JP3308027B2 - 一又はそれより多い被分析物質の免疫学的測定のための診断方法 - Google Patents
一又はそれより多い被分析物質の免疫学的測定のための診断方法Info
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Description
【０００１】本発明は、特異的結合性パートナーにより
一又はそれより多い被分析物質（analyte）を免疫学的
に測定するための改良された診断方法であって、一方の
特異的結合性パートナーを担体に固定しそして第一特異
的結合性パートナーへの被分析物質結合度を、この被分
析物質に対して特異的でありかつ直接にまたは更なる結
合性パートナーを介して標識された第二結合性パートナ
ーにより測定することより成る方法に関する。
一又はそれより多い被分析物質（analyte）を免疫学的
に測定するための改良された診断方法であって、一方の
特異的結合性パートナーを担体に固定しそして第一特異
的結合性パートナーへの被分析物質結合度を、この被分
析物質に対して特異的でありかつ直接にまたは更なる結
合性パートナーを介して標識された第二結合性パートナ
ーにより測定することより成る方法に関する。
【０００２】「神経細胞接着分子」（neural cell adhe
sion molecule; ＮＣＡＭ）は、ヒトのほか動物例えば
マウス、ニワトリなどの様々な組織、特に神経組織で発
現される細胞間接着タンパク質である。分子量の異なる
三つのイソ型（isoforms）が報告されており、またそれ
らは付加的に例えば異なるグリコシル化パターンなどに
より修飾され得る（Nybroe et al., Neurochem. Int. 1
2, 215〜262, 1988）。更に、ＮＣＡＭは免疫組織化学
的研究から、肺のヒト小細胞癌(ＳＣＬＣ, small cell
lung cancer）の腫瘍関連抗原として知られている（Kib
belaar et al.,J. Pathol. 159: 23〜28, 1989）。α−
２,８−結合Ｎ−アセチル−ノイラミン酸鎖（２,８−Ｎ
ＡｃＮ）に対し特異的なＭＡｂ ７３５(Frosch et al.,
Proc Natl. Acad. Sci, 82: 1194〜1198, 1985; Finne
et al., J. Immunol. 138: 4402〜4407, 1987)を固相
抗体としてＭＡｂ ＢＷ ＳＣＬＣ−１（ＦＣＡＣＣ寄託
Ｎｏ．９０ ０２２ １１０）またはＢＷ ＳＣＬＣ−２
（ＥＣＡＣＣ寄託Ｎｏ. ９０ ０２２ １０９）と組合せ
て用いることによりいわゆる「胚」（embryonic）ＮＣ
ＡＭイソ型を認識できるイムノアッセイを用いることに
より、驚くべきことに、このイソ型または前述の抗体に
より規定される抗原（Ｔ−ＮＣＡＭ)が多数のＳＣＬＣ
患者の血清中に高濃度に存在することが示された（ＥＰ
−Ａ−０,４４３,５９９ Ａ２）。
sion molecule; ＮＣＡＭ）は、ヒトのほか動物例えば
マウス、ニワトリなどの様々な組織、特に神経組織で発
現される細胞間接着タンパク質である。分子量の異なる
三つのイソ型（isoforms）が報告されており、またそれ
らは付加的に例えば異なるグリコシル化パターンなどに
より修飾され得る（Nybroe et al., Neurochem. Int. 1
2, 215〜262, 1988）。更に、ＮＣＡＭは免疫組織化学
的研究から、肺のヒト小細胞癌(ＳＣＬＣ, small cell
lung cancer）の腫瘍関連抗原として知られている（Kib
belaar et al.,J. Pathol. 159: 23〜28, 1989）。α−
２,８−結合Ｎ−アセチル−ノイラミン酸鎖（２,８−Ｎ
ＡｃＮ）に対し特異的なＭＡｂ ７３５(Frosch et al.,
Proc Natl. Acad. Sci, 82: 1194〜1198, 1985; Finne
et al., J. Immunol. 138: 4402〜4407, 1987)を固相
