CN114230632B

CN114230632B - 一种丙烯酰胺衍生物模拟表位肽及应用

Info

Publication number: CN114230632B
Application number: CN202111100988.5A
Authority: CN
Inventors: 徐振林; 傅慧君; 王宇; 王弘; 罗林; 孙远明; 沈玉栋; 雷红涛
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-09-18
Filing date: 2021-09-18
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2041-09-18
Also published as: CN114230632A

Abstract

本发明公开了一种丙烯酰胺衍生物模拟表位肽及应用。本发明制备得到的丙烯酰胺衍生物模拟表位肽是国内外首次报道的与丙烯酰胺衍生物抗体特异性结合模拟表位肽；利用本发明制备得到的展示模拟表位肽的噬菌体可以建立灵敏，快速的竞争型酶联免疫分析法；利用本发明制备得到的展示模拟表位肽的噬菌体构建的竞争型免疫分析方法用于检测丙烯酰胺，IC₅₀为5.88ng/mL，检测限为1.41ng/mL；基于本发明提供的发明制备得到的展示模拟表位肽的噬菌体建立的竞争型免疫分析方法对丙烯酰胺的结构类似物的交叉反应良好。

Description

一种丙烯酰胺衍生物模拟表位肽及应用

技术领域

本发明涉及食品安全技术领域，具体地，涉及一种丙烯酰胺衍生物模拟表位肽。

背景技术

丙烯酰胺(Acrylamide)是一种无色、无味的小分子有机物，具有良好的水溶性。丙烯酰胺广泛存在高温加工的淀粉类食品中，主要是由于食品制作过程中发生的美拉德反应，原料中天冬酰胺和还原糖是美拉德反应中丙烯酰胺形成的主要前体物质。近年来，大量研究表明丙烯酰胺具有神经毒性、遗传毒性、生殖毒性和潜在致癌性，可通过皮肤、黏膜、呼吸道、消化道和胎盘进入生物体内并蓄积，危害人类健康。欧盟风险评估报告，丙烯酰胺可诱导动物各种器官发生肿瘤，如口腔、甲状腺、乳腺、睾丸、子宫及脑下垂体肿瘤等。国际癌症研究机构(IARC)于1994年将丙烯酰胺列为2类致癌物(2A)。由于丙烯酰胺毒性强，在食品中分布较广，对人体健康造成极大威胁，因此对食品中丙烯酰胺的监测必不可少。

目前食品中丙烯酰胺的检测方法主要有高效液相色谱法，高效液相串联质谱法，气相色谱法，气相串联质谱法和基于特异性抗体的免疫分析方法等。例如：CN201110349769.0一种丙烯酰胺快速检测卡及其检测方法、CN202011219056.8一种基于上转换荧光纳米体系对烘焙食品中丙烯酰胺含量的检测方法、CN201510288951.8一种基于荧光分析的煎炸食品中丙烯酰胺的检测方法等。

其中，免疫分析方法具有成本低，分析快，灵敏度高等特点备受青睐。丙烯酰胺具有超低的分子量(71.08Da)，难以有效引起动物免疫应答，因而其高亲和力抗体几乎无法获得，至今对其进行高灵敏直接免疫检测未能突破。目前仅能基于检测其衍生物的方式进行检测，其检测全抗原在化学合成过程中反应步骤繁琐，制备过程需要使用大量的有毒标准品和有机溶剂，直接威胁操作人员身体健康，若化学合成过程中产生的废液处理不当，极易造成实验室及环境的二次污染。另外，化学合成检测全抗原时，副产物多，具有不可精准操控的特性，易导致检测全抗原批间差异大，造成检测方法的不稳定性。因此，研究高敏感无毒的小分子检测全抗原替代物，是建立环境友好型免疫分析的重要发展方向。近年来研究人员发现从多肽展示库中可淘筛到抗原模拟表位蛋白，成功代替了免疫分析方法中的完全抗原。模拟表位蛋白与传统化学合成的竞争物相比，具有获取快速简单，环保，灵敏度更高的优势，但是目前应用于丙烯酰胺分析检测的模拟表位蛋白尚未报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种丙烯酰胺衍生物模拟表位肽及应用。

