CN111378690B - 一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法 - Google Patents

一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111378690B
CN111378690B CN202010244429.0A CN202010244429A CN111378690B CN 111378690 B CN111378690 B CN 111378690B CN 202010244429 A CN202010244429 A CN 202010244429A CN 111378690 B CN111378690 B CN 111378690B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
antigen receptor
chimeric antigen
plasmid
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010244429.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111378690A (zh
Inventor
唐东起
李世武
杨木
张文
刘江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Dahua Kaike Biological Group Co ltd
Original Assignee
Second Hospital of Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Hospital of Shandong University filed Critical Second Hospital of Shandong University
Priority to CN202010244429.0A priority Critical patent/CN111378690B/zh
Publication of CN111378690A publication Critical patent/CN111378690A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111378690B publication Critical patent/CN111378690B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：嵌合抗原受体慢病毒质粒的构建；慢病毒的制备；原代CD3+T细胞的筛选；原代CD3+T细胞的感染，感染后即得嵌合抗原受体T细胞。本发明中嵌合抗原受体T细胞的制备方法经过优化，省去了T细胞体外活化及扩增培养的步骤，T细胞离体培养时间大大缩短，节省了大量时间，有助于降低T细胞在体外培养污染的可能性，使得嵌合抗原受体T细胞制备过程更加快捷，能够限制T细胞的分化，最大程度发挥嵌合抗原受体T细胞的杀伤作用，本发明制备的嵌合抗原受体T细胞比采用常规方法制备的嵌合抗原受体T细胞杀伤能力更强、治疗效果更佳。

Description

一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，属于细胞免疫技术领域。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫治疗已被证实在B细胞恶性肿瘤的患者中有较好的临床疗效。嵌合抗原受体T细胞是从患者血液中提出T细胞，在体外改造细胞使之细胞表面表达嵌合抗原受体，并大量扩增和回输至患者体内。其最终目标是根除癌细胞并提供较长时间的免疫记忆。CAR-T治疗后的患者会有复发的情况出现，其中一个原因为肿瘤微环境会抑制T细胞的增殖和杀伤作用。CAR-T治疗的有效性最重要的一点是CAR-T细胞可以高效的转运/迁移到肿瘤部位，并在肿瘤刺激后具有持续增殖的能力以及强大的杀伤肿瘤的能力。
在利用嵌合抗原受体T细胞进行疾病治疗时，常见的作用靶标包括CD19、CD20和CD30。CD19是大多数B细胞恶性肿瘤表面的标志物，因此以CD19为靶标的CAR-T目前常应用于CD19阳性的复发性B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的患者。MSKCC(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)和FHCRC(Fred Hutchinson Cancer Research Center)两个机构分别进行了49例和26例成人急性淋巴细胞白血病，有效应答率分别为82.2％和83.3％，取得了良好成效。CD20是一种在大多数B细胞上表达的细胞表面抗原，但在淋巴样干细胞、大多数浆细胞都不表达CD20。CD30是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员。针对CD30的抗体药物结合物brentuximabvedotin(BV)在CD30+淋巴瘤中确实显示出良好的疗效，总应答率为75％，并且完全复发或难治性霍奇金淋巴瘤患者的缓解率为34％。因此CD20和CD30也是淋巴瘤中有效的靶标。
中国专利文献CN109468282A(申请号201811397455.6)公开了一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，该制备方法包括CD19-CAR慢病毒载体的构建，慢病毒的制备，T细胞的分离和培养，T细胞的感染和扩增，病毒感染T细胞后，需培养7-10天，以获得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞。现有技术中CAR-T细胞的制备会将T细胞离体培养2周左右以扩增CAR-T细胞数量来增强疗效，但是，长时间的体外培养会增加CAR-T细胞的分化，降低CAR-T细胞的杀伤能力。目前虽然CAR-T细胞制备方法已经很完善，但想要大规模生产CAR-T细胞，时间短，安全性高就成为CAR-T细胞研究的一个重要方向。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法。本发明的目的在于减少嵌合抗原受体T细胞的体外培养时间，利用低分化的嵌合抗原受体T细胞提高CAR-T细胞治疗的效力，更有效地杀伤肿瘤。