抗体としてＭＡｂ ＢＷ ＳＣＬＣ−１（ＦＣＡＣＣ寄託
Ｎｏ．９０ ０２２ １１０）またはＢＷ ＳＣＬＣ−２
（ＥＣＡＣＣ寄託Ｎｏ. ９０ ０２２ １０９）と組合せ
て用いることによりいわゆる「胚」（embryonic）ＮＣ
ＡＭイソ型を認識できるイムノアッセイを用いることに
より、驚くべきことに、このイソ型または前述の抗体に
より規定される抗原（Ｔ−ＮＣＡＭ)が多数のＳＣＬＣ
患者の血清中に高濃度に存在することが示された（ＥＰ
−Ａ−０,４４３,５９９ Ａ２）。
【０００３】初期段階で胎児奇形を検出するために様々
な診断方法が妊娠監視に用いられている。これに関連し
て、羊液または妊産婦血清中のα−フェトプロテイン
（ＡＦＰ）の免疫化学的測定が特に有用であることがわ
かっており、その場合ＡＦＰ濃度の上昇は胚神経管の欠
陥の指標となる。
な診断方法が妊娠監視に用いられている。これに関連し
て、羊液または妊産婦血清中のα−フェトプロテイン
（ＡＦＰ）の免疫化学的測定が特に有用であることがわ
かっており、その場合ＡＦＰ濃度の上昇は胚神経管の欠
陥の指標となる。
【０００４】しかしながら、偽陽性および偽陰性所見が
得られるため、この指標に対しては付加的検査を行うこ
とが推奨される。Ibsenら（J. Neurochem. 41: 363〜36
6, 1983）の研究により、更に羊液中の神経細胞接着分
子（＝Ｄ２）の濃度上昇が胎児奇形の指標であることも
知られている。
得られるため、この指標に対しては付加的検査を行うこ
とが推奨される。Ibsenら（J. Neurochem. 41: 363〜36
6, 1983）の研究により、更に羊液中の神経細胞接着分
子（＝Ｄ２）の濃度上昇が胎児奇形の指標であることも
知られている。
【０００５】しかしながら、Ibsenらの研究から、妊娠
監視上の第一試験に対する利用がより容易である妊産婦
血清が検体材料として用いられる場合には、彼等のＤ２
試験の診断選択性、すなわち、健常検体と病的検体との
区別能が不十分であることも明らかである。
監視上の第一試験に対する利用がより容易である妊産婦
血清が検体材料として用いられる場合には、彼等のＤ２
試験の診断選択性、すなわち、健常検体と病的検体との
区別能が不十分であることも明らかである。
【０００６】更に、Ｔ−ＮＣＡＭ試験をマイクロタイタ
ープレート方式からマイクロキューブ方式に切り換える
と、健常供血者の血清中のＴ−ＮＣＡＭ濃度がより高く
なる一方、腫瘍患者の血清中のＴ−ＮＣＡＭ濃度は両試
験において等しくより高く測定されることが明らかとな
った。この理由は、検体中に他のポリシアル酸鎖と共
に、固相抗体およびトレーサー／コンジュゲート抗体と
交叉反応しそして免疫化学的にいく分反応性の高いマイ
クロキューブ固相に対しより効果的に結合できるＮＣＡ
Ｍイソ型が存在するためかもしれない。
ープレート方式からマイクロキューブ方式に切り換える
と、健常供血者の血清中のＴ−ＮＣＡＭ濃度がより高く
なる一方、腫瘍患者の血清中のＴ−ＮＣＡＭ濃度は両試
験において等しくより高く測定されることが明らかとな
った。この理由は、検体中に他のポリシアル酸鎖と共
に、固相抗体およびトレーサー／コンジュゲート抗体と
交叉反応しそして免疫化学的にいく分反応性の高いマイ
クロキューブ固相に対しより効果的に結合できるＮＣＡ
Ｍイソ型が存在するためかもしれない。
【０００７】従って、本発明の目的は、診断選択性、す
なわち病的検体と正常検体との弁別が改善される、改善
されたＴ−ＮＣＡＭ試験、好ましくは腫瘍の診断検査用
および妊娠監視用の試験を開発することにある。
なわち病的検体と正常検体との弁別が改善される、改善
されたＴ−ＮＣＡＭ試験、好ましくは腫瘍の診断検査用
および妊娠監視用の試験を開発することにある。
【０００８】驚くべきことに、（例えば大腸菌（E. col
i）Ｋ１の莢膜多糖のように）α−２,８−結合Ｎ−アセ
チルノイラミン酸鎖を含み、そして「固相抗体」（例え
ばＴ−ＮＣＡＭ試験に用いられるＭＡｂ ７３５）によ
っては特異的に結合されるが、標識された「トレーサー
