CN112391349B - 滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增nk细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增NK细胞的方法。本发明所提供的滋养层细胞株，为整合有外源基因的K562细胞，外源基因包括：用于表达IL‑15的第一基因片段、用于表达自剪切多肽P2A的第二基因片段和用于表达4‑1BBL的基因片段，第一基因片段、第二基因片段和第三基因片段依次设置。将该滋养层细胞株应用于体外诱导扩增NK细胞，可极大地提升NK细胞的增殖倍数、纯度和细胞毒性。

Description

滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增NK细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增NK细胞的方法。
背景技术
NK细胞(自然杀伤细胞)，是机体重要的免疫细胞，其特异性分子标记为CD3-CD16+CD56+，并具有主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)非限制性杀伤的特点。NK细胞是驻留在粘膜系统和淋巴结等机体抵御病原体感染和恶性肿瘤的第一道防线的重要免疫细胞，在感染和肿瘤发生早期起着重要的控制作用。NK细胞可以识别并清除肿瘤细胞，无需预先抗原致敏，其对肿瘤细胞的识别依赖于细胞表面活化性受体和抑制性受体之间的平衡。NK细胞识别肿瘤细胞后，可通过释放穿孔素和颗粒酶、诱导凋亡、诱导肿瘤坏死因子(TNF)家族分子的表达，亦可通过其表面CD16分子介导的抗体依赖性细胞毒性作用(Antibody dependent cell cytotoxicity，ADCC)，迅速破坏肿瘤细胞。
当前绝大多数临床以及临床前研究中所使用的NK细胞来源于人自体外周血单个核细胞(PBMC)，然而，由于NK细胞在PBMC细胞中仅占5％-20％的比例，且NK细胞在体外的扩增能力远远低于T淋巴细胞，这限制了NK细胞在临床的大规模应用。因此，如何从PBMC诱导获得大量的高活性NK细胞成为其是否能成功应用于临床的关键。
目前，体外培养NK细胞的方法主要有以下2种：1)细胞因子组合法，例如采用IL-2、IL-15、IL-18、IL-21等细胞因子诱导NK细胞体外扩增，Torelli GF等利用IL-2、IL-15诱导培养人PBMC细胞，在第14天NK细胞群平均增殖了15.7±4.7倍，存活率为96±0.5％；2)滋养层细胞诱导培养法，例如采用基因修饰的K562细胞诱导NK细胞扩增，Baek HJ等利用构建的K562-mbIL15-41BBL滋养层细胞诱导培养人PBMC细胞，经过21天的体外培养，NK细胞增殖倍数达到980倍。据目前已有的研究显示，采用滋养层细胞诱导培养法在NK细胞扩增倍数和纯度上要优于细胞因子组合的扩增方案，但是，现有的滋养层细胞诱导培养法需要多次转染，操作繁琐，成功率低，仍需进一步改善。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种滋养层细胞株，以应用于体外诱导扩增NK细胞，从而提高NK细胞的扩增倍数和纯度。
本发明的另一目的在于提供上述滋养层细胞株的制备方法，又一目的在于提供一种体外诱导扩增NK细胞的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下具体技术方案：
一种滋养层细胞株，为整合有外源基因的K562细胞，所述外源基因包括：用于表达IL-15的第一基因片段、用于表达自剪切多肽P2A的第二基因片段和用于表达4-1BBL的基因片段，所述第一基因片段、所述第二基因片段和所述第三基因片段依次设置。
本发明提供的滋养层细胞株，为整合有外源基因的K562细胞，该外源基因通过表达自剪切多肽P2A的第二基因片段将表达IL-15的第一基因片段和表达4-1BBL的基因片段连接起来，使得IL-15和4-1BBL两种蛋白能够被同时表达，共同发挥IL-15和4-1BBL的作用；而且，该外源基因在K562细胞内表达时，自剪切多肽P2A进行共转录自剪切，产生分别单独表达在K562细胞膜上的IL-15和4-1BBL两种蛋白，提高了IL-15和4-1BBL的跨膜表达效率。将该滋养层细胞株应用于体外诱导扩增NK细胞，可极大地提升NK细胞的增殖倍数、纯度和细胞毒性。
相应的，一种上述滋养层细胞株的制备方法，包括以下步骤：
提供慢病毒，所述慢病毒的基因组包括：用于表达IL-15的第一基因片段、用于表达自剪切多肽P2A的第二基因片段和用于表达4-1BBL的基因片段，所述第一基因片段、所述第二基因片段和所述第三基因片段依次设置；
