CN117757752A - 稳定表达PRRSV次要结构蛋白的Marc-145细胞系及其制备方法和应用 - Google Patents
稳定表达PRRSV次要结构蛋白的Marc-145细胞系及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种稳定表达PRRSV次要结构蛋白的Marc‑145细胞系，该PRRSV次要结构蛋白包括GP2a、GP3、GP4、或ORF5a蛋白。本发明还公开了Marc‑145细胞系的制备方法，包括以下步骤：将猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4‑F112的次要结构蛋白DNA序列克隆到具有嘌呤霉素抗性的慢病毒载体上，应用慢病毒三质粒包装系统在293T细胞包装慢病毒，然后感染Marc‑145细胞，用嘌呤霉素选择性筛选，挑选单克隆细胞纯化，得到稳定表达次要结构蛋白的Marc‑145细胞株，所述次要结构蛋白选自下述任意一个：PRRSV次要结构蛋白GP2a、GP3、GP4、或ORF5a蛋白。本发明的Marc‑145细胞系，可用于PRRSV复制缺陷型疫苗的研发与筛选，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种稳定表达PRRSV次要结构蛋白的Marc-145细胞系及其制备方法和应用。
背景技术
稳定细胞系是指将外源基因整合到宿主细胞基因组中，使外源基因能够在宿主细胞中长期稳定表达。其原理是将外源基因克隆到具有某种抗性的载体上，通过转染宿主细胞，外源基因整合到宿主染色体上，用载体中所含抗性基因进行筛选即可得到成功整合目的基因的细胞。在试验过程中，常用的真核表达载体抗性筛选标志物有嘌呤霉素(puromycin)、新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)等。通过筛选可得到符合实验要求的稳定高表达目的蛋白细胞株或者稳定沉默目的基因的细胞株。利用慢病毒感染筛选单克隆是目前最常用的稳定细胞系构建方法之一。慢病毒可以感染几乎所有类型的细胞，并且可以将遗传物质整合到宿主细胞基因组中，进行长时间的稳定表达。
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种猪接触性传染病，给我国及世界养猪业造成了严重影响。疫苗接种是目前防控PRRSV病毒感染最有效的措施，目前商品化的PRRSV疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗两类。PRRSV灭活疫苗由于不能有效诱导中和抗体的产生，其有效性不是非常明确；其优点是安全性好，但是灭活苗存在免疫剂量大、免疫次数多、免疫力产生期较长等缺点。PRRSV弱毒疫苗能够很好地诱导猪体产生细胞免疫和体液免疫，提供有效的免疫保护，接种弱毒苗后猪体抗体产生快，且持续时间持久，保护力强。但是弱毒疫苗也有缺点，有研究表明弱毒疫苗病毒可经胎盘感染胎儿，并向未接种疫苗的母猪传播，或者表现出急性PRRS综合症状。所以PRRSV弱毒疫苗安全性问题是目前阻碍PRRSV弱毒疫苗广泛应用的重要原因之一。
PRRSV基因组编11个开放阅读框(ORF)。PRRSV有8种结构蛋白，分别是GP2a、GP3、GP4、GP5、膜(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白、包膜(E)蛋白和ORF5a蛋白。病毒核衣壳(N)蛋白，含量最高，高度保守，免疫原性强，可以诊断和鉴别病毒感染；N蛋白诱导产生的抗体不具备中和活性，无保护力。M蛋白与GP5蛋白形成异源二聚体，是PRRSV包膜的主要成分，与病毒组装，出芽以及病毒颗粒与细胞附着因子的结合有关。GP5蛋白具有较好的免疫原性，可诱导中和抗体产生，变异程度最大，常用于病毒的进化研究。GP2a、GP3和GP4，三个N-糖基化蛋白形成三聚体包膜蛋白复合物，对病毒感染至关重要。GP2a和GP4是病毒关键附着蛋白，诱导中和抗体产生。GP2、GP3和GP4蛋白不是病毒粒子形成所必须的，但缺少这些小糖蛋白的病毒颗粒不具传染性。病毒颗粒形成不需要E蛋白，但E缺失的PRRSV病毒不具有传染性；另外E蛋白具有单一的跨膜螺旋结构和离子通道活性；E蛋白可诱导细胞凋亡。ORF5a蛋白对病毒活力和感染力密切相关。
目前，病毒感染分子克隆被广泛应用于研究PRRSV的生物学特性、致病机理、毒力决定因子以及不断变异的分子机制，而其基因组作为外源基因表达载体的研究也被广泛开展。针对上述商品化PRRSV疫苗存在的问题，在PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株感染性分子克隆(专利号为201010559005.X的中国发明专利)的基础上，开发PRRSV复制缺陷型疫苗。首先需要构建稳定表达PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)的Marc-145细胞株；这些细胞系将用于PRRSV复制缺陷型疫苗的研发与筛选，以解决现有商品化PRRSV灭活疫苗免疫效果差以及PRRSV弱毒疫苗持续带毒、间歇排毒、毒力返强等安全性问题。PRRSV复制缺陷型疫苗株在稳定表达PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)的Marc-145细胞系正常复制且具有较高的病毒滴度，在普通Marc-145细胞系只能进行一次性感染与复制。