−コンジュゲート抗体」（例えばＴ−ＮＣＡＭ試験に用
いられるＭＡｂ ＢＷ ＳＣＬＣ−１および−２）によっ
ては特異的に結合されない適量の物質を検体インキュベ
ーション緩衝液に添加することにより、この目的を達成
できることが見出された。
i）Ｋ１の莢膜多糖のように）α−２,８−結合Ｎ−アセ
チルノイラミン酸鎖を含み、そして「固相抗体」（例え
ばＴ−ＮＣＡＭ試験に用いられるＭＡｂ ７３５）によ
っては特異的に結合されるが、標識された「トレーサー
−コンジュゲート抗体」（例えばＴ−ＮＣＡＭ試験に用
いられるＭＡｂ ＢＷ ＳＣＬＣ−１および−２）によっ
ては特異的に結合されない適量の物質を検体インキュベ
ーション緩衝液に添加することにより、この目的を達成
できることが見出された。
【０００９】従って、本発明は特異的結合性パートナー
により一又はそれより多い被分析物質を免疫学的に測定
するための方法であって、一方の特異的結合性パートナ
ーを担体に固定しそして第一特異的結合性パートナーへ
の被分析物質結合度を、この被分析物質に対して特異的
でありかつ直接にまたは更なる結合性パートナーを介し
て標識された第二結合性パートナーにより測定し、その
際少くとも特異的結合性パートナーの一方との反応が、
この特異的結合性パートナーに対しては高親和性を有す
るが他方のものまたは更なる特異的結合性パートナーに
対しては高親和性を有しない抑制物質の存在下に行われ
ることを特徴とする方法に関する。
により一又はそれより多い被分析物質を免疫学的に測定
するための方法であって、一方の特異的結合性パートナ
ーを担体に固定しそして第一特異的結合性パートナーへ
の被分析物質結合度を、この被分析物質に対して特異的
でありかつ直接にまたは更なる結合性パートナーを介し
て標識された第二結合性パートナーにより測定し、その
際少くとも特異的結合性パートナーの一方との反応が、
この特異的結合性パートナーに対しては高親和性を有す
るが他方のものまたは更なる特異的結合性パートナーに
対しては高親和性を有しない抑制物質の存在下に行われ
ることを特徴とする方法に関する。
【００１０】このタイプの好ましい方法の一つは、第一
特異的結合性パートナーがα−２,８−結合Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸鎖に特異的に結合でき、そして第二結合
性パートナーがモノクローナル抗体ＢＷ ＳＣＬＣ−１
およびＢＷ ＳＣＬＣ−２と同じエピトープに対し特異
的であるものである。
特異的結合性パートナーがα−２,８−結合Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸鎖に特異的に結合でき、そして第二結合
性パートナーがモノクローナル抗体ＢＷ ＳＣＬＣ−１
およびＢＷ ＳＣＬＣ−２と同じエピトープに対し特異
的であるものである。
【００１１】更に本発明は、抑制物質が親和性を有する
結合性パートナーが固相に結合されるこのタイプの方法
に関する。使用される抑制物質は、好ましくはα−２,
８−結合Ｎ−アセチルノイラミン酸鎖を含有する。
結合性パートナーが固相に結合されるこのタイプの方法
に関する。使用される抑制物質は、好ましくはα−２,
８−結合Ｎ−アセチルノイラミン酸鎖を含有する。
【００１２】抑制物質は大腸菌Ｋ１またはＢ型髄膜炎菌
（type B meningococci）由来莢膜の成分またはコロミ
ン酸（colominic acid）から、格別に好ましくはコロミ
ン酸から構成するのが特に好ましい。抑制物質は、試験
標準の測定信号が５０％より低率、好ましくは２０〜４
０％、格別に好ましくは約３０％阻害されるような濃度
で用いられる。このタイプの一方法においては、コロミ
ン酸は０.０１〜１０μｇ／ml、好ましくは０.１〜１μ
ｇ／mlの濃度で用いられる。
（type B meningococci）由来莢膜の成分またはコロミ
ン酸（colominic acid）から、格別に好ましくはコロミ
ン酸から構成するのが特に好ましい。抑制物質は、試験
