CN101627135B - 通过测量cd36诊断动脉粥样硬化斑块的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用在体液和/或斑块等CD36的浓度的测量对个体的动脉粥样硬化斑块的诊断、分类和检测。本发明还涉及个体中动脉粥样硬化斑块的负荷的诊断。此外，本发明还涉及用于诊断由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的方法。在本发明的范围内的还有用于确定个体治疗方案的方法。还请求保护用于该方法中的试剂盒和寡核苷酸。

Description

通过测量CD36诊断动脉粥样硬化斑块的方法
发明技术领域
本发明涉及利用在体液和/或斑块等的CD36浓度的测量来诊断、分类和监测动脉粥样硬化斑块。
发明背景
动脉粥样硬化是一种渐进性炎性疾病，其中动脉壁中的脂质、细胞外基质、巨噬细胞和激活血管平滑肌细胞导致动脉粥样硬化斑块的增长。动脉粥样硬化病变的发展会引出各种急性缺血性事件，如急性冠脉综合征、短暂性脑缺血发作(TIA)和中风，因为部分斑块是分离的并被血流携带，直到该斑块由于尺寸超过了动脉的尺寸而停滞。然而，虽然动脉粥样硬化进程中炎症介质的参与已经得到广泛认可，但不同组分的鉴定以及它们的相对重要性并不清楚。具体地，炎症以何种方式可促进无症状的纤维型斑块向易受攻击和有症状的病变的转变尚不完全清楚。
CD36有许多细胞功能。它是一种脂肪酸转位酶(FAT)，属于清道夫受体B类家族，在代谢活跃组织中整个细胞膜的长链脂肪酸(LCFA)的摄取中、在泡沫细胞形成中、以及在OxLDL被巨噬细胞的摄取中发挥着重要的作用。然后，脂质丰富的巨噬细胞被分化成泡沫细胞或获得泡沫细胞的特点，并促成动脉粥样硬化病变的形成。此外，巨噬细胞的CD36，与TSP和整合素αvβ3一起，能吞噬凋亡的中性粒细胞。而且，该蛋白是血小板粘附和聚集中胶原的受体之一。再者，通过与Src族络氨酸激酶相互作用，细胞质CD36在信号传导中发挥着重要作用。亚洲和非洲人口中CD36的缺乏已被认为与胰岛素抵抗有关。
CD36(Cluster Determinant 36，决定簇36)的别名包括CD36[HUGO基因名称]、GPlllb、GPIV、OKM5-抗原和PASIV。
发明内容
本发明发现在有动脉粥样硬化斑块的个体的体液样本中或者在动脉粥样硬化斑块本身中，CD36的浓度升高与所述动脉粥样硬化斑块成为症状性动脉粥样硬化斑块的增加的风险相关。
因此，本发明涉及用于诊断、分类和监测动脉粥样硬化斑块的方法，例如以便区别稳定的动脉粥样硬化斑块和不稳定的动脉粥样硬化斑块。此外，本文提出，循环非细胞结合CD36蛋白(可溶性CD36，(sCD36))或其碎片或片段，可选地为脂蛋白复合物的一部分，可能是对血管中动脉粥样硬化斑块的有用的诊断或预测标记，尤其是在颈动脉或冠状动脉中。
已经发现CD36在血浆和动脉粥样硬化斑块中的浓度随着动脉粥样硬化斑块向症状性动脉粥样硬化斑块发展而升高。因此，CD36浓度的升高可用作动脉粥样硬化斑块发展的标志。该方法可用于诊断个体发生本文所述的缺血性事件的风险，而且该方法还可用于对个体监测一段时期，观察动脉粥样硬化斑块是否在发展。
因此，本发明的一个方面涉及一种用于分类个体中的动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括在来自所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，分类所述动脉粥样硬化斑块。
第二方面涉及一种用于诊断个体中动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括在来自所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述动脉粥样硬化斑块。
本发明的第三方面涉及一种用于监测个体中动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括在来自所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与之前在相同的个体中测量的CD36多肽或其部分的浓度和/或CD36编码核酸分子或其部分的浓度相联系，和/或iv)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及v)基于根据iii)和/或iv)的所述联系，监测所述动脉粥样硬化斑块的任何进展。
本发明的第四方面涉及一种用于诊断个体处于具有和/或发生症状性动脉粥样硬化斑块的危险的方法，所述方法包括在来自所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述个体是否处于具有和/或发生症状性动脉粥样硬化斑块的危险中。
本发明的进一步方面涉及一种用于诊断个体中动脉粥样硬化斑块的负荷的方法，所述方法包括在来自所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述个体中动脉粥样硬化斑块的负荷。
本发明的再进一步方面涉及一种用于诊断个体中由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的方法，所述方法包括在来自所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述个体中由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的程度。
本发明的另一方面涉及一种用于确定个体治疗方案的方法，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的程度和/或诊断个体具有和/或发生症状性动脉粥样硬化斑块的危险，v)基于iv)的结果，确定对所述个体的治疗方案。
本发明的最后一个方面涉及一种用于本文所述方法的试剂盒，其中该试剂盒包括至少一个检测单元。可以理解的是，该检测单元为至少一种抗体，其中所述抗体是针对CD36多肽或其部分。此外，还应理解的是，该检测单元选自能够检测CD36编码核酸分子的至少一种引物，至少一种探针和至少一种引物对。
附图说明
图1：
对应斑块稳定性的颈动脉粥样硬化的患者血浆中的可溶性CD36(sCD36)。给出的数据作为自最后临床症状开始的时间段的函数。颈动脉粥样硬化是按照统一的标准通过脑前彩色双功能超声(1)和CT血管造影术(2)来诊断和分类。从检查和血液取样前的最后症状开始，与经历症状3-6个月(3-6mnd)或大于6个月(＞6mnd)的患者相比，经历临床症状在2个月内(＜2mnd)的患者的sCD36较高。N＝患者个数，p＝显著性水平(Mann-WhitneyU检验)。血浆sCD36以相对单位被测量，即相对于常规医院血液样本中EDTA血浆而言。斑块的临床症状代表脑血管症状的出现。症状性动脉粥样硬化斑块是在狭窄颈内动脉同侧的中风、TIA(短暂性脑缺血发作)或一过性黑矇的患者中的斑块。误差线代表SEM。
(1)Grant EG，Benson CB，Moneta GL等人，Carotid artery stenosis：gray-scale and Doppler US diagnosis-Society of Radiologists in MltrasoundConsensus Conference，Radiology.2003；229：340-346
(2)Anderson GB，Asforth R，Steinke DE等人，CT angiography for thedetection and characterization of carotid artery bifurcation disease.Stroke.2000；31：2168-2174。
图2：
动脉粥样硬化颈动脉狭窄患者中可溶性CD36(sCD36)的血浆水平。按照他们的最后临床症状出现后的月数(mth)，将患者分组。最近2个月内(空白条，n＝16)，3-6个月(方块线条，n＝15)，或大于6个月(黑条，n＝31)。*，p＜0.02对2个月；#，p＜0.02对2个月。
图3：
颈动脉粥样硬化患者血浆中的可溶性CD36(sCD36)。颈动脉狭窄是按照统一的标准通过脑前彩色双功能超声(1)和CT血管造影术(2)来诊断和分类。根据超声分类将患者分为无回声(Echolucent，EL)和强回声(Echogenic，EG)。N＝患者个数，p＝显著性水平(Mann-Whitney U检验)。血浆sCD36以相对单元被测量，即相对于常规医院血液样本的EDTA血浆而言。误差线代表SEM。
(1)Grant EG，Benson CB，Moneta GL等人，Carotid artery stenosis：gray-scale and Doppler US diagnosis-Society of Radiologists in MltrasoundConsensus Conference，Radiology.2003；229：340-346
(2)Anderson GB，Asforth R，Steinke DE等人，CT angiography for thedetection and characterization of carotid artery bifurcation disease.Stroke.2000；31：2168-2174。
图4：
动脉粥样硬化性颈动脉狭窄患者的可溶性CD36(sCD36)的水平。基于动脉粥样硬化性颈动脉的超声检查后的回音强度，将患者分组。EL，无回声斑块(n＝20)EG，强回声/异质性斑块(n＝39).(*)，p＝0.09。
图5：
根据患者是否在手术前的六个月经历过中风、TIA或一过性黑蒙，将动脉内膜切除患者的颈内动脉的动脉粥样硬化斑块分为两组。根据脑血管症状的存在或不存在，将斑块分别定性为有症状(n＝3)或无症状(n＝4)。可溶性CD36(sCD36)是在手术前那天抽出的血液样本的血浆中测量。这些患者与颈动脉斑块的基因表达谱图分析(微阵列)中涉及的患者一致(表1)，例外的是来自其中一名患者的血液样本丢失，从而没有测量sCD36。N＝患者个数。血浆sCD36是以相对单位被测量，即相对于常规医院血液样本的EDTA血浆而言。误差线代表SEM。
图6：
连续切片的代表性显微照片，说明通过动脉内膜切除术从不稳定性疾病的患者除去的颈动脉粥样硬化性病变中免疫染色的抗CD36(A)、抗钙防卫蛋白(B)和抗平滑肌肌动蛋白(C)。CD36免疫反应性定位于如B组所见的众多CD68-阳性巨噬细胞病变的部分富脂质核心(*)。该核心之外未见免疫染色。在邻近介质(m)的区域看见最强的抗CD-36免疫染色。C组显示介质中的抗平滑肌肌动蛋白免疫染色。线比例尺100μm。
发明详细说明
定义：
动脉粥样硬化斑块：该术语是在它的传统意义上被使用，即脂质、细胞外物质、炎症介质、炎症细胞(即白细胞)、巨噬细胞和血管平滑肌细胞在动脉壁上的堆积。
症状性动脉粥样硬化斑块：患有症状的个体中的动脉粥样硬化斑块，例如以同侧中风、短暂性脑缺血发作或一过性黑蒙的形式。
无症状动脉粥样硬化斑块：在过去的6个月或更长时间内未经历症状性动脉粥样硬化斑块中提到的症状的个体中的动脉粥样硬化斑块。
稳定性动脉粥样硬化斑块：在6个月或更长的预定时间段内未显示出发展迹象的个体中的动脉粥样硬化斑块。
不稳定性动脉粥样硬化斑块：显示出发展迹象的个体中的动脉粥样硬化斑块。
在本发明上下文中，术语动脉粥样硬化斑块是在动脉壁上的堆积和膨胀，在此膨胀是由例如，巨噬细胞、细胞碎片、脂质如胆固醇和脂肪酸、钙和纤维结缔组织引起。由此，在个体内动脉粥样化发展的进程被称为动脉粥样硬化形成，而该疾病进程的总的结果被称为动脉粥样硬化症。因此，术语动脉粥样斑块可与本发明中的动脉粥样硬化斑块交换使用。
术语“CD36编码核酸分子”是指编码CD36基因的转录产物。
诊断：本文使用的诊断指技术人员通过其能估计和/或确定患者是否经受给定疾病或情况的方法。该技术人员通常基于一个或多个诊断指标做出诊断，即标记的量或浓度，或标记的量的变化，其是该情况的存在、严重性或不存在的标志。
本文所用的术语“相联系”指将一患者中标记的存在或该标记的量与经受给定条件或有经受给定条件的危险的患者中它的存在或其量作比较，或者与已知免受给定条件的人中它的存在或其量作比较。
如上所讨论，可将患者样本中的标记水平与和特定诊断相关的已知水平作比较。该样本的标记水平被认为与诊断相关；也就是说，技术人员可以利用该标记水平确定患者是否经受特定类型的诊断，并相应地做出反应。或者，该样本的标记水平可以与已知的和好结果(例如，没有疾病等)相关的标记水平作比较。
应理解的是，本发明中的术语“标记”指CD36多肽和/或CD36编码核酸分子。
本文中使用的确定诊断指技术人员通过其能确定患者中特定疾病存在或不存在的方法。术语“诊断”并不表示以100％精确性确定特定疾病存在或不存在的能力。实际上，技术人员应理解，术语“诊断”指某些疾病在主体内存在的增加的可能性。在优选的实施方式中，诊断显示疾病是以约5％的增加的几率存在，约10％的几率，约15％的几率，约20％的几率，约25％的几率，约30％的几率，约40％的几率，约50％的几率，约60％的几率，约75％的几率，约90％的几率，约95％的几率。本文中的术语“约”指+/-2％。
诊断、分类和监测动脉粥样硬化斑块状态
本发明是基于患者的斑块和血液样本的分析，该患者已经经受或患有颈内动脉狭窄，并通过颈动脉内膜切除术或置入支架的颈动脉血管成形术治疗。基于患者样本中CD36多肽和/或CD36编码核酸分子的浓度的研究结果，本发明允许监测向症状性斑块的发展。
导致动脉粥样硬化斑块从无症状向症状性发展的动脉粥样硬化斑块的去稳定作用对诊断、分类和监测是很重要的，因为去稳定作用可以引起各种急性缺血性事件，例如中风、短暂性脑缺血发作和急性冠状动脉综合征。
本发明涉及一种用于诊断、分类和监测个体中动脉粥样硬化斑块的方法，以便预测和预防由该斑块的去稳定作用引起的急性缺血性事件。
该方法可用于诊断、分类和监测任意动脉中，尤其是颈动脉和冠状动脉中的动脉粥样硬化斑块。它还是一种用于确定个体是否具有和/或发生症状性动脉粥样硬化斑块的危险的方法。
此外，本发明涉及一种通过测量CD36多肽或CD36核酸分子的浓度来确定动脉粥样硬化斑块负荷(即个体中斑块的数量)的方法。
本发明还涉及一种通过测量CD36多肽或CD36核酸分子的浓度来确定动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的程度的方法。
此外，本发明涉及一种通过测量CD36多肽或CD36核酸分子的浓度来确定个体的治疗方案的方法。
因此，本发明一方面涉及一种用于分类个体中的动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括在来自所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度，和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，分类所述动脉粥样硬化斑块。
本发明的另一方面涉及一种用于诊断个体中动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括在来自所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度，和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述动脉粥样硬化斑块。
