CN116589569B - 一种抗h7n9亚型流感病毒ha蛋白的纳米抗体及其噬菌体展示文库的构建方法和应用 - Google Patents

一种抗h7n9亚型流感病毒ha蛋白的纳米抗体及其噬菌体展示文库的构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗H7N9亚型流感病毒HA蛋白的纳米抗体及其噬菌体展示文库的构建方法和应用，属于纳米抗体技术领域。本发明以H7N9亚型流感病毒为研究对象，将其灭活纯化后免疫羊驼，利用噬菌体展示技术筛选特异性、亲和力和中和活性均高的抗H7N9亚型流感病毒HA蛋白纳米抗体。抗H7N9亚型流感病毒HA蛋白纳米抗体的成功制备，不仅为H7N9流感病毒诊断试剂的开发提供材料，而且还为鉴定H7N9亚型流感病毒HA蛋白抗原表位和疫苗设计提供思路，还为防控H7N9亚型流感病毒提供了药物基础。

Description

一种抗H7N9亚型流感病毒HA蛋白的纳米抗体及其噬菌体展示 文库的构建方法和应用
技术领域
本发明属于纳米抗体技术领域，具体涉及一种抗H7N9亚型流感病毒的纳米抗体及其噬菌体展示文库的构建方法和应用。
背景技术
羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，其重链由一个可变区(VHH)通过铰链区(Hinge)与传统恒定区(CH2-CH3)相联而成，单独的可变区VHH即可特异性结合靶点分子，分子量仅有15KDa左右，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。与普通抗体相比，Nb具有分子质量小、组织穿透性强、抗原亲和力高、能识别隐藏表位、免疫原性低、结构稳定、水溶性好、生产成本低、易于产业化等优点，在疾病诊断、癌症和感染性疾病治疗、小分子药物及毒素残留检测等领域展现出巨大的应用前景。基于纳米抗体具有分子量小和易于基因工程改造的优点，可以将纳米抗体与酶等报告基因进行融合表达，从而直接获得纳米抗体与酶的融合蛋白，避免对抗体的标记和使用二抗，从而简化生产工艺，降低生产成本，并具有非常广阔的市场前景。Huo等利用原始美洲驼纳米抗体库并基于PCR技术，筛选制备出两个能高效结合冠状病毒S1亚基的受体结合域的纳米抗体H11-D4和H11-H4，该抗体能阻断刺突蛋白与宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合。
H7N9亚型流感病毒是甲型流感病毒中的一种亚型，根据流感病毒的HA(血细胞凝集素)和NA(神经氨酸酶)分型。HA具有16种亚型，NA有9种亚型，HA和NA可以形成144种不同亚型流感病毒。目前，针对H7N9亚型流感病毒的检测，通常是利用抗N(神经氨酸酶)的特异性抗体进行检测，例如，公开号为CN105445459A的专利公开了检测H7N9亚型流感病毒神经氨酸酶(N9)特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒，其中，是利用生物信息学软件预测H7N9亚型流感病毒浙江株的神经氨酸酶线性B细胞抗原表位，并制备相应的特异性抗体实现检测目的。然而目前尚未有关于针对H7N9流感病毒的纳米抗体的报道，这无疑阻碍了H7N9流感病毒诊断试剂的开发和应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗H7N9亚型流感病毒的纳米抗体，所述纳米抗体抗体是利用噬菌体展示技术筛选得到的，具有特异性和亲和力高的特点，为H7N9亚型流感病毒诊断试剂的开发提供材料，而且为鉴定H7N9亚型流感病毒抗原表位和疫苗设计提供思路。
本发明提供了一种抗H7N9亚型流感病毒的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种表达所述纳米抗体的噬菌体展示文库的构建方法，包括以下步骤：
1)将H7N9亚型流感病毒和佐剂制成疫苗免疫羊驼，免疫5次后采血，分离外周血淋巴细胞；
2)提取所述外周血淋巴细胞的RNA，经反转录得到的cDNA进行PCR扩增VHH基因片段；
3)将所述VHH基因片段克隆至噬菌体载体中，得到重组噬菌体载体；
4)用所述重组噬菌体载体构建噬菌体文库；
5)利用H7N9的HA蛋白对所述噬菌体文库进行若干次淘选，得到抗HA蛋白的阳性噬菌体。