本发明的技术方案如下：
一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：
嵌合抗原受体慢病毒质粒的构建；
慢病毒的制备；
原代CD3+T细胞的筛选；
原代CD3+T细胞的感染，感染后即得嵌合抗原受体T细胞。
本发明在制备嵌合抗原受体T细胞的过程中，省去了T细胞体外活化及扩增培养的步骤，节省了嵌合抗原受体T细胞的制备时间，降低了污染风险，减少了细胞分化，提高了治疗效果。
根据本发明优选的，所述嵌合抗原受体慢病毒质粒是将嵌合抗原受体基因与慢病毒表达载体经双酶切、连接后得到的。
进一步优选的，所述慢病毒表达载体为pLVX-IRES-Puro质粒或Lenti-EF1-EGFRvIII质粒。
根据本发明优选的，所述慢病毒是将嵌合抗原受体慢病毒质粒与辅助质粒混合后转染293ft细胞培养得到的。
进一步优选的，所述辅助质粒为psPAX2质粒和pMD2.G质粒。
根据本发明优选的，所述原代CD3+T细胞是从血液外周血单个核细胞中采用CD3+T细胞分选磁珠筛选得到。
根据本发明优选的，所述感染是将慢病毒与原代CD3+T细胞进行共培养，所述共培养的时间为4～10小时，共培养结束后即得嵌合抗原受体T细胞；进一步优选共培养的时间为4～7小时，最优选为4小时。
进一步优选的，所述慢病毒的MOI值为15～25。
本发明中一种优选的技术方案为靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备，包括步骤如下：
(1)全基因合成靶向CD19的嵌合抗原受体基因，所述靶向CD19的嵌合抗原受体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将靶向CD19的嵌合抗原受体基因与慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro质粒经双酶切、连接后得到靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒质粒；
(2)将步骤(1)的靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒质粒与辅助质粒psPAX2质粒、pMD2.G质粒混合后转染293ft细胞培养得到慢病毒；
(3)从血液样本的外周血单个核细胞中采用CD3+T细胞分选磁珠筛选得到原代CD3+T细胞；
(4)将步骤(2)中的慢病毒与步骤(3)的原代CD3+T细胞进行共培养，所述共培养的时间为4～10小时，共培养结束后即得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞。
本发明中一种优选的技术方案为靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备，包括步骤如下：
1)全基因合成靶向CD20的嵌合抗原受体基因，所述靶向CD20的嵌合抗原受体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，将靶向CD20的嵌合抗原受体基因与慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro质粒经双酶切、连接后得到靶向CD20的嵌合抗原受体慢病毒质粒；
2)将步骤1)的靶向CD20的嵌合抗原受体慢病毒质粒与辅助质粒psPAX2质粒、pMD2.G质粒混合后转染293ft细胞培养得到慢病毒；
3)从血液样本的外周血单个核细胞中采用CD3+T细胞分选磁珠筛选得到原代CD3+T细胞；
4)将步骤2)中的慢病毒与步骤3)的原代CD3+T细胞进行共培养，所述共培养的时间为4～10小时，共培养结束后即得靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞。
本发明中未作详细描述的实验步骤均按照本领域常规操作进行。
有益效果：
1.本发明中嵌合抗原受体T细胞的制备方法经过优化，省去了T细胞体外活化及扩增培养的步骤，本发明意外发现，经感染后得到的嵌合抗原受体T细胞在回输至体内后也可以实现T细胞的体内扩增，T细胞离体培养时间大大缩短，节省了大量时间，有助于降低T细胞在体外培养污染的可能性，使得嵌合抗原受体T细胞制备过程更加快捷，降低了CAR-T细胞治疗时所需要的CAR-T细胞数量，缩短了T细胞回输至体内所需要的时间。
2.本发明在制备嵌合抗原受体T细胞的过程中大大缩短了T细胞离体培养活化的时间，能够限制T细胞的分化，最大程度发挥嵌合抗原受体T细胞的杀伤作用，本发明制备的嵌合抗原受体T细胞比采用常规方法制备的嵌合抗原受体T细胞杀伤能力更强、治疗效果更佳。
附图说明
图1为实施例1和对比例1CD19CAR-T细胞的制备时间柱状图；
图2为实施例1和对比例1CD19CAR-T细胞的杀伤实验效果对比图；
图3为实施例2和对比例2CD20CAR-T细胞的动物实验肿瘤大小成像图；
图4为实施例2和对比例2CD20CAR-T细胞的动物实验小鼠生存曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明作进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例中涉及的材料及试剂盒，若无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例中的室温具有本领域公认的含义，一般是指25±2℃。
实施例1.