将所述慢病毒感染K562细胞，筛选稳定表达的细胞克隆，构建稳转细胞株。
本发明提供的上述滋养层细胞株的制备方法，通过慢病毒感染和筛选的方法制备稳定表达IL-15和4-1BBL两种蛋白的K562细胞，采用表达自剪切多肽P2A的第二基因片段将表达IL-15的第一基因片段连接表达4-1BBL的基因片段并整合到慢病毒的基因组中，提高了IL-15和4-1BBL两种蛋白的跨膜表达效率。与现有技术相比，本发明提供的方法只需采用一种慢病毒感染K562细胞，避免多种慢病毒感染导致的细胞毒性，提升了感染效率，降低了制备成本。
相应的，一种体外诱导扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：
提供滋养层细胞，所述滋养层细胞株包括前述滋养层细胞株或上述制备方法制得的滋养层细胞株；
将所述滋养层细胞进行辐照处理，然后加入PMBC细胞进行混合培养。
本发明提供的体外诱导扩增NK细胞的方法，将上述滋养层细胞株经辐照处理后与PBMC细胞进行混合培养，上述滋养层细胞的表面高丰度表达IL-15和4-1BBL两种蛋白，可刺激PBMC细胞向NK细胞分化，并有效提高NK细胞体外扩增能力，以及提高NK细胞纯度和细胞毒性。
附图说明
图1为本发明优选实施例的一种滋养层细胞株的结构简图；
图2为实施例1中设计的外源基因的序列结构示意图；
图3为实施例1中构建的慢病毒表达载体pLVX-IL15-41BBL的质粒图谱；
图4为实施例1中慢病毒表达载体pLVX-IL15-41BBL的克隆PCR产物的电泳图；
图5为实施例1中经梯度稀释的ZsGreen1慢病毒感染293T细胞48小时后的流式细胞检测结果；
图6为实施例1中IL15-41BBL慢病毒感染K562细胞过程中各阶段的流式细胞检测结果；
图7为测试例1中NC-NK组和KIB-NK组诱导培养16天后的NK细胞的显微拍摄图；
图8为测试例1中NC-NK组和KIB-NK组诱导培养16天的NK细胞的生长曲线图(**p<0.01)；
图9为测试例1中NC-NK组和KIB-NK组诱导培养第0天及第16天的NK细胞的细胞表型流式检测散点图；
图10为测试例1中NC-NK组和KIB-NK组中CD3-CD56+NK细胞的增殖倍数检测结果(**p<0.01)；
图11为测试例2中NC-NK组、KIB-NK组诱导培养16天后的NK细胞内IFN-γ、TNF-α细胞因子表达的流式散点检测图；
图12为测试例2中NC-NK组、KIB-NK组诱导培养16天后的NK细胞内IFN-γ、TNF-α细胞因子表达阳性比例的统计图(**p<0.01)；
图13为测试例3中NC-NK组、KIB-NK组诱导培养16天后的上清液中IFN-γ、TNF-α细胞因子的流式散点检测图；
图14为测试例3中NC-NK组、KIB-NK组诱导培养16天后的上清液中IFN-γ、TNF-α细胞因子浓度的统计图(**p<0.01)；
图15为测试例4中NC-NK组、KIB-NK组诱导培养16天后的NK细胞对肿瘤细胞K562和H520细胞的杀伤力比例统计图(**p<0.01)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种滋养层细胞株，为整合有外源基因的K562细胞，所述外源基因包括：用于表达IL-15的第一基因片段、用于表达自剪切多肽P2A的第二基因片段和用于表达4-1BBL的基因片段，所述第一基因片段、所述第二基因片段和所述第三基因片段依次设置。
本发明实施例提供的滋养层细胞株，为整合有外源基因的K562细胞，该外源基因通过表达自剪切多肽P2A的第二基因片段将表达IL-15的第一基因片段和表达4-1BBL的基因片段连接起来，使得IL-15和4-1BBL两种蛋白能够被同时表达，共同发挥IL-15和4-1BBL的作用；而且，该外源基因在K562细胞内表达时，自剪切多肽P2A进行共转录自剪切，产生分别单独表达在K562细胞膜上的IL-15和4-1BBL两种蛋白，提高了IL-15和4-1BBL的跨膜表达效率。将该滋养层细胞株应用于体外诱导扩增NK细胞，可极大地提升NK细胞的增殖倍数、纯度和细胞毒性。
