CN114106166B - 人源抗新冠病毒中和性抗体d2及其应用 - Google Patents
人源抗新冠病毒中和性抗体d2及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了人源抗新冠病毒中和性抗体D2及其应用。本发明利用噬菌体抗体库技术，成功获得一株特异性针对新型冠状病毒表面抗原的人源中和性抗体D2；且其在体外具有阻止新型冠状病毒感染敏感细胞的中和功能，在宿主中表达量高，对抗原亲和力高。利用上述方法获得的人源中和性抗新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及上述每个抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产此抗体或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其他基因，获得具有中和新型冠状病毒感染的抗体产物，制成临床上用于预防和治疗新型冠状病毒肺炎的特异性抗体药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及人源抗新冠病毒中和性抗体D2及其应用。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β属冠状病毒，是一种单股正链RNA病毒，可导致人类病毒性肺炎或肺部感染。冠状病毒基因组依次编码棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中刺突蛋白（Spike）是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基S1和S2，其中S1主要包含受体结合区（RBD），负责识别细胞的受体。新冠病毒刺突蛋白与人血管紧张素转化酶2（ACE2）互作来感染人的呼吸道上皮细胞。由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）感染引起的新型冠状病毒肺炎，对人类健康构成了严重威胁，同时新冠病毒基因不断突变，新的变异株不断出现（如Dalta、Omicron）。迄今为止，可以发现以下特点：1）新冠病毒感染和其他呼吸道病毒感染一样，是反复感染的；存在大量的无症状感染者；2）突变株的不断出现，SARS-CoV-2刺突蛋白（S）上的突变可对SARS-CoV-2的感染性、致病性产生较大影响，尤其是德尔塔毒株。3）尽管多种疫苗已上市，但仍应该研究更多的应对策略以期扼制SARS-CoV-2传播。全球多个研究团队及药物研发企业广泛合作开展多方面的针对新冠预防和治疗药物研发。
发明内容
本发明的目的是提供人源抗新冠病毒中和性抗体D2及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供人源抗新冠病毒中和性抗体D2，其轻链及重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下：
抗体D2的轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
第二方面，本发明提供编码抗体D2的核酸分子。其中，编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。
第三方面，本发明提供含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第四方面，本发明提供抗体D2经改造得到的单链抗体或全抗体。
第五方面，本发明提供用于预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病的药物，其有效成分为抗体D2或抗体D2经改造得到的单链抗体或全抗体。
第六方面，本发明提供一种新冠病毒检测试剂，其包含抗体D2或抗体D2经改造得到的单链抗体或全抗体。
第七方面，本发明提供抗体D2或抗体D2经改造得到的单链抗体或全抗的以下任一应用：
1）用于制备预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病的药物；
2）用于制备新冠病毒检测试剂或试剂盒；
3）用于预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病；
4）用于检测新冠病毒。
所述新冠病毒包括但不限于SARS-CoV-2野生株、Delta变体、Beta变体、Alpha变体、Omicron变体。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用噬菌体抗体库技术，成功获得一株特异性针对新型冠状病毒表面抗原的人源中和性抗体D2；且其在体外具有阻止新型冠状病毒感染敏感细胞的中和功能，在宿主中表达量高，对抗原亲和力高。利用上述方法获得的人源中和性抗新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及上述每个抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产此抗体或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其他基因，获得具有中和新型冠状病毒感染的抗体产物，制成临床上用于预防和治疗新型冠状病毒肺炎的特异性抗体药物。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中18株单克隆细菌裂解液中Fab抗体结合活性。
图2为本发明较佳实施例中人源中和性抗体D2的SDS-PAGE纯化胶图。
图3为本发明较佳实施例中抗体D2与变异株抗原结合活性验证。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW，Molecular Cloning: a Laboratory Manual，2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 人源抗新冠病毒中和性抗体D2的制备及功能
