CN116179606B - 转录因子tcf1在抵抗car-t细胞耗竭和终末分化中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了转录因子TCF1在抵抗CAR‑T细胞耗竭和终末分化中的应用，涉及基因工程领域。本发明通过过表达转录因子TCF1提高了CAR‑T细胞在小鼠体内的数量，减少了CAR‑T细胞在小鼠体内的耗竭和终末分化。本发明也使杀伤性CD8+CAR‑T细胞比例增加，即过表达TCF1提高了CAR‑T细胞在小鼠体内的持久性。本发明中过表达转录因子TCF1还能够增加转导后细胞的增殖速率、存活时间、杀伤效率、免疫记忆等特性。可见过表达转录因子TCF1可抵抗CAR‑T细胞耗竭和终末分化。

Description

转录因子TCF1在抵抗CAR-T细胞耗竭和终末分化中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及转录因子TCF1在抵抗CAR-T细胞耗竭和终末分化中的应用。
背景技术
1.1嵌合抗原受体T细胞疗法的成就和局限
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor-modified T cell，CAR-T)疗法是利用基因工程技术对T细胞进行基因改造后，使其表达能够特异性识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体并对肿瘤细胞发动免疫攻击的革命性细胞免疫治疗方法1。嵌合抗原受体由胞外可以识别特定肿瘤抗原的单链抗体可变结构域，跨膜结构域和胞内信号传导结构域构成，胞内信号传导结构域一般由CD3ζ和共刺激分子(包括CD28、ICOS、4-1BB、OX4O和CD27等)的信号传导结构域构成。目前应用最多的CAR-T胞内信号传导结构域通常由CD28或4-1BB共刺激结构域与CD3ζ串联而成。
靶向CD19的CAR-T(CD19 CAR-T)在治疗B细胞来源的难治/复发急性淋巴细胞白血病(refractory/relapsed acute lymphocyte leukemia，R/R ALL)中取得了举世瞩目的疗效，目前各单位报道的完全缓解率在60％到93％之间。
然而，随着越来越多的临床试验数据得以披露，CAR-T疗法的局限逐渐凸显。最近研究表明有17％到61％的患者在CAR-T治疗取得完全缓解后会出现白血病复发。根据复发时白血病细胞表达CD19的情况，复发分为CD19阳性和阴性复发，其中以CD19阳性复发居多，约有46.1％的患者发生CD19阳性复发，10％-20％的患者发生CD19阴性复发。占复发多数的CD19阳性复发主要与CAR-T体内持久性不足有关。另外，在实体瘤中，也有研究报道CAR-T体内持久性与病人无进展生存期(progression-free survival，PFS)的长度呈正相关。因此，探索延长CAR-T细胞体内持久性的新策略对于改善患者的预后具有重要意义。
1.2限制CAR-T体内持久性的因素
限制CAR-T细胞体内持久性的因素可以划分为CAR-T细胞外部因素和CAR-T细胞内部因素。其中外部因素主要指抑制性肿瘤微环境，而内部因素主要指由于CAR-T细胞耗竭和终末分化引起的CAR-T细胞功能失调。T细胞耗竭是在慢性感染和肿瘤中由于长期慢性抗原刺激引起的T细胞功能失调，表现为T细胞效应功能(如细胞毒功能)的减退，T细胞膜表面持续表达抑制性免疫检查点分子(如PD-1和LAG-3)，以及T细胞增殖变缓和凋亡增多。根据分化阶段的不同，可将T细胞划分为TN(初始T细胞)、TSCM(干细胞样中央记忆T细胞)、TCM(中央记忆T细胞)、TEM(效应记忆T细胞)和TEFF(效应T细胞)。已有研究表明CAR-T中具有自我更新能力和较长体内持久性的TN、TSCM和TCM的比例越高，CAR-T的体内抗肿瘤效果越好。
1.3 T细胞的分化和耗竭受多种转录因子的调控
T细胞的分化和耗竭受多种转录因子调控。根据转录因子对T细胞分化和耗竭命运的调控，可将转录因子划分为促T细胞记忆和促T细胞耗竭两大类。其中促T细胞记忆的转录因子包括BACH2，C-Myb，TCF1等，而促T细胞耗竭的转录因子包括TOX、TOX2、BATF22和NR4A等。已有研究团队通过过表达或敲除转录因子获得了体内持久性更好的CAR-T，如在CAR-T中过表达c-Jun可抵抗CAR-T的耗竭，敲除TOX和TOX2可CAR-T对黑色素瘤的疗效。
1.4转录因子TCF1对T细胞干性维持与记忆T细胞形成起着重要作用
由Tcf7编码的T细胞因子-1(TCF1)作为一个先导转录因子，对T细胞的发育分化、干性的维持与记忆T细胞的形成起着重要的作用。对于CD4+T细胞，TCF1可以通过诱导转录因子GATA3和IL-4的表达，同时抑制IFN-γ的产生来促进CD4+T细胞往Th2细胞分化。在慢性病毒感染期间，TCF1高表达的CD8+ T细胞表现出干细胞样表型，具有较好的增殖能力。TCF1还可维持耗竭CD8+ T细胞的功能，通过促进一系列与效应功能相关的转录调节因子(包括Foxo1，Zeb2，Id3和Eomes)的表达，促进耗竭CD8+ T细胞的增殖，存活和细胞因子的产生。此外，TCF1还参与了T细胞衰老的调控，在衰老T细胞中TCF1表达下调，这种表达下调可能会导致衰老个体的初始T细胞失去干性。
但是转录因子TCF1在抵抗CAR-T细胞耗竭和终末分化中的应用还未见报道。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明证实了过表达转录因子TCF1的CAR-T细胞在小鼠体内持久性更好。申请人发现过表达转录因子TCF1提高了CD19.28z CAR-T细胞在小鼠体内的数量，减少了CD19.28z CAR-T细胞在小鼠体内的耗竭和终末分化，且使杀伤性CD8+CAR-T细胞比例增加，即过表达TCF1提高了CD19.28z CAR-T细胞在小鼠体内的持久性。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了转录因子TCF1在抵抗CAR-T细胞耗竭和终末分化中的应用。
本发明还提供了一种抵抗CAR-T细胞耗竭和终末分化的方法，包括以下步骤：
(1)构建表达转录因子TCF1的表达载体；
(2)病毒包装：将步骤(1)中构建的表达载体转导到工程细胞中包装获得病毒；
(3)使用步骤(2)中获得的病毒感染T细胞，得到能够抵抗耗竭和终末分化的CAR-T细胞。
优选的，所述表达载体为慢病毒表达载体。更为优选的，所述慢病毒表达载体为Lenti-EF1α。
本发明还提供了一种质粒，所述质粒包括用于质粒复制和扩增的慢病毒骨架质粒、转录因子TCF1、CAR嵌合抗原受体结构域：
