CN113861288B - 新型冠状病毒SARS-CoV-2广谱中和抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新型冠状病毒SARS‑CoV‑2广谱中和抗体及其应用。具体地公开了能有效抑制多种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2突变株的单域抗体。本发明利用噬菌体抗体库技术，成功获得了特异性结合SARS‑CoV‑2刺突蛋白RBD的广谱中和单域抗体B3A3和I3A10。本发明的单域抗体对抗原亲和力高，并对SARS‑CoV‑2主要流行株均有明显的抑制作用，是具有广谱作用的中和抗体，广谱性和中和活性好。本发明的单域抗体可制成临床上用于预防和治疗新型冠状病毒肺炎(COVID‑19)的特异性抗体药物及SARS‑CoV‑2诊断试剂或试剂盒等，在药物应用和临床诊断等领域具有十分广阔的前景和重要的意义。

Description

新型冠状病毒SARS-CoV-2广谱中和抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及新型冠状病毒SARS-CoV-2广谱中和抗体及其应用。具体涉及一种有效抑制多种新型冠状病毒SARS-CoV-2突变株的单域抗体及其应用。
背景技术
抗体(antibody，Ab)是B细胞被B细胞抗原表位特异性刺激后增殖分化为浆细胞所产生的效应免疫分子，介导体液免疫，是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。Ig通过其V区CDR所组成的抗原结合槽，与相应抗原表位以锁-匙(lock-key)互补关系进行特异性识别与结合。当抗体与病原体表面，或者细菌毒素关键表位相结合，则封闭了病原体或毒素的毒力结构，使病毒丧失感染能力，并使毒素丧失毒力，称为中和作用(neutralization)。大部分抗体是通过向T-淋巴细胞发出锁定抗原的信号，激发细胞免疫反应，杀死病毒，而中和抗体是B淋巴细胞产生的能够与病原微生物表面的抗原结合的一类抗体，是特异针对病毒中和表位产生的抗体，可直接靶定到病毒中和表位，使病毒失去结合受体的能力，可有效清除胞外病原体(大部分细菌)和处于裂解复制期的游离病毒，因此是大部分预防性疫苗显示免疫保护机制的关键。理想的疫苗应诱导出能够中和绝大多数甚至所有正在传播的此类病毒家族的抗体，这样的抗体被称为广谱中和抗体(broadly neutralizing antibody，bnAb)。bnAb普遍通过靶向高度保守并暴露于可变病毒表面蛋白上的表位来发挥功能。抗体对抗原的特异性结合能力，使其在疾病诊断和免疫防治中具有重要意义。由抗体物质(包括具有治疗功能的全抗体分子和抗体片段)组成的抗体药物是靶向治疗的重要手段之一，已经成为目前生物医药产业最有前景和应用价值的热点领域。
重链抗体(heavy chain antibody，HcAb)是天然存在的一种抗体类型，其于1993年首次由比利时布鲁塞尔自由大学的Hamers博士及其团队报导(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans Set al.Naturally occurring antibodies devoid of lightchains.Nature.1993；363:446-8.)。重链抗体是骆驼科动物或软骨鱼类所具有的独特抗体类型，其抗体结构域天然缺失轻链，只由两条重链组成。重链抗体的抗原识别功能主要由重链抗体的可变区(VHH)决定。单独的VHH即可以识别抗原，因此其又被称为单域抗体(Single-domain antibody，sdAb)。单域抗体的分子量只有约13-15KDa，直径约为2.5nm，长4nm，是迄今为止最小的具有抗原结合功能的抗体片段，其与抗原结合的能力及其稳定性，与完全抗体基本一致或具有更高的特异性抗原亲和力。与传统抗体相比，单域抗体还具有许多独特的性质，比如稳定性好，可抵达特殊抗原表位，砌块模式任意组合，生产成本低等。获得单域抗体的常规方法是通过多次免疫骆驼科动物、B淋巴细胞分离、VHH区扩增、展示文库构建和筛选等众多步骤构成。随着合成生物学的发展，构建基于全合成的高质量随机化大容量单域抗体库成为可能。目前，VHH单域抗体因其结构稳定、分子小、溶解性好、耐受各类不良环境、制剂稳定性好、易于人源化等优点，已经被广泛使用在小型化基因工程抗体研究、新药开发以及疾病的诊断治疗上。单域抗体的研究和开发在药物应用和临床诊断等领域具有十分广阔的前景和重要的意义。
冠状病毒科(coronaviridase)是一类主要感染脊椎动物的单股正链RNA病毒家族，其基因组是已知RNA病毒中相对较大的。冠状病毒通常经呼吸道或粪口途径感染，可导致多种疾病，如：普通感冒、支气管炎、肺炎，肠胃炎以及心脏病变等。某些冠状病毒的致死率较高，并且传播速度较快，能引起严重的社会和公共卫生问题。冠状病毒颗粒的典型特征为在电子显微镜下呈现出“皇冠”样形态，此形态是由分布于病毒包膜上的众多刺突蛋白(Spike Protein，S蛋白)所形成的。冠状病毒科包含4个病毒属，分别为：α冠状病毒属，β冠状病毒属，γ冠状病毒属和δ冠状病毒属。与人类感染相关的冠状病毒主要为α冠状病毒属和β冠状病毒属成员，具体病毒成员包括：hCoV-229E，hCoV-NL63，hCoV-OC43，hCoV-HKU1，SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2)为β冠状病毒属成员，为新发病原体，与SARS-CoV基因组的同源性约为80％，主要引起人类新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。SARS-CoV-2病毒在体外可以感染多种细胞，包括Vero-E6，Huh7，Calu-3，以及分化的人呼吸道上皮细胞等。SARS-CoV-2病毒是具有包膜的正链RNA病毒，病毒颗粒直径约为80～140nm，其包含四种主要的结构蛋白：表面的刺突蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、核衣壳蛋白(N蛋白)，在这四种蛋白中，最重要的就是刺突蛋白(S蛋白)。