具体的，K562细胞为一种人慢性髓系白血病细胞，在本发明实施例中，所述滋养层细胞株为经过基因修饰的K562细胞，其基因组中整合有外源基因，该外源基因包括：用于表达IL-15的第一基因片段、用于表达自剪切多肽P2A的第二基因片段和用于表达4-1BBL的基因片段，所述第一基因片段、所述第二基因片段和所述第三基因片段依次设置。一方面，通过表达自剪切多肽P2A的第二基因片段将表达IL-15的第一基因片段和表达4-1BBL的基因片段连接起来，使得IL-15和4-1BBL两种蛋白能够被同时表达。其中，IL-15(白介素15)是维持NK细胞活性和功能的重要因子，可促进NK细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)，促进ADCC作用，大大提高NK细胞联合单抗治疗肿瘤的疗效。4-1BBL是Ⅱ型跨膜糖蛋白，属于TNF超家族。4-1BB/4-1BBL作为一对重要的协同刺激信号分子，可促进NK细胞增殖、激活和分泌INF-γ，同时还可抑制NK细胞凋亡，提高NK细胞毒性，在NK细胞介导的免疫应答中起十分重要的调控作用。在K562细胞表面同时表达IL-15和4-1BBL两种蛋白，有利于发挥IL-15和4-1BBL的作用，促进NK细胞增殖及提升其细胞纯度和细胞毒性。
自剪切多肽P2A是由21个氨基酸构成，来源于I型猪肠病毒，其序列比内核糖体进入位点(Internal ribosome entry site，IRES)序列小很多。在本发明实施例中，所述外源基因在K562细胞内表达时，自剪切多肽P2A进行共转录自剪切，产生独立的两个目的蛋白IL-15和4-1BBL，增加了共表达蛋白的产量，同时实现同一个启动子控制下的两蛋白共翻译，避免了多基因共表达时下游基因表达量低、蛋白活性低的缺陷，提高了IL-15和4-1BBL的跨膜表达效率。将该滋养层细胞株应用于体外诱导扩增NK细胞，可极大地提升NK细胞的增殖倍数、纯度和细胞毒性。
作为优选的实施方式，所述外源基因包括如SEQ ID No.1所示的基因片段。如图1所示，该基因片段在K562细胞内表达为重组蛋白：CD8α信号肽-IL15-CD8α跨膜区-P2A-41BBL，IL15和4-1BBL两种蛋白在K562细胞内经过P2A自剪切后，分别单独表达在K562细胞膜上，从而获得稳定表达IL15蛋白和4-1BBL蛋白的滋养层细胞株。
以下为本发明实施例的滋养层细胞株的一种优选的制备方法。
相应的，一种上述滋养层细胞株的制备方法，包括以下步骤：
S01、提供慢病毒，所述慢病毒的基因组包括：用于表达IL-15的第一基因片段、用于表达自剪切多肽P2A的第二基因片段和用于表达4-1BBL的基因片段，所述第一基因片段、所述第二基因片段和所述第三基因片段依次设置；
S02、将所述慢病毒感染K562细胞，筛选稳定表达的细胞克隆，构建稳转细胞株。
本发明实施例提供的上述滋养层细胞株的制备方法，通过慢病毒感染和筛选的方法制备稳定表达IL-15和4-1BBL两种蛋白的K562细胞，采用表达自剪切多肽P2A的第二基因片段将表达IL-15的第一基因片段连接表达4-1BBL的基因片段并整合到慢病毒的基因组中，提高了IL-15和4-1BBL两种蛋白的跨膜表达效率。与现有技术相比，本发明提供的方法只需采用一种慢病毒感染K562细胞，避免多种慢病毒感染导致的细胞毒性，提升了感染效率，降低了制备成本。
具体的，在步骤S01中，所述慢病毒作为基因转移载体，以在K562细胞中整合入上文所述的外源基因，从而提高K562细胞中IL-15和4-1BBL两种蛋白的跨膜表达效率。优选的，所述慢病毒的基因组包括如SEQ ID No.1所示的基因片段。进一步的，所述慢病毒的制备包括：构建包括如SEQ ID No.1所示的基因片段的慢病毒表达载体，然后与包装质粒一起转染包装获得慢病毒，所述构建慢病毒表达载体和转染包装的步骤可参考本领域常规操作。在一些实施例中，所述包装质粒采用psPAX2和pMD2.G，或采用pCMV8.9和PMD.G。
作为一种实施方式，所述慢病毒的制备包括以下步骤：
S011、提供如SEQ ID No.1所示的基因片段，将所述基因片段插入pLVX-IRES-Puro质粒的酶切位点上，构建慢病毒表达载体pLVX-IL15-41BBL质粒；
S012、提供包装质粒psPAX2和pMD2.G，将psPAX2、pMD2.G和所述慢病毒表达载体pLVX-IL15-41BBL质粒转染至293T细胞中，转染48h以上。
在步骤S02中，将所述慢病毒感染K562细胞，所述慢病毒进入细胞后，其遗传物质反转录出DNA，并再整合到K562细胞的基因组中。与现有技术相比，本发明实施例仅需采用一种基因组中包括上述外源基因的慢病毒来感染K562细胞，避免了多种慢病毒感染导致的细胞毒性，提升了感染效率，降低了制备成本。
作为优选，将所述慢病毒感染K562细胞的步骤中，以感染复数为10-50，将所述慢病毒与所述K562细胞进行混合培养。如此，保证K562细胞活性的基础上，尽可能提高慢病毒感染效率。进一步的，将所述慢病毒与所述K562细胞混合后，在37℃、5％CO2培养箱培养6小时以上。在一些实施例中，在37℃、5％CO2培养箱培养6h后离心换液，换成K562细胞完全培养基(RPMI1640+10％FBS)，感染24h后重复感染一次，至感染72h。更进一步的，培养基中添加有5-10μg/mL聚凝胺(Polybrene)，Polybrene是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率。
