CN105924533B - Ror1特异性嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ROR1特异性嵌合抗原受体及其应用。本发明所提供的ROR1特异性嵌合抗原受体，为自氨基端到羧基端依次由抗人ROR1的scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、CD28跨膜区和胞内区、CD3ζ胞内区串联而成的蛋白质。该嵌合抗原受体修饰的T细胞对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，有望在各类实体瘤和血液肿瘤治疗中得到广泛应用。

Description

ROR1特异性嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于生物与医药技术领域，涉及一种ROR1特异性嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，过继细胞免疫治疗近年来取得了长足的进步，以嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰T细胞为代表的肿瘤靶向免疫治疗的成就尤为突出，在体外和临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。虽然如此，但也存在肿瘤特异的靶抗原可选择性不多，杀伤效果不显著，以及“细胞因子风暴”、“脱靶效应”等安全性问题，因此研究广谱、高效、安全的新一代肿瘤靶向免疫治疗方法是细胞免疫治疗未来的发展趋势和必须解决的问题。
CAR-T治疗的基本原理是通过使用特定生物工程方法使得体外培养的T细胞具有一个针对靶分子的胞外单链抗体-跨膜蛋白-胞内信号区的结构，由于胞外的单链抗体直接与肿瘤细胞上的靶分子作用，因此无MHC限制性，大幅度提升过继免疫治疗的效果。CAR结构主要由膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区三部分构成。膜外区是一段单链可变区结构域(scFv)，具有特异性识别并结合TAA的功能；铰链区通常是由免疫球蛋白超家族组成，如CD8、CD28等；胞内信号传导区主要是由CD3复合体中的ζ链组成。近年来，随着研究的深入，发现在胞内的信号传导区中加入共刺激分子如CD28或CD137，可以加强T细胞的抗肿瘤活性，因此，出现了第二代及第三代的CAR。表达CAR的T细胞可以直接识别并结合肿瘤细胞表面的TAA，CAR将信号传入T细胞内，促使T细胞合成并分泌细胞因子，如穿孔素、颗粒酶、INF-γ和TNF-α等，从而发挥杀伤肿瘤细胞作用。CAR-T细胞将抗体-抗原特异性结合的能力以及T细胞介导的杀伤功能结合于一体，发挥特异性抗肿瘤活性CAR-T技术应用的关键是确定一种肿瘤相关的抗原，这种抗原在肿瘤细胞表面高表达，而在正常细胞表面无表达或者低表达。
ROR1基因最初是从成神经瘤细胞系中克隆得到的，随后的研究发现其在胚胎发育过程中高表达，尤其在调节胚胎的肌肉和骨骼发育方面起关键作用。近年来研究发现，在脂肪组织中存在少量表达，而在胰腺、肺、少量B前体细胞阶段也有极少量表达，其他正常细胞几乎不表达，但在多种肿瘤细胞中却高度表达。这些肿瘤细胞包括乳腺癌、黑色素瘤、肾癌、肺腺细胞癌、胃癌等实体瘤细胞以及某些血液肿瘤细胞。就血液肿瘤而言，在慢性淋巴细胞白血病蛋白的肿瘤特异性表达量最高，在髓细胞白血病，边缘区淋巴瘤细胞中也有较高表达，此外，骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤，儿童B系淋巴性白血病等肿瘤细胞也表达ROR1，因此ROR1是一种肿瘤特异性高，并在各类肿瘤中具有广谱表达的较为理想的肿瘤靶抗原。
嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞(chimeric antigen receptor modified Tcell，CAR-T)是通过取病人自身T细胞进行嵌合抗原受体的基因修饰。CAR-T细胞能够特异识别肿瘤细胞标志物，从而引导T细胞靶向肿瘤。CAR-T细胞治疗方式的优点是能够克服诸多原因造成的T细胞不应答问题，这些原因包括肿瘤靶点密度过低，T细胞表位HLA类型的限制或者HLA表达量太低。而CAR-T细胞治疗的难点在于其对靶点在肿瘤细胞上表达的特异性要求非常高，否则容易造成T细胞持续激活而杀伤正常B细胞，或释放大量细胞因子引起严重副作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种ROR1特异性嵌合抗原受体及其应用。
本发明所提供的ROR1特异性嵌合抗原受体，为自氨基端到羧基端依次由抗人ROR1的scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、CD28跨膜区和胞内区、CD3ζ胞内区串联而成的蛋白质。
