CN116218783A - 一种过表达hs3st5基因的重组bhk-21细胞系及其在增强病毒复制中的应用 - Google Patents

一种过表达hs3st5基因的重组bhk-21细胞系及其在增强病毒复制中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种过表达HS3ST5基因的重组BHK‑21细胞系及其在增强病毒复制中的应用，属于基因工程技术领域。本发明提供通过将HS3ST5片段克隆到慢病毒载体中构建出重组慢病毒质粒，再经病毒拯救包装出的慢病毒，感染BHK‑21细胞，获得过表达HS3ST5的重组BHK‑21细胞系。过表达HS3ST5的重组BHK‑21细胞会促进FMDV的吸附和复制，这为病毒疫苗抗原的制备提供了有效工具，为后续研究病毒感染和防治奠定了基础。

Description

一种过表达HS3ST5基因的重组BHK-21细胞系及其在增强病毒 复制中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种过表达HS3ST5基因的重组BHK-21细胞系及其在增强病毒复制中的应用。
背景技术
1961年，英国学者首次从1日龄叙利亚金仓鼠肾脏细胞分离并建立幼仓鼠肾细胞系(Babyhamsterkidney,BHK-21)。BHK-21细胞呈纤维样，可连续传代，是最常见的动物细胞类型之一。BHK-21细胞具有可悬浮培养、生长速度快、病毒敏感谱广等优点，被广泛应用于大规模制备病毒疫苗抗原。目前已有多种病毒利用BHK-21细胞繁殖，包括口蹄疫病毒(Food-and-mouth disease，FMDV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、狂犬病毒(Rabies virus,RV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)和辛徳毕斯病毒(Sindbis virus，SV)等。BHK-21细胞被驯化实现悬浮生长以来，在FMD疫苗生产领域应用最为广泛，是FMDV增殖的理想细胞系之一。现今也有利用BHK-21悬浮细胞大量表达重组蛋白而制备亚单位疫苗的报道。因此，BHK-21细胞在生物制品行业是一种较为重要的工程细胞，显示出巨大的应用潜力。为了提升该细胞的生产性能，利用不同策略对BHK-21细胞的改造在持续更新研究中。
硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)是一类线性硫酸化的生物大分子。功能性HS在生理条件下携带大量负电荷，通过弱相互作用识别并结合带正电荷的病毒粒子，增强病毒对宿主细胞的感染能力。因此HS可作为受体参与细胞与病毒粒子的相互作用，提高病毒的复制能力。HS已被证明能够辅助包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)、I型单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirus type1，HSV-1)和FMDV等多种病毒入侵细胞，显著提升病毒在宿主细胞上的增殖能力。硫酸基转移酶HS3ST5通过硫酸化反应修饰HS，从而形成3-O-硫酸化的HS，发挥调控HS生物学功能的作用。目前还没有稳定表达HS3ST5的BHK-21细胞系的报道，尚不清楚稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞是否能够增强以HS为受体的病毒的复制性能。
FMDV是一种经典的小RNA病毒，能够利用HS受体感染宿主细胞。FMDV通过识别并结合细胞膜表面的HS受体而吸附在宿主细胞上，随后在HS介导的内吞作用下进入宿主细胞内，起始病毒的复制。FMDV和HS互作研究多关注于不同FMD毒株和同一毒株上关键氨基酸残基对于HS的利用效率和能力。尚不清楚HS修饰酶HS3ST5对FMDV复制的影响。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种过表达HS3ST5基因的重组BHK-21细胞系，通过过表达HS3ST5基因的细胞系能够增强病毒复制，可大规模制备病毒疫苗抗原。
本发明提供了一种过表达HS3ST5基因的重组BHK-21细胞系，所述重组BHK-21细胞系过表达HS3ST5蛋白。
优选的，所述HS3ST5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明提供了所述重组BHK-21细胞系的构建方法，包括以下步骤：
1)构建过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒；
2)将步骤1)中所述过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒和辅助质粒共同转染细胞，拯救得到过表达HS3ST5基因的重组慢病毒；
3)将所述过表达HS3ST5基因的重组慢病毒感染BHK-21细胞，经筛选得到稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞系。
