CN114456264B - 一种新型冠状病毒稀有广谱表位的人源抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型冠状病毒稀有广谱表位的人源抗体及应用。利用原型株RBD与Beta毒株RBD抗原递次筛选模式，快速聚焦保守靶位，成功分离到结合在RBD不同表位的能对VOC实现广谱中和的全人源抗体IMCAS‑364。其对原型株、Alpha、Beta、Delta、Omicron亲和力达到nM级。通过已知表位抗体竞争实验，证实IMCAS‑364结合于RBD内侧面且不与受体发生竞争的稀有靶位，首次发现结合该靶位的抗体具有不竞争ACE2但可中和新冠的特点。IMCAS‑364具备与通过受体阻挡发挥中和作用的抗体进行配对潜力，且具备结合非典型肺炎病毒的能力亲和力在nM级，可用于泛SARS类冠状病毒中和抗体开发。

Description

一种新型冠状病毒稀有广谱表位的人源抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及新型冠状病毒稀有广谱表位的人源抗体及其应用。
背景技术
筛选广谱高中和活性的新冠病毒抗体，对于临床预防与治疗具有重要的现实意义。
新冠暴发后全人类通过疫苗构筑了最大规模预存免疫，然而随着病毒在人群持续传播，产生的多种突变给全球的疫苗免疫防线带来极大压力，目前Omicron出现不但跨越了多种疫苗的免疫防线，全球8个上市抗体仅存S309尚可以继续抵御，Omicron更具备了跨种传播感染小鼠等啮齿类动物的可能性。值得警惕的是，目前虽然Omicron表现出对人致病力降低，但是长远看高传播力的病毒一旦进入非人类宿主，是否免疫压力改变而带来的新型突变将不在适应人类，进而产生对人类免疫逃逸与致病力双加强的新毒株。这些科学问题都迫使科学家加快在人类免疫群体中，阐明冠状病毒交叉保护能力机制，同时对抗突变广谱抗体研究重要再一次被突出到显著位置。
然而目前研究的技术手段存在局限，全球利用新冠康复病人外周血细胞测序产出的2988抗体主要针对的是缺乏抗突变能力的免疫优势表位，鲜有针对保守表位的广谱中和能力，多个顶级期刊归纳分类文章已经关注到这个问题。从进化选择来说保守表位只有弱免疫源性才能在宿主免疫对抗中适应生存，针对保守位点免疫原性低的特点，在流感广谱抗体研究中，科学家进一步通过不同抗原的免疫聚焦、续贯免疫的策略提升“抗体的有效调动”继而获得广谱抗体，例如S309抗体是从一位感染10年的非典型肺炎病毒（SARS-CoV）康复患者中体外利用SARS2靶蛋白获得的，但是这类志愿者的不但存在极少，而且在sarbecoviruses层面实现广谱一定对SARS2新生突变产生的有效抵御尚缺相关性定论，仅以Omicron来看包括S2H97、2-36、MW06等多个pan-sarbecovirus明星抗体出现效能丧失。更棘手的是，SARS2暴发事件不长，对于同一人先后感染不同VOC病毒株的机率或是对同一人交替免疫不同VOC疫苗的可能性极小，这驱使研究人员必须另辟蹊径挖掘这种弱免疫原性稀有靶位的广谱抗体。
发明内容
本发明利用全新抗体增扩引物构建康复病人抗体噬菌体展示库，与现有技术中噬菌体展示筛选不同，本发明利用原性株RBD与Beta毒株RBD抗原递次筛选模式，快速聚焦保守靶位，成功在体外分离到多株结合在RBD不同表位的能对VOC实现广谱中和的全人源抗体。其中，IMCAS-364抗体对原型株、Alpha、Beta、Delta、Omicron亲和力达到nM水平，对高传播力Omicron突变株假病毒中和达到7.99ug/ml。IMCAS-364结合于RBD内侧面且不与受体发生竞争的稀有靶位，具备与主流通过阻挡受体结合来发挥中和作用的抗体进行配对的潜力。同时IMCAS-364具备结合SARS-CoV的能力，是良好的泛SARS类冠状病毒中和抗体。
因此，本发明首先提供针对SARS-CoV-2的原型株、Alpha、Beta、Delta、Omicron株均有效的广谱新型冠状病毒的人源抗体，具体是新型冠状病毒稀有广谱表位的人源抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括的CDR1氨基酸序列是：SEQ ID NO.13：GFTFSRYG，CDR2氨基酸序列是：SEQ ID NO.14：IWYDGSNK，CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO.15：AKQEGTYCSGGSCYSGLDY，其轻链可变区包括的CDR1的氨基酸序列是：SEQ ID NO.16：QSISSY、CDR2的氨基酸序列是：SEQ ID NO.17：AAS、CDR3的氨基酸序列是：SEQ ID NO.18：QQSYSTPLT。