动脉粥样硬化斑块的分类和/或诊断包括确定是否无症状的斑块是不稳定的并具有更高的发展为症状性斑块的危险。症状性斑块可导致急性缺血性事件的发展。本发明中发现了CD36多肽和/或CD36编码核酸分子与无症状斑块转为症状性斑块的去稳定作用之间的相互关系。因此，与标准水平相比，CD36多肽和/或CD36编码核酸分子的浓度的升高预示着无症状斑块发展为症状性斑块的去稳定作用。
本发明的又一方面涉及一种用于监测个体中动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括在来自所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度，和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与之前在相同的个体中测量的CD36多肽或其部分的浓度和/或CD36编码核酸分子或其部分的浓度相联系，和/或iv)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及v)基于根据iii)和/或iv)的所述联系，监测所述动脉粥样硬化斑块的任何进展。
因此，监测动脉粥样硬化斑块的去稳定作用的进展也在本发明的范围内，不管是个体中的无症状斑块还是症状性斑块。CD36多肽和/或CD36编码核酸分子的浓度是如步骤i)或ii)中所述来确定，并与标准水平相联系。该联系的结果可以与在所述个体中其他时间点确定的CD36多肽和/或CD36编码核酸分子的浓度相比较。通过监测不同时间点个体中CD36多肽和/或CD36编码核酸分子的浓度，可以跟踪动脉粥样硬化斑块的去稳定作用的发展。这种对个体的监测可用于确定本文其他处所述的个体的治疗方案。
本发明的进一步方面涉及一种用于诊断个体处于具有和/或发生症状性动脉粥样硬化斑块的危险中的方法，所述方法包括在来自所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度，和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述个体是否处于具有和/或发生症状性动脉粥样硬化斑块的危险中。
本发明的再进一步方面涉及一种用于诊断个体中动脉粥样硬化斑块的负荷的方法，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度，和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述个体中的动脉粥样硬化斑块的负荷。
此外，本发明涉及一种用于诊断个体中由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的方法，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度，和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述个体中由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的程度。
此外，本发明涉及一种用于确定个体的治疗方案的方法，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度，和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的程度和/或诊断个体具有和/或获得症状性动脉粥样硬化斑块的危险，v)基于iv)的结果，确定对所述个体的治疗方案。应理解的是，该治疗的效果可以随后被监测。
本发明涉及机体所有类型的动脉中的动脉粥样硬化斑块，例如供给胳膊和腿的颈动脉、冠状动脉、肾动脉。以下列出一些症状，其与动脉硬化症和动脉粥样硬化斑块的去稳定作用以及发展为症状性动脉粥样硬化斑块的增大的危险性有关。
狭窄是血管中不正常的变窄。血管型的狭窄常常与经过狭窄血管的湍流产生的噪音(杂音)有关。这种杂音可通过听诊器听到。然而，其他更精确的诊断方法包括超声、磁共振成像/磁共振血管造影术，计算机断层扫描/CT-血管造影术，其显示解剖成像和/或流动现象。
在本发明范围内的还包括与确定、分类、诊断、监测冠心病(CHD)有关的方法，冠心病又称为冠状动脉疾病(CAD)、缺血性心脏病、动脉粥样硬化性心脏病。冠心病是动脉粥样硬化斑块在为心肌供应氧气和营养的动脉壁内积聚的最终结果。
典型地，冠心病的症状只有在疾病的晚期状态时才被注意到。患有冠心病的大多数个体，在该疾病发展时，好几年甚至几十年都未显示出疾病的任何迹象，直到症状(常为“突发性”心脏病)的第一次发作出现。该疾病发展的原因常常是动脉粥样硬化斑块的破裂，该斑块可破裂并开始限制血液流向心肌。
急性心肌梗塞也是本发明涉及的一种情况，其通常也被称为心脏病发作。急性心肌梗塞是涉及向心脏部分的血液供应中断的情况。该血液供应的中断常常是由内动脉壁的动脉粥样硬化斑块的破裂引起。动脉粥样硬化斑块可阻塞血液在动脉中通过，其导致缺血或氧气不足，引起心脏组织的损伤和潜在性死亡。
处于具有和/或发生急性心肌梗塞危险中的个体通常的特征是危险因素的作用，例如血管疾病的既往病史，如动脉粥样硬化冠心病和/或心绞痛，先前的心脏病发作或中风。
心绞痛主要是由冠状动脉疾病引起，由于心肌缺血从而缺氧气供应引起胸痛，其通常是由于冠状动脉的阻塞或痉挛。因此，根据本发明的一种实施方式，本文中的方法和试剂盒也涉及确定个体是否处于具有/发生动脉粥样硬化斑块引起的心绞痛的危险中。
颈动脉狭窄是颈动脉管腔的狭窄，通常是由动脉硬化症引起。非严格的术语“颈动脉狭窄”在常见的医疗用途中指颈内动脉近端部分的狭窄(在颈动脉球囊处)，因为这是迄今为止颈动脉内狭窄的最常见的位置。颈动脉其他部分的狭窄也会发生。因此，在本发明上下文中，术语“颈动脉狭窄”涵盖了颈动脉的至少一处的狭窄，并且尤其是颈内动脉的近端部分的狭窄。
动脉粥样硬化颈动脉狭窄可能是无症状的或它可能通过大脑中脑血管或视网膜动脉的栓塞而引起症状。本文所用的术语“栓子”是在其传统意义上使用，即在该事件中通过循环从身体的一个部位迁移并引起身体另一部位中血管阻塞的栓塞物(目标物)。脑动脉的栓子引起短暂性脑缺血发作(TIA)或脑血管意外(CVA)。视网膜的栓子导致一过性黑蒙或视网膜梗塞。
颈动脉狭窄的诊断通常是通过颈动脉的彩色流动双功能超声扫描来确定。该测试具有中度敏感性和特异性，并产生许多假阳性结果。
本发明的方法和试剂盒还涉及短暂性脑缺血发作(TIA)，其通常被称为“小中风”。TIA是由脑部受限制区域的血流供给的暂时性障碍引起。脑部的血液供给障碍常常导致短暂的神经功能障碍，其通常持续小于24小时。与TIA相关的症状差别很大，取决于受TIA影响的脑部区域。经常遇到的症状包括视力的暂时丧失(典型地为一过性黑蒙)；言语困难(失语症)；身体一侧无力(轻偏瘫)；以及通常在身体的一侧的麻木或刺痛(皮肤感觉异常)。意识的减弱是非常少见的。如果神经系统症状持续超过24小时，则它被归类为脑血管意外或中风。
中风或脑血管意外(CVA)的临床特征是由于脑部血液供给障碍导致脑功能丧失的迅速发展。这种障碍可能是由于血栓或栓塞引起的血液供给缺少(局部缺血)，或者是由于出血。中风的传统定义是“脑血管的神经功能缺损持续超过24小时或在24小时内因死亡中断”。在本发明中，所述方法和试剂盒涉及由动脉粥样硬化斑块引起的中风，该斑块引起脑部的血液供给障碍。
先前的中风或短暂性脑缺血发作是典型的中风的危险因素。
CD36
就本发明而言，短语中使用的术语“CD36”，例如“循环性CD36”或“非细胞结合CD36”和权利要求中使用的术语“CD36”包括由抗CD36的特异性抗体识别的CD36蛋白或其片段，如sc5522、sc9154和sc7309。这包括全长CD36蛋白、多肽或其肽片段，以及包括其脂蛋白的高分子量血浆片段复合物中存在的该蛋白质或其片段，所有这些都优选地是可溶性的(sCD36)。术语“循环性CD36”和“可溶性CD36”在本文中可作为同义词使用。循环性CD36可从细胞膜穴样内陷(caveolae)中分泌出来，或者是微粒的一部分，该微粒包括源于细胞膜穴样内陷膜的膜部分，细胞膜穴样内陷膜从细胞膜释放出来并存在于血液循环中。在这方面，所关注的细胞膜穴样内陷可存在于细胞的细胞膜中，如脂肪细胞、巨噬细胞、单核细胞和凝血细胞。
CD36是471个氨基酸的跨膜蛋白(在氨基酸残基位置439-460和可能在7-28具有1或2个跨膜区)。CD36是带有棕榈基结合位点的高度糖基化的88kDa糖蛋白。CD36存在于细胞膜穴样内陷中，在此它在调节细胞的胆固醇进出细胞的运动中发挥作用。
CD36作为其中成员的分子家族：
CD36->SR-B类->宿主防御清道夫受体->清道夫受体超家族
CD36的分子结构：
471个氨基酸残基；
跨膜区(残基439-465)和
438氨基酸氨基末端区域可完全在细胞外，或可在该氨基末端附近具有第二潜在的跨膜区；
短的细胞质尾(残基466-471)；
在细胞外区域留有一疏水区域，其可能与外部细胞膜有关联(残基184-204)
据报导CD36的分子量取决于如下所示的细胞类型：
血小板88kDa/113kDa
胎儿红细胞78kDa
乳腺上皮细胞85kDa
红白血病细胞88kDa，85kDa，57kDa8
HeLa细胞85(160)kDa 85kDa
真皮微血管内皮细胞80-90kDa
在CD36的转录后修饰中，已鉴别出两种可选择的CD36mRNA形式。第一种mRNA类型是在HEL细胞中表达，并省略氨基酸残基41-143。第二种mRNA类型还未被翻译出，但其中末尾的89个氨基酸残基被省略。因此，已经发现CD36的形式，其中开放阅读框分别是90-1708和357-1775。
CD36的翻译后修饰：
CD36被称为重度糖化，在胞外部分带有10个N-连接的糖基化位点。糖基化作用被提出以讨论它的对蛋白裂解的抗性；
苏氨酸92已经显示是磷酸化的；
CD36也在N-和C-末端细胞质尾上被棕榈酰化。
调节CD36分子的转录的蛋白质和DNA成分：
Oct-2：在B细胞分化期间显示由Oct-2转录因子调节的第一基因；
PEBP2：PEBP2/CBF转录因子可能对单核细胞中CD36的组成型表达很重要；
CBF：PEBP2/CBF转录因子可能对单核细胞中CD36的组成型表达很重要。
CD36的底物是未知的。有可能CD36调节残基Thr92的自动磷酸化。修饰CD36的酶是未知的。有可能Thr92是被胞外苏氨酸激酶磷酸化。
细胞内信号可能与Fyn、Lyn和Yes的磷酸化作用有关，但细胞质尾与这些PTK相互作用的方式是未知的。
CD36的主要细胞表达：
CD36在红系细胞发展的阶段是在血小板、成熟的单核细胞和巨噬细胞、微血管内皮细胞、乳腺血管内皮细胞上表达，以及在一些巨噬细胞产生的树突状细胞、肌肉细胞、肝细胞和脂肪细胞上表达。
由CD36结扎调节的生理活动仍然是未知的。高达50％的氧化型LDL是通过CD36被摄取，由此CD36似乎是一种重要的清道夫受体。然而，鉴于在CD36缺乏患者中疾病状态的明显缺乏，其他机制似乎也能弥补它的缺乏。CD36序列
根据本发明方法的CD36多肽和/或CD36核酸分子优选地具有以下所示的序列之一。此外，核酸分子可以是与如下所示的序列的一种或多种互补的RNA核酸：
Gene Symbol CD36 HGNC
Chromosomal Location 7q 11.2
UniGene ID
Build 191(2006年5月7日)
Hs.120949 NCBI(全长)
Hs.248425
Hs.75613
Hs.325823
Entrez Gene 948 Entrez gene
HGNC：1663
HPRD：01430
SwissProt
P16671 EMBL-EBI
OMIM
173510 NCBI
248310 NCBI
608404 NCBI
参考序列
蛋白质ID
NP_000063.2 NCBI
NP_001001547.1 NCBI
NP_001001548.1 NCBI
转录物ID
NM_000072 NCBI
NM_001001547 NCBI
NM_001001548 NCBI
核苷酸序列：
(SEQ ID NO.：1)
NM_00100154 82338bp  mRNA  线性PRI 20-JAN-2008人类CD36分子(凝血酶敏感蛋白受体)(CD36)，转录变体1，mRNA。登录号NM_001001548(版本号NM_001001548.1)
起点
   1 gaggactgca gtgtaggact ttcctgcaga ataccatttg atcctattaa gaattgtcca
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2281 tcataatcgc ctcataaaga caggtttcaa ccattaaaat atgttcttcc ttaaaaaa
登录号NM_000072(版本号NM_000072.2)
(SEQ ID NO.：2)
NM_000072 1983bp  mRNA  线性PRI 20-JAN-2008
定义人类CD36分子(凝血酶敏感蛋白受体)(CD36)，转录变体3，mRNA。
起点
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登录号NM_01001547(版本号NM_01001547.1)
(SEQ ID NO.：3)
NM_001001547 2050bp  mRNA  线性PRI 20-JAN-2008
人类CD36分子(凝血酶敏感蛋白受体)(CD36)，转录变体2，mRNA。
起点
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 661 atgtaaccca ggacgctgag gacaacacag tctctttcct gcagcccaat ggtgccatct
 721 tcgaaccttc actatcagtt ggaacagagg ctgacaactt cacagttctc aatctggctg
 781 tggcagctgc atcccatatc tatcaaaatc aatttgttca aatgatcctc aattcactta
 841 ttaacaagtc aaaatcttct atgttccaag tcagaacttt gagagaactg ttatggggct
 901 atagggatcc atttttgagt ttggttccgt accctgttac taccacagtt ggtctgtttt
 961 atccttacaa caatactgca gatggagttt ataaagtttt caatggaaaa gataacataa
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蛋白质序列：
(SEQ ID NO.：4)
登录号NP_01001548(版本号NP_001001548.1)
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序列同一性
本文中功能等价体和变体可交换地使用。在本发明的一种优选实施方式中，提供了CD36的变体及其片段的变体。当为多肽时，变体是基于与预定的氨基酸序列相比，它们的同一性或它们的同源性的程度来确定，所述预定的氨基酸序列是SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8或SEQ ID NO：9中之一，当变体是片段时，分别为上述任意氨基酸序列的片段。
