CN110042083B - 稳定表达map3k8蛋白的bhk-21细胞株及其构建和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及稳定表达MAP3K8蛋白的BHK‑21细胞株及其构建和应用。该细胞株命名为BHK‑21/MAP3K8，保藏编号为CCTCC NO:C2018261。细胞株制备：目的基因MAP3K8合成，重组慢病毒载体Lv‑MAP3K8构建，包装表达MAP3K8的慢病毒，慢病毒感染BHK‑21细胞，经筛选、培养和鉴定获得稳定表达MAP3K8蛋白的BHK‑21细胞株。和BHK‑21相比较，BHK‑21/MAP3K8细胞株更有利于FMDV或SVV复制，更适合FMDV或SVV疫苗的研制和生产，同时为研究MAP3K8的基因功能提供了可靠材料。

Description

稳定表达MAP3K8蛋白的BHK-21细胞株及其构建和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及稳定表达MAP3K8蛋白的BHK-21细胞株及其构建和应用。
背景技术
稳定表达是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，可随细胞转录、表达和传代，细胞中目的蛋白的表达持久、稳定。一般是将外源DNA克隆到具有某种抗性或选择基因的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到染色体中，但外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组和连接，形成巨大的结构最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供，如用载体中所含有的选择标志进行筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白的细胞株。缺点是由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。
BHK-21细胞系(Baby Hamster Syrian Kidney)是从叙利亚幼鼠肾组织中分离培养获得的成纤维型贴壁细胞系，其可连续传代。BHK-21细胞系可以用于多种病毒的增殖和纯化。如口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)、脑心肌炎病毒(EMC Virus)、呼肠孤病毒(Reoviridae)、水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)和塞内卡古病毒(Seneca valley virus,SVV)等。目前BHK-21细胞系已被广泛应用于口蹄疫疫苗生产。
有丝分裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，简称MAPK)是一类丝氨酸/苏氨酸(Serine/Threonine，简称Ser/Thr)蛋白激酶家族，可以被多种细胞因子、生长因子、神经递质、激素、细胞应激和细胞粘附等信号激活，是免疫、癌变和细胞凋亡途径的调节剂。MAPK信号通路在进化上是高度保守的，并在基因表达调控及巧胞质巧信号传递过程中发挥着重要作用，如病原诱导宿主保护性反应。MAP3K8又称TPL2(tumorprogression locus 2)/COT(cancer Osaka thyroid)，在不同的组织中都有着广泛的表达。
有研究表明TPL2通过上调裂解基因表达和病毒裂解基因的启动子活性(包括RTA和开放阅读框57(ORF57))来增强MHV-68裂解复制，TPL2/AP-1信号转导途径为MHV- 68裂解复制的正调节物；另外MAP3K8/Tpl2还能促进鼠γ疱疹病毒的复制(Li,X.；Feng,J.； Chen,S.et al.Tpl2/AP-1enhances murine gammaherpesvirus 68lytic replication.J Virol2010,84 (4),1881-1890.)。魏楠楠等根据GenBank公布的TPL2基因序列设计构建TPL2的真核表达质粒以及设计并合成宿主TPL2的RNAi序列，利用脂质体方法转染BHK-21细胞，结果表明，FMDV感染BHK-21细胞后，TPL2转录水平显著上调；过表达TPL2能够促进FMDV 在BHK-21细胞中复制，而下调表达内源性TPL2后FMDV的复制受到抑制(魏南南,徐守兴,史喜娟,etal.TPL2促进口蹄疫病毒在BHK-21细胞复制[J].畜牧兽医学报,2018, 49(6).)。