其中，所述抗人ROR1的scFv中的轻链可变区的氨基酸序列如序列表中序列1的第1-110位所示；所述抗人ROR1的scFv中的重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列1的第111-198位所示。进一步，所述抗人ROR1的scFv的氨基酸序列如序列表中序列1所示。所述CD8α的铰链区和跨膜区的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述CD28跨膜区和胞内区的氨基酸序列如序列表中序列3所示。所述CD3ζ胞内区的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
进一步，所述ROR1特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
其中，序列5共由449个氨基酸组成，其中第1-198位为所述抗人ROR1的scFv的氨基酸序列；第199-267位为所述CD8α的铰链区和跨膜区的氨基酸序列；第268-336位为所述CD28跨膜区和胞内区的氨基酸序列；第337-449位为所述CD3ζ胞内区的氨基酸序列。
编码所述ROR1特异性嵌合抗原受体的基因也属于本发明的保护范围。
其中，编码所述抗人ROR1的scFv中的轻链可变区的基因的核苷酸序列如序列表中序列6的第1-330位所示；编码所述抗人ROR1的scFv中的重链可变区的基因的核苷酸序列如序列表中序列6的第331-594位所示。进一步，编码所述抗人ROR1的scFv的基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示。编码所述CD8α的铰链区和跨膜区的基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示。编码所述CD28跨膜区和胞内区的基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示。编码所述CD3ζ胞内区的基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示。
进一步，编码所述ROR1特异性嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示。
其中，序列10共由1350个核苷酸组成，其中第1-594位为编码所述抗人ROR1的scFv的基因的核苷酸序列；第595-801位为编码所述CD8α的铰链区和跨膜区的基因的核苷酸序列；第802-1008位为编码所述CD28跨膜区和胞内区的基因的核苷酸序列；第1009-1350位为编码所述CD3ζ胞内区的基因的核苷酸序列。
含有所述基因的重组载体、表达盒、重组病毒或重组细胞也属于本发明的保护范围。
其中，所述重组载体为能够表达所述ROR1特异性嵌合抗原受体的重组慢病毒表达载体；具体为将所述基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP后得到的重组质粒；更加具体的为将所述基因(序列10)插入到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的多克隆位点XbaI和BamHI之间后得到的重组质粒。所述重组细胞为能够表达所述ROR1特异性嵌合抗原受体的免疫效应细胞。所述重组病毒为能够表达所述ROR1特异性嵌合抗原受体且能够侵染免疫效应细胞的病毒。
具体的，所述免疫效应细胞可为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、NK细胞或辅助性T细胞。所述病毒为慢病毒、疱疹病毒、巨噬细胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或艾滋病毒。
本发明还提供了ROR1特异性CAR-T细胞的制备方法。
本发明所提供的ROR1特异性CAR-T细胞的制备方法，具体可包括在T细胞上表达所述ROR1特异性嵌合抗原受体的步骤。
具体的，所述方法可包括如下步骤：(1)将能够表达所述ROR1特异性嵌合抗原受体的重组表达载体A和pSPAX2质粒以及pMD2.G质粒转染293T细胞，获得病毒上清；所述重组表达载体A为将所述基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP后得到的重组质粒；(2)用所述病毒上清感染T细胞，从感染后的细胞中获得表达所述ROR1特异性嵌合抗原受体的T细胞。
其中，步骤(1)中，所述重组表达载体A、所述pSPAX2质粒和所述pMD2.G质粒的摩尔比具体可为4：2：1。在转染293T细胞后的48-72小时可获得所述病毒上清；得到所述病毒上清后还可包括对所述病毒上清进行离心(如4℃3000rpm离心10min)、过滤(如0.45μm滤器过滤)、再离心(如4℃50000g离心3h)及浓缩(如10倍浓缩)的步骤。
步骤(2)中，所述T细胞的可来源于外周血单个核细胞、腹水、胸腔积液或肿瘤组织。采用所述病毒上清感染所述T细胞时，具体可为按照每1×106T细胞加入含有1×108PFU的病毒上清的量进行感染。在进行完所述感染后还可包括如下步骤：向感染体系中加入Polybrene至终浓度为8μg/ml，然后置于32℃，1800rpm离心1.5h后转入5％CO2 37℃孵箱培养24h，然后换液并以1×106/ml的密度接种并加入rhIL-2以200IU/ml刺激培养。
