗原の
一種であり、心筋、血小板および単球などの細胞におい
て発現している糖蛋白である。
【００１３】これまでに、本抗原と各種疾病との関係が
研究されている。
研究されている。
【００１４】例えば、Yamamotoらはフローサイトメトリ
ー法により血小板のＣＤ３６抗原の欠損を検出し、血小
板機能との関係について検討している（Br. J. Haemato
l. 81, 86-92, 1992）。しかし、そこには急性心筋梗塞
と本抗原との関係については全く言及されてはいない。
ー法により血小板のＣＤ３６抗原の欠損を検出し、血小
板機能との関係について検討している（Br. J. Haemato
l. 81, 86-92, 1992）。しかし、そこには急性心筋梗塞
と本抗原との関係については全く言及されてはいない。
【００１５】また例えば、特開平１０−１６０７３３号
公報にはヒトから分離された細胞のＣＤ３６抗原の異常
（欠損または変異）を検出し、肥大型心筋症を判定する
方法が記載されている。しかし、そこに記載されている
肥大型心筋症は遺伝的に左心室壁が異常に肥大し、その
結果左心室の拡張機能が障害される心臓疾患であり、本
発明における急性心筋梗塞とはその病態が全く異なる。
公報にはヒトから分離された細胞のＣＤ３６抗原の異常
（欠損または変異）を検出し、肥大型心筋症を判定する
方法が記載されている。しかし、そこに記載されている
肥大型心筋症は遺伝的に左心室壁が異常に肥大し、その
結果左心室の拡張機能が障害される心臓疾患であり、本
発明における急性心筋梗塞とはその病態が全く異なる。
【００１６】このように、現在までＣＤ３６抗原と急性
心筋梗塞との関係は全く知られてはいない。
心筋梗塞との関係は全く知られてはいない。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】このような状況におい
て、本発明の課題は、急性心筋梗塞の新規な判定方法及
び判定用試薬を提供することにある。
て、本発明の課題は、急性心筋梗塞の新規な判定方法及
び判定用試薬を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者らはＣＤ３６抗原が心筋細胞に存在するこ
とに着目し、急性心筋梗塞患者及び健常人から分離した
血液中のＣＤ３６抗原レベルを比較検討したところ、血
液中のＣＤ３６抗原量と急性心筋梗塞との間には高い相
関関係があること見い出し、本発明を完成した。
に、本発明者らはＣＤ３６抗原が心筋細胞に存在するこ
とに着目し、急性心筋梗塞患者及び健常人から分離した
血液中のＣＤ３６抗原レベルを比較検討したところ、血
液中のＣＤ３６抗原量と急性心筋梗塞との間には高い相
関関係があること見い出し、本発明を完成した。
【００１９】本発明によれば、急性心筋梗塞の判定が可
能となる。より具体的には、ヒトから分離された生物試
料中のＣＤ３６抗原を検出し、健常人の検出値よりも高
い場合に、そのヒトは急性心筋梗塞に罹患している疑い
があると判定することができる。
能となる。より具体的には、ヒトから分離された生物試
料中のＣＤ３６抗原を検出し、健常人の検出値よりも高
い場合に、そのヒトは急性心筋梗塞に罹患している疑い
があると判定することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明は、ヒトから分離された生
物試料中のＣＤ３６抗原を検出することを特徴とする急
性心筋梗塞の判定方法に関する。
物試料中のＣＤ３６抗原を検出することを特徴とする急
性心筋梗塞の判定方法に関する。
【００２１】ここにおいて、「急性心筋梗塞の判定」な
る用語は、発症している本疾患の存在を推定することの
みならず、発症している場合にその重症度、すなわち、
梗塞巣の大きさを推定することも意味する。
る用語は、発症している本疾患の存在を推定することの
みならず、発症している場合にその重症度、すなわち、
梗塞巣の大きさを推定することも意味する。
【００２２】判定は、ＣＤ３６抗原の検出のみに依存し
て行ってもよいが、他の判定方法、例えば、心電図検
査、心エコー図検査及びＣＤ３６抗原以外の急性心筋梗
塞の生化学的マーカーの測定等と組み合わせることによ
って本疾患の判定がより確実になる。
て行ってもよいが、他の判定方法、例えば、心電図検
査、心エコー図検査及びＣＤ３６抗原以外の急性心筋梗
塞の生化学的マーカーの測定等と組み合わせることによ
って本疾患の判定がより確実になる。
【００２３】本発明における生物試料としては血液、
尿、唾液等の液体試料が挙げられ、特に血液が好まし
い。しかし、血液にはＣＤ３６抗原を常に発現している
血球や血小板が存在しているのでこれらを除いたもの、
すなわち血清や血漿を生物試料とするのが最も好まし
い。
尿、唾液等の液体試料が挙げられ、特に血液が好まし
い。しかし、血液にはＣＤ３６抗原を常に発現している
血球や血小板が存在しているのでこれらを除いたもの、
すなわち血清や血漿を生物試料とするのが最も好まし
い。
【００２４】ＣＤ３６抗原の検出はいずれの方法により
行ってもよい。さらにこれらの方法は、定性、定量ある
いは半定量の何れを目的とするものであってもよい。そ
の中でもＣＤ３６抗原を認識する抗体（以下、抗ＣＤ３
