CN112341541B - 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-163及其应用 - Google Patents

人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-163及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV‑163及其应用。本发明利用噬菌体抗体库技术，成功获得一条特异性针对新型冠状病毒表面抗原的人源中和性抗体nCoV‑163，其在体外具有阻止新型冠状病毒感染敏感细胞的中和功能，对抗原亲和力高，有望制成临床上用于预防和治疗新型冠状病毒肺炎的特异性抗体药物。

Description

人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-163及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-163及其应用。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2是在2019年发现的一种新病毒，可导致人类病毒性肺炎或肺部感染。冠状病毒基因组依次编码棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中刺突蛋白(Spike)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基S1和S2，其中S1主要包含受体结合区(RBD)，负责识别细胞的受体。新冠病毒刺突蛋白与人血管紧张素转化酶2(ACE2)互作来感染人的呼吸道上皮细胞。
尽管瑞德西韦、羟氯喹、洛匹那韦与干扰素β1a等多种药物在体外被证明对抗新冠有效，但据WHO最新研究表明这些药物都不能显著降低新冠病毒的死亡率，也没有改善患者的治疗过程。因此开发具有中和活性的单克隆抗体以及多种单抗联合治疗的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-163及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-163，其轻链及重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下：
Figure BDA0002793911240000011
抗体nCoV-163的轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
第二方面，本发明提供编码抗体nCoV-163的核酸分子。其中，编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。
第三方面，本发明提供含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第四方面，本发明提供抗体nCoV-163经改造得到的单链抗体或全抗。
第五方面，本发明提供用于预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病的药物，其有效成分为抗体nCoV-163或抗体nCoV-163经改造得到的单链抗体或全抗。
在本发明的一个具体实施方式中，全抗体IgG的轻链和重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-6所示，编码轻链和重链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示。
第六方面，本发明提供一种新冠病毒检测试剂，其包含抗体nCoV-163或抗体nCoV-163经改造得到的单链抗体或全抗。
第七方面，本发明提供抗体nCoV-163或抗体nCoV-163经改造得到的单链抗体或全抗的以下任一应用：
1)用于制备预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病的药物；
2)用于制备新冠病毒检测试剂或试剂盒；
3)用于预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病；
4)用于检测新冠病毒。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用噬菌体抗体库技术，成功获得一条特异性针对新型冠状病毒表面抗原的人源中和性抗体nCoV-163，其在体外具有阻止新型冠状病毒感染敏感细胞的中和功能，对抗原亲和力高。利用上述方法获得的人源中和性抗新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及上述每个抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产此抗体或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其他基因，获得具有中和新型冠状病毒感染的抗体产物，可制成临床上用于预防和治疗新型冠状病毒肺炎的特异性抗体药物。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中12株单克隆细菌裂解液中Fab抗体滴度。
图2为本发明较佳实施例中人源中和性抗体nCoV-163的SDS-PAGE纯化胶图。
图3为本发明较佳实施例中抗体nCoV-163中和新型冠状病毒(活病毒)分析结果。
图4为本发明较佳实施例中抗体nCoV-163与新冠病毒表面抗原结合活性ELISA检测结果。
图5为本发明较佳实施例中抗体nCoV-163与新冠病毒表面抗原结合活性IFA检测结果。
图6为本发明较佳实施例中抗体nCoV-163与新冠病毒S蛋白结合活性流式细胞术检测结果。
图7为本发明较佳实施例中抗体nCoV-163亲和力测定曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-163的制备及功能
一、材料
1.样本、载体：新冠病毒抗体阳性血清及淋巴细胞：由武汉疾控、山东疾控提供。菌株XLI-Blue购自美国Stratagene公司，抗体库构建载体pComb3H(40kb)由美国Scripps研究所惠赠。
