JP7213507B2 - 組換え豚パルボウイルス抗原タンパク質及びその用途 - Google Patents
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Description
(a)本発明は、豚パルボウイルスVP2タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクター、該ベクターによって形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞、該組換え植物体又は組換え昆虫細胞から得た豚パルボウイルスVP2タンパク質を含む豚パルボウイルスに対するワクチン組成物及び豚パルボウイルス診断用組成物を提供する。
実施例1.組換え豚パルボウイルス(PPV)VP2(PPV 82-opt、PPV 07-opt)抗原植物発現ベクター作製
抗原性の最も高いVP2をターゲッティングするために、ブタ流死産胎児の試料から得たPPV VP2 DNA配列を使用し、Genescriptコドン最適化(optimization)プログラムを用いてニコチアナベンサミアナ(Nicotiana benthamiana)に合わせて最適化し、バイオニア社に依頼して合成した。最適化されたPPV 82-opt VP2のヌクレオチド配列は1740bpであり、PPV 07-opt VP2は1737bpで構成される。
PPV VP2抗原の植物発現のためにpCAMBIA1300ベクターのCaMV 35Sプロモーター遺伝子とNOSターミネーター(terminator)との間にルビスコ(RuBisCO)トランジットペプチド(transit peptide)をコードするポリヌクレオチド(配列番号1)、6個の連続したヒスチジン(Histidin)をコードするポリヌクレオチド(配列番号2)及びPPV 82 VP2タンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号3)を順に連結して組換えPPV 82-opt VP2植物発現ベクターを作製した(図2A)。
PPV VP2抗原の植物発現のために、pCAMBIA1300ベクターのCaMV 35Sプロモーター遺伝子とNOSターミネーター(terminator)との間にルビスコ(RuBisCO)トランジットペプチド(transit peptide)をコードするポリヌクレオチド(配列番号1)、6個の連続したヒスチジン(Histidin)をコードするポリヌクレオチド(配列番号2)、及びPPV 07 VP2タンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号4)を順に連結し、組換えPPV 07-opt VP2植物発現ベクターを作製した(図2B)。
植物で組換えPPV 82-opt VP2タンパク質又はPPV 07-opt VP2を発現させるために、前記の実施例1で準備した組換え発現ベクターは、メーカーの指示に従って、Gene pulser XCell(Bio-Rad,USA)を用いて電気穿孔によってアグロバクテリア菌株GV3101に形質転換された。形質転換されたGV3101を安定期(stationary phase)に到達するまで、適切な抗生剤を含有するYEP培地(酵母抽出物10g、ペプトン10g、NaCl 5g、カナマイシン50mg/L、リファンピシン25mg/L)で成長させた。培養物を遠心分離し、沈殿物を浸潤培地(10mM Mes、10mM MgCl2、100mMアセトシリンゴン)に0.5のOD 600で再懸濁させた後、1時間室温で培養した。25℃条件下で4~6週齢に育ったニコチアナベンサミアナ葉にアグロバクテリア懸濁液を注射器又は真空浸透させる方法でアグロ-インフィルトレーション(Agro-infiltration)を行った。
約3cm2の葉組織を100μlの粉砕緩衝液(20mM Tris-HCl[pH 7.5]、150mM NaCl、1mM EDTA、1% Triton X-100、0.1% SDS、5mM DTT及び植物プロテアーゼ抑制剤カクテル[Sigma-Aldrich])を用いて粉砕し、不溶性残骸を4℃で10分間20,000x gで遠心分離した。サンプルを12% SDS-PAGEゲルから分離し、PVDFメンブレイン(Millipore Merck KGaA of Darmstadt,Germany)に移した。その後、単クローンHis抗体(1:1,000希釈、Invitrogen)と反応させ、化学発光基質(Chemiluminescent Substrate)で検出した。
PPV 07-opt VP2配列を増幅して、pDrive vectorにクローニングした後、塩基配列を分析した。バキュロウイルス(Baculovirus)組換え発現のためにpFastBacTM HT Bベクトル(Invitrogen社)を用いてクローニングを行った。