本发明的第一个目的是提供一种丙烯酰胺衍生物的模拟表位肽。

本发明的第二个目的是提供一种编码丙烯酰胺衍生物的模拟表位肽的基因。

本发明的第三个目的是提供一种噬菌体。

本发明的第四个目的是提供另一种噬菌体。

本发明的第五个目的是提供一种检测丙烯酰胺的方法。

本发明的第六个目的是提供一种检测丙烯酰胺的试剂盒。

本发明的第七个目的是提供所述模拟表位肽、所述基因、所述噬菌体、和/或所述另一噬菌体任意一种或几种在制备检测占吨聚丙烯酰胺和/或丙烯酰胺的试剂盒中的应用。

本发明的第八个目的是提供所述模拟表位肽、所述基因、所述噬菌体、所述另一噬菌体、和/或所示的试剂盒任意一种或几种在检测占吨聚丙烯酰胺和/或丙烯酰胺中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明将用蛋白G柱纯化的丙烯酰胺衍生物单克隆抗体(图1为免疫原结构式意图)包被在高吸附酶标板上，用3％(w/v)脱脂奶粉封闭酶标板，随后将随机七环噬菌体展示库加入酶标板中进行淘筛，按照结合-洗脱-扩增的淘选方案进行，通过3轮的富集淘筛。其中，三轮淘筛包被的抗体用量和用于竞争洗脱噬菌体的丙烯酰胺衍生物用量依次减少；经过3轮淘筛后，随机挑选40个噬菌体单克隆进行噬菌体ELISA的初步鉴定，对于得到的34个阳性克隆进行扩增、测序共发现6种丙烯酰胺衍生物模拟表位肽，其氨基酸序列如氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11所示，编码丙烯酰胺衍生物模拟表位肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示。本发明制备得到的可与丙烯酰胺衍生物抗体特异性结合的模拟表位肽，可代替抗原建立竞争型噬菌体酶联免疫分析法(phage-ELISA)，用于丙烯酰胺的检测，有望实现于快速、灵敏、简便和廉价的检测食品中的丙烯酰胺残留。

因此本发明要求保护以下内容：

一种丙烯酰胺衍生物的模拟表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11所示，丙烯酰胺衍生物结构式如式(I)。

结构式如式(I)丙烯酰胺衍生物即为占吨聚丙烯酰胺。

优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

一种编码丙烯酰胺衍生物的模拟表位肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示，丙烯酰胺衍生物结构式如式(I)

优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

一种噬菌体，所示噬菌体表面表达有所述模拟表位肽。即氨基酸序列如SEQ IDNO：1、3、5、7、9或11所示模拟表位肽和噬菌体衣壳蛋白融合展示于噬菌体表面，即展示氨基酸序列如1、3、5、7、9或11所示丙烯酰胺衍生物模拟表位肽的噬菌体。

优选地，所述的模拟表位肽展示于所示噬菌体pIII壳蛋白的N端。

一种噬菌体，所示噬菌体表面表达所述的基因。

优选地，所示噬菌体以M13噬菌体质粒为载体，所述基因插入到噬菌体编码的膜蛋白的gⅢ基因中。

一种检测丙烯酰胺的方法，酸性条件下，利用占吨氢醇进行衍生化反应，得到衍生化产物；以抗丙烯酰胺衍生物抗体作为包被抗体，以所述的模拟表位肽、所述噬菌体、所述噬菌体任意一种或几种作为竞争抗原进行酶联免疫检测，丙烯酰胺衍生物结构式如式(I)所示，