更优选地，其重链可变区序列为：SEQ ID NO.19：QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCAKQEGTYCSGGSCYSGLDYWGQGTLVTVSSAS，轻链可变区序列为：SEQ ID NO.20：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIKG。
进一步优选地，重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在一个具体实施方式中，所述人源抗体为单链抗体。优选地，其氨基酸序列如SEQID NO.8所示。
本发明进一步提供所述的人源抗体或其抗原结合片段的编码核酸。优选地，重链的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。或者其为单链抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
由此，本发明还提供所述的编码核酸的表达载体或重组细胞。
进而，本发明提供含有所述的人源抗体作为有效成分的预防或治疗SARS-CoV-2引起的疾病的药物组合物。进一步地，还包括药学上可接受助剂。
同时，本发明还提供所述的人源抗体的用途，其特征在于，在制备治疗SARS-CoV-2引起的疾病的预防或治疗的药物中应用。其中，所述SARS-CoV-2选自原型株、Alpha、Beta、Delta、Omicron株中一种或多种。
本发明筛选到的IMCAS-364与全球已经报道的全部4210条不同新冠抗体序列比较，IMCAS-364具有以下特点：第一是重链的CDR3：ARDRDRFGDQGGWFDP氨基酸序列首次发现；重链轻链配对形式：IGHV3-33，IGHD2-15，IGHJ4 ：IGKV1-39 ，IGKJ4首次发现。此外，通过8个已报道在不同表位的抗体确认IMCAS-364表位只与CoV1-16与CR3022抗体发生竞争，同时不与新冠病毒受体ACE2竞争，由于COVA1-16和CR3022是结合位置已知抗体。判定IMCAS-364是结合在RBD内侧稀有表位抗体，具备与绝大部分已知抗体联合用药的潜力。这也是首次通过噬菌体展示发现此类抗体。已发表数据中结合此靶位两个抗体其中CR3022不具备中和新冠病毒能力，COVA1-16由于和受体ACE2发生竞争，所以不能和大多数通过受体阻断抗体进行配对联合。因此，本发明提供新型冠状病毒稀有广谱表位的人源抗体具有重大的应用价值。
附图说明
图1实施例1中Prototype新冠原型株RBD抗原表达的分子筛层析及其目的峰的SDS-PAGE图。
图2实施例1中Beta新冠突变株RBD抗原表达的分子筛层析及其目的峰的SDS-PAGE图。
图3 纯化的IMCAS-364scfv蛋白的分子筛图谱和SDS-PAGE图。
图4 IMCAS-364与SARS-CoV-RBD亲和力检测（biacore-8k）。
图5 293F表达IMCAS-364全抗过Superdex200pg分子筛图和SDS-PAGE图。
图6 IMCAS-364对WHO提出的全部VOCs病毒株的假病毒中和实验。
图7 IMCAS-364与ACE2/其他抗体竞争性结合验证（Octet）。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第四版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：广谱结合能力IMCAS-364抗体的获得
康复病人外周血淋巴细胞RNA提取与人源单链抗体噬菌体展示文库的建立
在12名感染新型冠状病毒且痊愈出院的人员知情同意下，各采集3-10mL 的血液，分离PBMCs，转入1.5mlEP管中。加入700mltrizol并放置5分钟，在上述EP管中，加入0.14ml氯仿，盖上EP管盖子，剧烈震荡15秒，室温静置3分钟，12000g（4℃）离心15分钟。取上层水相置于新EP管中，加入 0.5ml异丙醇，在室温下静置10分钟，12000g（4℃）离心10分钟。弃上清，加入1ml 75% 乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（4℃）离心5分钟，弃上清。让沉淀的RNA在室温在自然干燥。用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
