KR101871847B1 - Igbp1을 포함하는 루프스 신염 진단용 바이오 마커 조성물 - Google Patents

Igbp1을 포함하는 루프스 신염 진단용 바이오 마커 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IGBP1을 포함하는 루프스 신염 진단용 바이오 마커, 루프스 신염 진단용 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 IGBP1을 포함하는 루프스 신염 진단용 바이오 마커를 이용 시, 혈액 또는 소변을 이용하여 루프스 신염의 서브형 I 내지 Ⅵ형을 진단할 수 있다. 또한, 루푸스 신염 환자의 활성도 및 만성도를 확인하여 약물 치료 반응을 예측할 수 있음을 확인하였다. 또한, 루프스 신염 환자의 치료 후 재악화 시, 본 발명의 마커를 이용하여 활성도 및 만성도를 확인함으로써 생검 조직 검사의 재시행을 감소시킬 수 있다. 또한, 생검 조직 검사를 수행할 수 없는 경우 본 발명의 마커를 이용하여 예후가 나쁜 루프스 신염 Ⅲ형 및 Ⅳ형의 가능성을 예측할 수 있다. 또한, 루프스 신염 환자의 신장 손상 정도를 예측할 수 있어, 면역 억제제 및 치료제의 적시 사용 정보를 제공할 수 있다. 또한, IGBP1의 루푸스 신염 발생 및 악화에 미치는 영향을 확인함으로써 IGBP1 억제제는 루프스 신염에 의한 신장 조직 손상을 억제할 수 있어 신규한 루프스 신염 치료제로서 활용될 수 있다.

Description

IGBP1을 포함하는 루프스 신염 진단용 바이오 마커 조성물{A biomarker composition for diagnosis of lupus nephritis comprising Immunoglobulin binding protein 1}
본 발명은 IGBP1을 포함하는 루프스 신염 진단용 바이오 마커 조성물, 루프스 신염 진단용 조성물 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
전신 홍반 루프스(systemic lupus erythematous; SLE)는 주로 가임기 여성을 포함한 젊은 나이에 발병하는 만성 자가 면역 질환으로서, 피부 증상이 가장 일반적이나, 이 외에도 관절, 폐, 심장 및 심낭, 신장, 골수, 혈관, 뇌 등 여러 장기를 침범하여 다양한 증상이 나타나는 질환이다.
상기 전신 홍반 루푸스 중 신장 손상을 보이는 질환인 루푸스 신염(lupus nephritis)은 사구체(토리)에 면역복합체(IC)가 침착하여 손상을 일으키는 질환으로, 증상 및 검사 소견으로는 소변소견에서 단백뇨, 현미경적 혈뇨(때로는 육안적 혈뇨)가 나타나며, 소변침전물에서 적혈구, 백혈구, 다양한 세포성 원주 등의 소견이 나타난다. 상기 루프스 신염은 성인 전신 홍반 루푸스 환자의 30-60%를 차지하고, 어린이의 경우 70%까지 발생하며, 전신 홍반 루프스 중 가장 치명적인 사망 원인이 되는 질환이며, 환자의 예후와 관련이 있다. 상기 루프스 신염은 전신 홍반 루푸스 진단 초기 2년 이내에 많이 발생하며, 환자의 25-75%에서 발견되고, 10년 생존율 또한, 루프스 신염을 동반하는 경우 급격히 낮아진다. 상기 루프스 신염의 종류로는 사구체 신염이 가장 많으나, 괴사형혈관염 및 급성간질성 신염이 발생하기도 한다.
상기 루프스 신염을 병리조직학적으로 사구체의 손상 정도에 따라 조직형(클래스) 및 활동성을 판단하여 서브형 I 내지 Ⅵ형으로 나눌 수 있으며, 이에 따라 치료 방침을 결정한다. I형은 미세 혈관 사이질 증식 루푸스 신염이라 하고, 광학현미경 상에서 사구체는 정상이나, 형광항체법을 수행 시 사구체 간질(mesangium) 영역에서 침착물이 발견된다. Ⅱ형은 혈관 사이질 증식 루푸스 신염이라 하며, 광학현미경 상에서는 혈관 사이 세포의 증식 또는 혈관 사이 바탕질의 증식이 관찰되며, 사구체 간질 영역에서 침착물을 확인할 수 있다. 형광항체법 또는 전자현미경 상에서 바닥막의 상피 아래 또는 내피 아래에 약간의 침착물이 보이는 경우가 있다. Ⅲ형은 국소 분절성 루푸스 신염이라 하며, 광학현미경 상에서 활동성 또는 비활동성, 분절성 또는 전절성, 관내 또는 관외의 사구체 병변이 보이며, 전형적인 예로는 내피 아래에서 침착물을 관찰할 수 있다. 사구체 간질 변화를 동반하는 경우가 있으며, 신장 생검으로 얻은 표본의 50% 미만에서 상기의 병변이 보이는 특징이 있다. Ⅳ형은 미만형 증식성 루푸스 신염이라 하며, 상기 과 같은 사구체 병변을 볼 수 있다. 미만성(漫性)인 철사 고리 모양의 침착물이 있지만, 증식성 변화가 경도 혹은 존재하지 않는 예도 상기 Ⅳ형에 포함된다. 병변이 있는 토리의 50% 이상이 분절성 병변이면 Ⅳ-S형, 전절성 병변이면 Ⅳ-G형으로 정의하며, 신장 생검으로 얻은 표본의 50% 이상에서 상기의 병변을 확인할 수 있다. Ⅴ형은 막성 루푸스 신염이라 하며, 광학현미경, 형광항체법 또는 전자현미경 상에서, 분절성 또는 전절성의 상피 아래에서 침착물을 관찰할 수 있다. 사구체 간질 변화를 동반하는 경우가 있으며, Ⅲ 및 IV형이 함께 공존하는 경우가 있다. Ⅵ형은 진행성 경화성 루푸스 신염이라 하며, 활동성 병변은 볼 수 없고, 신장 생검으로 얻은 표본의 90% 이상이 비가역적 전절성 경화를 나타낸다.