６抗体ということもある）、特にモノクローナル抗体が
有する特異反応を利用する免疫学的方法が好ましい。
行ってもよい。さらにこれらの方法は、定性、定量ある
いは半定量の何れを目的とするものであってもよい。そ
の中でもＣＤ３６抗原を認識する抗体（以下、抗ＣＤ３
６抗体ということもある）、特にモノクローナル抗体が
有する特異反応を利用する免疫学的方法が好ましい。
【００２５】免疫学的方法としては、標識抗体を用いる
方法と用いない方法とがある。標識抗体を用いる免疫学
的な方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、放射
性免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ
法）、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法な
どが挙げられる。この中で好ましいのはＥＩＡ法であ
る。２種類の抗体、特にモノクローナル抗体を用いたサ
ンドイッチＥＩＡ法が抗原に対する特異性および検出操
作の容易性において更に好ましい。
方法と用いない方法とがある。標識抗体を用いる免疫学
的な方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、放射
性免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ
法）、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法な
どが挙げられる。この中で好ましいのはＥＩＡ法であ
る。２種類の抗体、特にモノクローナル抗体を用いたサ
ンドイッチＥＩＡ法が抗原に対する特異性および検出操
作の容易性において更に好ましい。
【００２６】サンドイッチＥＩＡ法によるＣＤ３６抗原
の検出は、ＣＤ３６抗原の異なるエピトープを認識する
２種類の抗体、すなわち固相化抗体と酵素標識抗体との
間にＣＤ３６抗原を挟み込み（サンドイッチ）、ＣＤ３
６抗原に結合した標識抗体の酵素量を測ることにより行
うことができる。
の検出は、ＣＤ３６抗原の異なるエピトープを認識する
２種類の抗体、すなわち固相化抗体と酵素標識抗体との
間にＣＤ３６抗原を挟み込み（サンドイッチ）、ＣＤ３
６抗原に結合した標識抗体の酵素量を測ることにより行
うことができる。
【００２７】また、サンドイッチ法を原理とする別の方
法として、いわゆるイムノクロマト法があり、本方法の
実施には特別な測定機器は不要であるため、迅速な診断
を必要とする本疾患の判定には有利な方法である。
法として、いわゆるイムノクロマト法があり、本方法の
実施には特別な測定機器は不要であるため、迅速な診断
を必要とする本疾患の判定には有利な方法である。
【００２８】標識抗体を用いない免疫学的方法として
は、抗体感作ラテックス粒子と抗原との凝集反応を利用
したラテックス凝集法、抗原抗体複合体形成に伴う濁度
を測定する比濁法、抗体固相膜電極を利用し抗原との結
合による電位変化を検出する酵素センサー電極法等があ
り、何れの方法によってもＣＤ３６抗原を検出すること
ができる。
は、抗体感作ラテックス粒子と抗原との凝集反応を利用
したラテックス凝集法、抗原抗体複合体形成に伴う濁度
を測定する比濁法、抗体固相膜電極を利用し抗原との結
合による電位変化を検出する酵素センサー電極法等があ
り、何れの方法によってもＣＤ３６抗原を検出すること
ができる。
【００２９】急性心筋梗塞の判定は、このようにして検
出された生物試料中のＣＤ３６抗原量を健常人の場合と
比較することにより行うことができる。すなわち、健常
人の値よりも高い場合に急性心筋梗塞に罹患していると
判定することができる。また、ＣＤ３６抗原の検出限界
が健常人レベル以上であるＣＤ３６抗原の定性的な検出
方法を採用すれば、急性心筋梗塞の陽性、陰性の判定も
可能である。さらに、予め求めておいた本抗原量と梗塞
巣の大きさとの関係から、本疾患の重症度を推定するこ
ともできる。
出された生物試料中のＣＤ３６抗原量を健常人の場合と
比較することにより行うことができる。すなわち、健常
人の値よりも高い場合に急性心筋梗塞に罹患していると
判定することができる。また、ＣＤ３６抗原の検出限界
が健常人レベル以上であるＣＤ３６抗原の定性的な検出
方法を採用すれば、急性心筋梗塞の陽性、陰性の判定も
可能である。さらに、予め求めておいた本抗原量と梗塞
巣の大きさとの関係から、本疾患の重症度を推定するこ
ともできる。
【００３０】また、本発明は少なくともＣＤ３６抗原を
認識する抗体からなる急性心筋梗塞の判定用試薬に関す
る。
認識する抗体からなる急性心筋梗塞の判定用試薬に関す
る。
【００３１】本発明の判定用試薬は本発明の判定方法の
実施に直接使用されるものであり、急性心筋梗塞の判定
方法と同一の目的を達成するものである。
実施に直接使用されるものであり、急性心筋梗塞の判定
方法と同一の目的を達成するものである。
【００３２】本発明の判定用試薬である抗ＣＤ３６抗体
は、遊離の状態、標識された状態または固定化された状
態で前述の免疫学的方法に適用される。
は、遊離の状態、標識された状態または固定化された状
態で前述の免疫学的方法に適用される。
【００３３】本発明の判定用試薬は抗ＣＤ３６ポリクロ