通过HiScript-TS 5'/3' RACE Kit (Vazyme) 逆转录试剂盒，按说明书分别增扩VH、VL的DNA模板后，用2 × Taq Master Mix酶 (Vazyme)进行PCR，通过引物组合扩增抗体可变区序列，反应条件如下：95℃，2min；95℃，15s，58℃(重链/κ链/ λ链)，15s，72℃，30s，35个循环，72℃，7min。1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物，将400-500bp的条带切胶回收。等摩尔比将12个人VH混合一起，同法混合VL片段后，将混合后VH与VL进行等摩尔比混合后用PCR搭桥引物连接抗体基因的重链轻链可变区，使用2 × Taq Master Mix酶(Vazyme)进行PCR，反应条件如下：95℃，2min；95℃，15s，67℃，15s，72℃，30s，30个循环，72℃，7min增扩出完整的单链抗体scfv(VH-VL)，1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物，将750-800bp的条带切胶回收。将Overlapping后的产物与sfiI酶切后的pcomb3xss(addgene)质粒按照3：1的比例连接形成Phagemid，连接产物转化Top10感受态细胞，涂氨苄抗性平板（1：1000），37℃过夜培养后，将所有菌落收集大提质粒（先获得大量质粒文库，然后基于质粒每次按流程转换为噬菌体文库，以保证库均一性），得到5-10mg质粒文库。将20ug质粒使用电转仪(biorad)转化入TG1感受态细胞，1mlSOC37度1小时慢摇后，加入5ml氨苄抗性培养基，40分钟后加入5E7个辅助噬菌体，1小时后，转入125ml锥形瓶，加入氨苄西林和卡那霉素双抗LB，25ml，30度过夜，可增扩得到5E12pfu/ml 的噬菌体文库。
关键抗原的制备
合成野生型新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域段（RBD）蛋白（氨基酸序列如SEQIDNO.1所示、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示）Beta型新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域段（RBD）蛋白（氨基酸序列如SEQIDNO.3所示、核苷酸序列如SEQIDNO.4所示）通过EcoRI与XhoI两个酶切位点构建到pCAGGS质粒载体上。其中蛋白编码区5‘端前置信号肽核苷酸序列ATGTTTGTGTTTCTTGTGCTTCTTCCTCTTGTGTCATCACAATGC，同时蛋白编码区的3’端连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子。用含10%FBS的DMEM培养293T细胞。用质粒转染293T。转染4-6小时后给细胞换液成无血清的DMEM继续培养3天，收集上清，并补加DMEM，再培养4天，收集上清。收集的上清经过5000rpm离心30min后，与含有20mM磷酸钠(pH 8.0)的缓冲液等体积混合，经过0.22 μm滤膜过滤后，与His-trapExcel预装柱结合（5mL，GE Healthcare）。以10mM咪唑洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过SDS-PAGE确定，图1说明Prototype新冠原型株RBD抗原目标蛋白得到正常表达，图2说明Beta新冠突变株RBD抗原正常表达。
人源单链抗体噬菌体展示文库筛选
取纯化的野生型新型冠状病毒RBD蛋白，用PBS（Ph7.4）溶液按5ng/ul，每孔100ul包被96孔板，置于4℃冰箱中过夜包被。过夜包被后，弃去各孔内的包被液用0.05%的PBST溶液洗去未吸附的抗原，每孔加入65ul浓度为0.5%的BSA封闭半小时，随后加入40ul 10%吐温-20室温下静置半小时30min后，弃去封闭液，0.05%的PBST洗板3次。取100ul纯化后的前述噬菌体溶入900ul 溶解buffer(0.5%的BSA0.05%的PBST)中混匀，用排枪向每孔中加入100ul，室温下孵育2h。弃去Elisa板中的噬菌体溶液，用0.05%的PBST洗板10次。用排枪向每孔内加入100ul洗脱液（pH=2.2,0.1M HCL），400rpm摇20min。将每10个孔内的洗脱液混合在一起，得到1000ul噬菌体。每管噬菌体加入200ul 终止液(1M Tris和0.5% BSA 1:1混合)，收集在2ml离心管内。取1管XLI-Blue感受态细胞（约100ul）接入5ml液体LB培养基中，摇至OD600介于0.6至0.8时停止。向5ml菌液中加入600ul前述噬菌体，转移至50ml无菌离心管中，37℃下220rpm摇菌半小时。向50ml管中加入1/1000的比例氨苄西林37℃下220rpm接菌，摇至OD值0.8左右。按1：1000的比例加入辅助噬菌体M13KO7（9×1012pfu/ml），37℃下220rpm摇菌半小时。随后转入到含有30ml 2YT培养基的锥形瓶，1：1000加入氨苄西林和卡那霉素。37℃下220rpm摇菌4小时，向锥形瓶中1:1000加入IPTG 30℃下过夜培养后或的5E12pfu噬菌体筛选文库。重复上述步骤三次后，将野生型新型冠状病毒RBD蛋白变化为突变新型冠状病毒beta-RBD蛋白开展第四轮筛选。将第四轮洗脱的噬菌体，20ul接入摇至OD600介于0.6至0.8时的XLI-Blue感染20分钟后，涂布LB平板，37度过夜静置后，挑选384个单克隆进行菌落PCR，使用2 × Taq Master Mix酶 (Vazyme)进行PCR，反应条件如下：95℃，2min；95℃，15s，67℃，15s，72℃，30s，30个循环，72℃，7min增扩。1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物，将850-1000bp的阳性条带切胶回收。