루프스 신염의 검사 방법으로는 신장 생검(Kidney biopsy)을 주로 이용하며, 이는 신장의 침범 정도를 평가하는데 가장 중요한 검사로서, 신장 초음파를 통하여 신장의 위치를 확인하면서 조직 검사용 굵은 바늘로 신장 조직의 일부를 떼어 내어 일반 광학 현미경 검사, 면역 형광 현미경 검사, 전자 현미경 검사 등을 시행하는 것이다. 그러나, 루푸스 신염 진단 이후, 원인을 알 수 없는 단백뇨 증가 (2g/일), 지속적인 단백뇨 이상(3g/일 이상), 신기능감소(혈청크레아티닌 30% 이상 증가) 증상이 나타나면 반복적 신장 조직 생검을 수행해야 하나, 조직 검사 부위의 심한 출혈, 염증 발생 및 감염 가능성으로 반복적인 검사를 통한 질환의 경과 추적에는 제한점이 있어, 이를 대체할 수 있는 새로운 진단 방법 또는 바이오 마커가 필요한 실정이다.
또한, 루프스 신염 치료 약물은 손상된 조직이나 장기의 정도에 따라 처방 되며 흔히 사용되는 약물은 비스테로이드 항염제(NSAID), 저용량 글루코코르티코이드(부신피질호르몬), 항말라리아제 등 이고, 중증(생명 위협 수준)일 경우 고용량 스테로이드 및 면역억제제 등을 사용한다. 그러나, 상기 글루코코르티코이드 및 스테로이드 제제는 장기간 사용 시 근병증, 골다공증, 고혈압, 당뇨, 동맥경화성 혈관 질환 및 감염 위험의 증가 등과 같은 부작용이 발생한다. 또한, 항 말라리아 제제는 망막 손상 부작용이 발생될 수 있다. 또한, 루푸스 병인 기전과 주요 관련이 있는 B세포와 관련된 단일 클론 항체 치료제가 개발되고 있으나, 임상 연구에서는 그 효과가 미미하여 부작용이 적고 효과가 뛰어난 새로운 치료제 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 루프스 신염을 정확하고 특이적으로 진단하는 바이오 마커를 연구한 결과, IGBP1(Immunoglobulin binding protein 1, NM_001551.2)을 포함하는 루프스 신염 진단용 바이오 마커를 발굴하였다. 상기 IGBP1 바이오 마커는 혈액 또는 소변을 이용하여 루프스 신염의 서브형 I 내지 Ⅵ형을 진단할 수 있다. 또한, 루푸스 신염 환자의 활성도 및 만성도를 확인하여 약물 치료 반응을 예측할 수 있음을 확인하였다. 또한, 루프스 신염 환자의 치료 후 재악화 시, 본 발명의 마커를 이용하여 활성도 및 만성도를 확인함으로써 생검 조직 검사의 재시행을 감소시킬 수 있다. 또한, 생검 조직 검사를 수행할 수 없는 경우 본 발명의 마커를 이용하여 예후가 나쁜 루프스 신염 Ⅲ형 및 Ⅳ형의 가능성을 예측할 수 있다. 이를 통하여, 본 발명의 마커는 루프스 신염 환자의 신장 손상 정도를 예측할 수 있어, 면역 억제제 및 치료제의 적시 사용 정보를 제공할 수 있다. 또한, IGBP1의 루푸스 신염 발생 및 악화에 미치는 영향을 확인함으로써 IGBP1 억제제는 루프스 신염에 의한 신장 조직 손상을 억제할 수 있고, 치료제로서 사용 가능성을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 IGBP1(Immunoglobulin binding protein 1, NM_001551.2)을 포함하는 루프스 신염 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 IGBP1을 포함하는 루프스 신염의 만성도(chronicity index) 평가용 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 IGBP1을 포함하는 루프스 신염의 활성도(activity index) 평가용 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염의 만성도 평가용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염의 활성도 평가용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 루프스 신염 진단용 키트을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 생물학적 시료에서 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 루프스 신염의 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 루프스 신염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 루프스 신염 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 IGBP1(Immunoglobulin binding protein 1, NM_001551.2)을 포함하는 루프스 신염 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 IGBP1을 포함하는 루프스 신염의 만성도(chronicity index) 평가용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 IGBP1을 포함하는 루프스 신염의 활성도(activity index) 평가용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염의 만성도 평가용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염의 활성도 평가용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 루프스 신염 진단용 키트을 제공한다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료에서 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 루프스 신염의 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 루프스 신염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료에 후보물질을 처리하고 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제시키는 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 루프스 신염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 IGBP1을 포함하는 루프스 신염 진단용 바이오 마커를 이용 시, 혈액 또는 소변을 이용하여 루프스 신염의 서브형 I 내지 Ⅵ형을 진단할 수 있다. 또한, 루푸스 신염 환자의 활성도 및 만성도를 확인하여 약물 치료 반응을 예측할 수 있음을 확인하였다. 또한, 루프스 신염 환자의 치료 후 재악화 시, 본 발명의 마커를 이용하여 활성도 및 만성도를 확인함으로써 생검 조직 검사의 재시행을 감소시킬 수 있다. 또한, 생검 조직 검사를 수행할 수 없는 경우 본 발명의 마커를 이용하여 예후가 나쁜 루프스 신염 Ⅲ형 및 Ⅳ형의 가능성을 예측할 수 있다. 또한, 루프스 신염 환자의 신장 손상 정도를 예측할 수 있어, 면역 억제제 및 치료제의 적시 사용 정보를 제공할 수 있다. 또한, IGBP1의 루푸스 신염 발생 및 악화에 미치는 영향을 확인함으로써 IGBP1 억제제는 루프스 신염에 의한 신장 조직 손상을 억제할 수 있어 신규한 루프스 신염 치료제로서 활용될 수 있다.