然而，目前尚无能稳定表达PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)的Marc-145细胞株，需要通过实验进行构建和筛选鉴定。
发明内容
本发明要解决现有商品化PRRSV灭活疫苗免疫效果差以及PRRSV弱毒疫苗持续带毒、间歇排毒、毒力返强的技术问题，提供一种稳定表达PRRSV次要结构蛋白的Marc-145细胞系，该细胞系将被用于PRRSV复制缺陷型疫苗的研发与筛选。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种Marc-145细胞系，所述细胞系稳定表达PRRSV次要结构蛋白，该PRRSV次要结构蛋白包括GP2a、GP3、GP4、或ORF5a蛋白。
优选的，所述GP2a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述GP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述GP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述ORF5a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明的另一方面，还提供了一种重组慢病毒表达载体，所述载体包含PRRSV次要结构蛋白的基因序列，该PRRSV次要结构蛋白包括GP2a、GP3、GP4、或ORF5a蛋白。
在本发明的另一方面，还提供了上述Marc-145细胞系的制备方法，包括以下步骤：将猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的次要结构蛋白DNA序列克隆到具有嘌呤霉素抗性的慢病毒载体上，应用慢病毒三质粒包装系统在293T细胞包装慢病毒，然后感染Marc-145细胞，用嘌呤霉素选择性筛选，挑选单克隆细胞纯化，得到稳定表达次要结构蛋白的Marc-145细胞株，所述次要结构蛋白选自下述任意一个：PRRSV次要结构蛋白GP2a、GP3、GP4、或ORF5a蛋白。
优选的，所述GP2a蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，GP3蛋白的DNA序列如SEQID NO.4所示，GP4蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，ORF5a蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的另一方面，还提供了上述Marc-145细胞系在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。
优选的，所述疫苗包括猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型疫苗。
本发明的稳定表达PRRSV次要结构蛋白的Marc-145细胞系，可用于PRRSV复制缺陷型疫苗的研发与筛选，PRRSV复制缺陷型疫苗在这些过表达细胞系上能正常复制且具有较高的病毒滴度，在普通Marc-145细胞系只能进行一次性感染与复制。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)基因重组慢病毒表达载体构建过程中的核酸电泳结果图；其中a是PCR扩增PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)的片段；b是限制性内切酶EcoR I酶切慢病毒骨干质粒pLV-EF1a-IRES-Puro的结果图；
图2是本发明实施例2重组慢病毒的RT-PCR鉴定结果图；
图3是本发明实施例3稳定表达PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)的Marc-145细胞系qPCR检测结果图；
图4是本发明实施例3稳定表达PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)的Marc-145细胞系的间接免疫荧光实验结果图；
图5是本发明实施例3稳定表达PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)的Marc-145细胞系活力检测结果图。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112是本实验室通过将高致病性PRRSV强毒HuN4株体外传代致弱获得的减毒活疫苗株，之前的大量临床实验证实HuN4-F112弱毒疫苗株具有很好的免疫保护力(专利号为200810097546.8的中国发明专利)。本发明分别将HuN4-F112弱毒疫苗株次要结构蛋白(GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)DNA序列克隆到具有嘌呤霉素(puromycin)抗性的慢病毒载体上，应用慢病毒三质粒包装系统在293T细胞包装慢病毒，然后感染Marc-145细胞，用嘌呤霉素选择性筛选，挑选单克隆细胞纯化，得到可稳定表达PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)的Marc-145细胞株。这四株Marc-145细胞系将用于PRRSV复制缺陷型疫苗的研发与筛选，以解决现有商品化PRRSV灭活疫苗免疫效果差以及PRRSV弱毒疫苗持续带毒、间歇排毒、毒力返强等安全性问题，PRRSV复制缺陷型疫苗株在稳定表达PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)的Marc-145细胞系正常复制且具有较高的病毒滴度，在普通Marc-145细胞系只能进行一次性感染与复制。
