CN113754762B - 一种抗Cry3Bb蛋白单域重链抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗Cry3Bb蛋白单域重链抗体及其应用，属于基因工程抗体和食品生物技术领域。该单域重链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所述，本发明提供的单域重链抗体可以有效结合Cry3Bb蛋白，可应用于Cry3Bb的免疫学检测，该单域重链抗体具有结合活性高、制备简单、稳定性好等特点。

Description

一种抗Cry3Bb蛋白单域重链抗体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程抗体和食品生物技术领域，具体涉及一种抗Cry3Bb蛋白单域重链抗体及其应用。

背景技术

Cry蛋白(crystal protein)是一类杀虫蛋白，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种昆虫具有高效毒杀作用，被广泛用作生物杀虫剂和转基因杀虫成分，常见的Cry蛋白包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry2A和Cry3Bb等。不同种类的Cry蛋白杀虫谱不同，Cry3Bb主要对鞘翅目昆虫如马铃薯甲虫有毒力。近年来，转基因农作物的种植面积呈快速增长趋势，但转基因农作物的安全性并未得到广泛认同，转基因农作物可能对生态环境和人体健康造成潜在危害。为安全起见，许多国家已经对转基因产品实行了标签制度。因此，对转基因农作物及其产品中的Cry蛋白进行有效监控和快速检测是十分必要的。

Cry蛋白的检测方法主要是基于核酸和蛋白质水平的分析，包括PCR方法和ELISA方法。PCR方法具有灵敏度高、准确性高等特点，但不能对表达的Cry蛋白进行定量检测，且需要专业的仪器设备和操作人员。而ELISA方法具有简便、快速、低耗等特点，适合于农作物和环境中Cry蛋白的现场快速定性和定量检测。其中，高特异性、高亲和性抗体的制备是ELISA方法建立的前提和关键。

单域重链抗体(VHH)，源于驼科动物(骆驼、羊驼等)体内缺失轻链的重链抗体，是目前已知最小的功能性抗体片段，只含有3个互补决定区(Complementarity-determiningregion,CDR)，却具有与普通抗体相同的抗体功能。与普通抗体相比，单域重链抗体的CDR3更长，可以形成凸环结构，能够伸入目标蛋白的凹槽、裂缝等普通抗体难以达到的表位。同时，单域重链抗体还具有高亲和力、高水溶性、易表达等特点。因此，单域重链抗体是一种优良的抗体材料；然而到目前为止，暂未见抗Cry3Bb蛋白单域重链抗体的报道。

发明内容

本发明的目的是通过噬菌体展示单域重链抗体库筛选，获得针对Cry3Bb蛋白的单域重链抗体。

本发明提供了一种抗Cry3Bb蛋白单域重链抗体,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所提及的单域重链抗体包括四个框架区FR和三个互补决定区CDR。其中，框架区(FR1-FR4)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.8所示；互补决定区(CDR1-CDR3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQID NO.7所示。

本发明同时提供了编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示抗Cry3Bb单域重链抗体的核苷酸，其序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，其含有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组工程菌，其含有所述重组表达载体。

本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的单域重链抗体在Cry3Bb蛋白检测中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明制备的单域重链抗体可替代传统抗体，应用于Cry3Bb蛋白的免疫学检测分析，该单域重链抗体具有结合活性性高、稳定性高、易规模化制备等特点。

附图说明

图1单域重链抗体的氨基酸序列示意图；

图2单域重链抗体与Cry3Bb蛋白的分子对接示意图；

图3单域重链抗体结合活性测定结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。

实施例1抗Cry3Bb单域重链抗体的淘选

将Cry3Bb蛋白用10mM PBS(pH 7.4)稀释至100μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；用PBST(10mM PBS，pH 7.4，含0.1％Tween-20)洗涤6次，加入300μL的3％BSA-PBS(3％OVA-PBS)，37℃封闭2h；PBST洗板6次，加入100μL的噬菌体展示天然单域重链抗体库(滴度约2.0×10¹¹pfu)，37℃孵育1h；PBST洗涤6次，加入100μL的Glycine-HCl(0.2M,pH2.2)洗脱8min后，立即加入15μL Tris-HCl(1M，pH 9.0)中和，取10μL洗脱噬菌体测滴度，其余的感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1进行扩增，扩增噬菌体经PEG/NaCl纯化后用于下一轮的淘选。