所述CAR嵌合抗原受体结构域包括：信号肽、CD19抗体重链可变区和轻链可变区序列以及CD19抗体内铰链、CD8 Hinge铰链、CD8 Transmembrane跨膜区、嵌合抗原受体共刺激结构域为CD28共刺激结构域和CD3共刺激结构域。
优选的，所述CD3嵌合抗原受体共刺激结构域为CD3ζ嵌合抗原受体共刺激结构域。
所述慢病毒骨架质粒包括：用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列；用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40 Ori序列；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；红色荧光蛋白Mcherry；用于增强转基因的表达效率的WPRE乙肝病毒转录后调控元件。所述质粒的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了所述的质粒在构建CAR-T细胞中的应用。
本发明所采用的靶向CD19的CAR-T技术，通过对嵌合抗原受体(CAR)结构的设计，使得嵌合抗原受体能够识别CD19抗原阳性的细胞，同时激活CAR-T细胞的增殖以及杀伤功能，使得CAR-T能够以MHC非依赖的方式特异杀伤靶细胞，深层清除患者体内的肿瘤细胞，达到病情缓解乃至痊愈的目的。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明通过过表达转录因子TCF1提高了CAR-T细胞在小鼠体内的数量，减少了CAR-T细胞在小鼠体内的耗竭和终末分化。本发明也使杀伤性CD8+CAR-T细胞比例增加，即过表达TCF1提高了CAR-T细胞在小鼠体内的持久性。
本发明中过表达转录因子TCF1还能够增加转导后细胞的增殖速率、存活时间、杀伤效率、免疫记忆等特性。可见过表达转录因子TCF1可抵抗CAR-T细胞耗竭和终末分化。
附图说明
图1为CD19.28z CAR片段的示意图。
图2为CD19.28z-TCF1 CAR片段示意图。
图3为携带mcherry的CAR慢病毒载体结构示意图。
图4为携带mcherry的过表达TCF1的CAR慢病毒载体结构示意图。
图5为慢病毒成功包装后感染293T细胞进行滴度测定结果图。
图6为流式细胞仪检测CAR-T细胞比例结果图。
图7为建立GFP+luciferase+Nalm-6细胞株图。
图8为不同效靶比的CAR-T细胞杀伤率图。
图9为过表达TCF1对CD19.28z CAR-T扩增的影响图。
图10为过表达TCF1对体外培养的CD19.28z CAR-T细胞分化的影响图。D9-13天细胞分化状态流式检测结果的柱状统计图。检测结果由8次独立重复的实验统计而来，每次检测样本由不同的健康供者提供。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图11为过表达TCF1对体外培养的CD19.28z CAR-T耗竭和活化标记的影响。D9-13天活化和耗竭标记流式检测结果的柱状统计图。所有标记的检测重复次数均≥6，每次检测样本由不同的健康供者提供。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图12为过表达TCF1对体外培养的CD19.28z CAR-T细胞凋亡的影响。检测结果由4次独立重复的实验统计而来，每次检测样本由不同的健康供者提供。*P＜0.05，***P＜0.001。
图13为过表达TCF1对CD19.28z CAR-T体外杀伤功能的影响。检测结果由3次独立重复的实验统计而来，每次检测样本由不同的健康供者提供。*P＜0.05，**P＜0.01。
图14为过表达TCF1对CD19.28z CAR-T体内抗肿瘤功能的影响。A：各组小鼠光子数变化折线图。B：各组小鼠的生存曲线。(Untransduced T组：n＝3；CD19.28z CAR-T组：n＝4；CD19.28z-TCF1 CAR-T组：n＝4)，**P＜0.01。
图15为过表达TCF1对小鼠体内CD19.28z CAR-T分化的影响。小鼠骨髓CAR-T细胞计数及分化状态流式检测结果柱状统计图(小鼠骨髓CAR-T细胞计数：每组分别3只小鼠；小鼠骨髓CAR-T细胞计分化状态：每组分别4只小鼠)。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，NS：No significance，即没有统计学差异的意思。
具体实施方式
一、实验材料
(1)HEK293T细胞，ALL细胞株Nalm-6由中科院上海细胞所引进保存。感受态细胞DH5α购自南京诺维赞生物科技有限公司。外周血T细胞来源于健康捐献者。
(2)慢病毒载体(三质粒系统：psPAX2、pMD2.G和Lenti-EFlα)
(3)NCG小鼠：6-8周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，浙江大学药物安全评价研究中心SPF级环境常规饲养。
二、实验仪器：
(1)流式细胞仪Cytoflex(美国Beckman公司)
(2)CytoFLEX LX流式细胞分析仪(美国Beckman公司)
(3)流式细胞分选仪(美国Beckman公司)
(4)小动物活体成像仪(美国Perkin-Elmer公司)
三、主要试剂：
(1)RPMI 1640培养基(美国Corning公司)
(2)DMEM(High Glucose)培养基(美国Coming公司)
(3)胎牛血清(FBS)(美国GIBCO公司)
(4)Ficoll淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)
(5)质粒抽提试剂盒(美国Life Biotechnology公司)
(6)Genomic DNA Purification Kit(Lifetech，CAT#K0512)
(7)PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(日本Takara公司，CAT#6210A)
(8)Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)，ROXplus(日本Takara公司，CAT#RR42WR(LR×5))
(9)IL-2(美国Peprotech公司)
(10)anti-CD3/CD28磁珠：临床研究级别，Cat#40203D(美国Thermo公司)
(11)Bright-GloTM Luciferase Assay system(美国Promega公司，Cat：E2620)
