CN108410885A - 一种猪细小病毒的全长感染性dna克隆及其构建方法和应用 - Google Patents

一种猪细小病毒的全长感染性dna克隆及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108410885A
CN108410885A CN201810271877.2A CN201810271877A CN108410885A CN 108410885 A CN108410885 A CN 108410885A CN 201810271877 A CN201810271877 A CN 201810271877A CN 108410885 A CN108410885 A CN 108410885A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ppv
segment
full
pig parvoviral
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810271877.2A
Other languages
English (en)
Inventor
崔尚金
张玲玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Science of CAAS
Original Assignee
Institute of Animal Science of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Animal Science of CAAS filed Critical Institute of Animal Science of CAAS
Priority to CN201810271877.2A priority Critical patent/CN108410885A/zh
Publication of CN108410885A publication Critical patent/CN108410885A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种猪细小病毒的全长感染性DNA克隆及其构建方法和应用。所述的猪细小病毒的全长感染性DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过该全长感染性DNA能够拯救出与PPV野毒具有相似生长特性的拯救病毒，并且在全长感染性克隆中引入遗传标记EcoRv，该标记在传代之后依然能够稳定存在，可以作为鉴定野毒与拯救病毒可靠的遗传标志。此外，本发明还建立了的猪细小病毒反向遗传学操作系统，可用于猪细小病毒蛋白的毒力分析，并据此可以制备新型灭活疫苗或弱毒疫苗。本发明的提出为研究猪细小病毒基因结构与功能及致病性研究等方面提供平台，也为研究针对猪细小病毒病的疫苗等奠定了基础。

Description

一种猪细小病毒的全长感染性DNA克隆及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种病毒感染性克隆及其构建方法，特别涉及一种猪细小病毒的全长感染性克隆及其构建方法，还涉及猪细小病反向遗传学操作系统的建立。本发明属于生物技术领域。
背景技术
猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是细小病毒科细小病毒属的成员，是引起母猪繁殖障碍的病原。1966年，Mayr进行猪瘟病毒组织培养时发现了PPV。Cartwright和Huck于1967年首次在英国猪流产胎儿的脏器中分离出猪细小病毒以来，现已在比利时(1967)、德国(1968)、美国(1972)、日本(1972)、荷兰(1972)、澳大利亚(1973)、芬兰(1979)、法国(1977)和加拿大(1978)等国都有相继的报道。在我国，猪细小病毒发现较晚，但是流行情况却相当普遍。临床上，该病毒不仅可以导致初孕母猪的繁殖障碍，而且还能引起仔猪的皮肤炎症和肠炎性腹泻，给世界各国的养猪行业造成了巨大的经济损失。
根据ICTV第九次分类报告，PPV属于细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属。PPV与多数细小病毒一样，对外界理化因素具有很强大的抵抗力，耐热能力极强，据Cartwright等的试验，当56℃30min加热处理时，无论病毒的传染性还是凝集红细胞的能力，都无明显改变；70℃2h感染力有所下降，但并不丧失；80℃5min即可失去活性。对脂、酶溶剂及有机溶剂抵抗力强，耐酸范围大，感染能力在pH3.0～10.0范围内没有明显的改变。具有血凝性，能凝集人、猴、豚鼠和鸡的红细胞，对豚鼠红细胞凝集效果最好。
细小病毒都在细胞核内增殖。依赖病毒属除外，其它细小病毒均能自我复制，但是需要依赖宿主细胞有丝分裂过程中的某些功能。所以体外培养该病毒时，必须在细胞传代培养的同时或最迟24h内接种病毒，即同步接毒，才能达到病毒良好增殖的目的。PPV只能在来源于猪的细胞和人的某些传代细胞中增殖培养，其中以猪的原代肾细胞较为常用。PPV在PK-15细胞系中培养，当接种时机适当时，于2～5天出现细胞病变，7～8天达到收获程度。
PPV与其它细小病毒具有共同的形态结构特征，外观呈六角形或圆形，无囊膜，直径20～23nm，二十面体等轴立体对称，衣壳约由32个壳粒组成，核心含有单股线状DNA，分子量为1.4×106，G+C＝48％，DNA约占整个病毒粒子的26.5％，病毒在氯化铯中的浮密度为1.37～1.39g/cm3。PPV基因组是单链线状DNA分子，大小约5000nt。根据GenBank报道的序列，PPV全长基因组为5075nt(序列号：NC_001718)。