酸性条件下，酸性条件下，丙烯酰胺与占吨氢醇，进行衍生化反应，脱水得到衍生化产物占吨聚丙烯酰胺。抗丙烯酰胺衍生物抗体作为包被抗体，以所述的模拟表位肽、所述噬菌体、和/或所述噬菌体任意一种或几种作为竞争抗原进行酶联免疫检测衍生化产物占吨聚丙烯酰胺。

更优选地，一种检测丙烯酰胺的方法，包括以下步骤：

(1)抗体包被

用PBS稀释抗丙烯酰胺单克隆抗体，包被酶标板，在孵育过夜。PBST洗涤、封闭、甩干。

(2)衍生：

待测样本与占吨氢醇混合，然后加入HCl(0.5mol/L)充分反应，后加入NaOH(1.5mol/L)终止衍生反应(HCl和NaOH的用量均为待测样本与占吨氢醇的1/10体积)。反应混合液用PBS稀释，作为后续Phage ELISA的竞争抗原。

(3)Phage ELISA:所述噬菌体与上述衍生产物一同加入包被抗体的微孔中，孵育，PBST清洗后加入稀释HRP标记的抗M13噬菌体HRP二抗，再次用PBST清洗，加入TMB显色液，避光显色，10％(v/v)H₂SO₄终止。读取450nm吸光度。

(4)结果判定

绘制标准曲线，以各丙烯酰胺标准品浓度的对数值为横坐标，所对应的B/B₀为纵坐标(B₀位丙烯酰胺浓度为0的孔测的吸收值，B其他系列丙烯酰胺浓度孔的吸光值。

一种检测丙烯酰胺的试剂盒，含有所述模拟表位肽、所述噬菌体、和/或所述噬菌体任意一种或几种。

更优选地，还含有抗丙烯酰胺衍生物抗体，

丙烯酰胺衍生物结构式如式(I)所示，

优选地，还含有占吨氢醇。

最优选，所述试剂盒包括：结构式如式(I)所示抗丙烯酰胺衍生物抗体，所述噬菌体、占吨氢醇、HCl、NaOH、PBS、PBST、HRP标记的抗M13噬菌体HRP二抗、TMB显色液、10％(v/v)H2_SO₄。

所述模拟表位肽、所述基因、所述噬菌体、和/或所述另一噬菌体任意一种或几种在制备检测占吨聚丙烯酰胺和/或丙烯酰胺的试剂盒中的应用。

所述模拟表位肽、所述基因、所述噬菌体、所述另一噬菌体、和/或所示的试剂盒任意一种或几种在检测占吨聚丙烯酰胺和/或丙烯酰胺中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)新颖性：本发明获取的丙烯酰胺衍生物模拟表位肽是国内外首次报道的与丙烯酰胺衍生物抗体特异性结合模拟表位肽；

(2)实用性：利用本发明制备得到的展示模拟表位肽的噬菌体可以建立灵敏，快速的竞争型酶联免疫分析法。

(3)高灵敏度：利用本发明制备得到的展示模拟表位肽的噬菌体构建的竞争型免疫分析方法，IC₅₀为5.88ng/mL，检测限为1.41ng/mL。

(4)高特异性：基于本发明提供的发明制备得到的展示模拟表位肽的噬菌体建立的竞争型免疫分析方法对丙烯酰胺的结构类似物的交叉反应良好。

附图说明

图1制备抗丙烯酰胺衍生物单克隆抗体的免疫原结构式意图。

图2为噬菌体展示模拟表位肽淘筛示意图。

图3为噬菌体展示模拟表位肽的phage-ELISA筛选结果。

图4为基于噬菌体展示模拟表位肽检测丙烯酰胺的标准曲线的建立。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

主要实验材料：

蛋白G柱纯化的丙烯酰胺衍生物单克隆抗体由华南农业大学食品学院广东省食品安全重点实验室制备，丙烯酰胺衍生物结构式如式(I)，图1为免疫原结构式意图。

噬菌体展示七环肽库购于NEB公司。

主要试剂：

蛋白胨，酵母提取物，琼脂，IPTG、Xgal、PEG8000、辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体(Sino Biological)。