標準の測定信号が５０％より低率、好ましくは２０〜４
０％、格別に好ましくは約３０％阻害されるような濃度
で用いられる。このタイプの一方法においては、コロミ
ン酸は０.０１〜１０μｇ／ml、好ましくは０.１〜１μ
ｇ／mlの濃度で用いられる。
【００１３】これらの物質の作用の仕方の一つの可能性
は次のとおりである：トレーサー／コンジュゲート抗体
により認識されない２,８−ＮＡｃＮはＭＡｂ ７３５の
フリーの結合部位に対しＴ−ＮＣＡＭ分子および「交叉
反応物質」と競合するものと推定される。例えばＭＡｂ
７３５に対するＴ−ＮＣＡＭおよび２,８−ＮＡｃＮの
結合に差があるため、固相抗体に対する親和性がＴ−Ｎ
ＣＡＭまたは２,８−ＮＡｃＮよりも低い「交叉反応物
質」分子はほとんど結合されず、その結果Ｔ−ＮＣＡＭ
試験の診断選択性は最終的には実質的に改善される。
２,８−ＮＡｃＮを選択することの決定的重要性はその
固相抗体に対する結合能である。ＭＡｂ７３５により特
異的に結合されないが高含量のシアル酸を有する他の糖
タンパク質例えばフェツイン（fetuin）（Sigma）、ム
チン（タイプＩ−Ｓ、Sigma）、α１−酸糖タンパク質
（Behringwerke）、またはシアル酸類（例えばタイプVI
またはタイプVIII、Sigma）は０.１mg／mlまでの濃度で
さえ効果がなかった。
は次のとおりである：トレーサー／コンジュゲート抗体
により認識されない２,８−ＮＡｃＮはＭＡｂ ７３５の
フリーの結合部位に対しＴ−ＮＣＡＭ分子および「交叉
反応物質」と競合するものと推定される。例えばＭＡｂ
７３５に対するＴ−ＮＣＡＭおよび２,８−ＮＡｃＮの
結合に差があるため、固相抗体に対する親和性がＴ−Ｎ
ＣＡＭまたは２,８−ＮＡｃＮよりも低い「交叉反応物
質」分子はほとんど結合されず、その結果Ｔ−ＮＣＡＭ
試験の診断選択性は最終的には実質的に改善される。
２,８−ＮＡｃＮを選択することの決定的重要性はその
固相抗体に対する結合能である。ＭＡｂ７３５により特
異的に結合されないが高含量のシアル酸を有する他の糖
タンパク質例えばフェツイン（fetuin）（Sigma）、ム
チン（タイプＩ−Ｓ、Sigma）、α１−酸糖タンパク質
（Behringwerke）、またはシアル酸類（例えばタイプVI
またはタイプVIII、Sigma）は０.１mg／mlまでの濃度で
さえ効果がなかった。
【００１４】Ｔ−ＮＣＡＭ試験用に見出された本方法
は、同様にして他の試験、例えば抗体−抗原−抗体「サ
ンドイッチ」イムノアッセイまたは抗原−抗体−抗体
「サンドイッチ」イムノアッセイなどにも用いることが
できる。この方法において、検体に含まれそして試験に
用いられた特異的受容体Ｒ１およびＲ２の両方により認
識される交叉反応物質の特異的受容体の一つであるＲ１
（それ自体好ましくは固相に結合されている）に対する
結合は、検体インキュベーション媒質に適切な濃度で添
加される抑制物質により妨げられるが、その際抑制物質
は、交叉反応物質のＲ１に対する結合を競合的に阻害し
また受容体Ｒ２に対する特異的結合を示さない。
は、同様にして他の試験、例えば抗体−抗原−抗体「サ
ンドイッチ」イムノアッセイまたは抗原−抗体−抗体
「サンドイッチ」イムノアッセイなどにも用いることが
できる。この方法において、検体に含まれそして試験に
用いられた特異的受容体Ｒ１およびＲ２の両方により認
識される交叉反応物質の特異的受容体の一つであるＲ１
（それ自体好ましくは固相に結合されている）に対する
結合は、検体インキュベーション媒質に適切な濃度で添
加される抑制物質により妨げられるが、その際抑制物質
は、交叉反応物質のＲ１に対する結合を競合的に阻害し
また受容体Ｒ２に対する特異的結合を示さない。
【００１５】極く少量の特異的抑制物質を用いて得られ
たものと同様の改良はＮａＣｌまたはＣａＣｌ2などで
ははるかに高濃度を用いてのみ得られた。すなわち、１
５０〜２,０００mmol／リットル、特に２５０〜１,００
０mmol／リットルの範囲のＮａＣｌ濃度を用いた検体イ
ンキュベーション緩衝液を用いて良好な結果が得られ
