CN116376981A - 一种重组犬细小病毒假病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于病毒基因工程技术领域，具体涉及一种重组犬细小病毒假病毒。本发明通过将CPV‑2全长感染性克隆质粒改造为携带外源基因的复制缺陷型重组质粒，构建表达外源基因的重组CPV‑2假病毒系统。本发明构建的重组CPV‑2假病毒系统可以成功感染F81细胞，并且有效表达携带的外源基因。克服了现有CPV‑2表达外源基因时存在表达效率和组装效率受到限制的问题。这不仅对病毒致病机制研究提供了良好的研究工具，并且为基于CPV‑2假病毒系统的基因工程多联疫苗及新型靶向药物的研发奠定理论基础，具有广泛的应用前景。

Description

一种重组犬细小病毒假病毒
技术领域
本发明属于病毒基因工程技术领域，具体涉及一种重组犬细小病毒假病毒。
背景技术
犬细小病毒(Canine parvovirus type 2，CPV-2)，属于细小病毒科、细小病毒属，是一种单股负链的无包膜DNA病毒。CPV-2的病毒衣壳直径约为20nm，呈二十面体对称结构，包裹着约5kb的单链DNA基因组。CPV-2基因组主要包含两个开放性阅读框(Open readingframe，ORF)ORF1和ORF2，ORF1编码非结构蛋白NS1和NS2，ORF2编码衣壳蛋白VP1和VP2。
依托于反向遗传操作系统，从分子水平上操作病毒，可以实现在病毒基因组水平改造病毒，并进行病毒载体的开发。但是，细小病毒不仅基因组容量较小，而且基因组基因高度重叠编码，限制了直接在CPV-2感染性克隆的基础上构建重组病毒，不能通过直接携带或表达外源序列而实现对CPV-2载体的开发应用。
假病毒是指病毒衣壳蛋白包裹缺陷型核酸分子组装成的病毒颗粒，只有一个细胞感染周期，具有较高生物安全性，同时具有病毒衣壳表面的天然结构，易于体外制备且稳定性好。目前，假病毒系统已经被广泛应于病毒宿主细胞筛选、抗病毒药物筛选、新型疫苗研发、中和抗原表位研究及基因靶向治疗等各个领域。
以往研究中的CPV-2包装系统，包括了保留两末端ITR序列的目的基因表达质粒和提供病毒复制所需的非结构蛋白及结构蛋白的辅助质粒。但是包含CPV-2编码区全长序列的辅助质粒的表达效率受到病毒基因组结构本身的限制，且依赖于病毒基因组自身表达调控机制，难以实现重组系统扩大生产的稳定性。
因此，在本领域中，如何开发有效表达及组装效率更高的CPV-2重组假病毒系统，从而实现CPV-2重组假病毒在体外的稳定高效的组装，这仍然是一个亟需解决的问题。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供一种重组犬细小病毒假病毒，目的在于：保留CPV-2基因组非结构蛋白编码序列，构建仅缺失衣壳蛋白编码区的目的基因表达质粒，并且构建能够同时高效表达衣壳蛋白VP1与VP2的辅助质粒，有效组装表达外源基因的CPV-2重组假病毒。
一种核心质粒重组前体，所述核心质粒重组前体为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或相似性与SEQ ID NO.1大于等于90％的核苷酸序列。
本发明还提供一种重组质粒，它包括相互连接的外源基因序列与权利要求1所述的核心质粒重组前体。
优选的，所述外源基因序列为EGFP荧光报告基因。
本发明还提供一种重组犬细小病毒假病毒，它包括上述重组质粒和用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒。
优选的，所述用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒包括依次串联连接的质粒载体、V1片段、V2片段、T2A和V3片段；
其中，所述V1片段为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或相似性与SEQ ID NO.2大于等于90％的核苷酸序列；
所述V2片段为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或相似性与SEQ ID NO.3大于等于90％的核苷酸序列；
所述T2A为如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，或相似性与SEQ ID NO.4大于等于90％的核苷酸序列；
所述V3片段为如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或相似性与SEQ ID NO.5大于等于90％的核苷酸序列。
优选的，所述质粒载体选自pCDNA3.1。
优选的，所述重组犬细小病毒假病毒按照如下方法制备得到：将所述重组质粒和用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒转染至细胞中，继续培养后分离病毒液，即得。
本发明还提供上述重组犬细小病毒假病毒的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，以CPV-2基因组DNA为模板，扩增得到所述V1片段、V2片段和V3片段，将V1片段和V2片段进行拼接，并引入T2A连接V2片段和V3片段，得到含有表达盒转录区的片段VP2-T2A-VP1；所述VP2-T2A-VP1包括依次串联连接的V1片段、V2片段、T2A和V3片段；
