CN109706179A - 稳定携带遗传标记的猪细小病毒感染性克隆系统及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定携带遗传标记的猪细小病毒感染性克隆系统及其构建方法和应用。在猪细小病毒(PPV)基因组两端的ITR序列中间引入平末端酶切位点，利用In‑Fusion技术，并通过在PPV中间序列引入一个无义突变，获得携带遗传标记并能够与野生毒株进行区分的PPV全长感染性克隆质粒。本发明利用反向遗传操作技术所构建的感染性克隆质粒在体外转染PK15细胞后，经连续盲传可以诱导细胞发生与亲本株相同的细胞病变效应，能够拯救出具有与亲本株生长趋势相似、稳定携带遗传标记的拯救病毒。应用该克隆系统能够快速方便的在基因组的任意位置进行碱基突变，为后续研发猪细小病毒的弱毒苗以及多联苗提供便利、有效的工具。

Description

稳定携带遗传标记的猪细小病毒感染性克隆系统及其构建方 法和应用

技术领域

本发明涉及利用反向遗传操作技术进行病毒基因组水平改造，具体涉及携带遗传标记的猪细小病毒全长感染性克隆的构建。

背景技术

猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一，能够通过母猪的胎盘屏障，引起初孕母猪产弱胎、死胎和木乃伊胎等，在各个地区均有流行，给全球养猪业带来巨大的经济损失，但目前尚无有效的防控措施。PPV为细小病毒科细小病毒属成员，其基因组为单股负链DNA，大小约为5000bp，在基因组两端均有回文发夹结构，3’端的102bp的回文序列折叠形成Y型结构，5’端有一个127bp的回文序列，中间被一个24bp的短回文序列中断，折叠形成U型结构。其两端的发夹结构在强毒株和弱毒株上均存在并且高度保守，是病毒复制所必需的。

反向遗传学操作技术是从全病毒水平研究病毒蛋白功能最有效的工具之一。利用反向遗传操作技术构建病毒的感染性DNA克隆，使得在病毒基因组的任何位置引入突变成为可能，方便对病毒的复制以及致病机制进行更准确、精细的定位分析以及进行基因治疗。但是由于猪细小病毒基因组两端存在末端重复(ITR)的回文序列，对全基因组克隆带来较大困难，从而限制对猪细小病毒各个蛋白的功能进行研究，如何构建PPV的反向遗传操作平台成为进一步有效研究其各个蛋白的功能必须解决的关键问题。

DNA重组技术能够在分子水平上对病毒基因组进行修饰和研究，从而有助于深入了解病毒基因组上不同区段基因所编码蛋白的功能。PPV属于单股负链DNA病毒，其两端均具有典型的末端重复(ITR)的回文序列，而这种序列不能通过PCR方法直接扩增得到，所以在整体分子水平上对其基因组进行研究显得十分困难，且目前对其致病机制的研究仍不十分清楚，对其各个蛋白在致病中的作用更不清楚，病毒基因组全长感染性克隆的成功构建将为这一难题找到切实可行的解决方法。目前，国外通过引入酶切位点进行传统的酶切连接方法获得一株PPV弱毒株NADL-2的全长感染性克隆，该方法耗时、耗力、构建周期长，无法与野生毒株感染进行区分，并且对后期从病毒基因组水平对病毒改造带来很大的困难。有报道应用多个骨架载体克隆病毒基因组片段，并通过酶切位点引入等繁琐的步骤获得感染性克隆，操作步骤多、周期长，构建效率低，不利于在病毒基因组上进行人为改造。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定携带遗传标记的猪细小病毒感染性克隆系统及其构建方法和应用，从而简便、快速、高效的获得稳定携带遗传标记的重组拯救病毒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于构建猪细小病毒全长感染性克隆的重组载体，包括克隆载体以及插入在克隆载体的多克隆位点内的人工序列，人工序列包括猪细小病毒基因组两端的ITR序列以及连接在ITR序列之间的具有平末端酶切位点的序列，所述具有平末端酶切位点的序列包括两个通过保护碱基连接的平末端酶切位点以及分别位于该平末端酶切位点上游、下游的与猪细小病毒分离毒株基因组对应端的ITR下游、上游序列同源的序列。