主要试剂配方：

LB液体培养基：1g蛋白胨，0.5g酵母提取物，1g NaCl，加入三级水100mL，高压灭菌，室温储存。

Top培养基：1g蛋白胨，0.5g酵母提取物，0.5g NaCl，0.7g琼脂，加入三级水100mL，高压灭菌，室温储存。

IPTG+Xgal：1.25gIPTG，1gXgal，用25mLDMF溶解后过有机膜除菌。

LB/IPTG/Xgal平板:1L LB培养基加入15g/L琼脂后灭菌，冷却至70度以下,加入1ml IPTG/Xgal混合物混匀后，倒平板。该平板培养基需避光储存于4度条件。

Tet：20mg/mL，用无水乙醇:水＝1:1(体积比)溶解

20％PEG8000/NaCl：80g PEG8000，58.44gNaCl，三级水定容至400mL，高压灭菌，室温储存。

TBS：先配Tris-HCl(pH＝7.5)：15.764gTris，三级水定容至200mL，用HCl调pH至7.5；取150mL Tris-HCl溶解17.532g NaCl，再定容至200mL。高压灭菌，室温储存。

实施例1与丙烯酰胺衍生物抗体特异性结合的模拟表位肽的淘选

一、实验方法

1、噬菌体的筛选和扩增(图2)

(1)淘选：用0.0 1mol/L PBS稀释抗体纯化后的抗丙烯酰胺衍生物抗体，取100μL，10μg/mL于高吸附酶标板中(3个平行)，4℃包被过夜。

(2)将步骤(1)的酶标板用PBST洗涤两遍(300μL/孔)，3％(w/v)脱脂奶粉，37℃孵育1小时。

(3)将步骤(2)的酶标板的封闭液甩干后，向酶标板中每孔加入100μL的10¹¹pfu/mL的噬菌体展示七环肽库(5％(w/v)脱脂奶粉稀释)，4℃孵育2小时。

(4)用预冷的PBST洗10次，冷PBS清洗10次后，加入10μg/mL的丙烯酰胺衍生物进行竞争洗脱4℃竞争2h。

(5)收集步骤(4)的上清，将竞争后的洗脱液(取少量噬菌体测滴度)加入到装有20mL的大肠杆菌ER2738(OD₆₀₀为0.01至0.05)的250mL三角瓶中，37℃摇床，250rpm,培养4.5h。

(6)将扩增后的噬菌体移入50mL的离心管中，在4℃下12000rpm，离心10min,取上清。

(7)向(6)上清中加入体积1/6的20％PEG8000/NaCl，充分混匀后，4℃冰浴过夜

(8)将(7)步骤中的溶液于4℃，12000rpm的条件，再次离心10min，去上清，加入1mLTBS重悬沉淀物，再次相同条件离心一次。

(9)取350μL TBS重悬步骤(8)的沉淀物用于下一轮的筛选。

(10)步骤(1)到(9)为一轮筛选和扩增，重复(1)到(9)两次作为第二轮和第三轮的筛选和扩增，其中第二轮和第三轮的筛选和扩增中步骤(1)使用的抗体浓度分别为5μg/mL和2.5μg/mL，中第二轮和第三轮的筛选和扩增中步骤(4)使用的丙烯酰胺衍生物为1μg/mL和100ng/mL。

2、洗脱液或扩增后的噬菌体滴度的测定

(1)取10mL LB液体培养基，加入0.1％(v/v)的四环素，接种大肠杆菌ER2738，37℃转速250rpm，培养至OD600为～0.5；

(2)LB/IPTG/Xgal至于37℃烘箱预热至少1h，预热Top培养基，使其保持温度在45℃左右。

(3)对洗脱液或扩增后的噬菌体，稀释到相应的倍数，一般洗脱液稀释10～10³倍，扩增后的噬菌体稀释10⁸～10¹⁰倍。

(4)取10μL相应稀释倍数的噬菌体加入到200μL准备好的OD600为～0.5的大肠杆菌ER2738，斡旋混匀。加入到3mL准备好的Top培养基中，混匀，平铺到(2)步准备好的平板上，冷却10min,防于37℃培养箱中倒置培养过夜。

