CN113061167A

CN113061167A - 兔出血症病毒重组抗原及其应用

Info

Publication number: CN113061167A
Application number: CN202110435235.3A
Authority: CN
Inventors: 孔迪; 徐蓉; 方鹏飞; 曹文龙; 滕小锘; 张大鹤
Original assignee: Suzhou Shinuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Womei Biology Co ltd
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2041-04-22
Also published as: CN113061167B

Abstract

本发明涉及一种兔出血症病毒重组抗原及其应用，兔出血症病毒重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的兔出血症病毒重组抗原由RHDV1和RHDV2的VP60蛋白序列组成并对特定位置的氨基酸进行了点突变，该蛋白的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高、免疫原性强，对兔类没有致病性，能够在兔类体内产生较强的体液免疫，免疫后的兔类能够抵御强毒攻毒，可供大规模批量生产，质控容易，生产成本低。

Description

兔出血症病毒重组抗原及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种兔出血症病毒重组抗原及其应用。

背景技术

兔病毒性出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD)又名兔出血症，俗称兔瘟，是由兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus，RHDV)引起的兔的一种急性、烈性、高度传染性和高度致死性的疾病。经典的RHDV(RHDV1)主要侵害2月龄以上的家兔，发病率和死亡率高达90％，主要引起兔肝脏出血、坏死，实质器官水肿、淤血，并伴有呼吸系统出血等病变。2010年首次发现了RHDV新毒株，并将其命名为RHDV2型毒株，研究发现RHDV2型毒株对不同日龄的家兔均易感，且是唯一个能跨种传播的兔病毒属成员，并突破经典RHDV疫苗的免疫防线，迅速在世界范围内流行。RHDV2给家兔养殖业带来极大的潜在威胁和严重的影响，RHD亦被我国农业部兽医局列为二类动物疫病，也是OIE法定的通报动物疫病。

RHDV属于嵌杯病毒科兔病毒属，为无囊膜的单股正链RNA病毒，呈球形，直径为27～40nm。根据RHDV毒力差异可将其分为经典RHDV1型和RHDV2型。RHDV2型和经典RHDV1型二者病毒基因组结构相同，但核苷酸同源性仅为82.4％。RHDV病毒基因组分为ORF1和ORF2两个阅读框，ORF1位于基因组5’末端10～7041碱基位编码一个大的多聚蛋白前体，该蛋白可进一步水解为多个非结构蛋白和衣壳蛋白VP60；ORF2位于基因组3’末端7025～7378的碱基位编码另一个小蛋白VP10。VP60和VP10是RHDV的结构蛋白，其中VP60是组成病毒衣壳蛋白的唯一结构蛋白，也是病毒免疫保护性抗原，它在病毒诱导机体产生免疫反应的过程中起着非常重要的作用，同时由于VP60蛋白能够自我组装成病毒样颗粒，是RHDV新型疫苗的主要研究对象。

RHDV2临床症状与RHDV1毒株感染后相似，但在遗传特性和抗原性上有很大差异，用现有RHDV1疫苗不能有效预防家兔感染RHDV2。在已爆发2型兔病毒性出血症的国家多采用传统的灭活疫苗来防治RHDV2，但传统的灭活疫苗在灭活过程中可能损害有效的抗原决定簇，其产生的抗体水平维持时间较短，需要多次免疫，且灭活苗一定程度上也存在着散毒的潜在风险。因此，现亟需一种能够同时有效预防RHDV1和RHDV2感染的基因工程亚单位疫苗。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够同时有效预防RHDV1和RHDV2感染且安全高效、免疫原性强的兔出血症病毒重组抗原。

一种兔出血症病毒重组抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种核酸分子，其编码如上所述的兔出血症病毒重组抗原。

在其中一个实施例中，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的核酸分子。

在其中一个实施例中，所述重组载体为重组杆状病毒。

在其中一个实施例中，所述重组载体基于pFastBac1、pVL1393或pFastBac dual构建得到。

本发明还提供了一种宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸分子。

在其中一个实施例中，所述宿主细胞为Sf9细胞、High Five细胞或Sf21细胞。

本发明还提供了一种如上所述的兔出血症病毒重组抗原、核酸分子、重组载体或宿主细胞在制备用于防治兔病毒性出血症的产品中的应用。

本发明还提供了一种兔病毒性出血症疫苗，其包括如上所述的兔出血症病毒重组抗原，以及药学上可接受的佐剂。

在其中一个实施例中，所述佐剂为MONTANIDE ISA 206VG、MONTANIDE ISA 201VG、MONTANIDE ISA 51VG、液体石蜡、樟脑油和植物细胞凝集素中的一种或多种。

本发明还提供了一种如上所述的兔出血症病毒重组抗原的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养如上所述的宿主细胞，收集培养液和/或所述宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到所述兔出血症病毒重组抗原。

