CN113637071A - 一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体及其制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体及其制备和用途，包括所述的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明制备的纳米抗体可替代传统抗体，应用于Cry3Bb蛋白的免疫学检测分析，该纳米抗体具有制备简单、成本低、结合活性高等特点。

Description

一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体及其制备和用途
技术领域
本发明属于基因工程抗体和食品生物技术领域，尤其是涉及一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体及其制备和用途。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)在形成孢子阶段会产生一种伴胞晶体蛋白，对鳞翅目、鞘翅目等多种昆虫具有高效毒杀作用，被称为Bt蛋白或δ-内毒素。目前已知的Bt蛋白超过400种，根据氨基酸序列同源性，分为晶体蛋白(crystal protein,Cry)和细胞溶解蛋白(cytolytic protein,Cyt)两大类。其中，Cry蛋白被广泛应用于转基因农作物的害虫防治中，常见的种类包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry2A和Cry3Bb等。近年来，转基因农作物的种植面积呈快速增长趋势，但转基因农作物的安全性并未得到广泛认同，转基因农作物可能对生态环境和人体健康造成潜在危害。为安全起见，许多国家已经对转基因产品实行了标签制度。因此，对转基因农作物及其产品中的Bt Cry蛋白进行有效监控和快速检测是十分必要的。
Bt Cry蛋白的检测方法主要是基于核酸和蛋白质水平的分析，包括PCR方法和ELISA方法。PCR方法具有灵敏度高、准确性高等特点，但不能对表达的Bt Cry蛋白进行定量检测，且需要专业的仪器设备和操作人员。而ELISA方法具有简便、快速、低耗等特点，适合于农作物中Cry蛋白的现场快速定性和定量检测。其中，高特异性、高亲和性抗体的制备是ELISA方法建立的前提和关键。
纳米抗体(Nanobody)源于驼科动物(骆驼、羊驼等)体内天然缺失轻链的重链抗体，克隆重链抗体的可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为单域重链抗体，也称为纳米抗体。纳米抗体是目前已知最小的功能性抗体片段，只含有3个互补决定区(Complementarity-determining region,CDR)，却具有与普通抗体相同的抗体功能。与普通抗体相比，纳米抗体的CDR3更长，可以形成凸环结构，能够伸入目标蛋白的凹槽、裂缝等普通抗体难以达到的表位。同时，纳米抗体还具有高亲和力、高水溶性、易表达等特点。因此，纳米抗体是一种优良的抗体材料，可替代传统抗体，广泛应用于医疗诊断、食品安全检测等多个领域。然而，目前，针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体还未见报道。因此，迫切需要开发有效的针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体及其制备和用途。
为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体，所述的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述纳米抗体包含框架区及互补决定区，其中框架区包括以下4段FR的氨基酸序列：SEQ ID NO.2所示的FR1、SEQ ID NO.4所示的FR2、SEQ ID NO.6所示的FR3及SEQID NO.8所示的FR4；所述互补决定区包括以下3段CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO.3所示的CDR1、SEQ ID NO.5所示的CDR2及SEQ ID NO.7所表示的CDR3。互补决定区主要负责抗原的识别，框架区结构相对稳定，主要起着支撑维持蛋白质结构的作用。
本发明的第二方面，提供了一种编码如上述针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明的第三方面，提供了一种重组表达载体，包含如权利要求3所述的核苷酸。
本发明的第四方面，提供了一种重组工程菌，包含如权利要求4所述的重组表达载体。
本发明的第五方面，提供了一种如上述针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体在Cry3Bb免疫学检测分析中的应用。
本发明的第六方面，提供了一种如上述的针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1：Cry3Bb纳米抗体的淘选；
S2：Cry3Bb纳米抗体阳性噬菌体克隆的鉴定；
S3：噬菌体展示纳米抗体的扩增及活性鉴定；
S4：Cry3Bb纳米抗体在大肠杆菌中的表达及纯化。
可选的，所述S1中重复进行多轮淘选，其中多轮淘选过程中包被的Cry3Bb蛋白的浓度依次减少，PBST的洗涤次数依次增加。
可选的，所述S2采用phage-ELISA进行阳性噬菌体克隆的鉴定，当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，初步判定为阳性克隆。
可选的，所述S4的具体步骤为：
S41：将噬菌粒载体上的纳米抗体基因亚克隆至表达载体pET-30a中，获得重组表达载体；
S42：将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，培养后涂布于LB-K平板，继续培养；
S43：从LB-K平板上挑取单菌落接种于LB培养基中进行培养，将培养物接种于LB-KG培养基中；
S44：当培养物菌体浓度OD600达到0.5时，向培养物中加入IPTG，振荡培养；
S45：将S44获得的培养物离心收集菌体沉淀，重悬细胞于PBS溶液，超声破碎后，离心取上清，即得纳米抗体粗提液；
S46：将纳米抗体粗提液经镍柱进行纯化，得到纯化的纳米抗体蛋白
综上所述，本发明具有以下有益效果：
本发明制备的纳米抗体可替代传统抗体，应用于Cry3Bb蛋白的免疫学检测分析，该纳米抗体具有制备简单、成本低、结合活性高等特点。
附图说明