ーナル抗体でもよいが、特異性及び抗体の均一性が高い
点において抗ＣＤ３６モノクローナル抗体の方が好まし
い。本抗体は後記実施例に示すように市販のものを入手
することができる。また、下記工程によって製造するこ
ともできる。
ーナル抗体でもよいが、特異性及び抗体の均一性が高い
点において抗ＣＤ３６モノクローナル抗体の方が好まし
い。本抗体は後記実施例に示すように市販のものを入手
することができる。また、下記工程によって製造するこ
ともできる。
【００３４】ポリクローナル抗体は、ヒトの心筋等の細
胞から精製したＣＤ３６抗原、または遺伝子組み換え技
術により製造したＣＤ３６抗原を適当なアジュバントと
ともにマウス、ラット、ウサギなどの動物に免疫し、血
液を採取して公知の処理をなすことにより製造すること
ができる。
胞から精製したＣＤ３６抗原、または遺伝子組み換え技
術により製造したＣＤ３６抗原を適当なアジュバントと
ともにマウス、ラット、ウサギなどの動物に免疫し、血
液を採取して公知の処理をなすことにより製造すること
ができる。
【００３５】またモノクローナル抗体は、このように免
疫した動物の脾臓細胞を採取し、ミルシュタインらの方
法によりミエローマ細胞との細胞融合、抗体産生細胞の
スクリーニング及びクローニング等を行い、抗ＣＤ３６
モノクローナル抗体を産生する細胞株を樹立し、これを
培養することにより製造することができる。
疫した動物の脾臓細胞を採取し、ミルシュタインらの方
法によりミエローマ細胞との細胞融合、抗体産生細胞の
スクリーニング及びクローニング等を行い、抗ＣＤ３６
モノクローナル抗体を産生する細胞株を樹立し、これを
培養することにより製造することができる。
【００３６】サンドイッチＥＩＡ法に本発明の心筋梗塞
判定用試薬を適用する場合には、本試薬は固相化抗ＣＤ
３６抗体及び酵素標識抗ＣＤ３６抗体の形をとる。
判定用試薬を適用する場合には、本試薬は固相化抗ＣＤ
３６抗体及び酵素標識抗ＣＤ３６抗体の形をとる。
【００３７】固相化抗ＣＤ３６抗体は、前述のようにし
て得られた抗体を固相、例えばマイクロプレートウェル
やプラスチックビーズに結合させることにより製造する
ことができる。固相への結合は通常、抗体をクエン酸緩
衝液等の適当な緩衝液に溶解し、固相表面と抗体溶液を
適当な時間（１〜２日）接触させることにより行うこと
ができる。そして、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のリン
酸緩衝溶液を固相と接触させることにより、抗体によっ
てコートされなかった固相表面部分をＢＳＡでコートす
ることが一般的に行われる。
て得られた抗体を固相、例えばマイクロプレートウェル
やプラスチックビーズに結合させることにより製造する
ことができる。固相への結合は通常、抗体をクエン酸緩
衝液等の適当な緩衝液に溶解し、固相表面と抗体溶液を
適当な時間（１〜２日）接触させることにより行うこと
ができる。そして、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のリン
酸緩衝溶液を固相と接触させることにより、抗体によっ
てコートされなかった固相表面部分をＢＳＡでコートす
ることが一般的に行われる。
【００３８】酵素標識抗ＣＤ３６抗体は、前述の固相化
抗体とは異なるＣＤ３６抗原のエピトープを認識する抗
体と酵素を結合（標識）させることにより製造すること
ができる。本抗体を標識する酵素としては、アルカリホ
スファターゼ、グルコースオキシダーゼ、パーオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
抗体とは異なるＣＤ３６抗原のエピトープを認識する抗
体と酵素を結合（標識）させることにより製造すること
ができる。本抗体を標識する酵素としては、アルカリホ
スファターゼ、グルコースオキシダーゼ、パーオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
【００３９】これらの酵素と抗ＣＤ３６抗体との結合は
それ自体公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、
マレイミド法などにより行うことができる。酵素標識抗
体はアビジン−ビオチン反応を利用した方法、すなわ
ち、後記実施例に示すように酵素の代わりにビオチンで
標識した抗体をＣＤ３６抗原に反応させ、その後に酵素
標識ストレプトアビジンを結合させることにより形成さ
せてもよい。
それ自体公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、
マレイミド法などにより行うことができる。酵素標識抗
体はアビジン−ビオチン反応を利用した方法、すなわ
ち、後記実施例に示すように酵素の代わりにビオチンで
標識した抗体をＣＤ３６抗原に反応させ、その後に酵素
標識ストレプトアビジンを結合させることにより形成さ
せてもよい。
【００４０】サンドイッチＥＩＡ法では、抗ＣＤ３６抗
体以外に必要に応じて、酵素基質、洗浄液、反応停止
液、標準抗原、基質溶解液などが使用され、これらの試
薬も本発明の急性心筋梗塞判定用試薬を構成するもので
ある。
体以外に必要に応じて、酵素基質、洗浄液、反応停止