优选的，步骤1)中所述构建方法，用含Xba I和Not I酶切位点的引物扩增HS3ST5基因，得到的扩增片段和慢病毒载体pLOV-CMV-EGFP分别经Xba I和Not I双酶切，酶切片段和线性化载体连接，鉴定，得到过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒。
优选的，含Xba I和Not I酶切位点的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物。
优选的，步骤3)中所述筛选的方法为采用嘌呤霉素进行筛选；
所述嘌呤霉素的浓度为4μg/mL。
本发明提供了所述重组BHK-21细胞系或所述构建方法构建得到的重组BHK-21细胞系在增强病毒复制中的应用。
本发明提供了所述重组BHK-21细胞系或所述构建方法构建得到的重组BHK-21细胞系在生产病毒疫苗中的应用。
优选的，所述病毒包括包括利用HS受体入侵细胞的病毒。
优选的，所述利用HS受体入侵细胞的病毒包括口蹄疫病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒和单纯疱疹病毒中的一种或几种。
本发明提供了一种过表达HS3ST5基因的重组BHK-21细胞系，所述重组BHK-21细胞系过表达HS3ST5蛋白。本发明以FMDV为病毒模型，测定重组BHK-21细胞系上FMDV的吸附和复制水平，结果显示稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞会促进FMDV的吸附和基因复制。可见BHK-21细胞过表达HS3ST5基因后可影响FMDV对细胞的吸附，促进FMDV的感染。又鉴于BHK-21细胞常常用来大规模制备病毒疫苗抗原，因此本发明提供的过表达HS3ST5基因的重组BHK-21细胞系为病毒疫苗抗原的制备提供了有效工具，为后续研究病毒感染和防治奠定了基础。
附图说明
图1为CHO-K1和BHK-21细胞的HS3ST5基因序列比对结果；
图2为HS3ST5基因扩增结果；
图3为带有EGFP标签的重组慢病毒质粒在HEK-293T细胞中的表达结果；
图4为单克隆重组BHK-21细胞株中EGFP的表达结果；
图5为BHK-HS3ST5-OE-1重组细胞株中HS3ST5蛋白表达分析结果；
图6为BHK-HS3ST5-OE-1重组细胞株中HS3ST5 mRNA水平检测结果；
图7为稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞对FMDV吸附的影响结果；
图8为稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞对FMDV复制的影响结果。
具体实施方式
本发明提供了一种过表达HS3ST5基因的重组BHK-21细胞系，所述重组BHK-21细胞系过表达HS3ST5蛋白。
在本发明中，所述HS3ST5蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO：2所示。
本发明提供了所述重组BHK-21细胞系的构建方法，包括以下步骤：
1)构建过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒；
2)将步骤1)中所述过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒和辅助质粒共同转染细胞，拯救得到过表达HS3ST5基因的重组慢病毒；
3)将所述过表达HS3ST5基因的重组慢病毒感染BHK-21细胞，经筛选得到稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞系。
本发明构建过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒。
在本发明中，所述构建方法，优选用含Xba I和NotI酶切位点的引物扩增HS3ST5基因，得到的扩增片段和慢病毒载体pLOV-CMV-EGFP分别经Xba I和Not I双酶切，酶切片段和线性化载体连接，鉴定后得到过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒。
在本发明中，所述HS3ST5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明中，含Xba I和Not I酶切位点的引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物。所述扩增的反应体系优选如下：50℃反转录30min；94℃预变性5min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2.5min，循环35次；72℃再延伸10min。