所述ROR1特异性嵌合抗原受体或基因或重组载体或表达盒或重组病毒或重组细胞在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(a)制备用于治疗肿瘤的产品；
(b)制备用于杀伤表达ROR1蛋白的肿瘤细胞的产品。
其中，所述肿瘤具体为与ROR1蛋白表达异常(如ROR1蛋白高表达)相关的肿瘤，具体可选自如下中任一：乳腺癌、黑色素瘤、肾癌、肺腺细胞癌、胃癌等实体瘤细胞以及某些血液肿瘤。在本发明中，所述肿瘤细胞具体为ROR1阳性的肿瘤细胞，如MDA-MB-231、Raji和K562/ROR1细胞。
在本发明中，所述产品具体可为药物。
本发明的有益效果：本发明采用抗人ROR1 scFv基因序列，将其进行密码子优化，从NCBI GenBank数据库中搜索到人CD8α铰链肽基因、人CD28跨膜区和胞内区基因，以及人CD3ζ胞内区基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受体hROR1scFv-hinge-TM-CD8α-CD28-CD3ζ(hROR1-CAR)基因片段，插入到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP中，构成抗人ROR1-CAR表达质粒(pCDH-CAR质粒)，利用该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G在293T细胞中包装病毒并感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。获得的CAR-T细胞在体外与ROR1阳性的肿瘤细胞MDA-MB-231、Raji和K562/ROR1共培养，通过流式细胞术、细胞毒性分析实验以及ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，以证实该嵌合抗原受体修饰的T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。利用该技术，可以将CAR分子精确地整合到人T细胞基因组特定的“安全港”位点，不影响任何人体正常基因的给功能，因此本发明所述的嵌合抗原受体hROR1scFv-hinge-TM-CD8α-CD28-CD3ζ可在各类实体瘤和血液肿瘤治疗中得到广泛应用。
附图说明
图1为慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的质粒图谱。
图2为荧光显微镜观察慢病毒感染T细胞后的绿色荧光表达情况。
图3为流式细胞仪检测慢病毒感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白的表达情况。
图4为CAR-T细胞的体外杀伤作用测定结果。
图5为ELISA检测各靶细胞与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平。其中，A为TNF-α检测结果；B为IL-2检测结果；C为IFN-γ检测结果。
图6为CAR-T细胞的体内杀瘤活性检测结果(肿瘤大小)。
图7为CAR-T细胞的体内杀瘤活性检测结果(小鼠存活率)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP：普如汀生物技术(北京)有限公司产品。该质粒能表达GFP，产生绿色荧光。该载体的质粒图谱如图1所示。
pSPAX2质粒：为优宝生物产品，产品货号：VT1444。
pMD2.G质粒：为优宝生物产品，产品货号：VT1443。
293T细胞：为ATCC产品，其产品编号为CRL-3216TM。
MDA-MB-231细胞：为ATCC产品，其产品编号为HTB-26TM。
Raji细胞：为ATCC产品，其产品编号为CCL-86TM。
K562细胞：为ATCC产品，其产品编号为CCL-243TM。
实施例1、hROR1 scFv-hinge-TM-CD8α-CD28-CD3ζ表达质粒的构建
一、hROR1 scFv-hinge-TM-CD8α-CD28-CD3ζ基因序列的确定
从美国国立医学图书馆网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)GenBank数据库中搜索到人CD8α铰链区和跨膜区基因、人CD28跨膜区和胞内区基因，人CD3ζ胞内区基因序列信息，以及抗人ROR1 scFv基因序列，并将其进行密码子优化，以保证在编码氨基酸序列不变情况下更适合人类细胞表达。
其中，抗人ROR1 scFv基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示。人CD8α铰链区和跨膜区基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示。人CD28跨膜区和胞内区基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示。人CD3ζ胞内区基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示。