优选的，所述平末端酶切位点之间为所述猪细小病毒分离毒株基因组的中间片段的插入位置，该中间片段包括所述猪细小病毒分离毒株基因组两端的ITR序列之间的部分序列，中间片段的两端与所述平末端酶切位点上游、下游序列对应同源。

一种猪细小病毒全长感染性克隆质粒，该感染性克隆质粒是通过无缝克隆将重组载体与扩增自猪细小病毒分离毒株基因组的中间片段连接而得到的；所述重组载体包括克隆载体以及插入在克隆载体的多克隆位点内的人工序列，人工序列包括猪细小病毒基因组两端的ITR序列以及连接在ITR序列之间的具有平末端酶切位点的序列，所述具有平末端酶切位点的序列包括两个通过保护碱基连接的平末端酶切位点以及分别位于该平末端酶切位点上游、下游的与猪细小病毒分离毒株基因组对应端的ITR下游、上游序列同源的序列；所述中间片段包括所述猪细小病毒分离毒株基因组两端的ITR序列之间的部分或全部序列，所述中间片段的两端与所述平末端酶切位点上游、下游序列对应同源。

一种携带遗传标记的猪细小病毒全长感染性克隆质粒，该感染性克隆质粒是通过无缝克隆将重组载体与扩增自猪细小病毒分离毒株基因组的两个部分重叠的中间片段连接而得到的；所述重组载体包括克隆载体以及插入在克隆载体的多克隆位点内的人工序列，人工序列包括猪细小病毒基因组两端的ITR序列以及连接在ITR序列之间的具有平末端酶切位点的序列，所述具有平末端酶切位点的序列包括两个通过保护碱基连接的平末端酶切位点以及分别位于该平末端酶切位点上游、下游的与猪细小病毒分离毒株基因组对应端的ITR下游、上游序列同源的序列；所述中间片段包括所述猪细小病毒分离毒株基因组两端的ITR序列之间的部分序列，所述中间片段的非重叠端与所述平末端酶切位点上游、下游序列对应同源，且两个中间片段的重叠区段内含有通过扩增引入的用于将限制性片段长度多态性遗传标记引入猪细小病毒基因组的无义突变。

一种猪细小病毒全长感染性克隆质粒的构建方法，包括以下步骤：

将位于猪细小病毒基因组两端的ITR序列通过具有平末端酶切位点的序列进行连接，得人工序列，将人工序列插入克隆载体，得重组载体，利用所述平末端酶切位点对重组载体进行酶切，得线性化载体，然后通过无缝克隆(In-Fusion技术)将线性化载体与扩增自猪细小病毒分离毒株基因组的中间片段连接，得猪细小病毒全长感染性克隆质粒，所述中间片段包括该猪细小病毒分离毒株基因组两端的ITR序列之间的部分或全部序列。

一种携带遗传标记的猪细小病毒全长感染性克隆质粒的构建方法，包括以下步骤：

将位于猪细小病毒基因组两端的ITR序列通过具有平末端酶切位点的序列进行连接，得人工序列，将人工序列插入克隆载体，得重组载体，利用所述平末端酶切位点对重组载体进行酶切，得线性化载体，然后通过无缝克隆(In-Fusion技术)将线性化载体与扩增自猪细小病毒分离毒株基因组的两个部分重叠的中间片段连接，得猪细小病毒全长感染性克隆质粒，所述中间片段包括该猪细小病毒分离毒株基因组两端的ITR序列之间的部分序列，且两个中间片段的重叠区段内含有通过扩增引入的无义突变，该猪细小病毒全长感染性克隆通过该无义突变形成位于猪细小病毒基因组的限制性片段长度多态性遗传标记。