一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：
(1)pLVX-CD19CAR质粒构建：
全基因合成CD19CAR质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，上述核苷酸序列中含有IgK leader、avidin、CD28跨膜区、T2A序列及Firefly来源的Luciferase，同时设计上下游酶切位点分别为XhoI和BamHI；用XhoI和BamHI双酶切上述CD19CAR质粒和慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro质粒；切胶回收，连接，得到靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒质粒pLVX-CD19CAR质粒；
(2)质粒大提：将步骤(1)得到的pLVX-CD19CAR质粒转化stbl3感受态细胞，挑取单克隆至200mL LB培养基，过夜培养，利用天根质粒大提试剂盒提取质粒，测得质粒浓度大于1.0μg/μL；
(3)病毒包装：
a)制备A液：将1.2mL Opti-MEM培养基加入1.5mL离心管中，并加入10μg步骤(2)提取得到的pLVX-CD19CAR质粒和7.5μg psPAX2质粒、2.5μg pMD2.G质粒，涡旋振荡5-10s以彻底混匀；
b)制备B液：取1.2mL Opti-MEM培养基加入1.5mL离心管中，并加入100μLlipo3000(p3000 50μL+lipo3000 50μL)，涡旋振荡5-10s；
c)将A液和B液1:1(v/v)混合，室温放置20分钟；
d)293ft细胞准备：将293ft细胞培养于10cm培养皿，培养至细胞密度为60-70％；
e)将步骤c)A液和B液的混合液均匀滴在步骤d)的10cm培养皿中，静置3-5min，轻轻摇匀，37℃培养箱培养2天；
f)300rcf离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液，得CD19CAR慢病毒，分装置于-80℃保存；
(4)原代CD3+T细胞筛选
1)收集血液样本中的外周血单个核细胞(PBMC细胞)，计数板计数，并采用磷酸盐缓冲液(PH 7.2)重悬得细胞悬液；
2)将一定剂量的CD3+T细胞分选磁珠加入细胞悬液中，每107个PBMC细胞加入15μLCD3+T细胞分选磁珠(品牌为invitrogen)，充分混合，静置10min；
3)将分选柱放于分选架上，用0.5mL buffer(磷酸盐缓冲液+0.5％牛血清白蛋白(BSA)+0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA))冲洗分选柱；
4)将步骤2)中加入了CD3+T细胞分选磁珠的细胞悬液过步骤3)分选柱，弃过柱液；
5)将分选柱取下，用磷酸盐缓冲液冲洗分选柱，将分选柱中的T细胞冲入培养瓶/皿中，加入淋巴细胞完全培养基培养；
6)细胞计数，得原代CD3+T细胞；
(5)慢病毒感染CD3+T细胞
将步骤(4)得到的原代CD3+T细胞铺板于12孔培养板中，加入步骤(3)得到的CD19CAR慢病毒，每孔加入8μL，其中MOI为20，在培养箱中共培养4小时，即得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(CD19CAR-T细胞)，用磁力分选架除去CD3+T细胞分选磁珠。
对比例1.
按照常规方法制备靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞，其制备方法中步骤(1)～(4)与实施例1相同，包括步骤如下：
(1)pLVX-CD19CAR质粒构建：
全基因合成CD19CAR质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，上述核苷酸序列中含有IgK leader、avidin、CD28跨膜区、T2A序列及Firefly来源的Luciferase，同时设计上下游酶切位点分别为XhoI和BamHI；用XhoI和BamHI双酶切上述CD19CAR质粒和慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro质粒；切胶回收，连接，得到靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒质粒pLVX-CD19CAR质粒；
(2)质粒大提：将步骤(1)得到的pLVX-CD19CAR质粒转化stbl3感受态细胞，挑取单克隆至200mL LB培养基，过夜培养，利用天根质粒大提试剂盒提取质粒，测得质粒浓度大于1.0μg/μL；
(3)病毒包装：