た。８.０以上のpH（pH８〜１０が特に良い）を有する
炭酸塩緩衝液は、pH６〜８の範囲のTris緩衝液またはリ
ン酸塩緩衝液と同様、緩衝液として特に適していること
がわかった。
たものと同様の改良はＮａＣｌまたはＣａＣｌ2などで
ははるかに高濃度を用いてのみ得られた。すなわち、１
５０〜２,０００mmol／リットル、特に２５０〜１,００
０mmol／リットルの範囲のＮａＣｌ濃度を用いた検体イ
ンキュベーション緩衝液を用いて良好な結果が得られ
た。８.０以上のpH（pH８〜１０が特に良い）を有する
炭酸塩緩衝液は、pH６〜８の範囲のTris緩衝液またはリ
ン酸塩緩衝液と同様、緩衝液として特に適していること
がわかった。
【００１６】Ｔ−ＮＣＡＭ試験の診断感度は前述の措置
により著しく改善された。以下、実施例を挙げて本発明
に例示するが、本発明はそれらによっていささかも限定
されるものではない。
により著しく改善された。以下、実施例を挙げて本発明
に例示するが、本発明はそれらによっていささかも限定
されるものではない。
【００１７】実施例１ ヒト体液中Ｔ−ＮＣＡＭ測定用酵素イムノアッセイ Ｔ−ＮＣＡＭ濃度を測定するために、当業者に知られた
方法によりＭＡｂ ７３５でコート済みのマイクロタイ
タープレート（Nunc）の穴に１０μｌの検体材料および
１００μｌの検体緩衝液（ＯＳＮＤ、Behringwerke）を
それぞれピペットでとり、そして１時間３７℃でインキ
ュベートした。
方法によりＭＡｂ ７３５でコート済みのマイクロタイ
タープレート（Nunc）の穴に１０μｌの検体材料および
１００μｌの検体緩衝液（ＯＳＮＤ、Behringwerke）を
それぞれピペットでとり、そして１時間３７℃でインキ
ュベートした。
【００１８】希釈されたEnzygnost洗浄緩衝液（ＯＳＥ
Ｗ、Behringwerke）で３回洗浄後、個々の穴に１００μ
ｌのＭＡｂ ＢＷ ＳＣＬＤ−１−ＰＯＤまたはＢＷ Ｓ
ＣＬＤ−２−ＰＯＤ−コンジュゲートをそれぞれ添加し
た（ここでＰＯＤ＝西洋ワサビペルオキシダーゼ）。次
の＋３７℃における１時間のインキュベーション段階は
３回洗浄サイクルにより終結させた。
Ｗ、Behringwerke）で３回洗浄後、個々の穴に１００μ
ｌのＭＡｂ ＢＷ ＳＣＬＤ−１−ＰＯＤまたはＢＷ Ｓ
ＣＬＤ−２−ＰＯＤ−コンジュゲートをそれぞれ添加し
た（ここでＰＯＤ＝西洋ワサビペルオキシダーゼ）。次
の＋３７℃における１時間のインキュベーション段階は
３回洗浄サイクルにより終結させた。
【００１９】室温での第三インキュベーション段階で
は、次に１００μｌの緩衝剤／基質−発色原溶液（Ｈ2
Ｏ2／ＴＭＢ；ＯＵＶＧ／ＯＵＶＦ、ＢＷ）を各穴にピ
ペットでとり、そして３０分後にEnzygnost停止溶液
（ＯＳＦＡ、ＢＷ）を用いて酵素反応を停止させた。検
体吸光度測定を４５０nmで行った。検体のＴ−ＮＣＡＭ
濃度を添付の標準シリーズを用いて定量測定した（測定
単位：Ｕ／ml）。
は、次に１００μｌの緩衝剤／基質−発色原溶液（Ｈ2
Ｏ2／ＴＭＢ；ＯＵＶＧ／ＯＵＶＦ、ＢＷ）を各穴にピ
ペットでとり、そして３０分後にEnzygnost停止溶液
（ＯＳＦＡ、ＢＷ）を用いて酵素反応を停止させた。検
体吸光度測定を４５０nmで行った。検体のＴ−ＮＣＡＭ
濃度を添付の標準シリーズを用いて定量測定した（測定
単位：Ｕ／ml）。
【００２０】実施例２ 妊娠監視用診断方法 羊水液検体中のＴ−ＮＣＡＭ濃度を実施例１に記載の免
疫化学的方法と同様の方法により測定した。ＡＦＰ濃度
は、商業的に入手できる試験を用いて測定した。
疫化学的方法と同様の方法により測定した。ＡＦＰ濃度
は、商業的に入手できる試験を用いて測定した。
【００２１】結果：胎児奇形（例えば二分脊椎または無
脳体）が存在する場合には羊液検体中に高いＴ−ＮＣＡ
Ｍ濃度が測定された（表１：検体５２、５６および１５
９）。病理学的に高いＡＦＰ濃度を有する検体５３およ
び１３９の場合には、そのＮＣＡＭ濃度は正しく正常範
囲にあり、健常胎児の臨床所見に符合する。このことか