液、標準抗原、基質溶解液などが使用され、これらの試
薬も本発明の急性心筋梗塞判定用試薬を構成するもので
ある。
【００４１】酵素基質としては、選択した標識酵素に応
じて適当なものが選ばれる。例えば、酵素としてアルカ
リフォスファターゼを選択した場合においてはｐ−ニト
ロフェニルフォスフェート（ＰＮＰＰ）等が挙げられ
る。また、パーオキシダーゼを選択した場合においては
基質として過酸化水素が挙げられ、この際発色剤として
ｏ−フェニレンジアミン、テトラメチルベンチジン（Ｔ
ＭＢ）などが用いられる。
じて適当なものが選ばれる。例えば、酵素としてアルカ
リフォスファターゼを選択した場合においてはｐ−ニト
ロフェニルフォスフェート（ＰＮＰＰ）等が挙げられ
る。また、パーオキシダーゼを選択した場合においては
基質として過酸化水素が挙げられ、この際発色剤として
ｏ−フェニレンジアミン、テトラメチルベンチジン（Ｔ
ＭＢ）などが用いられる。
【００４２】また、例えば特開昭６１−１４５４５９号
公報や特表平１−５０３１７４号公報などに記載のイム
ノクロマト法に本発明の判定用試薬を適用することがで
きる。本法では全ての反応系がシート状のキャリア上に
保持されており、生物試料の添加のみで操作が終了す
る。生物試料がキャリアに適用されると、試料中のＣＤ
３６抗原が、金コロイドなどで標識された抗体と結合
し、この結合体がキャリア上をクロマト的に展開してゆ
き、ある特定位置に固相化された抗体に捕捉され、標識
物の集積を肉眼で観察することによりＣＤ３６抗原を検
出することができる。本試薬は迅速な判定を要する本疾
患の判定用試薬として好適である。
公報や特表平１−５０３１７４号公報などに記載のイム
ノクロマト法に本発明の判定用試薬を適用することがで
きる。本法では全ての反応系がシート状のキャリア上に
保持されており、生物試料の添加のみで操作が終了す
る。生物試料がキャリアに適用されると、試料中のＣＤ
３６抗原が、金コロイドなどで標識された抗体と結合
し、この結合体がキャリア上をクロマト的に展開してゆ
き、ある特定位置に固相化された抗体に捕捉され、標識
物の集積を肉眼で観察することによりＣＤ３６抗原を検
出することができる。本試薬は迅速な判定を要する本疾
患の判定用試薬として好適である。
【００４３】ＲＩＡ法やＦＩＡ法などにも前述のＥＩＡ
試薬の場合と同様に本発明の判定用試薬が適用できる。
試薬の場合と同様に本発明の判定用試薬が適用できる。
【００４４】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体
的に説明する。
的に説明する。
【００４５】実施例１− 急性心筋梗塞判定用試薬の製造
【００４６】下記の〜の成分からなる急性心筋梗塞
判定用試薬を製造した。
判定用試薬を製造した。
【００４７】固相化抗ＣＤ３６抗体：マウス抗ヒトＣ
Ｄ３６モノクローナル抗体（MCA1214；SEROTEC社製）を
０．０５ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶
解し、５μｇ／ｍＬ抗体溶液を調製した。この抗体溶液
を９６穴マイクロプレートウエルに１００μＬ／ウェル
ずつ分注し、２５℃にて２日間放置した。その後、この
抗体溶液を除去し、各ウェルを０．１％ＢＳＡ及び０．
１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む０．０４ｍｏｌ／Ｌリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００μＬで２回洗浄した。
０．５ｍｇ／ｍＬのカゼインを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌク
エン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３００μＬ／ウェルずつ
分注し、２５℃で３時間放置することによりブロッキン
グを行い、標記抗体を得た。
Ｄ３６モノクローナル抗体（MCA1214；SEROTEC社製）を
０．０５ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶
解し、５μｇ／ｍＬ抗体溶液を調製した。この抗体溶液
を９６穴マイクロプレートウエルに１００μＬ／ウェル
ずつ分注し、２５℃にて２日間放置した。その後、この
抗体溶液を除去し、各ウェルを０．１％ＢＳＡ及び０．
１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む０．０４ｍｏｌ／Ｌリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００μＬで２回洗浄した。
０．５ｍｇ／ｍＬのカゼインを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌク
エン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３００μＬ／ウェルずつ
分注し、２５℃で３時間放置することによりブロッキン
グを行い、標記抗体を得た。
【００４８】ビオチン標識抗ＣＤ３６抗体：マウス抗