候选抗体 SS320原核细胞小规模表达与鉴定
测序并进行序列比对，将所ScFv序列重复数大于2的噬菌体质粒，利用电转技术转化进入SS320细胞，加入无抗培养基在37℃摇菌1h，涂1‰氨苄抗性平板，挑单克隆菌落到100ul含有氨苄的培养基中，37℃培养箱中过夜培养。次日，接入到1.5ml的含有1‰氨苄和20ml 1M MgCl2的SB培养基中,继续在400 rpm/min的37℃培养箱中培养8h后1：1000加入1M的IPTG 37℃过夜诱导。次日，将诱导完成的菌液收集，6500rpm，4℃，离心30min，收集上清后用0.22μm滤膜进行推滤。上清加入包被有野生型和Beta突变型、Omicron新型冠状病毒RBD蛋白（氨基酸序列如SEQIDNO.5所示、核苷酸序列如SEQIDNO.6所示）的96孔板中进行ELISA实验，每孔按顺序加入100ul试表达溶液，每个样品加3个孔，室温下静置1h。100ul0.1%PBST溶液洗脱洗3次。按照1：2500的比例在0.1%的PBST中稀释一抗（兔抗HA），注意避光保存。用排枪向每孔中加入100ul一抗稀释液，室温下孵育1h。100ul 0.1%PBST溶液洗脱洗3次。二抗为羊抗兔IgG-HRP，孵育1h，100ul 0.1%PBST溶液洗脱洗3次。向每孔中加入50ul显色液TMB，37℃反应10-20min至显色适当时，立即加入50ul 2M浓HCl终止显色反应。
经筛选和验证，确认得到新型冠状病毒稀有广谱表位有非常强的结合能力的scfv为IMCAS-364，所述抗体SCFV形式（氨基酸序列如SEQIDNO.8所示、核苷酸序列如SEQIDNO.7所示）。
测序分析表明，其中重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，对应的重链的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
重链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.19：QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCAKQEGTYCSGGSCYSGLDYWGQGTLVTVSSAS，轻链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.20：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIKG。
进一步分析可知，重链的CDR1：GFTFSRYG（SEQIDNO.13）、CDR2：IWYDGSNK（SEQIDNO.14）、CDR3：AKQEGTYCSGGSCYSGLDY（SEQIDNO.15）。轻链CDR1：QSISSY（SEQIDNO.16）、CDR2：AAS（SEQIDNO.17）、CDR3：QQSYSTPLT（SEQIDNO.18）。
与截至2022年1月全球已经报道的全部4210条不同新冠抗体序列比较具有以下两个特点，第一是重链的CDR3（ARDRDRFGDQGGWFDP）氨基酸序列首次发现；重链轻链配对形式：IGHV3-33，IGHD2-15，IGHJ4 ：IGKV1-39 ，IGKJ4首次发现。
抗体 SS320原核细胞大规模表达
挑IMCAS-364单克隆SS320菌落到1ml含有氨苄的培养基中，37℃培养箱中过夜培养。次日，接入到10ml的含有1‰氨苄和20ml 1M Mgcl2的SB培养基中,继续在180 rpm/min的37℃培养箱中培养8h后1：1000加入 1M的IPTG 37℃过夜诱导。次日，将诱导完成的菌液收集，6500rpm，4℃，离心30min，收集上清后用0.22μm滤膜进行真空抽滤。接着将上清用HisTrapTM HP亲和柱结合过夜，将目的蛋白用10%的(20 mM Tris, 150 mM NaCl，pH 8.0,300 mM imidazole)从His柱上洗脱下来，并以10 KD蛋白浓缩管用缓冲液 (20 mM Tris,150 mM NaCl，pH 8.0)进行换液，以去除蛋白溶液里的咪唑浓度，并浓缩到体积小于500μl。将浓缩完成的蛋白溶液使用AKTA-purifier(GE)和superdex75 Increase 10/300 GL分子筛(GE)，用(20 mM Tris, 150 mM NaCl，pH 8.0)平衡分子筛，500μl loop环上样，同时监测280 nm的紫外吸收值，收取目的蛋白，并通过SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。