PPV基因组的结构非常特殊，在其3’-端和5’-端各有一个发夹结构，中间为单链部分，3’-端为102nt的发夹结构，中间被2个10nt的短回文结构中断，折叠成Y型结构；5’-端有一个127nt的回文序列被一个24nt的短回文序列中断，折叠成U型结构。PPV的复制只能在细胞周期的S期的晚期和G2期早期进行，它的复制是完全依赖于宿主DNA的复制机制进行。PPVDNA的复制不需要DNA环化，也不需要RNA引物，这是因为PPV DNA的3’-端自我折回产生了DNA多聚酶作用所需的引物-OH，在宿主DNA多聚酶的作用下，从3’-端发夹结构的3’-OH起始合成基因组互补链，从而将感染的亲代DNA转变为双链复制型DNA(RFDNA)，再以此RFDN为模板，合成子代病毒基因组。PPV基因组含两个开放阅读框，3’-端ORF编码非结构蛋白(NS)，5’-端ORF编码构成核衣壳的结构蛋白(VP)，共编码3中衣壳蛋白：VP1、VP2和VP3，VP1和VP2是两种mRNA分别从不同位置的ATG起始翻译，共同终止于TAG处，分别翻译产生的，有学者预测VP3是VP2翻译后切割加工的产物，如图1。
每个核衣壳中有60个VP1、VP2、VP3组成的蛋白亚单位构成，其中VP1蛋白的拷贝数为6-10个，其N端4-13残基具有核靶向能力。VP2是主要的衣壳蛋白和保护性抗原，而VP2蛋白能够自我组装成病毒样颗粒；另外，还有少量的VP3蛋白，空衣壳中无VP3。
反向遗传学(reverse genetics)及相关分子生物学技术的诞生和发展，可以为我们更好的解决上述问题，也为我们提供了强有力的理论基础和技术手段。反向遗传学是在已知基因序列的基础上，利用分子生物学的理论与技术，通过核苷酸序列的突变、缺失、插入等手段，创造突变体并研究突变体所造成的表型效应。即直接从生物的遗传物质入手来研究基因的生物学功能，阐述生命发生的本质现象与规律。与反向遗传操作相关的各种技术统称为反向遗传学技术(reverse genetics techniques)。
建立DNA病毒反向遗传操作技术体系主要包括基因组全长的克隆及改造、序列测定、辅助质粒的构建、共转染拯救病毒粒子和新生病毒有关特性的鉴定与应用等内容。其建立过程就是通过体外人工基因操作，使建立的系统满足病毒复制和包装所需要的各种必要条件。目前有很多DNA病毒反向遗传操作平台都已经建立，如圆环病毒、疱疹病毒和腺病毒等。但有些病毒基因组太大或者是基因组结构复杂，很难构建全长基因组克隆。
目前，对整个细小病毒家族复制过程的研究还很少，尤其是对猪细小病毒分子方面的研究。尽管PPV已有50多年的历史了，但是PPV全长克隆的例子很少有人研究，特别是全长的感染性克隆。目前国内外学者对PPV基因组进行测序研究运用到了不同的方法，但是有些方法较复杂不容易重复，有些扩增不能准确的获得两端复杂结构序列。尽管有报道能克隆PPV的绝大部分病毒基因组，并进行了测序，但是并未进行病毒的拯救及其分子的致病机理等研究工作。由于自主复制性细小病毒的基因组结构特殊，很难克隆出其全长基因组，严重影响了其反向遗传学操作平台的建立。迄今未见有关PPV反向遗传操作平台建立的研究报道，极大地影响了其分子致病机制、与宿主细胞相互作用关系的深入研究。
目前，在猪细小病毒的研究和应用中，PPV的致病机理和病毒主要抗原蛋白的致病力尚不完全清楚，这个问题仍然亟需解决。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提出了一种猪细小病毒的全长感染性克隆及其构建方法，并建立了猪细小病毒的反向遗传学操作系统，为今后进行该病毒毒力研究和新型疫苗的研制提供了技术保障。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明得到的一种猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)的全长感染性DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，本发明还提出了含有所述全长感染性DNA的载体。
其中，优选的，所述载体的出发载体为pBluscript II SK(+)。
其中，优选的，所述的载体通过以下方法制备得到：
(1)改造载体pBluscript II SK(+)
在pBluscript II SK(+)载体中的Kpn I与Sac I酶切位点之间增加Afe I以及StuI酶切位点；
(2)全长感染性DNA的合成
合成PPV基因组3’末端长度为114bp的片段，即片段I，通过Kpn I以及Afe I酶切位点克隆到改造后的pBluscript II SK(+)载体上；合成与片段I相连的PPV基因组3’端长度为65bp的片段，即片段II，通过Infusion克隆技术与片段I连接；用Stu I线性化含PPV基因组3’端片段的载体；根据猪细小病毒基因组相对保守区设计三对引物，扩增猪细小病毒基因组中间的非发夹结构，三对引物序列分别如SEQ ID NO.2和3、SEQ ID NO.4和5以及SEQID NO.6和7所示；通过Over-lap PCR将三段片段连接起来，得到片段III；将片段III克隆到pEASY-Blunt载体上；将片段III中3193bp处的碱基A突变成碱基G，引入EcoRv位点作为遗传标记拯救病毒；设计引物Infusion III SF，Infusion III SR，引物序列如SEQ ID NO.8和9所示，扩增突变过的片段III；合成PPV 5’端长度为238bp的片段克隆到pMD-19T载体中，设计引物Infusion IV SF，Infusion IV SR，引物序列如SEQ ID NO.10和11所示，扩增PPV基因组5’端片段，即片段IV；用Infusion克隆技术将线性化的含PPV基因组3’端片段的载体，突变过的片段III及PPV基因组5’端片段IV无缝连接起来，得到的重组质粒命名为pPPV，其中，最终合成的猪细小病毒全长感染性DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
含有所述的全长感染性DNA或所述载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。