도 1은 정상 대조군(HC); 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반한 환자군(SLE with Nephritis); 및 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반하지 않은 환자군(SLE without Nephritis)의 혈중 IGBP1 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 루프스 신염 질병 활성도를 평가하는 지표인 SLEDAI와 혈중 IGBP1농도간의 상관성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 신장 생존률 감소 측정의 주요 지표인 만성도와 혈중 IGBP1 농도간의 상관성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 혈중 IGBP1 농도 측정을 통하여 루프스 신염의 각 서브형 Ⅱ형 내지 Ⅴ형을 진단한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 정상 대조군(HC); 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반한 환자군(SLE with Nephritis); 및 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반하지 않은 환자군(SLE without Nephritis)의 소변 중 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 루프스 신염 질병 활성도를 평가하는 지표인 SLEDAI와 소변 중 IGBP1농도간의 상관성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 신장 생존률 감소 측정의 주요 지표인 조직 활성도와 소변 중 IGBP1 농도간의 상관성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 루프스 신염의 활성도 임상 지표로 이용되는 C3 와 소변 중 IGBP1 농도간의 상관성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 루프스 신염의 활성도 임상 지표로 이용되는 dsDNA와 소변 중 IGBP1 농도간의 상관성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 루프스 신염 환자의 소변 중에 유출된 단백질양과 IGBP1양과의 상관 관계를 나타낸 도이다.
도 11은 루프스 신염 서브형 Ⅱ형 내지 Ⅴ형의 각 신장 생검에서 IGBP1 단백질 발현을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 12은 나타낸 바와 같이, HK-2 세포에서 IGBP1 siRNA에 의한 IGBP1 발현 감소에 의하여, 88개의 유전자의 발현이 상향-조절(up-regulation)된 결과를 마이크로어레이를 수행하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 HK-2 세포에서 IGBP1 siRNA에 의한 IGBP1의 발현 감소에 의하여, 104개의 유전자의 발현이 하향-조절(down-regulation)된 결과를 마이크로어레이를 수행하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 IGBP1(Immunoglobulin binding protein 1, NM_001551.2)을 포함하는 루프스 신염 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "IGBP1(Immunoglobulin binding protein 1, NM_001551.2)"는 B 세포수용 복합체에 결합되어 있는 52-kDa 크기의 인단백질(phosphoprotein)로서 B세포 증식 및 분화에 관여하는 단백질을 의미한다. 또한, IGBP1은 촉매소단위(catalytic subunit)에 결합되어 전신 홍반 루프스 환자의 말초혈액단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)에서 발현이 증가되는PP2A(Protein Phosphatase 2A)의 활성을 조절한다. 또한, 상기 IGBP1은 NCBI accession number는 NM_001551.2를 포함한다.
본 발명에 있어서, "루프스 신염"은 상기 전신 홍반 루푸스 중 신장 손상을 보이는 질환을 의미하며, 사구체(토리)에 면역복합체(IC)가 침착하여 손상을 일으킨다. 루프스 신염은 병리조직학적으로, 사구체의 손상 정도에 따라 서브형 I 내지 Ⅵ형으로 나눌 수 있다.
본 발명에 있어서, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 상기 진단은 발병 여부뿐만 아니라 예후, 루프스 신염의 경과, 병기 등을 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 목적상, 진단은 루프스 신염의 발병, 예후, 경과, 병기 상태 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, "바이오 마커"는 진단용 마커 또는 진단 마커로도 쓰일 수 있으며, 생물학적 시료에서 루프스 신염 감염 여부를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 시료에 비하여 루프스 신염에 감염된 환자에서 채취한 시료에서 IGBP1의 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 발명의 목적상, 본 발명의 루프스 신염 진단용 바이오 마커는 정상 대조군에 비하여, 루프스 신염 환자의 혈액 또는 소변 중 IGBP1가 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 IGBP 및 이를 코딩하는 유전자를 의미한다.
상기 루프스 신염은 서브형 I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ 및 Ⅵ형으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 바람직하게는 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ형이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 루프스 신염은 환자의 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액 및 신장 조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 시료이고, 바람직하게는 혈액 또는 소변이나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 IGBP1을 포함하는 루프스 신염의 만성도(chronicity index) 평가용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 IGBP1을 포함하는 루프스 신염의 활성도(activity index) 평가용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "만성도(chronicity index)"는 루프스 신염의 예후에 있어서 가장 중요한 것은 신 기능의 저하인데, 만성도가 신장 생존률 감소 측정의 가장 중요한 지표를 나타낸다.
본 발명의 목적상, 상기 만성도 평가를 위하여 사구체 경화증(glomerulosclerosis), 섬유성 반월형(fibrous crescent), 간질성 섬유증(interstitial fibsosis) 및 관 위축(tubule atrophy) 정도에 따라 각각 0~3점을 주어 총 12점 중 4점 이상이면 치료 반응이 나쁠 것으로 예측할 수 있다. 또한 만성도 점수가 높을수록 면역억제제 치료에 반응이 없을 것으로 예측할 수 있다. 또한 만성도 점수가 높을수록 면역억제제 치료 반응이 낮을 것으로 예측되어, 환자에게 발생 가능한 부작용을 고려하려 호전적인 면역억제제(aggressive immunosuppressant)의 사용을 추천하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 IGBP1은 루프스 신염의 만성도와 양의 상관성이 있고, 이에 대한 지표로 이용 가능한 바, 루프스 신염 치료 반응에 대한 치료 반응 예측 및 면역억제제 치료 사용 정도에 대한 예측이 가능하다.