因此，变体优选地具有与预定的序列有至少91％的同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性。
以下术语用于描述两种或多种多核苷酸之间的序列关系：“预定的序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性的比例”和“基本同一性”。
“预定的序列”是作为序列比较的基础使用的定义序列；预定的序列可以是较大序列的子序列，例如作为全长DNA的一个片段，它的转录产物，序列表中给出的基因序列，如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的多核苷酸序列，或可包括完整的DNA或基因序列。通常，预定的序列为至少20个核苷酸的长度，常见地为至少25个核苷酸，并且经常是至少50个核苷酸的长度。
由于两种多核苷酸可各自(1)包括与两种多核苷酸之间相似的序列(即完整的多核苷酸序列的一部分)和(2)可进一步包括与两种多核苷酸之间不同的序列，两种(或多种)多核苷酸之间的序列比较典型地是通过在“对比窗”上比较这两种多核苷酸的序列而形成，以识别并比较序列相似性的局部区域。本文使用的“比较窗”指至少20个连续核苷酸位置的概念性片段，其中多核苷酸序列可与至少20个连续核苷酸的预定的序列作比较，并且当与预定的序列(不包括增加或缺失)比较以便最佳排列两个序列时，其中比较窗中的多核苷酸的部分可包括增加或缺失(即缺口)20％或更少。
用于排列比较窗的序列的最佳排列可通过Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源算法；通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源排列算法；通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444的相似方法的探究；通过这些算法(威斯康星遗传学软件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，Wis.)的计算机化的实现；或者通过检察来进行；并且选择出通过不同算法产生的最佳排列(即在比较窗上产生同源性的最高比例)。
术语“序列同一性”意思是两种多核苷酸序列在比较窗上是一致的(即在核苷酸-核苷酸连接的基础上)。术语“序列同一性的比例”是通过以下来计算：在比较窗上比较两种最佳排列的序列；确定出现在两个序列中的相同的核苷酸碱基的位置数目(例如A、T、C、G、U、或I)以产生匹配位置的数目；用匹配位置的数目除以比较窗中的位置的总数目(即窗口大小)；然后该结果乘以100以得到序列同一性的比例。本文使用的术语“基本同一性”指多核苷酸序列的特征，其中在至少20个核苷酸位置的比较窗上，常见地在至少25-50个核苷酸的比较窗上与预定的序列比较，该多核苷酸包括有至少85％序列同一性的序列，优选地至少90-95％序列同一性，更通常至少99％序列同一性，其中该序列同一性的比例是通过比较预定序列和该多核苷酸序列而计算得到。该多核苷酸序列可包括比较窗上预定的序列的总的20％或更少的缺失或增加。该预定的序列可以是较大序列的子序列，例如作为本文所示的全长SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3多核苷酸序列的一部分。
术语“转录或翻译产物”在本文中是指基因转录的产物，如RNA转录物，例如未拼接的RNA转录物、mRNA转录物和所述mRNA转录拼接产物，以及基因翻译的产物，例如从任意基因mRNA转录物翻译的多肽和所述多肽的翻译后程序的各种产物，如多肽的翻译后蛋白水解程序的产物或所述多肽的各种翻译后修饰的产物。
本文使用的术语“基因的转录产物”指含有与基因相同的序列信息的前信使RNA分子(前体mRNA)(虽然核苷酸U代替T)，或成熟信使RNA分子(mRNA)，它是由于前体mRNA的拼接而产生的，并且是基因的遗传信息翻译成蛋白质的模板。
本文使用的术语“基因的翻译产物”指由CD36基因编码的蛋白质。
本文使用的术语“基因的转录产物”指由CD36编码基因(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3)编码的转录物。本领域技术人员可以理解，CD36的许多同工型(isoform)是已知的。同工型是有少许差异的蛋白质的形式，通常是拼接变体或者是一些翻译后修饰的产物。本发明涉及CD36的任意同工型。本文给出的例子并不意味着限制本发明的范围。
因此，本发明涉及通过例如确定与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQID NO：3或其部分的转录产物相对应的至少一种CD36转录物的浓度，来分类、诊断和/或监测个体中动脉粥样硬化斑块的方法。
具体地，本发明涉及的方法包括确定CD36编码核酸分子的浓度的步骤，CD36编码核酸分子是下述CD36编码基因的转录产物：
(i)本发明中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3或其片段一致的核酸序列，
(ii)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3或其片段具有至少90％同一性的核酸序列，
(iii)与(i)或(ii)的任意序列互补的核酸序列。
具体地，本发明涉及的方法包括确定CD36编码核酸分子的浓度的步骤，CD36编码核酸分子是CD36编码基因的转录产物
本发明还涉及的方法包括确定下述CD36多肽或其部分的浓度的步骤，在：
(i)变异蛋白，对应于和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9或其变体、或其片段一致的蛋白质，
(ii)多肽序列，与(i)的变异蛋白或其片段具有至少90％的同一性。
因此，本发明的一种实施方式是将以上同一的变异蛋白和/或转录产物用于下述目的：
i)分类个体中的动脉粥样硬化斑块
ii)诊断个体中的动脉粥样硬化斑块
iii)监测个体中的动脉粥样硬化斑块
iv)诊断个体处于具有和/或获得症状性动脉粥样硬化斑块的危险中
v)诊断个体中动脉粥样硬化斑块的负荷
vi)诊断个体中由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄，和/或
vii)确定个体的治疗方案
在一种实施方式中，序列同一性是通过利用CD36肽的片段来确定，其包括至少25个连续氨基酸并且具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9具有至少80％，如85％、如90％、如95％、如99％的同一性，其中同一性比例是以威斯康星遗传学软件包7.0版中的算法GAP、BESTFIT或FASTA，利用缺省空位权重(defaμlt gap weight)确定。
保守性氨基酸替换
如下所示的氨基酸基团中的替换被视为保守性氨基酸替换。氨基酸的不同基团之间的替换被视为非保守性氨基酸替换。
P、A、G、S、T(中性，弱疏水性)
Q、N、E、D、B、Z(亲水性，酸性胺)
H、K、R(亲水性，碱性)
F、Y、W(疏水性，芳香性)
L、I、V、M(疏水性)
C(交联成形)
个体
本发明涉及个体，例如任意性别或年龄的哺乳动物，尤其是人。该个体对于由本文所述的动脉粥样硬化引起的疾病而言是无症状的。因此，本发明的个体可能永远都不会患有任何与动脉粥样硬化有关的疾病。然而，同样属于本发明范围内的是，本发明的个体可能先前已经患有与动脉粥样硬化有关的疾病，但在施行本发明的方法的时候是无症状的。
样本
根据本发明的样本可以是体液样本，尤其是无细胞血浆或血清样本，或者斑块的组织样本等。无细胞血浆可以在血液样本离心后用显微镜验证。离心导致血细胞与血浆分离。血液样本在2,500至3000G范围内的离心将产生无细胞血浆。在一种实施方式中，样本是外周静脉血样本。优选的实施方式是无细胞样本，优选地为无细胞血浆样本。
合适的血浆制剂可以是来自肝素-稳定的血、柠檬酸稳定的血或EDTA稳定的血中的血浆。
样本可以是新鲜的或冷冻的。例如，将样本冷冻在-80℃并且在确定CD36和/或CD36编码核酸的浓度之前，解冻仅一次。
在具体的实施方式中，本发明的样本可以是动脉粥样硬化斑块的活组织切片(biopsy)。具体地，该活组织切片是来自颈动脉粥样硬化斑块。
检测方法
核酸分子检测方法
在本发明上下文中，“核酸分子检测方法”应理解为基于DNA和/或RNA的检测的分析方法，尤其是mRNA形式的RNA，并且尤其是如下所述的在高密度寡核苷酸微阵列上检测。被检测的序列尤其是以上披露的CD36序列。
当检测来自动脉粥样硬化斑块的组织样本的CD36升高时，该核酸分子检测方法尤其有用。然而，该核酸分子检测方法还能用于测量CD36编码核酸分子的浓度的升高。
提供用于检测mRNA的方法也是在本发明的一般范围内。该方法常常涉及样本提取、PCR扩增、核酸分裂和标记、延伸反应和转录反应。
可以根据本领域技术人员熟知的许多方法中的任意一种将核酸(或基因组DNA、RNA或mRNA)与样本分离。一名技术人员将了解，如果要检测基因的拷贝数目的改变，优选分离基因组DNA。相反地，当要检测基因(例如CD36编码基因)的表达水平时，优选地分离RNA(mRNA)。
对于那些对全细胞或其他组织样本进行分析的实施方式来说，在继续进行各种样本制备操作之前，从细胞或病毒中提取核酸通常是很有必要的。因此，在样本收集后，核酸可以从收集的细胞、病毒外壳等被释放，进入粗提取物中，接着经额外处理以制备用于随后操作的样本，如污染(DNA结合)蛋白质的变性、纯化、过滤和脱盐。
核酸从样本细胞中的释放和DNA结合蛋白的变性通常可通过物理或化学方法完成。例如，化学方法通常采用细胞溶解剂来破坏细胞并从细胞中提取核酸，接着用离液盐(chaotropic salt，例如异硫氰酸胍或尿素)处理该提取物，以使任何污染的和潜在地干扰的蛋白质变性。
或者，物理方法可用于提取核酸和使DNA结合蛋白变性(例如微型通道内的物理突起或穿透细胞膜的尖锐边缘的颗粒)，并提取它们的内容物。这些结构与用于搅拌的压电元件的相结合能为溶解提供合适的剪切力。
更多传统的细胞提取的方法也可使用，例如，采用限制横截面尺寸的通道，当样本以足够的流动压力通过该通道时，导致细胞溶解。此外，细胞提取和污染蛋白质的变性可通过给样本施加交流电流来完成。更具体地，将细胞的样本流经微管列阵，同时将交流电流作用于流动流体上。将细胞进行超声搅拌或迫使细胞通过微小孔隙，由此使细胞受高剪切应力导致破裂，也是可能的提取方法。
分离总mRNA的方法对本领域技术人员来说是熟知的。RNA可通过各种技术从生物样本中分离出来。在一种实施方式中，总核酸是利用如酸胍-苯酚-氯仿提取方法从给定的样本中提取，而mRNA是通过杂交方法用聚(dT)矩阵来分离，其通过例如寡核苷酸柱层析或通过利用(dT)n磁珠，结合mRNA的多聚腺苷酸3′-端(例如，参见Sambrook等人，Molecμlar Cloning：A LaboratoryManual(第二版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)或者CurrentProtocols in Molecμlar Biology，F.Ausubel等人编Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(1987))。
结合mRNA可以随后被洗涤和从基质上洗脱，并可选地沉淀。通过在无核糖核酸酶(RNAse)环境中用蛋白酶K处理和脱氧核糖核酸酶(DNAse)处理，接着用苯酚萃取并可选地在盐的存在下用乙醇沉淀，可分离出细胞总RNA。例如，所述盐为氯化钠、乙酸钠、氯化锂或乙酸铵。
样本可来自组织和/或体液，如本文其他处限定的那样。在分析该样本之前，例如在寡核苷酸阵列上，通常可取的是在该样本上进行一或多次样本准备操作。典型地，这些样本制备操作包括细胞内物质的提取(比如从全细胞样本中提取核酸)等的处理、核酸的扩增、分裂、转录、标记和/或延伸反应。可将这些不同操作中的一种或多种随时纳入本发明中。
提取之后，通常需要的是从粗提取物的其他成分(例如变性蛋白、细胞膜颗粒和盐)中分离核酸。颗粒物质的去除通常是通过过滤或絮凝来完成。而且，当使用化学变性方法时，可能需要在进入下一个步骤之前，脱去该样本的盐分。脱去样本的盐分和核酸的分离通常可一步完成，例如通过将核酸与固相结合并洗掉污染盐，或对样本进行凝胶过滤色谱使盐穿过透析膜。合适的用于核酸结合的固体载体包括，例如硅藻土或者硅土(即玻璃棉)。本领域中同样熟知的合适的硅胶排除介质可随时纳入本发明的装置中，并且可在商业上获得，例如获自Pharmacia and Sigma Chemical。
或者，脱盐方法通常可利用与其它元素相比的DNA的高电泳迁移率和负性(negativity)。电泳方法也可用于从其他细胞污染物和碎片中提纯核酸。当施加一个合适的电场时，样本中存在的核酸将向正极迁移并被困在捕获膜上。然后，通过施加适当的流体流将保留在膜之外的样本杂质洗掉。当逆转电压时，核酸以基本上较纯的方式从膜上释放。此外，也可将粗过滤器覆盖在该屏障(barrier)上以避免该屏障被颗粒物质、蛋白质和核酸引起的任何污染，因此允许重复使用。
在类似的方面，带有负电荷的核酸的高电泳迁移率可用于分离核酸和污染物，通过利用凝胶短柱或其他合适的凝胶基质，减慢或延缓其他污染物的流动，同时允许速度更快的核酸通过。
本发明提供核酸亲和基质，其承载大量不同的核酸亲和配体，容许从样本中同时选择和除去大量的预选核酸，还提供了生产这些亲和基质的方法。通常，该方法包括步骤：a)提供核酸扩增模板阵列，该阵列包括一表面，其上附着具有不同核酸序列的至少50个寡核苷酸，并且其中各个不同的寡核苷酸是定位在所述表面的预定区域，所述寡核苷酸的密度大于约60个不同寡核苷酸每1平方厘米，并且所述不同寡核苷酸都具有相同的3′末端核酸序列和相同的5′末端核酸序列。b)扩增大量的所述寡核苷酸以提供扩增的核酸库；和c)将该核酸库附着到固体载体上。
例如，核酸亲和色谱是基于互补的单链核酸的趋势，以通过互补的碱基配对形成双链或复式结构。核酸(DNA或RNA)能容易地附着到固体载体(基质)上，在此它作为一种固定配体，其与接触该固定配体的溶液中存在的互补核酸相互作用并形成双链(duplex)。非结合组分可以从该结合复合物上被洗掉，以提供一种不含有与该亲和柱结合的目标分子的溶液，或提供分离的目标分子本身。捕获在杂化双链中的核酸可以经加热、调节盐浓度或利用去稳定剂如甲酰胺、TWEEN.TM.-20变性剂或十二烷基硫酸钠(SDS)，通过变性从该亲和基质中分离和释放。
亲和柱(基质)典型地是通过提供亲和配体的单一种类，用于分离单一核酸。此外，承载单一亲和配体的亲和柱(例如oligo dt柱)已被用于分离多种核酸，其中核酸都有着共同的序列(例如聚A)。
使用的亲和基质的类型取决于分析的目的。例如，当需要分析复合核酸样本中特定基因的mRNA表达水平(例如总mRNA)时，通常需要的是消除由基因产生的组成性地过度表达的核酸，并由此倾向于掩盖在典型的较低水平表达的基因产物。因此，在一种实施方式中，亲和基质可以用于除去大量的预选定的基因产物(如肌动蛋白、GAPDH等)。这是通过提供承载与基因产物(例如mRNA或由此得到的核酸)互补的核酸亲和配体的亲和基质来完成。核酸样本和亲和基质的杂交将导致亲和配体和它们的目标核酸之间的双链构造。当从亲和基质上洗脱样本时，该基质将保留双链核酸，并脱去废弃的过度表达的目标核酸的样本。