优选的，所述H7N9亚型流感病毒和佐剂的体积比为1:1；
所述佐剂包括弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。
优选的，所述采血后，检测血清中抗体效价，当抗体效价不低于1:64000时从采集的血液中分离外周血淋巴细胞。
优选的，所述PCR扩增为巢式PCR扩增；所述巢式PCR扩增的引物包括外引物和内引物；
所述外引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:3所示的反向引物；
所述内引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:5所示的反向引物。
优选的，用所述重组噬菌体载体构建噬菌体文库的方法为将所述重组噬菌体载体转化入大肠杆菌感受态细胞中，振荡培养，然后将菌体进行离心，将上清液与PEG8000/NaCl溶液混合静置，离心分离沉淀得到噬菌体文库。
优选的，利用H7N9的HA蛋白对所述噬菌体文库进行若干次淘选的方法为将噬菌体文库溶液添加到包被有H7N9-HA蛋白的酶标板中孵育，洗脱，得到的洗脱液经中和后在辅助噬菌体的作用下感染细菌，经过抗生素培养，获得第一轮噬菌体文库，完成第一次淘选，将所述第一轮噬菌体文库按照所述第一次淘选的方法进行第二次和第三次淘选，得到富集的噬菌体文库。
优选的，在若干次淘选后，还包括对富集噬菌体文库进行纳米抗体的筛选；
纳米抗体的筛选的方法为将淘选后的噬菌体单菌落接种于含抗生素的培养基中培养，收集噬菌体利用ELISA方法筛选HA蛋白对应的纳米抗体，再利用Phage ELISA鉴定挑选阳性菌液，得到的阳性菌液经测序，得到SEQ ID NO:1所示的纳米抗体序列。
本发明提供了所述纳米抗体在制备检测H7N9亚型流感病毒或鉴定H7N9亚型流感病毒抗原表位或筛选疫苗的试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供了所述纳米抗体在制备抗H7N9亚型流感病毒的药物中的应用。
本发明提供了一种抗H7N9亚型流感病毒的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明以H7N9亚型流感病毒为研究对象，将其灭活纯化后免疫羊驼，利用噬菌体展示技术筛选特异性和亲和力高的抗HA蛋白纳米抗体。H7N9亚型流感病毒抗HA蛋白纳米抗体的制备，不仅为H7N9流感病毒诊断试剂的开发提供材料，而且为鉴定H7N9亚型流感病毒抗原表位和疫苗设计提供思路。
附图说明
图1为纳米抗体编码基因连接到载体后PCR鉴定结果；
图2为纳米抗体的纯化结果；
图3为抗H7N9 HA蛋白中和活性检测结果；
图4为抗H7N9 HA蛋白Nb5抗体亲和力检测结果；
图5为H7N9-HA-Nb1纳米抗体特异性检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种抗H7N9亚型流感病毒的纳米抗体(Nb5)，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(QVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCAASGSIFSINVMGWYRQAPGKQLEFVAQISNSGKLAYGDSVQGRFTISRDNAKSTIYLQMNSLNPEDTAVYHCAAWHERETSTWYEGQGTQVTVSS)所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:8(CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCACCCAGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCATCTTCAGTATCAATGTCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAACAGCTCGAGTTTGTCGCACAGATCTCTAATAGTGGTAAATTAGCCTATGGAGACTCCGTGCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGTCGACGATTTATCTACAAATGAACAGCCTGAACCCTGAGGACACAGCCGTCTATCACTGTGCAGCATGGCACGAACGTGAGACTAGTACCTGGTACGAAGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA)所示。