将上述基因序列依次按抗人ROR1 scFv基因、人CD8α铰链区和跨膜区基因、人CD28跨膜区和胞内区基因以及人CD3ζ胞内区基因序列进行连接，形成最终完整的hROR1-CAR基因序列信息，具体如序列表中序列10所示。序列10共由1350个核苷酸组成，其中第1-594位为编码所述抗人ROR1的scFv的基因的核苷酸序列；第595-801位为编码所述CD8α的铰链区和跨膜区的基因的核苷酸序列；第802-1008位为编码所述CD28跨膜区和胞内区的基因的核苷酸序列；第1009-1350位为编码所述CD3ζ胞内区的基因的核苷酸序列。
二、hROR1 scFv-hinge-TM-CD8α-CD28-CD3ζ表达质粒的构建
全基因合成步骤一优化后的完整的hROR1-CAR序列(序列10，克隆到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP(简称pCDH-空载体)中，获得抗人CD19-CAR表达质粒(命名为pCDH-CAR质粒)和含有该质粒的DH5α菌液。具体操作如下：用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切hROR1-CAR序列(“TCTAGA+序列10+GGATCC”)，与经过同样双酶切的慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP相连，得到重组质粒。将重组质粒送上海英俊生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的hROR1-CAR序列比对以证实序列正确。测序引物为Sense和Anti-sense。将经测序表明，在慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切位点XbaI和BamHI之间插入序列表中序列10所示DNA片段的重组质粒命名为pCDH-CAR。
Sense：5’-ctccacgctttgcctgaccctgctt-3’；
Anti-sense：5’-ggtgatgcggcactcgatctccatg-3’。
三、包装质粒和目的质粒的提取
将步骤二构建的pCDH-CAR质粒，以及pCDH-空载体、pSPAX2和pMD2.G包装质粒的菌株在LB培养基中大量培养，采用北京天根生化科技有限公司的无内毒素质粒提取试剂盒(DP117)提取质粒，以备感染。具体操作步骤如下：
1、柱平衡步骤：向吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(用平衡液处理过的柱子最好立即使用)。
2、取100ml(根据培养菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用200ml)过夜培养的菌液加入离心管，室温8000rpm离心3min收集细菌，尽量吸除上清。
注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌液量以能够充分裂解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。
3、尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。
4、向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低。对于低拷贝质粒，加大菌体用量的同时按比例增加P1、P2、P4的用量。
5、向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，室温放置5min。注意：温和地混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
6、向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8000rpm离心5-10min，使白色沉淀离至管底(可适当增加离心时间)，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中(请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器)，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的管中(自备)。
注意：加入溶液P4后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过滤器CS1中的溶液有白色沉淀也不会影响过滤。如果菌体过多(>100ml)，推荐延长离心时间至20-30min。
7、向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致RNA污染)，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)。