优选的，所述猪细小病毒分离毒株选自YL分离株(JN860197)。

优选的，所述具有平末端酶切位点的序列包括两个通过保护碱基连接的平末端酶切位点以及分别位于该平末端酶切位点(即连接在一起的平末端酶切位点整体)上游、下游的与猪细小病毒分离毒株基因组对应端的(基因组5`端)ITR下游、(基因组3`端)ITR上游序列同源的序列，所述中间片段的两端或非重叠端与所述平末端酶切位点上游、下游序列对应同源。

优选的，所述人工序列选自SEQ.ID.NO.1。

优选的，所述克隆载体选自低拷贝质粒，所述人工序列插入在低拷贝质粒的多克隆位点。

优选的，所述重组载体选自序列如SEQ.ID.NO.2所示的质粒。

优选的，所述中间片段是以YL株基因组为模板，利用引物F1和F2，或者引物F1和F4及引物F3和F2为上游和下游引物扩增得到的，引物序列示例如下：

F1：5'-AAAAAAGAGGCGGGAAAAAAAGAGG-3'

F2：5'-TGTTTTTTGGGGATAATTGGTATACAG-3'

F3：5'-GAACACGAAACATACAAAAGAATTCATG-3'

F4：5'-CATGAATTCTTTTGTATGTTTCGTGTTC-3'

优选的，所述无义突变为猪细小病毒结构蛋白VP1编码序列内的单个碱基置换(例如，A3058T，JN860197)。

优选的，所述遗传标记选自限制性内切酶EcoR I识别位点。

上述猪细小病毒全长感染性克隆质粒及其构建方法在制备(特别是稳定携带遗传标记的)猪细小病毒全长感染性重组拯救病毒中的应用，该重组拯救病毒是通过将猪细小病毒全长感染性克隆质粒转染宿主细胞，并经盲传而制备得到的。

优选的，所述重组拯救病毒的基因组具有通过无义突变A3058T(JN860197)形成的EcoR I识别位点。

优选的，所述宿主细胞选自PK15细胞。

本发明的有益效果体现在：

本发明利用In-Fusion技术进行无缝克隆获得了猪细小病毒分离毒株基因组全长感染性克隆质粒，并在成功构建该感染性克隆质粒基础上，在猪细小病毒分离毒株基因组引入同义碱基突变以形成遗传标记，获得能与野生毒株进行区分的稳定携带遗传标记的猪细小病毒分离毒株基因组全长感染性克隆质粒。利用获得的稳定携带遗传标记的全长感染性克隆质粒转染宿主细胞，经过连续盲传，使得全长感染性克隆得到拯救。本发明解决了猪细小病毒分离毒株基因组克隆效率低的问题，且改造获得了稳定遗传且容易辨识的遗传标记位点，不仅构建方法简单易行，而且应用该克隆系统能够快速方便的在基因组的任意位置进行碱基突变(缺失、引入或突变)，为进一步研发猪细小病毒的弱毒苗以及多联苗提供有利便捷的工具。

进一步的，本发明设计的人工序列(例如，SEQ.ID.NO.1)及其对应的重组载体(例如，SEQ.ID.NO.2)可以高效克隆猪细小病毒基因组全长，可以一次性克隆较长的中间片段，或在克隆2个部分重叠的中间片段部分同时引入突变位点，简化分子克隆步骤，提高构建猪细小病毒全长感染性克隆质粒的效率。

进一步的，本发明采用的YL分离株为强毒株，利用其研究猪细小病毒功能，对于猪细小病毒的致病机理和防治措施更具指导意义。同时，YL分离柱基因组中具有天然存在的平末端酶切位点(Stu I和SnaB I)，便于中间片段的扩增位置设计，保证不引入非病毒基因组的多余的碱基。