实施例1PRRSV次要结构蛋白基因重组慢病毒表达载体的构建
1.1材料与方法
1.1.1细胞及质粒
慢病毒骨干质粒pLV-EF1a-IRES-Puro、慢病毒包装质粒psPAX2、VSV-G包膜表达质粒pMD2.G，293T细胞，Marc-145细胞均由中国农科院上海兽医研究所猪传染病研究室保存。
1.1.2主要试剂
质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自上海华舜生物科技有限公司；DNA纯化回收试剂盒购置Omega公司；PfuUltraⅡFusion HSDNAPolymerase购自Stratagene公司；Taq酶、dNTP、DL-2000DNA Marker、DL-1 5000DNA Marker均购自TaKaRa公司；胎牛血清、opti-培养基和高糖的DMEM培养基购自Gibco公司；ClonExpress IIOne Step CloningKit购自诺唯赞公司；其他化学试剂均为进口或国产分析纯。
1.1.3引物设计
根据PRRSV疫苗株HuN4-F112基因序列，用Primer 5.0软件设计了带有同源臂的引物用于扩增PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)，其中，引物序列见表1，小写字母部分为质粒pLV-EF1a-IRES-Puro的同源臂，GP2a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，GP2a蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，GP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，GP3蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，GP4蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，GP4蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、ORF5a蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.7所示，ORF5a蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
表1PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)的引物
1.2PRRSV次要结构蛋白基因重组慢病毒表达载体的构建
1.2.1PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)基因的PCR扩增
以感染性克隆载体pSK-HuN4-F112质粒为模板，利用表1特异性引物和高保真酶Pfu UltraⅡFusion HSDNA Polymerase进行PCR扩增。反应体系和反应条件如下：
表2PCR反应体系
反应过程：95℃预变性3min、95℃变性20s、65℃退火20s、72℃延伸30s，35个循环后72℃再延伸10min，4℃保存。PCR产物跑核酸胶如图1a，纯化目的片段，测浓度并置于-20℃保存。
1.2.2pLV-EF1a-IRES-Puro载体线性化
将pLV-EF1a-IRES-Pur载体按以下表3反应体系37℃过夜酶切。通过琼脂糖凝胶电泳分离出目的片段如图1b，并进行胶回收，步骤参考试剂盒说明书。
表3酶切反应体系
1.2.3PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)基因重组慢病毒表达载体的构建
根据ClonExpress IIOne Step Cloning Kit试剂盒说明书，利用胶回收的线性化载体pLV-EF1a-IRES-Puro与带有同源臂的PRRSV GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白片段进行同源重组，体系如下：
表4同源重组反应体系
将配好的同源重组体系用枪吹打混匀，在37℃水浴孵育30min。孵育结束后将同源重组产物加入到DH5α感受态中，冰浴30min后，42℃热激80s，继而冰上冷却2～3min；然后在超净台后加入900μL无抗LB培养基，37℃摇床摇50min后，将菌液3000×g离心4min，留约100μL上清将离心产物重悬，涂在具有氨苄抗性的LB平板上。在37℃培养14h后，挑菌落扩大培养并测序。将测序正确的菌液大量培养抽提质粒，命名为pLV-Puro-GP2a、pLV-Puro-GP3、pLV-Puro-GP4、pLV-Puro-ORF5a，保存于-20℃备用。