目的蛋白的分子筛图谱和SDS-PAGE图表明获得了纯化后的IMCAS-364scfv蛋白（如图3所示）。
实施例2、表面等离子共振技术检测蛋白与抗体亲和力（biacore 8k）
利用表面等离子共振现象检测分子间相互作用，在 GE Healthcare集团生产的生物大分子相互作用分析系统Biacore 8K上完成。使用生物素-链霉亲和素偶联法（SA 芯片）捕获Prototype RBD，Alpha variant RBD，Beta variant RBD，Delta variant RBD,Lamdavariant RBD，Omicron variant RBD蛋白作为固定相，流动相为需要检测的IMCAS-364新冠中和抗体蛋白，之后通过 BIA evaluation 软件分析动力学参数并作图。
实验步骤：利用生物素-链霉亲和素的偶联作用，首先将Prototype RBD，Alphavariant RBD，Beta variant RBD，Delta variant RBD, Lamda variant RBD, Omicronvariant RBD蛋白与生物素化试剂按比例室温放置30分钟，将蛋白进行生物素化标记，之后用浓缩管换液至 PBS，去除多余的生物素化试剂。将生物素化的抗原蛋白SARS-CoV-2Prototype RBD，SARS-CoV-2 Alpha variant RBD，SARS-CoV-2 Beta variant RBD，SARS-CoV-2 Delta variant RBD, SARS-CoV-2 Lamda variant RBD，SARS-CoV-2 Omicronvariant RBD以10μg/ml的浓度固定在SA芯片（GE）上。
然后将浓度梯度为6.25nM，12.5nM，25nM，50nM和100 nM的抗体IMCAS-364注入芯片，分析在恒温25℃进行，使用的缓冲液是0.05%PBST。芯片表面的再生使用的是10mM PH =1.7的Glynice溶液，结合曲线如图所示，不同浓度的曲线组成图示的动力学曲线。结合动力学常数的计算是利用BIA evaluation software version 3.2 (Biacore, Inc.)软件进行的。
结果如图4所示，抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Prototype RBD蛋白的亲和力常数为1.04nM，抗体IMCAS-364b和SARS-CoV-2 Alpha variant RBD蛋白的亲和力常数为1.06nM。抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Beta variant RBD蛋白的亲和力常数为1.07nM；抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Delta variant RBD蛋白的亲和力常数为1.18nM，抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Gamma variant RBD蛋白的亲和力常数为1.17nM，抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Lamda variant RBD蛋白的亲和力常数为0.92nM，抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Omicron variant RBD蛋白的亲和力常数为2.19nM，上述数据表明：抗体IMCAS-364与SARS-CoV-RBD有很强的亲和力。同时抗体IMCAS-364和SARS-CoV RBD蛋白的亲和力常数为8.17nM，是一种具有泛SARS类冠状病毒结合能力的抗体。
实施例3、抗体IgG全抗构建和表达及纯化
抗体IgG全抗构建
为了获得人源抗体进行后续评价，设计了全抗IgG1构建。策略如下：
重链H：CMV promoter-EcoRI-信号肽(SP)-重链可变区(VH)-重链恒定区(CH)-Xhol；
轻链κ：CMV promoter-EcoRI-信号肽(SP)-轻链可变区(VK)-轻链恒定区(CLκ)-Xhol；