S蛋白是形成病毒“冠状”形态的主要蛋白之一，介导SARS-CoV-2进入细胞。SARS-CoV-2的S蛋白约由1273个氨基酸组成，结构上属于Ⅰ型膜融合蛋白，分为S1和S2两个区。S1区主要包括受体结合区(receptor binding domain，RBD)和N末端域(NTD)，而S2区则为膜融合所必需。SARS-CoV-2的潜在受体是人血管紧张素转换酶2(human angiotensin converting enzyme2，ACE2)。SARS-CoV-2通过S蛋白的RBD与人体细胞表面的受体ACE2结合，就像一把钥匙配一把锁一样，打开了进入宿主的通道。因此，SARS-CoV-2病毒的RBD结构决定了其与潜在受体ACE2结合的效率以及感染的种属特异性，是重要的中和抗体识别与开发靶点。
SARS-CoV-2是一种RNA病毒，容易在复制过程中出错，大量复制可引起多种变异。一旦出现一种适应性好的变异株，则可能引起广泛传播。SARS-CoV-2刺突蛋白的亚基S1被认为是一个突变热点，可能在毒性、传播能力和宿主免疫逃逸方面具有很高的临床相关性。随着SARS-CoV-2病毒的传播时间的不断延长，越来越多的突变株随之产生，突变位点已成百上千的出现。为了规范突变株的命名问题，世界卫生组织(WHO)推出了一套新的命名系统，根据传播力、致病力的不同将其分为值得关注的新冠突变病毒株(VOC)和待观察突变株(VOI)等。WHO推荐使用希腊字母alpha、beta、gamma、delta、lambda等来标识这些重要的SARS-CoV-2突变病毒株。一些国家也根据本国的流行情况，来定义其当前的VOC和VOI包括哪些突变毒株。越来越多的突变毒株产生多种多样的后果，包括传播加速和致病力改变等，另外一个直接后果就是导致疫苗的保护性下降、早期研发的一些单克隆抗体药物失效或中和能力大大降低。
鉴于此，研究和开发更为有效的，针对各种突变毒株的广谱中和抗体对于疾病的临床治疗和诊断试剂的研发均具有重要的科学意义和广泛的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够有效抑制多种新型冠状病毒SARS-CoV-2突变株活性的广谱中和单域抗体及其应用。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白的单域抗体，所述单域抗体由重链可变区(VHH)组成，所述重链可变区(VHH)包含选自A1)或A2)的互补决定区：
A1)氨基酸序列分别是SEQ ID No.1的第26-34位的互补决定区CDR1、SEQ ID No.1的第51-57位的互补决定区CDR2和SEQ ID No.1的第96-113位的互补决定区CDR3；
A2)氨基酸序列分别是SEQ ID No.2的第26-34位的互补决定区CDR1、SEQ ID No.2的第51-57位的互补决定区CDR2和SEQ ID No.2的第96-115位的互补决定区CDR3。
所述单域抗体可为特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)受体结合区(receptor binding domain，RBD)的广谱中和单域抗体。所述单域抗体由重链可变区组成，又称为VHH抗体。
进一步地，本发明所述单域抗体还包括框架区。
所述单域抗体B3A3的框架区FR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1-25位所示；FR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第35-50位所示；FR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第58-95位所示；FR4的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第114-124位所示。
所述单域抗体I3A10的框架区FR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第1-25位所示；FR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第35-50位所示；FR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第58-95位所示；FR4的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第116-126位所示。
上述单域抗体中，所述重链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2。
氨基酸序列是SEQ ID No.1的单域抗体(重链可变区)名称为B3A3，氨基酸序列是SEQ ID No.2的单域抗体(重链可变区)名称为I3A10。
本发明还提供了与所述单域抗体相关的生物材料，所述生物材料可为下述C1)至C5)中的任一种：
C1)编码所述单域抗体重链可变区的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的细胞系、或含有C2)所述表达盒的细胞系、或含有C3)所述重组载体的细胞系。
其中，C4)所述的重组微生物和C5)所述的细胞系可表达所述单域抗体。
上述生物材料中，所述核酸分子可为下述任一种：
D1)核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子；
D2)核苷酸序列是SEQ ID No.4的DNA分子；
D3)与D1)或D2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述单域抗体重链可变区的DNA分子。
SEQ ID No.3所示的DNA分子编码SEQ ID No.1所示的单域抗体B3A3；