본 발명에 있어서, "활성도(activity index)"는 루프스 신염의 활성 정도를 나타내는 지표이다.
본 발명의 목적 상, 루프스 신염에 대한 활성도는 조직 검사 상 사구체의 모세혈관 증식(endocapillary proliferation), 백혈구 침윤(leukocytes infiltration), 와이어 루프(wire loop), 세포성 반월형(cellular crescents), 섬유소성 괴사(fibrinoid necrosis) 및 세관/간질(tubule/interstitium)의 단핵 세포 침입(mononuclear cell infiltration) 소견에 따라 점수를 부여하여 높을수록 활성도가 높은 것으로 평가할 수 있다. 또한 혈액검사 상 항-dsDNA Abs, 보체 3,4 수준 및 SLEDAI(SLE disease activity index)가 질병 활성도를 반영하기도 하며, 높은 활성도가 지속적으로 높게 관찰되면, 현재 환자에게 투여되는 면역억제제 치료가 불충분한 것으로 판단되어, 약제의 변경 혹은 용량, 증량 등을 고려할 수 있다. 따라서, 본 발명의 IGBP1은 루프스 신염의 활성도와 양의 상관성이 있고, 이에 대한 지표로 이용 가능한 바, 루프스 신염 환자에 대한 면역 억제제 치료가 충분한지 여부 및 약제의 변경, 사용 약제의 용량 또는 증량 등을 고려할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 혈액 또는 소변을 시료로 하여 IGBP1를 바이오 마커로 이용 시, 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염 질환에 걸린 환자만을 정확하게 진단할 수 있고, 루푸스 신염의 질병 활성도 및 신장 생존률 감소 측정의 지표로서 사용 가능함을 확인하였다. 또한, 루프스 신염의 각 서브형 Ⅱ 내지 Ⅴ형을 정확하게 진단할 수 있다. 특히, 위험한 증식성 형태의 사구체 손상이 있는 환자에서 나타나는 루프스 신염 환자의 서브형 Ⅲ 형 및 Ⅳ형을 유의적으로 진단 할 수 있다. 또한, IGBP1는 루프스 신염 환자의 예후 예측에 대한 정보 또는 신장 손상 정도를 측정하는 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염의 만성도 평가용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염의 활성도 평가용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제"란 상기와 같이 루프스 신염 환자의 생물학적 시료에서 발현이 증가하는 마커인 IGBP1의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하여, 이의 발현 또는 활성 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.
상기 IGBP1의 발현 또는 활성을 측정하는 제제는 상기 IGBP1에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다.
본 발명에 있어서 "IGBP1 발현 또는 활성을 측정"이란 루프스 신염을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 루프스 신염 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 분자를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것이다.
이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 IGBP1에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질 에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명의 루프스 진단용 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
상기 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제는 상기 IGBP1 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에 있어서, "mRNA 발현수준 측정"이란 루프스 신염을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 루프스 신염 진단용 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, IGBP1 유전자의 핵산 서열은 공지된 바 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 IGBP1 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 루프스 신염을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 MED30 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 루프스 신염을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 루프스 신염 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트에는 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제뿐만 아니라, 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 바이오 마커 조성물 및 진단용 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 루프스 신염의 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 진단에 대한 정보는 루프스 신염의 서브형 I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ 및 Ⅵ형으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 정보이고, 바람직하게는 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 진단에 대한 정보는 루프스 신염 환자의 예후 예측에 대한 정보이고,본 발명의 목적상, 상기 루프스 신염 환자의 예후 예측 측정은 루프스 신염의 서브형 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ형을 진단하여 환자의 예후를 측정하는 것이다. 높은 혈중 또는 소변에서 IGBP1의 높은 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 높은 발현 또는 활성;은 위험한 증식성 형태의 사구체 손상이 있는 환자에서 나타나는 루프스 신염 환자의 서브형 Ⅲ형 및 Ⅳ형을 진단할 수 있다. 상기 서브형 Ⅲ형 및 Ⅳ형은 나쁜 예후를 대변하는 것으로, 이를 통해 환자의 예후에 대한 정보를 제공한다.
상기 진단에 대한 정보는 루프스 신염 환자의 신장 손상 정도에 대한 측정 정보이고, 본 발명의 목적상, 상기 루프스 신염 환자의 신장 손상 정도 측정은 루프스 신염의 서브형 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ형을 진단하여 환자의 예후를 측정하는 것이다. 높은 혈중 또는 소변에서 IGBP1의 높은 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 높은 발현 또는 활성;은 위험한 증식성 형태의 사구체 손상이 있는 환자에서 나타나는 루프스 신염 환자의 서브형 Ⅲ형 및 Ⅳ형을 진단할 수 있다. 상기 서브형 Ⅲ형 및 Ⅳ형은 나쁜 예후를 대변하는 것으로, 이를 통해 루프스 신염 환자의 신장 손상 정도 측정에 대한 정보를 제공할 수 있다. 또한, 상기 루프스 신염 환자의 신장 손상 정도 측정에 대한 정보는 본 발명의 IGBP1은 루프스 신염의 질병 활성도, 만성도 및 활성도와 양의 상관성이 있어, 이에 대한 지표로 이용 가능하므로, 이를 통해 루프스 신염 환자의 신장 손상 정도 측정에 대한 정보를 제공할 수 있다.