分别将轻重链可变区序列与相应的含由重链CH和轻链CLκ的恒定区的表达载体pCAGGS，通过同源重组连接，克隆至表达载体pCAGGS中，得到含有特定抗体轻、重链编码基因的重组质粒；其中，使用酶切位点ScaI和KpnI将轻重链可变区连入含有恒定区的载体中。
全抗的表达及纯化
用IMCAS-364轻、重链编码基因的质粒按照重链：轻链1：1.5比例共转染密度3*10^6 293F细胞。用150mM NaCl稀释质粒1ml细胞加1ug质粒，用150mM NaCl稀释1mg/ml PEI1ml 细胞加3ul，静置5min；上述二者混匀后静置20min，逐滴加入293F细胞。转染24h后按照1ml加0.035ml补料液，随后每48h加一次补料液。
转染5d后收上清，6500rpm离心30min去除细胞沉淀，与含有20mM磷酸钠(pH 7.4)等体积混合，经过0.22 um滤膜过滤后，与protein A预装柱结合（5mL, GE Healthcare）。以10mM甘氨酸(pH 3.0)洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过SDS-PAGE确定，结果如图5所示。
实施例4、抗体IMCAS-364与SARS-CoV-2假病毒中和实验
准备部分：
样品：
IMCAS-364全抗
假病毒（WT，Alpha，Beta，Delta，Omicron）
耗材：枪头（无菌），圆底96孔板， 10cm细胞培养皿,平底12孔板，平底96孔板，流式固定液，流式管
试剂：DMEM+10%FBS (044)
假病毒包装：
pCAGGS-SARS-CoV-2-S 各突变体质粒各30
Figure 631664DEST_PATH_IMAGE001
g,转染293T细胞10cm2盘（细胞量80%-90%），4h后换液DMEM（10%FBS），转染后24h，加入VSV-ΔG-GFP假病毒5ml ，2h后换液，加入DMEM 10%FBS，含VSVG抗体1:1000（10mg/ml 由I1Hybridoma ATCC® CRL2700™细胞表达,终浓度10ug/ml），加入假病毒后20h收上清，3000rpm, 10min离心，过0.45滤膜。分装冻-80。未转染S蛋白的细胞，后续同样加入VSV-ΔG-GFP假病毒和抗体的组作为假病毒包装对照。
假病毒颗粒定量：
假病毒用0.5U/μlBaseMuncher endonuclease (Abcam, ab270049)处理1.5小时。
提取RNA，用L蛋白的引物进行QPCR。并根据结果进行一致化处理。
假病毒滴度测定：
将vero细胞铺96孔板，24小时长到90%；
将假病毒用DMEM （10% FBS 044）3倍梯度稀释（2*，6*），100ul/孔加入96孔板，每个样做三孔平行(每个假病毒每种细胞6个孔，共8种假毒)15h之后CQ1拍照读数，计算滴度。
中和实验：
将vero细胞铺96孔板，24小时长到90%；实验当天从-80℃取出灭活血清，冰上融化（血清需提前56℃ 30min灭活）。取DMEM培养基（10% FBS 044）倒入一个10cm皿，用于稀释血清。稀释抗体（初始200ug/ml）(3个重复，2倍稀释，8个梯度)，稀释假病毒（到1000TU/50ul/assay）。
将稀释好的假病毒倒入10cm皿，加入96孔板（与培养基体积1:1，即1个重复孔60ul培养基+60ul假病毒），吹打混匀1次。将96孔板放入37℃孵育1h（如果超过2块，可两两摞起来，保证受热均匀）；孵育时间至40-50min，取出培养箱中事先准备好的vero细胞，将抽泵功力调至50%，吸尽vero细胞上清，加入血清与病毒的混合液100ul。
37℃孵育15h后，用CQ1显微镜读数法检测绿色荧光并拍照、计数。
实验结果如图6所示，其中半抑制率数据如下表（单位：ug/ml）：
Figure 548805DEST_PATH_IMAGE002
由结果可见，IMCAS-364对WHO提出的全部VOCs病毒株的假病毒均非常好的中和作用，是对三种Omicron突变型均可以中和的抗体。
实施例5、Octet检测IMCAS-364与其它已确认结合靶位抗体的竞争性实验
利用生物分子相互作用分析仪Octet red96检测IMCAS-364与SARS-CoV-2Prototype RBD的结合是否和hACE2以及其他抗体存在竞争关系。使用生物素-链霉亲和素偶联法（SA 芯片）捕获Prototype RBD（10ug/ml），使其响应值在一个合适的值。然后将需检测抗体稀释到浓度为400nM，每个孔的体积为200μl。先通过浓度为400nM的IMCAS-364抗体，使其与SARS-CoV-2 Prototype RBD的结合达到饱和状态，400nM的另外一个抗体在400nMIMCAS-364抗体存在的条件下通过尖端，同样的方法，先将另一个抗体通过尖端，使其与抗原的结合达到饱和状态，再将含有同样浓度抗体和IMCAS-364的混合溶液通过尖端，进行反向验证，利用Octet RED96系统(FortéBio)的生物膜干涉仪(BLI)进行实时关联和解离，所有实验均在室温环境下进行，最后使用Octet数据分析软件对数据进行处理，并得出结合曲线。