在本发明中，所述纳米抗体(Nb5)是从噬菌体展示文库中分离筛选得到，与同批分离的纳米抗体(Nb1、Nb2、Nb3、Nb4)相比，具有更强的中和活性，中和实验结果表明，抗H7N9HA蛋白的纳米抗体中和活性分别为：Nb1是25ng/ml；Nb2和Nb3均为15.88ng/ml；Nb4是10.61ng/ml；Nb5是7.5ng/ml。同时亲和力实验结果表明，Nb5具有较高的亲和活性，其EC50为1.54nM。此外，Nb5还具有较强的特异性，间接免疫荧光试验结果表明，Nb5仅与H7N9亚型流感病毒HA蛋白特异性结合，与其它亚型流感病毒HA蛋白和新城疫病毒无反应。
本发明提供了一种表达所述纳米抗体的噬菌体展示文库的构建方法，包括以下步骤：
1)将H7N9亚型流感病毒和佐剂制成疫苗免疫羊驼，免疫5次后采血，分离外周血淋巴细胞；
2)提取所述外周血淋巴细胞的RNA，经反转录得到的cDNA进行PCR扩增VHH基因片段；
3)将所述VHH基因片段克隆至噬菌体载体中，得到重组噬菌体载体；
4)用所述重组噬菌体载体构建噬菌体文库；
5)利用H7N9的HA蛋白对所述噬菌体文库进行若干次淘选，得到抗HA蛋白的阳性噬菌体。
本发明将H7N9亚型流感病毒和佐剂制成疫苗免疫羊驼，免疫5次后采血，分离外周血淋巴细胞。
在本发明中，所述H7N9亚型流感病毒和佐剂的体积比优选为1:1。所述佐剂优选包括弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。在免疫动物时，第一次免疫采用的佐剂为弗氏完全佐剂，在以后的每次免疫中优选用弗氏不完全佐剂。所述免疫的间隔时间优选为两周。第5次免疫后7天进行采血。所述采血后，优选检测血清中抗体效价，当抗体效价不低于1:64000时从采集的血液中分离外周血淋巴细胞。本发明对所述分离外周血淋巴细胞的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的分离方法即可。
得到外周血淋巴细胞后，本发明提取所述外周血淋巴细胞的RNA，经反转录得到的cDNA进行PCR扩增VHH基因片段。
本发明对提取所述外周血淋巴细胞的RNA和反转录的方法均没有特殊的限制，采用本领域所熟知的提取RNA和反转录的方法即可。
在本发明中，所述PCR扩增优选为巢式PCR扩增；所述巢式PCR扩增的引物优选包括内引物和外引物。所述外引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2(GTCCTGGCTGCTCTTCT)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3(GGTACGTGCTGTTGA)所示的反向引物；所述内引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4(CTACAAATGCCTATGCATCCCAGGTGCAGCTCGTGGAGTC)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:5(AAACAACTTTCAACAGTGGAGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG)所示的反向引物。第一步(外引物)PCR反应扩增的总体系为50μl：模板cDNA2μl、2.5mM dNTPs 4μl、5×Phusion HF Buffer 10μl、Phusion DNAPolymerase 1μl、正向引物1μl、正向引物1μl、ddH2O 31μl。PCR反应条件：98℃，30sec；98℃，10sec，55℃，30sec，72℃，15sec，25cycles；72℃，5min。第二步(内引物)PCR反应扩增的总体系为50μl：第一步PCR产物2μl、2.5mMdNTPs 4μl、5×Phusion HF Buffer 10μl、Phusion DNA Polymerase 1μl、正向引物1μl、正向引物1μl、ddH2O 31μl。PCR反应条件优选为：98℃，30sec；98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，15sec，25个循环；72℃，5min。