进一步的，本发明利用低拷贝质粒为载体，解决了现有其他克隆载体对ITR序列重组克隆效率低的问题。

进一步的，本发明在猪细小病毒结构蛋白VP1的N端进行碱基置换，一方面提高了引入的无义突变位点的遗传稳定性，另一方面确保了通过该无义突变所形成的遗传标记在现有已知野生毒株中的唯一性。

进一步的，本发明通过无义突变引入的EcoR I酶切位点(作为后续与野生毒株感染相区分的遗传标记)在野生毒株上分布数量较少，便于通过酶切和片段长度分析，直观、快速、准确的与野生毒株感染进行区分。

附图说明

图1为PPV(YL株)基因组通过引入点突变形成的遗传标记示意图；图中：突变后序列(mutated sequence)在原始序列(original sequence)下方，斜体表示突变位点，碱基下面表示其对应的氨基酸，框内碱基表示突变之后所引入的新的EcoR I酶切位点。

图2为PPV-G和PPV-G+酶切鉴定的电泳图；图中：泳道1和2为PPV-G的EcoR I和BamHI/Xba I酶切鉴定；泳道3和4为PPV-G+的EcoR I和BamH I/Xba I酶切鉴定，M为marker。

图3为PPV、PPV-G和PPV-G+转染PK15细胞后盲传5代进行病毒拯救的结果；图中：(A)PPV组(YL株)；(B)PPV-G组；(C)PPV-G+组；(D)未转染对照组。

图4为PPV-G和PPV-G+感染性克隆经病毒拯救后的鉴定结果；图中：泳道1和4为PPV-G+和PPV-G组PCR鉴定；泳道2和3为PPV-G+和PPV-G组PCR产物回收后EcoR I单酶切；泳道5为水对照。

图5为PPV-G+拯救病毒遗传标记稳定性检测结果；图中：泳道1、2和3为PPV-G+拯救病毒5代、10代和15代病毒DNA经引物F5/F6扩增后酶切检测；泳道4为PPV野生毒株(YL)对照。

图6为pKQLL(F1+F2)的质粒图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例用于解释本发明，而非对本发明的限定。

本发明利用In-Fusion技术进行无缝克隆获得了PPV YL分离株(西北农林科技大学动物医学院兽医病理实验室分离，JN860197，2011年10月)的全长感染性克隆，在成功获得该感染性克隆基础上，通过将PPV YL分离株基因组3058位的碱基A突变成T，在不影响PPVYL基因组编码氨基酸的情况下(同义碱基突变)引入一个新的EcoR I酶切位点(遗传标记)，获得能与野生毒株(例如，YL株)进行区分的稳定携带遗传标记的全长感染性克隆，将带有遗传标记的重组质粒(即具有遗传标记的全长感染性克隆)体外转染PK15细胞，经连续盲传，使带有遗传标记的重组质粒在PK15细胞中得到拯救。本发明为后续深入研究PPV的基因组功能提供了一个便利、有效的工具和平台。

一、PPV全长感染性克隆PPV-G和PPV-G+构建

1.PPV两端ITR区域片段的获取：

对NCBI上已公布的PPV全基因组序列进行比对发现，对于不同地方的PPV分离株，其基因组5′末端以及3′末端的ITR序列均高度保守，由于此两段序列存在着较长的发夹结构，常规PCR方法难以扩增得到，送至公司进行人工合成，具体合成序列如下(序列设计完成时间2017年6月)：