SEQ ID No.4所示的DNA分子编码SEQ ID No.2所示的单域抗体I3A10。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指核苷酸序列的同一性。所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
具有改善的亲和力和/或效价的本发明所述单域抗体的变体可通过采用在本领域已知的方法来获得，并包括在本发明的范围内。例如，氨基酸置换可用于获得具有进一步改善的亲合力的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化也可用来改善用于产生抗体的表达系统中的翻译效率。此外，包含通过对本发明的任何核酸序列应用定向进化法而优化抗体特异性或中和活性的序列的多核苷酸也属于本发明的范围内。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、人工染色体(如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、P1人工染色体(PAC)或Ti质粒人工染色体(TAC)等)、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。在本发明的一个实施例中，载体具体可为pET-28b。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。在本发明的一个实施例中，微生物具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述细胞(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)、植物细胞或原核细胞。
在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体可为pET-28b-B3A3和pET-28b-I3A10。其中：
所述重组载体pET-28b-B3A3是采用DNA分子1替换原核表达载体pET-28b(Novagen公司，货号：69865-3)的NcoI和XhoI之间的DNA分子，得到表达单域抗体B3A3(与组氨酸标签融合)的重组原核表达载体pET-28b-B3A3。DNA分子1是在SEQ ID No.3的3'末端(SEQ IDNo.3的第372位)添加了XhoI识别位点(编码的氨基酸序列为LE)和6个组氨酸标签的编码序列(ctcgagcaccaccaccaccaccac)，保持SEQ ID No.3的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；
所述重组载体pET-28b-I3A10是采用DNA分子2替换原核表达载体pET-28b的NcoI和XhoI之间的DNA分子，得到表达单域抗体I3A10(与组氨酸标签融合)的重组原核表达载体pET-28b-I3A10。DNA分子2是在SEQ ID No.4的3'末端(SEQ ID No.4的第378位)添加了XhoI识别位点(编码的氨基酸序列为LE)和6个组氨酸标签的编码序列(ctcgagcaccaccaccaccaccac)，保持SEQ ID No.4的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子。
在本发明的一个实施例中，所述重组微生物(重组菌)具体可为BL21/pET-28b-B3A3和BL21/pET-28b-I3A10。其中：
重组微生物BL21/pET-28b-B3A3含有SEQ ID No.3所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.1的单域抗体B3A3。所述重组微生物BL21/pET-28b-B3A3是将所述重组载体pET-28b-B3A3导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。
重组微生物BL21/pET-28b-I3A10含有SEQ ID No.4所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的单域抗体I3A10。所述重组微生物BL21/pET-28b-I3A10是将所述重组载体pET-28b-I3A10导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有所述单域抗体和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
其中，所述药物组合物具有抑制或中和SARS-CoV-2活性的中和抗病毒作用。所述药物组合物用于改善、预防或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病和/或用于抑制SARS-CoV-2感染。
进一步地，本发明的药物组合物包含第一抗体和第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体为本发明的单域抗体，而第二抗体为中和SARS-CoV-2病毒感染的任何抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了所述单域抗体和/或所述生物材料在制备抑制或中和SARS-CoV-2活性的药物中的应用。
所述抑制或中和SARS-CoV-2活性包括特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)RBD区域，从而使SARS-CoV-2失去结合受体ACE2的能力。
上述应用中，所述抑制或中和SARS-CoV-2活性的药物可用于改善、预防或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病和/或用于抑制SARS-CoV-2感染。
本发明还提供了所述单域抗体和/或所述生物材料在制备用于检测SARS-CoV-2水平和/或SARS-CoV-2的刺突蛋白的产品中的应用。