(12)D-Luciferin Firefly，potassium salt(美国Perkin-Elmer公司，Cat#122799)
(13)Goat Anti-Mouse IgG，F(ab′)2fragment特异性抗体(美国Jackson公司，货号：115-066-006)
(14)streptavidin FITC(美国Biolegend公司)
(15)polybrene(美国Sigma-Adrich公司)
(16)聚乙烯亚胺盐酸(PEI)(美国Polysciences公司)
(17)流式荧光抗体：anti-human CD3(PE-cy7)、anti-human CD19(APC)、anti-human CD4(APC-cy7)、anti-human CD8(PE-cy7)、anti-human CD62L(PE)、anti-humanCD45RO(APC)、anti-human CD25(APC)、anti-human CD69(PE-cy7)、anti-human PD-1(APC)、anti-human TIM-3(PE)、anti-human LAG-3(PE-cy7)、Annexin V(APC)、anti-mouseTER119(BV510)、anti-mouse CD3(PC7)、anti-mouse CD8(BV786)、anti-mouse CD4(APC-cy7)、anti-mouse CD62L(PE)、anti-mouse CD45RO(APC)；PE、APC，PE-cy7，APC-cy7同型对照均购自美国Biolegend公司。
(18)EasySepTM人T细胞阴选试剂盒(美国Stem Cell公司，CAT#17951)
(19)10X Annexin V binding buffer(美国BD bioscience公司，CAT#51-66121E)
(20)10X裂红液(美国Biolegend，CAT#420301)
(21)Zombie Green Fixable Viability Kit(美国Biolegend，CAT#423111)
四、溶液配制：
(1)RPMI 1640完全培养基：RPMI 1640+10％FBS+1％青链霉素；
(2)DMEM(高糖)完全培养基：DMEM(高糖)培养基+10％FBS+1％青链霉素；
(3)FBS：使用前56℃水浴30min，室温冷却后分装至50ml离心管，-20℃贮存；
(4)转染试剂PEI溶液：准确称量线性化聚乙烯亚胺盐酸(Polyethylenimine，Linear，mw-25000)50mg，转移至50ml离心管中，加入50mL ddH2O，置于80℃水浴箱中将其充分溶解。调节pH至7.0，超净台内0.22μm滤膜过滤除菌，分装于无菌的1.5mLEP管中，-20℃保存；
(5)IL-2溶液配制：取1支500μg IL-2冻干粉剂，溶于1ml浓度为100mM的乙酸中，进一步加入含0.1％BSA的PBS 49mL，储存浓度为1×106IU/ml，分装后-80℃保存；
(6)羊抗鼠IgG，F(ab′)2片段特异性抗体配置：使用500μl无菌ddH2O溶解该抗体冻干粉末，配置浓度为1.5mg/ml，分装至100μl EP管，-80℃保存；
(7)Bright-GloTM Luciferase Assay反应液配置：室温下将100ml Bright-GloTMLuciferase Assay Buffer添加至1 vial Bright-GloTM Luciferase Assay Substrate中，充分溶解后分装至15ml离心管-80℃保存；
(8)体外培养所用曲美替尼溶液配制：将曲美替尼粉剂，溶于DMSO配制成浓度为10mmol/L的贮存液，分装后-80℃贮存。临用前使用DMSO稀释成需要的不同浓度，确保所有实验中DMSO终浓度为千分之一；
(9)小动物成像用luciferin注射液配置：临用前根据3mg/鼠计算总需要量，称取相应质量的D-Luciferin Firefly，potassium salt粉剂溶于相应体积的DPBS，配置浓度为15mg/ml，并予0.22μm滤器过滤后使用。
(10)1×Annexin V binding buffer：临用前取适量体积的10×Annexin Vbinding buffer加入9倍体积的ddH2O稀释为1×溶液后贮存于4℃冰箱。
实施例1携带CAR慢病毒载体的构建制备
1.根据目的基因设计合成CAR基因片段
以靶向CD19的鼠源抗体重链和轻链可变区序列为基础(克隆号FMC63，https：//www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589097001442)，以CD28和CD3ζ作为T细胞激活信号，构建第二代CAR序列。
CAR片段为在CAR的5’端通过2A多肽连接红色荧光蛋白mcherry构成，示意图如图1所示，序列如SEQ ID NO.1所示。过表达TCF1的CAR片段为在CAR的3’端通过2A多肽连接转录因子TCF1，在CAR的5’端通过2A多肽连接红色荧光蛋白mcherry构成，示意图如图2所示，序列如SEQ ID NO.2所示。
上述CAR片段(CD19.28z CAR)及过表达TCF1的CAR片段(CD19.28z-TCF1 CAR)直接进行全基因合成，并将合成后的片段作为PCR扩增模板。
2.构建CAR慢病毒载体
(1)使用上述合成的片段作为PCR扩增的模板，使用下表中的引物序列扩增CAR-mcherry片段，同时在序列两端通过PCR分别引入EcoRI酶切位点和XbaI酶切位点用于慢病毒表达载体构建。
表1 CAR克隆引物
引物名称 5’-3’序列 引物酶切位点
CAR Mcherry F ttcgaattcgccgccaccatggcctt EcoRI酶切位点gaattc
CAR Mcherry R cggtctagattactacttgtacagctcgtcc XbaI酶切位点tctaga
(2)按照下表配置PCR反应体系：
表2 PCR反应体系
成分 用量(μL)
Ex Taq HS(Takara，RR006) 1
10×Buffer 5
dNTP(25mM) 2
CAR F(10μM) 1
CAR R(10μM) 1
PCR模板 1
无菌水 39
总体积 50
(3)配置好PCR反应体系后，按照程序设置PCR仪，程序如表3。
表3 PCR程序
(4)PCR反应结束，使用1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并将目的片段进行胶回收。