上述合成序列包含用于构建PPV的5′末端的Y型的ITR(第1-182位，U44978.1)所在的片段f1(斜体部分)，和用于构建PPV的3′末端的U型的ITR(第4789-5075位，U44978.1)所在的片段f2(下划线部分)，合成序列的5′末端引入有BamH I酶切位点，3′末端引入有Xba I酶切位点，片段f1和片段f2之间通过外源序列CCTagctTAC(小写为保护性碱基)连接，从而导入两个平末端酶切位点Stu I和SnaB I(平末端酶切位点的设计保证不引入非基因组的多余的碱基)。将合成序列经BamH I/Xba I双酶切后，连接到同样经过BamH I/Xba I双酶切的低拷贝质粒pKQLL(北京华大)上，构建中间质粒pKQLL(F1+F2)，中间质粒的大小为2582bp，该中间质粒也可以由公司构建(2017年9月)，其提供的与该中间质粒对应(序列一致)的商业化质粒命名为pKQLL-WHC22445-seq(图6)，其所含元件WHC22445即为上述合成序列。

2.扩增中间片段M-PPV(U44978.1，第158-4813位)

设计中间片段M-PPV的PCR扩增引物(引物设计完成时间2017年10月)

上游引物F1：5'-AAAAAAGAGGCGGGAAAAAAAGAGG-3'；

下游引物F2：5'-TGTTTTTTGGGGATAATTGGTATACAG-3'。

收集PPV(YL株)感染后的PK15细胞(PK15细胞购自ATCC，2017年10月)，提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以引物F1和F2应用高保真酶(例如，TAKARA公司PrimerSTAR GXL DNA R050A)扩增PPV YL分离强毒株全基因组的中间片段M-PPV，扩增产物经电泳后胶回收4600bp左右片段。

3.全长感染性克隆质粒(PPV-G)的构建

提取pKQLL(F1+F2)质粒，应用Stu I和SnaB I两种平末端限制性内切酶进行线性化，应用In-Fusion技术进行无缝连接，按照如下体系：线性化pKQLL(F1+F2)质粒2.0μL，PCR扩增M-PPV的回收产物6.0μL，以及连接酶2.0μL，于50℃条件下连接15min，转化大肠杆菌Stable3感受态细胞(上海碧云天)，在含卡那霉素抗性的LB平板37℃过夜培养后，挑取单克隆，37℃摇床摇菌12h，质粒提取试剂盒提取质粒，提取的质粒用PCR鉴定和酶切鉴定，酶切鉴定结果见图2，鉴定正确后送北京奥科生物科技有限公司进行测序，测序正确后命名为PPV-G，大小为7166bp。

4.携带遗传标记的全长感染性克隆质粒(PPV-G+)的构建

所述遗传标记为无义突变(JN860197，A3058T)，如图1所示，设计引入该遗传标记的突变引物(引物设计完成时间2017年10月)：

上游引物F3：5'-GAACACGAAACATACAAAAGAATCATG-3'；

下游引物F4：5'-CATGATTCTTTTGTATGTTTCGTGTTC-3'。

上述引物序列中，框内为突变后位点。

收集PPV(YL株)感染后的PK15细胞，提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以引物F1和F4扩增中间片段的上半段(上游片段)，以引物F3和F2扩增中间片段的下半段(下游片段)，进行胶回收。应用In-Fusion技术进行无缝连接，按照如下体系：线性化pKQLL(F1+F2)质粒2.0μL，PCR上游回收产物3.0μL，PCR下游回收产物3.0μL，连接酶2.0μL的体系，于50℃条件下连接30min，转化大肠杆菌Stable3感受态细胞中，在含卡那霉素的LB平板37℃过夜培养后，挑取单克隆，37℃摇床摇菌12h，质粒提取试剂盒提取质粒，提取的质粒用PCR鉴定和酶切鉴定，酶切鉴定结果见图2，由于在PPV基因组3589位(JN860197)本身存在一个EcoR I酶切位点，在3058位(JN860197)引入的突变形成了一个新的EcoR I酶切位点，所以感染性克隆PPV-G+经EcoR I单酶切后会出现一条大约500左右的条带，而PPV-G则没有此条带，鉴定正确后送北京奥科生物科技有限公司进行测序，测序正确后命名为PPV-G+。