一、材料
1. 样本、载体：新冠病毒抗体阳性血清及淋巴细胞：由武汉市疾病预防控制中心、山东省疾病预防控制中心提供。菌株为XLI-Blue（美国Stratagene），载体为pComb3H(40kb)，由美国Scripps研究所惠赠。
2. 抗原：新型冠状病毒野生株S1蛋白和RBD蛋白，新型冠状病毒Delta变体S1蛋白和RBD蛋白，Beta变体S1蛋白，Alpha变体S1蛋白由东抗生物有限公司提供，新型冠状病毒Omicron变体S1蛋白和RBD蛋白由北京义翘神州科技股份有限公司惠赠。
二、方法
1. 人源抗新冠病毒表面抗原抗体库的构建与筛选
1.1 噬菌体抗体库的构建
用淋巴细胞分离液（美国Sigma）从具有高滴度新冠病毒抗体的疫苗注射者的抗凝血液中分离淋巴细胞，用RNeasy Mini Kit (德国QIAGEN) 提取总细胞RNA，用Oligo-dT引物将提取的RNA采用Invitrogen公司的第一链合成试剂盒(SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR. Cat No.18080-051)逆转录成cDNA，用一组扩增人源抗体IgG1重链Fd及轻链Kappa（κ链）和Lambda（λ链）引物，对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为： 94℃ 1min，52℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环。建库方法基本按文献进行（Barbas, C. FⅢ., Kang, A. S., and larner, R. A. Assembly ofcombinatorial antibody libraries on phage surface: the geneⅢ site.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18): 7978-7982）。
1.2 噬菌体抗体库的富集筛选及Fab段抗体的诱导表达
筛选抗原为纯化新型冠状病毒Delta变体S1蛋白。使用0.1M NaHCO3 (pH8.6) 的溶液稀释抗原，包被免疫孔，每孔150µl；用含2 %脱脂奶的PBST，37 ℃封闭2 h后，加入上述噬菌体抗体库，每孔150μl，37 ℃孵育2 h，用5 % Tween-20-PBST 反复洗10 遍；最后每孔用150μl pH2.2的甘氨酸-盐酸洗脱液洗脱，pH9.6的Tris液中和；洗脱后的噬菌体继续感染20ml新鲜的OD600 = 0.5左右的XL1-Blu菌，经辅助噬菌体VCSM13 (美国Stratagene) 感染后进行下一轮筛选。如此反复筛选3次。具体富集筛选方法及Fab段的诱导表达基本按文献进行（Barbas, C. FⅢ., Kang, A. S., and larner, R. A. Assembly ofcombinatorial antibody libraries on phage surface: the geneⅢ site.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18): 7978-7982）。
2. 新冠病毒表面抗原基因工程Fab抗体的检测
2.1 Fab抗体表达的检测
用0.1 m/L NaHCO3（pH9.6）的溶液包被抗人Fab抗体（美国Sigma，1:2000稀释使用）于酶标板，4℃过夜；5%脱脂奶封闭，37℃ 1h，加入表达的Fab抗体（用PBS按1:1000稀释后检测），37℃ 1h；加入酶标抗人Fab二抗（美国Sigma，1:2000稀释使用），37℃1h；显色液显色，2M H2SO4终止反应，酶标仪检测吸光度A值。
2.2 间接ELISA检测Fab抗体与新型冠状病毒表面抗原结合活性
用纯化新型冠状病毒野生株RBD蛋白，Delta变体S1蛋白，Beta变体S1蛋白作为包被抗原，后续步骤同上。
3. 人源Fab抗体可变区基因的核酸序列分析：
用Qiagen Miniprep Kit (德国 QIAGEN) 制备质粒DNA进行核酸序列分析。轻重链的测序引物分别为5＇-ATTGAATTCAGGAGGAA-3＇和5＇-TGAAATACCTATTGCCTA -3＇。测序结果和Internet V-Base基因库中IgG基因序列比较。
4. 全抗体重组表达质粒的构建与表达纯化
4.1 全抗体重组表达质粒的构建
参照V-base中抗体序列，设计引物扩增出Fab抗体轻重链可变区基因片段，在κ链5’和3’端引入Age1/BsiW1酶切位点，λ链5’和3’端引入Age1/Xho1酶切位点，重链5’和3’端引入Age1/Sal1酶切位点，分别将轻重链克隆到全长抗体载体-米歇尔系列(清华赠送）载体中，构建成全抗体表达载体。
4.2 全抗体表达及纯化
取构建好表达质粒与1mg/mL聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)溶液1:5（w/v）混合后，瞬时转染密度为2×106的Expi293F细胞，37℃孵育120rpm培养4天后，采用GE公司的Protein-G亲和层析柱分别纯化收集上清。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分析抗体纯度，利用BCATM protein assay kit(Thermo,美国)检测抗体浓度。
5. 新冠病毒表面抗原基因工程抗体的功能检测
5.1 BIAcore法测定抗体亲和力：
表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）是一种光学物理现象。当一束偏 振光在一定的角度范围内入射到棱镜端面，在棱镜与金属薄膜的界面将产生表面等离子波。当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数相匹配时，引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子共振。运用SPR技术，可以免标记实时得到分子间互相作用。分析时，先将偶联物偶联到芯片上，然后将分析物流过芯片表面，若偶联物与分析物有结合活性，则会引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，并以Biacore的响应信号值RU来呈现。通过检测SPR角度变化，获得动力学常数（结合速率常数（ka）、解离速率常数（kd）、亲和力常数（KD））和特异性等信息。