其中，优选的，所述的细胞为PK-15细胞。
更进一步，本发明还提出了一种猪细小病毒的反向遗传学操作系统，所述的系统包括本发明所述的载体以及宿主细胞。
其中，优选的，所述的细胞为PK-15细胞。
更进一步的，本发明还提出了所述的反向遗传学操作系统在PPV病毒拯救、PPV的致病机理和致病力研究以及PPV疫苗研制中的应用。
一种拯救猪细小病毒的方法，包括以下步骤：接种PK-15细胞于六孔板中，培养至细胞密度为80％-90％时进行转染：每孔中加入本发明以上所述载体和Lipofectamine2000转染试剂，在Opti-MEM中震荡混匀，进行转染，并且逐日观察细胞病变，收取细胞转染物反复冻融三次并盲传，收取病毒细胞培养物反复冻融三次后，得到拯救病毒，置于-70℃保存备用。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种猪细小病毒的全长感染性DNA克隆，通过该全长感染性DNA能够拯救出与野毒具有相似生长特性的拯救病毒，并且在全长感染性克隆中引入的遗传标记EcoRv，该标记在传代之后依然能够稳定存在，可以作为鉴定野毒与拯救病毒可靠的遗传标志。
2、本发明建立的猪细小病毒反向遗传学操作系统也可以用于猪细小病毒蛋白的毒力分析，并据此可以制备新型灭活疫苗或弱毒疫苗。
3、本发明为研究猪细小病毒基因结构与功能及致病性研究等方面提供平台，也为研究针对猪细小病毒病的疫苗等奠定了基础。
附图说明
图1为细小病毒基因组结构及其表达方式示意图；
其中，TR为反向末端重复序列，D为剪接供体，A为受体；
图2A-D为本发明的试验设计图；
图3为野毒及拯救病毒的生长曲线(同步接毒测病毒滴度)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或跳进所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1突变猪细小病毒载体的构建
(1)改造载体pBluscript II SK(+)(购自宝生物工程有限公司)：
在载体pBluscript II SK(+)中的Kpn I与Sac I酶切位点之间增加两个酶切位点，即Afe I以及Stu I，得到新的多克隆酶切位点Kpn I-Afe I-Stu I-Sac I，改造后的载体命名为pBSK-Modified；
(2)猪细小病毒全长感染性DNA的合成
合成PPV基因组3’末端长度为114bp的片段(片段I)，通过Kpn I/Afe I酶切位点克隆到改造后的pBSK-Modified载体上得到pBSK-FY1；合成与片段I相连的PPV基因组3’端长度为65bp的片段(片段II)，通过Infusion克隆技术与片段I连接,得到pBSK-FY；用Stu I线性化含PPV基因组3’端片段的载体；根据猪细小病毒基因组相对保守区设计三对引物(见表1)，扩增猪细小病毒基因组中间的非发夹结构，通过Over-lap PCR将三段片段连接起来，得到(片段III)；将片段III克隆到pEASY-Blunt载体(购自北京天根生化科技有限公司)上。将片段III 3193bp处的碱基A突变成碱基G，引入EcoRv位点作为遗传标记拯救病毒。设计引物Infusion III SF，Infusion III SR(见表1)扩增突变过的片段III。合成PPV 5’端长度为238bp的片段克隆到pMD-19T载体(购自宝生物工程有限公司)。设计引物Infusion IV SF，Infusion IV SR(见表1)扩增PPV基因组5’端片段(片段IV，含有pMD-19T一部分序列)。用Infusion克隆技术将线性化的含PPV基因组3’端片段的载体，突变过的片段III及PPV基因组5’端片段IV无缝连接起来，得到的重组质粒命名为pPPV(具体构建策略见图2A-D)。其中，最终合成的猪细小病毒全长感染性DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
表1引物序列
实施例2拯救病毒的制备
接种PK-15细胞置于六孔板中，培养至细胞密度为80％-90％时进行转染。每孔中加入5ug质粒pPPV和10ul Lipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)转染试剂，在500ul的Opti-MEM中震荡混匀，根据转染试剂说明书进行转染。并且逐日观察细胞病变。在第三天出现细胞病变(CPE)，第五天收取细胞转染物反复冻融三次并盲传。收取第七代的病毒细胞培养物反复冻融三次后，得到拯救病毒pPPV，置于-70℃保存备用。
实施例3拯救病毒的鉴定
将实施例2制备的拯救病毒与亲本病毒进行效价测定，结果显示：亲本病毒PPV与拯救病毒pPPV TCID50及血凝效价没有显著差异，同时进行多步生长曲线测定，结果显示在感染后8h开始复制后，在60h达到复制高峰期，野毒与拯救病毒之间的差异不显著(图3)。
结果显示，本发明利用反向遗传操作系统获得了和野毒具有相似生长特性的全长感染性克隆，同时说明在病毒基因组中引入生物遗传标记并不影响整个病毒的生长。猪细小病毒全长感染性克隆中引入的遗传标记EcoRv，在传代之后依然能够稳定存在，可以作为鉴定野毒与拯救病毒可靠的遗传标志。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种猪细小病毒的全长感染性DNA克隆及其构建方法和应用
<130> KLPI180195
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5013
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
aatctttaaa ctgaccaact gtctttgcgt atggtgacgt gatgacgcgc gctacgcgcg 60
ctgccttcgg cagtcacacg tcaccatcag caaagacagt tggtcagttt aaagattaat 120