二、重组质粒(PPV-G+)的病毒拯救

质粒大量提取试剂盒提取质粒(PPV-G+)并测定质粒浓度。用限制性内切酶BamH I和Xba I双酶切重组质粒(PPV-G+)，获得线性化PPV全长DNA片段，核酸胶回收试剂盒回收酶切后的质粒。将PK15细胞培养于含10％FBS的DMEM培养液中，转染前1d均匀铺于24孔板，每孔约5×10⁴个。铺板24h后，按照PEI转染试剂盒操作说明，采用脂质体法将线性化PPV全长DNA片段转染PK15细胞，具体转染方法如下：(1)将DNA质粒(即线性化PPV全长DNA片段)溶于50μL无血清无抗生素的Opti-Medium培养液中，轻轻混匀，并在室温下孵育5min；(2)将适量PEI转染试剂溶于50μL无血清无抗生素的Opti-Medium培养液中，混匀并在室温下孵育5min；(3)将步骤(1)、(2)所得两种混合物混合(总体积100μL，体积比1:1)，轻轻混匀，在室温下孵育20min(不能出现雾状沉淀)；(4)上述操作同时，将待转染PK15细胞用PBS清洗两次，在每孔(24孔板)中加入100μL无血清无抗生素的Opti-Medium培养液，待DNA质粒/PEI复合物混合20min后，立即加入待转染细胞对应孔中，并混匀，然后将细胞于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，约4h后更换为含2％FBS的DMEM细胞培养液，继续培养，并定期用显微镜观察细胞生长情况。转染后2～3d收取细胞转入15mL离心管中，反复冻融3次裂解细胞，短暂离心后收集上清，将上清继续传代至正常(未转染)PK15细胞，如此反复盲传几代，并不断观察细胞病变效应，收集细胞上清进行鉴定。由图3A、B、C可以看出，与对照组相比(图3D)，拯救出的病毒能诱导出与亲本毒株(YL)一致的PPV典型拉丝状细胞病变。

三、重组拯救病毒鉴定

鉴定引物：

上游引物F5：5'-CAACAATGGCTAGCTATATGCA-3'；

下游引物F6：5'-CTAGTGCGACCATTAAGCTTGC-3'。

以DNA质粒(即线性化PPV全长DNA片段)转染细胞后，连续传代，待细胞出现明显的细胞病变效应后收集细胞培养物。提取细胞DNA，以设计的鉴定引物扩增出大小约1400bp的片段，由于PPV-G+引入了一个EcoR I酶切位点，将胶回收的PCR产物应用EcoR I进行单酶切，出现一条1100bp和一条300bp左右的条带(图4)，而亲本毒株的感染组(即图3中的PPV组)仅有一条1400bp左右的条带，说明重组质粒(PPV-G和PPV-G+)转染后能够产生具有感染性的PPV病毒。并且拯救出来的病毒能够与野生毒株(YL株)感染产生的病毒进行区分。

本发明以低拷贝质粒为克隆载体，将PPV基因组两端的ITR序列进行人工合成并插入克隆载体，在两端ITR序列结构中间引入Stu I和SnaB I平末端酶切位点，最后利用In-Fusion技术将PPV中间序列在不引入任何多余碱基的条件下，定向接入经Stu I和SnaB I双酶切后的线性化载体，从而获得PPV全长感染性克隆PPV-G。在获得PPV-G的基础，通过在中间序列引入一个无义突变(JN860197，A3058T位)，获得携带遗传标记(EcoR I酶切位点)并能够与野生毒株进行区分的PPV全长感染性克隆PPV-G+。本发明所构建的感染性克隆在体外转染PK15细胞后，连续盲传5代后可以诱导细胞发生与亲本毒株(YL株)相同的细胞病变效应，能够拯救出具有与亲本毒株(YL株)生长趋势相似的PPV重组拯救病毒，以及与野生毒株感染相区分的具有遗传标记的PPV重组拯救病毒。