筛选稳定表达的细胞克隆，以获得能够稳定表达IL-15和41BBL的稳转细胞株。作为优选，筛选稳定表达的细胞克隆的步骤中，加入嘌呤霉素进行抗性筛选。进一步的，所述嘌呤霉素的工作浓度为5-10μg/mL，以高效杀死未稳定表达目的基因的K562细胞，从而筛选出能够稳定表达IL-15和41BBL的稳转细胞株。在一些实施例中，加入终浓度为5μg/mL的嘌呤霉素进行筛选；24h后换成不含嘌呤霉素的K562细胞完全培养基，48h后加入10μg/mL嘌呤霉素，继续筛选培养；在另一些实施例中，采用所述慢病毒和嘌呤霉素进行交替感染和筛选，使得稳定表达IL-15和41BBL的K562细胞的百分比在95％以上
相应的，一种体外诱导扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：
S03、提供滋养层细胞，所述滋养层细胞株包括前述滋养层细胞株或上述制备方法制得的滋养层细胞株；
S04、将所述滋养层细胞进行辐照处理，然后加入PMBC细胞进行混合培养。
本发明实施例提供的体外诱导扩增NK细胞的方法，将上述滋养层细胞株经辐照处理后与PBMC细胞进行混合培养，所述滋养层细胞的表面高丰度表达IL-15和4-1BBL两种蛋白，可刺激PBMC细胞向NK细胞分化，并有效提高NK细胞体外扩增能力，以及提高NK细胞纯度和细胞毒性。
具体的，在步骤S03中，所述滋养层细胞为上述技术方案中提供的滋养层细胞，为节省篇幅，此处不再一一赘述。
在步骤S04中，将所述滋养层细胞进行辐照处理，使得该整合有外源基因的K562细胞失去分裂能力。作为一种优选的实施方式，将所述滋养层细胞进行辐照处理的步骤中，将所述滋养层细胞株进行γ射线辐照处理。经过γ射线辐照处理后，该滋养层细胞株在体外与PBMC细胞共培养可获得高增殖倍数、高纯度和高细胞毒性的人NK细胞。在一些测试例中，经过辐照的滋养层细胞株可在16天内诱导PBMC转化的NK细胞纯度达到94.79％，增值倍数达到4480倍左右，远高于野生型K562细胞诱导培养组。
作为优选，所述PBMC细胞与所述滋养层细胞株的细胞数量比为(2-4):(0.2-0.8)，以高效诱导NK细胞分化成熟。在一些实施方式中，所述PBMC细胞的细胞数量为2×106-4×106，所述滋养层细胞株的细胞数量为0.2×106-0.8×106；在另一些实施例中，PBMC细胞与所述滋养层细胞株的细胞数量比为6:1。
作为优选，加入PMBC细胞进行混合培养的步骤中，培养时间为16天以上，确保诱导的NK细胞充分活化及增殖。在一些实施例中，加入PMBC细胞进行混合培养的步骤中，将经过辐照处理的滋养层细胞与PMBC在37℃、5％CO2的环境中进行混合培养。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例一种滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增NK细胞的方法的进步性能显著地体现，以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。
以下实施例中，人慢性髓系白血病细胞K562、人胚胎肾细胞293T购自北京北纳生物；RPMI 1640培养基、高糖DMEM培养基、胎牛血清、谷氨酰胺购自美国Thermo公司；EcoR I、Xho I限制性内切酶购自美国New England Biolabs公司；pLVX-IRES-Puro、pLVX-IRES-ZsGreen1质粒购自美国Clontech公司；pUC57-IL15-41BBL质粒及相关引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；psPAX2、pMD.2G质粒由哈尔滨工业大学胡颖教授赠送；DH5α感受态细胞购自上海生工生物公司；D2000 DNA Marker、无内毒素质粒中量提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司；NK细胞无血清培养基、DPBS由深圳默赛尔生物公司提供；人白介素2(IL-2)购自北京同立海源生物公司；LEGENDplexTMHuman Th Cytokine Panel(13-plex)、Intracellular Staining Permeabilization WashBuffer(10×)、PE-anti-human 4-1BBL、CD3-PerCP/Cy5.5、CD56-FITC、CD3-FITC、CD56-PE、IFN-γ-PE、TNF-α-APC流式抗体均购自美国Biolegend公司；嘌呤霉素购自上海翊圣生物公司；乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒购自中国碧云天生物公司。