aagacattcc attggctgaa aagaggcggg aaattcaaaa aaagaggcgg gaaaaaaaga 180
ggtggagcct aacactataa atacagttgc ttacttcagt tagttccttt ctgcttcaga 240
ctgcacttcg ctccagagac acagctacaa actactctca gctactgcag catggcagcg 300
ggaaacactt actcggaaga ggtactaaaa gctaccaact ggcttcaaga taatgctcaa 360
aaagaagcat tctcttatgt atttaaaaca caaaaagtca atctaaatgg aaaagaaatt 420
gcctggaata actacaacca agatacaaca gatgcggaaa tgataaacct acaaagagga 480
gcagaaacat catgggacca ggcaacagac atggaatggg aatcagaaat cgacagcctc 540
acaaaacggc aagtactgat ttttgactct cttgttaaaa aatgtctctt tgaaggtata 600
ttgcaaaaga acctaagtcc aagtgactgc tactggttca tacagcatga acatggtcaa 660
gatactggct atcactgcca tgtactacta ggtggaaaag gcttacaaca agcaatggga 720
aaatggttca gaaaacaatt aaacaattta tggagtagat ggttaataat gcaatgcaaa 780
gtacctctaa caccagttga aagaataaaa ttaagggaat tagcagagga tggtgagtgg 840
gtatcgctac taacctacac tcacaaacaa actagaaaac aatatacaaa aatgactcat 900
tttggaaata tgattgctta ctacttccta aataaaaaaa gaaagacaac tgaaagagag 960
catggatatt atctcagctc agattctggc ttcatgacaa atttcttaaa agaaggcgag 1020
agacacttag tcagtcacct atttactgaa gcaaataaac ctgaaactgt ggaaacaaca 1080
gttactacag ctcaggaagc caaaagaggc agaatacaaa caaaaaaaga agtaagcata 1140
aaatgcacaa taagagactt ggttaataaa agatgtacta gcatagaaga ctggatgatg 1200
acagatccag acagttatat agaaatgatg gctcaaaccg gaggagaaaa tttaatcaaa 1260
aacacactag aaataacaac tcttactcta gcaagaacaa aaacagcata tgacttaata 1320
cttgaaaagg caaaaccaag catgctacca acatttaata ttagcaatac aagaacatgt 1380
aaaatattca gcatgcacaa ttggaactac attaaagtct gccatgctat aacttgtgta 1440
ctaaacagac aaggaggaaa aagaaataca attctatttc atgggccagc atcaacagga 1500
aaaagtataa ttgctcaaca cattgcaaac ttggttggta atgttggttg ctacaatgca 1560
gccaatgtga actttccatt taatgactgt acaaataaaa acttaatatg gattgaagaa 1620
gcaggaaact tctctaacca agtaaaccaa ttcaaagcca tatgttccgg tcaaacaatt 1680
agaattgacc aaaaaggtaa aggaagcaaa caaattgaac caactcctgt tatagtgact 1740
acaaatgaag acataactaa agttagaata ggatgcgagg aaagaccaga acatacacaa 1800
ccaataagag acagaatgtt aaacataaac ctaaccagaa aactgccagg tgattttgga 1860
cttttagaag aaactgaatg gccactaata tgtgcttggt tggtaaagaa aggttaccaa 1920
gcaacaatgg ctagctatat gcatcattgg ggaaatgtac ctgattggtc agaaaaatgg 1980
gaggagccaa aaatgcaaac cccaataaat acaccaacag actctcagat ttccacatca 2040
gtgaaaactt cgccagcgga caacaactac gcagcaactc caatacagga ggacctggat 2100
ttagctttag ccttggagcc gtggagcgag ccaacaacac caactttcac caacctgcac 2160
ttaactccaa cacctccaga ttcagcaata cggacaccaa gtccaacttg gtcggaaata 2220
gaaaccgaca taagagcctg ctttggtgaa aactgtgcac ccacaacaaa ccttgaataa 2280