实施例2PRRSV次要结构蛋白重组慢病毒的包装与鉴定
2.1慢病毒的包装
复苏293T细胞，待细胞长至80％时，准备包装慢病毒。试验中同时设置慢病毒表达载体pLV-EF1a-IRES-Puro转染以及未转染293T细胞作为对照。质粒转染具体操作如下：
(1)将293T细胞培养于T75细胞瓶中，待细胞长到80％左右且分布均匀时，准备进行质粒转染。
(2)按照LipofectamineTM3000Transfection Reagent试剂盒说明书将质粒pLV-Puro-GP2a/pLV-Puro-GP3/pLV-Puro-GP4/pLV-Puro-ORF5a 10μg、psPAX2 6.5μg、pMD2.G3.5μg与所需试剂量加入5mL预热的Opti-MEM培养基中吹打混匀，室温静置15min。
(3)在等待的15min内，弃掉细胞瓶中原有培养基，立即轻柔缓慢加入PBS清洗细胞洗2遍，吸干残留PBS。
(4)将孵育好的混合液沿壁缓缓加入T75中，放置于5％ CO2、37℃细胞培养箱培养。
(5)6～8h后换液，弃掉T75中液体换成10mL含10％ FBSDMEM培养基继续培养。
(6)转染后48h收取上清病毒液离心，过滤，分装，标记好，保存于-80℃冰箱，一次性使用，不可反复冻融。
2.2重组慢病毒的浓缩
用冻融的方法使细胞破碎释放病毒，3000rpm室温离心5min，除去细胞碎片；然后用0.22μm的过滤器过滤。取20mL病毒液加入4.66mL的PEG6000(polyethylene glycol)以及2.47mL NaCl(4mol/L)混匀，4℃静置7～8h。5000rpm离心40～50min，收集病毒沉淀；在病毒沉淀中加入适量的Tris-HCl(50mmol/L)重悬病毒颗粒，即可获得10～100倍浓缩的重组慢病毒液，分装，置-80℃保存备用。
2.3重组慢病毒的鉴定
使用RNA提取试剂盒提取重组慢病毒病毒液RNA，并反转录为cDNA 作为模板，使用PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)基因特异性引物进行RT-PCR检测，引物序列、反应体系及反应程序均同实施例1的1.2.1.，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图2，1、2、3、4为pLV-Puro-GP2a、pLV-Puro-GP3、pLV-Puro-GP4、pLV-Puro-ORF5a包装的慢病毒。
实施例3重组慢病毒感染Marc-145细胞及其稳转细胞系筛选鉴定
3.1慢病毒感染细胞
复苏Marc-145细胞，加入含10％FBS的DMEM培养液，于37℃ 5％ CO2细胞培养箱中培养。Marc-145细胞传代两次后，铺至六孔板中，待细胞长到30％-40％且细胞状态良好时进行细胞感染。
用PBS清洗Marc-145细胞，加入2mL/孔10％FBS的DMEM培养基。取50μL浓缩后的慢病毒悬液感染细胞，再加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺(Polybrene)，置于37℃ 5％CO2细胞培养箱中培养，24h后，开始进行嘌呤霉素筛选。
3.2嘌呤霉素筛选
将感染后的细胞用PBS清洗三次，加入含终浓度1μg/ml嘌呤霉素10％FBS的DMEM培养基进行筛选培养，每隔24h换液一次，直至对照组未用慢病毒感染的Marc-145细胞全部死亡。实验组细胞在压力筛选下不断增殖，当细胞汇合度约为50％时，将细胞用胰酶消化后继续维持筛选，随后根据细胞生长情况，再进行扩大培养。
3.3稳转细胞系的鉴定
3.3.1qPCR检测
设计并合成PRRSV次要结构蛋白(即GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)基因的实时荧光定量PCR的引物(表5)，然后根据SYBR Premix ExTaq试剂盒说明书按需要计算并配置如下表6的反应体系。将反应体系轻轻吹打混匀，然后避光加入到荧光定量PCR板中瞬时离心，一般每个样品cDNA设置3个重复避免误差。在96实时荧光定量PCR仪上设置如表7程序。qPCR反应结束后，用2^-△△Ct法分析数据并绘制图表。结果表明，这四株稳转细胞系PRRSV GP2a/GP3/GP4/ORF5a蛋白在mRNA水平远高于普通Marc-145细胞(图3)。
表5PRRSV GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白基因的实时荧光定量PCR的引物
表6Real-time PCR反应体系
表7Real-time PCR反应条件
3.3.2间接免疫荧光实验
将稳转细胞系及普通Marc-145细胞铺在24孔板中，待其长满时取出做间接免疫荧光实验。将细胞在室温下用冰甲醇固定10min；然后用PBS洗涤3次后，用5％的BSA于37℃恒温箱中封闭30min。将一抗阳性猪血清用1％的BSA按1:100稀释好后每孔加200μL，37℃下孵育2h。弃上清，将细胞用PBS洗涤三遍，用1％的BSA将Goat anti-Pig IgG/FITC抗体以1：1000的比例稀释加入到细胞板中，37℃温育1h。洗涤细胞然后通过倒置荧光显微镜观察并留图(图4)。间接免疫荧光实验结果显示：与普通Marc-145细胞相比，Marc-145-GP2a、Marc-145-GP3、Marc-145-GP4、Marc-145-ORF5a细胞系都有较明显的绿色荧光，表明它们各自均能表达相应的PRRSV GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白。