实施例1
本实施例制备了一种滋养层细胞株，具体包括以下步骤：
1、构建慢病毒表达载体pLVX-IL15-41BBL
1)从NCBI的基因库中搜索目的基因IL-15和41BBL的cDNA序列，设计外源基因“CD8α信号肽-IL15-CD8α跨膜区-P2A-41BBL”全序列，其编码序列如SEQ ID No.1所示，其序列结构示意图如图2所示，将该序列在合适的位点插入pUC57质粒中，将获得的pUC57-IL15-41BBL质粒全序列送交南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
2)以pUC57-IL15-41BBL质粒为模板，利用IL15-41BBL扩增引物(Sense：CGGAATTCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCC，Antisense：GCTCGAGCGGTTATTCCGACCTCG)扩增“CD8α信号肽-IL15-CD8α跨膜区-P2A-41BBL”基因片段(1474bp)。然后，将pLVX-IRES-Puro质粒采用EcoRI、Xho I进行酶切，在酶切位点插入“CD8α信号肽-IL15-CD8α跨膜区-P2A-41BBL”基因片段，经过DNA连接，即合成慢病毒表达载体pLVX-IL15-41BBL，图3为慢病毒表达载体pLVX-IL15-41BBL的质粒图谱。
将慢病毒表达载体pLVX-IL15-41BBL转染DH5α感受态细胞，进行克隆PCR(引物CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG，IRES-R：CCTCACATTGCCAAAAGACG)，获得克隆PCR产物。将该克隆PCR产物进行电泳初步鉴定，如图4所示，该克隆PCR产物的长度为1757bp。之后，选取成功转染的细胞进行大量扩增，提取慢病毒表达载体pLVX-IL15-41BBL进行最终测序鉴定。
3)制备IL15-41BBL慢病毒：将慢病毒表达载体pLVX-IL15-41BBL与第二代慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G用氯化钙转染法共同转染至293T细胞中，转染6～12h后更换新鲜的293T细胞完全培养基(高糖DMEM+10％FBS+1％谷氨酰胺)。转染48h和72h后分别收获一次病毒，1000rpm离心5min后，上清液用0.45μm滤器过滤后，转移至超高速离心管中，4℃，22000转/min离心2h，弃去上清后用适量DPBS重悬慢病毒沉淀，分装后置于-80℃长期保存，即为收获的IL15-41BBL慢病毒。
制备ZsGreen1慢病毒：将pLVX-IRES-ZsGreen1质粒与第二代慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G用氯化钙转染法共同转染至293T细胞中，按照上述步骤制备获得ZsGreen1慢病毒。
4)ZsGreen1慢病毒的滴度检测：第1天，将293T细胞消化计数后稀释至2×105/mL，加入12孔板，1mL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；第2天，将上述制备的ZsGreen1慢病毒用293T细胞完全培养基进行10倍梯度稀释，弃除12孔板中的旧培养基，用1毫升未稀释、1:10、1:102、1:103、1:104、1:105稀释的ZsGreen1慢病毒(含8μg/mL Polybrene)感染293T细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜后，更换新鲜的293T细胞完全培养基。慢病毒感染48小时后，消化293T细胞，DPBS重悬后，用流式细胞仪检测成功转染有ZsGreen1慢病毒的293T细胞(标记为ZsGreen1+293T细胞)的比例，各组的检测结果如图5所示。然后，根据如下计算公式计算ZsGreen1+293T细胞百分比在10％-30％之间的滴度：
滴度(TU/mL)＝(接种细胞数×ZsGreen1+293T细胞百分比×1000)/病毒原液体积(μL)。
根据图5的流式检测结果，选取稀释103倍的慢病毒感染组作为病毒滴度计算组。根据公式，计算本实验中制备的ZsGreen1慢病毒的滴度＝(2×105×14.40％×1000)/1＝2.88×107TU/mL。