a)制备A液：将1.2mL Opti-MEM培养基加入1.5mL离心管中，并加入10μg步骤(2)提取得到的pLVX-CD19CAR质粒和7.5μg psPAX2质粒、2.5μg pMD2.G质粒，涡旋振荡5-10s以彻底混匀；
b)制备B液：取1.2mL Opti-MEM培养基加入1.5mL离心管中，并加入100μLlipo3000(p3000 50μL+lipo3000 50μL)，涡旋振荡5-10s；
c)将A液和B液1:1(v/v)混合，室温放置20分钟；
d)293ft细胞准备：将293ft细胞培养于10cm培养皿，培养至细胞密度为60-70％；
e)将步骤c)A液和B液的混合液均匀滴在步骤d)的10cm培养皿中，静置3-5min，轻轻摇匀，37℃培养箱培养2天；
f)300rcf离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液，得CD19CAR慢病毒，分装置于-80℃保存；
(4)原代CD3+T细胞筛选
1)收集血液样本中的外周血单个核细胞(PBMC细胞)，计数板计数，并采用磷酸盐缓冲液(PH 7.2)重悬得细胞悬液；
2)将一定剂量的CD3+T细胞分选磁珠加入细胞悬液中，每107个PBMC细胞加入15μLCD3+T细胞分选磁珠(品牌为invitrogen)，充分混合，静置10min；
3)将分选柱放于分选架上，用0.5mL buffer(磷酸盐缓冲液+0.5％牛血清白蛋白(BSA)+0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA))冲洗分选柱；
4)将步骤2)中加入了CD3+T细胞分选磁珠的细胞悬液过步骤3)分选柱，弃过柱液；
5)将分选柱取下，用磷酸盐缓冲液冲洗分选柱，将分选柱中的T细胞冲入培养瓶/皿中，加入淋巴细胞完全培养基培养；
6)细胞计数，得原代CD3+T细胞；
(5)CD3+T细胞的感染与培养
i)将步骤(4)得到的原代CD3+T细胞，铺板于12孔培养板中，每孔中加入DynabeadsCD3/CD28活化；
ii)磷酸盐缓冲液稀释RetroNectin至4μg/mL，加入24孔培养板中，0.5mL/孔，室温孵育2小时；
iv)弃去RetroNectin，每孔加0.5mL含2％牛血清白蛋白(BSA，品牌为索莱宝)的磷酸盐缓冲液，室温孵育30分钟；
v)将步骤(3)得到的CD19CAR慢病毒按照MOI＝20加入RetroNectin包被的24孔培养板中，3000rpm，26℃离心3小时；
vi)将步骤i)活化后的CD3+T细胞加入步骤v)中已包被CD19CAR慢病毒的24孔培养板中，CD3+T细胞加量为5×105个/孔，3000rpm，32℃，离心2h；
vii)放于培养箱(5％CO2，37℃)培养12天，隔天每孔补培养基50μL，即得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(CD19CAR-T细胞)，用磁力分选架除去CD3+T细胞分选磁珠。
实施例1和对比例1中，从原代CD3+T细胞的筛选到慢病毒感染CD3+T细胞形成靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(CD19CAR-T细胞)，所需时间的对比如图1所示，在形成CD19CAR-T细胞的时间上，实施例1比对比例1节约了约90％的时间。
实验例1.CD19CAR-T细胞杀伤检测
复苏Raji-luc细胞(荧光素酶标记的淋巴瘤细胞)，加入RPMI-1640完全培养基和1％双抗，并在37℃、5％CO2培养箱中培养并传代，待细胞处于生长对数期，取出Raji-luc细胞，铺在24孔培养板中，每孔加入1×105个Raji-luc细胞和X-VIVO15无血清细胞培养基150μL。
将实施例1得到的CD19CAR-T细胞和实施例2得到的CD19CAR-T细胞分别加入到上述含有Raji-luc细胞的24孔培养板中，加量为5×105个/孔，与铺好的Raji-luc细胞混合，在37℃、5％CO2培养箱中培养，分别在12小时、24小时取100μL上清检测荧光值(使用promoga试剂盒)，结果如图2所示。
Raji-luc细胞是被荧光素酶标记的淋巴瘤细胞，Raji-luc细胞被CD19CAR-T细胞杀伤后，细胞内部的荧光素酶分泌到胞外，通过检测细胞培养上清液中荧光值的大小判断CD19CAR-T细胞的杀伤能力。从图2中可以看出，CD19CAR-T细胞与Raji-luc细胞共培养12小时后，实施例1的CD19CAR-T细胞的杀伤能力高于对比例1的CD19CAR-T细胞，共培养24小时后，实施例1的CD19CAR-T细胞的杀伤能力显著高于对比例1的CD19CAR-T细胞，说明按照本发明的制备方法制备得到的CD19CAR-T细胞不仅大大缩短了制备时间，其肿瘤细胞的杀伤能力也大大增强。
实施例2.