ggtaggatgg cgcctcctgc aaaaagagca agaggtaagg gtagttttaa gggggtggtg 2340
ggcatacata taaaactaac tgcaaataat ttttttatat attacaggat taactctacc 2400
aggatacaaa taccttggtc caggaaactc actagaccaa ggagaaccaa ctaatccatc 2460
agacgccgca gcaaaagaac acgacgaagc ctacgacaaa tacataaaat ctggaaaaaa 2520
tccatacttc tacttctcag cagctgatga aaaattcata aaagaaactg aacacgcaaa 2580
agactacgga ggtaaaattg gacattactt cttcagagca aagcgtgcct ttgctccaaa 2640
actctcagaa acagactcac caactacatc tcaacaacca gaggtaagaa gatcgccgag 2700
aaaacaccca gggtctaaac caccaggaaa aagacctgct ccaagacata tttttataaa 2760
cttagctaaa aaaatagcta aagggacatc taatacaaac tctaactcaa tgagtgaaaa 2820
tgtggaacaa cacaacccta ttaatgcaga cactgaattg tctgcaacag gaaatgaatc 2880
tgggggtggg ggcggcggtg gcgggggtag gggtgctggg ggggttggtg tgtctacagg 2940
tagtttcaat aatcaaacag aatttcaata cttgggggag ggcttggtta gaatcactgc 3000
acacgcatca agactcatac atctaaatat gccagaacac gaaacataca aaagaataca 3060
tgtactaaat tcagaatcag gggtggcggg acaaatggta caagacgatg cacacacaca 3120
aatggtaaca ccttggtcac taatagatgc taacgcatgg ggggtatggt tcaatccagc 3180
ggactggcag ttaatatcca acaacatgac agaaataaac ttagttagtt ttgaacaaga 3240
aatattcaat gtagtactta aaacaattac agaatcagca acctcaccac caaccaaaat 3300
atataataat gatctaactg caagcttaat ggtcgcacta gacaccaata acacacttcc 3360
atacacacca gcagcaccta gaagtgaaac acttggtttt tatccatggt tacctacaaa 3420
accaactcaa tacagatatt acctatcatg caccagaaac ctaaatccac caacatacac 3480
tggacaatca caacaaataa cagactcaat acaaacagga ctacacagtg acattatgtt 3540
ctacacaata gaaaatgcag taccaattca tcttctaaga acaggagatg aattctccac 3600
aggaatatat cactttgaca caaaaccact aaaattaact cactcatggc aaacaaacag 3660
atctctagga ctgcctccaa aactactaac tgaacctacc acagaaggag accaacaccc 3720
aggaacacta ccagcagcta acacaagaaa aggttatcac caaacaatta ataatagcta 3780
cacagaagca acagcaatta ggccagctca ggtaggatat aatacaccat acatgaattt 3840
tgaatactcc aatggtggac catttctaac tcctatagta ccaacagcag acacacaata 3900
taatgatgat gaaccaaatg gtgctataag atttacaatg ggttaccaac atggacaatt 3960
aaccacatct tcacaagagc tagaaagata cacattcaat ccacaaagta aatgtggaag 4020
agctccaaag caacaattta atcaacaagc accactaaac ctagaaaata caaataatgg 4080
aacactttta ccttcagatc caataggagg gaaacctaac atgcatttca tgaatacact 4140
caatacatat ggaccattaa cagcactaaa caatactgca cctgtatttc caaatggtca 4200
aatatgggat aaagaacttg atacagatct aaaacctaga ctacatgtta cagctccatt 4260
tgtttgtaaa aacaatccac caggacaact atttgtaaaa atagcaccaa acctaacaga 4320
tgatttcaat gctgactctc ctcaacaacc tagaataata acttattcaa acttttggtg 4380
gaaaggaaca ctaacattca cagcaaaaat gaggtccagt aatatgtgga accctattca 4440