本发明对Xba I和NotI双酶切和连接的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的Xba I和Not I双酶切和连接的方法即可。所述鉴定的方法优选为载体测序，所述测序用引物核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
得到过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒后，本发明将所述过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒和辅助质粒共同转染细胞，拯救得到过表达HS3ST5基因的重组慢病毒。
在本发明中，所述共同转染细胞优选包括质量份的组分：10份重组慢病毒质粒、7.5份psPAX2辅助质粒、2.5份pMD2.G辅助质粒。所述共同转染细胞时转染试剂优选为Lipofectamine 2000。本发明对细胞的种类没有限制，采用本领域所熟知的细胞即可，在本发明实施例中，以HEK-293T细胞作为侵染细胞。
得到重组慢病毒后，本发明将所述重组慢病毒感染BHK-21细胞，经筛选得到稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞系。
在本发明中，所述重组慢病毒感染BHK-21细胞的方法优选为，将慢病毒液和完全细胞培养基按照1：1体积比混匀制成混合培养基，加入对数期的BHK-21细胞中，每隔24h更换依次混合培养基。
在本发明中，所述筛选的方法优选为采用嘌呤霉素进行筛选。所述嘌呤霉素的浓度为4μg/mL。
在本发明中，重组BHK-21细胞系优选包括验证。所述验证的方法优选包括RT-qPCR检测和Western Blot分析。在本发明实施例中，经过RT-qPCR检测，得到筛选的细胞系中HS3ST5 mRNA水平显著上升，说明成功构建得到过表达HS3ST5的重组细胞系。通过WesternBlot分析，所述重组BHK-21细胞系第5和20代重组细胞系表达HS3ST5蛋白的水平无显著差异，说明所述重组BHK-21细胞系能够稳定表达HS3ST5蛋白。
在本发明中，稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞会促进FMDV的吸附和复制。
本发明提供了所述重组BHK-21细胞系或所述构建方法构建得到的重组BHK-21细胞系在增强病毒复制中的应用。
本发明提供了所述重组BHK-21细胞系或所述构建方法构建得到的重组BHK-21细胞系在生产病毒疫苗中的应用。
在本发明中，所述病毒优选包括包括利用HS受体入侵细胞的病毒。所述利用HS受体入侵细胞的病毒包括口蹄疫病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒和单纯疱疹病毒中的一种或几种。在本发明实施例中，以口蹄疫病毒为例加以说明重组BHK-21细胞系在提高病毒复制中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种过表达HS3ST5基因的重组BHK-21细胞系及其在增强病毒复制中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验材料和试剂来源说明
1细胞、质粒和病毒
BHK-21细胞源自中国典型培养物保藏中心，HEK-293T细胞源自中国典型培养物保藏中心，JM109感受态细胞购自TaKaRa公司，pMD2.G、psPAX2和pLOV-CMV-EGFP质粒购自Invitrogen公司，经典O型口蹄疫疫苗株O/HN/CHA/93(Cathay)由中国国家口蹄疫参考实验室提供。
2.主要试剂和仪器
兔源HS3ST5多克隆抗体购自Novus公司，鼠源β-actin单克隆抗体购自康为世纪公司，RNeasy Mini Kit购自Qiagen公司，磷酸盐缓冲液(PBS)购自BI生物公司，黄芪胶购于MPBiomedicals公司，高糖DMEM、MEM培养基、Lipofectamine 2000、Opti-MEM培养基和胰酶购自Invitrogen公司，胎牛血清(FBS)和嘌呤霉素购自Gibco公司，质粒小量提取试剂盒和质粒大量提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,慢病毒快速检测卡购自北京博奥龙免疫技术有限公司，ChamQ SYBR qPCR MasterMix购自诺唯赞公司。
3.引物设计与合成
根据NCBI上HS3ST5基因序列设计引物，通过RT-PCR扩增BHK-21细胞中的HS3ST5全长基因，设计的上游引物为5'-ATGAAAAGCGTAGTAGTGATGAGT-3'(SEQ ID NO:3)，下游引物为5'-TTAGGGCCAGTTCAATGTCCTCCCAGTGAT-3'(SEQ ID NO:4)。RT-qPCR试验扩增HS3ST5基因片段的上游引物序列为5'-CCATTTGCCCTGTTGAAAGCC-3'(SEQ ID NO:6)，下游引物序列为5'-CCGGAATTCATGCAGCAGAC-3'(SEQ ID NO:7)；内参基因GAPDH的上游引物序列为5'-CAAGAAGGTGGTGAAGCA-3'(SEQ ID NO:8)，下游引物序列为5'-AAGTGGAAGAGTGAGTGTC-3'(SEQ ID NO:9)。RT-qPCR试验扩增FMDV 3D基因的上游引物序列为5'-ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA-3'(SEQ ID NO:10)，下游引物序列为5'-GCGAGTCCTGCCACGACGGA-3'(SEQ ID NO:11)。以上引物均由金唯智生物技术公司合成。