2.抗原：新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白由华兰生物工程股份有限公司提供，新型冠状病毒S蛋白三聚体由江苏东抗生物医药科技有限公司提供，RBD蛋白表达质粒、S蛋白全长表达质粒(参见Chi X,Yan R,Zhang J,Zhang G,Zhang Y,Hao M,Zhang Z,Fan P,DongY,Yang Y,Chen Z,Guo Y,Zhang J,Li Y,Song X,Chen Y,Xia L,Fu L,Hou L,Xu J,Yu C,Li J,Zhou Q,Chen W.Aneutralizing human antibody binds to the N-terminaldomain of the Spike protein of SARS-CoV-2.Science.2020 Aug7；369(6504):650-655.doi:10.1126/science.abc6952.Epub 2020Jun 22.PMID:32571838；PMCID:PMC7319273)由清华大学史宣玲教授惠赠。
3.新冠病毒：实验使用的新冠病毒19nCoV-CDC-Tan-Strain(HB02)由中国疾病预防控制中心病毒病所分离并保存。
二、方法
1.人源抗新冠病毒表面抗原抗体库的构建与筛选
1.1噬菌体抗体库的构建
用淋巴细胞分离液(美国Sigma)从新型冠状病毒患者恢复期外周血液中分离淋巴细胞，用RNeasy Mini Kit(德国QIAGEN)提取总细胞RNA，用Oligo-dT引物将提取的RNA采用Invitrogen公司的第一链合成试剂盒(SuperScriptTMⅢ First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR.Cat No.18080-051)逆转录成cDNA，用一组扩增人源抗体IgG1重链Fd及轻链Kappa和Lambda引物，对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃1min，52℃1min，72℃1min，35个循环。建库方法基本按文献进行(Barbas,C.FⅢ.,Kang,A.S.,and larner,R.A.Assembly of combinatorial antibody libraries on phagesurface:the geneⅢsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991；88(18):7978-7982)。
1.2噬菌体抗体库的富集筛选及Fab段抗体的诱导表达
筛选抗原为纯化新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白。用0.1M NaHCO3(pH8.6)溶液稀释抗原，包被96孔板免疫孔，每孔150μl；用2％脱脂奶-PBST，37℃封闭2h后，加入上述噬菌体抗体库，每孔150μl，37℃孵育2h，用5％Tween-20-PBST反复洗10遍；最后每孔用150μlpH2.2的甘氨酸-盐酸洗脱液洗脱，用pH9.6的Tris液中和；洗脱后的噬菌体继续感染20ml新鲜的OD600＝0.5左右的XL1-Blu菌，经辅助噬菌体VCSM13(美国Stratagene)感染后进行下一轮筛选。如此反复筛选3次。具体富集筛选方法及Fab段的诱导表达基本按文献进行(Barbas,C.FⅢ.,Kang,A.S.,and larner,R.A.Assembly of combinatorial antibodylibraries on phage surface:the geneⅢsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991；88(18):7978-7982)。
2.新冠病毒表面抗原基因工程Fab抗体的检测
2.1Fab抗体表达的检测
用0.1m/L NaHCO3(pH9.6)溶液包被抗人Fab抗体(美国Sigma，1:2000稀释使用)于酶标板，4℃过夜；5％脱脂奶封闭，37℃1h，加入表达的Fab抗体，37℃1h；加入酶标抗人Fab二抗(美国Sigma，1:2000稀释使用)，37℃1h；显色液显色，2M H2SO4终止反应，酶标仪检测吸光度A值。
2.2间接ELISA检测Fab抗体与新型冠状病毒表面抗原的结合活性
用纯化的新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白作为包被抗原，后续步骤同上。
3.人源Fab抗体可变区基因的核酸序列分析：
用Qiagen Miniprep Kit(德国QIAGEN)制备质粒DNA进行核酸序列分析。轻、重链的测序引物分别为5＇-ATTGAATTCAGGAGGAA-3＇和5＇-TGAAATACCTATTGCCTA-3＇。测序结果与Internet V-Base基因库(http://www.vbase2.org/)中IgG基因序列比较。
4.全抗体重组表达质粒的构建与表达纯化
4.1全抗体重组表达质粒的构建
参照V-base数据库中抗体序列，设计引物扩增出Fab抗体轻重链可变区基因片段，在κ链5’和3’端引入Age1/BsiW1酶切位点，λ链5’和3’端引入Age1/Xho1酶切位点，重链5’和3’端引入Age1/Sal1酶切位点，分别将轻重链克隆到全抗体表达载体-米歇尔系列载体(该载体由清华大学史宣玲教授惠赠，参见Chi X,Yan R,Zhang J,Zhang G,Zhang Y,Hao M,Zhang Z,Fan P,Dong Y,Yang Y,Chen Z,Guo Y,Zhang J,Li Y,Song X,Chen Y,Xia L,FuL,Hou L,Xu J,Yu C,Li J,Zhou Q,Chen W.Aneutralizing human antibody binds tothe N-terminal domain of the Spike protein of SARS-CoV-2.Science.2020Aug 7；369(6504):650-655.doi:10.1126/science.abc6952.Epub 2020Jun 22.PMID:32571838；PMCID:PMC7319273.)中，构建成全抗体表达载体。
4.2全抗体表达及纯化
取构建好表达质粒与1mg/mL聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)溶液按1:5(w/v)混合后，瞬时转染密度为2×106的Expi293F细胞，37℃孵育120rpm摇床培养4天后，采用GE公司的Protein-G亲和层析柱分别纯化收集上清。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析抗体纯度，利用BCATM protein assay kit(Thermo，美国)检测抗体浓度。