图1为本发明纳米抗体的氨基酸序列示意图；
图2本发明纳米抗体结合活性测定结果示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。并且下面对本申请涉及的术语做进一步的说明，若无特殊指明，按照本领域通用的一般所属进行理解和解释。
纳米抗体：骆驼科动物重链抗体的可变区；
氨基酸序列框架区FR1，纳米抗体的第一段恒定区序列；
氨基酸序列框架区FR2，纳米抗体的第二段恒定区序列；
氨基酸序列框架区FR3，纳米抗体的第三段恒定区序列；
氨基酸序列框架区FR4，纳米抗体的第四段恒定区序列；
氨基酸序列互补决定区CDR1，纳米抗体的第一段可变区序列；
氨基酸序列互补决定区CDR2，纳米抗体的第二段可变区序列；
氨基酸序列互补决定区CDR3，纳米抗体的第三段可变区序列；
实施例1：针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体的淘选
将Cry3Bb蛋白用PBS(0.01M，pH 7.4)稀释至100μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；用PBST(0.01M PBS，pH 7.4，含0.1％Tween-20)洗涤6次，加入300μL的3％BSA-PBS(3％OVA-PBS)，37℃封闭2h；PBST洗板6次，加入100μL的噬菌体展示天然纳米抗体库(滴度约2.0×1011pfu)，37℃孵育1h；PBST洗涤6次，加入100μL的Glycine-HCl(0.2M，pH 2.2)洗脱8min后，立即加入15μL Tris-HCl(1M，pH 9.0)中和，取10μL洗脱噬菌体测滴度，其余的感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1进行扩增，扩增噬菌体经PEG/NaCl纯化后用于下一轮的淘选。
随后重复进行3轮淘选，淘选步骤与第一轮基本相同，包被的Cry3Bb蛋白的浓度分别减少为50μg/mL，25μg/mL和10μg/mL，PBST的洗涤次数分别增加为9次，12次和15次。
实施例2：针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体阳性噬菌体克隆的鉴定
从上述实施例1中第三轮和第四轮噬菌体滴度平板上随机挑取48个克隆，接种于2×YT-A培养基，37℃振荡培养过夜；按1％接种量(v/v)接种于1mL 2×YT-AG培养基，37℃振荡培养至OD600约为0.5；加入辅助噬菌体M13K07，37℃振荡培养45min；将培养物3000rpm离心10min后，加入1mL 2×YT-AK培养基重悬菌体，30℃200rpm振荡培养4-5h；将培养物于4℃下10000rpm离心10min，收集噬菌体上清，采用phage-ELISA进行阳性噬菌体克隆的鉴定。
具体方法为：将Cry3Bb蛋白用0.01M PBS稀释至5μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，加入300μL的5％脱脂奶粉，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL噬菌体，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL的HRP标记M13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL TMB底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值。当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，初步判定为阳性克隆。将阳性噬菌体克隆送生物公司进行测序，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。根据核苷酸测序结果及密码子表可翻译获得Cry3Bb纳米抗体的氨基酸序列如图1所示。Cry3Bb纳米抗体包含框架区及互补决定区，其中框架区包括以下4段FR的氨基酸序列：SEQ ID NO.2所示的FR1、SEQ ID NO.4所示的FR2、SEQID NO.6所示的FR3及SEQ ID NO.8所示的FR4；所述互补决定区包括以下3段CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO.3所示的CDR1、SEQ ID NO.5所示的CDR2及SEQ ID NO.7所表示的CDR3。具体见下表：
Figure BDA0003267739580000051
实施例3：噬菌体展示纳米抗体的扩增及活性鉴定
(1)噬菌体展示纳米抗体的扩增
将实施例2获得的阳性噬菌体克隆细胞接种于50mL2×YT-AG培养基中，37℃振荡培养至OD600约为0.5；加入辅助噬菌体M13K07，37℃振荡培养45min；将培养物10000rpm离心10min后，加入50mL 2×YT-AK培养基重悬菌体，30℃200rpm振荡培养过夜；将培养物于4℃下10000rpm离心10min，收集上清，加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀后4℃静置4h；4℃下10000rpm离心10min，弃上清，将沉淀重悬于0.5mL PBS(0.01M，pH 7.4)中，再加入0.5mL甘油于-80℃保存备用。
(2)扩增噬菌体展示纳米抗体结合活性的鉴定
将Cry3Bb蛋白用0.01M PBS稀释至1μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，加入300μL的5％BSA，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL倍比稀释的噬菌体展示纳米抗体(1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL的HRP标记M13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL TMB底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值。选择吸收值在1.0-1.5之间的稀释倍数为扩增噬菌体展示纳米抗体的最适稀释倍数。