또한, 상기 루프스 신염의 만성도 및 활성도는 상술한 루프스 신염 진단용 조성물의 만성도 및 활성도 평가용 기재를 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 루프스 신염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "예방" 은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (1) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (2) 질환 또는 질병의 경감; 및 (3) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.
상기 IGBP1의 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 상기 IGBP1에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 천연추출물 또는 화합물이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 상기IGBP1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프로브, 천연추출물 또는 화합물이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "siRNA"는 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 것을 말한다. 본 발명의 목적 mRNA에 특이적으로 결합하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 목적 상, 상기 siRNA는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 것으로, 서열번호 1 및 2로 표시된다.
본 발명에 있어서, "shRNA"는 45 내지 70 뉴클레오티드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서 타겟유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10 개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노바이러스 (adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 루프(loop)가 있는 헤어핀(hairpin) 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타내는 것을 의미한다. shRNA (small hairpin RNA)를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터는 당분야에서 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, "miRNA(microRNA)"는 mRNA의 3' 비번역 영역(UTR) 부위와의 염기결합을 통해 전사후 억제자 역할을 하는 대략 22 nt의 비번역 RNA를 의미한다. miRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, "안티센스 올리고뉴클레오티드"란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다.
안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나, 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 증진제 내 해당 유전자 또는 이의 단백질의 발현 억제제의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는, 루프스 신염의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
또한, 본 발명은 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 루프스 신염 치료제를 제공한다.
본 발명에 있어서, 루프스 신염 치료제란 루프스 신염을 예방 또는 치료하기 위한 목적으로 하는 의약품을 말하며, 환자의 몸에 제제화한 물질을 직접 주입하여 치료하기 위한 치료제를 의미한다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료에 후보물질을 처리하고 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제시키는 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 루프스 신염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법은, 바람직하게는, (1) 실험군으로서 생물학적 시료에 스크리닝 하고자 하는 대상 물질인 후보물질을 처리하는 단계; (2) 상기 (1)의 실험군 생물학적 시료와 처리하지 않은 대조군 생물학적 시료에서 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하여 비교하는 단계; 및 (3) 상기 (2)의 대조군과 비교하여 실험군의 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제시키는 대상 물질인 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 루프스 신염 치료제의 스크리닝 방법이나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1. 실험 대상 선별
본 발명의 실험 대상으로 미국 류마티스학회에서 1982년 개정한 전신성 홍반성 루푸스의 진단기준을 만족한 한국인 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반한 환자 30명, 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반하지 않은 환자 40명을 선별하였다. 또한, 정상 대조군으로서, 루프스 신염 질환의 기왕력(anamnesis)이 없는 18명의 건강한 자원자를 선별하였다.
실시예 1. 루프스 신염 환자의 혈중 IGBP1 ( Immunoglobulin binding protein 1)의 농도 측정 및 질병 활성도와의 상관성 확인
루프스 신염 환자의 혈중 IGBP1의 농도를 측정하고, 루프스 신염 질병 활성도를 평가하기 위한 표준화된 지표인 SLEDAI와 혈중 IGBP1 농도간의 상관성을 평가하였다.
구체적으로, 루프스 신염 환자의 혈중 IGBP1(Immunoglobulin binding protein)의 농도를 측정하기 위하여, IGBP1 Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit (Uscn Life Science Inc.)을 이용하였다. 상기 실험예 1의 정상 대조군(건강한 성인); 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반한 환자군; 및 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반하지 않은 환자군의 혈중 IGBP1 농도를 측정하였다 (도 1). 혈중 IGBP1 측정을 위해, IGBP1 항체가 코팅되어 있는 웰에 plasma 100 uL를 넣은 후 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, Detection reagent A를 첨가하고 다시 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이 후, 웰을 세척한 후, Detection reagent B를 첨가하고 37℃에서 30분간 배양하고 세척 후, substrate 용액을 넣고 15-25분간 발색시킨 후 stop 용액을 추가하였다. 혈중 IGBP1 농도의 측정을 위해 흡광도는 450nm에서 측정하였다.
또한, 루프스 신염의 질병 활성도를 평가하기 위한 표준화된 지표들 중 SLEDAI(Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index)가 가장 대표적으로 사용되는 지표인 바, 이에 대한 IGBP1의 양 또는 음의 상관성을 확인하였다(도 2). 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 혈중 IGBP1는 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반한 환자군이 정상 대조군에 비하여 유의적으로 증가되었음을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 혈중 IGBP1 농도는 질병 활성도 지표인 SLEDAI와 유의한 양의 상관성을 보임을 확인하였다(r=0.3063).
따라서, IGBP1는 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염 질환에 걸린 환자만을 정확하게 진단할 수 있고, 루푸스 신염의 질병 활성도의 지표로서 사용 가능함을 확인하였다.
실시예 2. 혈중 IGBP1과 루프스 신염 만성도간의 상관성 측정 및 루프스 신염 서브형 진단 가능성 확인
신장 생존률 감소 측정의 주요 지표인 만성도와 혈중 IGBP1 농도와의 상관성을 측정하였다. 또한, 상기 혈중 IGBP1 농도 측정을 통해 루프스 신염의 각 서브형 Ⅱ형 내지 Ⅴ형 진단 가능성을 확인하였다.
구체적으로, 혈중 IGBP1 농도와 만성도간의 상관성을 측정하기 위하여, 신장 생검 조직 만성도 지표는 사구체 경화증(glomerular sclerosis), 섬유성 반월형(fibrous crescents), 관 위축(tubular atrophy) 및 간질성 섬유증(interstitial fibrosis)에 따라 점수화화여 측정하였다(도 3).