ら、Ｔ−ＮＣＡＭまたはＮＣＡＭ測定診断法が妊娠監視
（胎児奇形の早期発見）に適していると結論しなければ
ならない。
脳体）が存在する場合には羊液検体中に高いＴ−ＮＣＡ
Ｍ濃度が測定された（表１：検体５２、５６および１５
９）。病理学的に高いＡＦＰ濃度を有する検体５３およ
び１３９の場合には、そのＮＣＡＭ濃度は正しく正常範
囲にあり、健常胎児の臨床所見に符合する。このことか
ら、Ｔ−ＮＣＡＭまたはＮＣＡＭ測定診断法が妊娠監視
（胎児奇形の早期発見）に適していると結論しなければ
ならない。
【００２２】
【表１】
【００２３】実施例３ ヒト体液中Ｔ−ＮＣＡＭ測定用化学発光イムノアッセイ Ｔ−ＮＣＡＭ濃度を測定するために、当業者に知られた
方法によりＭＡｂ ７３５でコート済みのポリスチレン
マイクロチューブ（Greiner）に２０μｌの検体材料お
よび２００μｌの検体緩衝液（例えばＯＳＮＤ、Behrin
gwerke）をそれぞれピペットでとり、そして振盪しなが
ら室温で１時間インキュベートした。
方法によりＭＡｂ ７３５でコート済みのポリスチレン
マイクロチューブ（Greiner）に２０μｌの検体材料お
よび２００μｌの検体緩衝液（例えばＯＳＮＤ、Behrin
gwerke）をそれぞれピペットでとり、そして振盪しなが
ら室温で１時間インキュベートした。
【００２４】各々２mlのBeriLux洗浄緩衝液（Behringwe
rke）を用いて２回洗浄後、個々の穴をそれぞれアクリ
ジニウム−Ｎ−アシル−スルホンアミドで標識されたＭ
ＡｂＢＷ ＳＣＬＣ−１またはＢＷ ＳＣＬＣ−２の溶液
２００μｌで満たした。次に振盪しながらの室温で１時
間インキュベーション段階を行い３回洗浄サイクルによ
り終結させた。
rke）を用いて２回洗浄後、個々の穴をそれぞれアクリ
ジニウム−Ｎ−アシル−スルホンアミドで標識されたＭ
ＡｂＢＷ ＳＣＬＣ−１またはＢＷ ＳＣＬＣ−２の溶液
２００μｌで満たした。次に振盪しながらの室温で１時
間インキュベーション段階を行い３回洗浄サイクルによ
り終結させた。
【００２５】次に３００μｌのBeriLuxアナライザー試
薬Ｒ１およびＲ２（Behringwerke）をそれぞれルミノメ
ーター内のマイクロチューブに自動添加し、そして発光
原（luminogenic）測定信号を３秒間測定した。検体の
Ｔ−ＮＣＡＭ濃度を添付の標準シリーズを用いて定量測
定した（測定単位：Ｕ／ml）。
薬Ｒ１およびＲ２（Behringwerke）をそれぞれルミノメ
ーター内のマイクロチューブに自動添加し、そして発光
原（luminogenic）測定信号を３秒間測定した。検体の
Ｔ−ＮＣＡＭ濃度を添付の標準シリーズを用いて定量測
定した（測定単位：Ｕ／ml）。
【００２６】実施例４ 正常血清／腫瘍血清弁別を改善するための検体インキュ
ベーション緩衝液への２,８−ＮＡｃＮ添加 健常供血者由来血清の、または例えば肺小細胞癌患者由
来のＴ−ＮＣＡＭ含有検体のＴ−ＮＣＡＭ濃度を、実施
例３による免疫化学試験法を用いて測定した。この場合
には、例えばＢ型髄膜炎菌の莢膜多糖のようにα−２,
８−結合Ｎ−アセチルノイラミン酸鎖を有しそしてＭＡ
ｂ ７３５によっては特異的に結合されるがＭＡｂ ＢＷ
ＳＣＬＣ−１または−２によっては特異的に結合され
ない化合物、例えば大腸菌Ｋ１莢膜多糖調製物（Rohr &
Troy, J. Biol Chem. 255: 2332〜2342, 1980; Weisge
rber & Troy, J. Biol Chem. 265: 1578〜1587, 1990も
参照）またはコロミン酸（Sigma）などを含む様々な物
質を検体インキュベーション媒質（ＯＳＮＤ、Behringw
erke）に添加した。２,８−ＮＡｃＮの添加量は、試験
標準の測定信号が１〜５０％阻害されるように選んだ。
高含量のシアル酸を有する他の糖タンパク質、例えばフ
ェツイン（Sigma）、ムチン（タイプＩ−Ｓ、Sigma）、
α１−酸糖タンパク質（Behringwerke）またはシアル酸
（例えばタイプVIまたはタイプVIII、Sigma）などは０.