数据结果处理使用Biacore Insight Evaluation 程序软件输出原始数据，并进行1:1 Binding结合模式进行动力学拟合分析。根据拟合结果得到结合速率常数（ka）和解离速率常数（kd）以及亲 和力常数（KD）。
5.2. 抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体中和活性
Beta（保藏中心编号HB0000035；原始编号YC0517002C1），Delta（保藏中心编号HB0000039；原始编号244752C1）。
Vero细胞由中国生物技术股份有限公司提供，病毒使用标准株（WIV04，P16），Delta株（HB0000039，P13），Beta株（HB0000035，P12），Omicron株（WIBP 001，PX+2）。纯化单抗进行2倍梯度稀释，取50ul稀释抗体与等体积2000TCID50/ml病毒混合，37℃孵育2h；使用上述混合物感染：vero细胞，37℃，5%CO2培养箱培养，96h观察CPE，记录细胞病变孔数，按Reed and Muench法计算IC50。
5.3 ELISA检测抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体与抗原结合活性
用纯化新型冠状病毒野生株S1蛋白和RBD蛋白、Delta变体S1蛋白，Beta变体S1蛋白，Alpha变体S1蛋白，Omicron变体S1蛋白包被ELISA板，分别检测纯化单抗与上述抗原的结合活性。5%脱脂奶封闭包被抗原板，37℃ 1h，加入表达的IgG抗体（用PBS稀释后检测），37℃ 1h；加入酶标抗人Fc二抗（美国Sigma，1:2000稀释使用），37℃1h；显色液显色，2M H2SO4终止反应，酶标仪检测吸光度A值。
三、结果
1. 人源抗新冠病毒表面抗原抗体库的构建与筛选
1.1 人源抗新冠病毒表面抗原抗体库的构建
成功构建了4个Kappa库和1个Lambda库，库容量在1×107以上，轻重链插入率在90%以上。分别对Kappa子库和Lambda子库进行包装，再按1:1比例混合，用纯化新型冠状病毒Delta变体S1蛋白，经过三轮筛选洗脱库容逐渐增加挑取200个克隆， ELISA检测并测序共发现18株序列不同的抗体克隆，如表1所示。
表1 抗体库包装和富集筛选产出量
1.2 人源抗新冠病毒Fab抗体对新冠表面抗原的特异性结合
18株唯一克隆Fab诱导裂解液中抗人Fab和新冠野生株RBD抗原、Delta变体S1抗原，Beta变体S1抗原ELISA检测结果显示（图1），其中D2号野生株RBD抗原、Delta变体S1抗原，Beta变体S1抗原，Alpha变体S1抗原结合活性均较高，因此选择这株构建IgG全抗体。
2. 人源抗新冠病毒表面抗原抗体的序列分析
用DNAstar Lasergene软件分析，并与Internet V-Base基因库中的IgG序列进行比较，筛选出的18株序列不同的Fab抗体。共计4条重链，18条轻链。其中一株重链可变区的分类在VH3，轻链可变区的分类在VL1，命名为D2。
3. 全抗体重组表达质粒的构建与表达纯化
将D2抗体的轻链和重链Fd段基因，分别克隆入全抗体表达载体后瞬时转染Expi293F细胞，利用该哺乳动物细胞系统实现全抗体IgG的分泌表达。采用GE公司的Protein-G亲和层析柱直接纯化表达上清，通过SDS-PAGE检验全抗体IgG的表达及纯化情况，结果证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻、重链，分别位于约28kD、55kD处（图2）。
4. 新冠病毒表面抗原基因工程抗体的功能检测
4.1 亲和力测定
利用生物传感器BIAcoreTM 8000测定人源单抗的亲和力，生物传感器工作的原理和基本过程概括起来就是利用表面等离子共振 (surface plasmon resonance) 现象监测传感片表面介质的折射率变化所引发的共振角改变，而这一改变与传感片表面结台的生物大分子的量成正比，溶液中游离的分子不影响共振角的大小，因此非常特异、敏感。用生物传感器检测任何生物大分子间的相互作用都要经过这样几个步骤：结合，解离，再生。本文使用纯化的新冠Delta变体RBD蛋白和Omicron变体RBD蛋白作为抗原偶联至生物传感芯片来测定人源单抗的亲和力，亲和常数用Biacore Insight Evaluation计算，如表2所示。D2针对新冠Delta变体RBD蛋白和Omicron变体RBD蛋白的亲和力分布为KD=6.21×10-11 M，KD=1.1×10-11 M。
表2 表面等离子共振技术测定抗体亲和力
4.2 中和实验
活病毒中和实验表明D2号抗体具有中和活性，对WIV04株，beta变异株，Delta变体和Omicron变体的IC50值分布为＜0.39μg/ml、0.78μg/mL、＜0.39μg/ml、0.78μg/mL，中和活性较好（表3）。
表3 纯化D2抗体中和试验结果
注：“－”表示没有CPE，“＋”表示有CPE。
4.3 ELISA检测抗体与新冠病毒表面抗原结合活性
D2号抗体与新型冠状病毒野生株RBD蛋白及S1蛋白、Alpha变体S1蛋白、Beta变异株S1蛋白、Delta变异体S1蛋白、Omicron变体S1蛋白均可结合，并与上述蛋白均有良好的结合活性（图3）。D2号抗体与新冠病毒表面抗原结合活性ELISA检测结果见表4。
表4 ELISA检测结果