注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱CP6的最大容积为15ml，所以需要分2次过柱。
8、室温8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。
注意：将第7步中所得溶液分2次过柱，每次均按以上条件操作。
9、向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，8000rpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10、重复操作步骤9。
11、向吸附柱CP6中加入3ml无水乙醇，室温8000rpm离心2min，倒掉废液。
12、将吸附柱CP6重新放回收集管中，8000rpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
13、将吸附柱CP6置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2ml洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温8000rpm离心2min。将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管，-20℃保存。
注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤13。
实施例2、嵌合抗原受体hROR1scFv-hinge-TM-CD8α-CD28-CD3ζ慢病毒修饰T细胞的制备及其鉴定
一、嵌合抗原受体hROR1scFv-hinge-TM-CD8α-CD28-CD3ζ慢病毒修饰T细胞的制备
1、将实施例1构建的pCDH-CAR质粒以及包装质粒pSPAX2和pMD2.G按4：2：1比例用聚乙烯亚胺转染试剂(Sigma公司)转染293T细胞，具体方法见PEI转染试剂说明书。分别于转染后72小时收取病毒上清，于4℃，3000rpm离心10分钟后经0.45μm滤器过滤后，采用4℃50000g 3h超速离心后进行10倍浓缩，将收集的病毒浓缩液转入-80℃保存。
2、T细胞的制备
取健康供者新鲜外周血，用Ficoll分离液和人T细胞富集抗体混合物(StemCell公司)分离获得较纯的CD3+T cell(约占95％以上)，具体操作步骤详见RosetteSep T cellenrichment Cocktail说明书。用含10％FBS的RPMI1640培养基调整细胞浓度至1×106/ml，将细胞以1ml/孔接种至预先用抗人CD3和CD28抗体(eBioscience，用量为5μg/ml)包被的24孔板，再加入500IU/ml重组人白细胞介素2(rhIL-2)，刺激培养24h后进行病毒感染。
3、慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的培养
从-80℃中取出步骤1获得的病毒浓缩液，按每1×106T细胞加入100μl病毒上清(相当于1×108PFU)，后加入Polybrene至终浓度为8μg/ml混匀后，置于32℃，1800rpm离心1.5h后转入5％CO2，37℃孵箱培养；将培养24h后的细胞以1000rpm10min离心换液，以1×106/ml的密度接种于六孔板中，加入rhIL-2以200IU/ml刺激培养后，每2-3天换液一次，细胞生长密度和rhIL-2用量同前；感染后96h，用荧光显微镜观察T细胞的绿色荧光表达情况并照相，结果见图2。收集细胞后，1000rpm离心10min，PBS洗涤1次，用适量PBS重悬细胞置于流式检测管仲，用流式细胞仪检测GFP阳性率。
二、流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白的表达
离心收集感染后96h的待检测细胞及对照组(以pCDH-空载体替代实施例1构建的pCDH-CAR质粒)，PBS洗涤1次后弃上清，按照抗体说明书加入相应检测量的单抗(CD3由APCanti-human CD3标记，购自ebioscience，货号：17-0037；CAR由Biotin anti-mouse IgG,F(ab’)2和APC/Cy7 Streptavidin标记，其中CAR即为序列5所示的嵌合抗原受体hROR1scFv-hinge-TM-CD8α-CD28-CD3ζ)，用于流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白的表达情况。
结果见图3，由图可见经重组慢病毒表达载体pCDH-CAR表达产物刺激后的T淋巴细胞成功获得了表达ROR1特异性嵌合抗原受体的T细胞，即为CAR-T细胞。
实施例3、嵌合抗原受体hROR1 scFv-hinge-TM-CD8α-CD28-CD3ζ慢病毒修饰T细胞的体外杀瘤活性检测
一、多种肿瘤细胞系中ROR1表达水平
供试肿瘤细胞系：Raji、K562、K562/ROR1(转染了ROR1的K562细胞)、MDA-MB-231。