本发明的单域抗体通过检测抗SARS-CoV-2疫苗的抗原是否含有具有正确构象的特异性表位来监测所述疫苗的质量的用途也设想处于本发明的范围内。
所述用于检测SARS-CoV-2水平和/或SARS-CoV-2的刺突蛋白的产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法或免疫比浊法等检测抗原抗体结合的产品。
本发明还提供了所述单域抗体和/或所述生物材料在制备用于诊断或辅助诊断SARS-CoV-2感染引起的疾病的产品中的应用。
上述应用中，所述SARS-CoV-2感染引起的疾病可为呼吸系统感染和/或消化系统感染。所述呼吸系统感染可为呼吸道感染和/或肺部感染，所述呼吸道感染可为鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎，所述肺部感染可为肺炎，如为新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19，简称新冠肺炎)。所述消化系统感染可为腹泻。
上述应用中，所述产品可为试剂或试剂盒。
所述试剂或试剂盒含有本文任一所述单域抗体或其组合。所述试剂盒可为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒、或荧光免疫试剂盒，但不限于此。
本文中，术语“特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白的单域抗体”和“抗RBD单域抗体”具有相同的含义，可互换使用。
本文中，术语“中和抗体”是指一种能中和，即防止、抑制、减小、阻碍或干扰病原体引发和/或保持宿主内感染的能力的抗体。如本文所述，这些抗体可单独地或以组合形式，在经适当配制后用作预防剂或治疗剂，与活性疫苗接种联合使用，用作诊断工具或用作生产工具。
在一个实施例中，本发明的单域抗体能够中和SARS-CoV-2假型病毒及其多种突变株或其组合。示例性SARS-CoV-2突变株包括但不限于Alpha突变株、Beta突变株、Gamma突变株、Delta突变型株和Kappa突变株。
本发明利用噬菌体抗体库技术，经过多轮筛选富集具有RBD蛋白抗原特异性的噬菌体，并鉴定获得阳性克隆，通过测序得到的相应的编码序列，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化，成功获得了特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)受体结合区(receptorbinding domain，RBD)的广谱中和单域抗体B3A3和I3A10。本发明的单域抗体B3A3和I3A10对SARS-CoV-2抗原(RBD蛋白)亲和力高，能通过特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)RBD区域来抑制或中和SARS-CoV-2活性，使SARS-CoV-2失去结合受体ACE2的能力。同时，本发明的单域抗体对SARS-CoV-2主要流行株(Alpha突变株、Beta突变株、Gamma突变株、Delta突变型株和Kappa突变株)均有明显的抑制作用，对SARS-CoV-2假型病毒具有较强的抑制活性和中和活性，具有广谱抑制多种突变株SARS-CoV-2假型病毒感染的能力，是具有广谱作用的中和抗体。广谱性和中和活性好。本发明的单域抗体可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产，获得具有中和SARS-CoV-2感染的抗体产物，可制成临床上用于预防和治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的特异性抗体药物，或SARS-CoV-2的诊断试剂或诊断试剂盒等，在药物应用和临床诊断等领域具有十分广阔的前景和重要的意义。
附图说明
图1为单域抗体B3A3抑制SARS-CoV-2多种假型病毒入侵的中和活性统计结果。
图2为单域抗体I3A10抑制SARS-CoV-2多种假型病毒入侵的中和活性统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区域的单域抗体的筛选与制备
一、噬菌体文库筛选
噬菌体文库筛选的基本原理和基本操作流程参考邵宁生等人所著的《生物文库技术—噬菌体展示与SELEX技术》，筛选步骤简要描述如下：首先将50μg的分别来源于巴西和印度的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区重组蛋白(北京义翘神州科技有限公司，货号：40592-V08H86、40592-V08H88，简称RBD蛋白)抗原利用赛默飞世尔科技公司的商品化试剂盒EZ-LinkTM Sulfo NHS-LC-LC-Biotin进行生物素标记，并进行脱盐纯化(脱盐柱购自赛默飞世尔科技公司)。第一轮筛选为液相选择，首先将12μg生物素标记的RBD蛋白与1mL(1012-1013)噬菌体文库混合室温孵育1小时；随后加入100μL链霉亲和素磁珠(GE生命科学公司)，转台转动室温孵育30分钟；利用生物素与链霉亲和素的吸附作用将磁珠和RBD蛋白抗原连在一起以俘获液相中具有RBD蛋白结合活性的噬菌体抗体。然后用PBS-T和PBS洗涤磁珠10-15次，并向磁珠中加洗脱液400μL洗脱5min；取200μL洗脱液加入5mL的对数生长期的TG1大肠杆菌培养物中，37℃培养1小时；上述培养物感染辅助噬菌体CM13后，扩大过夜培养并在第二天利用PEG6000(Sigma公司)对上清中的噬菌体进行纯化，即获得1012噬菌体VHH抗体库，用于下一轮筛选。第二轮筛选为固相选择，首先将50μg的RBD蛋白在4℃条件下包被5mL的免疫吸附管过夜，随后用PBS洗涤免疫管3次并加入1mL第一轮筛选收获的1012噬菌体VHH抗体库，室温下转台转动30分钟，再静置孵育1.5小时；然后用PBS-T和PBS洗免疫管15-20次，加洗脱液洗脱；取一半的洗脱液加入5mL的对数生长期的TG1大肠杆菌培养物中，37℃培养1小时；上述培养物感染辅助噬菌体CM13后，扩大过夜培养并在第二天利用PEG对上清中的噬菌体进行纯化，用于下一轮筛选。利用相似的方法进行第三轮和第四轮筛选，第三轮为液相筛选，第四轮为固相筛选。最后一轮筛选后，挑取1000个单个克隆进行培养和辅助噬菌体拯救，得到拯救噬菌体，用于后续阳性克隆的鉴定。