(5)记录平板上的蓝色噬菌体斑点，用于计算所测的噬菌体的滴度。

二、实验结果

结果如下表1。

表1噬菌体的滴度：

结果显示，从淘筛从第2轮开始富集，第3轮output最高，根据噬菌体展示库说明书建议，淘筛只可进行3轮，根据此结果从第3轮output的滴度测定平板上挑取若干克隆进行阳性克隆的筛选。

实施例2与丙烯酰胺衍生物抗体特异性结合的模拟表位肽的鉴定

一、实验方法

(1)实施例1第三轮淘筛后，对洗脱液进行滴度测定，选择少于100个蓝色噬菌体的培养基板，从中随机挑取40个蓝色噬菌斑，进行扩增和鉴定。

(2)蓝色噬菌斑扩增步骤，与洗脱液扩增步骤相似。将单个噬菌斑接种到装有1mL的ER2738(OD₆₀₀为0.01至0.05)的4mL离心管中，37℃摇床，250rpm，培养4.5h。

(3)培养液4℃12000rpm离心10min，上清可用于之后的阳性克隆的应用基于噬菌体酶联免疫分析方法(phage ELISA)进行鉴定以及序列测定。

(a)phage ELISA鉴定的具体方法为：

用PBS稀释抗体纯化后的抗丙烯酰胺衍生物单克隆抗体(图1为免疫原结构式意图，可以特异性识别结结构式如式(I)所示的丙烯酰胺衍生物)，取100μL，10μg/mL于高吸附酶标板中，4℃包被过夜。次日酶标板用PBST洗涤两遍(300μL/孔)，3％(w/v)脱脂奶粉，37℃孵育1小时。取50μL(3)的上清液分别与等体积的1μg/mL丙烯酰胺衍生物或PBS混合加入酶标孔中，同时用1μg/mL BSA作为对照试验检测非特异性结合能力。在室温孵育1h后并用PBST洗涤7次，将100μL抗M13噬菌体抗体-HRP用PBST稀释5000倍后加入孔中，在37℃条件下孵育30分钟。再次洗涤5次，每孔加入100μL TMB液体底物缓冲液，37℃孵育10分钟。最后，在用50μL的H₂SO₄(10％，v/v)终止反应后读取吸光度(450nm)。

选择阳性克隆的标准为：可结合抗丙烯酰胺衍生物抗体(吸光值高于1.5)、可以被氨基甲酸乙酯衍生物竞争(吸光值低于0.5)、且对BSA的结合能力较弱(吸光值低于0.2)。

(b)序列测定的具体方法为：

经phage ELISA鉴定得到的阳性克隆，通过测序引物96gIII进行测序，获取基因序列，阳性克隆的序列通过引物96gIII测序鉴定(TTTTGAAATCTAGCAATGCGATTGATACTCCCG)。

二、实验结果

结果如图3所示，其中挑选的40个克隆中有34个克隆经phage ELISA鉴定为阳性克隆，进一步进行序列测定，测序共发现6种丙烯酰胺衍生物模拟表位肽。测序结果如表2所示：

表2噬菌体展示模拟表位肽测序结果

实施例3与丙烯酰胺衍生物抗体特异性结合的模拟表位肽作为竞争抗原在酶联免疫分析方法中的应用

一、实验方法

1、抗体包被

用PBS稀释抗丙烯酰胺衍生物单克隆抗体(丙烯酰胺衍生物的结构式如式(I)所示)，2μg/mL包被酶标板，在4℃条件下孵育过夜。次日，应用PBST洗涤2次，3％脱脂奶粉37℃封闭1h。甩干后，可存放于4℃用于后续实验。