ヒトＣＤ３６モノクローナル抗体（VM58；MONOSAN社
製）２００μｇを１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．
５）０．２ｍＬに溶解し、５ｍｇ／ｍＬに調製したＮＨ
Ｓ−ＬＣビオチン（フナコシ社製）／ＤＭＳＯ溶液５μ
Ｌを添加した。激しく撹拌後、４℃にて１６時間放置
し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを用いてビオチン
化抗体と過剰の試薬を分離し、標記抗体を得た。本抗体
は０．１％ＢＳＡ及び０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを
含む０．０４ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
より１μｇ／ｍＬに希釈して使用した。
ヒトＣＤ３６モノクローナル抗体（VM58；MONOSAN社
製）２００μｇを１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．
５）０．２ｍＬに溶解し、５ｍｇ／ｍＬに調製したＮＨ
Ｓ−ＬＣビオチン（フナコシ社製）／ＤＭＳＯ溶液５μ
Ｌを添加した。激しく撹拌後、４℃にて１６時間放置
し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを用いてビオチン
化抗体と過剰の試薬を分離し、標記抗体を得た。本抗体
は０．１％ＢＳＡ及び０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを
含む０．０４ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
より１μｇ／ｍＬに希釈して使用した。
【００４９】パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジ
ン溶液：パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（SE
ROTEC社製）を０．２ｍｇ／ｍＬのカゼイン及び０．５
％チラミン（パーオキシダーゼ安定剤）を含む１０ｍｍ
ｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１０００倍
希釈し、標記溶液を得た。
ン溶液：パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（SE
ROTEC社製）を０．２ｍｇ／ｍＬのカゼイン及び０．５
％チラミン（パーオキシダーゼ安定剤）を含む１０ｍｍ
ｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１０００倍
希釈し、標記溶液を得た。
【００５０】酵素基質液：標記試薬として０．５ｍｇ
／ｍＬテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を含む過酸化
水素水溶液（ＤＡＫＯ社製）を用いた。
／ｍＬテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を含む過酸化
水素水溶液（ＤＡＫＯ社製）を用いた。
【００５１】反応停止液：標記試薬として１．６Ｎ硫
酸液を用いた。
酸液を用いた。
【００５２】洗浄液：０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ
ｌ、０．０５％ポリソルベート８０、０．０３％Ｔｒｉ
ｔｏｎ（登録商標）Ｘ−４０５及び０．０１％防腐剤
（１．１５％５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾ
リン−３−オン、０．３５％２−メチル−４−イソチア
ゾリン−３−オン及び２３．０％ＭｇＣｌ2を含む水溶
液；ローム・アンド・ハース社製）を含む０．０４ｍｏ
ｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を標記試薬として用
いた。
ｌ、０．０５％ポリソルベート８０、０．０３％Ｔｒｉ
ｔｏｎ（登録商標）Ｘ−４０５及び０．０１％防腐剤
（１．１５％５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾ
リン−３−オン、０．３５％２−メチル−４−イソチア
ゾリン−３−オン及び２３．０％ＭｇＣｌ2を含む水溶
液；ローム・アンド・ハース社製）を含む０．０４ｍｏ
ｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を標記試薬として用
いた。
【００５３】実施例２− 急性心筋梗塞の判定
【００５４】実施例１に記載の判定用試薬を用いて、急
性心筋梗塞患者及び健常人の血中ＣＤ３６抗原を検出し
た。
性心筋梗塞患者及び健常人の血中ＣＤ３６抗原を検出し
た。
【００５５】前述のＷＨＯの基準によって判定された急
性心筋梗塞患者２０例及び健常人２０例の肘静脈から血
液をプレーン採血管に採取し、３０分静置後、遠心分離
（３０００ｒｐｍ、１０分間）したものを生物試料とし
て用いた。
性心筋梗塞患者２０例及び健常人２０例の肘静脈から血