acaacacaca acaacagcag aaaacattgg taactatatt cctacaaata ttggtggcat 4500
aaaaatgttt ccagaatatt cacaacttat accaagaaaa ttatactaga aataactctg 4560
taaataaaaa ctcagttact tggttaatca tgtactacta tcattgttac tagaaataac 4620
tctgtaaata aaaactcagt tacttggtta atcatgcact actatcattg tatacttcaa 4680
taaaaataaa ttgtaaaatc aataaaacta agttacttag tttatgtata ccaattatcc 4740
ccaaaaaaac aataaaattt taaaaagaaa caagctctca tgtgtttact attaactaaa 4800
ccaaccacac ttatatgacc ttatgtcttt agggtgggtg ggtgggaatt actatgtatt 4860
cctttgagtt agttggtcgc ctttgggcga ctaaccaagc ggctctgccg cttggttagt 4920
cgcacggcga ccaactaact caaaggaata catagtaatt cccacccacc caccctaaag 4980
acataaggtc atataagtgt ggttggttta gtt 5013
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
aggtggagcc taacactata aatac 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
ctcgctccac ggctccaag 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
gacaacaact acgcagcaac tc 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
gtcagcattg aaatcatctg ttagg 25
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
gcaccaaacc taacagatg 19
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 7
tagttaatag taaacacatg agagc 25
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
ttgggcggga aaaggtggag cctaacacta taaatac 37
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 9
tagttaatag taaacacatg agagcaacca accacccaca c 41
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 10
tcattgtata cttcaataat tataaaaa 28
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 11
ctcaaaggaa tacatagtaa ttccca 26

Claims (10)

1.一种猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)的全长感染性DNA，其特征在于，所述的全长感染性DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有权利要求1所述全长感染性DNA的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，出发载体为pBluscript II SK(+)。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的载体通过以下方法制备得到：
(1)改造载体pBluscript II SK(+)
在pBluscript II SK(+)载体中的Kpn I与SacI酶切位点之间增加Afe I以及Stu I酶切位点；
(2)全长感染性DNA的合成
合成PPV基因组3’末端长度为114bp的片段，即片段I，通过Kpn I以及Afe I酶切位点克隆到改造后的pBluscript II SK(+)载体上；合成与片段I相连的PPV基因组3’端长度为65bp的片段，即片段II，通过Infusion克隆技术与片段I连接；用Stu I线性化含PPV基因组3’端片段的载体；根据猪细小病毒基因组相对保守区设计三对引物，扩增猪细小病毒基因组中间的非发夹结构，三对引物序列分别如SEQ ID NO.2和3、SEQ ID NO.4和5以及SEQ IDNO.6和7所示；通过Over-lap PCR将三段片段连接起来，得到片段III；将片段III克隆到pEASY-Blunt载体上；将片段III中3193bp处的碱基A突变成碱基G，引入EcoRv位点作为遗传标记拯救病毒；设计引物Infusion III SF，Infusion III SR，引物序列如SEQ ID NO.8和9所示，扩增突变过的片段III；合成PPV 5’端长度为238bp的片段克隆到pMD-19T载体中，设计引物Infusion IV SF，Infusion IV SR，引物序列如SEQ ID NO.10和11所示，扩增PPV基因组5’端片段，即片段IV；用Infusion克隆技术将线性化的含PPV基因组3’端片段的载体，突变过的片段III及PPV基因组5’端片段IV无缝连接起来，得到的重组质粒命名为pPPV，其中，最终合成的猪细小病毒全长感染性DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.含有权利要求1所述的全长感染性DNA或权利要求2-4任一项所述载体的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞为PK-15细胞。