2、标准曲线的建立

实施例2淘筛到的6株噬菌体虽均可模拟丙烯酰胺的衍生物与抗丙烯酰胺衍生物抗体的结合，且灵敏度无显著区别，但根据与抗丙烯酰胺衍生物抗体结合，吸光值取1～1.2时，噬菌体的滴度测定结果显示，其亲和力存在一定的差异，其中N.10(SEQ ID NO：11)亲和力最强10⁸pfu/mL。因此，选择基于亲和力最高的噬菌体(N.10)构建标准曲线。

(1)衍生：

丙烯酰胺的酰胺基团与占吨氢醇的羟基，在酸性条件下脱水，生成占吨聚丙烯酰胺。

具体地，用PBS配置系列浓度的丙烯酰胺标准品：每个浓度的标准品取0.6mL与0.4mL占吨氢醇(4mg/mL)，然后加入0.1mLHCl(0.5mol/L)反应30min后加入0.1mLNaOH(1.5mol/L)终止衍生反应。即生成丙烯酰胺(AA)的衍生物占吨聚丙烯酰胺(XAA)。反应混合液用PBS稀释5倍，取50μL作为后续Phage ELISA的竞争抗原。

(2)Phage ELISA

50μL的实施例2淘筛到的N.10噬菌体克隆与50μL PBS或者上述系列浓度的丙烯酰胺的衍生产物一同加入包被抗体的微孔中，37℃孵育45min，PBST清洗7次后加入100μL1:5000倍稀释HRP标记的抗M13噬菌体HRP二抗，再次用PBST清洗5次，加入100μL TMB显色液，避光显色10min，50μL 10％(v/v)H₂SO₄。读取450nm吸光度。以各丙烯酰胺标准品浓度的对数值为横坐标，所对应的B/B₀为纵坐标(B₀位丙烯酰胺浓度为0的孔测的吸收值，B其他系列丙烯酰胺浓度孔的吸光值。

二、实验结果

标准曲线如图4该方法的检测丙烯酰胺的LOD(IC₁₀)为1.41ng/mL，定量范围为2.39～14.49ng/mL(y＝-0.68434lgX+1.035)。

实施例4可与丙烯酰胺衍生物抗体特异性结合的模拟表位肽特异性评估

一、实验方法

以丙烯酰胺交叉反应率(CR)为100％，选取5种丙烯酰胺结构相似的化合物(类似物)：氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酰胺以及衍生剂占吨醇，分别绘制标准曲线(具体步骤同实例3)，计算各自的IC₅₀值。用下式计算交叉反应率(CR)：

CR(％)＝100×IC₅₀(丙烯酰胺)/IC₅₀(类似物)

50μL的N.10噬菌体克隆与待测化合物一同加入包被抗体的微孔中，37℃孵育45min,PBST清洗7次后加入100μL1:5000倍稀释HRP标记的抗M13噬菌体HRP二抗，再次用PBST清洗5次，加入100μL TMB显色液，避光显色10min,50μL 10％(v/v)H₂SO₄。读取吸光度(450nm)。

二、实验结果

如表3所示，丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酰胺以及衍生剂占吨醇的交叉反应率均小于0.1％，对氨基甲酸甲酯有22.7％，氨基甲酸乙酯1％。但由于在用于分析丙烯酰胺的样品中，不会产生及存在氨基甲酸乙酯以及氨基甲酸甲酯，所以即使有交叉对后续实际样品的检测不会造成干扰。表明淘筛到的与丙烯酰胺衍生物抗体特异性结合的模拟表位肽具有良好的特异性，有望能实现无干扰地对丙烯酰胺的快速检测。