5.新冠病毒表面抗原基因工程抗体的功能检测
5.1BIAcore法测定抗体亲和力
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是一种光学物理现象。当一束偏振光在一定的角度范围内入射到棱镜端面，在棱镜与金属薄膜的界面将产生表面等离子波。当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数相匹配时，引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子共振。运用SPR技术，可以免标记实时得到分子间互相作用。分析时，先将偶联物偶联到芯片上，然后将分析物流过芯片表面，若偶联物与分析物有结合活性，则会引起金属膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，并以Biacore的响应信号值RU来呈现。通过检测SPR角度变化，获得动力学常数(结合速率常数ka、解离速率常数kd、亲和力常数KD)和特异性等信息。
数据结果处理使用Biacore Insight Evaluation程序软件输出原始数据，并进行1:1Binding结合模式进行动力学拟合分析。根据拟合结果得到结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)以及亲和力常数(KD)。
5.2抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体中和活性
Vero细胞由中国生物技术股份有限公司提供，病毒使用19nCoV-CDC-Tan-Strain(HB02，P5)。纯化单抗进行2倍梯度稀释，取50ul稀释抗体与等体积2000TCID50/ml病毒混合，37℃孵育2h；使用上述混合物感染vero细胞，37℃，5％CO2培养箱培养，96h观察细胞病变效应(CPE)，记录细胞完全保护的样本最高稀释度。
5.3ELISA检测抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体与抗原结合活性
用纯化新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白、S蛋白作为包被抗原，分别检测纯化单抗与上述抗原的结合活性，后续步骤同2.1。
5.4间接免疫荧光(IFA)检测抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体与抗原结合活性
5.4.1与新冠病毒的结合活性
将经过新冠病毒19nCoV-CDC-Tan-Strain(HB02)感染的vero细胞培养4天后制成抗原片，95％酒精，固定30分钟；加入抗体表达上清37℃孵育30分钟，洗净，吹干；加入按照1:40的比例用1:30000稀释的伊文思蓝染色液稀释的抗人Fc荧光抗体(Sigma)，37℃孵育30min，洗净，吹干。荧光显微镜检测拍照。
5.4.2与新冠病毒RBD蛋白的结合活性
取RBD蛋白表达质粒与1mg/mL聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)溶液按1:5(w/v)比例混合后，瞬时转染汇合度达80％的Expi293F细胞，置于37℃CO2孵箱，培养48h制成抗原片，后续步骤同5.4.1。
5.4.3与新冠病毒S蛋白的结合活性
取S蛋白全长表达质粒与1mg/mL聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)溶液按1:5(w/v)比例混合后，瞬时转染汇合度达80％的Expi293F细胞，置于37℃CO2孵箱，培养48h制成抗原片，后续步骤同5.4.1。
5.5流式细胞术检测检测抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体与新型冠状病毒S蛋白结合活性
取S蛋白全长表达质粒与1mg/mL聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)溶液按1:5(w/v)比例混合后，瞬时转染汇合度达80％的Expi293F细胞，置于37℃CO2孵箱，培养36h。将细胞消化下来用PBS洗3次，以20ug/ml的浓度将待测抗体加入至5.5×105个细胞中，室温孵育30min。用PBS洗3次，以1:40的浓度将抗人Fc-FITC抗体(Sigma)加入至细胞中，室温孵育30min。用PBS洗3次后用200ul的PBS将细胞重悬，随后上机检测(BD FACSAriaTMII)。
三、结果
1.人源抗新冠病毒表面抗原抗体库的构建与筛选
1.1人源抗新冠病毒表面抗原抗体库的构建
成功构建4个Kappa库和1个Lambda库，库容量在1×107以上，轻重链插入率在90％以上。分别对Kappa子库和Lambda子库进行包装，再按1:1比例混合，用纯化新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白、S2蛋白经过三轮筛选洗脱库容逐渐增加挑取600个克隆，ELISA检测并测序共发现12株序列不同的抗体克隆，如表1所示。
表1抗体库包装和富集筛选产出量
Figure BDA0002793911240000061
1.2人源抗新冠病毒Fab抗体对新冠表面抗原的特异性结合
12株克隆Fab诱导裂解液抗人Fab和新冠RBD抗原、S1抗原、S2抗原的ELISA检测结果显示(图1)，其中nCoV-163号抗体抗人Fab、新冠RBD抗原、S1抗原滴度均较高，因此选择该株构建IgG全抗体。
2.人源抗新冠病毒表面抗原抗体的序列分析
用DNAstar Lasergene软件分析，并与Internet V-Base基因库中IgG序列进行比较，筛选出的12株序列不同的Fab抗体。共计6条重链，12条轻链。其中一株重链可变区的分类在VH3，轻链可变区的分类在VK3，命名为nCoV-163。其轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示，编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。
3.全抗体重组表达质粒的构建与表达纯化