二、噬菌体酶联免疫吸附试验鉴定与RBD蛋白结合的阳性克隆。
酶联免疫吸附试验(ELISA)的基本原理和基本操作流程参考曹雪涛等人所著的《免疫学技术及其应用》。鉴定步骤简要描述如下：取RBD蛋白25ng/孔过夜包被96孔免疫板。多孔板用BSA封闭后，加入步骤一中的拯救噬菌体100μL/孔，室温静置孵育1小时。PBS-T洗板5次后，加入抗噬菌体抗体Anti-M13 antibody[B62-FE2](HRP)(Abcam公司#ab50370)，室温静置孵育1小时。PBS-T洗板6次洗掉未结合抗体后，每孔加入TMB底物100μL(北京索莱宝公司)，37℃避光孵育5-30分钟，每孔加入终止液50μL终止反应，于20分钟内测定实验结果，450nm波长下读取吸光值。实验设置一组阴性对照测定孔，当样品孔与对照孔的比值大于5则可判定为阳性结果。
经过上述筛选，对所有阳性克隆(能与RBD蛋白结合的含有单域抗体的噬菌体)进行序列测定和同源性比对分析，结果显示所有阳性克隆可总结为2个独立的克隆，其代表性克隆分别为：B3A3和I3A10。
三、抗RBD单域抗体的获得
经过上述筛选，将阳性克隆通过高保真PCR扩增单域抗体的完整读码框，得到抗RBD单域抗体的编码核酸分子及其编码的氨基酸序列。
共筛选得到2个单域抗体(分别命名为B3A3和I3A10)，单域抗体依次由框架区FR1、互补决定区CDR1、框架区FR2、互补决定区CDR2、框架区FR3、互补决定区CDR3和框架区FR4组成，具体信息如下：
单域抗体B3A3，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。SEQ ID No.1的第1-25位为框架区FR1，第26-34位为互补决定区CDR1，第35-50位为框架区FR2，第51-57位为互补决定区CDR2，第58-95位为框架区FR3，第96-113位为互补决定区CDR3，第114-124位为框架区FR4。编码单域抗体B3A3的核酸分子如SEQ ID No.3所示。
单域抗体I3A10，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2的第1-25位为框架区FR1，第26-34位为互补决定区CDR1，第35-50位为框架区FR2，第51-57位为互补决定区CDR2，第58-95位为框架区FR3，第96-115位为互补决定区CDR3，第116-126位为框架区FR4。编码单域抗体I3A10的核酸分子如SEQ ID No.4所示。
B3A3和I3A10为抗RBD单域抗体(特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白的单域抗体)，为特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)受体结合区(receptor binding domain，RBD)的广谱中和单域抗体。
四、表达抗RBD单域抗体的原核表达载体构建
1、表达单域抗体B3A3的原核表达载体
采用DNA分子1替换原核表达载体pET-28b(Novagen公司，货号：69865-3)的NcoI和XhoI之间的DNA分子，得到表达单域抗体B3A3(与组氨酸标签融合)的重组原核表达载体pET-28b-B3A3。DNA分子1是在SEQ ID No.3的3'末端(SEQ ID No.3的第372位)添加了XhoI识别位点(编码的氨基酸序列为LE)和6个组氨酸标签的编码序列(ctcgagcaccaccaccaccaccac)，保持SEQ ID No.3的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子。
2、表达单域抗体I3A10的原核表达载体
采用DNA分子2替换原核表达载体pET-28b的NcoI和XhoI之间的DNA分子，得到表达单域抗体I3A10(与组氨酸标签融合)的重组原核表达载体pET-28b-I3A10。DNA分子2是在SEQ ID No.4的3'末端(SEQ ID No.4的第378位)添加了XhoI识别位点(编码的氨基酸序列为LE)和6个组氨酸标签的编码序列(ctcgagcaccaccaccaccaccac)，保持SEQ ID No.4的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子。
五、抗RBD单域抗体的表达与纯化
1、抗RBD单域抗体的表达
将步骤四得到的两种原核表达载体(pET-28b-B3A3和pET-28b-I3A10)分别单独转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞(购自北京全式金公司)中，得到重组菌BL21/pET-28b-B3A3(转入pET-28b-B3A3)和重组菌BL21/pET-28b-I3A10(转入pET-28b-I3A10)。分别将重组菌BL21/pET-28b-B3A3和重组菌BL21/pET-28b-I3A10)接种于LB液体培养基，在37℃、230rpm条件培养至OD600＝0.5，然后向培养体系中加入终浓度0.3mM的IPTG并在18℃、230rpm条件继续诱导培养16小时后，离心收获菌体，保存于-80℃备用。
2、抗RBD单域抗体的纯化
(1)裂解菌体
将步骤1得到的菌体重悬于裂解缓冲液(50mM Tris-Cl pH 8.0，100mM NaCl，5mM咪唑)，超声破碎菌体后，12000×g离心15分钟，上清液转移至新管中。
(2)亲和层析