一种靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：
(1)pLVX-CD20CAR质粒构建：
全基因合成CD20CAR质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，上述核苷酸序列中含有IgK leader、avidin、CD28跨膜区、T2A序列及Firefly来源的Luciferase，同时设计上下游酶切位点分别为XhoI和BamHI；用XhoI和BamHI双酶切上述CD20CAR质粒和慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro质粒；切胶回收，连接，得到靶向CD20的嵌合抗原受体慢病毒质粒pLVX-CD20CAR质粒；
(2)质粒大提：将步骤(1)得到的pLVX-CD20CAR质粒转化stbl3感受态细胞，挑取单克隆至200mL LB培养基，过夜培养，利用天根质粒大提试剂盒提取质粒，测得质粒浓度大于1.0μg/μL；
(3)病毒包装：
a)制备A液：将1.2mL Opti-MEM培养基加入1.5mL离心管中，并加入10μg步骤(2)提取得到的pLVX-CD20CAR质粒和7.5μg psPAX2质粒、2.5μg pMD2.G质粒，涡旋振荡5-10s以彻底混匀；
b)制备B液：取1.2mL Opti-MEM培养基加入1.5mL离心管中，并加入100μLlipo3000(p3000 50μL+lipo3000 50μL)，涡旋振荡5-10s；
c)将A液和B液1:1(v/v)混合，室温放置20分钟；
d)293ft细胞准备：将293ft细胞培养于10cm培养皿，培养至细胞密度为60-70％；
e)将步骤c)A液和B液的混合液均匀滴在步骤d)的10cm培养皿中，静置3-5min，轻轻摇匀，37℃培养箱培养2天；
f)350rcf离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液，得CD20CAR慢病毒，分装置于-80℃保存。
(4)原代CD3+T细胞筛选
1)收集血液样本中的外周血单个核细胞(PBMC细胞)，计数板计数，并采用磷酸盐缓冲液(PH 7.2)重悬得细胞悬液；
2)将一定剂量的CD3+T细胞分选磁珠加入细胞悬液中，每107个PBMC细胞加入15μLCD3+T细胞分选磁珠(品牌为invitrogen)，充分混合，静置10min；
3)将分选柱放于分选架上，用0.5mL buffer(磷酸盐缓冲液+0.5％牛血清白蛋白(BSA)+0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA))冲洗分选柱；
4)将步骤2)中加入了CD3+T细胞分选磁珠的细胞悬液过步骤3)分选柱，弃过柱液；
5)将分选柱取下，用磷酸盐缓冲液冲洗分选柱，将分选柱中的T细胞冲入培养瓶/皿中，加入淋巴细胞完全培养基培养；
6)将细胞计数，得原代CD3+T细胞；
(5)慢病毒感染CD3+T细胞
将步骤(4)得到的原代CD3+T细胞铺板于12孔板中，加入步骤(3)得到的CD20CAR慢病毒，每孔加入8μL，其中MOI为20，在培养箱中共培养4小时，即得靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞(CD20CAR-T细胞)，用磁力分选架除去CD3+T细胞分选磁珠。
对比例2.
按照常规方法制备靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞，其制备方法中步骤(1)～(4)与实施例2相同，包括步骤如下：
(1)PLVX-CD20CAR质粒构建：
全基因合成CD20CAR质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，上述核苷酸序列中含有IgK leader、avidin、CD28跨膜区、T2A序列及Firefly来源的Luciferase，同时设计上下游酶切位点分别为XhoI和BamHI；用XhoI和BamHI双酶切上述CD20CAR质粒和慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro质粒；切胶回收，连接，得到靶向CD20的嵌合抗原受体慢病毒质粒pLVX-CD20CAR质粒；
(2)质粒大提：将步骤(1)得到的PLVX-CD20CAR质粒转化stbl3感受态细胞，挑取单克隆至200mL LB培养基，过夜培养，利用天根质粒大提试剂盒提取质粒，测得质粒浓度大于1.0μg/μL；
(3)病毒包装：
a)制备A液：将1.2mL Opti-MEM培养基加入1.5mL离心管中，并加入10μg步骤(2)提取得到的pLVX-CD20CAR质粒和7.5μg psPAX2质粒、2.5μg pMD2.G质粒，涡旋振荡5-10s以彻底混匀；