实施例1
BHK-21细胞中HS3ST5基因的扩增
利用上述设计合成的引物扩增BHK-21细胞中HS3ST5基因。PCR反应体系如表1，反应条件如下：50℃反转录30min；94℃预变性5min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2.5min，循环35次；72℃再延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后进行DNA琼脂糖凝胶回收，回收产物送至金唯智生物技术公司测序。
表1RT-PCR体系
Figure BDA0004049196970000071
BHK-21细胞中HS3ST5基因的扩增结果：
以提取的BHK-21细胞基因组为模板，利用设计的引物扩增HS3ST5全长基因。琼脂糖凝胶电泳结果显示成功扩增出BHK-21细胞中的HS3ST5基因。电泳图如图1，扩增产物条带大小1000bp左右。将目的条带胶回收后送至公司测序，序列测定结果显示BHK-21中的HS3ST5基因序列长度为1038nts，而之前测定的CHO-K1中的HS3ST5基因序列长度为981nts。
利用Megalign软件进一步对BHK-21和CHO-K1细胞的HS3ST5进行序列比对，发现两种细胞中HS3ST5基因序列具有明显差异。
结果如图2所示，相较于BHK-21细胞中的HS3ST5基因，CHO-K1细胞中的HS3ST5基因在N端连续缺失46nts，提示两种细胞中HS3ST5基因的功能可能具有差异。
实施例2
过表达BHK-21细胞源HS3ST5重组慢病毒质粒的构建
慢病毒载体pLOV-CMV-EGFP经Xba I和NotI酶切，回收8000bp的片段。将回收片段和HS3ST5扩增片段连接而构建重组慢病毒质粒，重组质粒命名为pLOV-EGFP-BHK-HS3ST5。pLOV-EGFP-BHK-HS3ST5质粒经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将阳性质粒送至金唯智生物技术公司进行测序，测序引物为：5'-CGGTGAATGCTGGTGGCATC-3'(SEQ ID NO:5)。大量提取鉴定正确的阳性重组质粒以及辅助质粒pMD2.G和psPAX2。
HS3ST5重组慢病毒质粒的构建及鉴定结果：
将pLOV-CMV-EGFP载体用Xba I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳观察到2条片段，回收8000bp片段，并与BHK-21细胞源HS3ST5的扩增片段进行连接。连接产物经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后，将阳性克隆送测进行鉴定，结果表明成功构建重组慢病毒质粒pLOV-EGFP-BHK-HS3ST5。将测序正确的阳性质粒大提留存备用。
实施例3
1.过表达HS3ST5重组慢病毒的拯救
将正常的HEK-293T细胞铺在10cm的细胞培养皿中，细胞状态良好且密度长至70％时，利用Lipofectamine 2000转染试剂进行质粒转染(10μg重组慢病毒质粒+7.5μg psPAX2辅助质粒+2.5μg pMD2.G辅助质粒)。6h后往细胞培养皿中轻轻加入4ml的高糖DMEM完全培养基，放置37℃培养箱中培养，期间利用荧光显微镜多次观察转染细胞的绿色荧光强度，48h后收取细胞上清液并用0.45μm滤器过滤。使用慢病毒快速检测卡测定上清液中慢病毒的滴度，过滤后的慢病毒液放至-40℃冰箱储存备用。
2.嘌呤霉素筛选浓度的确定
将BHK-21细胞平铺至六孔板中，细胞密度长至90％后，分别加入浓度为1、2、3、4、5和6μg/mL的嘌呤霉素处理细胞，每隔24h重新加药处理。7d后观察六孔板细胞存活情况，无细胞存活的最低药物浓度即为嘌呤霉素筛选的最佳浓度。
3.稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞系的构建