本发明还提供了一种成套试剂盒，其包含如上所述的兔病毒性出血症疫苗，以及用于接种所述兔病毒性出血症疫苗的容器。

本发明构建了一个嵌合的VP60蛋白作为兔出血症病毒重组抗原，命名为RHDV-VP60C(Chimeric VP60)，RHDV-VP60C由RHDV1和RHDV2的VP60蛋白序列组成并对特定位置的氨基酸进行了点突变，该蛋白的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对兔类没有致病性，可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。具体来说，在RHDV-VP60C的氨基酸序列中，第1～92位是RHDV2的VP60片段，第93～281位是RHDV1的VP60片段，第282～459位是RHDV2的VP60片段，第460～579位是RHDV1的VP60片段。而且，将氨基酸序列中第301N和第305P突变成RHDV1 VP60蛋白相应位置的301S和305S。突变之后，该嵌合VP60C蛋白产生的RHDV1中和抗体显著增多，产生的RHDV2的中和抗体虽然有所减少，但是依然达到了保护的标准。而突变之前的嵌合蛋白，产生的RHDV1抗体少，当免疫剂量低的时候，对RHDV1型不能完全保护。

附图说明

图1为实施例1中RHDV-VP60C基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其在1.7kbp位置出现目的条带；

图2为实施例1中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其在1.7kbp位置出现目的条带；

图3为实施例1中构建的含有目的基因的转移载体pF-RHDV-VP60C的结构示意图；

图4为实施例4中RHDV-VP60C表达产物的SDS-PAGE检测结果图，其在分子量约62kDa附近出现目的条带；

图5为实施例5中RHDV-VP60C表达产物的Western Blot鉴定结果图；

图6为实施例6中接种了杆状病毒的Sf9细胞的荧光显微镜照片；

图7为实施例8中重组杆状病毒细胞培养物的病毒样颗粒的电镜照片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语解释

“抗原”是指所有能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。因此，抗原有两个基本特性，就是抗原性和免疫原性。抗原性指抗原与其所诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力。免疫原性是指能引起免疫应答的性能，即抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。

“载体(vector)”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。

“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

本发明一实施例的兔出血症病毒重组抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明构建了一个嵌合的VP60蛋白作为兔出血症病毒重组抗原，命名为RHDV-VP60C(Chimeric VP60)，RHDV-VP60C由RHDV1和RHDV2的VP60蛋白序列组成并对特定位置的氨基酸进行了点突变，其能够在兔类体内产生较强的体液免疫，免疫后的兔类能够抵御强毒攻毒，且对兔类没有致病性，安全性高。具体来说，在RHDV-VP60C的氨基酸序列中，第1～92位是RHDV2的VP60片段，第93～281位是RHDV1的VP60片段，第282～459位是RHDV2的VP60片段，第460～579位是RHDV1的VP60片段。而且，将氨基酸序列中第301N和第305P突变成RHDV1 VP60蛋白相应位置的301S和305S。突变之后，该嵌合VP60C蛋白产生的RHDV1中和抗体显著增多，产生的RHDV2的中和抗体虽然有所减少，但是依然达到了保护的标准。而突变之前的嵌合蛋白，产生的RHDV1抗体少，当免疫剂量低的时候，对RHDV1型不能完全保护。

本发明一实施例的核酸分子，其编码如上所述的兔出血症病毒重组抗原。

在一个具体示例中，该核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。可以理解，由于密码子的简并性，能够表达同一蛋白的核酸序列具有多种形式，以上为经过密码子优化的核酸序列，采用了两个终止密码子，可以提高终止效率，但序列形式不限于此。

本发明一实施例的重组载体，其含有如上所述的核酸分子。

在一个具体示例中，上述重组载体为重组杆状病毒。昆虫杆状病毒表达载体系统是一种可在昆虫细胞中大规模表达外源重组蛋白的最通用和最强大的真核表达系统之一，其具有安全性高、高水平及可溶性表达、修饰及折叠的准确性高、低成本等优势。

可选地，重组载体基于pFastBac1、pVL1393或pFastBac dual构建得到，优选为pFastBac1。以上为用于杆状病毒表达载体系统的转移载体，但载体的类型并不限于此，可根据具体需要进行选择。

可以理解，载体还可包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子等及其他表达控制元件(例如转录终止信号、或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

本发明一实施例的宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸分子。

在一个具体示例中，宿主细胞为Sf9细胞、High Five细胞或Sf21细胞等，优选为Sf9。通过悬浮培养Sf9细胞进行蛋白表达，表达水平较高，蛋白免疫原性好。

本发明一实施例的兔出血症病毒重组抗原的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养上述宿主细胞，收集培养液和/或宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到兔出血症病毒重组抗原。