昆虫で組換えPPV 07-opt VP2タンパク質を発現させるために、メーカーの指示に従って、組換え発現ベクターを42℃熱ショック(heat shock)を用いてDH10Bacに形質転換した。形質転換されたDH10Bacを、S.O.C培地で37℃、4時間培養させた。1/10希釈してLB培地にゲンタマイシン(7ug/ml)抗生剤を添加し、48時間、37℃で培養した。10個のコロニーを10枚のプレートに移した後、pUC/M13プライマーでPCRを用いて組換えPPV 07-opt VP2配列を確認した。Cellfectin II reagent(Invitrogen社)用いてSf-9細胞にトランスフェクション(transfection)した。
6-1.組換えPPV 82-opt VP2タンパク質免疫原性評価
植物体で発現させた組換えPPV 82-opt VP2タンパク質を、水酸化アルミニウムゲルアジュバント(Aluminium hydroxide gel adjuvant)と1:1に混合し、25,000HAユニットで100~110日齢ブタに1次接種し、2週後に2次接種した後、2週後に採血してHI力価(HI titer)を測定した。その結果、平均27の抗体価を確認した(図5A及び図5B)。
昆虫細胞で発現させた組換えPPV 07-opt VP2タンパク質と植物発現システムを用いて発現させた組換えPPV 07-opt VP2タンパク質をそれぞれ、500HAユニットでモルモットに1次接種し、2週後に2次接種した後、2週後に採血してHI力価を測定した。その結果、植物体で発現した組換えPPV 07-opt VP2タンパク質は、210の平均抗体価を示し、昆虫細胞で発現した組換えPPV 07-opt VP2タンパク質は、211の平均抗体価を示した(図6A及び図6B)。
7-1.組換えPPV 82-opt VP2タンパク質の血球凝集能
PPVは、モルモット赤血球に凝集する特徴を示し、Senda et al.(1986)論文を参考して血球凝集反応を実施した。96ウェルUプレートにニコチアナベンサミアナで発現したPPV 82-opt VP2タンパク質を2倍希釈した後、0.6%モルモット赤血球と混合し、37℃で1時間反応させた後、結果を解析した。
PPVは、モルモット赤血球に凝集する特徴を示し、Senda et al.(1986)論文を参考して血球凝集反応を実施した。96ウェルUプレートにニコチアナベンサミアナで発現したPPV 07-opt VP2タンパク質を2倍希釈した後、0.6%モルモット赤血球と混合し、37℃で1時間反応させた後、結果を解析した。
Claims (9)
- 配列番号1のルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号2の6個の連続したヒスチジン(6xHis)をコードするポリヌクレオチド、および配列番号3の塩基配列又は配列番号4の塩基配列で表示される豚パルボウイルス(porcine parvovirus,PPV)VP2タンパク質をコードする遺伝子の配列を順に連結してなる、組換え発現ベクター。
- 請求項1の組換え発現ベクターによって形質転換された豚パルボウイルス(porcine parvovirus)VP2タンパク質を発現させる組換え植物体。
- 請求項1の組換え発現ベクターによって形質転換された豚パルボウイルス(porcine parvovirus)VP2タンパク質を発現させる組換え昆虫細胞。
- 請求項1に記載の組換え発現ベクターで形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞が発現させる豚パルボウイルス(porcine parvovirus)VP2タンパク質を含む、豚パルボウイルスワクチン用組成物。
- 請求項1に記載の組換え発現ベクターで形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞が発現させる豚パルボウイルス(porcine parvovirus)VP2タンパク質を含む、豚パルボウイルス診断用組成物。
- 請求項1に記載の組換え発現ベクターで形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞が発現させる豚パルボウイルス(porcine parvovirus)VP2タンパク質を含む、豚パルボウイルス診断用キット。
- 請求項1に記載の組換え発現ベクターで形質転換された組換え植物体又は組換え昆虫細胞が発現させる豚パルボウイルスVP2タンパク質を抗原として用いて、試料内で抗原-抗体反応によって豚パルボウイルスのVP2抗体を検出する豚パルボウイルス診断方法。
- 前記抗原-抗体反応は、組織免疫染色、放射能免疫分析法(RIA)、酵素免疫分析法(ELISA)、ウェスタンブロット(Western Blotting)、免疫沈殿分析法(Immunoprecipitation Assay)、免疫拡散分析法(Immunodiffusion Assay)、補体固定分析法(Complement Fixation Assay)、FACS(Fluorescence-activated cell sorter)及びタンパク質チップ(protein chip)分析法からなる群から選ばれる1種以上の方法を用いて行う、請求項7に記載の豚パルボウイルス診断方法。
- 前記試料は、細胞、血液、小便、唾液及び組織からなる群から選ばれる1種以上である、請求項7に記載の豚パルボウイルス診断方法。
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