１mg／mlまでの濃度で用いた。
ベーション緩衝液への２,８−ＮＡｃＮ添加 健常供血者由来血清の、または例えば肺小細胞癌患者由
来のＴ−ＮＣＡＭ含有検体のＴ−ＮＣＡＭ濃度を、実施
例３による免疫化学試験法を用いて測定した。この場合
には、例えばＢ型髄膜炎菌の莢膜多糖のようにα−２,
８−結合Ｎ−アセチルノイラミン酸鎖を有しそしてＭＡ
ｂ ７３５によっては特異的に結合されるがＭＡｂ ＢＷ
ＳＣＬＣ−１または−２によっては特異的に結合され
ない化合物、例えば大腸菌Ｋ１莢膜多糖調製物（Rohr &
Troy, J. Biol Chem. 255: 2332〜2342, 1980; Weisge
rber & Troy, J. Biol Chem. 265: 1578〜1587, 1990も
参照）またはコロミン酸（Sigma）などを含む様々な物
質を検体インキュベーション媒質（ＯＳＮＤ、Behringw
erke）に添加した。２,８−ＮＡｃＮの添加量は、試験
標準の測定信号が１〜５０％阻害されるように選んだ。
高含量のシアル酸を有する他の糖タンパク質、例えばフ
ェツイン（Sigma）、ムチン（タイプＩ−Ｓ、Sigma）、
α１−酸糖タンパク質（Behringwerke）またはシアル酸
（例えばタイプVIまたはタイプVIII、Sigma）などは０.
１mg／mlまでの濃度で用いた。
【００２７】結果：腫瘍血清／正常血清弁別の改善は、
２,８−ＮＡｃＮの添加によってのみ得られた（表２の
例および図面参照）。
２,８−ＮＡｃＮの添加によってのみ得られた（表２の
例および図面参照）。
【００２８】
【表２】
【００２９】実施例５ 正常血清／腫瘍血清弁別を改善するための検体インキュ
ベーション緩衝液への塩／イオン添加 健常供血者由来血清のまたは例えば肺小細胞癌患者由来
のＴ−ＮＣＡＭ含有検体のＴ−ＮＣＡＭ濃度を実施例３
による免疫化学法を用いて測定した。この場合には、付
加的に０.１％のヒト血清アルブミンおよび０.５％のTw
een ２０を含む５０mM Tris／ＨＣｌ緩衝液、pH７.０に
様々な塩を添加し、そしてこの緩衝液を次いで検体イン
キュベーション緩衝液として用いた（結果については表
３参照）。
ベーション緩衝液への塩／イオン添加 健常供血者由来血清のまたは例えば肺小細胞癌患者由来
のＴ−ＮＣＡＭ含有検体のＴ−ＮＣＡＭ濃度を実施例３
による免疫化学法を用いて測定した。この場合には、付
加的に０.１％のヒト血清アルブミンおよび０.５％のTw
een ２０を含む５０mM Tris／ＨＣｌ緩衝液、pH７.０に
様々な塩を添加し、そしてこの緩衝液を次いで検体イン
キュベーション緩衝液として用いた（結果については表
３参照）。
【００３０】
【表３】
【図１】０.５μｇ／mlのコロミン酸（Sigma）を添加し
または添加しない（対照）検体インキュベーション媒質
（ＯＳＮＤ、Behringwerke）を用いてＴ−ＮＣＡＭ試験
により測定された健常供血者および肺小細胞癌患者にお
けるＴ−ＮＣＡＭの血清濃度。
または添加しない（対照）検体インキュベーション媒質
（ＯＳＮＤ、Behringwerke）を用いてＴ−ＮＣＡＭ試験
により測定された健常供血者および肺小細胞癌患者にお
けるＴ−ＮＣＡＭの血清濃度。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 欧州特許出願公開443599（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/98
Claims (7)
- 【請求項１】 特異的結合性パートナーにより一又はそ
れより多い被分析物質を免疫学的に測定するための方法
であって、第一の特異的結合性パートナーを担体に固定
しそして第一特異的結合性パートナーへの被分析物質結
合度を、この被分析物質に対して特異的でありかつ第二
結合性パートナー（直接にまたは更なる第三の結合性パ
ートナーを介して標識された）により測定し、その際少
くとも第一又は第二の特異的結合性パートナーの一方と
の反応が、第一の特異的結合性パートナーに対しては高
親和性を有するが第二の特異的結合性パートナーまたは
第三の特異的結合性パートナーの１つに対しては高親和
性を有しない抑制物質の存在下に行われることを特徴と
する方法。 - 【請求項２】 第一特異的結合性パートナーがα−２,
８−結合Ｎ−アセチルノイラミン酸鎖に特異的に結合で
きそして第二特異的結合性パートナーがモノクローナル
抗体ＢＷ ＳＣＬＣ−１およびＢＷ ＳＣＬＣ−２と同じ
エピトープに対し特異的である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 抑制物質が親和性を有する結合性パート
ナーが固相に結合される請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 抑制物質がα−２,８−結合Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸鎖を含む請求項１、２または３記載の方
法。 - 【請求項５】 抑制物質が大腸菌Ｋ１またはＢ型髄膜炎
菌由来莢膜多糖の成分より、またはコロミン酸より、好
ましくはコロミン酸より構成される請求項１、２または
３記載の方法。 - 【請求項６】 抑制物質が、試験標準の測定信号が５０
％を超えない率だけ阻害されるような濃度で用いられる
請求項１、２または３記載の方法。 - 【請求項７】 コロミン酸が０.０１〜１０μｇ／mlの
濃度で用いられる請求項１、２または３記載の方法。