5)制备滋养层细胞株K562-IL15-41BBL：取1×106个K562细胞，参照步骤4)测得的ZsGreen1慢病毒的滴度检测结果，以感染复数(Multiplicity of infection，MOI)＝30加入IL15-41BBL慢病毒，加入8μg/mL Polybrene，然后置于37℃、5％CO2培养箱中培养，6h后离心换液，换成K562细胞完全培养基(RPMI 1640+10％FBS)；感染24h后，重复感染一次；72h后，加入5μg/mL嘌呤霉素进行筛选；之后，在24h后换成不含嘌呤霉素的K562细胞完全培养基，48h后加入10μg/mL嘌呤霉素，继续筛选培养，待观察到K562细胞状态生长良好，有克隆团后，取适量细胞悬液。以未感染慢病毒的K562细胞作为阴性对照，上流式检测成功转染有IL15-41BBL慢病毒的K562细胞(IL15-41BBL+K562细胞)的比例，如图6所示，第一轮病毒感染及嘌呤霉素筛选后IL15-41BBL+K562细胞的百分比约为46.60％。
之后，按照上述步骤继续加入IL15-41BBL慢病毒进行第二轮感染，加入嘌呤霉素进行第二轮筛选，以未感染慢病毒的K562细胞作为阴性对照，上流式检测成功转染有IL15-41BBL慢病毒的K562细胞(IL15-41BBL+K562细胞)的比例，如图6所示，第二轮病毒感染及嘌呤霉素筛选后IL15-41BBL+K562细胞的百分比约为96.50％，IL15-41BBL+K562细胞的百分比在95％以上，收集稳转细胞株K562-IL15-41BBL。
实施例2
本实施例提供了一种体外诱导扩增NK细胞的方法，采用稳转细胞株K562-IL15-41BBL诱导培养NK细胞，标记为KIB-NK组，具体包括以下步骤：
用密度梯度离心法从健康志愿者来源的肝素钠抗凝外周血中分离PBMC细胞，将3×106个PBMC细胞和0.5×106个经过辐照(100Gy)的稳转细胞株K562-IL15-41BBL重悬在含10U/mL IL-2的NK细胞无血清培养基中，接种至24孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，培养第0天时即采用流式细胞仪检测PBMC细胞中CD3-CD56+NK细胞比例，后续根据NK细胞生长状况用新鲜的NK细胞培养基进行补液或半量换液。
对比例1
本对比例与实施例2的区别在于：采用野生型K562细胞诱导扩增NK细胞，标记为NC-NK组，作为阴性对照；
其余地方与实施例2基本相同，此处不再一一赘述。
测试例1
分别收集实施例2和对比例1中诱导培养16天后的NK细胞(NC-NK组、KIB-NK组)，采用血球计数板进行细胞计数，以及按照抗体使用说明书用流式抗体CD3-FITC、CD56-PE进行染色，上流式细胞仪检测CD3-CD56+NK细胞比例。
图7为NC-NK组和KIB-NK组诱导培养16天后的NK细胞的显微拍摄图，总细胞数量计数结果显示，NC-NK组的总细胞数为(480.26±34.78)×106个，KIB-NK组的总细胞数为(948.95±10.41)×106个，KIB-NK组相对于NC-NK组具有显著性差异(p<0.01)。
图8为NC-NK组和KIB-NK组诱导培养16天的NK细胞的生长曲线图，KIB-NK组相对于NC-NK组具有显著性差异(**p<0.01)。
图9为NC-NK组和KIB-NK组诱导培养第0天及第16天的NK细胞的细胞表型流式检测散点图，显示第0天时的CD3-CD56+NK细胞比例为8.70％，NC-NK组诱导培养第16天时的CD3-CD56+NK细胞比例为45.04％，和KIB-NK组诱导培养第16天时的CD3-CD56+NK细胞比例为94.79％。
根据总细胞数量和细胞表型检测结果，计算NC-NK组和KIB-NK组中CD3-CD56+NK细胞的增殖倍数，计算结果如图10所示，诱导培养16天后，NC-NK组的增殖倍数为1079.12±60.01倍，KIB-NK组的增殖倍数为4480.43±37.80倍，两组数据差异显著性(**p<0.01)。
测试例2
分别收集1×106个实施例2和对比例1中诱导培养16天后的NK细胞(NC-NK组、KIB-NK组)，按照抗体使用说明书用流式抗体CD3-PerCP/Cy5.5、CD56-FITC进行染色后，用4％多聚甲醛室温固定，DPBS洗涤一次后，用Intracellular Staining Permeabilization WashBuffer洗涤并重悬，加入IFN-γ-PE、TNF-α-APC流式抗体，室温避光孵育15-20min后，用Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer及DPBS各洗涤一次后，DPBS重悬细胞，上流式细胞仪检测细胞因子IFN-γ、TNF-α表达阳性的NK细胞比例。