表3噬菌体展示模拟表位肽与丙烯酰胺结构类似物的交叉反应

实施例5一种检测丙烯酰胺的方法

(1)抗体包被

(2)衍生

待测样本0.6mL与0.4mL占吨氢醇(4mg/mL)，然后加入0.1mLHCl(0.5mol/L)反应30min后加入0.1mLNaOH(1.5mol/L)终止衍生反应。反应混合液用PBS稀释5倍，取50μL作为后续Phage ELISA的竞争抗原。

(3)Phage ELISA

50μL的实施例2淘筛到的N.10噬菌体克隆与50μL上述衍生产物一同加入包被抗体的微孔中，37℃孵育45min，PBST清洗7次后加入100μL 1：5000(v/v)倍稀释HRP标记的抗M13噬菌体HRP二抗，再次用PBST清洗5次，加入100μL TMB显色液，避光显色10min，50μL 10％(v/v)H₂SO₄。读取450nm吸光度。

(4)结果判定

标准曲线绘制，以各丙烯酰胺标准品浓度的对数值为横坐标，所对应的B/B₀为纵坐标(B₀位丙烯酰胺浓度为0的孔测的吸收值，B其他系列丙烯酰胺浓度孔的吸光值。

实施例6一种检测丙烯酰胺的试剂盒

一、组成

抗丙烯酰胺衍生物单克隆抗体(丙烯酰胺衍生物的结构式如式(I)所示)、实施例2淘筛到的N.10噬菌体克隆、占吨氢醇、HCl、NaOH、PBS、PBST、HRP标记的抗M13噬菌体HRP二抗、TMB显色液、10％(v/v)H₂SO₄。

二、使用方法

同实施例5。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种丙烯酰胺衍生物模拟表位肽及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Cys Ser Leu Thr Asp Trp Trp His Cys

1 5

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtagtttga cggattggtg gcattgc 27

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Cys Ser Ser Asn Thr Val Pro Ala Cys

1 5

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgttcttcta atacggtgcc ggcttgc 27

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Cys Asp Tyr Thr Arg Trp Trp His Cys

1 5

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtgattata ctcgttggtg gcattgc 27

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Cys Asp Gly Arg Pro Asp Arg Ala Cys

1 5

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtgatggtc ggcctgatag ggcgtgc 27

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Cys Asn Phe Thr Val Trp Trp His Cys

1 5

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtaatttta cggtgtggtg gcattgc 27

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Cys Thr Asp Lys Ala Ser Ser Ser Cys

1 5

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgtacggata aggctagtag ttcgtgc 27

Claims

1.一种丙烯酰胺衍生物的模拟表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11所示，丙烯酰胺衍生物结构式如式（I）所示，

（I）。

2.一种编码丙烯酰胺衍生物的模拟表位肽的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO：2、4、6、8、10或12所示。

3.一种噬菌体，其特征在于，所示噬菌体表面表达有权利要求1所述的表位肽。

4.一种非诊断目的检测丙烯酰胺的方法，其特征在于，酸性条件下，利用占吨氢醇进行衍生化反应，得到衍生化产物；以抗丙烯酰胺衍生物的抗体作为包被抗体，以权利要求1所述的模拟表位肽、权利要求3所述噬菌体任意一种或几种作为竞争抗原进行酶联免疫检测，

丙烯酰胺衍生物结构式如式（I）所示，

（I）。

5.一种检测丙烯酰胺的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的模拟表位肽、权利要求3所述噬菌体任意一种或几种，还含有抗丙烯酰胺衍生物的抗体，

丙烯酰胺衍生物结构式如式（I）所示，

（I）。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有占吨氢醇。

7.权利要求1所述模拟表位肽、权利要求2所述基因、权利要求3所述噬菌体任意一种或几种在制备检测占吨聚丙烯酰胺和/或丙烯酰胺的试剂盒中的应用。

8.权利要求1所述模拟表位肽、权利要求2所述基因、权利要求3所述噬菌体、权利要求5所示的试剂盒任意一种或几种在非诊断目的检测占吨聚丙烯酰胺和/或丙烯酰胺中的应用。