3.3.3细胞活力检测
取对数生长期的Marc-145-GP2a、Marc-145-GP3、Marc-145-GP4、Marc-145-ORF5a细胞，血细胞计数板计数，调整细胞数为2.5×105/mL备用。以逐级稀释法分别以0、25000、50000、100000/孔的细胞铺96孔板，使每孔体积为100μL，每个浓度设5个重复。经37℃、5％CO2培养24h，待细胞贴壁、铺展，弃去原培养基，每孔加入100μL含25μg/mL刃天青的DMEM新培养基，开盖避光，37℃、5％ CO2孵育4h。然后以Ex/Em＝540/590nm酶标仪检测荧光强度(fluorescence intensity，FLU)，以无细胞含25μg/mL刃天青的培养基为空白对照，作为检测背景。结果显示，相同细胞数的孔对应的荧光强度无显著差异(图5)，表明这四株稳转细胞系与普通Marc-145细胞活力相当。
3.4结果
分别将HuN4-F112弱毒疫苗株次要结构蛋白(GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白)的DNA序列克隆到具有嘌呤霉素(puromycin)抗性的慢病毒载体上，应用慢病毒三质粒包装系统在293T细胞包装慢病毒，然后感染Marc-145细胞，用嘌呤霉素选择性筛选，经qPCR检测，这四株稳转细胞系PRRSV GP2a/GP3/GP4/ORF5a蛋白在mRNA水平远高于普通Marc-145细胞；经过间接免疫荧光实验验证，PRRSV GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白成功在Marc-145细胞上表达；对这四株稳转细胞系进行细胞活力检测，它们与普通Marc-145细胞活力相当；将这些可稳定表达PRRSV GP2a、GP3、GP4、ORF5a蛋白的Marc-145细胞株分别命名为Marc-145-GP2a、Marc-145-GP3、Marc-145-GP4、Marc-145-ORF5a。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种Marc-145细胞系，其特征在于，所述细胞系稳定表达PRRSV次要结构蛋白，该PRRSV次要结构蛋白包括GP2a、GP3、GP4、或ORF5a蛋白。
2.根据权利要求1所述的Marc-145细胞系，其特征在于，所述GP2a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的Marc-145细胞系，其特征在于，所述GP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的Marc-145细胞系，其特征在于，所述GP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求1所述的Marc-145细胞系，其特征在于，所述ORF5a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.一种重组慢病毒表达载体，其特征在于，所述载体包含PRRSV次要结构蛋白的基因序列，该PRRSV次要结构蛋白包括GP2a、GP3、GP4、或ORF5a蛋白。
7.权利要求1所述Marc-145细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的次要结构蛋白DNA序列克隆到具有嘌呤霉素抗性的慢病毒载体上，应用慢病毒三质粒包装系统在293T细胞包装慢病毒，然后感染Marc-145细胞，用嘌呤霉素选择性筛选，挑选单克隆细胞纯化，得到稳定表达次要结构蛋白的Marc-145细胞株，所述次要结构蛋白选自下述任意一个：PRRSV次要结构蛋白GP2a、GP3、GP4、或ORF5a蛋白。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述GP2a蛋白的DNA序列如SEQ IDNO.2所示，GP3蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，GP4蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，ORF5a蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.8所示。
9.权利要求1-5任一项所述的Marc-145细胞系在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疫苗包括猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型疫苗。
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