图11为NC-NK组、KIB-NK组诱导培养16天后的NK细胞内IFN-γ、TNF-α细胞因子表达的流式散点检测图，图12为NC-NK组、KIB-NK组诱导培养16天后的NK细胞内IFN-γ、TNF-α细胞因子表达阳性比例的统计图(**p<0.01)，如图所示，IFN-γ+NC-NK细胞比例为16.28±2.86％，TNF-α+NC-NK细胞比例为14.53±1.15％；IFN-γ+KIB-NK细胞比例为63.07±3.37％，TNF-α+KIB-NK细胞比例为54.85±2.04％，KIB-NK组两种细胞因子的表达均显著高于NC-NK组，差异有显著性(p<0.01)。
测试例3
分别收集实施例2和对比例1中诱导培养16天后的NK细胞(NC-NK组、KIB-NK组)的培养上清液，按照LEGENDplexTM Human Th Cytokine Panel(13-plex)试剂盒使用说明处理上清样本，流式细胞仪上样检测上清液中的IFN-γ和TNF-α两种细胞因子。利用LEGENDplexV8.0软件根据已知浓度的标准品制作标准曲线，从而推算出NC-NK细胞和KIB-NK细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α细胞因子的浓度。
图13为NC-NK组、KIB-NK组诱导培养16天后的上清液中IFN-γ、TNF-α细胞因子的流式散点检测图，图14为NC-NK组、KIB-NK组诱导培养16天后的上清液中IFN-γ、TNF-α细胞因子浓度的统计图(**p<0.01)，NC-NK组培养上清中IFN-γ浓度为44.99±4.74pg/mL，TNF-α浓度为11.09±2.45pg/mL；KIB-NK组培养上清中IFN-γ浓度为111.39±6.95pg/mL，TNF-α浓度为32.76±3.23pg/mL。显然，KIB-NK细胞培养上清中两种细胞因子的含量均显著高于NC-NK细胞培养上清，差异有显著性(p<0.01)。
测试例4
采用LDH法检测诱导培养得到的NK细胞的细胞毒性，以实施例2和对比例1中诱导培养16天后的NK细胞(NC-NK组、KIB-NK组)作为效应细胞，选取K562细胞系和人肺癌细胞系H520作为杀伤靶细胞。按照效应细胞：靶细胞＝2.5：1的效靶比设置共培养反应体系，同时设置无细胞的培养液孔(扣除背景)、只有靶细胞的样品对照孔以及只有靶细胞用于后续裂解的孔(样品最大酶活性孔)。37℃、5％CO2培养箱中共培养3小时后，在样品最大酶活性孔加入总体积10％的LDH释放试剂。共培养4小时后，将细胞培养板用多孔板离心机离心，分别取各孔的上清液120μL，加入到一新的96孔板中，随即进行样品测定；各孔分别加入60μLLDH检测工作液，充分混匀，室温避光孵育30min，于490nm处测定吸光度。细胞毒性或死亡率计算公式如下：细胞毒性或死亡率(％)＝(实验组样品吸光度－样品对照孔吸光度)/(样品最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100％。
图15为NC-NK组、KIB-NK组诱导培养16天后的NK细胞对肿瘤细胞K562和H520细胞的杀伤力比例统计图，NC-NK组对K562细胞的杀伤比例为48.53±6.66％，对H520细胞的杀伤比例为35.85±3.99％；KIB-NK组对K562细胞的杀伤比例为78.52±7.36％，对H520细胞的杀伤比例为65.03±3.27％。显然，KIB-NK组对两种肿瘤细胞的杀伤比例均显著高于NC-NK组，差异有显著性(**p<0.01)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 刘韬
<120> 滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增NK细胞的方法
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccccatggg gctaccggaa tggtcactgg cggaacgagg acggcgaccg gaacgacgag 60
gtgcggcggt ccggcttgac ccacttacat tattcactaa acttttttta acttctagaa 120
taagttagat acgtataact acgatgaaat atatgccttt cactacaagt ggggtcaacg 180
tttcattgtc gttacttcac gaaagagaac ctcaatgttc aataaagtga actcaggcct 240