亲和基质还可用于识别样本中未知的mRNA或cDNA。当亲和基质包含与样本中各已知基因(例如，cDNA文库中，从mRNA反转录的DNA、直接使用的或扩增的或从DNA模板中聚合的mRNA)互补的核酸时，被亲和基质捕获的已知核酸离开富含那些未知的核酸序列的样本。实际上，该亲和基质被用于实施差减杂交以分离未知的核酸序列。然后，留下的“未知”序列可根据标准方法被纯化和测序。
亲和基质还可用于捕获(分离)从而纯化未知的核酸序列。例如，可以制备包含核酸(亲和配体)的亲和基质，该核酸(亲和配体)与未事先确定的或者未事先知道其在特定核酸样本中的表达的序列互补。然后，该样本与亲和基质杂交，而保留在该亲和基质上的那些序列是“未知的”核酸。保留的核酸可以从基质上被洗脱(例如，在增加的温度、增加的去稳定剂浓度或减少的盐条件下)，然后该核酸可根据标准方法测序。
类似地，亲和基质可用于有效地捕获(分离)大量已知的核酸序列。再次制备基质，该基质载有与需要被分离的那些核酸互补的核酸。将该样本在一定条件下接触基质，其中互补的核酸序列与基质中的亲和配体杂交。非杂交物质被从该基质上洗掉，离开所需要的序列结合。然后将该杂交双链变性，提供一系列分离的核酸。随后可根据标准方法分离该批中不同的核酸(例如凝胶电泳)。
如上所述，亲和基质可用于选择性地从含有核酸的实质上任意样本中除去核酸(例如，在cDNA文库中，从mRNA反转录的DNA、直接使用的或扩增的或从DNA模板中聚合的mRNA等)。结合在柱上的核酸可通过用低盐浓度缓冲剂洗涤来除去，该缓冲剂包含去稳定剂，如甲酰胺；或通过提高柱温来除去。
在优选的实施方式中，将亲和基质装在圆柱的外套中。然后将样本施加于该亲和基质(例如通过泵，如自动进样器驱动的采样泵，注入柱子上或加至柱子)。将载有样本的亲和基质(例如亲和柱)经受一定条件，在该条件下，包括该亲和基质的核酸探针与互补的目标核酸进行特异性杂交。这些条件可通过保持合适的pH、盐和温度条件来实现，以促进如上讨论的杂交。
对于许多应用来说，可能需要从细胞、细胞碎片或其他污染物中提取和分离信使RNA。因此，在一些情况下，本发明的装置包括mRNA纯化室或通道。通常，这种纯化利用了mRNA上的聚-A尾。具体地并如上所述，聚-T寡核苷酸可被固定在装置的腔室或通道内，以作为mRNA的亲和配体。聚-T寡核苷酸可被固定在该腔室或通道纳入的固体载体上，或者可选择地，可被固定在该腔室或通道本身的表面上。聚-T寡核苷酸在该腔室或通道的表面上的固定可通过本文所描述的方法完成，例如包括该表面的氧化和硅烷化，随后为寡核苷酸的标准DMT合成。
在操作中，将裂解的样本引至高盐溶液以增加杂交的离子强度，据此mRNA杂交至固定的聚-T。然后结合在固定的聚-T寡核苷酸上的mRNA在低离子强度的缓冲剂中被洗掉。该聚-T寡核苷酸可固定在多孔表面上，例如多孔硅、分子筛硅凝胶、烧结颗粒或其他固体载体。
样本制备之后，可将该样本进行一种或多种不同的分析操作。通常可进行各种分析操作，包括利用例如微毛细管电泳的基于大小的分析，和/或利用例如杂交至寡核苷酸阵列的基于序列的分析。
在后一种情况下，可用寡核苷酸探针的阵列来探测核酸样本。寡核苷酸阵列通常包括底物，其具有连接至该底物的大量位置不同的寡核苷酸探针。这些阵列可利用机械或光导合成方法来生产，其包括了光刻法和固相寡核苷酸合成方法的结合。
用于寡核苷酸阵列的光导合成的基本策略如下：用光敏保护基修饰的固体载体表面是通过光刻用掩模来照射，在照射区域产生反应的羟基。然后，选定的核苷酸，典型地为3′-O-亚磷酰胺-活化的脱氧核苷(5′羟基用光敏保护基保护)，出现在该表面并耦合出现在暴露于光的位置。封盖和氧化之后，将底物漂洗，并且通过第二掩模照射该表面以暴露额外的羟基以便耦合。第二选定的核苷酸(例如，5′-被保护的3′-O-亚磷酰胺-活化的脱氧核苷)出现在该表面。选择性的脱保护和耦合循环被重复，直到获得需要的产物。由于采用了光刻，该过程可易于小型化以产生高密度阵列的寡核苷酸探针。而且，寡核苷酸在各位点的序列是已知的。参见Pease等，除涉及用于流体脱保护的机械引导和合成步骤的增加以外，机械合成方法与光导方法类似。
对于一些实施方式，可制备具有所有可能的给定长度探针的寡核苷酸阵列。该阵列上的靶序列的杂交模式可用于重建该目标DNA序列。大量探针的杂化分析可用于测序DNA的长的延伸或提供寡核苷酸阵列，该寡核苷酸阵列是特异性的并与特定的核酸序列互补。例如，在特别优选的实施方式中，寡核苷酸阵列将包含寡核苷酸探针，其互补于特定的靶序列以及这些序列的个别或多重突变。这些阵列在特异性疾病的诊断中尤其有用，这些疾病是以特定核酸序列的出现为特征。
样本收集和核酸提取之后，典型地将该样本的核酸部分进行一个或多个制备反应。这些制备反应包括体外转录、标记、分裂、扩增和其他反应。核酸扩增增大了所关注的目标核酸序列的拷贝数目。各种扩增方法都适合用于本发明的方法和装置，包括例如，聚合酶链反应方法(或PCR)，连接酶链反应(LCR)，自我持续序列复制(3SR)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。
后两种扩增方法包括基于等温转录的等温反应，其生成单链RNA(ssRNA)和双链DNA(dsDNA)，扩增产物分别为约30或100比1的比例。因此，当采用这后两种方法时，序列分析可利用任一种类型的底物来完成，即与DNA或RNA互补的。
常见地，需要在杂交之前扩增核酸样本。本领域的技术人员将理解，任何扩增方法都可使用，如果定量结果是人们需要的，则必须注意使用一种保持或控制扩增核酸的相对频率的方法。
“定量”扩增的方法对本领域技术人员来说是熟知的。例如，定量PCR包括用相同的引物同时地共同扩增已知数量的控制序列。这就设置了可用于校准该PCR反应的内部标准。然后该高密度阵列可包括专门针对该内部标准的探针，用于该扩增核酸的定量。
因此，在一种实施方式中，本发明提供了一种优化探针组用于检测特定基因的方法。通常，该方法包括提供一高密度阵列，其包含与目标基因转录的mRNA的子序列互补的一种或多种特定长度的许多探针。在一种实施方式中，该高密度阵列可包含与特定mRNA互补的各个特定长度的探针。然后该高密度阵列的探针与它们的目标核酸单独地杂交，然后与高复合性、高密度核酸样本杂交，该核酸样本不包含与探针互补的目标物。因此，例如当目标核酸为RNA时，该探针首先与它们的目标核酸单独地杂交，然后与由cDNA文库(如反转录聚A+mRNA)制成的RNA杂交，其中杂交的RNA的意义(sense)与目标核酸的意义是相对的(以保证该高复合性的样本不包含该探针的目标物)。那些探针显示出与它们的目标物的强烈的杂交信号，而与高复杂性样本很少或没有交叉杂交，它们是用于本发明的高密度阵列的优选的探针。
PCR扩增通常包括用目标核酸的一条链作为模板，用于生成该序列的大量的互补物。通常，与目标序列的互补链片段的不同末端互补的两个引物序列与它们各自目标序列的链杂交，并且在聚合酶和三磷酸核苷的存在下，该引物沿着目标序列延伸。延伸物从目标序列中融解，并重复该过程，这次是用之前步骤合成的目标序列的额外拷贝。PCR扩增典型地包括变性、杂交和延伸反应的重复循环，以生成足够量的目标核酸。PCR各循环的第一步包括经引物延伸形成的核酸双链的分离。一旦该链被分离，PCR中的下一步包括将该分离的链与从侧面攻击该目标序列的引物杂交。然后将该引物延伸以形成目标链的互补拷贝。为了PCR扩增成功，设计该引物使得各引物沿着双链序列杂交的位置就是由一个引物合成延伸产物的位置，当与模板(互补的)分开时，其作为用于其他引物延伸的模板。变性、杂交和延伸的循环被重复必要的很多次，以获得所需要量的扩增核酸。
在PCR方法中，链分离通常是通过加热该反应至足够高的温度、足够长的时间来实现，以引起该双链变性，但不引起聚合酶的不可逆的变性。典型的热变性包括在几秒至几分钟的范围内约80摄氏度至105摄氏度的温度。然而，链分离可通过任意合适的变性方法来完成，包括物理、化学或酶的手段。例如，链分离可被解旋酶、或能够表现出解旋酶活性的酶诱导。
除PCR和IVT反应外，本发明的方法和装置还适用于许多其他反应类型，例如反转录、切口平移等。
通常，样本中的核酸被标记以促进随后步骤中的检测。标记可在扩增、体外转录或缺口平移过程中完成。具体地，通过使用标记的引物或将标记的dNTP纳入扩增序列，扩增、体外转录或缺口平移可将标记纳入扩增的或转录的序列。
然后，检测样本核酸和阵列上的寡核苷酸探针之间的杂交，例如使用落射荧光显微镜。典型地，将样本在杂交期间混合，以增强样本中的核酸和阵列上核酸探针的杂交。
在一些情况下，杂交的寡核苷酸可在杂交后被标记。例如，当生物素标记的dNTP被用于例如扩增或转录时，链亲和素连接的信息基团可用于标记杂交的复合物。这种操作很容易被整合到本发明的系统中。此外，样本中的核酸可在扩增后标记。扩增后标记典型地包括将特定的可检测组共价连接到扩增序列上。合适的标记或可检测组包括本领域所熟知的各种荧光的或放射性的标记基团。这些标记也可用本领域所熟知的方法与该序列耦合。
检测方法取决于所选择的标记物。荧光标记物是优选的，因为它极度敏感和简单。标准的标记程序被用于确定序列和反应物(reagent)之间的相互作用发生的位置。例如，如果目标序列被标记并暴露于不同探针的矩阵，只有那些探针与目标物相互作用的位置会显示出一些信号。此外，其他方法也可用于扫描该矩阵以确定相互作用在哪发生。当然，通过重复扫描在各多重条件下发生的相互作用，相互作用的光谱可以短暂的方式被确定。然而，不是单独地测试各个个体的相互作用，而是多重序列的相互作用可同时在矩阵上确定。
检测与高密度阵列探针杂交的标记的目标(样本)核酸的方法是本领域技术人员所熟知的。因此，例如当使用比色标记物时，该标记物的简单可见就足够了。当使用放射性标记的探针时，辐射的检测(例如用照相软片或固态探测器)就是足够的。
然而，在优选的实施方式中，目标核酸是用荧光标记物来标记的，且该标记物在探针阵列上的定位是用荧光显微镜完成的。杂交阵列是用光源在特定荧光标记的激发波长处激发，并检测在发射波长产生的荧光。在特别优选的实施方式中，激发光源是适于激发荧光标记的激光。
目标多核苷酸可被任何的许多方便的检测记号标记。荧光标记物是优选的，因为它以弱的背景提供非常强的信号。在高分辨率和灵敏度下通过快速扫描程序，它还可光学探测。其他潜在的标记族包括放射性同位素、化学发光化合物、标记结合蛋白、重金属原子、光谱标记、磁性标记和连接酶。
用于标记的其他方法可绕开目标序列的任何标记。该目标物可暴露于探针中，并且双链杂交仅在那些位置上形成。添加双链杂交反应物将检测杂交在哪发生。可使用嵌入染料，如溴化乙锭，只要探针自身不向它们自身折回在很大程度上形成发夹环。然而，短寡核苷酸探针中发夹环的长度将典型地足以形成稳定的双链。
合适的色原体将包括分子和化合物，其在独特的波长范围内吸收光以便可观察到颜色，或当被特定波长或波长范围的辐射照射时发射光，如荧光增白剂。胆素蛋白质，如藻红蛋白也可用作标记物。
各种各样合适的染料都可使用，主要是被选择以提供强烈的颜色，而周围环境的吸收最小。说明性的染料类型包括喹啉染料、三芳甲烷染料、吖啶染料、茜素染料、酞类、昆虫染料、偶氮染料、蒽醌染料、菁染料、吩噻嗪染料和吩噁嗪染料。
各种不同的荧光增白剂可单独或与淬灭分子结合使用。所关注的荧光增白剂分成包括具有某些主要官能团的不同种类。这些主要官能团包括1-和2-氨基萘、p，p′-二氨基二苯乙烯、芘类、季菲啶盐、9-氨基啶、p，p′-二氨基二苯甲酮亚胺、蒽类、氧碳菁、部花菁、3-氨基马萘雌酮、苝类、双苯并恶唑、双-p-噁唑基苯、1，2-苯并吩嗪、视黄醇、双-3-氨基吡啶盐、嚏根草苷元、四环素、sterophenol、苯并咪唑基苯胺、2-羰基-3-色烯、吲哚、占吨、7-羟基香豆素、吩噁嗪类、水杨酸盐、毒毛旋花苷元、卟啉类、三芳基甲烷类和核黄素。具有连接的官能团或者可被修饰以纳入这些官能团的个别荧光化合物包括，例如丹磺酰氯、荧光素如3，6-二羟基-9-苯基占吨氢醇、罗丹明异硫氰酸酯、N-苯基-1-氨基-8-磺酸萘、N-苯基-2-氨基-6-磺酸萘、4-乙酰胺基-4-异硫氰酸根合-均二苯代乙烯-2，2′-二磺酸、芘-3-磺酸、2-甲苯氨基萘-6-磺酸酯、N-苯基-N-甲基-2-氨基萘-6-磺酸酯、溴化乙锭、stebrine、金胺-0，2-(9′-蒽基)棕榈酸酯、丹酰基磷脂酰乙醇胺、N，N′-二(十八烷基)氧杂羰花青、部花青，4-(3′芘基)丁酸盐、d-3-氨基脱氧马萘雌酮、12-(9′-蒽基)硬脂酸盐、2-甲基蒽、9-乙烯基蒽、2，2′-(乙烯撑-P-苯撑)-二苯并噁唑、p-双[2-(4-甲基-5-苯基-噁唑基)]苯、6-二甲氨基-1，2-苯并吩嗪、视黄醇、双(3′-氨基吡啶)1，10-癸二醇二碘化物、hellibrienin的磺基萘基腙、氯四环素、N-(7-二甲氨基-4-甲基-2-氧代-3-色烯基)马来酰亚胺、N-[p-(2-苯并咪唑基)-苯基]马来酰亚胺、N-(4-fluoranthyl)马来酰亚胺、双(高香草酸)、刃天青、4-氯-7-硝基-2，1，3-苯并二噁唑、部花菁540、试卤灵、玫瑰红、乙基2，4-二苯基-3(H)-呋喃酮。
理想的是，荧光增白剂应在高于约300nm处吸收光，优选地约350nm，更优选地高于约400nm，通常在比吸收光的波长高约10nm的波长处发射光。应该注意的是，结合染料的吸收和发射特性可能与非结合染料不同。因此，当提到染料的不同波长范围和特性时，意在说明使用的染料，而不是非结合的染料并以任意溶剂中为特性。荧光增白剂通常是优选的，因为通过用光照射荧光增白剂，人们可以获得多种放射。由此，单一的标记物能提供多种可测量的情况。
检测信号也可由化学发光源和生物发光源提供。化学发光源包括被化学反应电子激发，然后可发射光的化学物。该发射的光作为检测信号或为荧光受体提供能源。已经发现大量不同家族的化合物在不同条件下提供化学发光。化合物家族之一是2，3-二氢-1，-4-二氮杂萘二酮。最受欢迎的化合物是5-氨基化合物的鲁米诺。该家族的其他成员包括5-氨基-6，7，8-三甲氧基-和二甲氨基＞calbenz类似物。用碱性过氧化氢或次氯酸钙和碱可使这些化合物发冷光。其他家族的化合物是2，4，5-三苯基咪唑，以洛粉碱作为现有产品的通用名称。化学发光类似物包括对位-二甲氨基和-甲氧基取代物。化学发光还可在碱性条件下用草酸酯获得，通常为草酰活性酯，如p-硝苯基，以及过氧化物，如过氧化氢。或者，荧光素可与荧光素酶或光泽精结合用于提供生物发光。
自旋标记物是由带有未配对的电子自旋的报告分子提供，其可通过电子自旋共振(ESR)谱检测。示范性的自旋标记物包括有机自由基、过渡金属复合物，尤其是钒、铜、铁、锰等。示范性的自旋标记物包括氮氧自由基。
此外，扩增序列可进行其他扩增后的处理。例如，在一些情况下，可能需要的是在杂交前用寡核苷酸阵列使该序列分段，以便提供更易于进入探针的片段，其避免了成环和/或与多重探针杂交。核酸的分裂通常可通过本领域已知的物理、化学或酶方法完成。
在各种样本制备操作之后，该样本通常将进行一种或多种分析操作。尤其优选的分析操作包括，例如用寡核苷酸阵列进行基于序列的分析，和/或例如用微细管阵列电泳进行基于大小的分析。
在一些实施方式中，可能需要的是提供附加的或替代的方式用于分析样本中的核酸。