发明内容
本发明用重组慢病毒载体和包装质粒感染BHK-21靶细胞，然后用载体抗性筛选单克隆细胞，传代、建立稳定表达MAP3K8蛋白的细胞株BHK-21/MAP3K8，用FMDV或SVV 感染构建的细胞株BHK-21/MAP3K8后，和野生型BK-21相比较该细胞株能显著促进病毒复制，提高了病毒产量。该细胞株为解决FMDV或SVV疫苗的研制和生产提供功能细胞株，并为研究MAP3K8基因功能及其背后的分子机制提供了生物材料。
本发明提供的稳定表达MAP3K8蛋白的BHK-21细胞株，该细胞株命名为BHK- 21/MAP3K8，其保藏编号为CCTCC NO:C2018261。
BHK-21细胞株在促进FMDV或SVV复制中的应用也属于本发明的内容。
本发明还提供了BHK-21细胞株在FMDV或SVV的分离和/或培养中的应用。
本发明还提供了BHK-21细胞株在FMDV或SVV疫苗的研究和/或生产中的应用。
本发明还提供了BHK-21细胞株在MAP3K8基因功能及其分子机制的研究中的应用。
本发明还提供一种稳定表达MAP3K8蛋白的BHK-21细胞株的构建方法，具体包括以下步骤：
步骤1：重组慢病毒载体Lv-MAP3K8的构建：将MAP3K8基因插入到慢病毒载体Lv-pCDH的MCS区；
步骤2：包装表达MAP3K8的慢病毒：用293FT细胞包装Lv-MAP3K8病毒液；48小时后收集病毒液，过滤、保存备用；
步骤3：慢病毒感染BHK-21细胞：将步骤2得到的慢病毒浓缩后感染BHK-21细胞，8小时后终止；
步骤4：筛选培养：感染48h后，进行药物筛选，48h～72h后更换培养基并传代，维持培养，鉴定，得到稳定表达MAP3K8蛋白的BHK-21细胞株BHK-21/MAP3K8。
本发明还利用qRT-PCR验证筛选到的细胞株BHK-21/MAP3K8，结果显示MAP3K8 在该细胞株中能够高效、稳定表达。
本发明将细胞株BHK-21/MAP3K8分别接FMDV和SVV，qRT-PCR结果显示，与野生型BHK-21相比，细胞株BHK-21/MAP3K8能促进FMDV和SVV的复制。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明利用慢病毒系统构建了稳定表达MAP3K8蛋白的BHK-21细胞株，该细胞株的建立为研究BHK-21细胞中MAP3K8基因功能及其背后的分子机制提供了生物材料。
2、利用本发明构建的BHK-21/MAP3K8细胞株过表达MAP3K8可以促进FMDV或 SVV的复制，将细胞株BHK-21/MAP3K8、野生型BHK-21均分别接FMDV和SVV后， BHK-21/MAP3K8中FMDV的mRNA相对表达量高于野生型BHK-21细胞中FMDV的 mRNA相对表达量，差异极显著(p<0.01)，BHK-21/MAP3K8中SVV的病毒拷贝数显著高于野生型BHK-21细胞中SVV的病毒拷贝数，差异极显著(p<0.001)。因此可以利用 BHK-21/MAP3K8细胞株分离和培养FMDV或SVV、制备FMDV或SVV疫苗。与现有技术相比，本发明细胞株提高了FMDV、SVV的产量和FMDV、SVV疫苗的生产效率。
附图说明
图1为细胞株pCDH-BHK-21、BHK-21/MAP3K8中MAP3K8的表达量对比图。
图2为细胞株pCDH-BHK-21、BHK-21/MAP3K8中MAP3K8和β-actin的qRT-PCR 产物电泳检测图。
图3为野生型BHK-21和细胞株BHK-21/MAP3K8中FMDV/GAPDH mRNA表达量对比图，图中**表示p<0.01。