将各供试肿瘤细胞系分别培养后，各取5×105个细胞的细胞悬液，PBS洗涤2次后，加入APC标记的抗人ROR1单抗(eBioscience公司)，以标记APC-isotype(eBioscience公司产品)为对照组，冰上孵育30min，采用流式细胞术检测各种细胞系的ROR1表达的水平。实验重复三次，结果取均值。
结果显示：Raji、K562/ROR1、MDA-MB-231细胞系表达ROR1的百分率分别为69％、90％和95％；而K562不表达ROR1。
根据不同的靶细胞分为四个实验组：MDA-MB-231、Raji、K562/ROR1组(转染了ROR1的K562细胞)和K562细胞组，设置效应细胞对照组和靶细胞对照组。调整效应细胞CAR-T(实施例2制备)和各组相应的靶细胞密度，分别为1×106/ml和1×107/ml，在各实验组中按效靶比(E/T)10：1往96孔板中加入效应细胞悬液和靶细胞悬液，总体积为200μL，放入37℃，5％CO2培养箱中培养48h后每孔加入20μL CCK-8，继续孵育2h后上酶标仪检测，于450nm波长处读取OD值，杀伤率＝[1-(实验组OD值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100％。
实验同时设置以pCDH-空载体替代实施例1构建的pCDH-CAR质粒的对照组(NTD-T组)。
结果如图4所示，由图可见以MDA-MB-231、Raji、K562/ROR1(转染了ROR1的K562细胞)为靶细胞时，CAR-T细胞对其杀伤作用明显高于NTD-T组。而以K562为靶细胞时，CAR-T细胞对其杀伤作用与NTD-T组类似，均较低。
二、ELISA检测各靶细胞与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平
实验分组同上，每组设3个复孔。取出已包被抗体(IFN-γ，购自Abcam公司，货号：(ab46551)；TNF-α,购自Abcam公司货号：181421；IL-2，购自Abcam公司货号：174444)的酶标板，设置TMB空白显色孔，依次加入0.1ml按一定倍数稀释的标准品及用样品稀释液稀释的样品。酶标板加上盖，37℃反应90min。反应后用自动洗板机吸弃酶标板内的液体。分别将生物素化的抗人IFN-γ、TNF-α、IL-2抗体(同上)工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)，37℃反应60min，0.01M PBS洗涤3次。将ABC工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)，37℃反应30min，0.01M PBS洗涤5次。按每孔90μl依次加入TMB显色液，37℃避光反应20-25min，按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，用酶标仪在450nm处测定OD值。根据标准曲线计算共培养上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2细胞因子水平。实验重复三次，结果取均值。
结果表明：各靶细胞与CAR-T细胞共培养上清中TNF-α(图5中A)、IL-2(图5中B)、IFN-γ(图5中C)细胞因子水平不表达ROR1的K562细胞的共培养上清中的IFN-γ、TNF-α、IL-2细胞因子水平相比较有显著性升高(均P<0.01)。该结果表明，嵌合抗原受体hROR1scFv-hinge-TM-CD8α-CD28-CD3ζ修饰的T细胞(即CAR-T细胞)在表达ROR1细胞系刺激下，能够分泌Th1类细胞因子。
实施例4、嵌合抗原受体hROR1 scFv-hinge-TM-CD8α-CD28-CD3ζ慢病毒修饰T细胞体内杀瘤活性检测
收集对数生长期的MDA-MB-231肿瘤细胞，调整细胞浓度于每只小鼠右侧背部皮下接种5×106个细胞；待肿瘤体积达到300-400mm3时，计数CAR-T细胞(实施例2制备)浓度调整至1×108个/ml，尾静脉注射小鼠100μl/只，对照组注射未经嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，于接种肿瘤细胞30天后，用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积并统计生存率。
实验同时设置以pCDH-空载体替代实施例1构建的pCDH-CAR质粒的对照组(NTD-T组)和未处理组。
具体结果如图6和图7所示，由图可见，与NTD-T组和未处理组相比，CAR-T组小鼠的肿瘤大小得到有效控制，并且其存活率得到显著提高。在实验进行的30天内，NTD-T组和未处理组小鼠均全部死亡，而CAR-T组小鼠仍100％存活。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请的保护范围内。
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Claims (18)

1.ROR1特异性嵌合抗原受体，为自氨基端到羧基端依次由抗人ROR1的scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、CD28跨膜区和胞内区、CD3ζ胞内区串联而成的蛋白质；