结果如图7所示，表明在与全部8种已知位点的代表抗体竞争中：IMCAS-364与ACE2、CR3022、COA1-16两个已知抗体发生竞争同时可以抑制ACE2结合的抗体，这也是首次发现此类结合特点抗体。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120>一种新型冠状病毒稀有广谱表位的人源抗体及其应用
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<160>20
<170>PatentIn version 3.5
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<213>人工序列
<400>20
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIKG 108

Claims (13)

1.一种新型冠状病毒稀有广谱表位的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括的CDR1氨基酸序列是：SEQ ID NO.13：GFTFSRYG，CDR2氨基酸序列是：SEQ ID NO.14：IWYDGSNK，CDR3的氨基酸序列是SEQ IDNO.15：AKQEGTYCSGGSCYSGLDY，其轻链可变区包括的CDR1的氨基酸序列是： SEQ ID NO.16：QSISSY、CDR2的氨基酸序列是： SEQ ID NO.17：AAS， CDR3的氨基酸序列是： SEQ IDNO.18：QQSYSTPLT。
2.如权利要求1所述的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，重链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.19：QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCAKQEGTYCSGGSCYSGLDYWGQGTLVTVSSAS，轻链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.20：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIKG。
3.如权利要求2所述的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，重链的全长氨基酸序列如SEQIDNO.10所示，轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
4.如权利要求1所述的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源抗体为单链抗体。
5.如权利要求4所述的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.8所示。
6.如权利要求1至5任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段的编码核酸。
7.如权利要求6所述的编码核酸，其特征在于，重链的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
8.如权利要求6所述的编码核酸，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
9.含如权利要求6-8任一项所述的编码核酸的表达载体或重组细胞。
10.含有权利要求1-6任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段作为有效成分的预防或治疗SARS-CoV-2引起的疾病的药物组合物。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受助剂。
12.权利要求1-6任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段的用途，其特征在于，在制备治疗SARS-CoV-2引起的疾病的预防或治疗的药物中应用。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述SARS-CoV-2选自原型株、Alpha、Beta、Delta、Omicron株中的一种或多种。
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