液をプレーン採血管に採取し、３０分静置後、遠心分離
（３０００ｒｐｍ、１０分間）したものを生物試料とし
て用いた。
【００５６】マウス抗ヒトＣＤ３６モノクローナル抗体
固相化マイクロプレートウェルに試料血清を100μＬず
つ分注し、２５℃にて１６時間インキュベーションした
（一次抗原抗体反応）。次に、液体部分を吸引除去し、
３００μＬの洗浄液で各ウェルを３回洗浄後、ビオチン
標識マウス抗ヒトＣＤ３６モノクローナル抗体液を１０
０μＬずつ添加した。２５℃にて１時間インキュベーシ
ョンした後（二次抗原抗体反応）、液体部分を除去し、
３００μＬの洗浄液にて３回洗浄した。その後、パーオ
キシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液を１００μＬず
つ添加し、２５℃にて３０分間インキュベーションした
後、３００μＬの洗浄液にて３回洗浄した。そして酵素
基質液を１００μＬずつ添加し、遮光条件下で、２５℃
にて３０分間インキュベーションし（酵素反応）、反応
停止液１００μＬを加えて酵素反応を停止した。次に発
色強度（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）を測定
した。
固相化マイクロプレートウェルに試料血清を100μＬず
つ分注し、２５℃にて１６時間インキュベーションした
（一次抗原抗体反応）。次に、液体部分を吸引除去し、
３００μＬの洗浄液で各ウェルを３回洗浄後、ビオチン
標識マウス抗ヒトＣＤ３６モノクローナル抗体液を１０
０μＬずつ添加した。２５℃にて１時間インキュベーシ
ョンした後（二次抗原抗体反応）、液体部分を除去し、
３００μＬの洗浄液にて３回洗浄した。その後、パーオ
キシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液を１００μＬず
つ添加し、２５℃にて３０分間インキュベーションした
後、３００μＬの洗浄液にて３回洗浄した。そして酵素
基質液を１００μＬずつ添加し、遮光条件下で、２５℃
にて３０分間インキュベーションし（酵素反応）、反応
停止液１００μＬを加えて酵素反応を停止した。次に発
色強度（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）を測定
した。
【００５７】なお、陽性コントロールとして、ＣＤ３６
抗原が豊富に発現していると考えられるヒト心筋約０．
１ｇを１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む
０．０４ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬ
中でホモジネートしたものの上清を用いた。
抗原が豊富に発現していると考えられるヒト心筋約０．
１ｇを１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む
０．０４ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬ
中でホモジネートしたものの上清を用いた。
【００５８】結果を図１に示す。急性心筋梗塞患者血清
（２０例）の平均吸光度は０．２７９であるのに対し
て、健常人（２０例）のそれは０．０８３であり、両者
には有意な差（ｔ検定；ｐ＜０．０００１）が認められ
た。なお、陽性コントロールの吸光度は０．８５６であ
った。
（２０例）の平均吸光度は０．２７９であるのに対し
て、健常人（２０例）のそれは０．０８３であり、両者
には有意な差（ｔ検定；ｐ＜０．０００１）が認められ
た。なお、陽性コントロールの吸光度は０．８５６であ
った。
【００５９】
【発明の効果】本発明の判定方法または判定用試薬によ
り急性心筋梗塞の判定ができ、本疾患の臨床の場、特に
救急医療において有用である。
り急性心筋梗塞の判定ができ、本疾患の臨床の場、特に
救急医療において有用である。
【図１】図１は、実施例２において測定した急性心筋梗
塞患者群及び健常人群の血清中ＣＤ３６抗原量の分布図
である。
塞患者群及び健常人群の血清中ＣＤ３６抗原量の分布図
である。
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒトから分離された生物試料中のＣＤ３
６抗原を検出することを特徴とする急性心筋梗塞の判定
方法。 - 【請求項２】 ＣＤ３６抗原を認識する抗体を用いてＣ
Ｄ３６抗原を検出する請求項１記載の判定方法。 - 【請求項３】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
２記載の判定方法。 - 【請求項４】 ＣＤ３６抗原を酵素免疫学的方法により
検出する請求項２または３記載の判定方法。 - 【請求項５】 少なくともＣＤ３６抗原を認識する抗体
からなる急性心筋梗塞判定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10352970A JP2000180447A (ja) | 1998-12-11 | 1998-12-11 | 急性心筋梗塞の判定方法及び判定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10352970A JP2000180447A (ja) | 1998-12-11 | 1998-12-11 | 急性心筋梗塞の判定方法及び判定用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000180447A true JP2000180447A (ja) | 2000-06-30 |