将慢病毒液和完全细胞培养基按照1：1体积混匀制成混合培养基，将正常的BHK-21铺在六孔板中，用混合培养基进行培养。待细胞长满六孔板后，转至细胞培养瓶中，继续加入混合培养基培养，期间每隔24h更换一次混合培养基。7d后利用荧光显微镜观察细胞经慢病毒感染后的绿色荧光程度。用最佳浓度的嘌呤霉素处理慢病毒感染后的细胞，每隔24h更换带有嘌呤霉素的完全培养基。7d后存活的BHK-21细胞几乎均为携带重组慢病毒质粒的重组细胞。把过表达HS3ST5的重组BHK-21细胞计数后稀释成单个细胞加入到96孔板中，待细胞长成一团后，用显微镜观察是否为单个克隆。细胞长满后，对单克隆重组细胞进行扩大培养和冻存，并通过Western Blot和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测单克隆重组细胞中HS3ST5的表达水平。Western Blot试验使用的一抗为兔源HS3ST5多克隆抗体和鼠源β-actin单克隆抗体，使用的二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG和HRP标记的山羊抗兔IgG。RT-qPCR方法的反转录体系见表2，反转录程序为37℃15min，85℃5s。RT-qPCR方法的扩增体系见表3，扩增反应程序为95℃30s预变性；95℃5s，60℃30s，72℃30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃30s，60℃15s。利用ΔΔCT法计算HS3ST5的相对mRNA拷贝数。
表2HS3ST5的RT-qPCR反转录体系
Figure BDA0004049196970000091
表3HS3ST5的RT-qPCR的扩增体系
Figure BDA0004049196970000092
稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞系的建立及鉴定结果：
将阳性重组慢病毒质粒pLOV-EGFP-BHK-HS3ST5转染HEK-293T细胞，48h后用荧光显微镜观察细胞是否发出绿色荧光。结果如图3所示，荧光显微镜下可观察到转染细胞中产生较强的绿色荧光。由于重组慢病毒质粒携带EGFP蛋白标签，EGFP蛋白在HEK-293T细胞中的成功表达说明重组慢病毒质粒成功转染进HEK-293T细胞，表明过表达重组慢病毒拯救成功。用梯度浓度的嘌呤霉素处理BHK-21细胞，观察到BHK-21细胞经过最小浓度为4μg/mL的嘌呤霉素筛选一周后，细胞全部死亡。因此确定筛选BHK-21重组细胞系的最佳嘌呤霉素浓度为4μg/mL。
BHK-21细胞经成功拯救的重组慢病毒感染和最佳浓度的嘌呤霉素筛选后，用荧光显微镜观察细胞是否发出绿色荧光。结果如图4所示，荧光显微镜观察到重组慢病毒感染的BHK-21细胞发出较强的绿色荧光，说明重组慢病毒成功感染BHK-21细胞，表明过表达HS3ST5的重组BHK-21细胞系初步构建成功。构建的重组细胞系命名为BHK-HS3ST5-OE，从重组细胞系中挑选3个荧光较强的单克隆细胞株冻存留用。
选取BHK-HS3ST5-OE-1进行HS3ST5蛋白和mRNA表达水平的验证。结果如图5所示，Western Blot结果显示与正常BHK-21细胞相比，重组细胞株BHK-HS3ST5-OE-1中HS3ST5蛋白水平显著上升。
RT-qPCR结果如图6所示，与正常BHK-21细胞相比，BHK-HS3ST5-OE-1中HS3ST5mRNA水平显著上升。以上结果表明稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞系建立成功。
实施例4
稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞对FMDV吸附的影响
通过检测FMDV 3D mRNA表达水平评价重组BHK-21细胞对FMDV吸附的影响。先对细胞进行计数，加入感染剂量(MOI)为1的4℃预冷FMDV，4℃放置2h使FMDV充分吸附细胞，再用4℃预冷的PBS缓冲液洗去未吸附的FMDV，随后加入RNA裂解液，收取样品后提取RNA，用RT-qPCR方法检测吸附至细胞表面FMDV的3D mRNA水平。RT-qPCR方法的反转录体系见表4，反转录程序为37℃15min，85℃5s。RT-qPCR方法的扩增体系见表5，扩增反应程序为95℃30s预变性；95℃5s，60℃30s，72℃30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃30s，60℃15s。利用ΔΔCT法计算FMDV 3D的相对mRNA拷贝数。
表4FMDV 3D的RT-qPCR反转录体系
成分 体积
RNA (1000/浓度)μL
5×RFMix 4μL
水 至20μL
表5FMDV 3D的RT-qPCR的扩增体系
成分 体积
2×TB Green Premix EX Taq 10μL
cDNA 2μL
上游引物 0.4μL
下游引物 0.4μL
ROXDye 0.4μL
水 6.8μL
结果：
利用RT-qPCR试验检测BHK-HS3ST5-OE-1重组细胞对FMDV吸附的影响。结果如图7所示，相对于正常BHK-21细胞，稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞中的FMDV mRNA水平显著提高，BHK-HS3ST5-OE-1中病毒mRNA水平是对照细胞中的3.5倍，表明稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞有利于FMDV的吸附。
实施例5
稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞对FMDV复制的影响
用MOI为1的病毒接种重组BHK-21细胞，置于37℃培养箱，分别在4、6、8、10、12和16h后加入RNA裂解液收取样品。提取RNA，用RT-qPCR方法检测FMDV的复制水平。
结果：
利用RT-qPCR试验检测BHK-HS3ST5-OE-1重组细胞对FMDV基因复制的影响。结果如图8所示，对于所有时间点样品，相较于正常BHK-21细胞，稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞中的FMDV mRNA水平显著提高。BHK-HS3ST5-OE-1重组细胞和正常BHK-21细胞中的FMDVmRNA水平在12h样品中达到峰值，此时BHK-HS3ST5-OE-1中的FMDV mRNA水平是对照细胞中的1.8倍。上述结果说明稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞提高了FMDV的复制水平。
由上述实施例可知，通过RT-PCR技术扩增获得BHK-21细胞内的HS3ST5基因，克隆到pLOV-CMV-EGFP载体中从而构建出重组慢病毒质粒，再利用脂质体转染技术使重组慢病毒质粒pLOV-EGFP-BHK-HS3ST5与辅助质粒pMD2.G和psPAX2转染进入HEK-293T细胞，收获HEK-293T细胞包装出的慢病毒，然后感染BHK-21细胞，嘌呤霉素持续筛选10d后获得表达HS3ST5的重组BHK-21细胞系，通过有限稀释法和绿色荧光强度观察筛选出稳定表达HS3ST5的单克隆重组BHK-21细胞株。
利用建立的稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞，以FMDV为病毒模型，测定重组BHK-21细胞上FMDV的吸附和复制的影响。结果显示稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞能够促进FMDV的吸附和复制。因此，稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞明显提高了FMDV的复制能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种过表达HS3ST5基因的重组BHK-21细胞系，其特征在于，所述重组BHK-21细胞系过表达HS3ST5蛋白。
2.根据权利要求1所述重组BHK-21细胞系，其特征在于，所述HS3ST5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.权利要求1或2所述重组BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒；
2)将步骤1)中所述过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒和辅助质粒共同转染细胞，拯救得到过表达HS3ST5基因的重组慢病毒；
3)将所述过表达HS3ST5基因的重组慢病毒感染BHK-21细胞，经筛选得到稳定表达HS3ST5的重组BHK-21细胞系。
4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤1)中所述构建方法，用含Xba I和NotI酶切位点的引物扩增HS3ST5基因，得到的扩增片段和慢病毒载体pLOV-CMV-EGFP分别经Xba I和Not I双酶切，酶切片段和线性化载体连接，鉴定，得到过表达HS3ST5基因的重组慢病毒质粒。
5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，含Xba I和Not I酶切位点的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物。
6.根据权利要求3～5任意一项所述构建方法，其特征在于，步骤3)中所述筛选的方法为采用嘌呤霉素进行筛选；
所述嘌呤霉素的浓度为4μg/mL。
7.权利要求1或2所述重组BHK-21细胞系或权利要求3～6任意一项所述构建方法构建得到的重组BHK-21细胞系在增强病毒复制中的应用。
8.权利要求1或2所述重组BHK-21细胞系或权利要求3～6任意一项所述构建方法构建得到的重组BHK-21细胞系在生产病毒疫苗中的应用。
9.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于，所述病毒包括包括利用HS受体入侵细胞的病毒。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述利用HS受体入侵细胞的病毒包括口蹄疫病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒和单纯疱疹病毒中的一种或几种。
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