步骤2，将VP2-T2A-VP1与质粒载体进行连接，得到用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒；
步骤3，以CPV-2全长感染性克隆质粒为模板，扩增得到所述核心质粒重组前体，将所述核心质粒重组前体与所述外源基因序列进行连接，得到重组质粒；
步骤4，将所述重组质粒和用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒转染至细胞中，继续培养后分离病毒液，即得。
优选的，步骤1中，扩增引物包括：
用于扩增V1片段的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，
用于扩增V1片段的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，
用于扩增V2片段的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，
用于扩增V2片段的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，
用于扩增V3片段的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，
用于扩增V3片段的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
和/或，步骤2中，VP2-T2A-VP1与质粒载体均经BamH I/Xba I双酶切后进行连接；
和/或，步骤3中，扩增引物包括：
用于扩增核心质粒重组前体的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，
用于扩增核心质粒重组前体的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
所述核心质粒重组前体与所述外源基因序列通过ClonExpress II One StepCloning Kit方法进行连接；
和/或，步骤4中，所述细胞为F81细胞。
本发明还提供上述重组犬细小病毒假病毒用于表达外源基因的用途。
本发明构建了一种缺失VP2编码序列的核心质粒重组前体CPV(ΔVP2)，其保留了CPV-2基因组两端的反向末端重复序列及NS1全长序列。进一步的，将外源基因序列(例如荧光报告基因EGFP序列)替换VP2编码序列，能够构建出一种表达外源基因的重组质粒。
进一步的，本发明还构建能同时有效表达CPV-2衣壳蛋白VP1和VP2的辅助质粒pVP2-T2A-VP1，为进行假病毒包装提供病毒组装的VP1和VP2蛋白。
将上述重组质粒与辅助质粒pVP2-T2A-VP1共转染进细胞，即可包装出具有感染能力，并且能够有效表达外源基因的CPV重组假病毒。
本发明克服了现有CPV-2在表达外源基因时存在的病毒基因组结构对表达效率和组装效率的限制，具有很好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是重组犬细小病毒假病毒构建过程的流程示意图。
图2是辅助质粒pVP2-T2A-VP1的构建示意图。
图3是辅助质粒pVP2-T2A-VP1转染F81细胞后的VP1和VP2表达的westernblotting检测结果。
图4是核心质粒pCPV-EGFP的构建示意图。
图5是核心质粒pCPV-EGFP转染F81细胞后EGFP荧光报告基因的表达情况。
图6是核心质粒pCPV-EGFP转染F81细胞后EGFP表达的western blotting检测结果。
图7是CPV-2重组假病毒的病毒拷贝数的检测结果。
图8是CPV-2重组假病毒感染F81细胞后EGFP荧光报告基因的表达情况。
具体实施方式
以下实施例中，未具体说明的试剂和原料均为市售品。
实施例1重组犬细小病毒假病毒
本实施例的重组犬细小病毒假病毒构建过程如图1所示，重组犬细小病毒假病毒包括重组质粒和用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒。
重组质粒(下文中称为核心质粒pCPV-EGFP)包括相互连接的外源基因序列(本实施例中外源基因序列为EGFP荧光报告基因)与核心质粒重组前体(下文中简写为CPV(ΔVP2))。
用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒是在质粒载体(本实施例中质粒载体选自质粒pCDNA3.1)中插入依次串联连接的V1片段、V2片段、T2A和V3片段。
以上各片段的核苷酸序列如下：
CPV(ΔVP2)序列(SEQ ID NO.1)：
GTTCAATTTTACACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTCGCTACAGGAACATTTTATTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAACACAAACATTATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGTCTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAGAAGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATATATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTCCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCACCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAAATGAGTATCAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAGTAATATTGGAGGTATGAAAATTGCATATGAAAAATCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATATTAACATACTTACTATGTTTTTATGTTTATTACATATTATTTTAAGATTAATTAAATTACAGCATAGAAATATTGTACTTGTACTTGATATAGGATTTAGAAGGTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAGTTTGTTTTATAAAATGTATTGTAAACCATTAATGTATGTTGTTATGGTGTGGGTGGTTGGTTGGTTTGCCCTTAGAATATGTTAAGGACCAAAAAAATCAATAAAAGACATTTAAAACTAAATGGCCTCGTATACTGTCTATAAGGTGAACTAACCTTACCATTAGTATCAATCTGTCTTTAAGGGGGGGTGGGTGGGAGATGCACAATATCAGTAGACTGACTGGCCTGGTTGGTTGTTCTGCTTAATCAACCAGACCGTTATGCGGTCTGGTTGATTAAGCGCAACCAACCAGGCCAGTCAGTCTACTGATGTTGTGCATCTCCCACCCACCCCCCC
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AAGACCATCAAAACCAACTAAAAGAAGTAAACCACCACCTCATATTTT
CATCAATCTTGCAAAAAAAAAAAAAACCGGTGCAGGACAAGTAAAAAGAGACAATCTTGCACCAATG；
V1片段(SEQ ID NO.2)：
GCGGATCCGATGAAAACTGGGCGGAGCCTAAAATACAAGAAGGTATAAATTCACCAGGTTGCAAAGACTTAGAGACACAAGCGGCAAGCAATCCTCAGAGTCAAGACCAAGTTCTAACTCCTCTGACTCCGGACGTAGTGGACCTTGCACTGGAACCGTGGAGTACTCCAGATACGCCTATTGCAGAAACTGCAAATCAACAATCAAACCAACCTGGCGTTACTCACAAAGACGTGCAAGCGAGTCCAACGTGGTCCGAAATAGAGGCAGACCTGAGAGCCATCTTTACTTCTGAACAATTGGAAGAAGATTTTCGAGACGACTTGGATT；
V2片段(SEQ ID NO.3)：
TTCGAGACGACTTGGATTAAGACTTGTGCCTCCAGGTTATAAATATCTTGGGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGAACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCTTCGCTCTGGTAAAAACCCATACTTATATTTCTCGCCAGCAGATCAACGCTTTATAGATCAAACTAAGGACGCTAAAGATTGGGGGGGGAAAATAGGACATTATTTTTTTAGCGCTAAAAAGGCAATTGCTCCAGTATTAACTGATACCCCAGATCATCCATCAACATCAAGACCATCAAAACCAACTAAAAGAAGTAAACCACCACCTCATATTTTCATCAATCTTGCAAAAAAAAAAAAAACCGGTGCAGGACAAGTAAAAAGAGACAATCTTGCACCAATGAGTGATGGAGGAGTTCAACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCTACAGGATCTGGGAACGGGTCTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTTAATAATCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGATACTCATGCACAAATTGTAACACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCAACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTACACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTCGCTACAGGAACATTTTATTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAACACAAACATTATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGTCTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAGAAGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATATATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTCCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCACCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAAATGAGTATCAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAGTAATATTGGAGGTATGAAAATTGCATATGAAAAATCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATATGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT；
T2A linker序列(SEQ ID NO.4)：
GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAAT CCCGGCCCT；
片段V3(SEQ ID NO.5)：
GAGGAGAATCCCGGCCCTATGGCACCTCCGGCAAAGAGAGCCAGGAGAGGACTTGTGCCTCCAGGTTATAAATATCTTGGGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGAACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCTTCGCTCTGGTAAAAACCCATACTTATATTTCTCGCCAGCAGATCAACGCTTTATAGATCAAACTAAGGACGCTAAAGATTGGGGGGGGAAAATAGGACATTATTTTTTTAGCGCTAAAAAGGCAATTGCTCCAGTATTAACTGATACCCCAGATCATCCATCAACATCAAGACCATCAAAACCAACTAAAAGAAGTAAACCACCACCTCATATTTTCATCAATCTTGCAAAAAAAAAAAAAACCGGTGCAGGACAAGTAAAAAGAGACAATCTTGCACCAATGAGTGATGGAGGAGTTCAACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCTACAGGATCTGGGAACGGGTCTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTTAATAATCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGATACTCATGCACAAATTGTAACACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCAACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTACACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTCGCTACAGGAACATTTTATTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAACACAAACATTATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGTCTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAGAAGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATATATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTCCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCACCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAAATGAGTATCAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAGTAATATTGGAGGTATGAAAATTGCATATGAAAAATCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATATTAATCTAGAGC；EGFP报告基因序列(SEQ ID NO.6)：
GAGACAATCTTGCACCAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGAGTTCAATTTTACACTATTG。
实施例2重组犬细小病毒假病毒的制备和鉴定
本实施例提供实施例1所述的重组犬细小病毒假病毒的制备方法及其鉴定实验结果，具体步骤如下：
(一)辅助质粒pVP2-T2A-VP1的构建及鉴定
1.1提取CPV-2基因组DNA
取437.5μL的CPV-2病毒液上清，加入50μL 10％的SDS和12.5μL的蛋白酶K，55℃孵育30min，参照酚氯仿法提取病毒DNA，即CPV-2c基因组DNA(MT892649)。
1.2克隆V1、V2及V3序列
以提取的CPV-2c基因组DNA为模板，利用引物VP-F1/VP-R1扩增片段V1；以提取的CPV-2c基因组DNA为模板，利用引物VP-F2/VP-R2扩增片段V2；以提取的CPV-2c基因组DNA为模板，利用引物VP-F3/VP-R3扩增片段V3。
以上扩增均采用PCR仪完成，反应体系为：5×EVO Buffer 10μL、dNTP Mix(10mM)1μL、上下游引物(均为10μM)各2μL、Phanta EVO Super-Fidelity DNA Polymerase(vazyme)1μL、模板DNA(150ng/μL)1μL，以及ddH2O33μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后分别胶收纯化后回收目的片段V1(330bp)、V2(2224bp)及V3(2210bp)。
V1、V2及V3的PCR扩增引物如下：
上游引物VP-F1(SEQ ID NO.7)：
Figure BDA0004192036210000131
下游引物VP-R1(SEQ ID NO.8)：
Figure BDA0004192036210000132
上游引物VP-F2(SEQ ID NO.9)：
Figure BDA0004192036210000133
Figure BDA0004192036210000134
下游引物VP-R2(SEQ ID NO.10)：
Figure BDA0004192036210000141
上游引物VP-F3(SEQ ID NO.11)：
Figure BDA0004192036210000142
下游引物VP-R3(SEQ ID NO.12)：
Figure BDA0004192036210000143
以上引物中，下划线部分为限制性内切酶酶切识别位点。边框部分为T2A序列相关的部分。
1.3辅助质粒pVP2-T2A-VP1的构建
如图2所示，以回收片段V1和V2共同为模板，以VP-F1/VP-R2为上下游引物进行overlap PCR，按照上述反应程序进行扩增，得到片段V1-V2。以回收片段V1-V2和V3共同为模板，以VP-F1/VP-R3为上下游引物进行overlap PCR，按照上述反应程序进行扩增，得到片段V1-V2-T2A-V3。将胶收纯化的V1-V2-T2A-V3与pCDNA3.1质粒分别经BamH I/Xba I双酶切后进行连接，连接产物转化DH5α感受态(Invitrogen公司)，涂板过夜培养后挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。
将阳性菌落送公司进行测序鉴定。测序正确的质粒命名为pVP2-T2A-VP1，将阳性菌摇菌扩大培养后，提取质粒，测定质粒浓度后备用。
1.4辅助质粒pVP2-T2A-VP1的表达鉴定
将F81细胞(普诺赛)均匀铺到细胞培养板中，37℃5％CO2培养，待细胞密度达到80％，开始转染细胞。即预先采用等体积的无血清无双抗的细胞培养基分别稀释辅助质粒pVP2-T2A-VP1与Lipo8000转染试剂(碧云天)，然后将Lipo8000稀释液缓缓加入辅助质粒pVP2-T2A-VP1稀释液中，混匀，得质粒-转染试剂混合液；弃去F81细胞原有培养基，用无血清无双抗的细胞培养基洗涤一次，将质粒-转染试剂混合液缓缓加入细胞培养板中，继续培养6h，弃掉转染孵育液，加入完全培养基继续培养。
在培养至转染后48h，收集细胞，3000rpm离心5min，收集细胞沉淀，加入适量RIPA裂解液(碧云天)冰浴裂解30min，12000rpm 4℃离心10min，转移上清到新的离心管中，加入蛋白上样缓冲液煮沸变性，进行western blotting检测。
结果如图3所示，使用CPV Capsid(Novus)抗体，在pVP2-T2A-VP1转染组与CPV-2c感染的F81细胞阳性对照组中都检测到CPV-2c衣壳蛋白VP1和VP2的表达，而未作处理的阴性对照组中没有检测到特异性条带。结果说明辅助质粒pVP2-T2A-VP1构建成功，并且能够同时表达CPV-2c衣壳蛋白VP1和VP2。
(二)核心质粒pCPV-EGFP的构建及鉴定
2.1pCPV-EGFP的构建
以pEGFP-N1模板，利用引物EGFP F/EGFP R扩增EGFP荧光报告基因序列；以CPV-2全长感染性克隆质粒(由本实验保存)为模板，利用引物CPV F/CPV R扩增缺失VP2编码序列的CPV(ΔVP2)，CPV(ΔVP2)中保留了CPV-2基因组两端的反向末端重复序列及NS1全长序列。
以上扩增均采用PCR仪完成，反应体系为：5×EVO Buffer 10μL、dNTP Mix(10mM)1μL、上下游引物(均为10μM)各2μL、Phanta EVO Super-Fidelity DNA Polymerase(vazyme)1μL、模板DNA(150ng/μL)1μL，以及ddH2O33μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后分别胶收纯化回收片段EGFP和CPV(ΔVP2)。