从以上实验结果可以看出，本发明运用噬菌体抗体库技术，成功地获得了一株特异性针对新型冠状病毒表面抗原的人源中和性抗体D2；且其在体外具有阻止新型冠状病毒感染敏感细胞的中和功能，在宿主中表达量高，对抗原亲和力高。利用上述方法获得的人源中和性抗新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及上述每个抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产此抗体或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其他基因，获得具有中和新型冠状病毒感染的抗体产物，制成临床上用于预防和治疗新型冠状病毒肺炎的特异性抗体药物。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120> 人源抗新冠病毒中和性抗体D2及其应用
<130> KHP221110198.5YS
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Ala Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asp Asn
20 25 30
Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Leu Tyr Asp Asp Ala Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asn Ser Leu
85 90 95
Asn Val Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Trp Asn Ser Gly Val Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu His Met Arg Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Val Tyr Ser Glu Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcgccatc 60
tcctgctctg gaagcacctc caacattggg gataattttg tatcctggta ccagcagttc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcctttat gacgatgcta ggcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgttta tttctgcagt acttgggata acagtctgaa tgtcgtcctt 300
ttcggcggag ggaccaagtt gaccgtcctg 330
<210> 4
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggccggtc cctgacactc 60
tcctgtggag cctctggatt cacctttgag gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attgattgga acagtggtgt tataggctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcatcatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcacatga gaagtctgac agcagaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatgta 300
tatagcgaat cgggttcggg gagttattac gactattggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcctca 369
Claims (10)
1.人源抗新冠病毒中和性抗体，其特征在于，其轻链及重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下：
轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为TSNIGDNF、DDA和STWDNSLNVVL；
重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GFTFEDYA、IDWNSGVI和AKDVYSESGSGSYYDY。
2.根据权利要求1所述的中和性抗体，其特征在于，其轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
3.编码权利要求1或2所述中和性抗体的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。
5.含有权利要求3或4所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
6.权利要求1或2所述中和性抗体经改造得到的单链抗体。
7.用于预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病的药物，其特征在于，有效成分为权利要求1或2所述中和性抗体或权利要求6所述单链抗体。
8.新冠病毒检测试剂，其特征在于，其包含权利要求1或2所述中和性抗体或权利要求6所述单链抗体。
9.权利要求1或2所述中和性抗体或权利要求6所述单链抗体的以下任一应用：
1）用于制备预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病的药物；
2）用于制备新冠病毒检测试剂或试剂盒。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述新冠病毒包括SARS-CoV-2野生株、Delta变体、Beta变体、Alpha变体、Omicron变体。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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