得到VHH基因片段后，本发明将所述VHH基因片段克隆至噬菌体载体中，得到重组噬菌体载体。
在本发明中，所述克隆的方法有选为将所述VHH基因片段和线性化噬菌体载体通过同源重组的方法进行连接。在本发明实施例中，克隆的方法用同源重组试剂盒操作完成。
得到重组噬菌体载体后，本发明用所述重组噬菌体载体构建噬菌体文库。
在本发明中，用所述重组噬菌体载体构建噬菌体文库的方法优选为将所述重组噬菌体载体转化入大肠杆菌感受态细胞中，振荡培养，然后进行抗生物素筛选培养，分离上清与PEG8000/NaCl溶液混合静置，离心分离沉淀得到噬菌体文库。所述大肠杆菌感受态细胞采用SS320大肠杆菌制备得到。本发明对所述大肠杆菌感受态的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的大肠杆菌感受态的制备方法即可。所述转化的方法优选为电转化。所述电转化优选用Eppendorf电穿孔仪，设置参数为2.5kV，25μF，200Ω，2mm。电转化后优选在37℃预热的SOC培养基中培养。所述振荡培养的转速优选为110～130rpm更优选为120rpm。所述抗生物素筛选培养的培养基优选为2×YT/Amp-Kan培养基。培养的条件优选为37℃培养12～14h。所述分离上清的方法优选为离心。所述离心的转速优选为9000～11000rpm，更优选为10000rpm。所述离心的时间优选为9～11min，更优选为10min。
得到噬菌体文库后，本发明利用H7N9的HA蛋白对所述噬菌体文库进行若干次淘选，得到抗HA蛋白的阳性噬菌体。
在本发明中，利用H7N9的HA蛋白对所述噬菌体文库进行若干次淘选的方法优选为将噬菌体文库溶液添加到包被有H7N9-HA蛋白(购自义翘神州，货号SEK40103)的酶标板中孵育，洗脱，得到的洗脱液经中和后在辅助噬菌体的作用下感染细菌，经过抗生素培养，获得第一轮噬菌体文库，完成第一次淘选，将所述第一轮噬菌体文库按照所述第一次淘选的方法进行第二次和第三次淘选，得到富集的噬菌体文库。
在本发明中，在若干次淘选后，优选还包括对富集噬菌体文库进行纳米抗体的筛选。纳米抗体的筛选的方法为将淘选后的噬菌体单菌落接种于含抗生素的培养基中培养，收集噬菌体利用ELISA方法筛选HA蛋白对应的纳米抗体，再利用Phage ELISA鉴定挑选阳性菌液，得到的阳性菌液经测序，得到SEQ ID NO:1所示的纳米抗体序列。
基于所述纳米抗体具有良好的特异性、亲和力和中和活性，因此本发明提供了所述纳米抗体在制备检测H7N9亚型流感病毒的试剂或试剂盒中的应用。同时还提供了所述纳米抗体在制备鉴定H7N9亚型流感病毒抗原表位或筛选疫苗的试剂或试剂盒中的应用。本发明提供了所述纳米抗体在制备抗H7N9亚型流感病毒的药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种抗H7N9亚型流感病毒的纳米抗体及其噬菌体展示文库的构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种表达抗H7N9亚型流感病毒的纳米抗体的噬菌体展示文库的构建方法
1、实验方法
1.1乳化纯化的病毒及免疫羊驼
将50μg灭活后纯化的H7N9 AIV与相同体积的弗氏佐剂混合、乳化后，通过颈部皮下多点注射免疫羊驼。首次免疫，选用弗氏完全佐剂；此后，每隔两周使用弗氏不完全佐剂进行乳化H7N9 AIV，共免疫5次，每次免疫的剂量为50μg。第5次免疫后7天采血，利用间接ELISA方法检测其抗体效价，具体方法为：
a包被：以灭活后纯化的H7N9AIV为包被抗原，100ng/孔，4℃包被过夜。
b封闭：弃包被液，于吸水纸上拍干残余液体，加入2％BSA进行，200μl/孔，37℃下孵育1h。
c孵育一抗：用洗涤液PT洗涤3次，拍干残余液体，加入使用PBS梯度稀释的待检血清及阴性血清对照，100μl/孔，37℃下孵育1h。
d孵育二抗：用洗涤液PT洗涤3次，拍干残余液体，加入使用PBS稀释的Anti-alpaca-HRP酶标二抗，100μl/孔，37℃下孵育1h。
e显色：用PBST洗涤液洗涤3次，拍干残余液体，加入TMB显色液进行显色，100μl/孔，37℃下孵育5min。