图4为野生型BHK-21和细胞株BHK-21/MAP3K8在接毒FMDV0h、8h、16h后的间接免疫荧光观察照片；A：BHK-21；B：感染FMDV 8h的BHK-21；C：感染FMDV 16h 的BHK-21；D：BHK-21/MAP3K8；E：感染FMDV 8h的BHK-21/MAP3K8；F：感染 FMDV 16h的BHK-21/MAP3K8。
图5为野生型BHK-21和细胞株BHK-21/MAP3K8中SVV的病毒拷贝数对比图，图中***表示p<0.001。
图6为野生型BHK-21和细胞株BHK-21/MAP3K8在接毒SVV0h、8h、16h后的间接免疫荧光观察照片；A：BHK-21；B：感染SVV 8h的BHK-21；C：感染SVV 16h的 BHK-21；
D：BHK-21/MAP3K8；E：感染SVV 8h的BHK-21/MAP3K8；F：感染SVV 16h的BHK- 21/MAP3K8。
附图中MAP3K8-BHK-21或MAP3K8(hamster)-BHK-21均表示BHK-21/MAP3K8。
保藏信息：
保藏时间：2018年12月19日；
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；
保藏编号：CCTCC NO:C2018261；
保藏单位地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山街16号；
分类命名：仓鼠肾细胞BHK-21/MAP3K8。
具体实施方式
以下结合说明附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特殊说明，本发明采用的试剂、方法和设备为为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例中所用材料来源：口蹄疫病毒毒株A/GDMM/CHA/2013、塞内卡古病毒(Seneca valley virus,SVV)毒株和乳仓鼠肾细胞(BHK-21)由兰州兽医研究所口蹄疫流行病学团队保存；Opti-MEM、Lipo 2000、0.25％EDTA胰酶和新生牛血清(FBS)均购于Gibco公司；DMEM细胞培养液和PBS溶液购于Hyclone公司；反转录试剂盒由诺维赞生物公司生产。慢病毒Lv-pCDH购自于质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心(NTCC)。重组慢病毒载体Lv-MAP3K8由PPL(Public Protein/Plasmid Library,China)公司构建。FMDV的VP3 蛋白兔一抗、SVV的兔一抗由兰州兽医研究所口蹄疫流行病学团队制备，制备方法参考 (陈飞.口蹄疫病毒3C蛋白多克隆抗体的制备与鉴定[D].山东农业大学,2018.)和(胡涛等. 教学用纯化水疱性口炎病毒抗原制备兔多克隆抗体结果分析[J]，卫生职业教育，2019(6)： 112-114)。免疫荧光兔二抗购自Cell Signaling Technology(CST)公司。
实施例1稳定表达MAP3K8的BHK-21细胞株BHK-21/MAP3K8的构建过程
1.1慢病毒载体的构建及病毒包装
具体包括以下步骤：
步骤1：重组慢病毒载体Lv-MAP3K8的构建：化学合成法合成Cricetulus griseus(Chinese hamster)MAP3K8基因的CDS序列，MAP3K8基因的CDS序列参照NCBI上登录号为XM_007616553.2的序列，MAP3K8基因CDS序列的5’端和3’端分别引入有Xba I和BamH I的识别位点，用Xba I和BamH I酶切目的基因和慢病毒载体Lv-pCDH后，连接，得到重组慢病毒载体Lv-MAP3K8。
步骤2：包装慢病毒：
(1)用293FT细胞分别包装慢病毒Lv-pCDH和Lv-MAP3K8病毒液；
①293T细胞的消化接种：将生长状态良好的293T细胞用0.25％胰蛋白酶消化制备单细胞悬液并调整浓度为4×105/ml，取10ml接种于10cm培养皿中。在37℃、5％CO2培养箱内培养过夜，第二天细胞汇合度达到80％，备用。