本发明一实施例的兔病毒性出血症疫苗，其包括上述兔出血症病毒重组抗原，以及药学上可接受的佐剂。

在一个具体示例中，佐剂可以是MONTANIDE ISA 206VG、MONTANIDE ISA 201VG、MONTANIDE ISA 51VG、液体石蜡、樟脑油和植物细胞凝集素中的一种或者两种以上的组合，优选使用MONTANIDE ISA 201VG。

可以理解，该兔病毒性出血症疫苗还可用于与其他疫苗制成多联疫苗。本发明一实施例的多联疫苗，包括上述兔病毒性出血症疫苗、兔多杀性巴氏杆菌病疫苗、兔魏氏梭菌病疫苗中的至少两种，例如兔多杀性巴氏杆菌病-兔病毒性出血症疫苗(二联苗)、兔魏氏梭菌病-兔多杀性巴氏杆菌病-兔病毒性出血症疫苗(三联苗)等。

本发明一实施例的成套试剂盒，其包含上述兔病毒性出血症疫苗，以及用于接种该兔病毒性出血症疫苗的容器例如注射器等。

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1转移载体pF-RHDV-VP60C的构建与鉴定

1.RHDV-VP60C基因扩增与纯化

在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的RHDV-VP60C基因(SEQ IDNO:2)并克隆到pUC17载体上，得到pUC-RHDV-VP60C质粒载体。以pUC-RHDV-VP60C质粒作为模板，RHDV-VP60C-F、RHDV-VP60C-R作为上下游引物进行PCR扩增(RHDV-VP60C-F、RHDV-VP60C-R的基因序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示)，扩增体系见表1。

表1 RHDV-VP60C基因扩增体系

反应成分	单位(μL)
		pUC-RHDV-VP60C质粒	1
RHDV-VP60C-F引物	2
		RHDV-VP60C-R引物	2
2×PCR MasterMix	25
		ddH<sub>2</sub>O	20

反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图1所示，在1.7kbp的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切与纯化

将pFastBac1质粒和RHDV-VP60C基因PCR扩增产物使用BamHⅠ、HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2和表3。将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac1质粒以及RHDV-VP60C基因片段。

表2 RHDV-VP60C基因酶切反应体系

反应成分	单位(μL)
		PCR产物	20
反应Buffer	5
		BamHⅠ酶	2
HindⅢ酶	2
		ddH<sub>2</sub>O	21

表3 pFastBac1质粒酶切反应体系

反应成分	单位(μL)
		PFastBac1质粒	10
反应Buffer	5
		BamHⅠ酶	2
Hind Ⅲ酶	2
		ddH<sub>2</sub>O	31

3.连接

将双酶切的pFastBac1质粒和RHDV-VP60C基因酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，具体连接反应体系见表4。

表4 RHDV-VP60C基因与pFastBac1质粒连接体系

反应成分	单位(μL)
		RHDV-VP60C基因酶切产物	6
酶切质粒	2
		反应Buffer	1
T4 DNA连接酶	1

4.转化

将10μL连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μL不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0mL菌液浓缩成100μL涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5.菌落PCR和测序鉴定

挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，RHDV-VP60C-F和RHDV-VP60C-R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图2所示，出现1.7kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。构建的含有目的基因的转移载体pF-RHDV-VP60C的结构示意图如图3所示。

实施例2重组杆状病毒基因组Bac-RHDV-VP60C构建

1.DH10Bac菌转化

取实施例1中1μL pF-RHDV-VP60C质粒加入100μL的含有穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μL不含Amp的LB液体培养基，37℃培养5小时。取100μL菌液稀释81倍后，取100μL稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上，37℃培养48小时。

2.挑选单克隆

使用接种针挑取大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌落接种含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的LB液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒，获得重组质粒Bacmid-RHDV-VP60C。

实施例3重组杆状病毒转染

六孔板中每个孔接种0.8×10⁶个Sf9细胞，细胞汇合度为50％～70％。对于每一个孔制备以下的复合物：用100μL转染培养基T1稀释4μL的Cellfectin转染试剂，短暂的漩涡震荡；用100μL转染培养T1基稀释3μg实施例2中的重组Bacmid-RHDV-VP60C质粒，将稀释的转染试剂和质粒混合，轻轻吹匀，制备转染混合物。待细胞贴壁后加入上述的转染复合物，27℃孵育5小时，移除上清，添加2mL SF-SFM新鲜培养基，27℃培养4～5日收获上清。获得重组杆状病毒rBac-RHDV-VP60C，对收获的P1代重组杆状病毒使用间接免疫荧光法检测病毒滴度，rBac-RHDV-VP60C P1种毒病毒滴度为5.4×10⁷TCID₅₀/mL，扩增重组杆状病rBac-RHDV-VP60C作为种毒备用。