f终止：加入硫酸终止液进行终止，100μl/孔，终止后立即使用酶标仪在波长450nm时各孔光吸收值。
当血清中抗H7N9 AIV的抗体效价不低于1:64000时，进行噬菌体展示抗体库的构建。
1.2 VHH噬菌体抗体文库的构建及淘选
1.2.1外周血淋巴细胞的分离
利用人外周血淋巴细胞分离液分离羊驼外周血淋巴细胞(PBMC)，具体操作按照试剂盒(索莱宝，货号P9270-200)的说明书完成，分离获得的PBMC用于细胞总RNA的提取。
1.2.2 VHH基因片段的扩增
利用RNA提取试剂盒(OMEGA公司，货号R6834-01)提取PBMC的总RNA，并利用反转录试剂盒(TaKaRa公司，货号R026A)，以提取的总RNA为模板，反转录获得cDNA，再通过巢式PCR扩增VHH基因，具体方法如下：第一步(外引物)PCR反应扩增的总体系为50μl：模板cDNA2μl、2.5mM dNTPs 4μl、5×Phusion HF Buffer 10μl、Phusion DNAPolymerase 1μl、正向引物1μl、正向引物1μl、ddH2O 31μl。PCR反应条件：98℃，30sec；98℃，10sec，55℃，30sec，72℃，15sec，25cycles；72℃，5min。第二步(内引物)PCR反应扩增的总体系为50μl：第一步PCR产物2μl、2.5mM dNTPs 4μl、5×Phusion HF Buffer 10μl、Phusion DNAPolymerase 1μl、正向引物1μl、正向引物1μl、ddH2O 31μl。PCR反应条件优选为：98℃，30sec；98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，15sec，25个循环；72℃，5min。其中外引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2(GTCCTGGCTGCTCTTCT)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3(GGTACGTGCTGTTGA)所示的反向引物；所述内引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4(CTACAAATGCCTATGCATCCCAGGTGCAGCTCGTGGAGTC)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:5(AAACAACTTTCAACAGTGGAGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG)所示的反向引物。
第一步PCR的产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定、分离，回收分子量大小～700bp的PCR产物；再以此回收产物为模板，进行第二轮PCR扩增，获得分子量大小为400bp左右的VHH片段，再行切胶回收。
1.2.3 VHH噬菌体展示载体的构建
将上述VHH片段和线性化的噬菌粒载体，通过同源重组的方法进行连接，具体操作按照同源重组试剂盒说明书进行(诺唯赞，货号C113-01)。
1.2.4 SS320大肠杆菌感受态细胞的制备
将SS320大肠杆菌(预感染M13KO7 Helper Phage)培养至OD600nm为0.4后，将其迅速冷却，在4℃、6000g下离心5～10min，用预冷的ddH2O(无菌)反复洗涤3～5次，最后一次离心结束后用10％甘油水(无菌)重悬SS320感受态细胞，200μl/管，-80℃保存备用。
1.2.5连接产物转化及纳米抗体噬菌体文库的收获
从-80℃超低温保存箱取出1管SS320大肠杆菌感受态细胞，冰上放置5min使其融化，然后将连接产物轻轻加入到SS320感受态细胞中，轻轻混匀加入到电转杯中，用Eppendorf电穿孔仪，设置参数为2.5kV，25μF，200Ω，2mm，进行电击转化。将转化后的感受态细胞立即重悬，转入到20mL的37℃预热的SOC培养基中，37℃、120r/min，震荡培养1h后，取100μl原液(备用)，其余培养物转接到500ml的2×YT/Amp-Kan培养基，37℃培养12～14h，培养结束后，将培养液离心，10000g/min，10min，4℃，收集上清，并加入1/4体积预冷的PEG8000/NaCl溶液，充分混匀，放入4℃冰箱静置30～60min；最后将混合液离心，用1mlPBST悬浮沉淀，测定并稀释至特定浓度，分装保存于-80℃备用。