7.一种猪细小病毒的反向遗传学操作系统，其特征在于，所述的系统包括权利要求2-4任一项所述的载体以及宿主细胞。
8.如权利要求7所述的反向遗传学操作系统，其特征在于，所述的细胞为PK-15细胞。
9.权利要求7或8所述的反向遗传学操作系统在PPV病毒拯救、PPV的致病机理和致病力研究以及PPV疫苗研制中的应用。
10.一种拯救猪细小病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：接种PK-15细胞于六孔板中，培养至细胞密度为80％-90％时进行转染：每孔中加入权利要求2-4任一项所述载体和Lipofectamine 2000转染试剂，在Opti-MEM中震荡混匀，进行转染，并且逐日观察细胞病变，收取细胞转染物反复冻融三次并盲传，收取病毒细胞培养物反复冻融三次后，得到拯救病毒，置于-70℃保存备用。
CN201810271877.2A 2018-03-29 2018-03-29 一种猪细小病毒的全长感染性dna克隆及其构建方法和应用 Pending CN108410885A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810271877.2A CN108410885A (zh) 2018-03-29 2018-03-29 一种猪细小病毒的全长感染性dna克隆及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810271877.2A CN108410885A (zh) 2018-03-29 2018-03-29 一种猪细小病毒的全长感染性dna克隆及其构建方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108410885A true CN108410885A (zh) 2018-08-17

Family

ID=63133973

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810271877.2A Pending CN108410885A (zh) 2018-03-29 2018-03-29 一种猪细小病毒的全长感染性dna克隆及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108410885A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109337884A (zh) * 2018-12-21 2019-02-15 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种丙酮酸激酶基因及其应用
CN109706179A (zh) * 2019-01-17 2019-05-03 西北农林科技大学 稳定携带遗传标记的猪细小病毒感染性克隆系统及其构建方法和应用
CN109810976A (zh) * 2019-02-12 2019-05-28 扬州大学 猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用
CN113557302A (zh) * 2018-12-05 2021-10-26 农林畜产检疫本部 重组猪细小病毒抗原蛋白及其用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001083737A2 (en) * 2000-05-03 2001-11-08 University Of Guelph Porcine adenovirus type 5 vector and vaccine
CN103305534A (zh) * 2013-05-22 2013-09-18 中国农业大学 一种水貂肠炎病毒反向遗传学操作系统及其应用
CN106085971A (zh) * 2016-06-15 2016-11-09 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 表达鸡细小病毒vp2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法
CN106893732A (zh) * 2017-04-18 2017-06-27 扬州大学 一种鹅细小病毒感染性克隆的拯救方法
CN107012170A (zh) * 2017-05-02 2017-08-04 扬州大学 一种番鸭细小病毒感染性克隆的构建及拯救方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001083737A2 (en) * 2000-05-03 2001-11-08 University Of Guelph Porcine adenovirus type 5 vector and vaccine
CN103305534A (zh) * 2013-05-22 2013-09-18 中国农业大学 一种水貂肠炎病毒反向遗传学操作系统及其应用
CN106085971A (zh) * 2016-06-15 2016-11-09 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 表达鸡细小病毒vp2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法
CN106893732A (zh) * 2017-04-18 2017-06-27 扬州大学 一种鹅细小病毒感染性克隆的拯救方法