另外按照上述方法构建如下表5所示对照组的重组杆状病毒。

表5对照组信息

实施例4 SDS-PAGE检测

将实施例3中收获的RHDV-VP60C表达产物进行SDS-PAGE检测，同时使用感染空杆状病毒的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μL收获的表达产物，加入10μL的还原性5×loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。如图4所示，RHDV-VP60C表达产物在分子量约62kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

实施例5Western Blot鉴定

将实施例4中SDS-PAGE电泳后的还原性产物转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，羊源抗RHDV1阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的兔抗羊多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。同时使用羊源抗RHDV2阳性血清进行Western Blot检测。结果如图5所示，重组杆状病毒表达样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。

实施例6间接免疫荧光检测

向96孔细胞培养板中加入Sf9细胞悬液，100μL/孔(细胞浓度为2.5×10⁵～4.0×10⁵个/mL)，接种4孔，27℃静置15分钟，使Sf9细胞贴于培养板底壁，然后每孔加入10μL稀释10倍的重组病毒。同时设空白细胞对照。接种后细胞置27℃恒温培养箱中培养72～96小时，弃培养液，冷甲醇/丙酮(1:1)固定。首先同时与羊源抗RHDV1多抗血清和鼠源抗RHDV2多抗血清反应，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗羊IgG和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的羊抗鼠IgG反应，避光放置2h，4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核，滴加抗荧光淬灭封片剂封片。根据不同的染料选择不同波段的激发光，在荧光显微镜观察结果。接种空杆状病毒的Sf9细胞不能观察到荧光，而接种了重组杆状病毒的Sf9细胞能够观察到不同颜色的荧光，如图6所示，说明目的抗原蛋白在Sf9细胞中得到正确表达，重组杆状病毒构建正确，且RHDV-VP60C蛋白和两个抗体都能结合。

实施例7抗原蛋白血凝检测

将重组杆状病毒rBac-RHDV-VP60C接种昆虫细胞培养物，反复冻融3次后，以1000g离心5分钟，上清即为重组RHDV-VP60C蛋白。按照红细胞凝集试验中50孔板法。取重组RHDV-VP60C蛋白于50μL反应板，用0.01mol/L，pH值7.0～7.2的PBS溶液作2倍比稀释，加入等体积1％人“O”型红细胞悬液，振荡均匀，置2～8℃作用45分钟，观察结果。将反应板倾斜后判定结果，结果显示重组RHDV-VP60C蛋白对人“O”型红细胞凝集效价＞1:2¹⁸。

实施例8电镜观察

将重组杆状病毒细胞培养物超声破碎，12000r/min离心30分钟，取上清，0.22μm滤膜过滤，去除杂质，使用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩10倍。每个离心管加入浓度为40％的蔗糖溶液10mL，然后加入2.0mL超滤浓缩样品，29000r/min超速离心2小时，弃上清，沉淀用2.0mL PBS重悬。然后将悬液经过浓度分别为50％、60％、70％、80％的梯度浓度蔗糖离心，29000r/min超速离心2小时，然后收集位于60％～70％浓度交界处的条带。使用磷钨酸负染观察收集的产物，电镜下观察到大小约为40～50nm的病毒样颗粒，电镜结果如图7所示。

实施例9昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养及重组蛋白表达定量

在1000mL摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3～4天，待浓度长到(3～5)×10⁶cell/mL，活力大于95％时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为(3～8)×10⁵cell/mL。当细胞浓度达到(3～55)×10⁶cell/mL时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为(3～55)×10⁶cell/mL，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到(2～85)×10⁶cell/mL时，接种rBac-RHDV-VP60C，反应器培养条件为pH值6.0～6.5、温度25～27℃、溶氧30％～80％、搅拌速度100～180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧50％、搅拌速度100～180rpm。在感染之后继续培养5～9天，然后加入千分之一终浓度BEI，37℃作用48h后，加千分之二终浓度Na₂S₂O₃终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2～8℃保存疫苗原液。

使用双抗夹心Elisa方法对上述制备的疫苗抗原中RHDV-VP60C重组蛋白的含量进行检测，并计算得出结果如下，疫苗原液中RHDV-VP60C重组蛋白的平均含量约为168μg/mL。

实施例10疫苗的制备

取实施例9中所收获的适量RHDV-VP60C重组蛋白原液，测定血凝效价，抗原对人“O”型红细胞凝集效价均不低于1:2¹⁸，经0.2％甲醛溶液灭活后，将抗原加入到MONTANIDEISA 201VG佐剂中(体积比为46:54)，使得最终乳化好的疫苗中蛋白浓度为100μg/mL，乳化、质检合格后置于4℃保存。以相同的方法将实施例3中的对照组1制备成疫苗并保存。