1.2.6噬菌体展示文库库容和多样性的测定
将电转活化后的重组菌(上述100μl原液)进行10倍比梯度稀释，选择10-3～10-5的稀释液分别取10μl滴涂于LB/Amp-Kan平板，37℃培养12h，计算转化效率，最终得到库容为1×109CFU(colony-forming units)的噬菌体文库。随机挑取30个单克隆，利用VHH-F(CAGGTGCAGCTCGTGGAG，SEQ ID NO:6)和VHH-R(TGAGGAGACGGTGACCTG，SEQ ID NO:7)引物进行PCR鉴定，PCR反应体系：2×ExTaq mix 12.51μl、VHH-F 1μl、VHH-R1μl、模板2μl，ddH2O补至25μl。PCR扩增条件：96℃2min；96℃15s，58℃25s，72℃30s，35个循环72℃5min。琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，目的片段大小约400bp，并将阳性克隆进行测序，以确定纳米抗体的多样性。
1.3、抗H7N9-HA蛋白的特异性纳米抗体的筛选
1.3.1抗H7N9-HA蛋白特异性重组噬菌体的淘选
将纯化的H7N9-HA蛋白包被ELISA板，2％BSA为无抗原对照。取上述制备的噬菌体溶液，加入ELISA板中，室温孵育2h，弃去噬菌体样品。然后，每孔中加入新鲜配制的0.1MHCl溶液，室温轻轻震荡10min，将洗脱液迅速用等体积1M Tris-HCl(pH 8.0)中和。取洗脱液加入到1mL的对数期的NEB5aF’细菌中，在37℃、200r/min下振荡培养1h，然后加入M13辅助噬菌体，继续37℃、200r/min培养1h，转接到40mL的2×YT/Amp-Kan培养基中。重复上述操作，收集得到噬菌体文库；将获得的筛选后第一轮噬菌体文库，利用上述操作进行第二轮和第三轮的筛淘，每轮通过滴定的方法，确定噬菌体的富集情况。
1.3.2纳米抗体的筛选
从富集的平板上随机挑取90个单菌落，接种于96孔深孔板中，每孔一个单菌落，加入到2×YT/Amp-Kan培养基培养(并加入20μl辅助噬菌体)过夜；将菌液离心收获上清中噬菌体，用ELISA方法筛选HA蛋白对应的纳米抗体，Phage ELISA鉴定挑选阳性菌液进行测序，得到纳米抗体序列，具体操作如下：
(1)用HA蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4度包被过夜；
(2)将ELISA酶标板倒扣去掉上清，每孔加入200μl 2％BSA，同时未包被HA蛋白的阴性对照组也加入200μl 2％BSA，37度封闭1h；
(3)将96深孔板离心，4000rpm，4度离心10min；
(3)1.5h后，弃掉ELISA酶标板中的上清液，用PBST清洗酶标板3遍后甩干，加入50μl的噬菌体(即96深孔板的上清)，室温轻轻摇晃2h；
(4)清洗ELISA酶标板：用PBST清洗4遍后加入HRP-M13抗体100μl，37℃孵育1h；
(5)显色：弃掉ELISA酶标板中的上清液，用PBST清洗酶标板3遍后甩干，加入100μlTMB显色液，室温放置10～15min，观察显色；
(6)终止反应：每孔加入100μl硫酸终止液终止反应；
(7)用酶标仪测量：在450nm波长处测定各孔OD450值。选取吸光度值较高的10～15个阳性克隆菌液保菌，并进行测序验证。
1.4重组纳米抗体的克隆表达与纯化
将抗体序列克隆至pCDNA3.1-Fc(人)真核表达载体，大提质粒后转染至293F悬浮细胞，7天后，8000rpm/min离心收集上清，利用ProteinA纯化介质纯化目的抗体，并进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色液染色1h，通过脱色液脱色，分析结果，收集表达的纳米抗体。
1.5纳米抗体的克隆与表达
将纳米抗体序列克隆至pcDNA 3.1真核表达载体，提取质粒并转染至293F悬浮细胞，培养7天后收集上清，PBS缓冲液透析过夜，利用Ni-NTA纯化介质纯化出目的抗体，进行SDS-PAGE试验，分析结果。
2、试验结果
2.1 PCR扩增