Family
ID=18427702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10352970A Pending JP2000180447A (ja) | 1998-12-11 | 1998-12-11 | 急性心筋梗塞の判定方法及び判定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000180447A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005116644A2 (en) * | 2004-05-26 | 2005-12-08 | Atherocheck Aps | Method of evaluation of the relative risk of developing atherosclerosis in patients |
| WO2008095492A2 (en) | 2007-02-05 | 2008-08-14 | Aarhus Universitet | A method for diagnosing atherosclerotic plaques by measurement of cd36 |
| US9372190B2 (en) | 2004-05-26 | 2016-06-21 | Region Nordjylland | Method of evaluation of the relative risk of developing atherosclerosis in patients |
| US20160202268A1 (en) * | 2015-01-11 | 2016-07-14 | VIT University (Vellore Institute of Technology) | Method of diagnosing kidney damage in diabetic patients using urinary cd36 as a biomarker |
-
1998
- 1998-12-11 JP JP10352970A patent/JP2000180447A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005116644A2 (en) * | 2004-05-26 | 2005-12-08 | Atherocheck Aps | Method of evaluation of the relative risk of developing atherosclerosis in patients |
| WO2005116644A3 (en) * | 2004-05-26 | 2006-01-05 | Aase Handberg | Method of evaluation of the relative risk of developing atherosclerosis in patients |
| US9372190B2 (en) | 2004-05-26 | 2016-06-21 | Region Nordjylland | Method of evaluation of the relative risk of developing atherosclerosis in patients |
| WO2008095492A2 (en) | 2007-02-05 | 2008-08-14 | Aarhus Universitet | A method for diagnosing atherosclerotic plaques by measurement of cd36 |
| WO2008095492A3 (en) * | 2007-02-05 | 2008-10-02 | Univ Aarhus | A method for diagnosing atherosclerotic plaques by measurement of cd36 |
| CN101627135B (zh) * | 2007-02-05 | 2013-04-10 | 北日德兰大区 | 通过测量cd36诊断动脉粥样硬化斑块的方法 |
| US20160202268A1 (en) * | 2015-01-11 | 2016-07-14 | VIT University (Vellore Institute of Technology) | Method of diagnosing kidney damage in diabetic patients using urinary cd36 as a biomarker |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7421 Effective date: 20040506 |