随后重复进行3轮淘选，淘选步骤与第一轮基本相同，包被的Cry3Bb蛋白的浓度分别减少为50μg/mL，25μg/mL和10μg/mL，PBST的洗涤次数分别增加为9次，12次和15次。

实施例2抗Cry3Bb单域重链抗体阳性噬菌体克隆的鉴定

从上述实施例1中第三轮和第四轮噬菌体滴度平板上随机挑取48个克隆，接种于2×YT-A培养基，37℃振荡培养过夜；按1％接种量(v/v)接种于1mL 2×YT-AG培养基，37℃振荡培养至OD600约为0.5；加入辅助噬菌体M13K07，37℃振荡培养45min；将培养物3000rpm离心10min后，加入1mL 2×YT-AK培养基重悬菌体，30℃200rpm振荡培养4-5h；将培养物于4℃下10000rpm离心10min，收集噬菌体上清，采用phage-ELISA进行阳性噬菌体克隆的鉴定。

具体方法为：将Cry3Bb蛋白用10mM PBS稀释至5μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，加入300μL的5％脱脂奶粉，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL噬菌体，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL的HRP标记M13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL TMB底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值。当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，初步判定为阳性克隆。将阳性噬菌体克隆送生物公司进行测序，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。根据核苷酸测序结果及密码子表可翻译获得Cry3Bb单域重链抗体的氨基酸序列如图1所示。

实施例3抗Cry3Bb单域重链抗体的同源建模及与Cry3Bb蛋白的分子对接

将实施例2中的抗Cry3Bb单域重链抗体氨基酸序列提交SWISS-MODEL网站(网址为http://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模，获得其三维结构模型；从NCBI数据库下载Cry3Bb蛋白的三维结构模型；随后利用ZDOCK网站(网址为http://zdock.umassmed.edu/)进行两个模型的分子对接，获得抗Cry3Bb单域重链抗体与Cry3Bb蛋白的复合物结构模型。三维结构模型采用PyMOL软件进行分析，抗Cry3Bb单域重链抗体(VHH)与Cry3Bb蛋白分子对接分析结果见图2,结果初步表明抗Cry3Bb单域重链抗体能够与Cry3Bb蛋白结合。

实施例4噬菌体展示单域重链抗体的扩增及活性鉴定

(1)噬菌体展示单域重链抗体的扩增

将实施例2获得的阳性噬菌体克隆细胞接种于50mL 2×YT-AG培养基中，37℃振荡培养至OD600约为0.5；加入辅助噬菌体M13K07，37℃振荡培养45min；将培养物10000rpm离心10min后，加入50mL 2×YT-AK培养基重悬菌体，30℃200rpm振荡培养过夜；将培养物于4℃下10000rpm离心10min，收集上清，加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀后4℃静置4h；4℃下10000rpm离心10min，弃上清，将沉淀重悬于0.5mL PBS(10mM，pH 7.4)中，再加入0.5mL甘油，即得到扩增后的噬菌体展示单域重链抗体，-80℃保存备用。

(2)噬菌体展示单域重链抗体结合活性的鉴定

将Cry3Bb蛋白稀释至1μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，加入300μL的5％BSA，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL倍比稀释的上述噬菌体展示单域重链抗体(1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL的HRP标记M13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μLTMB底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值。选择吸收值在1.0-1.5之间的稀释倍数为扩增噬菌体展示单域重链抗体的最适稀释倍数。