实施例11免疫试验

试验一：安全性检验

取2～3月龄健康家兔10只为试验组，其中5只各颈部皮下注射实施例10中制备的重组RHDV-VP60C疫苗2.0mL，另外5只各颈部皮下注射对照组1疫苗2.0mL，同时以相同条件家兔5只作为对照，不接种疫苗，连续观察14日，记录三组的精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等。结果显示，所有试验兔均健活，精神状态、粪便正常，注射部位吸收良好，无肿块，说明疫苗安全性良好。

试验二：效力实验

取实施例10中制备的重组RHDV-VP60C疫苗和对照组1疫苗，分别充分摇匀后以2.0mL、1.0mL、0.5mL、0.25mL颈部皮下注射2～3月龄健康家兔各5只，同时设立阴性对照组5只。

(1)HI抗体检测：在免疫期间，每组动物每隔7天采一次血，分离血清并测定HI抗体效价。具体操作如下：将RHDV1肝悬液和RHDV2肝悬液用人“O”型红细胞进行HA试验，并根据结果配置制4HAU的病毒抗原液。在50孔微量血凝板第1～10孔各加入PBS液50μL。吸取待检血清50μL加入第1孔，混匀，依次倍比稀释至第10孔，吸取50μL弃去。第l～10孔各加入4HAU病毒抗原液50μL，室温静置至少30min。每孔各加入50μL红细胞，振荡1min混匀后，室温静置40min。以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价，具体结果见表6。

(2)攻毒试验：分别取免疫后21日的各组家兔5只攻毒，分别于颈部皮下注射RHDV1和RHDV2肝悬液1mL，观察21日，记录死亡与保护的动物数量，具体结果见表6。

表6效力试验分组及结果

根据以上结果可知，相比于对照组1，本发明的嵌合VP60C蛋白产生的RHDV1中和抗体显著增多，产生的RHDV2的中和抗体虽然有所减少，但是依然达到了保护的标准。而突变之前的对照组1嵌合蛋白，产生的RHDV1抗体少，当免疫剂量低的时候，对RHDV1型不能完全保护。

相关序列信息如下：

兔出血症病毒重组抗原(SEQ ID NO:1)：

MEGKARAASQGETAGTATTASVPGTTTDGMDPGVVATTSVVTTENASTSIATAGIGGPPQQVDQQETWRTNFYYNDVFTWSVADAPGNILYT

VQHSPQNNPFTAVLSQMYAGWAGGMQFRFIVAGSGVFGGRLVAAVIPPGIEIGPGLEVRQFPHVVIDARSLEPVTITMPDLRPNMYHPTGDPGLVPTLVLSVYNNLINPFGGSTNAIQVTVETRPSDDFEFVMIRAPSSKTVDSISPAGLLTTPVLTGVGNDNRWNGQIVGLQPVPGGFSTCNRHWNLN

GSTFGWSSPRFAAIDHDRGSASYSGSSSSNVLELWYASAGSAADNPISQIAPDGFPDMSFVPFSGTTVPTAGWVGFGGIWNSSNGAPFVTTVQAYELGFATGAPSNPQPTTTTSGAQIVAKSIYGVATGINQATAGLFVMASGVISTPNSSAITYTPQPNRIVNAPGTPAAAPIGKNT