2.1.1第一轮PCR扩增
琼脂糖凝胶电泳结果显示，使用oligo dT+随机引物反引物转录后进行第一轮扩增使用2μl作为模板扩增条带强清晰且无杂带，切胶并回收目的条带。
2.1.2第二轮PCR扩增
2.2阳性克隆率菌落PCR
菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果显示，挑选的15个单克隆均为阳性克隆，阳性率为100％，抗体文库阳性克隆率符合要求。
2.3重组纳米抗体的克隆表达与纯化
将筛选出的纳米抗体基因克隆至pCDNA3.1-Fc表达载体，通过PCR方法鉴定，目的基因成功连接到载体中(图1)。此外，将阳性质粒转至DH5α感受态，并挑单克隆菌体，摇菌后提取质粒，并将该质粒转染至293F细胞，7天后收集细胞上清，通过protein A介质纯化抗体。纯化的纳米抗体经SDS-PAGE电泳后，使用考马斯亮蓝染色液染色、脱色后，可以看出在洗脱的样品中含有纳米抗体(图2)，将样品收集存放于-80℃。
实施例2
H7N9亚型流感病毒HA蛋白的纳米抗体特性鉴定
1中和活性检测
通过病毒和抗体中和实验，分析抗H7N9 HA蛋白纳米抗体的中和活性，具体步骤如下：96孔细胞板铺制MDCK细胞，将单克隆抗体从100ng/μl开始，按照2倍比依次稀释至0.25ng/μl，将稀释好的抗体分别和100TCID50的H7N9流感病毒混合，室温孵育1h，以40μl/孔的体积加入MDCK细胞中，设置病毒感染阳性对照和抗体阴性对照，37℃，5％CO2培养箱培养72小时后，取细胞上清检测血凝，根据抗体抑制病毒比例抗体的计算IC50。
中和实验结果表明，抗H7N9 HA蛋白的纳米抗体中和活性分别为：Nb1是25ng/ml；Nb2和Nb3均为15.88ng/ml；Nb4是10.61ng/ml；Nb5是7.5ng/ml。通过中和试验结果表明，Nb5具有很好的中和活性(图3)。后续试验选取Nb5进行相关研究。
2亲和力检测
H7N9亚型流感HA蛋白100ng/孔包被ELISA板，将抗H7N9亚型流感病毒HA蛋白纳米抗体(H7N9-HA-Nb1)2倍比若干次稀释后加入ELISA板，37℃孵育1h，PBST洗涤ELISA板3次，加入商品化His-HRP二抗，37℃孵育1h，PBST洗涤ELISA板3次，TMB显色10min，读取OD450值，并计算EC50值(计算EC50网址：https://www.aatbio.com/tools/ec50-calculator)，判定筛选出来的纳米抗体亲和能力。
经ELISA测得抗H7N9 HA蛋白Nb5具有较高的亲和活性，筛选出来的纳米抗体的EC50为1.54nM(见图4)。
3特异性检测
通过间接免疫荧光实验，对所得的H7N9-HA-Nb5特异性进行分析。具体步骤为：分别转染不同亚型的流感病毒(H1N1、H3N2、H5N6、H6N6、H7N9、H9N2和H10N5)的HA蛋白真核表达质粒，转染细胞后24h，使用PBS洗涤细胞2次；加入4％多聚甲醛固定细胞15min；PBS洗涤细胞3次后加入由PBS配制的2％的BSA溶液，37℃封闭30min；PBS缓冲液充分洗涤后加入0.1％Triton X-100透膜15min，PBS缓冲液充分洗涤；加入使用1％BSA溶液稀释的抗HA蛋白纳米抗体，孵育1h，洗涤，然后加入抗anti-His-FITC二抗，孵育30min，洗涤，加入DAPI，用激光共聚焦显微镜检测并拍摄照片。
在转染HA真核表达质粒后24h进行间接免疫荧光(IFA)试验，并设置空白细胞对照。试验结果证明，筛选的H7N9-HA-Nb5与H7N9亚型流感病毒HA蛋白特异性结合，与其它亚型流感病毒HA蛋白和新城疫病毒无反应(图5)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种抗H7N9亚型流感病毒的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述纳米抗体在制备检测H7N9亚型流感病毒或鉴定H7N9亚型流感病毒抗原表位或筛选疫苗的试剂或试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述纳米抗体在制备抗H7N9亚型流感病毒的药物中的应用。
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