EGFP荧光报告基因及CPV(ΔVP2)的PCR扩增引物如下：
上游引物EGFP F(SEQ ID NO.13)：
Figure BDA0004192036210000151
上游引物EGFP R(SEQ ID NO.14)：
Figure BDA0004192036210000152
没有斜体加粗的部分是进行连接的同源序列；斜体加粗的部分为EGFP荧光报告基因序列。
上游引物CPV F(SEQ ID NO.15)：
Figure BDA0004192036210000153
下游引物CPV R(SEQ ID NO.16)：
Figure BDA0004192036210000154
如图4所示，将EGFP和CPV(ΔVP2)通过试剂盒(ClonExpress II One StepCloning Kit)方法进行连接(37℃30min)，连接产物转化DH5α感受态(Invitrogen公司)，涂板后37℃过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。
将阳性菌落送公司进行测序鉴定。测序为阳性的重组质粒命名为pCPV-EGFP，将阳性菌摇菌扩大培养后，提取质粒，测定质粒浓度后备用。
2.2pCPV-EGFP的鉴定
通过将pCPV-EGFP转染F81细胞，验证EGFP荧光报告基因的表达情况，具体如下：
采用等体积的无血清无双抗的细胞培养基分别稀释pCPV-EGFP与Lipo8000转染试剂(碧云天)，然后将Lipo8000稀释液缓缓加入pCPV-EGFP稀释液中，混匀，得质粒-转染试剂混合液。弃去F81细胞原有培养基，用无血清无双抗的细胞培养基洗涤一次，将质粒-转染试剂混合液缓缓加入细胞培养板中，继续培养6h，弃掉转染孵育液，加入完全培养基继续培养。
在培养至转染后24h，荧光显微镜下观察EGFP荧光报告基因的绿色荧光表达情况(图5)，核心质粒pCPV-EGFP可以成功表达携带的外源基因。
在培养至转染后48h，收集细胞，3000rpm离心5min，收集细胞沉淀，加入适量RIPA裂解液(碧云天)冰浴裂解30min，12000rpm 4℃离心10min，转移上清到新的离心管中，加入蛋白上样缓冲液煮沸变性，进行western blotting检测。
结果如图6所示，使用EGFP抗体(Cell Signaling Technology公司)，在pCPV-EGFP转染组检测到了EGFP的表达，而未转染的阴性对照组中没有检测到特异性条带。结果说明构建的核心质粒pCPV-EGFP能够有效表达其所携带的EGFP荧光报告基因。
(三)携带EGFP荧光报告基因的CPV-2重组假病毒的包装
将F81细胞均匀铺到细胞培养板中，37℃5％CO2培养，待细胞密度达到80％，开始转染细胞。即预先将pCPV-EGFP与pVP2-T2A-VP1两个质粒依次加入无血清无双抗的细胞培养基中，轻轻混匀，并且另取等体积的无血清无双抗的细胞培养基稀释Lipo8000转染试剂(碧云天)，然后将Lipo8000稀释液缓缓加入双质粒(pCPV-EGFP与pVP2-T2A-VP1等比例混合)稀释液中，轻轻混匀后静置20min，得质粒-转染试剂混合液；弃去F81细胞的原有培养基，用无血清无双抗的培养基洗涤一次，将质粒-转染试剂混合液缓缓加入细胞培养板中(即将核心质粒pCPV-EGFP与辅助质粒pVP2-T2A-VP1同时共转染F81细胞)，继续培养6h，弃掉转染孵育液，用无血清无双抗的培养基洗涤两次，加入完全培养基继续培养。
在培养至转染后72h，3000rpm离心5min，收集上清(即为获得的CPV-2重组假病毒病毒液)用于进行携带EGFP荧光报告基因的CPV-2重组假病毒包装效率的检测。
实时荧光定量PCR检测上清液中重组假病毒的滴度：取437.5μL收集的上清液，提取病毒DNA。应用定量引物CPV-EGFP F/CPV-EGFP R进行实时荧光定量PCR，检测72h细胞上清中CPV-2重组假病毒的DNA拷贝数达到1×108.6(图7)。
(四)携带EGFP荧光报告基因的CPV-2重组假病毒的感染性检测
将F81细胞均匀铺到24孔细胞培养板中，37℃5％CO2培养，待细胞密度达到70％，弃去细胞上清，用无血清无双抗的培养基洗涤一次，将收集的CPV-2重组假病毒病毒液加入细胞孔中，接毒4h后补加等体积的5％FBS的细胞培养基，继续孵育8h，弃去孵育后细胞上清液，用无血清无双抗的培养基洗涤一次，加入完全培养基继续培养。
F81细胞感染携带EGFP荧光报告基因的CPV-2重组假病毒后24h、48h及72h，在荧光显微镜下观察EGFP荧光报告基因的表达情况，在感染CPV-2重组假病毒的细胞中检测到了绿色荧光(图8)，说明包装获得的CPV-2重组假病毒可以成功感染F81细胞，并且有效表达携带的外源基因。
通过上述实施例可以看到，本发明通过将CPV-2全长感染性克隆质粒改造为携带外源基因的复制缺陷型重组质粒，构建表达外源基因的重组CPV-2假病毒系统，克服了现有CPV-2表达外源基因时存在表达效率和组装效率受到限制的问题。这不仅对病毒致病机制研究提供了良好的研究工具，并且为基于CPV-2假病毒系统的基因工程多联疫苗及新型靶向药物的研发奠定理论基础，具有广泛的应用前景。