微细管阵列电泳通常包括使用可能充有或不充有特定分离介质的细的毛细管或通道。通过毛细管的样本的电泳为样本提供基于大小的分离曲线。微细管阵列电泳通常为基于大小的测序、PCR产物分析和限制性片段排列大小提供了快速的方法。这些毛细管的高表面体积比允许应用较高电场穿过毛细管，而毛细管没有大量的热变化，因此允许更快的分离。此外，当与共焦成像方法相结合时，这些方法提供在埃摩尔范围内的灵敏度，其与放射性测序方法的灵敏度相似。
在许多毛细管电泳方法中，毛细管，例如蚀刻、加工或模塑成平面基层的熔融二氧化硅毛细管或通道，被充入合适的分离/筛分基质。典型地，本领域已知的各种筛分基质都可用于微细管阵列。这些基质的实例包括，例如羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺和琼脂糖。凝胶基质可被引入并在毛细管通道内聚合。然而，在一些情况下，这可能导致通道内气泡的诱捕，这会干扰样本分离。因此，通常需要的是在毛细管的平面元(planar element)配合之前，在毛细管通道内放置预成型的分离基质。固定这两个部分，例如通过声波焊接，永久地将该基质固定在通道内。通道之外的聚合作用有助于保证没有气泡形成。而且，焊接过程的压力有助于保证无孔隙的体系。
除了用于核酸“指纹”和其他基于大小的分析外，毛细管阵列还可用于测序应用。特别地，凝胶基测序技术可随时适用于毛细管阵列电泳。
反转录PCR也可用于本发明，以检测CD36编码基因的转录物的浓度。RT-PCR，被称为“第一链反应”，互补DNA是由信使RNA模板用dNTPs和依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶)通过反转录过程制成。RT-PCR利用了成熟mRNA的特性，其被称为3′多聚腺苷酸区域，通常称作聚A尾，是常见的聚(T)DNA引物的结合位点。在细菌mRNA的情况下，缺少聚(A)尾的序列特异性引物可生成以扩增目标mRNA序列。这些引物将退火至溶液中各mRNA的3′端，允许通过反转录酶进行互补DNA的5′->3′的合成。通过使用基因特异性引物或随机六聚体引物，cDNA也可由mRNA制成。
逆转录反应完成后，并且互补DNA已经从原始的单链mRNA产生，则启动标准的聚合酶链反应，称为“第二链反应”。如果初始的mRNA模板是来源于相同的组织，随后的PCR反应可用于探测由反转录产生的cDNA文库。可以设计引物以扩增在源组织中表达的目标基因。然后，可用实时定量PCR来比较基因表达的水平。
在本发明的范围内，术语“杂交”表示常规杂交条件下的杂交，优选地为严格的条件下，如Sambrook等人所述(Molecμlar Cloning，A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。术语“严格的”在与杂交条件相结合使用时和本领域所限定的相同，即在熔点Tm下15-20℃，参见Sambrook等人，1989，页数11.45-11.49。优选地，条件是“非常严格的”，即在熔点Tm下5-10℃。在非常严格的条件下，杂交只有在寡核苷酸序列和所关注的位点之间的同一性为100％时才发生，而如果寡核苷酸和DNA位点之间只有一个不匹配，杂交也不发生。通过调整本领域所述的杂交缓冲液的温度和/或离子强度，可达到这种优化的杂交结果。然而，同等高的特异性可用高亲和力的DNA类似物获得。一种这样的高亲和力DNA类似物被称作“锁核酸”(LNA)。LNA是一种新型的双环核酸类似物，其中呋喃环构形被连接2′-O位置至4′-C位置的亚甲基连接限制。所有这些LNA的共同点是对互补核酸的亲和力，是目前为止报导的最高亲和力的DNA类似物(Drum等人(1999)，Clinical Chemistry 45，1898-1905；WO 99/14226EXIQON)。LNA探针可在市场上从Proligo LLC(美国科罗拉多州，Boμlder)购买得到。另一种高亲和力DNA类似物是所谓的蛋白质核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被包含酰胺的骨架代替，尤其是氨乙基甘氨酸骨架。核酸碱基被保留并且直接或间接地结合到骨架的酰胺部分的aza-氮原子上(Science(1991)254：1497-1500)。
多种不同的标记可耦合到探针上。其中优选的是荧光报告基团，因为它们产生高的信噪比。
合适的荧光基团的例子包括荧光黄、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、吖啶、Hoechst 33258、罗丹明、罗丹明绿、四甲基罗丹明、德州红(Texas Red)、Cascade Blue、俄勒冈绿(Oregon Green)、Alexa Fluor、铕和钐。
另一种类型的标记物是酶标记。在与目标核酸序列杂交后，将酶的底物加入并测量有色产物的形成。酶标记的例子包括β-牛乳糖、过氧物酶、辣根过氧物酶、脲酶、糖苷酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶和荧光素酶。
进一步的标记物包括化学发光基团，如酰肼类，比如鲁米诺和草酸酯类。再进一步的可能性是利用放射性同位素，并用闪烁计数检测杂种。放射性同位素可选自32P、33P、35S、125I、45Ca、14C和3H。
一种特别优选的基于探针检测的实施方式包括利用捕获探针来捕获目标核酸序列。捕获探针是结合到固体表面上，如珠、孔或棍。然后，捕获的目标核酸序列可以在非常严格的条件下与检测探针接触，并可以检测等位基因。
基于探针技术的一种实施方式是基于TAQMAN技术。这是一种利用被称为TAQMAN
Figure G2008800041057D00381
探针的双标记荧光寡核苷酸探针测量PCR产物积累的方法。这种探针是由用两种不同的荧光染料标记的短(约20-25个碱基)寡脱氧核苷酸组成。在5′端点上是报告染料，而在3′端点上是淬火染料。该寡核苷酸探针序列与PCR扩增子中存在的内部目标序列是同源的。当探针原封不动时，两种荧光团之间发生能量转移，并且来自报告剂的放射光被淬火剂淬灭。在PCR的延伸阶段，该探针被聚合酶的5′核酸酶活性分裂，从而将报告剂从寡核苷酸淬灭剂释放出并且引起报告剂放射强度的增大。
其他合适的方法包括利用质谱、单碱基延伸，确定探针和目标核酸序列之间的杂种的Tm曲线，利用单链构象多态性，利用单链构象多态性异源双链、利用RFLP或RAPID，利用来自所述生物样本的目标核酸序列的测序。
寡核苷酸引物和/或探针
本发明的一个方面涉及寡核苷酸引物和/或探针，用于检测CD36编码核酸分子或其部分，尤其用于检测CD36转录产物或其部分，其中所述至少一种核酸引物和/或探针检测至少一种CD36转录物或其部分。
正如技术人员所知，本发明的分离的寡核苷酸引物是与其所基于的序列足够互补的核酸分子，并且足够长，以选择性地与有意扩增的核酸分子的对应的区域杂交。该引物能够起动上述方法中有意的核酸分子的相应区域的合成。类似地，本发明的分离的寡核苷酸探针是一种分子，例如足够长且与所关注的核酸序列足够互补的核酸分子，其在高度严格或较低严格条件下选择性地结合到所关注的核酸序列上。因此，可以理解的是，至少一种寡核苷酸引物和/或探针能够扩增CD36编码核酸分子或其部分。技术人员可进一步理解的是，根据本发明，利用至少一种寡核苷酸引物和/或探针，例如利用3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25种寡核苷酸引物和/或探针。
本发明的一种实施方式涉及分离的寡核苷酸，包括与CD36转录物或其部分的序列100％相同的至少10个连续核苷酸。如本文他处解释的那样，这种探针可用于确定至少一种CD36转录物或其部分的浓度。优选地，分离的寡核苷酸包括与SEQ ID NO：10-45或对应的互补链相同的序列的至少10个连续碱基，或者与SEQ ID NO：10-45或其互补链有至少90％序列同一性、更优选地有至少95％序列同一性的链。所述分离的寡核苷酸包括本发明的基因标记。
根据本发明，在检测中使用3个探针组A、B和C。
探针组A
SEQ ID NO：10
＞HG-U133A_2：206488_S_AT(目标序列)
aactggattcactttacaatttgcaaaacggctgcaggtcaacctattggtcaagccatc
agaaaaaattcaagtattaaagaatctgaagaggaactatattgtgcctattctttggct
taatgagactgggaccattggtgatgagaaggcaaacatgttcagaagtcaagtaactgg
aaaaataaacctccttggcctgatagaaatgatcttactcagtgttggtgtggtgatgtt
tgttgcttttatgatttcatattgtgcatgcagatcg
参考：https://www.affymetrix.com/anaylsis/netaffx/fμllrecord.affx？pk＝HG-U133A 2％3A206488 S AT
探针序列(5′-3′)：探针X：探针Y：位置：目标链
SEQ ID NO：11：AACTGGATTCACTTTACAATTTGCA 145 131 1272反义
SEQ ID NO：12：GCAAAACGGCTGCAGGTCAACCTAT 11 323 1294反义
SEQ ID NO：13：GTCAACCTATTGGTCAAGCCATCAG 227 443 1309反义
SEQ ID NO：14：GGAACTATATTGTGCCTATTCTTTG 662 515 1364反义
SEQ ID NO：15：GTGCCTATTCTTTGGCTTAATGAGA 553 455 1375反义
SEQ ID NO：16：AATGAGACTGGGACCATTGGTGATG 242 151 1393反义
SEQ ID NO：17：TGGAAAAATAAACCTCCTTGGCCTG 517 535 1449反义
SEQ ID NO：18：CCTCCTTGGCCTGATAGAAATGATC 686 259 1461反义
SEQ ID NO：19：GATCTTACTCAGTGTTGGTGTGGTG 46 409 1482反义
SEQ ID NO：20：TTGGTGTGGTGATGTTTGTTGCTTT 127 689 1496反义
SEQ ID NO：21：GATTTCATATTGTGCATGCAGATCG 171 413 1524反义
探针组B
SEQ ID NO：22
＞HG-U133A 2：209555_S_AT(目标序列)
aaccaatttgtgttgttctgattcaataattggtttctgggtggccaattcagaagaaga
gtgtacatgctcaacagtctccaggaccatcagtatactgcatttcatgtgcaccaaata
ttttgaaagacatttataaataattggcttatgactcatatttctctatgaataccttca
tacagcaggtataactcttttctttatgggcttaaatattttgtcactgatcctgcaaat
ggacatcattttagcacactagcggtttatattttaaggaccttcattctctgttctgca
cctcttctggaaattgagtaaattttgctttttttttttactcagttgcaacttacgctt
ggcatcttcagaatgcttttctagcattaagagatgtaaatgataaaggaattattgtat
gaaatattacaaagcgtagactatgcattgttattcattataatattttttgctgtcata
atcgcctcata
参考：https://www.affymetrix.com/analysis/neatffx/fμllrecord.affx？pk＝HG-U133A 2％3A209555 S AT
探针序列(5′-3′)：探针X：探针Y：位置：目标链
SEQ ID NO：23：AACCAATTTGTGTTGTTCTGATTCA  586 135 1702反义
SEQ ID NO：24：TTGGTTTCTGGGTGGCCAATTCAGA  119 677 1731反义
SEQ ID NO：25：AACAGTCTCCAGGACCATCAGTATA  22 117 1774反义
SEQ ID NO：26：GTATACTGCATTTCATGTGCACCAA  663 431 1794反义
SEQ ID NO：27：GTCACTGATCCTGCAAATGGACATC  499 443 1924反义
SEQ ID NO：28：ATGGACATCATTTTAGCACACTAGC  454 39 1940反义
SEQ ID NO：29：AGCACACTAGCGGTTTATATTTTAA  624 71 1954反义
SEQ ID NO：30：TTTAAGGACCTTCATTCTCTGTTCT  675 655 1974反义
SEQ ID NO：31：CAGTTGCAACTTACGCTTGGCATCT  139 187 2044反义
SEQ ID NO：32：GCTTGGCATCTTCAGAATGCTTTTC  667 311 2058反义
SEQ ID NO：33：TTTTTGCTGTCATAATCGCCTCATA  683 659 2168反义
探针组C
SEQ ID NO：34
＞HG-U133A_2：209554_AT(目标序列)
gaaatctgggcttggatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcacatatgcagtgt
ggtgggagtggggcaacttggggaatatgttacatgtgtgactgtgttggccctggcgaa
gtaatgtgtcagaaagggtaaatgtgtggacacttgcaagtgctcatggatgaatttata
tgtttgagtcatagaaaaagtgtaccctttgatagaagcacattttctttccaaaggcgt
ggttattaaccagcagaattatagcaggtatacataacttaagtg
参考：https://www.affymetrix.com/analysis/netaffx/fμllrecord.affx？pk＝HG-U133A 2％3A209554 AT
探针序列(5′-3′)：探针X：探针Y：位置：目标链
SEQ ID NO：35：GAAATCTGGGCTTGGATGTGTGTGT 350 357 3352反义
SEQ ID NO：36：GTGTGCACATATGCAGTGTGGTGGG 327 465 3393反义
SEQ ID NO：37：GTGTGGTGGGAGTGGGGCAACTTGG 394 467 3408反义
SEQ ID NO：38：GAGTGGGGCAACTTGGGGAATATGT 644 391 3417反义
SEQ ID NO：39：GTTACATGTGTGACTGTGTTGGCCC 289 425 3440反义
SEQ ID NO：40：GTTGGCCCTGGCGAAGTAATGTGTC 602 417 3457反义
SEQ ID NO：41：GTGTGGACACTTGCAAGTGCTCATG 314 467 3495反义
SEQ ID NO：42：ACTTGCAAGTGCTCATGGATGAATT 10 101 3503反义