将nCoV-163抗体的轻链和重链可变区基因分别克隆入全抗体表达载体后瞬时转染Expi293F细胞，利用该哺乳动物细胞系统实现全抗体IgG的分泌表达。采用GE公司的Protein-G亲和层析柱直接纯化表达上清，用SDS-PAGE检测全抗体IgG的表达及纯化情况，结果证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻链和重链分别位于约28kD、55kD处(图2)。全抗体IgG的轻链和重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-6所示，编码轻链和重链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示。
4.新冠病毒表面抗原基因工程IgG抗体的功能检测
4.1亲和力测定
利用生物传感器BIAcoreTM 8000测定人源单抗的亲和力，生物传感器工作的原理和基本过程是利用表面等离子共振(surface plasmon resonance)现象监测传感片表面介质的折射率变化所引发的共振角改变，而这一改变与传感片表面结台的生物大分子的量成正比，溶液中游离的分子不影响共振角的大小，因此非常特异、敏感。用生物传感器检测任何生物大分子间的相互作用都要经过以下几个步骤：结合、解离及再生。本发明使用纯化的新冠S1蛋白作为抗原偶联至生物传感芯片来测定人源单抗的亲和力，亲和常数用BiacoreInsight Evaluation计算，如表2所示。nCoV-163针对新冠病毒S蛋白的亲和力KD＜4.88×10-12M(图7)。
表2表面等离子共振技术测定抗体亲和力
Figure BDA0002793911240000071
4.2中和实验
活病毒中和实验结果表明nCoV-163号抗体具有中和活性，IC50值为0.646μg/ml，中和活性较好(图3)。
4.3ELISA检测抗体与新冠病毒表面抗原结合活性
nCoV-163号抗体与新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白、S蛋白均可结合，并与上述蛋白均有良好的结合活性(图4)。
4.4免疫荧光检测基因工程抗体与新型冠状病毒、新型冠状病毒RBD蛋白及S蛋白结合活性
nCoV-163号抗体与新型冠状病毒、在细胞中表达的新型冠状病毒RBD蛋白及S蛋白间接免疫荧光检测均为阳性，表明nCoV-163号抗体可结合上述抗原(图5)。
4.5流式细胞术检测检测抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体与新型冠状病毒S蛋白结合活性
抗体nCoV-163与新冠病毒S蛋白结合活性流式细胞术检测结果如图6所示。图中横坐标为FITC荧光强度，当抗体结合于细胞表面时，可检测到FITC荧光信号。与未转染S蛋白的对照组相比，转染S蛋白的实验组可见明显的细胞分群，同型对照抗体未见分群。这表明nCoV-163号抗体可与在细胞表面中表达的新型冠状病毒S蛋白结合。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120> 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-163及其应用
<130> KHP201117132.8
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Gly Arg Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Glu Ile Ile Val Asn Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Tyr Gly Asp Phe Tyr Val Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaattgtgt tgacgcagtc tccagtcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagcatggtc ggacgttcgg ccaagggacc 300
aaggtggaaa tcaaa 315
<210> 4
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgaag cctctgaaat catcgtcaat aggaattaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaatt atatatcccg gtggtagcac attctacgca 180
gactccgtga agggcagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gatgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaagacacg gctgtgtatt actgtgcgag atcctacggt 300
gacttctacg ttgacttctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 5
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Leu
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
35 40 45
Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Gly
100 105 110
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
115 120 125
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
130 135 140
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
145 150 155 160
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
165 170 175
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
195 200 205