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|---|---|---|---|
| DE4212706:8 | 1992-04-16 | ||
| DE4212706A DE4212706A1 (de) | 1992-04-16 | 1992-04-16 | Diagnostisches Verfahren zur immunologischen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten |
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|---|---|
| JPH0666794A JPH0666794A (ja) | 1994-03-11 |
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|---|---|
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| DK (1) | DK0565903T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2003048301A2 (en) * | 2001-10-11 | 2003-06-12 | Protein Design Labs Inc. | Anti-hla-dr antibodies and the methods of using thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3836348A1 (de) * | 1988-10-25 | 1990-04-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von fuer ein antigen klassenspezifischen antikoerpern und dazu geeignetes reagenz |
| DE4005630A1 (de) * | 1990-02-22 | 1991-09-05 | Behringwerke Ag | Monoklonale antikoerper gegen tumorassoziierte antigene, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung |
-
1992
- 1992-04-16 DE DE4212706A patent/DE4212706A1/de not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-03-19 DK DK93104573T patent/DK0565903T3/da active
- 1993-03-19 DE DE59308129T patent/DE59308129D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-19 EP EP93104573A patent/EP0565903B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-19 AT AT93104573T patent/ATE163229T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-03-19 ES ES93104573T patent/ES2112348T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-14 AU AU36928/93A patent/AU673822B2/en not_active Ceased
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- 1993-04-15 JP JP08846793A patent/JP3308027B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-11-02 US US08/334,035 patent/US5593898A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0565903T3 (da) | 1998-09-23 |
| DE4212706A1 (de) | 1993-10-21 |
| DE59308129D1 (de) | 1998-03-19 |
| CA2094089A1 (en) | 1993-10-17 |
| AU3692893A (en) | 1993-10-21 |
| EP0565903B1 (de) | 1998-02-11 |
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| EP0565903A2 (de) | 1993-10-20 |
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| AU673822B2 (en) | 1996-11-28 |
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| ES2112348T3 (es) | 1998-04-01 |
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