(5)将慢病毒表达载体Lenti-EF1α及上述胶回收的PCR产物片段使用EcoRI-XbaI进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳后，回收酶切后的载体及PCR产物片段，进行T4 DNA连接酶连接。连接体系如表4。
表4克隆连接体系
试剂 用量
CAR片段 5μL
Lenti-EF1α 200ng
10×T4 buffer 2μL
T4 DNA连接酶 1μL
无菌水 补至20μL
(6)将上述T4 DNA连接体系置于16℃连接过夜后，取10μL转化至大肠杆菌感受态stbl3细胞中，涂布氨苄抗性的LB平板后，将LB平板置于37℃过夜培养，第二天挑取单克隆细胞进行小规模摇菌培养约5mL，使用质粒小提试剂盒提取质粒DNA后，进行Sanger测序。慢病毒载体结构如图3和图4所示。
实施例2携带CAR慢病毒载体质粒的转化、扩增和抽提
1、质粒的转化
(1)-80℃冰箱取出DH5α感受态细胞，置于冰上缓慢融化；
(2)混匀感受态细胞，10μl/管分装至无菌的200μl EP管内，加入1μl携带CAR的载体质粒，冰浴20min；
(3)42℃水浴锅热激60s，转移至冰上静置5min；
(4)将转化好的感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素的固体LB培养皿中；
(5)倒置培养皿于37℃培养箱中培养16-24小时。
2、细菌扩增
(1)取15ml离心管，加入4mL含氨苄青霉素的LB培养基；
(2)使用无菌10μl枪头，挑取固体LB培养皿中生长的单个菌落克隆，放入到上述离心管中，摇床培养4-6小时(37℃，200rpm)；
(3)4-6小时后若离心管中有出现絮状悬浮的细菌，再将其转移至500ml含氨苄青霉素的LB培养基的锥形瓶中，摇床继续振荡培养12-16小时。
3、质粒抽提(大抽)
(1)500mL菌液分装至无菌离心瓶内，4000g离心10min，弃上清收集沉淀菌体；
(2)添加含RNA酶的R3溶液10ml重悬沉淀；
(3)加入10ml Lysis Buffer(L7)，充分混匀后室温静置5min，裂解菌体；
(4)加入10ml Precipitation Buffer(N3)，混匀后室温12000g离心10min；
(5)收集上清悬液，置于柱子中过滤；
(6)加入60ml Wash Buffer(W8)于柱子中，清洗吸附在柱子中的质粒；
(7)将柱子放置于新的无菌50ml离心管上，加入15ml Elution Buffer(E4)洗脱，离心管中得到质粒悬液；
(8)加入10.5ml异丙醇，混匀，4℃离心(12000g，30min)；
(9)弃去上清，加入5ml 70％乙醇，4℃离心(12000g，10min)；
(10)弃去上清后自然干燥10min，根据得到的质粒的量，加入适当体积的ddH2O重悬质粒，测定DNA浓度，将浓度调整为500-1000ng/μl，-20℃储存。
实施例3携带CAR慢病毒的包装
1、HEK293T细胞的复苏和培养
(1)从液氮罐中取出HEK293T细胞，并迅速放入37℃水浴锅中解冻；
(2)细胞解冻后，在超净工作台内将冻存管中的细胞悬液转移至15ml离心管，并向离心管内加入5ml DMEM(高糖)完全培养基。细胞悬液混匀后置于离心机中，设置离心参数100g，室温离心8分钟；
(3)离心结束后，弃去上清，加入10ml DMEM(高糖)完全培养基，轻轻吹打重悬细胞后转移至10cm培养皿中，混匀后置于37℃、5％CO2培养箱中过夜培养；
(4)倒置显微镜下每天观察细胞形态和汇合度，若细胞汇合度不足80％，则将细胞放回培养箱继续培养；若细胞汇合度＞80％，则进行细胞传代扩大培养；
(5)传代培养：将培养皿中的培养基弃去，加入5ml的PBS轻轻润洗细胞一次以去除残留培养基，加入1ml 0.05％胰酶，轻轻晃动培养皿，确保所有的细胞表面被胰酶润洗过，将培养皿放在37℃、5％CO2培养箱中2分钟，取出并置于倒置显微镜下观察，直至细胞形态变圆或从培养皿底部脱离；
(6)向培养皿中加入5mL DMEM(高糖)完全培养基，混匀后将细胞转移至15ml离心管中300g离心5分钟；
(7)离心后弃上清，DMEM(高糖)完全培养基重选后置于37℃、5％CO2培养箱中继续扩大培养。
2、慢病毒包装
(1)上述培养的HEK293T细胞，在细胞汇合度60-70％时用于病毒包装；
(2)计算所需各质粒用量，配置PEI/DNA复合物(以10cm培养皿10ml体系计算)：不含血清和青链霉素的高糖DMEM培养基(200μl)+CAR(7.5μg)+psPAX2(5.625μg)+pMD2.G(1.875μg)+PEI(45μg)轻轻摇晃混匀后，室温静置20分钟；
(4)将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到10cm培养皿中，轻轻晃动培养皿混匀。将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱，培养6-8小时后，将含有转染试剂的培养基吸取弃去，更换为新鲜的DMEM(高糖)完全培养基；
(5)48小时后收集培养皿中的培养基，并更换新鲜的DMEM(高糖)完全培养基继续培养；
(6)72小时再次收集培养皿中的培养基，与48小时收集的培养基混合，400g离心5分钟，弃去培养基中的细胞碎片，并予0.45μm的滤膜过滤；
(7)将收集的培养基转移至超速离心管中(25ml/管)，电子天平上准确称量配平，使用Beckman超速离心机，60000g 4℃离心2小时；
(8)离心结束后，在超净工作台中，将离心管中的液体弃去，加入100μl不含FBS和青链霉素的RPMI 1640培养基(添加的体积按照250倍比例浓缩)，培养基覆盖离心管中的沉淀物，并将其置于4℃冰箱中浸泡过夜；
(9)第二天用移液器反复吹打，将沉淀重悬。按100μL/管分装，将病毒悬液置于-80℃保存。
3、慢病毒滴度测定
(1)将293T细胞按照2×105/孔接种于6孔板过夜；
(2)次日观察六孔板中293细胞形态，确认细胞生长良好后取一孔细胞用胰酶消化后计数；
(3)解冻一支分装的浓缩病毒液20μl，混匀，在EP管中配制病毒稀释液(含6μg/ml的polybrene)；
(4)将病毒浓缩液稀释10倍至200μl终体积并混匀，并按下列浓度配制病毒稀释液：
孔1：100μl稀释10倍的病毒液+400μl细胞培养液(含浓缩病毒液10μl)；
孔2：30μl稀释10倍的病毒液+470μl细胞培养液(含浓缩病毒液3μl)；
孔3：10μl稀释10倍的病毒液+490μl细胞培养液(含浓缩病毒液1μl)；再次取10μl稀释10倍的病毒液加入90μl细胞培养液再次稀释10倍。