SEQ ID NO：43：AGTGTACCCTTTGATAGAAGCACAT 137 51 3550反义
SEQ ID NO：44：AAGGCGTGGTTATTAACCAGCAGAA 277 149 3585反义
SEQ ID NO：45：ATAGCAGGTATACATAACTTAAGTG 181 1 3612反义
进一步优选的分离的寡核苷酸可包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或其对应的互补链的任意序列相同的至少10个连续碱基，或者与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或其对应的互补链具有至少90％的序列同一性的链，更优选地为至少95％的同一性，所述分离的寡核苷酸包括本发明的多态性。
分离的寡核苷酸的长度取决于目的。当被用于从基因组DNA的样本的扩增时，引物的长度应为至少15，并且更优选甚至更长，以保证需要的目标核酸序列的特异性扩增。当被用于从mRNA的扩增时，引物的长度可以较短，同时仍然保证特异性扩增。在一种具体的实施方式中，引物对中的一条可以为等位基因特异性引物，在这种情况下，扩增只有在样本中存在特异性等位基因时发生。当分离的寡核苷酸被用作杂交探针用于检测时，长度优选地是在10-15个核苷酸范围内。这就足以保证与扩增的目标核酸序列在样本中的特异性杂交。当使用比DNA结合更强的核苷酸(如LNA和/或PNA)时，引物的长度可以有些短，例如，下降至7-8个碱基。
长度可以是至少15个连续核苷酸，例如至少20个核苷酸。上限优选地确定分离的寡核苷酸的最大长度。因此，分离的寡核苷酸可少于1000个核苷酸，更优选少于500个核苷酸，更优选少于100位核苷酸，例如少于75个核苷酸，例如少于50个核苷酸，例如少于40个核苷酸，例如少于30个核苷酸，例如少于20个核苷酸。
分离的寡核苷酸可包括10至50个核苷酸，例如10至15、15至20、20至25，或包括20至30个核苷酸，或15至25个核苷酸。
根据用途，多态性可位于核酸序列的中心，在核酸序列的5′端、或在核酸序列的3′端。对于基于单个碱基延伸的检测，寡核苷酸的序列与突变/多态性相邻，或者在3′或者在5′方向。
分离的寡核苷酸序列可与目标核苷酸序列的编码链的子序列或与目标核苷酸序列的非编码链的子序列互补，因为多态性在编码和非编码链中估计有相似的效率。
分离的寡核苷酸序列可由RNA、DNA、LNA、PNA单体，或由能够与目标核酸序列杂交的化学修饰的核苷酸制成。该寡核苷酸也可由所述单体的混合物制成。
引物或探针的统称为术语“寡核苷酸”，其包括天然和/或非天然核苷酸的寡核苷酸，包括它们的任意结合。天然和/或非天然核苷酸可通过天然磷酸二酯键或非天然键连接。寡核苷酸可与多核苷酸交换使用。本发明的低聚物或聚合物序列是由单体亚单位化学或酶促加成形成。本文使用的术语“寡核苷酸”包括天然的线性低聚物或经修饰的单体或链接，包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其端基异构形式、肽核酸单体(PNA)、锁核苷酸单体(LNA)等，能够通过单体对单体相互作用的常规模式特异性地与单链多核苷酸标记结合，例如Watson-Crick的碱基配对、碱基堆积，Hoogsteen或反Hoogsteen型的碱基配对等。通常，单体是通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小为几个单体单元(如3-4)至几十个单体单元(如40-60)的寡核苷酸。无论何时寡核苷酸是由字母的序列表示，例如“ATGCCTG”，可以理解的是，核苷酸从左至右为5′->3′顺序，并且除非另有说明，“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，以及“T”表示胸苷。通常，本发明的寡核苷酸包括四种天然核苷酸，然而，它们也可包括甲基化或非天然的核苷酸类似物。合适的寡核苷酸可通过Beaucage和Carruthers描述的亚磷酰胺方法(Tetrahedron Lett.，22，1859-1862，1981)或者通过Matteucci等人的三酯方法(J.Am.Chem.Soc.，103，3185，1981)制备，在此将二者纳入作为参考，或者使用商业的自动寡核苷酸合成仪或VLSIPS.TM.技术通过其他化学方法制备。当寡核苷酸指“双链”时，本领域技术人员可以理解，一对寡核苷酸存在于例如典型地与DNA相关的氢键键合的螺旋结构中。除了双链寡核苷酸的100％互补形式外，本文使用的术语“双链”意思还表示包括像突起和环状这种结构特点的那些形式。例如，如US5.770.722中所述的单分子双链DNA。对本领域技术人员来说很清楚的是，当采用有天然或非天然核苷酸的寡核苷酸时，例如在需要用酶处理的情况下，通常需要由天然核苷酸组成的寡核苷酸。当核苷酸用合成程序被成串地结合在一起时，它们通常被称作寡核苷酸。
免疫学方法
在本发明的上下文中，“免疫学方法”应理解为表示基于免疫化学的，尤其是基于抗原抗体反应的分析方法。免疫学方法的例子包括免疫测定，例如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA，与固相技术结合：ELISA(酶联免疫吸附测定))或其他免疫荧光测定。免疫测定可通过将待研究的样本暴露于CD36-结合抗体并检测和定量结合到该抗体的CD36的量来完成。在这些测定中，检测和定量是以已知的方式直接或间接地完成。因此，通过使用合适的标记物使抗原-抗体复合物的检测和定量成为可能，该标记物可被抗CD36的抗体携带和/或被抗一级抗体的二级抗体携带。根据上述免疫测定的类型，例如，放射性标记、化学发光标记、荧光染料或其他酶，如磷酸酶或过氧化物酶，可在合适的底物的协助下被检测和定量。
在本发明的一种实施方式中，免疫学方法是在合适的固相的协助下完成。可提及的合适的固相包括由聚苯乙烯或薄膜制成的(例如用聚双氟乙烯制成，PVDF)通常的商业化微孔板，其习惯上用于ELISA技术。
为了实行本发明的方法，将合适的样本应用于固相上，例如患者的液体样本。该样本优选地为血浆样本，其中CD36或其片段是以非结合形式存在或以可结合到它的配体LDL上的形式存在。本文假定sCD36存在于和血浆中高分子片段形成的复合物中，意味着优选的是冷冻和解冻待测试的样本，以便所述高分子复合物(脂质-蛋白质复合物)可能被降解。
在一个方面，本发明涉及一种方法，其中通过下述步骤测定CD36多肽浓度，i)提供待研究的样本，ii)提供抗-CD36抗体，iii)将该样本暴露于抗-CD36抗体，iv)可选择地，将所述CD36-抗体复合物暴露于至少针对所述CD36-抗体复合物的另外的抗体中，以及v)检测和定量所述抗体的量。
在本发明的更具体的方面，提供一种通过固相ELISA酶免疫测定法测定血浆样本中人CD36的方法，其包括步骤：
(i)提供待研究的血浆样本，
(ii)提供本文所限定的抗-CD36抗体，
(iii)将该待研究的样本暴露于固相和所述抗体中，以及
(iv)检测和定量与CD36结合的抗体的量；并且在本发明更优选的方面，提供一种通过固相ELISA酶免疫测定法测定血浆样本中人CD36的方法，其包括步骤：
(i)提供待研究的样本，
(ii)提供抗-CD36抗体，
(iii)将待研究的该样本暴露于与固相结合的该抗CD-36抗体中，
(iv)可选择地将该CD36-抗体复合物暴露于第二抗-CD36抗体中，和
(iv)检测和定量与CD36结合的抗体的量，
其中，所述固相优选地为微孔板，CD36优选地存在于高分子量血浆部分(的一部分)，所述高分子量血浆部分优选地为CD36-脂蛋白复合物，所述抗-CD36抗体优选地选自以下具体指出的单克隆抗体，所述测定优选的是通过固相酶免疫测定完成，其中在酶免疫测定中，该样本暴露于第一、人CD36-结合抗体，并且结合的CD36的量是用载有酶标记物的第二CD36-结合抗体测量，在这里测量时通过酶-催化的显色反应或化学发光来完成。
通过多重悬浮点阵技术测定CD36的浓度也在本发明范围内。
抗体
本发明的一个方面涉及针对本文其他处所述的CD36多肽或其部分的抗原表位的抗体。该抗体可用在本发明的方法中，涉及用于分类动脉粥样硬化斑块、诊断动脉粥样硬化斑块、监测动脉粥样硬化斑块、诊断具有和/或获得症状性动脉粥样硬化斑块的危险、诊断动脉粥样硬化斑块的负荷和/或确定个体的治疗方案的方法。因此，本文中的抗原表位涵盖了能够被抗体或其结合的片段识别的任意抗原表位。
本文使用的术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体，以及它们的片段，例如能够结合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)2片段。它包括常规的小鼠单克隆抗体和人抗体，以及非人类抗体的人源化形式，而且它还包括从噬菌体抗体文库分离的“抗体”。
本发明的抗体可以是多克隆或单克隆，并且可通过本领域已知的体内或体外方法产生。因此，抗-CD36抗体选自多克隆和单克隆CD36-特异性抗体。
单克隆抗体是由杂交瘤产生的抗体。制备单克隆抗体-合成杂交瘤细胞的方法是本领域技术人员熟知的，例如通过将产生B淋巴细胞的抗体和永生化的B-淋巴细胞细胞株融合。
多克隆抗体是从(对给定的抗原)免疫的动物的血液中纯化的抗体分子的混合物(对给定的抗原有特异性)，在这里非限制性的例子是来自兔的抗体分子。这种抗体是多克隆的，因为它们是许多不同的产生抗体的细胞的产物。
本发明还涉及单克隆和/或多克隆抗体的混合物。至少两种单克隆抗体的混合物也在本发明的范围内。应理解的是，该混合物可包括3、4、5、6、7、8、9、10或15种单克隆抗体。
本文使用的抗-CD36抗体可以是上述单克隆抗体，和/或分离的多克隆抗体，可通过免疫处理获得，其中纯化和重组的人类CD36用作抗原成分，而该抗体优选地对以液体形式存在于人血血浆中的CD36蛋白质的各种片段有特异性，该片段可选择地作为CD36-脂蛋白复合物的一部分，例如，与存在于无细胞血浆的高分子量片段中的低密度脂蛋白(LDL)、IDL(中密度脂蛋白)或VLDL(极低密度脂蛋白)结合的CD36或其片段。在一种实施方式中，sCD36与氧化型LDL(oxLDL)、氧化型LDL、氧化型IDL和/或氧化型VLDL相关。在另一种实施方式中，在与氧化型HDL形成的复合物中发现了sCD36。
在一种实施方式中，抗体选自sc7309(CD36(SMf)，小鼠IgM)，和多克隆CD36特异性蛋白，如sc5522(CD36(N-15)，羊IgG，抗原表位N-末端(h))，sc9154(CD36(H-300)，兔IgG，抗原表位1-300(h))，如sc5522和sc9154(两者均来自Santa Cruz Biotechnology Inc.，美国加州圣克鲁斯)。
用于检测血浆中循环CD36的ELISA测定的抗体优选地被标记以方便检测，该标记物优选地是本领域技术人员熟知的生物素化的形式。
具体地，CD36-特异性单克隆抗体可选自：
185-1 G2 Vilella
131.1 Tandon，Rockville
131.2 Tandon，Rockville
131.4 Tandon，Rockville
131.5 Tandon，Rockville
131.7 Tandon，Rockville
NAM28-8C12 Blanchard，Nantes
AmAK-5 Kehrel，Muenster
CLB-IVC7 CLB，Amsterdam
Lyp 10.5 McGregor，Lyon
Lyp 13.10 McGregor，Lyon
诊断、分类和监测中使用的标准水平
在患有动脉粥样硬化斑块的个体中，CD36多肽和/或CD36核酸分子的浓度的至少为标准水平1.15倍的升高是动脉粥样硬化斑块向症状性动脉粥样硬化斑块发展的标志。具体地，标准水平的至少1.25倍的升高，例如至少1.30倍的升高，如标准水平的至少1.35倍的升高，例如标准水平的1.40倍，如标准水平的至少1.45倍的升高，例如标准水平的1.50倍，如标准水平的至少1.55倍的升高，如标准水平的至少1.60倍的升高，如标准水平的至少1.65倍的升高，如标准水平的至少1.70倍的升高，如标准水平的至少1.75倍的升高，如标准水平的至少1.80倍的升高，如标准水平的至少1.85倍的升高，如标准水平的至少2.0倍的升高，如标准水平的至少2.25倍的升高，如标准水平的至少2.50倍的升高如标准水平的至少3倍的升高，如标准水平的至少3.50倍的升高，如标准水平的至少4倍的升高，如标准水平的至少4.50倍的升高，如标准水平的至少5倍的升高，如标准水平的至少6、7、8、9或10倍的升高，是动脉粥样硬化斑块向症状性动脉粥样硬化斑块发展的标志。
术语“标准水平”是指来自个体的随机组的一系列样本中CD36多肽或CD36编码核酸分子的浓度。在一种实施方式中，标准水平是在来自无症状个体的随机组一系列样本中测定。该系列包括来自至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或例如至少100位个体的样本。
在另一种实施方式中，标准水平是指来自例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或者例如至少100位个体的一系列样本中的CD36多肽或CD36编码核酸分子的浓度，其中在提供样本时的2个多月前，3个多月前，4个多月前，5个多月前或6个多月前，没有观察到与动脉粥样硬化症有关的症状。在一种实施方式中，标准水平是来自例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或者例如至少100位个体的一系列样本中的CD36多肽或CD36编码核酸分子的浓度，其中在提供样本时的2个多月前，3个多月前，4个多月前，5个多月前或6个多月前，没有观察到与颈动脉狭窄和/或颈动脉硬化症有关的症状。
治疗方案的确定
本发明的一个方面涉及CD36多肽或CD36编码核酸分子的浓度在确定基于CD36多肽或CD36编码核酸分子的浓度的个体治疗方案中的用途。
因此，本发明涉及一种用于确定个体的治疗方案的方法，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的程度和/或诊断个体具有和/或获得症状性动脉粥样硬化斑块的危险，v)基于iv)的结果确定对所述个体的治疗方案。
如果个体面临的狭窄的增加程度的危险是基于本文的方法确立，则所述个体的治疗方案可被确定。例如，观察到的狭窄的治疗可包括通过血管成形术机械地扩大动脉，和/或扩张机体的至少一条动脉，或机体的两条、三条或四条动脉。在具体的实施方式中，分别机械地扩大颈动脉和/或冠状动脉的至少一条或两条。此外，治疗方案可包括动脉内膜切除术，包括动脉线中，动脉粥样化斑块物质或阻碍的移除。动脉内膜切除术可分别在颈动脉和/或冠状动脉的至少一条或两条上施行。
此外，如果个体面临具有和/或发生症状性动脉粥样硬化斑块的危险被确立，则可以启动个体的预防性治疗，以便减慢和/或抑制无症状斑块向症状性斑块的发展。例如，该治疗方案包括用降低胆固醇的药物治疗，如他汀类。他汀类包括洛伐他汀(Mevacor)、普伐他汀(Pravachol)、辛伐他汀(Zocor)、阿托伐他汀(Lipitor)、罗苏伐他汀(Crestor)。他汀类药物是HMG-CoA还原酶抑制剂。不受理论的约束，认为他汀类通过抑制HMG-CoA还原酶有助于预防机体内胆固醇的产生。