在AKTA Purifier蛋白纯化仪(GE生命科学公司)上将上述(1)得到的上清液通过Ni-NTA琼脂糖色谱柱(购自GE生命科学公司)，随后用20个柱体积的清洗液(50mM Tris-ClpH 8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)洗去未结合蛋白，最后利用仪器自带程序进行0-500mM咪唑的梯度洗脱并进行蛋白峰的分部收集，洗脱蛋白每1mL收集1管，经过SDS-PAGE鉴定得到纯化后的抗RBD单域抗体B3A3和I3A10。
将上述纯化后的抗RBD单域抗体装入透析袋中经过过夜透析更换PBS缓冲体系，并完成浓缩等步骤。
实施例2抗RBD单域抗体的亲和力测定
待测抗体：实施例1纯化的两种RBD单域抗体B3A3和I3A10。
利用BIAcore T-200生物分子相互作用仪(GE生命科学公司)进行抗体的亲和力测定，该技术是基于表面等离子共振(SPR)技术发展起来的，可进行生物大分子间相互作用的无标记、快速、实时、自动化操作与检测。
在测定重组RBD蛋白与其相应单域抗体间相互作用时，首先将抗原RBD蛋白(北京义翘神州科技有限公司，Gamma株RBD货号:40592-V08H86、Kappa株RBD货号:40592-V08H88)包被于传感器芯片上，然后以单域抗体作为流动相进行结合常数、解离常数与亲和力常数的测定。
1、RBD蛋白偶联CM5芯片：RBD蛋白偶联温度为25摄氏度，缓冲液为HBS-P(10mMHEPES,150mM NaCl,3mM EDTA and 0.05％P20,pH 7.4)。程序模板Immuobilization，选择CM5芯片通道2氨基偶联，配体为5μg/ml RBD-His蛋白，蛋白缓冲体系为pH 5.5醋酸钠(NaAC5.5)，目标偶联量300RU，洗脱液50mM NaOH。芯片激活剂50mmol/L的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)与200mmol/L的3-(3-二甲基氨基丙基)卡二亚胺盐酸盐(EDC)激活芯片，封闭剂为1mol/L盐酸乙醇胺。
2、抗RBD单域抗体与RBD蛋白抗原亲和力和动力学测定：选择多循环动力学模板，测定温度为25摄氏度，缓冲液为HBS-P，样品流动路径为2-1，样品结合时间180s，流速30ul/min，解离时间300s，再生洗脱液为Glycine-HCL 2.5，再生液结合时间30s，流速30ul/min，稳定时间0s，单域抗体浓度系列稀释(2,4,8,16,32,64nM)。最后所得数据用BiacoreEvaluation Software软件分析，计算结合常数(ka)，解离常数(kd)及亲和力常数(KD)。
上述Biacore分析中所用芯片、试剂及缓冲液，均购自GE生命科学公司。
结果如表1所示。结果显示，本发明所获得的单域抗体(B3A3和I3A10)与所检测的两种SARS-CoV-2RBD突变体蛋白(Gamma株和Kappa株)的亲和力常数介于0.023nMol/L至45.1nMol/L之间。KD值越低说明亲和力越强，本发明所获得的单域抗体总体上均具有较为理想的与RBD蛋白的亲和能力。从表1结果可知，单域抗体B3A3的亲和力较好，单域抗体I3A10的亲和力次之。
表1单域抗体与SARS-CoV-2RBD区相互作用的亲和力常数
Figure GDA0003393794480000111
实施例3抗RBD单域抗体的SARS-CoV-2假型病毒中和活性测定
待测抗体：实施例1纯化的两种单域抗体B3A3和I3A10。
SARS-CoV-2假型病毒是一种以逆转录病毒的复制核心元件与SARS-CoV-2病毒的包膜刺突糖蛋白(即S蛋白)组装形成的新型病毒颗粒。假型病毒与真病毒相比只能一次性感染细胞、宿主范围广、滴度高、不易被血清补体灭活，可以代替真病毒进行中和检测。假型病毒感染细胞的能力取决于其外面包裹的糖蛋白的种类与特性，是研究SARS-CoV-2的中和抗体抑制效率、受体利用和入侵感染机制的理想工具。
一、SARS-CoV-2假型病毒的包装制备
SARS-CoV-2 S基因表达质粒的构建方法：
根据GenBank中S蛋白的序列信息(GenBank号：QHD43416.1)，合成SARS-CoV-2S基因(核苷酸序列是GenBank Accession No.MN908947.3(Update Date 18-MAR-2020)的第21563-25330位核苷酸的基因)，用SARS-CoV-2 S基因替换质粒载体pCAGGS的EcoRI和XhoI识别位点间的片段(小片段)，保持pCAGGS载体的其他序列不变，得到的重组表达载体即为SARS-CoV-2 S基因表达质粒pSARS-CoV-2-wildtype-S(野生型S基因表达质粒)。
在野生型新冠病毒S基因(GenBank号：QHD43416.1)的基础上，合成各个突变株S基因，用于突变病毒假型病毒包装。包括：Alpha突变型(GenBank号：QQX99439.1)；Beta突变型(GenBank号：QUN71013.1)；Gamma突变型(GenBank号：QVQ47339.1)；Delta突变型(GenBank号：QVI56963.1)；Kappa突变型(GenBank号：QXP08802.1)。
按照上述SARS-CoV-2 S基因表达质粒的构建方法，利用下述突变型S基因分别构建各突变型S基因表达质粒：
SARS-CoV-2Alpha突变型(GenBank号：QQX99439.1)S基因(核苷酸序列是GenBankAccession No.MW531680.1(Update Date 27-JAN-2021)的第21503-25261位核苷酸的基因)；用该SARS-CoV-2Alpha突变型S基因替换质粒载体pCAGGSS的EcoRI和XhoI识别位点间的片段(小片段)，保持pCAGGSS载体的其他序列不变，得到名称为pSARS-CoV-2-Alpha-S的重组表达载体(SARS-CoV-2Alpha突变型S基因表达质粒)。