孔4：30μl稀释100倍的病毒液+470μl细胞培养液(含浓缩病毒液0.3μl)；
孔5：10μl稀释100倍的病毒液+490μl细胞培养液(含浓缩病毒液0.1μl)；
孔6：500μl细胞培养液(对照)；
(5)弃去6孔板各孔中原有的细胞培养液，加入以上配置的各浓度病毒稀释液；
(6)6小时后沿孔壁小心加入2.5ml新鲜培养液至各孔中；
(7)72小时后消化各孔中的293细胞，洗涤，流式检测各孔中Mcherry阳性细胞比例；
(7)病毒滴度计算：病毒颗粒数/ml＝加病毒液时每孔293T细胞数×Mcherry阳性细胞比例/每孔实际添加病毒原液体积(ml)。
慢病毒成功包装后感染293T细胞进行滴度测定结果如图5所示。
实施例4 CAR-T的制备
1、健康供者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)的分离
(1)采集健康供者外周血10-20ml；
(2)使用等体积的PBS将外周血进行稀释；
(3)取15ml离心管，加入5ml fcoll分离液，使用移液枪将稀释后的血样10ml沿管壁缓慢添加至fcoll分离液的上方，避免fcoll分离液与血样的混合；
(3)将离心机设置为400g，设置转速上升为4档，转速下降为0档，室温离心30分钟；
(4)离心结束后，轻轻吸取处于血清与fcoll分离液界面的絮状单个核细胞层并转移至一个新的离心管中，PBS洗涤细胞2次；
2、使用EasySepTM人T细胞阴选试剂盒从PBMC中分离T细胞(美国Stem Cell公司，CAT#17951)
(1)计数获取的单个核细胞，以含2％FBS的PBS重悬细胞，调整细胞浓度至5×107/ml；
(2)将样本转移到5ml无菌流式管里，每毫升样本加入50μl分离抗体组合并混匀，室温下孵育5min；
(3)震荡RapidSpheresT30s，每毫升样本中加入40ul RapidSpheresT并混匀，室温下孵育30s；
(4)加入一定量含2％FBS的PBS至总体积为2.5ml。
(5)将装有样本的无菌流式管放入EasySepTM磁极(加拿大StemCell公司，Catalog#18000)中室温下静置3min。
(6)取一根新的15ml离心管，倾倒磁极和与之相连的无菌流式管，以将无菌流式管里的细胞悬液倒入15ml离心管中。该细胞悬液即包含富集的T细胞(给细胞标记anti-humanCD3 PE-cy7流式抗体，流式细胞仪检测纯度在90％以上)。
(7)设置离心机参数为300g，5min，离心沉淀T细胞团块。
3、使用antiCD3/CD28 Dynabeads激活T细胞
(1)计数获取的T细胞，含IL-2(200IU/m1)的RPMI 1640完全培养基重悬，调整细胞浓度至107/ml；
(2)用1％BSA/PBS溶液洗涤anti-CD3/CD28磁珠(临床研究级别：Cat#40203D，Thermo)2遍；洗涤方法：取5ml 1％的BSA/PBS溶液置于50ml离心管中，加入计算后所需要的anti-CD3/CD28磁珠的量，充分混匀后置于磁力架上静置1分钟，磁珠贴于两侧离心管壁，吸取弃去1％BSA/PBS溶液。重复洗涤1次；
(3)按照T细胞纯度为95％，磁珠∶CD3(+)T细胞＝3∶1，将洗涤后的anti-CD3/CD28磁珠与T细胞充分混匀，移至T25细胞培养瓶中，置摇床轻轻摇晃30分钟，使磁珠与CD3(+)T细胞充分结合；
(4)用含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬结合磁珠的CD3(+)T细胞，调整细胞浓度至1×106/ml，37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时。
4、慢病毒感染T细胞
(1)离心并计数结合磁珠的CD3(+)T细胞，用含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬，调整细胞浓度至4×106/ml，按500μl/孔接种于12孔板；
(2)按照MOI＝3，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量＝(MOI×细胞数量)/病毒滴度；
(3)从-80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在12孔板中加入上述计算所得的病毒量，预留一孔T细胞不加入病毒作为未感染CAR的T细胞对照(UntransducedT)，给上述各孔细胞添加终浓度为6μg/ml的polybrene，充分混匀后置于37℃，5％CO2的培养箱中，6-8小时后补充含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基至2ml，继续培养24小时；
(4)24小时后，300g离心5分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至六孔板或培养瓶中，以后当培养基变黄或细胞密度超过2.5×106/ml时，对细胞进行换液，以新鲜含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基培养；
(5)加入病毒感染4天后，使用5ml移液枪吹打培养瓶中CAR-T细胞，并将细胞移入50ml离心管中，置于磁力架上静置1min，磁珠被吸附于管壁后，将细胞混悬液转移至新的离心管中，离心并添加新鲜含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基继续扩大培养。
(6)取部分细胞使用流式细胞仪检测细胞表面CAR分子的表达。
5、流式细胞仪检测CAR-T细胞比例
(1)细胞悬液制备：收集体外制备扩增培养的CAR-T细胞离心洗涤计数后，取3×105个细胞加入流式管中，使用100μl PBS缓冲液重悬细胞成单细胞悬液；
(2)标记抗体：向相应流式样品管中加入0.5μl Goat Anti-Mouse IgG，F(ab′)2fragment特异性抗体4℃避光孵育30min；
(3)洗涤：每管加入1ml PBS缓冲液，混匀后常温下300g离心5min，弃上清；
(4)流式管中添加100μl PBS，混匀后加入streptavidin FITC 0.5μl，4℃避光孵育30min；
(5)洗涤：每管加入1mLPBS缓冲液，混匀后常温下300g离心5min，弃上清；
(6)检测与分析：使用500μl PBS缓冲液重悬标记后的细胞，流式细胞仪上机检测；
(7)FlowJo X 10.0.7R2软件分析数据，结果以阳性细胞比例表示，CAR-T细胞的比例为RFP/CAR双阳性细胞比例。