此外，结合他汀类，烟酸和/或肠道胆固醇吸收抑制补充剂(例如，依替米贝)也可用于减慢和/或抑制无症状斑块向症状性斑块的发展。在进一步的实施方式中，该治疗方案包括用减慢和/或抑制凝血(在该过程中，血液形成固体凝块)的药剂治疗。
试剂盒
在一个方面，本发明涉及用于分类个体中动脉粥样硬化斑块的试剂盒，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，分类所述动脉粥样硬化斑块。
在本发明的另一方面，涉及一种用于诊断个体中动脉粥样硬化斑块的试剂盒，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述动脉粥样硬化斑块。
在又一方面，本发明涉及一种用于监测个体中动脉粥样硬化斑块的试剂盒，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与之前在相同的个体中测量的CD36多肽或其部分的浓度和/或CD36编码核酸分子或其部分的浓度相联系，和/或iv)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及v)基于根据iii)和/或iv)的所述联系，监测所述动脉粥样硬化斑块的任何进展。
在进一步的方面，本发明涉及一种用于诊断个体处于具有和/或发生症状性动脉粥样硬化斑块的危险的试剂盒，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述个体是否处于具有和/或发生症状性动脉粥样硬化斑块的危险中。
在进一步方面，本发明涉及一种用于诊断个体中动脉粥样硬化斑块的负荷的试剂盒，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述个体中的动脉粥样硬化斑块的负荷。
此外，本发明涉及一种用于诊断个体中由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的试剂盒，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断所述个体中由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的程度。
此外，本发明涉及一种用于确定个体治疗方案的试剂盒，所述方法包括在所述个体的样本中，i)测定CD36多肽或其部分的浓度和/或ii)测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，iii)将i)和/或ii)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及iv)基于根据iii)的所述联系，诊断由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的程度和/或诊断个体具有和/或获得症状性动脉粥样硬化斑块的危险，v)基于iv)的结果，确定对所述个体的治疗方案。
因此，本发明的一种或多种试剂盒包括至少一个检测单元，用于测定CD36多肽或其部分的浓度和/或用于测定CD36编码核酸分子或其部分的浓度，尤其是转录物。
该检测单元选自能够检测本文其他处所述的CD36编码核酸分子或其部分的至少一种引物，至少一种探针和至少一种引物对。
如上所述，该检测单元可以是能够与指示CD36编码核酸分子或其部分的浓度的mRNA或mRNA形式的转录物杂交的任意核苷酸探针，如DNA、RNA、PNA、或LNA探针。杂交条件优选地如本文对于探针的描述。在另一种实施方式中，检测单元是能够特异性地与CD36多肽或其部分结合的抗体。
CD36编码核酸分子，以mRNA形式存在的转录物的浓度和/或CD36多肽或其片段的浓度可由人手工地或通过电脑或其他机器来对比。算法可用于检测异同点。例如，算法可评分和比较被表达的基因或未表达的基因。或者，算法可查找特定基因、转录物或其翻译产物的表达强度的变化，并给两个样本之间的强度变化评分。相同点可在两个样本中表达的基因、转录物或其翻译产物，和两个样本中均未表达的基因的基础上，或者在表达强度在数字上相似的那些基因的基础上来确定。
通常，检测操作将用诊断装置之外的阅读装置进行。然而，在一些情况下可能需要将数据搜集操作纳入该诊断装置本身。
检测仪器可以是荧光检测器、或光谱检测器、或其他检测器。
尽管杂交是特异性相互作用的类型之一，其用在图谱实施方式中有明显的用途，但抗体试剂也可能非常有用。
从各种分析操作(例如寡核苷酸和/或微细管阵列)中收集数据将典型地用本领域已知的方法来完成。例如，可用激光扫描阵列以激发与上述探针阵列的区域杂交的荧光标记的目标物，然后其可用电荷耦合装置(CCD)成像，以便大范围扫描该阵列。此外，用于从阵列中收集数据的其他特别有用的方法是通过使用激光共焦显微镜，其将易于自动化的程序的简便和速度与高分辨率检测相结合。
在数据收集操作之后，该数据将典型地被报告给数据分析运算。为了促进样本分析运算，由装置的阅读器获得的数据将典型地用数字计算机来分析。典型地，该计算机将适当地被编程以便接收和储存来自装置的数据，以及分析和报告收集的数据，即解释荧光数据以确定杂交探针的序列、背景的常态化和单个碱基错配杂交，排列SBH应用中的序列数据等。
实验和实施例
患者
将取自连续切除术患者的颈动脉斑块根据患者在手术前的6个月是否经历同侧中风、TIA，或者一时性黑蒙分为两组。分别根据存在或不存在血管痉挛现象，将斑块定性为症候性或无症状。根据统一的标准，采用脑前彩色双功能超声诊断并分类颈内动脉狭窄(Grant EG，Benson CB，Moneta GL，Alexandrov AV，Baker JD，Bluth EI，Carroll BA，Eliasziw M，Gocke J，HertzbergBS，Katanick S，Needleman L，Pellerito J，Polak JF，Rholl KS，Wooster DL，Zierler RE.Carotid artery stenosis：gray-scale and Doppler US diagnosis-Society ofRadiologists in Mltrasound Consensus Conference.Radiology.2003；229：340-346)和CT血管造影术(Anderson GB，Ashforth R，Steinke DE，FerdinandyR，Findlay JM.CT angiography for the detection and characterization of carotidartery bifurcation disease.Stroke.2000；31：2168-2174)。在患有冠状动脉疾病(CAD)、外周动脉疾病或中风/TIA超过6个月的患者临床检查期间，检测到无症状的的颈内动脉狭窄。
颈动脉内膜切除标本
颈动脉粥样硬化斑块是在颈动脉内膜切除期间取自患者。将用于蛋白质和RNA提取的斑块迅速冻结在液氮中。为了免疫印迹，通过金属刃匀浆器，按0.1ml/10mg湿重量组织的比例，将取自斑块的组织粉末在冰冷的裂解缓冲液中搅匀(含有蛋白酶抑制剂混合物的PBS[Gibco Paisley UK]有1％的TritonX-100和0.1％的吐温20)。将提取物在冰上培养15分钟，并在12000g离心(4℃下15分钟)。保留上清液，并用BCA法(Pierce Cheshire UK)测量样本中的蛋白质浓度。
血液采样方案
将外周静脉血液吸入无热原的EDTA管，将该管立即浸入融化的冰中，并在2500g离心20分钟，在20分钟内获得贫血小板血浆。所有样本均储存在-80℃，并在分析程序开始前仅解冻一次。
高密度寡核苷酸微阵列
将总RNA用MagNA Pure kit III(Roche Applied Science，印第安纳波利斯，印度)从冰冻的颈动脉组织分离，用分光光度量化，并储存在-80℃。编码14500个基因的人类基因组U133A2.0阵列购自Affymetrix(圣塔克莱拉，加拿大)，并根据制造商的两个周期的目标标记方案进行杂交。简单地说，cDNA是从总100ng总RNA中制备，并且cRNA是由cDNA的体外转录获得。然后重复该周期，从600ng cRNA中制备cDNA。此后，生物素标记的cRNA由cDNA的体外转录产生，并在与该阵列杂交前被分段。为进行数据分析，使用GeneChipOperation Software(1.3)和ArrayAssist(3.4)。
实施例1、用于检测血清中CD36的ELISA分析试剂盒的实施例
ELISA分析，使用的试剂和分析条件
磷酸盐缓冲液，0.1mol/l，pH 8.0
Na2HPO4，2H2O，0.1mol/l，pH 8.0，储存在4℃
POD缓冲液
NaH2PO4，H2O，1.5mol/l
Na2HPO4，2H2O，8.5mol/l
NaCl 400mmol/l
pH 7.4
储存在4℃
溶菌酶溶液的制备：
溶菌酶，Sigma L-6876，20mg/ml。每份1ml，储存在-20℃，储存期限1年，4℃下的储存期限为4天。
POD-亲和素Dako P364：显色剂
四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(1种成分)
目录号No.50-76-06，Kirkegard and Perry laboratories。2-25℃下储存期限1年
磷酸1mol/l
POD-亲和素溶液：
POD缓冲液12ml
溶菌酶溶液120μl
POD-亲和素6μl
仅仅就在使用前制备
抗体
抗-CD36：生物素(酰)化的sc-9154(兔多克隆抗体，来自圣克鲁斯)
仪器
自动微孔板冲洗器Elx50(Biotek Instruments)
ELISA板在4℃下用捕获抗体羊(sc5522)-CD36(0.1ug/ml)过夜包被，接着在4℃下用磷酸缓冲盐水(PBS)和0.1％吐温封闭2天。将该板储存在-20℃备用。将用抗CD36的抗体包被的微孔板的每个孔用340μl冲洗缓冲液冲洗3次，使用程序12。在未抽吸冲洗缓冲液时终止最后的冲洗，在应用标准液(EDTA-血浆池)和样本(含可能的对照品)之前，以及在加入试剂之前，首先立即倒出该冲洗缓冲液。
标准
将通过常规血液采样取自100位受试者的EDTA血液在3000g离心10分钟，吸取血浆的上层并混合。混合血浆以350μl的等份被冷冻，并用稀释物作为标准曲线。其他EDTA血浆混合物用作高和低的内部分析对照品。
批间测定变异系数，根据相同样本的76次单独测定，估算为10％，根据15个不同日的高对照品的平行测定，估算为6％。批间测定变异系数，根据进行的每次运行中的对照品估算为16.4％。只有当对照品变化范围在+/-1.96×SD(批间测定)时，运行方被接受。
Elisa测定方法
将微孔板在Elx50上冲洗。标准品、对照品、样本以及稀释缓冲液排成两列，100μl/孔。标明应用位置。微孔板用塑料膜覆盖，并在振动台上培养60分钟。
将该板在Elx50上冲洗，100μl生物素化的SC-9154加到每个孔，用塑料膜覆盖，并在振动台上培养60分钟。将该板在Elx50上冲洗。
将100μl POD-亲和素溶液加到每个孔，用塑料膜覆盖并在振动台上孵育约30分钟。将该板在Elx50上冲洗。在通风橱内将100μl TMB加到每个孔，用塑料膜覆盖，并在振动台上培养10分钟。以每个孔加100μl磷酸终止该反应(在通风橱内)，用塑料膜覆盖直到读数。
测定
在反应终止后60分钟内，在Multiscan上读出450nm、620nm处的消灭情况。
计算
两个轴上带有线性刻度的三次样条。用EDTA池的稀释液作为标准曲线，结果是相对于EDTA血浆池来表达。
Elisa稀释缓冲液：磷酸盐缓冲液10mmol/l，含0.145mol/l NaCl，pH7.4。
实施例2、动脉粥样硬化斑块中的CD36基因表达
表1、与症状性颈动脉粥样硬化的患者(n＝4)相比，CD36在无症状斑块(n＝4)中的表达不同。Affimetrix芯片(Human Genome U133A 2.0Array)上的全部5个探针组检测CD36(Hs 120940)。
*无症状VS有症状
  单一基因ID   基因名称   基因代码   比率*
Hs.120949   CD36抗原(I型胶原受体凝血酶敏感蛋白受体) CD36 0.38
Hs.120949   CD36抗原(I型胶原受体凝血酶敏感蛋白受体) CD36 0.22
Hs.120949   CD36抗原(I型胶原受体凝血酶敏感蛋白受体) CD36 0.14
Hs.120949   CD36抗原(I型胶原受体凝血酶敏感蛋白受体) CD36 0.14
Hs.120949   CD36抗原(I型胶原受体凝血酶敏感蛋白受体) CD36 0.07
实施例3-5
患者
62名高度颈内动脉狭窄的连续患者(≥70％)用颈动脉内膜切除术(CEA，53名患者)或者用置入支架的颈动脉血管成形术(CAS，9名患者)治疗(表2)。研究包括19名(31％)女性和43(69％)名男性，平均年龄65.5岁(分布在44-83岁)。根据它们的症状将患者分为两组。在过去2个月内，16名(26％)患者经历过临床症状，例如与狭窄颈内动脉同侧的中风、短暂性脑缺血发作(TIA)或一过性黑蒙，其中46名(74％)患者在超过2个月前具有该症状(n＝22)或者从未经历过上述症状(n＝24)(表2)。按照统计的标准用脑前彩色双功能和CT血管造影术对颈动脉狭窄进行诊断和分类(Anderson等人，Stroke.2000；Grant EG等人，Radiology.2003；229：340-346)。
在超过六个月前患有冠状动脉疾病(CAD)、外周动脉疾病或中风/TIA的患者的临床检查期间，检测到无症状的颈动脉狭窄。根据前面所述的方法(European Carotid Plaque Study，EurJ Vasc Endovasc Surg.1995；10：23-30；Mathiesen EB et al，Circμlation.2001；103：2171-2175)，按照超声检查时的斑块回音强度，将斑块也分为两组，并分类为无回声或强回声/异质性。脑前动脉的三重超声、临床中枢检验和脑弥散加权磁共振成像(MRI)在该程序之前的两天内或在该程序之后进行。将伴随炎症性疾病的患者从该研究中排除，例如感染和自动免疫疾病、或者肝脏或肾脏疾病。该方案获得区域道德委员会的批准，并获得所有个体签署的知情同意书。
表2根据#临床症状以及出现症状后的月数的患者的基线变量
  ≤2月(n＝16)   ＞2月或无症状(n＝6)   P
  年龄，年   66(7.8)   65(9.3)   .98
  男性*   12(75)   31(67)   .57
  狭窄度％   80(80-95)   80(70-95)   .65
  无回音的颈动脉斑块*   7(43.8)   13(28.3)   .25
  脑MRI局部缺血*(n＝53)   11(68.8)   31(67.4)   .94
  体重指数，kg/m2   26.7(20.4-35.5)   25.8(19-35.5)   .72
  CEA治疗*   15(93.8)   38(82.6)   .28
  收缩压，mmHg   151(110-196)   150(110-194)   .60
  舒张压，mmHg   73(32-99)   80(49-101)   .59
  糖尿病*   4(25)   10(22)   .79
  他汀类治疗*   13(81.3)   41(89.1)   .42
  目前吸烟*   7(43.8)   25(54.3)   .74