②病毒包装：将7.5μg慢病毒载体Lv-pCDH和包装质粒(3μg pMD2G和6μg psPAX)、7.5μg重组慢病毒载体Lv-MAP3K8(hamster)和包装质粒(3μg pMD2G和6μg psPAX)分别加到150μl OPTI-MEM内混匀，得两组慢病毒载体混合物；取25μlLipo 2000 加入到500μl OPTI-MEM内混匀，室温静置5min，得Lipo 2000混合物；将两组慢病毒载体混合物分别缓慢加入Lipo 2000混合物中，混匀后室温静置15min。然后分别逐滴加入到①中得到的汇合度达80％的293T细胞中，充分混匀。6h后更换为含10％FBS的DMEM新鲜培养液。
慢病毒载体要求：浓度为1μg/μl，纯度：OD260/OD280的值在1.8～2.0范围内。
(2)终止感染：培养48h后收集两组培养液(含慢病毒)，于1500g、4℃条件下离心10min去细胞碎片，然后用0.45μm滤膜过滤病毒上清液，用0.45μm滤器过滤、保存备用。
1.2稳定表达MAP3K8的BHK-21细胞株BHK-21/MAP3K8的筛选及鉴定
具体包括以下内容：
1.2.1慢病毒感染BHK-21细胞：
将1.1中得到的Lv-pCDH、Lv-MAP3K8病毒过滤液，按照4：1的比例加入5×pEGit病毒浓缩液。4℃静置过夜后，于3200g、4℃条件下离心20min。弃去上清，用含5％FBS 的DMEM培养液重悬病毒团块，并以200μl/管分装，-80℃保存。
然后将慢病毒Lv-pCDH、Lv-MAP3K8分别感染BHK-21细胞：病毒液体积200μl，病毒数量约2×107，用完全培养基补足至2ml，加入2μl转染增强剂聚凝胺(polybrene)， 8h后终止。两组细胞分别记为pCDH-BHK-21和BHK-21/MAP3K8。
1.2.2细胞株pCDH-BHK-21、BHK-21/MAP3K8的筛选：
感染48h后，加入puromycin进行药物筛选，筛选48h～72h后更换培养基并传代，维持培养，得到阳性细胞株pCDH-BHK-21、BHK-21/MAP3K8。通过筛选得到的阳性细胞株BHK-21/MAP3K8即为稳定表达MAP3K8蛋白的BHK-21细胞株。
1.2.3qRT-PCR检测MAP3K8的表达量：
(1)设计MAP3K8(hamster)的qRT-PCR引物和β-actin基因的qRT-PCR引物。引物序列如表1(SEQ ID NO:1～4)。
(2)Trizol提取阳性细胞株pCDH-BHK-21、BHK-21/MAP3K8的RNA，并测定 RNA的浓度。
(3)按500ng RNA逆转录成10μl体系cDNA的标准进行逆转录，将逆转录成功的cDNA作为模板，以步骤(1)合成的引物作为扩增引物进行qRT-PCR检测。反应体系为：
Figure BDA0002012123780000061
Green Master Mix 10μl，灭菌ddH2O 7.2μl，Primer1(10μM)0.4μl，Primer2(10μM)0.4μl，模板cDNA2μl。扩增程序为：95℃5min；95℃10s，60℃30s， 40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s。qRT-PCR结果如图1所示，细胞株BHK- 21/MAP3K8中MAP3K8在mRNA水平的表达量较对照组细胞株pCDH-BHK-21提高约100 倍。
(4)qRT-PCR实验结束后，利用核酸电泳技术对qRT-PCR的产物进行检测，结果如图2所示：对于MAP3K8基因，细胞株BHK-21/MAP3K8的qRT-PCR扩增产物的条带与细胞株pCDH-BHK-21的相比，差异显著；对于β-actin基因，两个细胞株的qRT-PCR扩增产物的条带基本相当。
qRT-PCR检测和电泳结果说明：通过以上步骤筛选到了稳定表达MAP3K8的BHK-21细胞株，且MAP3K8在该细胞株中能够高效、稳定表达。
表1实时定量PCR引物
引物名称 序列(5'-3') 序列编号
MAP3K8-hamster-F AAGTGAAGAGCCAGCAGTCT SEQ ID NO:1