Claims (10)

1.一种核心质粒重组前体，其特征在于：所述核心质粒重组前体为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或相似性与SEQ ID NO.1大于等于90％的核苷酸序列。
2.一种重组质粒，其特征在于：它包括相互连接的外源基因序列与权利要求1所述的核心质粒重组前体。
3.按照权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：所述外源基因序列为EGFP荧光报告基因。
4.一种重组犬细小病毒假病毒，其特征在于：它包括权利要求2或3所述的重组质粒和用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒。
5.按照权利要求4所述的重组犬细小病毒假病毒，其特征在于：所述用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒包括依次串联连接的质粒载体、V1片段、V2片段、T2A和V3片段；
其中，所述V1片段为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或相似性与SEQ ID NO.2大于等于90％的核苷酸序列；
所述V2片段为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或相似性与SEQ ID NO.3大于等于90％的核苷酸序列；
所述T2A为如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，或相似性与SEQ ID NO.4大于等于90％的核苷酸序列；
所述V3片段为如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或相似性与SEQ ID NO.5大于等于90％的核苷酸序列。
6.按照权利要求4所述的重组犬细小病毒假病毒，其特征在于：所述质粒载体选自pCDNA3.1。
7.按照权利要求4所述的重组犬细小病毒假病毒，其特征在于：所述重组犬细小病毒假病毒按照如下方法制备得到：将所述重组质粒和用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒转染至细胞中，继续培养后分离病毒液，即得。
8.权利要求4-7任一项所述的重组犬细小病毒假病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，以CPV-2基因组DNA为模板，扩增得到所述V1片段、V2片段和V3片段，将V1片段和V2片段进行拼接，并引入T2A连接V2片段和V3片段，得到含有表达盒转录区的片段VP2-T2A-VP1；所述VP2-T2A-VP1包括依次串联连接的V1片段、V2片段、T2A和V3片段；
步骤2，将VP2-T2A-VP1与质粒载体进行连接，得到用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒；
步骤3，以CPV-2全长感染性克隆质粒为模板，扩增得到所述核心质粒重组前体，将所述核心质粒重组前体与所述外源基因序列进行连接，得到重组质粒；
步骤4，将所述重组质粒和用于表达CPV-2衣壳蛋白的辅助质粒转染至细胞中，继续培养后分离病毒液，即得。
9.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：
步骤1中，扩增引物包括：
用于扩增V1片段的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，
用于扩增V1片段的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，
用于扩增V2片段的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，
用于扩增V2片段的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，
用于扩增V3片段的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，
用于扩增V3片段的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
和/或，步骤2中，VP2-T2A-VP1与质粒载体均经BamH I/Xba I双酶切后进行连接；
和/或，步骤3中，扩增引物包括：
用于扩增核心质粒重组前体的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，
用于扩增核心质粒重组前体的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
所述核心质粒重组前体与所述外源基因序列通过ClonExpress II One Step CloningKit方法进行连接；
和/或，步骤4中，所述细胞为F81细胞。
10.权利要求4-7任一项所述的重组犬细小病毒假病毒用于表达外源基因的用途。
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