PIMFASVVRRTGDVNASAGSANGTQYGTGSQPLPVTIGLSLNNYSSALMPGQFFVWQLTFASGFMEIGLSVDGYFYAGTGASTTLIDLTELIDVRPVGPRPSKSTLVFNLGGTANGFSYV

重组抗原基因序列(SEQ ID NO:2)：

atggaaggcaaagcgcgcgcggcgagccagggcgaaaccgcgggcaccgcgaccaccgcgagcgtgccgggcaccaccaccgatggcatggatccgggcgtggtggcgaccaccagcgtggtgaccaccgaaaacgcgagcaccagcattgcgaccgcgggcattggcggcccgccgcagcaggtggatcagcaggaaacctggcgcaccaacttttattataacgatgtgtttacctggagcgtggcggatgcgccgggcaacattctgtataccgtgcagcatagcccgcagaacaacccgtttaccgcggtgctgagccagatgtatgcgggctgggcgggcggcatgcagtttcgctttattgtggcgggcagcggcgtgtttggcggccgcctggtggcggcggtgattccgccgggcattgaaattggcccgggcctggaagtgcgccagtttccgcatgtggtgattgatgcgcgcagcctggaaccggtgaccattaccatgccggatctgcgcccgaacatgtatcatccgaccggcgatccgggcctggtgccgaccctggtgctgagcgtgtataacaacctgattaacccgtttggcggcagcaccaacgcgattcaggtgaccgtggaaacccgcccgagcgatgattttgaatttgtgatgattcgcgcgccgagcagcaaaaccgtggatagcattagcccggcgggcctgctgaccaccccggtgctgaccggcgtgggcaacgataaccgctggaacggccagattgtgggcctgcagccggtgccgggcggctttagcacctgcaaccgccattggaacctgaacggcagcacctttggctggagcagcccgcgctttgcggcgattgatcatgatcgcggcagcgcgagctatagcggcagcagcagcagcaacgtgctggaactgtggtatgcgagcgcgggcagcgcggcggataacccgattagccagattgcgccggatggctttccggatatgagctttgtgccgtttagcggcaccaccgtgccgaccgcgggctgggtgggctttggcggcatttggaacagcagcaacggcgcgccgtttgtgaccaccgtgcaggcgtatgaactgggctttgcgaccggcgcgccgagcaacccgcagccgaccaccaccaccagcggcgcgcagattgtggcgaaaagcatttatggcgtggcgaccggcattaaccaggcgaccgcgggcctgtttgtgatggcgagcggcgtgattagcaccccgaacagcagcgcgattacctataccccgcagccgaaccgcattgtgaacgcgccgggcaccccggcggcggcgccgattggcaaaaacaccccgattatgtttgcgagcgtggtgcgccgcaccggcgatgtgaacgcgagcgcgggcagcgcgaacggcacccagtatggcaccggcagccagccgctgccggtgaccattggcctgagcctgaacaactatagcagcgcgctgatgccgggccagttttttgtgtggcagctgacctttgcgagcggctttatggaaattggcctgagcgtggatggctatttttatgcgggcaccggcgcgagcaccaccctgattgatctgaccgaactgattgatgtgcgcccggtgggcccgcgcccgagcaaaagcaccctggtgtttaacctgggcggcaccgcgaacggctttagctatgtgTGATAA

对照组1蛋白基因序列：

atggaaggcaaagcgcgcgcggcgagccagggcgaaaccgcgggcaccgcgaccaccgcgagcgtgccgggcaccaccaccgatggcatggatccgggcgtggtggcgaccaccagcgtggtgaccaccgaaaacgcgagcaccagcattgcgaccgcgggcattggcggcccgccgcagcaggtggatcagcaggaaacctggcgcaccaacttttattataacgatgtgtttacctggagcgtggcggatgcgccgggcaacattctgtataccgtgcagcatagcccgcagaacaacccgtttaccgcggtgctgagccagatgtatgcgggctgggcgggcggcatgcagtttcgctttattgtggcgggcagcggcgtgtttggcggccgcctggtggcggcggtgattccgccgggcattgaaattggcccgggcctggaagtgcgccagtttccgcatgtggtgattgatgcgcgcagcctggaaccggtgaccattaccatgccggatctgcgcccgaacatgtatcatccgaccggcgatccgggcctggtgccgaccctggtgctgagcgtgtataacaacctgattaacccgtttggcggcagcaccaacgcgattcaggtgaccgtggaaacccgcccgagcgatgattttgaatttgtgatgattcgcgcgccgagcagcaaaaccgtggatagcattagcccggcgggcctgctgaccaccccggtgctgaccggcgtgggcaacgataaccgctggaacggccagattgtgggcctgcagccggtgccgggcggctttagcacctgcaaccgccattggaacctgaacggcagcacctttggctggagcagcccgcgctttgcggcgattgatcatgatcgcggcaacgcgagctatccgggcagcagcagcagcaacgtgctggaactgtggtatgcgagcgcgggcagcgcggcggataacccgattagccagattgcgccggatggctttccggatatgagctttgtgccgtttagcggcaccaccgtgccgaccgcgggctgggtgggctttggcggcatttggaacagcagcaacggcgcgccgtttgtgaccaccgtgcaggcgtatgaactgggctttgcgaccggcgcgccgagcaacccgcagccgaccaccaccaccagcggcgcgcagattgtggcgaaaagcatttatggcgtggcgaccggcattaaccaggcgaccgcgggcctgtttgtgatggcgagcggcgtgattagcaccccgaacagcagcgcgattacctataccccgcagccgaaccgcattgtgaacgcgccgggcaccccggcggcggcgccgattggcaaaaacaccccgattatgtttgcgagcgtggtgcgccgcaccggcgatgtgaacgcgagcgcgggcagcgcgaacggcacccagtatggcaccggcagccagccgctgccggtgaccattggcctgagcctgaacaactatagcagcgcgctgatgccgggccagttttttgtgtggcagctgacctttgcgagcggctttatggaaattggcctgagcgtggatggctatttttatgcgggcaccggcgcgagcaccaccctgattgatctgaccgaactgattgatgtgcgcccggtgggcccgcgcccgagcaaaagcaccctggtgtttaacctgggcggcaccgcgaacggctttagctatgtgTGATAA

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 兔出血症病毒重组抗原及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 579

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Gly Lys Ala Arg Ala Ala Ser Gln Gly Glu Thr Ala Gly Thr