将Cry3Bb蛋白倍比稀释(1000ng/mL、500g/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL)后加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，加入300μL的5％BSA，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL上述最适稀释倍数的噬菌体展示单域重链抗体，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL的HRP标记M13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL TMB底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值，结果如图3所示。从图中可见，噬菌体展示单域重链抗体能够结合Cry3Bb蛋白，活性测定曲线在15.63ng/mL-1000ng/mL范围内具有较好的线性。

实施例5抗Cry3Bb单域重链抗体在大肠杆菌中的表达及纯化

将实施例2中阳性噬菌体克隆携带的单域重链抗体基因亚克隆至表达载体pET-25b中，再将重组表达载体转化至肠杆菌Rosetta感受态细胞中，将细胞培养后涂布于LB-A平板，37℃培养过夜；从平板上挑取单菌落接种于5mL LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB-AG培养基中，37℃，200rpm振荡培养；当培养物菌体浓度OD600达到0.5时，向培养物中加入终浓度为0.1mM的IPTG，30℃，200rpm振荡培养过夜；将培养物于4℃，8000rpm离心15min收集菌体沉淀；重悬细胞于5mL预冷的PBS溶液，超声破碎10min后，8000rpm离心15min取上清，即得单域重链抗体粗提液；将上清经镍柱进行纯化，得到纯度90％以上的单域重链抗体蛋白。

实施例6单域重链抗体在Cry3Bb免疫检测中的应用

(1)标准曲线的建立

将抗Cry3Bb单克隆抗体稀释至1μg/mL，4℃包被过夜；PBST洗涤3次，加入300μL的5％BSA，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL不同浓度的Cry3Bb蛋白标准品，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入实施例3获得的噬菌体展示单域重链抗体/实施例4获得的单域重链抗体蛋白，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入HRP标记的抗M13二抗/抗His标签二抗，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL TMB底物溶液，显色15min，在450nm波长处读取吸收值，建立ELISA标准曲线。

(2)样品的检测

称取1g待检样品(市售玉米)，粉碎后加入5mL PBS溶液，充分振荡1h；10000rpm离心10min后，取上清液用滤纸进行过滤，取1mL滤液与1mL PBS混匀，即为样品提取液。用样品提取液替代上述Cry3Bb蛋白标准品，按照标准曲线方法进行操作，根据标准曲线推算出样品中Cry3Bb的含量。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 一种抗Cry3Bb蛋白单域重链抗体及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Ala Thr Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Leu Ala Arg Gly Arg Asp Arg Arg Thr Asn

            20                  25                  30

Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val

        35                  40                  45

Ala Ala Ile Asp Thr Arg Thr Gly Val Ala Val Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Gly Arg Thr Tyr Asp Arg Ser Trp Lys Pro Leu Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

        115

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Ala Thr Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Leu Ala Arg

            20                  25

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 3

Gly Arg Asp Arg Arg Thr Asn Tyr

1               5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 4

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val Ala

1               5                   10                  15

Ala

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 5

Ile Asp Thr Arg Thr Gly Val Ala

1               5

<210> 6

<211> 38

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 6

Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1               5                   10                  15

Pro Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp

            20                  25                  30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

        35

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 7

Ala Lys Gly Arg Thr Tyr Asp Arg Ser Trp Lys Pro

1               5                   10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 8

Leu Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

<210> 9

<211> 357

<212> DNA

<213> Lama pacos

<400> 9

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtggcca ctggagggtc tctgaaactc 60

tcctgtctag cccgtggaag ggaccgtcgt accaactaca tggcctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgcgaaat agtcgcggca attgacacgc gtactggtgt cgcagtctat 180

gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca accccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaattga acagcctgaa aactgaggac acggccatgt attactgtgc aaaaggccgg 300

acttacgatc gtagctggaa acccctgggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357

Claims (4)

1. 一种抗Cry3Bb单域重链抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 一种编码如权利要求1所述单域重链抗体的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.一种重组表达载体，其含有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

4.一种重组工程菌，其含有权利要求3所述重组表达载体。

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