如图6所示，按MOI＝3加入病毒感染T细胞，感染效率可达50％及以上，细胞表面CAR分子表达良好，使用Goat Anti-Mouse IgG，F(ab′)2fragment特异性抗体检测鼠源scFv效果佳。
实施例6 CAR-T细胞的流式分选
(1)T细胞感染携带CAR的慢病毒后4-5天，流式检测确定细胞表面CAR表达后收集细胞；
(2)流式细胞分选缓冲液(含2％FBS和2％青链霉素的PBS)将CAR-T细胞重悬，配制细胞浓度为3-5×107ml；
(3)上机，无菌环境下选取收集Mcherry阳性细胞于含40％FBS+2％青链霉素RPMI1640培养液中，分选结束取少量细胞回测确定分选纯度是否大于90％；
(4)将分选后的CAR-T细胞置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中孵育20min；
(5)设置离心参数为200g，离心20min后弃上清，使用含2％青链霉素和IL-2200IU/ml的RPMI 1640完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度至0.5-1×106ml置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中继续培养。
实施例7 Nalm-6细胞株培养和冻存
(1)肿瘤细胞常规培养，采用RPMI 1640完全培养液，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，2-3天换液传代一次，取对数生长期细胞用于实验；
(2)细胞冻存：取对数生长期的细胞株，300g离心5min，弃上清，加入冻存液(由90％FBS+10％DMSO)，调整密度至1×107/ml。按照1ml细胞悬液/冻存管分装，封口膜封闭冻存管。将冻存管放入细胞冻存盒中，在负80℃冰箱放置24小时后，转移到液氮中。
实施例8建立过表达luciferase的Nalm-6细胞株
(1)Nalm-6细胞株常规培养于RPMI 1640完全培养液，37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中；
(2)pHIV-Luc-ZsGreen慢病毒载体质粒(货号：39196)购买自addgene公司；
(3)按照前述方法转化质粒、扩增细菌、抽提质粒，并储存于-20℃冰箱；
(4)按照前述方法进行病毒包装并储存于-80℃冰箱；
(5)取对数生长期的Nalm-6细胞株，调整细胞浓度至4×106/ml，按500μl/孔接种于12孔板，按照MOI＝3，计算所需要的病毒量；
(6)加入病毒后，添加终浓度为6μg/ml的polybrene，充分混匀后置于37℃，5％CO2的培养箱中培养6-8小时，补充RPMI 1640完全培养液至2ml，继续培养24小时；
(7)24小时后300g离心5分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至六孔板或培养瓶中，继续培养3-6天；
(8)流式细胞仪测定GFP阳性Nalm-6细胞比例；
(9)流式细胞分选仪分选并收集GFP阳性Nalm-6细胞，确保GFP阳性Nalm-6细胞比例大于90％，长期培养并取部分细胞冻存。建立GFP+luciferase+Nalm-6细胞株如图7所示。
实施例9体外评估CAR-T细胞的杀伤功能
(1)收集培养的CAR-T和Untransduced T细胞，离心后用含IL-2(200IU/ml)的RPMI1640完全培养基重悬，调整细胞浓度至2×105/ml；
(2)收集培养的luciferase(+)Nalm-6细胞，离心后用含IL-2(200IU/ml)的RPMI1640完全培养基重悬，调整细胞浓度至2×105/ml；
(3)在圆底96孔板中加入100μl的luciferase(+)Nalm-6细胞；
(4)按照效靶比1∶1，0.5∶1，0.25∶1分别在圆底96孔板中加入相应数量的效应细胞(CAR-T和T细胞)，吸取体积分别为100∶1、50∶1、25∶1，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养8小时；
(5)按照400g，10min离心圆底96孔板，弃去上清，每孔加入50μl PBS；
(6)混匀后将细胞转移至黑色不透光96孔板；
(7)每孔均加入50μl Bright-GloTMLuciferase Assay System，混匀避光2min，酶标仪检测各孔荧光值；
(8)杀伤率计算方法：杀伤率(％)＝(T细胞孔荧光值-CART细胞孔荧光值)/T细胞孔荧光值×100％。
结果如图8显示，当效靶比为1∶1时，CAR-T细胞的杀伤率是最高的，可达60％以上。
实施例10 CAR-T细胞绝对数量计数及比例检测
(1)在体外培养第4天分选mcherry阳性的CD19.28z CAR-T细胞和CD19.28z-TCF1CAR-T细胞，用含人IL-2200IU/mL的RPMll640完全培养基重悬并使用全自动细胞计数仪进行计数，按3×105/孔接种至6孔板中，37％、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，每3天离心换液；各组分别留取1×106CAR-T细胞继续培养。
(2)实验分组：CD19.28z CAR-T组、CD19.28z-TCF1 CAR-T组。
(3)细胞计数及流式细胞术检测具体操作步骤：
①采集时间点：分别于体外培养第5天、第8天和第11天取样检测；
②样本采集及处理：混匀六孔板中的各组细胞悬液后，将各组细胞悬液分别吸取至15ml离心管中，300g，5min离心后弃上清。各管分别加入1ml含IL-2200IU/ml的RPMI1640完全培养基重悬细胞沉淀并混匀，而后各管分别吸取15μl细胞悬液，用15μl 0.8％台盼蓝进行1∶1稀释。取稀释后的细胞悬液加入细胞计数板中用Count Star全自动细胞计数仪计数活细胞的数量三次，取平均值。
③计算方法：CAR-T细胞扩增倍数＝活细胞数量×CAR-T细胞初始数量。
结果：在CD19.28z CAR-T和CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞体外培养第5、8、11天时分别取样计数。如图9所示，过表达TCF1能促进28z CAR-T细胞的体外扩增。
实施例11细胞亚群检测