1 5 10 15

Ala Thr Thr Ala Ser Val Pro Gly Thr Thr Thr Asp Gly Met Asp Pro

20 25 30

Gly Val Val Ala Thr Thr Ser Val Val Thr Thr Glu Asn Ala Ser Thr

35 40 45

Ser Ile Ala Thr Ala Gly Ile Gly Gly Pro Pro Gln Gln Val Asp Gln

50 55 60

Gln Glu Thr Trp Arg Thr Asn Phe Tyr Tyr Asn Asp Val Phe Thr Trp

65 70 75 80

Ser Val Ala Asp Ala Pro Gly Asn Ile Leu Tyr Thr Val Gln His Ser

85 90 95

Pro Gln Asn Asn Pro Phe Thr Ala Val Leu Ser Gln Met Tyr Ala Gly

100 105 110

Trp Ala Gly Gly Met Gln Phe Arg Phe Ile Val Ala Gly Ser Gly Val

115 120 125

Phe Gly Gly Arg Leu Val Ala Ala Val Ile Pro Pro Gly Ile Glu Ile

130 135 140

Gly Pro Gly Leu Glu Val Arg Gln Phe Pro His Val Val Ile Asp Ala

145 150 155 160

Arg Ser Leu Glu Pro Val Thr Ile Thr Met Pro Asp Leu Arg Pro Asn

165 170 175

Met Tyr His Pro Thr Gly Asp Pro Gly Leu Val Pro Thr Leu Val Leu

180 185 190

Ser Val Tyr Asn Asn Leu Ile Asn Pro Phe Gly Gly Ser Thr Asn Ala

195 200 205

Ile Gln Val Thr Val Glu Thr Arg Pro Ser Asp Asp Phe Glu Phe Val

210 215 220

Met Ile Arg Ala Pro Ser Ser Lys Thr Val Asp Ser Ile Ser Pro Ala

225 230 235 240

Gly Leu Leu Thr Thr Pro Val Leu Thr Gly Val Gly Asn Asp Asn Arg

245 250 255

Trp Asn Gly Gln Ile Val Gly Leu Gln Pro Val Pro Gly Gly Phe Ser

260 265 270

Thr Cys Asn Arg His Trp Asn Leu Asn Gly Ser Thr Phe Gly Trp Ser

275 280 285

Ser Pro Arg Phe Ala Ala Ile Asp His Asp Arg Gly Ser Ala Ser Tyr

290 295 300

Ser Gly Ser Ser Ser Ser Asn Val Leu Glu Leu Trp Tyr Ala Ser Ala

305 310 315 320

Gly Ser Ala Ala Asp Asn Pro Ile Ser Gln Ile Ala Pro Asp Gly Phe

325 330 335

Pro Asp Met Ser Phe Val Pro Phe Ser Gly Thr Thr Val Pro Thr Ala

340 345 350

Gly Trp Val Gly Phe Gly Gly Ile Trp Asn Ser Ser Asn Gly Ala Pro

355 360 365

Phe Val Thr Thr Val Gln Ala Tyr Glu Leu Gly Phe Ala Thr Gly Ala

370 375 380

Pro Ser Asn Pro Gln Pro Thr Thr Thr Thr Ser Gly Ala Gln Ile Val

385 390 395 400

Ala Lys Ser Ile Tyr Gly Val Ala Thr Gly Ile Asn Gln Ala Thr Ala

405 410 415

Gly Leu Phe Val Met Ala Ser Gly Val Ile Ser Thr Pro Asn Ser Ser

420 425 430

Ala Ile Thr Tyr Thr Pro Gln Pro Asn Arg Ile Val Asn Ala Pro Gly

435 440 445

Thr Pro Ala Ala Ala Pro Ile Gly Lys Asn Thr Pro Ile Met Phe Ala

450 455 460

Ser Val Val Arg Arg Thr Gly Asp Val Asn Ala Ser Ala Gly Ser Ala

465 470 475 480

Asn Gly Thr Gln Tyr Gly Thr Gly Ser Gln Pro Leu Pro Val Thr Ile

485 490 495

Gly Leu Ser Leu Asn Asn Tyr Ser Ser Ala Leu Met Pro Gly Gln Phe

500 505 510

Phe Val Trp Gln Leu Thr Phe Ala Ser Gly Phe Met Glu Ile Gly Leu

515 520 525

Ser Val Asp Gly Tyr Phe Tyr Ala Gly Thr Gly Ala Ser Thr Thr Leu

530 535 540

Ile Asp Leu Thr Glu Leu Ile Asp Val Arg Pro Val Gly Pro Arg Pro

545 550 555 560

Ser Lys Ser Thr Leu Val Phe Asn Leu Gly Gly Thr Ala Asn Gly Phe

565 570 575

Ser Tyr Val

<210> 2

<211> 1743

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaaggca aagcgcgcgc ggcgagccag ggcgaaaccg cgggcaccgc gaccaccgcg 60