SARS-CoV-2Beta突变型(GenBank号：QUN71013.1)S基因(核苷酸序列是GenBankAccession No.MZ068155.1(Update Date 11-MAY-2021)的第21516-25274位核苷酸的基因)；用该SARS-CoV-2Beta突变型S基因替换质粒载体pCAGGSS的EcoRI和XhoI识别位点间的片段(小片段)，保持pCAGGSS载体的其他序列不变，得到名称为pSARS-CoV-2-Beta-S的重组表达载体(SARS-CoV-2Beta突变型S基因表达质粒)。
SARS-CoV-2Gamma突变型(GenBank号：QVQ47339.1)S基因(核苷酸序列是GenBankAccession No.MZ264787.1(Update Date 21-MAY-2021)的第21555-25322位核苷酸的基因)；用该SARS-CoV-2Gamma突变型S基因替换质粒载体pCAGGSS的EcoRI和XhoI识别位点间的片段(小片段)，保持pCAGGSS载体的其他序列不变，得到名称为pSARS-CoV-2-Gamma-S的重组表达载体(SARS-CoV-2Beta突变型S基因表达质粒)。
SARS-CoV-2Delta突变型(GenBank号：QVI56963.1)S基因(核苷酸序列是GenBankAccession No.MZ208926.1(Update Date 17-MAY-2021)的第21443-25204位核苷酸的基因)；用该SARS-CoV-2Delta突变型S基因替换质粒载体pCAGGSS的EcoRI和XhoI识别位点间的片段(小片段)，保持pCAGGSS载体的其他序列不变，得到名称为pSARS-CoV-2-Delta-S的重组表达载体(SARS-CoV-2Beta突变型S基因表达质粒)。
SARS-CoV-2Kappa突变型(GenBank号：QXP08802.1)S基因(核苷酸序列是GenBankAccession No.MZ571142.1(Update Date 16-JUL-2021)的第21538-25359位核苷酸的基因)；用该SARS-CoV-2Kappa突变型S基因替换质粒载体pCAGGSS的EcoRI和XhoI识别位点间的片段(小片段)，保持pCAGGSS载体的其他序列不变，得到名称为pSARS-CoV-2-Kappa-S的重组表达载体(SARS-CoV-2Beta突变型S基因表达质粒)。
利用上述制备的野生型S基因表达质粒和突变型S基因表达质粒(统称为SARS-CoV-2 S基因表达质粒)分别进行下述假病毒的制备：
将293T细胞(来源自中国医学科学院基础医学研究所)接种于10厘米培养皿中，利用含10％胎牛血清(购自Gibco公司)的DMEM培养基(购自赛默飞世尔公司)培养至80％细胞汇合度，共转染15微克SARS-CoV-2 S基因表达质粒与15微克PNL4.3-Luc-R-E-质粒(BioVector NTCC Inc.)，转染后6小时更换含2％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养36小时并收获含有SARS-CoV-2假型病毒的培养上清，分装并冻存于-80摄氏度长期保存。
将共转染pSARS-CoV-2-wildtype-S和PNL4.3-Luc-R-E-得到的假型病毒命名为野生型假型病毒，将共转染pSARS-CoV-2-Alpha-S和PNL4.3-Luc-R-E-得到的假型病毒命名为Alpha突变型假型病毒，将共转染pSARS-CoV-2-Beta-S和PNL4.3-Luc-R-E-得到的假型病毒命名为Beta突变型假型病毒，将共转染pSARS-CoV-2-Gamma-S和PNL4.3-Luc-R-E-得到的假型病毒命名为Gamma突变型假型病毒，将共转染pSARS-CoV-2-Delta-S和PNL4.3-Luc-R-E-得到的假型病毒命名为Delta突变型假型病毒，将共转染pSARS-CoV-2-Kappa-S和PNL4.3-Luc-R-E-得到的假型病毒命名为Kappa突变型假型病毒。
二、假型病毒入侵抑制试验
分别设置单域抗体B3A3实验组和单域抗体I3A10实验组，按照如下步骤进行假型病毒的入侵实验：
将步骤一制备的SARS-CoV-2假型病毒分别与不同稀释度的单域抗体(所含单域抗体的终浓度分别为0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100和1000nM)混合后，加入预先接种的含Calu-3细胞(人肺腺癌细胞)的96孔板中，继续孵育48小时。SARS-CoV-2假型病毒含有荧光素酶报告基因，假型病毒具有感染目标靶细胞的能力，通过检测荧光素酶报告基因等方法可以测定假型病毒的感染能力与水平。使用Promega公司的luciferase荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：E4550)，按产品说明书裂解细胞并对细胞裂解液中的报告基因活性进行检测，将荧光素酶原始读值数据转换为百分比数据进行做图。
结果如图1和图2所示。
结果显示，本发明所获得的单域抗体B3A3和I3A10对SARS-CoV-2主要流行株(Alpha突变株、Beta突变株、Gamma突变株、Delta突变型株和Kappa突变株)均有明显的抑制作用，对SARS-CoV-2假型病毒具有较强的抑制活性和中和活性，表明本发明的单域抗体具有广谱抑制多种突变株SARS-CoV-2假型病毒感染的能力，是具有广谱作用的中和抗体，具体半数中和剂量(ND50)见表2。单域抗体I3A10的广谱性和中和活性较好，单域抗体B3A3次之。
表2单域抗体对多种突变株SARS-CoV-2假型病毒感染的半数中和剂量
Figure GDA0003393794480000141
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所
<120> 新型冠状病毒SARS-CoV-2广谱中和抗体及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Glu Val Thr
20 25 30