또한, 혈중 IGBP1 농도 측정을 통하여 루프스 신염의 각 서브형 Ⅱ 내지 Ⅴ형을 진단 가능한지 여부를 측정하였다(도 4). 그 결과를 도 3 및 4에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 신장 생검 조직에서 혈중 IGBP1 농도는 루프스 신염 진단 시 수행하는 만성도와 유의한 양의 상관성을 보임을 확인하였다(r=0.6427).
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 서브형 Ⅱ형 내지 Ⅴ형에 따라 IGBP1 농도가 상이하게 나타나, 혈중 IGBP1 농도 측정을 통하여 루프스 신염의 각 서브형 Ⅱ형 내지 Ⅴ형을 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 신장 기능 소실 및 생존에 부정적인 예후를 보이는 루프스 신염 서브형 Ⅲ형 및 Ⅳ형에서 혈중 IGBP1 농도가 유의적으로 증가됨을 확인하였다.
따라서, 혈중 IGBP1는 루프스 신염 진단 시 수행되는 만성도와 상관성이 있어, 신장 생존률 감소 측정의 주요 지표로서 이용 가능함을 확인하였다. 또한, 루프스 신염의 각 서브형 Ⅱ형 내지 Ⅴ형을 정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 위험한 증식성 형태의 사구체 손상이 나타나는 루프스 신염 환자의 서브형 Ⅲ형 및 Ⅳ형을 유의적으로 진단할 수 있어, IGBP1는 루프스 신염에 대한 신장 조직의 손상도 및 신장 기능 저하 예후를 측정할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 루프스 신염 환자의 소변 중 IGBP1의 농도 측정 및 질병 활성도의 상관성 확인.
루프스 신염 환자의 소변 중 IGBP1의 농도를 측정하고, 루프스 신염 질병 활성도를 평가하기 위한 표준화된 지표인 SLEDAI와 소변 중 IGBP1 농도의 상관성을 평가하였다.
구체적으로, 루프스 신염 환자의 소변 중 IGBP1의 농도를 측정하기 위하여, 소변 중 크레아티닌(creatinine) 측정은 Creatinine(urinary) colorimetric assay kit (Cayman Chemical Company, USA)을 이용하였다. 상기 실험예 1의 정상 대조군(건강한 성인); 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반한 환자군; 및 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반하지 않은 환자군의 소변 중 IGBP1 농도를 측정하였다 (도 5). 소변 중 IGBP1 측정을 위해, IGBP1 항체가 코팅되어 있는 웰에 환자의 소변 100 uL를 넣은 후 37도에서 2시간 동안 배양하였다. Detection reagent A를 넣고 37도에서 2시간 동안 배양한 후, 웰을 세척하고, Detection reagent B를 넣고 37도에서 30분간 배양하고 세척하였다. 그 후, substrate 용액을 넣고 15-25분간 발색시킨 후 stop 용액을 넣고 분광광도계를 이용하여 흡광도를 450nm에서 측정하였다.
또한, 루프스 신염의 질병 활성도를 평가하기 위한 표준화된 지표들 중 SLEDAI가 가장 대표적으로 사용되는 지표인 바, 이에 대한 소변 중 IGBP1의 양 또는 음의 상관성을 확인하였으며(도 6), 상관관계 계수(Spearman correlation coefficients)를 이용한 통계분석을 하였으며 P values <0.05 를 유의한 수준으로 보았다. 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 소변 중 IGBP1는 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반한 환자군이 정상 대조군 및 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염을 동반하지 않은 환자군에 비하여 유의적으로 증가되었음을 확인하였다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 소변 중 IGBP1 농도는 질병 활성도 지표인 SLEDAI와 유의한 양의 상관성을 보임을 확인하여(r=0.4396), 세관(tubule)의 이상을 알 수 있는 지표로서 사용 가능함을 확인하였다
따라서, IGBP1는 전신 홍반 루프스 환자 중 루프스 신염 질환에 걸린 환자만을 정확하게 진단할 수 있고, 루푸스 신염의 질병 활성도의 지표로서 사용 가능함을 확인하였다.
실시예 4. 루프스 신염 활성도 및 만성도와 소변 중 IGBP1간의 상관성 측정
신장 생존률 감소 측정의 주요 지표인 활성도 및 만성도와 소변 중 IGBP1 농도간의 상관성을 측정하였다.
구체적으로, 소변 중 IGBP1 농도와 활성도 및 만성도간의 상관성을 측정하기 위하여, 신장 생검의 IGBP1 측정은 Creatinine(urinary) colorimetric assay kit (Cayman Chemical Company, USA)을 이용하여 측정하였다. 활성도 지표는 모세혈관 증식(endocapillary proliferation), 핵붕괴(karyorrhexis), 섬유양(fibrinoid), 세포성 반월형(cellular crescents), 유리질 침착(hyaline deposits), 백혈구 삼출(leukocyte exudation) 및 간질성 염증(interstitial inflammation)에 따라 점수화하여 측정하였다. 또한, 만성도 지표는 사구체 경화증(glomerular sclerosis), 섬유성 반월형(fibrous crescents), 관 위축(tubular atrophy) 및 간질성 섬유증(interstitial fibrosis)에 따라 점수화하여 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 신장 생검 조직에서 소변 중 IGBP1 농도는 루프스 신염 진단 시 수행하는 활성도 및 만성도와 유의한 양의 상관성을 보임을 확인하였다.