ctacgttcat aagtactatg tcatctttta gactagtagg atcgtttgtt gtcaaacaga 300
agattaccct tacattgtct tagacctacg tttcttacac tccttgacct ccttttttta 360
taatttctta aaaacgtctc aaaacatgta taacaggttt acaagtagtt gtgaagacgc 420
ttcgggtggt gctgcggtcg cggcgctggt ggttgtggcc gcgggtggta gcgcagcgtc 480
ggggacaggg acgcgggtct ccgcacggcc ggtcgccgcc ccccgcgtca cgtgtgctcc 540
cccgacctga agcggacact atagatgtag acccgcggga accggccctg aacaccccag 600
gaagaggaca gtgaccaata gtgggaaatg cctaggccac gatgattgaa gtcggacgac 660
ttcgtccgac ctctgcacct cctcttggga cctggatacc ttatgcggag actgcgaagt 720
gacctggggc ttcggggcac cggagggcgc ggggcgcgag cgcggacggc gcatgacgga 780
acccgggacc agcgccccga cgacgacgac gacgacgagc gacggcggac gcggcagaag 840
gagcggacgg ggacccggca caggccccga gcgcggagcg ggccgaggcg ccggtcgggc 900
tctgaggcgc tcccagggct cgaaagcggg ctgctagggc ggccggagaa cctggacgcc 960
gtcccgtaca aacgcgtcga ccaccgggtt ttacaagacg actagctacc cggggactcg 1020
accatgtcac tgggtccgga ccgtccgcac agggactgcc ccccggactc gatgtttctc 1080
ctgtgcttcc tcgaccacca ccggttccga cctcagatga tacagaagaa agttgatctc 1140
gacgccgcgc accaccggcc gctcccgagt ccgaggcaaa gtgaacgcga cgtggacgtc 1200
ggtgacgcga gacgacgacc ccggcggcgg gaccgaaact ggcacctgga cggtgggcgg 1260
aggaggctcc gagccttgag ccggaagcca aaggtcccgg cgaacgacgt ggactcacgg 1320
ccggtcgcgg acccgcaggt agaagtgtga ctccggtccc gtgcggtacg gaccgtcgaa 1380
tgggtcccgc ggtgtcagaa ccctgagaag gcccactggg ggctttaggg tcggcctgag 1440
ggaagtggct ccagccttat tggcgagctc gcc 1473

Claims (1)

1.一种利用滋养层细胞体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供滋养层细胞，所述滋养层细胞的制备方法包括以下步骤：提供慢病毒，所述慢病毒的基因组包括：用于表达IL-15的第一基因片段、用于表达自剪切多肽P2A的第二基因片段和用于表达4-1BBL的第三基因片段，所述第一基因片段、所述第二基因片段和所述第三基因片段依次设置；将所述慢病毒感染K562细胞，筛选稳定表达的细胞克隆，构建稳转细胞株，获得滋养层细胞K562-IL15-41BBL；其中，所述慢病毒的基因组包括如SEQ ID No.1所示的基因片段，所述基因片段在K562细胞内表达为重组蛋白：CD8α信号肽-IL15-CD8α跨膜区-P2A-41BBL；所述慢病毒感染K562细胞的步骤中，以感染复数为30，将所述慢病毒与所述K562细胞进行混合培养；所述筛选稳定表达的细胞克隆的步骤中，加入嘌呤霉素进行抗性筛选；
将所述滋养层细胞K562-IL15-41BBL进行100Gy辐照处理，然后加入PMBC细胞进行混合培养，培养时间为16天以上；其中，所述PBMC细胞与所述滋养层细胞株的细胞数量比为3:0.5。
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