CN107012170A (zh) * 2017-05-02 2017-08-04 扬州大学 一种番鸭细小病毒感染性克隆的构建及拯救方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN,C.M. ET AL.: "EU790641.1，Porcine parvovirus strain BQ，complete genome", 《GENBANK》 *
WOO-TAEK OH ET AL.: "Perspectives on the Evolution of Porcine Parvovirus", 《VIRUSES》 *
陈龙彪等: "猪细小病毒河南分离株全基因组克隆及序列分析", 《安徽农业科学》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113557302A (zh) * 2018-12-05 2021-10-26 农林畜产检疫本部 重组猪细小病毒抗原蛋白及其用途
CN109337884A (zh) * 2018-12-21 2019-02-15 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种丙酮酸激酶基因及其应用
CN109706179A (zh) * 2019-01-17 2019-05-03 西北农林科技大学 稳定携带遗传标记的猪细小病毒感染性克隆系统及其构建方法和应用
CN109810976A (zh) * 2019-02-12 2019-05-28 扬州大学 猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用
CN109810976B (zh) * 2019-02-12 2019-11-05 扬州大学 猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108410885A (zh) 一种猪细小病毒的全长感染性dna克隆及其构建方法和应用
EP0554414B1 (en) Method for producing a subunit vaccine against the canine parvovirus and other related viruses
Janssen et al. Virulence of La Crosse virus is under polygenic control
CN103266091B (zh) A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用
Gottschalck et al. Nucleotide sequence analysis of Aleutian mink disease parvovirus shows that multiple virus types are present in infected mink
US20180080045A1 (en) Canine adenovirus vectors
CN104152416B (zh) 伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用
CN104962581A (zh) 一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组病毒疫苗株
CN103509761B (zh) 表达猪圆环病毒ⅱ型orf2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株及其制备方法
CN113293148A (zh) 一种h基因替换的嵌合麻疹减毒株的构建
CN106244602A (zh) 一种携带两个g基因和vp2基因的重组狂犬病病毒及其应用
CN110305852A (zh) 表达猪流行性腹泻病毒s1基因重组伪狂犬病病毒的构建
CN106929485A (zh) 伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用
Nuss Molecular biology of wound tumor virus
US10894081B2 (en) Recombinant bivalent inactivated vaccine against foot-and-mouth disease virus, preparation method and use thereof
US5885585A (en) Attenuated canine parvovirus vaccine
CN108315306A (zh) 一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法
CN105713866A (zh) 人巨细胞病毒感染性克隆及其构建方法和应用
JPH0235079A (ja) 感染性ウシ鼻気管炎ウイルスの挿入突然変異体
CN110331135A (zh) 表达基因vii型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒候选疫苗株及制备方法
CN109536464A (zh) 一种缺失衣壳蛋白基因的基孔肯雅病毒感染性克隆及构建方法和在制备减毒疫苗中的应用
CN110331155B (zh) 携带2型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法
CN109136200A (zh) 一种重组传染性造血器官坏死病毒及其构建方法与应用
CN105385666B (zh) 伪狂犬病病毒双荧光标记5基因缺失株的构建
CN101112621A (zh) Prrsv和pcv-2二联重组鸡痘活载体疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180817