所述抗人ROR1的scFv中的轻链可变区的氨基酸序列如序列表中序列1的第1-110位所示；所述抗人ROR1的scFv中的重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列1的第111-198位所示；
所述抗人ROR1的scFv的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
所述CD8α的铰链区和跨膜区的氨基酸序列如序列表中序列2所示；
所述CD28跨膜区和胞内区的氨基酸序列如序列表中序列3所示；
所述CD3ζ胞内区的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
2.根据权利要求1所述的ROR1特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述ROR1特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
3.编码权利要求1或2所述ROR1特异性嵌合抗原受体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：编码所述抗人ROR1的scFv中的轻链可变区的基因的核苷酸序列如序列表中序列6的第1-330位所示；编码所述抗人ROR1的scFv中的重链可变区的基因的核苷酸序列如序列表中序列6的第331-594位所示。
5.根据权利要求3或4所述的基因，其特征在于：编码所述抗人ROR1的scFv的基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示；
编码所述CD8α的铰链区和跨膜区的基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示；
编码所述CD28跨膜区和胞内区的基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示；
编码所述CD3ζ胞内区的基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示。
6.根据权利要求3或4所述的基因，其特征在于：编码所述ROR1特异性嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示。
7.含有权利要求3-6中任一所述基因的重组载体。
8.含有权利要求3-6中任一所述基因的表达盒。
9.含有权利要求3-6中任一所述基因的重组病毒。
10.含有权利要求3-6中任一所述基因的重组细胞。
11.根据权利要求9所述的重组病毒，其特征在于：所述重组病毒为能够表达权利要求1或2所述ROR1特异性嵌合抗原受体，且能够侵染免疫效应细胞的病毒。
12.根据权利要求11所述的重组病毒，其特征在于：所述病毒为慢病毒、疱疹病毒、巨噬细胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或艾滋病毒。
13.根据权利要求10所述的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞为能够表达权利要求1或2所述ROR1特异性嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
14.根据权利要求13所述的重组细胞，其特征在于：所述免疫效应细胞为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、NK细胞或辅助性T细胞。
15.ROR1特异性CAR-T细胞的制备方法，包括在T细胞上表达权利要求1或2所述ROR1特异性嵌合抗原受体的步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)将能够表达所述ROR1特异性嵌合抗原受体的重组表达载体A和pSPAX2质粒以及pMD2.G质粒共转染293T细胞，获得病毒上清；所述重组表达载体A为将权利要求3-6中任一所述基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP后得到的重组质粒；(2)用所述病毒上清感染T细胞，从感染后的细胞中获得表达所述ROR1特异性嵌合抗原受体的T细胞。
17.权利要求1或2所述的ROR1特异性嵌合抗原受体或权利要求3-6中任一所述的基因或权利要求7所述的重组载体或权利要求8所述的表达盒或权利要求9或11或12所述的重组病毒或权利要求10或13或14所述的重组细胞在制备用于治疗肿瘤的产品中的应用。
18.权利要求1或2所述的ROR1特异性嵌合抗原受体或权利要求3-6中任一所述的基因或权利要求7所述的重组载体或权利要求8所述的表达盒或权利要求9或11或12所述的重组病毒或权利要求10或13或14所述的重组细胞在制备用于杀伤表达ROR1蛋白的肿瘤细胞的产品中的应用。
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