MAP3K8-hamster-R CCAGATTCTTGCGGTCGATG SEQ ID NO:2
β-actin-hamster-F GAAGTGTGACGTCGACATCC SEQ ID NO:3
β-actin-hamster-R CACACAGAGTACTTGCGCTC SEQ ID NO:4
GAPDH-F GAGAAACCTGCCAAGTATGATGAC SEQ ID NO:5
GAPDH-R AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAG SEQ ID NO:6
FMDV-F CACTGGTGACAGGCTAAGG SEQ ID NO:7
FMDV-R CCCTTCTCAGATTCCGAGT SEQ ID NO:8
SVV-F AGAATTTGGAAGCCATGCTCT SEQ ID NO:9
SVV-R GAGCCAACATAGAAACAGATTGC SEQ ID NO:10
SVV3D-PRI-FAM TTCAAACCAGGAACACTACTCGAGA-BHQ1 SEQ ID NO:11
实施例2
2.1qRT-PCR验证细胞株BHK-21/MAP3K8促进FMDV复制
包括以下步骤：
(1)用无血清的DMEM将FMDV毒液稀释至1:500的浓度。
(2)将BHK-21/MAP3K8细胞消化后铺于细胞板中，置于37℃、5％CO2培养箱中，待细胞长至70％～90％时，用无血清的DMEM将细胞清洗两遍，以去除细胞中残留的血清。
(3)将稀释好的毒液按照适当的体积加入到细胞中(每2ml的细胞培养基加4ul的FMDV毒液)，置于37℃、5％CO2培养箱孵育1h之后，弃去毒液，换成2％FBS DMEM维持液，继续培养。在接毒后0、12h、24h收取样品。
(4)提取样品RNA做反转录，然后进行qRT-PCR，所用扩增FMDV的3D蛋白的引物(SEQID NO:7～8)详见表1，内参GAPDH基因的扩增引物(SEQ ID NO:5～6)详见表1。
结果如图3所示，在接毒后12h、24h时收取的样品中，BHK-21/MAP3K8细胞中 FMDV/GAPDH mRNA表达量远高于野生型BHK-21细胞中FMDV/GAPDH mRNA表达量 (差异极显著)。也就是说BHK-21/MAP3K8细胞与野生型BHK-21相比在12h、24h均能促进FMDV的复制。这是因为BHK-21/MAP3K8细胞在FMDV刺激下过量表达MAP3K8，进而促进了FMDV的复制。这表明BHK-21/MAP3K8细胞可以用来过量表达MAP3K8进而促进FMDV的复制。
2.2间接免疫荧光验证细胞株BHK-21/MAP3K8促进FMDV复制
(1)将BHK-21和BHK-21/MAP3K8细胞分别铺于20mm的玻璃小皿中，待细胞长至40％～50％时，接FMDV；
(2)接毒后0h、8h、16h收取细胞，用1×PBS清洗1次；
(3)用4％的多聚甲醛(每皿1mL)室温避光固定1h；
(4)用1×PBS清洗3次，5min/次(轻加1×PBS，防止细胞被冲起来)；
(5)用0.2％Triton X-100(100mLPBS+20μLTriton100)室温通透1h；
(6)用1×PBS洗涤3次，5min/次；
(7)用5％BSA(1×PBST：50mL1×PBS+50μLTween20，5％BSA：10mL+0.5g BSA)37℃封闭1h；
(8)吸取封闭液，加入用5％BSA稀释的一抗(FMDV的VP3蛋白兔一抗)，4℃过夜；
(9)用1×PBST清洗三次，10min/次，加入用1×PBST稀释的荧光素标记二抗(免疫荧光兔二抗)(避光)，37℃孵育1h；
(10)1×PBST清洗三次，10min/次，每皿加100μL减封片剂封片(含DAPI)；
(11)使用激光共聚焦仪器观察荧光，并保存图片。
结果如图4所示，在接毒后8h、16h时收取的样品中，BHK-21/MAP3K8细胞的病变程度均远高于野生型BHK-21细胞的病变程度。也就是说BHK-21/MAP3K8细胞与野生型 BHK-21相比，在接毒后8h、16h均能促进FMDV的复制。这是因为BHK-21/MAP3K8细胞在FMDV刺激下过量表达MAP3K8，进而促进了FMDV的复制。这表明BHK- 21/MAP3K8细胞可以用来过量表达MAP3K8进而促进FMDV的复制。