Trp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Leu His Gln Thr Val Leu Thr Ser Val Glu Trp Glu Gly Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Leu Ala Val Phe
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr His Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gln Asp Leu Asp Tyr Asn Val Tyr Phe His Pro Tyr Trp Gln Leu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
caggtgcagc tggtggaatc gggtggggga ttggttcagg cggggggaag tttacgctta 60
tcgtgtgcgg catctggtcg tattttcgaa gttacttgga tgggttggta tcgccaggca 120
ccaggtaaag aacgtgaatt cgttgcctct atttctcgtg gcggtggtac caactacgcg 180
gactcagtga aaggccgctt cactatctcc cgtgataatg ctaagaacac cgtttatctg 240
cagatgaatt ctttgaaacc tgaagacact gccgtttatt attgcgcagc tctgcatcag 300
actgttctga cttctgttga atgggaaggt tacgactact ggggtcaggg aacccaggtt 360
acggtttctt ct 372
<210> 4
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
caggtgcagc tggtggaatc gggtggggga ttggttcagg cggggggaag tttacgctta 60
tcgtgtgcgg catctggtcg tattctggct gttttcgtta tgggttggta tcgccaggca 120
ccaggtaaag aacgtgaatt cgttgcctct attactcatg gcggtactac caactacgcg 180
gactcagtga aaggccgctt cactatctcc cgtgataatg ctaagaacac cgtttatctg 240
cagatgaatt ctttgaaacc tgaagacact gccgtttatt attgcgcagc tcaggacctg 300
gactacaacg tttacttcca tccgtactgg cagctgtacg actactgggg tcagggaacc 360
caggttacgg tttcttct 378

Claims (10)

1.特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体由重链可变区组成，所述重链可变区包含氨基酸序列分别是SEQ ID No.1的第26-34位的互补决定区CDR1、SEQ ID No.1的第51-57位的互补决定区CDR2和SEQ ID No.1的第96-113位的互补决定区CDR3。
2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQID No.1。
3.与权利要求1或2所述单域抗体相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述C1）至C5）中的任一种：
C1）编码权利要求1或2所述单域抗体重链可变区的核酸分子；
C2）含有C1）所述核酸分子的表达盒；
C3）含有C1）所述核酸分子的重组载体、或含有C2）所述表达盒的重组载体；
C4）含有C1）所述核酸分子的重组微生物、或含有C2）所述表达盒的重组微生物、或含有C3）所述重组载体的重组微生物；
C5）含有C1）所述核酸分子的细胞系、或含有C2）所述表达盒的细胞系、或含有C3）所述重组载体的细胞系，所述细胞系为动物细胞系。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：
D1）核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子；
D2）与D1）限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2所述单域抗体重链可变区的DNA分子。
5.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1或2所述的单域抗体和药学上可接受的载体。
6.权利要求1或2所述的单域抗体和/或权利要求3或4所述的生物材料在制备抑制或中和SARS-CoV-2活性的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制或中和SARS-CoV-2活性的药物用于改善、预防或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病和/或用于抑制SARS-CoV-2感染。
8.权利要求1或2所述的单域抗体和/或权利要求3或4所述的生物材料在制备用于检测SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-2的刺突蛋白的产品中的应用。
9.权利要求1或2所述的单域抗体和/或权利要求3或4所述的生物材料在制备用于诊断或辅助诊断SARS-CoV-2感染引起的疾病的产品中的应用。
10.根据权利要求7或9所述的应用，其特征在于，所述SARS-CoV-2感染引起的疾病为呼吸系统感染。
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