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
210 215 220
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 6
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Glu Ile Ile Val
35 40 45
Asn Arg Asn Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ile Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
85 90 95
Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Gly Asp Phe Tyr Val Asp Phe Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 7
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattctgaa 60
attgtgttga cgcagtctcc agtcaccctg tctttgtctc caggggaaag agccaccctc 120
tcctgcaggg ccagtcagag tgttagcagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 180
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccagca gggccactgg catcccagac 240
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 300
gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag catggtcgga cgttcggcca agggaccaag 360
gtggaaatca aacgtacggt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag 420
cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag 480
gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc 540
acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa 600
gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg 660
cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgttag 696
<210> 8
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattccgag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gggggtccct gagactctcc 120
tgtgaagcct ctgaaatcat cgtcaatagg aattacatga actgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtgggt ctcaattata tatcccggtg gtagcacatt ctacgcagac 240
tccgtgaagg gcagattcac catctccaga gacaattcca agaacacgat gtatcttcaa 300
atgaacagcc tgagagccga agacacggct gtgtattact gtgcgagatc ctacggtgac 360
ttctacgttg acttctgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagc gtcgaccaag 420
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacctgtga cggtctcgtg gaactcaggc 540
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380
tccctgtccc cgggtaaatg a 1401

Claims (9)

1.人源抗SARS-CoV-2中和性抗体nCoV-163，其特征在于，其轻链及重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下：
轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为QSVSSSY、GAS和QQHGRT；
重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为EIIVNRNY、IYPGGST和ARSYGDFYVDF。
2.根据权利要求1所述的中和性抗体，其特征在于，其轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
3.编码权利要求1或2所述中和性抗体的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。
5.含有权利要求3或4所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
6.权利要求1或2所述中和性抗体经改造得到的单链抗体。
7.用于预防或治疗由SARS-CoV-2感染以及由其感染所致相关疾病的药物，其特征在于，有效成分为权利要求1或2所述中和性抗体或权利要求6所述单链抗体。
8.SARS-CoV-2检测试剂，其特征在于，其包含权利要求1或2所述中和性抗体或权利要求6所述单链抗体。
9.权利要求1或2所述中和性抗体或权利要求6所述单链抗体的以下任一应用：
1)用于制备预防或治疗由SARS-CoV-2感染以及由其感染所致相关疾病的药物；
2)用于制备SARS-CoV-2检测试剂或试剂盒。
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