实施例3
3.1qRT-PCR验证细胞株BHK-21/MAP3K8促进SVV复制
包括以下步骤：
(1)用无血清的DMEM将SVV毒液稀释至1:500的浓度。
(2)将BHK-21/MAP3K8细胞消化后铺于细胞板中，置于37℃、5％CO2培养箱中，待细胞长至70％～90％时，用无血清的DMEM将细胞清洗两遍，以去除细胞中残留的血清。
(3)将稀释好的毒液按照适当的体积加入到细胞中(2ml的细胞培养基加4ul的SVV毒液)，置于37℃、5％CO2培养箱孵育1h之后，弃去毒液，换成2％FBS DMEM维持液，继续培养。在接毒后0、12h、24h收取样品。
(4)提取样品RNA做反转录，然后进行qRT-PCR。所用扩增SVV的3D蛋白保守区域的绝对定量引物(SEQ ID NO:9～10)和SVV的3D蛋白的探针(SEQ ID NO:11)详见表1。
结果如图5所示，在接毒后12h、24h时收取的样品中，BHK-21/MAP3K8细胞中 SVV的病毒拷贝数远高于野生型BHK-21细胞中SVV的病毒拷贝数(差异极显著)。也就是说BHK-21/MAP3K8细胞与野生型BHK-21相比，在接毒后12h、24h均能促进SVV的复制。这是因为BHK-21/MAP3K8细胞在SVV刺激下过量表达MAP3K8，进而促进了SVV 的复制。这表明BHK-21/MAP3K8细胞可以用来过量表达MAP3K8进而促进SVV的复制。
3.2间接免疫荧光验证BHK-21/MAP3K8细胞促进SVV复制
(1)将BHK-21细胞铺于20mm的玻璃小皿中，待细胞长至40％～50％时，接SVV；
(2)接毒后0h、8h、16h收取细胞，用1×PBS清洗1次；
(3)用4％的多聚甲醛(每皿1mL)，室温避光固定1h；
(4)用1×PBS清洗3次，5min/次(轻加1×PBS，防止细胞被冲起来)；
(5)用0.2％Triton X-100(100mLPBS+20μLTriton100)室温通透1h；
(6)用1×PBS洗涤3次，5min/次；
(7)用5％BSA(1×PBST：50mL1×PBS+50μLTween20，5％BSA：10mL+0.5g BSA)37℃封闭1h；
(8)吸取封闭液，加入用5％BSA稀释的一抗(SVV的兔一抗)，4℃过夜；
(9)用1×PBST清洗三次，10min/次，加入用1×PBST稀释的荧光素标记二抗(免疫荧光兔二抗)(避光)，37℃孵育1h；
(10)1×PBST清洗三次，10min/次，每皿加100μL减封片剂封片(含DAPI)；
(11)使用激光共聚焦仪器观察荧光，并保存图片。
结果如图6所示，在接毒后8h、16h时收取的样品中，BHK-21/MAP3K8细胞的病变程度高于野生型BHK-21细胞的病变程度。也就是说BHK-21/MAP3K8细胞与野生型BHK- 21相比，在接毒后8h、16h均能促进SVV的复制。这是因为BHK-21/MAP3K8细胞在SVV 刺激下过量表达MAP3K8，进而促进了SVV的复制。这表明BHK-21/MAP3K8细胞可以用过量表达MAP3K8进而促进SVV的复制。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 稳定表达MAP3K8蛋白的BHK-21细胞株及其构建和应用
<130> 无
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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Claims (1)

1.稳定表达MAP3K8蛋白的BHK-21细胞株在制备促进SVV复制的制剂中的应用，其特征在于，所述BHK-21细胞株命名为BHK-21/MAP3K8，保藏编号为CCTCC NO:C2018261。
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