四、PPV-G+重组拯救病毒的稳定性检测

将经过重组质粒(PPV-G+)转染并拯救后获得的病毒(简称PPV-G+重组拯救病毒)转接到正常PK15细胞中，每隔72h盲传一代，连续盲传15代，提取5代、10代和15代病毒DNA，应用鉴定引物F5/F6进行扩增，胶回收纯化PCR产物，并用EcoR I限制性内切酶进行单酶切，同时设立野生毒株PPV YL作为对照，进行电泳鉴定。在5代、10代和15代的PCR回收产物酶切后均出现1100bp和300bp左右的两条带，而野生毒株PPV YL仍然只有一条大约1400bp大小的条带(图5)，表明遗传标记在PPV-G+重组拯救病毒中至少能够稳定遗传15代。

总之，本发明利用In-Fusion技术进行无缝克隆获得了PPV YL分离株的全长感染性克隆，并在PPV YL分离株基因组3058位将A突变成T，从而在不影响其编码氨基酸的情况下引入一个EcoR I酶切位点作为遗传标记，获得能与野生毒株进行区分的具有遗传标记的全长感染性克隆，本发明为深入研究PPV复制及致病机理提供了更便捷的平台，为进一步研究和开发新型疫苗奠定理论基础。

<110> 西北农林科技大学

<120> 稳定携带遗传标记的猪细小病毒感染性克隆系统及其构建方法和应用

<160> 8

<210> 1

<211> 491

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggatccaatc tttaaactga ccaactgtct ttgcgtatgg tgacgtgatg acgcgcgcta 60

cgcgcgctgc cttcggcagt cacacgtcac catcagcaaa gacagttggt cagtttaaag 120

attaataaga cattccattg gctgaaaaga ggcgggaaat tcaaaaaaag aggcgggaaa 180

aaaagaggcc tagcttacgt ataccaatta tccccaaaaa acaataaaat tttaaaaaga 240

aacaagctct catgtgttta ctattaacta aaccaaccac acttatatga ccttatgtct 300

ttagggtggg tgggtgggaa ttactatgta ttcctttgag ttagttggtc gcctttgggc 360

gactaaccaa gcggctctgc cgcttggtta gtcgcacggc gaccaactaa ctcaaaggaa 420

tacatagtaa ttcccaccca cccaccctaa agacataagg tcatataagt gtggttggtt 480

tagtttctag a 491

<210> 2

<211> 2582

<212> DNA

<213> pKQLL-WHC22445-seq

<400> 2

tgtaatcacc tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt tgctggcgtt tttccatagg 60

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgatgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 120

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 180

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 240

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 300

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 360

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 420

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 480

tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac ctcggaaaaa 540

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 600

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg attttctacc 660

gaagaaaggc ccacccgtga aggtgagcca gtgagttgat tgcagtccag ttacgctgga 720

gtcaataggc gtatcacgag gccctttcgt tgtaaaacga cggccagtcg aaccacgcaa 780

tgcgtctcga tccgcagtgt cttgcgtctc tggatccaat ctttaaactg accaactgtc 840

tttgcgtatg gtgacgtgat gacgcgcgct acgcgcgctg ccttcggcag tcacacgtca 900

ccatcagcaa agacagttgg tcagtttaaa gattaataag acattccatt ggctgaaaag 960

aggcgggaaa ttcaaaaaaa gaggcgggaa aaaaagaggc ctagcttacg tataccaatt 1020

atccccaaaa aacaataaaa ttttaaaaag aaacaagctc tcatgtgttt actattaact 1080

aaaccaacca cacttatatg accttatgtc tttagggtgg gtgggtggga attactatgt 1140

attcctttga gttagttggt cgcctttggg cgactaacca agcggctctg ccgcttggtt 1200

agtcgcacgg cgaccaacta actcaaagga atacatagta attcccaccc acccacccta 1260

aagacataag gtcatataag tgtggttggt ttagtttcta gaagagacgg agtcactgcc 1320

aaccgagacg gtcatagctg tttcctgtgt gccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 1380