(1)取培养第9-13天的Untransduced T细胞、CD19.28z CAR-T细胞和CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞，用含人IL-2200IU/mL的RPM1 1640完全培养基重悬并使用全自动细胞计数仪进行计数，按3×105/孔接种至6孔板中，37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，每3天离心换液，计数以后各组分别留取1×106CAR-T细胞继续培养。
(2)实验分组：Untransduced T组、CD19.28z CAR-T组、CD19.28z-TCF1 CAR-T组。
(3)采集时间点：于体外培养第9-13天进行流式细胞术检测。
(4)流式细胞术检测操作步骤：
①样本采集及处理：混匀六孔板中各组细胞悬液并计数后，各组分别吸取适量细胞悬液离心洗涤后按照3-4×105个细胞/管加入流式管中，使用100μl PBS缓冲液重悬细胞；
②标记抗体：向相应流式样品管中加入0.5μl相应荧光标记的CD4、CD8、CD45RO、CD62L抗体，4℃避光孵育30min；
③洗涤：每管加入1mLPBS缓冲液，混匀后常温下300g离心5min，弃上清；
④检测与分析：使用500μl PBS缓冲液重悬标记后的细胞，流式细胞仪上机检测，使用FlowJo X 10.0.7R2软件分析，以mcherry阳性CAR-T为分析对象设门，分析各亚群的比例；
(5)细胞各亚群定义为：杀伤性T细胞：CD8+，辅助性T细胞：CD4+，初始T细胞：CD45RO-CD62L+，中心记忆T细胞：CD45RO+CD62L+，效应记忆T细胞：CD45RO+CD62L-，效应T细胞：CD45RO-CD62L-，均以比例表示。
结果：在Untransduced T细胞、CD19.28z CAR-T细胞和CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞体外培养第9-13天时分别取样进行流式检测。如图10所示，CD19.28z CAR-T和CD19.28z-TCF1 CAR-T的亚群构成均以TCM和TEM为主。CD19.28z CAR-T相比Untransduced T发生了终末分化，而CD19.28z-TCF1 CAR-T相较于CD19.28z CAR-T TCM的比例显著增加，TEM的比例显著减少，说明过表达TCF1减少了CD19.28z CAR-T的终末分化。
实施例12细胞活化和耗竭相关表面分子的检测
(1)实验分组，细胞培养，样本采集时间点及流式细胞术样本制备操作步骤均与实施例11一致；
(2)按前述方法收集样本、标记CD25、CD69、PD-1、TIM-3和LAG-3的荧光标记抗体和相应的同型对照抗体，洗涤后重悬，流式细胞仪检测；
(3)数据分析：使用FlowJo X 10.0.7R2软件分析数据，以mcherry阳性CAR-T为分析对象设门，结果以阳性细胞比例表示；
(4)活化标记以CD25、CD69阳性比例表示；耗竭相关标记以PD-1、TIM-3、LAG-3阳性比例表示。
结果：在Untransduced T细胞、CD19.28z CAR-T细胞和CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞体外培养第9-13天时分别取样进行流式检测。如图11所示，CD19.28z CAR-T相比Untransduced T耗竭相关抑制性分子(PD-1、TIM-3、LAG-3)和活化相关分子(CD25、CD69)的表达均上升，而CD19.28z-TCF1 CAR-T相较于CD19.28z CAR-T耗竭相关抑制性分子和活化相关分子的表达均下降，说明过表达TCF1降低了28z CAR-T的耗竭和活化程度。
实施例13 Annexin V流式检测
(1)细胞培养，实验分组及样本采集时间点均与实施例11一致。
(2)按实施例11所述收集样本加入流式管中以PBS离心洗去残余培养基后，每管加入100μL 1×Annexin V binding buffer重悬细胞。
(3)每管加入0.5μL Annexin V APC在4℃避光孵育30min。
(4)孵育毕直接加入500μL 1×Annexin V binding buffer混匀细胞后流式细胞仪上机检测。使用FlowJo x 10.0.7R2软件分析，结果以Annexin V阳性细胞比例表示。
结果：在Untransduced T细胞、CD19.28z CAR-T细胞和CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞体外培养第9-13天时分别取样进行流式检测。如图12所示，CD19.28z CAR-T相比Untransduced T发生明显凋亡，CD19.28z-TCF1 CAR-T相较于CD19.28z CAR-T凋亡细胞的比例减少，说明过表达TCF1可抑制CD19.28z CAR-T的凋亡。
实施例14多功能酶标仪检测分析过表达TCF1对CAR-T杀伤功能的影响
(1)实验分组：CD19.28z CAR-T组、CD19.28z-TCF1 CAR-T组。
(2)细胞培养和样本采集时间点与实施例11一致；
(3)收集培养的各组CAR-T细胞，未转染的T细胞和luciferase(+)Nalm-6细胞，按配置细胞浓度，按照效靶比0.25∶1、0.5∶1、1∶1接种于圆底96孔板中；置于37℃，5％CO2的培养箱中培养16小时；
(4)16小时后，按照实施例9所述步骤离心，转移细胞，添加PBS和Bright-GloTMLuciferase Assay System，酶标仪检测各孔荧光值；
(5)杀伤率计算方法：杀伤率(％)＝(T细胞孔荧光值-CART细胞孔荧光值)/T细胞孔荧光值×100％。
结果：在CD19.28z CAR-T细胞和CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞体外培养第9-13天时分别取样进行杀伤功能检测。如图13所示，CD19.28z-TCF1 CAR-T相较于CD19.28z CAR-T在各个效靶比下杀伤率均更高，说明过表达TCF1可提高CD19.28z CAR-T的杀伤功能。
实施例15 ALL-NCG小鼠体内验证过表达TCF1的CD19.28z CAR-T细胞的疗效
(1)CAR-T细胞准备：制备Untransduced T细胞、CD19.28z CAR-T细胞和CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞，在体外培养第4天分选mcherry阳性的CD19.28z CAR-T细胞和CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞，取少量细胞回测确定分选纯度大于90％，连续培养到第15天；