따라서, 소변 중 IGBP1는 루프스 신염 진단 시 수행되는 활성도 및 만성도와 상관성이 있어, 신장 생존률 감소 측정의 주요 지표로서 이용 가능함을 확인하였다. IGBP1은 루프스 신염 진단 뿐만 아니라, 루프스 신염 환자들의 신장 조직 손상 기전 중 IGBP1이 관여할 가능성이 높을 것임을 확인하였다. 또한, IGBP1는 신장 생검에 의한 진단 결과를 반영할 수 있는 지표인 바, 신장 생검을 대체하는 새로운 진단 수단으로 활용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 루프스 신염의 임상 지표(C3 및 dsDNA )와 소변 중 IGBP1간의 상관성 측정
루프스 신염의 임상 지표로 이용되는 dsDNA 및 질병활성이 심할수록 낮은 수치를 보이는 임상 지표인 C3와 소변 중 IGBP1 농도간의 상관성을 측정하였다.
구체적으로, 루프스 신염의 임상 지표로 이용되는 C3 및 dsDNA와 소변 중 IGBP1 농도간의 상관성을 측정하기 위하여, 실시예 3의 방법을 이용하였고, 상관관계 계수(Spearman correlation coefficients)를 이용한 통계분석을 하였으며 P values <0.05 를 유의한 수준으로 보았다. 그 결과를 도 8 및 9에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 소변 중 IGBP1 농도는 임상 지표인 C3와 음의 상관성을 보임을 확인하였다(r=0.4396).
또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 소변 중 IGBP1 농도는 임상 지표인 dsDNA와 유의적인 양의 상관성을 보임을 확인하였다(r=0.5475).
따라서, 소변 중 IGBP1는 루프스 신염의 임상 지표로 사용 가능함을 확인하였다.
실시예 6. 루프스 신염 환자의 소변 중에 유출된 단백질양과 IGBP1양과의 상관관계
루프스 신염 환자의 소변 중에 유출된 단백질양과 IGBP1양과의 상관관계를 확인하였다.
구체적으로, 루프스 신염 환자의 소변 중에 유출된 단백질양과 IGBP1양과의 상관관계는 실시예 3의 방법을 이용하였고, 상관관계 계수(Spearman correlation coefficients)를 이용한 통계분석을 하였으며 P values > 0.05으로 유의하지 않은 수준으로 보았다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 루푸스 신염 환자들에게서 증가되어 있는 소변 중의 IGBP1은 루푸스 신염 환자들의 소변 중 단백질 유출 증가에 의한 것이 아님을 확인하였고, IGBP1는 루프스 신염 질환 여부를 판단하는데 특이적인 바이오 마커로 활용가능한 단백질임을 검증하였다.
실시예 7. 루프스 신염 서브형 Ⅱ형 내지 Ⅴ형의 각 신장 생검에서 IGBP1 단백질 발현 측정
루프스 신염 환자의 신장 조직 손상의 특징은 사구체 이상 (glomerulosclerosis, fibrous crescents) 및 세뇨관간질 이상(interstitial fibrosis, tubular atrophy)이므로, 루프스 신염 서브형 Ⅱ형 내지 Ⅴ형의 각 신장 생검에서 IGBP1 단백질의 발현 및 신장 조직의 손상 부위를 확인하였다.
구체적으로, 각 루프스 신염 서브형 Ⅱ형 내지 Ⅴ형의 신장 생검에서 IGBP1 단백질 발현 측정은 면역조직학적 방법을 이용하여 측정하였다. 상기 각 루프스 신염 서브형 Ⅱ형 내지 Ⅴ형의 신장 생검 조직은 BenchMark ULTRA automatic immunostaining device(Ventana Medical Systems, Tucson, USA)를 이용하여 anti-IGBP1(Novus)로 면역 염색하였다. 상기 면역 염색된 각 신장 생검 조직은 Ventana OptiView DAB IHC Detection kit를 이용하여 발색을 확인하였다. 이 후, Ventana Hematoxylin Ⅱ를 이용하여 대비 염색제로 착색(counterstaining)하였다. 그 결과를 도 11에 확인하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, IGBP1는 루프스 신염 서브형 Ⅱ형 내지 Ⅴ형인 각 신장 생검에서 모두 발현함을 확인하였다. 또한, 루프스 신염 서브형 Ⅲ형 생검 조직에서 IGBP1이 주로 세뇨관 상피세포(Tubule epithelial cell), 특히 세포막에서의 발현이 현저함을 확인하였는 바, 이는 IGBP1가 루푸스 신염의 조직변화 중 하나인 관의 위축(tubular atropy) 및 세뇨 간질(tubulointerstitum) 염증에 관여하는 것으로 추정할 수 있다. 이를 통하여 IGBP1의 발현 측정을 통해 루프스 신염 환자의 관 위축 및 세뇨 간질 염증 또한 진단할 수 있음을 확인하였다
실시예 8. IGBP1 siRNA을 이용한 넉다운을 통한 인간 근위 상피 세포(Human proximal epithelial tubule cell)에서의 IGBP1의 역할 규명
ATCC에서 구입한 인간 신장 세뇨관 상피 세포(Human renal tubular epithelial cell)인 HK-2 세포는 인유두종 바이러스(human papilloma virus)의 16 E6/E7 유전자를 형질도입하여 고정된 세포로서, 인간 근위 상위 세포와 매우 유사하게 작용한다. 따라서, 상기 HK-2 세포주를 이용하여 IGBP1 단백질이 루프스 신염에서 분자 메커니즘(molecular mechanism)을 IGBP1 siRNA을 이용한 넉다운 후 마이크로어레이를 실시하여 분석하였다.