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Claims (10)

1.一种用于构建猪细小病毒全长感染性克隆的重组载体，其特征在于：该重组载体包括克隆载体以及插入在克隆载体的多克隆位点内的人工序列，人工序列包括猪细小病毒基因组两端的ITR序列以及连接在ITR序列之间的具有平末端酶切位点的序列，所述具有平末端酶切位点的序列包括两个通过保护碱基连接的平末端酶切位点以及分别位于该平末端酶切位点上游、下游的与猪细小病毒分离毒株基因组对应端的ITR下游、上游序列同源的序列。

2.根据权利要求1所述的用于构建猪细小病毒全长感染性克隆的重组载体，其特征在于：所述人工序列选自SEQ.ID.NO.1。

3.根据权利要求1所述的用于构建猪细小病毒全长感染性克隆的重组载体，其特征在于：所述重组载体选自序列如SEQ.ID.NO.2所示的质粒。

4.一种猪细小病毒全长感染性克隆质粒，其特征在于：该感染性克隆质粒是通过无缝克隆将重组载体与扩增自猪细小病毒分离毒株基因组的中间片段连接而得到的；所述重组载体包括克隆载体以及插入在克隆载体的多克隆位点内的人工序列，人工序列包括猪细小病毒基因组两端的ITR序列以及连接在ITR序列之间的具有平末端酶切位点的序列，所述具有平末端酶切位点的序列包括两个通过保护碱基连接的平末端酶切位点以及分别位于该平末端酶切位点上游、下游的与所述猪细小病毒分离毒株基因组对应端的ITR下游、上游序列同源的序列；所述中间片段包括所述猪细小病毒分离毒株基因组两端的ITR序列之间的部分或全部序列，所述中间片段的两端与所述平末端酶切位点上游、下游序列对应同源。

5.一种携带遗传标记的猪细小病毒全长感染性克隆质粒，其特征在于：该感染性克隆质粒是通过无缝克隆将重组载体与扩增自猪细小病毒分离毒株基因组的两个部分重叠的中间片段连接而得到的；所述重组载体包括克隆载体以及插入在克隆载体的多克隆位点内的人工序列，人工序列包括猪细小病毒基因组两端的ITR序列以及连接在ITR序列之间的具有平末端酶切位点的序列，所述具有平末端酶切位点的序列包括两个通过保护碱基连接的平末端酶切位点以及分别位于该平末端酶切位点上游、下游的与所述猪细小病毒分离毒株基因组对应端的ITR下游、上游序列同源的序列；所述中间片段包括所述猪细小病毒分离毒株基因组两端的ITR序列之间的部分序列，所述中间片段的非重叠端与所述平末端酶切位点上游、下游序列对应同源，且两个中间片段的重叠区段内含有通过扩增引入的用于将限制性片段长度多态性遗传标记引入猪细小病毒基因组的无义突变。

6.根据权利要求4或5所述的猪细小病毒全长感染性克隆质粒，其特征在于：所述克隆载体选自低拷贝质粒。

7.根据权利要求4或5所述的猪细小病毒全长感染性克隆质粒，其特征在于：所述人工序列选自SEQ.ID.NO.1。

8.根据权利要求5所述的猪细小病毒全长感染性克隆质粒，其特征在于：所述无义突变为猪细小病毒结构蛋白VP1编码序列内的单个碱基置换；所述遗传标记选自限制性内切酶EcoR I识别位点。

9.一种如权利要求4或5所述的猪细小病毒全长感染性克隆质粒在制备猪细小病毒全长感染性重组拯救病毒中的应用。

10.一种猪细小病毒全长感染性重组拯救病毒，其特征在于：该重组拯救病毒是通过将如权利要求4或5所述的猪细小病毒全长感染性克隆质粒转染宿主细胞，并经盲传而制备得到的。