(2)ALL-NCG小鼠模型准备：6-8周龄NCG小鼠饲养于SPF级动物研究中心。取对数生长期luciferase(+)Nalm-6细胞株，配制细胞浓度至5×106/ml，按1×106/鼠尾静脉注射，每只鼠注射总体积200μl。5天后小动物活体成像仪检测肿瘤负荷，按荧光强度随机分为3组，调整3组平均荧光强度无显著差异，次日尾静脉注射不同处理的CAR-T细胞；
(3)实验分组：实验分成3组，分别为①尾静脉注射培养第15天的Untransduced T细胞，②尾静脉注射培养第15天的CD19.28z CAR-T细胞，③尾静脉注射培养第15天的CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞；
(4)CAR-T细胞尾静脉注射：按照3×106CAR-T细胞/鼠，收集培养的CAR-T细胞离心后PBS重悬，配置浓度为1.5×107CAR-T细胞/ml，将制备好的各组细胞悬液以尾静脉注射的方式接种至NCG小鼠体内，注射体积为200μl/鼠；
(5)疗效及生存观察：
①每周使用小动物活体成像仪给小鼠成像，比较三组小鼠肿瘤负荷差异；
②对比观察各组小鼠毛色及活动状态；
③记录各组小鼠死亡时间，绘制生存曲线。
申请人观察了过表达TCF1是否可以提高CD19.28z CAR-T细胞的体内抗肿瘤效果。在CAR-T体外培养第15天时将分选后的纯度大于90％的CAR-T细胞回输到ALL肿瘤小鼠体内。定期通过小动物活体成像检测小鼠肿瘤负荷的变化并绘制小鼠生存曲线。结果发现：在肿瘤负荷方面，输注CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞小鼠的肿瘤负荷相比于输注CD19.28z CAR-T细胞和输注Untransduced T细胞小鼠的肿瘤负荷整体较低(图14)。生存曲线方面，输注Untransduced T细胞小鼠的中位生存期为20天，输注CD19.28z CAR-T细胞小鼠的中位生存期为43.5天，输注CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞小鼠的中位生存期为51天，这三组小鼠的生存期两两之间进行比较均有统计学差异(图14)。说明过表达TCF1的CD19.28z CAR-T体内可以发挥更好的抗肿瘤效果。
实施例16 ALL-NCG小鼠骨髓CAR-T细胞数量及亚群监测
(1)CAR-T细胞准备：制备CD19.28z CAR-T细胞和CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞，在体外培养第4天分选mcherry阳性的CD19.28z CAR-T细胞和CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞，取少量细胞回测确定分选纯度是否大于90％，连续培养到第15天；
(2)ALL-NCG小鼠模型准备与实施例15一致；
(3)实验分组：实验分成2组，分别为①尾静脉注射培养第15天的CD19.28z CAR-T细胞，②尾静脉注射培养第15天的CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞；
(4)CAR-T细胞尾静脉注射与实施例15一致；
(5)小鼠骨髓CAR-T细胞数量及亚群流式细胞术检测操作步骤
①样本采集及处理：在CAR-T输注后第8天将小鼠安乐死后，酒精喷洒尸体，取双后肢放置于装有10ml PBS的10cm dish中，用纱布剥除后肢肌肉，露出骨头，而后放置于装有PBS的研钵中。用杵将骨头磨碎后，加入PBS，而后使用40μm滤网过滤。300g10min离心将所有骨髓细胞收集于离心管底后，加3ml 1×裂红液，四度冰箱裂8分钟，而后加入6ml PBS终止反应，300g离心10min。弃去上清，各管加入500μl PBS重悬，混匀细胞后，各吸取50μl细胞悬液用于流式染色。
②标记抗体：向相应流式样品管中加入0.5μl Zombie Green Fixable ViabilityKit死活染料进行死活染色，4℃避光孵育30min，染色毕洗去死活染料。而后向相应流式样品管中加入0.5μl相应荧光标记的TER119，CD3，CD62L，CD45RO，CD8，CD4抗体，4℃避光孵育30min。
③洗涤：每管加入1ml PBS缓冲液，混匀后常温下300g离心5min，弃上清；
④检测与分析：使用500μl PBS缓冲液重悬标记后的细胞，流式细胞仪上机检测，使用FlowJo X 10.0.7R2软件分析，以死活染料阴性，TER119阴性，CD3阳性的细胞为分析对象设门，分析各亚群的比例。
⑤小鼠骨髓CAR-T细胞计数定义为：收集小鼠后肢骨髓的全部细胞用流式细胞仪进行分析，直至细胞悬液被收干，样本里CD3阳性的事件数即为骨髓中CAR-T细胞数量。
⑥细胞各亚群定义为：杀伤性T细胞：CD8+，辅助性T细胞：CD4+，初始T细胞：CD45RO-CD62L+，中心记忆T细胞：CD45RO+CD62L+，效应记忆T细胞：CD45RO+CD62L-，效应T细胞：CD45RO-CD62L-，均以比例表示。
在CAR-T体外培养第15天时将分选后的纯度大于90％的CAR-T细胞回输到ALL肿瘤小鼠体内，测定CAR-T输注后第8天小鼠骨髓的CAR-T细胞数量及亚群分布。小鼠骨髓流式结果显示，CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞在小鼠骨髓中的数量显著高于CD19.28z CAR-T细胞，且CD19.28z-TCF1 CAR-T细胞相比于CD19.28z CAR-T细胞的CD8+细胞、TCM、TEM比例均显著增加，TE比例显著降低(图15)，说明过表达TCF1提高了CD19。28z CAR-T细胞在小鼠体内的数量，减少了CD19.28z CAR-T细胞在小鼠体内的终末分化，且使杀伤性T细胞比例增加，即过表达TCF1提高了CD19.28z CAR-T细胞在小鼠体内的持久性。

Claims (2)

1.一种质粒，其特征在于，所述质粒包括用于质粒复制和扩增的慢病毒骨架质粒和过表达转录因子TCF1的CAR片段，过表达转录因子TCF1的CAR片段在EcoRI酶切位点和XbaI酶切位点与所述慢病毒骨架质粒连接，
所述过表达转录因子TCF1的CAR片段的序列如SEQ ID NO.2所示，所述慢病毒骨架质粒为Lenti-EF1α。
2.如权利要求1所述的质粒在构建CAR-T细胞中的应用。
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