구체적으로, 인간 근위 상피 세포와 매우 유사한 성질을 갖는 HK-2 세포에서 IGBP1 전사를 억제하기 위하여, IGBP1에 대한 siRNA((F: GGACGAAGUAGAAGUGGCGACUGAA(서열번호 1), R:UUCAGUCGCCACUUCUACUUCGUCC(서열번호 2))를 사용하였고, 이에 대한 음성 대조군으로는 Stealth RNAiTM siRNA negative control(Invitrogen)을 이용하였다. 형질 감염은 Lipofectamin RNAiMAX를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 형질 감염 혼합물이 포함된 OptiMEM serum reduced media 배지를 세포에 접종시키고 37도에서 48시간 동안 배양한 후, 상기 세포를 수집하고 이로부터 RNA를 분리하였다.
이 후, 마이크로어레이 분석을 위하여, 상기 준비된 총 RNA(300 ng)을 역전사효소, random hexamer를 이용한 역전사반응을 통해 double stranded cDNA로 전환시켰다. 이 후, IVT(in0vitro transcription) 반응을 이용하여 cRNA (amplified RNA)를 만든 후 Affymetrix sample cleanup module로 정제하였다. 정제된 cRNA는 dUTP를 함유한 dNTP를 이용한 random-primed reverse transcription을 이용하여 다시 cDNA로 전환시켰다. 상기 cDNA는 UDG 및 APE I restriction endonucleases에 의해 단편화되고 말단 전이효소 반응으로 biotinyated dideoxynucleotide가 말단에 표지되었다. 상기 표지 cDNA를 GeneChip® Human Gene 2.0 ST array (Affymetrix) 상에 놓고 45도, 60 rpm에서 17시간 동안 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화된 슬라이드은 염색 후 Genechip Fluidics Station 450 (Affymetrix)에서 세정하였다. GeneChip Array scanner 30007G(Affymetrix)에 의해 스캔 후 발현 수치는 스캔이미지로부터 Affymetrix Command Console software v 1.1를 사용하여 얻었고고 데이터는 CEL 파일로 저장하였다.
이 후, 데이터 분석을 위하여, CEL 파일의 수치는 어레이(array) 간의 오차를 최소화하기 위해 Affymetrix에서 제공하는 Expression Console software version 1.3.1의 Robust Multi-array Average(RMA) 알고리즘을 이용하여 표준화 (Normalziation) 하였다. 자료가 잘 표준화되었는지 점검하기 위해 표준화된 자료 전체를 R program version 3.0.2 환경으로 옮긴 후, Bioconductor Project tool 들을 이용한 그래프를 통해 각 어레이의 전반적인 시그널 분포도를 비교하였다. 자료가 충분히 표준화 된 것을 확인 후, 대조군과 처리군 각 그룹의 평균 시그널 값의 차이가 2배 이상인 differentially expressed genes(DEGs)을 수동으로 추출하였다. 선택된 DEG의 표준화 자료를 이용하여 다시 한 번 통계 t-test 분석을 수행하기 위해, R program 환경으로 옮긴 후 P-value 0.05 미만인 유전자는 추가 분석을 위한 중요 DEG를 선별하였다. 상기 유전자 중 발현패턴이 유사한 것끼리 분류하기 위해 MEV (Multi Experiment Viewer) software version 4.4를 이용하여 계층적 군집화(hierarchical clustering) 분석을 수행하였다. 마지막으로 web-based DAVID 툴을 이용하여, DEG이 관여하는 regulatory networks를 알아내기 위해 OMIMDISEASE, GENE ONTOLOGY, KEGG PATHWAY 및 BIOCARTA 데이터베이스와 같은 유전자 기능정보를 기반으로 기능분석 및 분류 (functional annotation 및 classification)를 수행하였다. 그 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, HK-2 세포에서 IGBP1 siRNA에 의한 IGBP1 발현 감소에 의하여, 88개의 유전자의 발현이 상향-조절(up-regulation)됨을 확인하였다.
또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, HK-2 세포에서 IGBP1 siRNA에 의한 IGBP1의 발현 감소에 의하여, 104개의 유전자의 발현이 하향-조절(down-regulation)됨을 확인하였다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation THE ASAN FOUNDATION <120> A biomarker composition for diagnosis of lupus nephritis comprising Immunoglobulin binding protein 1 <130> 1-7 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA forward of IGBP1 <400> 1 ggacgaagua gaaguggcga cugaa 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA reverse of IGBP1 <400> 2 uucagucgcc acuucuacuu cgucc 25

Claims (18)

  1. IGBP1(Immunoglobulin binding protein 1, NM_001551.2)을 포함하는 루프스 신염(Lupus nephritis) 진단용 바이오 마커 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 루프스 신염은 환자의 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액 및 신장 조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 시료에서 확인하는 것을 특징으로 하는, 루프스 신염 진단용 바이오 마커 조성물.
  4. IGBP1을 포함하는 루프스 신염의 만성도(chronicity index) 평가용 바이오 마커 조성물.
  5. IGBP1을 포함하는 루프스 신염의 활성도(activity index) 평가용 바이오 마커 조성물.
  6. IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염 진단용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 IGBP1의 발현 또는 활성을 측정하는 제제는 상기 IGBP1에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는, 루프스 신염 진단용 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 IGBP1를 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제는 상기 IGBP1를 코딩하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 루프스 신염 진단용 조성물.
  9. IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염의 만성도 평가용 조성물.
  10. IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 루프스 신염의 활성도 평가용 조성물.
  11. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 루프스 신염 진단용 키트.
  12. 생물학적 시료에서 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 루프스 신염의 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 환자의 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액 및 신장 조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 루프스 신염의 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 루프스 신염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 생물학적 시료에 후보물질을 처리하고 IGBP1의 발현 또는 활성; 또는 IGBP1을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제시키는 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 루프스 신염 치료제의 스크리닝 방법.

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