  新蝶呤，nmol/l   8.7(4.9-18.0)   9.1(5.7-60.3)   .48
  CRP，mg/l   3.5(1.0-39.0)   5(0.6-28.0)   .93
  总白细胞数，109/l   8.3(4.0-12.1)   7.5(3.8-11.1)   .31
  纤维蛋白原，g/l   4.0(2.9-6.6)   3.9(2.6-6.9)   .87
  胆固醇，mmol/l   4.3(3.6-5.9)   4.4(2.8-7.5)   .68
  HDL胆固醇，mmol/l   1.3(0.7-1.9)   1.2(0.8-2.5)   .82
  甘油三酸脂，mmol/l   1.4(0.6-3.8)   1.5(0.7-3.7)   .31
  LDL(n＝49)   2.6(2.0-4.0)   2.6(1.5-5.1)   .46
  HbAlc，％   5.7(5.2-6.9)   5.8(0.9-8.8)   .95
  β-血小板球蛋白，IU/ml   53.3(26.7-142.1)   54.8(15.4-268.5)   .61
  血小板数，109/l   225.5(132-391)   261(168-441)   .10
#临床症状包括狭窄颈内动脉同侧的中风、TIA或一过性黑蒙。数字是未调整的均数(SD)或者*数字(百分数)。
血液采样方案
将外周静脉血吸到无热原的EDTA管内，将该管立即进入融化的冰中，并在4℃下于2500g离心25分钟，20分钟内获得贫血小板血浆。所有样本均储存在-80℃并仅解冻一次。
免疫组织化学
颈动脉内膜切除期间取患者的颈动脉粥样硬化斑块，将丙酮固定部分使用以下物质染色：单克隆鼠抗人CD36(FA6-152，Novus Biologicais，Littleton，CO)，抗人CD3 IgG(DakoCvtomation，Glostrup，Denmark)，以及抗人平滑肌肌动蛋白(DakoCvtomation)，亲和纯化多克隆鼠抗人巨噬细胞(钙防卫蛋白)IgG(MCA874G，SerotecLtd.，英国牛津)，以及绵羊抗大鼠冯维勒布兰德因子IgG(Cedarlane，加拿大安大略湖)。一级抗体被生物素化的抗鼠或抗绵羊IgG(Vector Laboratories，加拿大伯林盖姆)跟踪。免疫反应性通过亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(Vectastain Elite试剂盒，VectorLaboratories)被进一步扩增。用二氨基联苯胺作为商业化金属加强体系的色原体(PierceChemical，Rockford，以色列)。将该部分用苏木精复染。一级抗体的省略用作阴性对照。
可溶性CD36酶联免疫测定(ELISA)
ELISA板在4℃用捕获抗体羊(sc5522)-CD36(0.1μg/ml)包被过夜，接着用磷酸缓冲盐水(PBS)和0.1％吐温在4℃封闭2天。将该板储存在-20℃直至使用。检测抗体sc9154是其他地方所述的生物素化的(Glintborg D等人，2007年11月3日出版前网络公开)。所有抗体均来自圣克鲁斯生物技术公司(加拿大圣克鲁斯)。按照常规血液采样，将取自100位受试者的EDTA-血浆作为标准血浆，并以增加的稀释度重复两份使用。其他EDTA-血浆作为高和低对照品，PBS用作背景对照。患者的样本以适宜的稀释度重复两份使用。在室温培养1小时后，冲洗该孔，应用生物素化的抗CD36(sc9154)并培养30分钟。冲洗后，加入TMB微孔过氧化酶底物(Kementec，Copenhagen，denmark)。通过磷酸终止该反应，并在Multiscan上，于450nm和620nm处测定消灭情况(Thermo，Langenselbold，德国)。相对标准EDTA-血浆池计算吸收值并表示为相对单位。对照品可以与真值偏差1SD。批间测定和长期批间测定的变异系数分别为6％和16％。
其他
在模块化平台上，通过高灵敏颗粒增强免疫比浊法测定C-反应蛋白(CRP)水平(Roche Diagnostic，瑞士巴塞尔)。通过前面所述的常规的实验室方法测定脂质参数和HbA1c的浓度。通过分别从IBL Hamburg(Hamburg，德国)和Diagnostica Stago(Asnieres，法国)获得的ELISA测定新喋呤以及β血小板球蛋白(β-TG)的血浆水平。
统计分析
采用Mann-WhitneyU检验比较2组个体。当比较3组个体时，采用非参数的克鲁斯凯-沃利斯检验方法。如果发现显著差异，采用Mann-Whitney U检验计算组中各对之间的差异。通过斯皮尔曼等级检验计算相关系数(r)。当比较比例时，采用Fisher的确切检验。分别采用针对连续和绝对因变量的线性和二元回归分析计算变量之间的关系。P值(两侧)＜0.05视为显著。
实施例3、血浆CD36和斑块稳定性
与CRP和新蝶呤相反，在过去两个月内有与颈动脉狭窄相关症状的患者与其他患者相比，sCD36的血浆水平明显较高，(2.17[0.58-4.74]VS1.27[0-6.03]，p＝0.019，数据是根据均数与范围按相对单位给出)。而且，当根据它们的最近的临床症状，将患者分为三组时(即，最近2个月内有症状[n＝16]；最近3-6个月内有症状[n＝15]；或无症状斑块，即无症状或者症状在超过6个月前[n＝31])，与其他两组相比，前面那组具有明显升高的血浆sCD36水平(图2)。将患者组作为一个整体，血浆sCD36水平明显与总白细胞数(r＝0.43，p＜0.02)和纤维蛋白原(r＝0.40，p＜0.02)相关。然而，在校正这些参数后，sCD36仍然是最近两个月内(p＝0.049，Cl：1.0-2.7)来自斑块的临床症状的重要预报者。我们已经报导过2型糖尿病和肥胖个体中血浆sCD36水平的升高，但在本研究中，我们发现sCD36与各BMI、糖尿病的发生或者血糖生成控制(即HbA1c)之间没有联系(数据未显示)。
我们之前已经证实CD36在血浆中以可溶性形式存在，其在2型糖尿病患者和多囊性卵巢症候群患者中水平升高，与动脉硬化症的危险因子有关，如胰岛素耐受性和血糖生成控制(Handberg A等人，Circulation.2006；114：1169-1176；Glintborg D等人，Diabetes Care.2007年11月13日出版前网络公开)。在本研究中，通过显示血浆sCD36水平与动脉粥样硬化性病变的本质之间的更直接的关系，我们扩大了这些发现，与BMI和糖尿病的发生无关。因此，尽管前2个月内颈动脉有症状性疾病的那些患者与其他颈动脉粥样硬化症患者之间，在心血管疾病的传统的危险标志或系统炎症和血小板激活的成立标志中并没有区别，然而血浆sCD36的水平在前面那组患者中明显升高。不被理论约束，这些患者中一种可能的sCD36的细胞来源，基于我们之前观察到的在症状性颈动脉斑块中升高的CD36mRNA水平，结合我们目前的数据，该数据显示出与无症状斑块相比，症状性斑块内巨噬细胞中CD36的强免疫染色，可能表明血浆sCD36水平升高能反映出从症状性和不稳定的病变中的释放增加。
实施例4、血浆CD36和斑块形态学
超声斑块外观或者回音强度原则上可分为：低水平回声斑块、腔表面上带有薄的通常不完整的壳(无回声斑块)、以及中等或者高水平回声的斑块，这种斑块通常反应致密的纤维组织和钙化物的较高含量(强回声/异质性斑块)。关于斑块形态的数据获取自59例患者，并在图4中可见。与强回声/异质性斑块(n＝39，p＝0.09)的那些患者相比，无回声斑块的患者(n＝20)往往具有更高的sCD36水平。
实施例5、颈动脉病变中CD36的表达
在症状性颈动脉病变患者中，血浆sCD36水平的细胞来源尚不清楚，但最近已确认CD36为在症状性颈动脉斑块中被明显上调的87个基因之一，，表明在这些患者中斑块本身有助于升高血浆sCD36。为进一步说明这些观点，对2例有症状性疾病的患者(＜2个月)和2例无症状患者的颈动脉斑块进行免疫组织化学分析(图6)。染色这些动脉粥样硬化病变的连续切片显示出症状性患者斑块中的抗CD36免疫染色，该免疫染色位于斑块的富含脂质的核心(图6A)，对钙防卫蛋白-阳性的巨噬细胞具有强免疫染色(图6B)。在核心区域以及带有非常弱或无抗CD36免疫染色的区域可见不同强度的CD36免疫反应，比如在该核心的无细胞中心，但其他区域显示更强的免疫染色。如图6所示，邻近介质的斑块区域显示最强的CD36免疫反应。然而，在核心外未见抗-CD36免疫染色。来自无症状疾病的患者的病灶中，富含脂质的钙防卫蛋白阳性区域也可见CD36免疫染色，但在这些患者中，动脉粥样硬化斑块较少发展，并且与有症状性疾病患者中的病灶相比，CD36阳性免疫染色区域较小。
CD36被认为通过其结合并内化动脉壁中捕获的改性LDL，促进充满脂质的巨噬泡沫细胞的形成，而在颈动脉硬化病变的起始和发展发挥关键作用(Collot-Teixeira S等人，Cardiovasc Res.2007；75：468-477；Tuomisto TT等人，Atherosclerosis.2005；180：283-291)。事实上，先前的研究已经报导了加速的CD36表达与动脉硬化症6的进展并行，尤其是位于泡沫的大型巨噬细胞(Nakata A et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol.1999；19：1333-1339)。在本研究中我们发现，与无症状斑块相比，症状性斑块中CD36的强免疫染色主要位于动脉粥样硬化斑块的脂肪核心中负载脂肪的巨噬细胞，进一步支持了增强的CD36与晚期动脉硬化症之间的关系。此外，在过去两个月内，与其他患者相比，在那些具有与他们的颈动脉狭窄相关的症状的患者中，血浆sCD36的水平显著提高。这种CD36以其可溶性形式释放的机制尚不清楚，但是已经表明血浆sCD36水平能作为CD36表达改变的那些情况的生物标记，如改性的脂蛋白和低级炎症的水平升高(Tuomisto TT等人，Atherosclerosis.2005；180：283-291)。
此外，泡沫细胞凋亡与斑块去稳定性和血栓形成，以及随后发展的急性缺血事件有关(Littlewood TD和Bennett.Curr OpinLipidol.2003；14：469-475)，可以推测，负载脂质的巨噬细胞的凋亡可导致CD36释放的增强。因此，可积极设想，近期有症状性颈动脉斑块的患者中，升高的血浆sCD36水平与急性症状具有时间依赖性关系，至少部分地反应了斑块去稳定期间sCD36释放的增强。
CD36不仅在单核细胞上和巨噬细胞上表达，而且在内皮细胞(Adachi H和Tsujimoto M.Prog Lipid Res.2006；45：379-404)以及血小板(Ikeda H.Hokkaido Igaku Zasshi.1999；74：99-104)上表达。近期，Podrez及其同事建议，与血小板相关的CD36可作为氧化应激的传感器和血小板激活的调节剂，促进高脂血条件下的血栓症(Podrez EA等人，Nat Med.2007；13：1086-1095)，例如在血小板和不稳定的动脉粥样硬化性病变之间的相互作用期间。与sCD36相反，我们发现血浆CRP、新蝶呤和β-TG水平没有关系，它们分别是系统炎症、单核细胞/巨噬细胞以及血小板激活的可靠标记。可能的是，sCD36反映斑块不稳定性和症状性疾病的能力可表现出它反映斑块去稳定化中涉及的几种病源性过程的能力，例如血小板和单核细胞/巨噬细胞的激活，以及病变中的病源性事件，如泡沫细胞凋亡、血小板和动脉粥样硬化斑块之间的相互作用。我们认为血浆中的sCD36是斑块不稳定性和症状性颈动脉粥样硬化的标志，可能至少部分地是由于CD36从覆盖脂肪核心的泡沫细胞渗透层释放到循环中，而这种释放在斑块破裂期间被加强。本研究的结果提出用sCD36预测即将到来的心血管事件。
参考文献
将本文的所有文献和专利参考文献通过引用纳入本文，包括以下选择的有关CD36的参考文献：
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Claims (13)

1.一种能够识别CD36多肽或其部分的物质在制备用于测定个体中动脉粥样硬化斑块稳定性的药物中的用途，通过
i)测定所述个体的体液样本中的CD36多肽或其部分的浓度，
ii)将i)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及
iii)基于ii)的所述联系，测定所述动脉粥样硬化斑块的稳定性。
2.一种能够识别CD36多肽或其部分的物质在制备用于测定个体中由不稳定的动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的药物中的用途，通过
i)测定所述个体的体液样本中的CD36多肽或其部分的浓度，
ii)将i)中测定的所述浓度与标准水平相联系，以及
iii)基于ii)的所述联系，诊断所述个体中由不稳定的动脉粥样硬化斑块引起的狭窄的程度。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述样本是无细胞样本。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述样本是血浆样本。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中CD36浓度在标准水平上增加至少1.15是动脉粥样硬化斑块不稳定的标志。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述CD36多肽或其部分的所述浓度是在以下中确定：
i)SEQ ID NO：4的氨基酸序列，
ii)与(i)的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述能够识别CD36或其部分的物质是抗-CD36抗体。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述CD36多肽浓度通过以下步骤确定：
i)提供抗-CD36抗体，
ii)将样本暴露于抗-CD36抗体，
iii)可选地，将所述CD36-抗体复合物暴露于至少一种抗所述CD36-抗体复合物的另外的抗体，和
iv)检测并定量所述抗体的量。 
9.根据权利要求7所述的用途，其中所述CD36多肽通过以下步骤确定：
i)提供抗-CD36抗体，
ii)将样本暴露于与固相结合的抗-CD36抗体，
iii)可选地，将该CD36-抗体复合物暴露于第二抗-CD36抗体，和
iv)检测并定量与CD36相结合的抗体的量。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其中所述多肽是通过固相ELISA酶免疫测定法测定，其中在步骤ii)中所述样本接触所述与固相结合的抗体。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述固相是微孔板。
12.根据权利要求7所述的用途，其中所述抗-CD36抗体选自单克隆和多克隆CD36特异性抗体。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述抗-CD36抗体为选自sc5522、sc9154和sc7309的抗体。 
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