agcgtgccgg gcaccaccac cgatggcatg gatccgggcg tggtggcgac caccagcgtg 120

gtgaccaccg aaaacgcgag caccagcatt gcgaccgcgg gcattggcgg cccgccgcag 180

caggtggatc agcaggaaac ctggcgcacc aacttttatt ataacgatgt gtttacctgg 240

agcgtggcgg atgcgccggg caacattctg tataccgtgc agcatagccc gcagaacaac 300

ccgtttaccg cggtgctgag ccagatgtat gcgggctggg cgggcggcat gcagtttcgc 360

tttattgtgg cgggcagcgg cgtgtttggc ggccgcctgg tggcggcggt gattccgccg 420

ggcattgaaa ttggcccggg cctggaagtg cgccagtttc cgcatgtggt gattgatgcg 480

cgcagcctgg aaccggtgac cattaccatg ccggatctgc gcccgaacat gtatcatccg 540

accggcgatc cgggcctggt gccgaccctg gtgctgagcg tgtataacaa cctgattaac 600

ccgtttggcg gcagcaccaa cgcgattcag gtgaccgtgg aaacccgccc gagcgatgat 660

tttgaatttg tgatgattcg cgcgccgagc agcaaaaccg tggatagcat tagcccggcg 720

ggcctgctga ccaccccggt gctgaccggc gtgggcaacg ataaccgctg gaacggccag 780

attgtgggcc tgcagccggt gccgggcggc tttagcacct gcaaccgcca ttggaacctg 840

aacggcagca cctttggctg gagcagcccg cgctttgcgg cgattgatca tgatcgcggc 900

agcgcgagct atagcggcag cagcagcagc aacgtgctgg aactgtggta tgcgagcgcg 960

ggcagcgcgg cggataaccc gattagccag attgcgccgg atggctttcc ggatatgagc 1020

tttgtgccgt ttagcggcac caccgtgccg accgcgggct gggtgggctt tggcggcatt 1080

tggaacagca gcaacggcgc gccgtttgtg accaccgtgc aggcgtatga actgggcttt 1140

gcgaccggcg cgccgagcaa cccgcagccg accaccacca ccagcggcgc gcagattgtg 1200

gcgaaaagca tttatggcgt ggcgaccggc attaaccagg cgaccgcggg cctgtttgtg 1260

atggcgagcg gcgtgattag caccccgaac agcagcgcga ttacctatac cccgcagccg 1320

aaccgcattg tgaacgcgcc gggcaccccg gcggcggcgc cgattggcaa aaacaccccg 1380

attatgtttg cgagcgtggt gcgccgcacc ggcgatgtga acgcgagcgc gggcagcgcg 1440

aacggcaccc agtatggcac cggcagccag ccgctgccgg tgaccattgg cctgagcctg 1500

aacaactata gcagcgcgct gatgccgggc cagttttttg tgtggcagct gacctttgcg 1560

agcggcttta tggaaattgg cctgagcgtg gatggctatt tttatgcggg caccggcgcg 1620

agcaccaccc tgattgatct gaccgaactg attgatgtgc gcccggtggg cccgcgcccg 1680

agcaaaagca ccctggtgtt taacctgggc ggcaccgcga acggctttag ctatgtgtga 1740

taa 1743

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccatgg aaggcaaagc gcgcgcggcg agccagg 37

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcttttat cacacatagc taaagccgtt cgcggtgc 38

Claims

1.一种兔出血症病毒重组抗原，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的兔出血症病毒重组抗原。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2或3所述的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组杆状病毒。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体基于pFastBac1、pVL1393或pFastBac dual构建得到。

7.一种宿主细胞，其特征在于，其基因组中掺有权利要求2或3所述的核酸分子。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为Sf9细胞、High Five细胞或Sf21细胞。

9.权利要求1所述的兔出血症病毒重组抗原、权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4～6任一项所述的重组载体或权利要求7或8所述的宿主细胞在制备用于防治兔病毒性出血症的产品中的应用。

10.一种兔病毒性出血症疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的兔出血症病毒重组抗原，以及药学上可接受的佐剂。

11.根据权利要求10所述的兔病毒性出血症疫苗，其特征在于，所述佐剂为MONTANIDEISA 206VG、MONTANIDE ISA 201VG、MONTANIDE ISA 51VG、液体石蜡、樟脑油和植物细胞凝集素中的一种或多种。

12.一种权利要求1所述的兔出血症病毒重组抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在适宜的条件下培养权利要求7或8所述的宿主细胞，收集培养液和/或所述宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到所述兔出血症病毒重组抗原。

13.一种成套试剂盒，其特征在于，其包含权利要求10或11所述的兔病毒性出血症疫苗，以及用于接种所述兔病毒性出血症疫苗的容器。