将Cry3Bb蛋白倍比稀释(1000ng/mL、500g/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL)后加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，加入300μL的5％BSA，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL上述最适稀释倍数的噬菌体展示纳米抗体，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL的HRP标记M13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL TMB底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值，结果如图2所示。
实施例4：针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体在大肠杆菌中的表达及纯化
将噬菌粒载体上的纳米抗体基因亚克隆至表达载体pET-30a中，再将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，将细胞培养后涂布于LB-K平板，37℃培养过夜；从LB-K平板上挑取单菌落接种于5mLLB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB-KG培养基中，37℃，200rpm振荡培养；当培养物菌体浓度OD600达到0.5时，向培养物中加入终浓度为0.1mM的IPTG，30℃，200rpm振荡培养过夜；将培养物于4℃，8000rpm离心15min收集菌体沉淀；重悬细胞于5mL预冷的PBS溶液，超声破碎10min后，8000rpm离心15min取上清，即得纳米抗体粗提液；将纳米抗体粗提液经镍柱进行纯化，得到纯度90％以上的纳米抗体蛋白。
实施例5：纳米抗体在Cry3Bb免疫检测中的应用
(1)标准曲线的建立
将Cry3Bb多克隆抗体稀释至1μg/mL，4℃包被过夜；PBST洗涤3次，加入300μL的5％BSA，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL不同浓度的Cry3Bb蛋白标准品，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入实施例3获得的噬菌体展示纳米抗体/实施例4获得的纳米抗体蛋白，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入HRP标记的抗M13二抗/抗His标签二抗，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μLTMB底物溶液，显色15min，在450nm波长处读取吸收值，建立ELISA标准曲线。
(2)样品的检测
称取1g待检样品(市售玉米)，粉碎后加入5mLPBS溶液，充分振荡1h；10000rpm离心10min后，取上清液用滤纸进行过滤，取1mL滤液与1mLPBS混匀，即为样品提取液。用样品提取液替代上述Cry3Bb蛋白标准品，按照标准曲线方法进行操作，根据标准曲线推算出样品中Cry3Bb蛋白的含量。
以上所述的实施方式，并不构成对该技术方案保护范围的限定。任何在上述实施方式的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在该技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包含框架区及互补决定区，其中框架区包括以下4段FR的氨基酸序列：SEQ ID NO.2所示的FR1、SEQ ID NO.4所示的FR2、SEQ ID NO.6所示的FR3及SEQ ID NO.8所示的FR4；所述互补决定区包括以下3段CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO.3所示的CDR1、SEQ ID NO.5所示的CDR2及SEQ ID NO.7所表示的CDR3。
3.一种编码如权利要求1-2任一所述针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体的核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求3所述的核苷酸。
5.一种重组工程菌，其特征在于，包含如权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种如权利要求1-2任一项所述针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体在Cry3Bb免疫学检测分析中的应用。
7.一种如权利要求1-2任一项所述的针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：Cry3Bb纳米抗体的淘选；
S2：Cry3Bb纳米抗体阳性噬菌体克隆的鉴定；
S3：噬菌体展示纳米抗体的扩增及活性鉴定；
S4：Cry3Bb纳米抗体在大肠杆菌中的表达及纯化。
8.根据权利要求7所述的一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述S1中重复进行多轮淘选，其中多轮淘选过程中包被的Cry3Bb蛋白的浓度依次减少，PBST的洗涤次数依次增加。
9.根据权利要求7所述的一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述S2采用phage-ELISA进行阳性噬菌体克隆的鉴定，当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，初步判定为阳性克隆。
10.根据权利要求7所述的一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述S4的具体步骤为：
S41：将噬菌粒载体上的纳米抗体基因亚克隆至表达载体pET-30a中，获得重组表达载体；
S42：将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，培养后涂布于LB-K平板，继续培养；
S43：从LB-K平板上挑取单菌落接种于LB培养基中进行培养，将培养物接种于LB-KG培养基中；
S44：当培养物菌体浓度OD600达到0.5时，向培养物中加入IPTG，振荡培养；
S45：将S44获得的培养物离心收集菌体沉淀，重悬细胞于PBS溶液，超声破碎后，离心取上清，即得纳米抗体粗提液；
S46：将纳米抗体粗提液经镍柱进行纯化，得到纯化的纳米抗体蛋白。
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