b)制备B液：取1.2mL Opti-MEM培养基加入1.5mL离心管中，并加入100μLlipo3000(p3000 50μL+lipo3000 50μL)，涡旋振荡5-10s；
c)将A液和B液1:1(v/v)混合，室温放置20分钟；
d)293ft细胞准备：将293ft细胞培养于10cm培养皿，培养至细胞密度为60-70％；
e)将步骤c)A液和B液的混合液均匀滴在步骤d)的10cm培养皿中，静置3-5min，轻轻摇匀，37℃培养箱培养2天；
f)300rcf离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液，得CD20CAR慢病毒，分装置于-80℃保存；
(4)原代CD3+T细胞筛选
1)收集血液样本中的外周血单个核细胞(PBMC细胞)，计数板计数，并采用磷酸盐缓冲液重悬得细胞悬液；
2)将一定剂量的CD3+T细胞分选磁珠加入细胞悬液中，每107个PBMC细胞加入15μLCD3+T细胞分选磁珠(品牌为invitrogen)，充分混合，静置10min；
3)将分选柱放于分选架上，用0.5mL buffer(磷酸盐缓冲液+0.5％牛血清白蛋白(BSA)+0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA))冲洗分选柱；
4)将步骤2)中加入了CD3+T细胞分选磁珠的细胞悬液过步骤3)分选柱，弃过柱液；
5)将分选柱取下，用磷酸盐缓冲液冲洗分选柱，将分选柱中的T细胞冲入培养瓶/皿中，加入淋巴细胞完全培养基培养；
6)细胞计数，得原代CD3+T细胞；
(5)CD3+T细胞的感染与培养
i)将步骤(4)得到的原代CD3+T细胞，铺板于12孔培养板中，每孔中加入DynabeadsCD3/CD28活化；
ii)磷酸盐缓冲液稀释RetroNectin至4μg/mL，加入24孔培养板中，0.5mL/孔，室温孵育2小时；
iv)弃去RetroNectin，每孔加0.5mL含2％牛血清白蛋白(BSA，品牌为索莱宝)的磷酸盐缓冲液，室温孵育30分钟；
v)将步骤(3)得到的CD20CAR慢病毒按照MOI＝20加入RetroNectin包被的24孔培养板中，3000rpm，26℃离心3小时；
vi)将步骤i)活化后的CD3+T细胞加入步骤v)中已包被CD20CAR慢病毒的24孔培养板中，CD3+T细胞加量为5×105个/孔，3000rpm，32℃，离心2h；
vii)放于培养箱(5％CO2，37℃)培养12天，隔天每孔补培养基50μL，即得靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞(CD20CAR-T细胞)，用磁力分选架除去CD3+T细胞分选磁珠。
实验例2.
选用雄性NSG小鼠(8周)，NSG小鼠处于SPF环境中喂养；按照常规方法培养Raji-luc细胞(荧光素酶标记的淋巴瘤细胞)，收集Raji-luc细胞，磷酸盐缓冲液重悬Raji-luc细胞；每只NSG小鼠尾静脉注射2×106个Raji-luc细胞，标为Day 0(第0天)，构建淋巴瘤小鼠模型；喂养至第三天(Day 3)，将淋巴瘤模型小鼠随机分为三组，其中两组分别尾静脉注射实施例2和对比例2制备得到的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞(CD20CAR-T细胞)，注射量均为2×106个CD20CAR-T细胞/只小鼠，第三组不做任何处理，为对照组。
喂养至第十天(Day 10)，分别给予对照组小鼠、注射了实施例2和对比例2的CD20CAR-T细胞的小鼠尾静脉注射荧光素酶反应底物100μL，置于小动物成像仪中进行荧光成像，成像结果如图3所示，荧光面积代表小鼠的肿瘤面积和大小，在图3中可以清晰看出，在注射入相应组别的CD20CAR-T细胞后，实施例2和对比例2的肿瘤面积显著比对照组小，并且实施例2的肿瘤面积比对比例2小，说明实施例2中的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞(CD20CAR-T细胞)比对比例2的杀伤效果好。
观察小鼠生存状态，记录对照组小鼠、注射了实施例2和对比例2的CD20CAR-T细胞的小鼠的生存时间，组别内小鼠全部存活时，记为100％存活率；组别内小鼠全部死亡时，记为0％存活率，小鼠生存曲线如图4所示，注射了实施例2和对比例2的CD20CAR-T细胞的小鼠要比对照组存活时间长，其中注射了实施例2的CD20CAR-T细胞的小鼠要比注射了对比例2的CD20CAR-T细胞的小鼠的存活时间长，说明实施例2中的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞(CD20CAR-T细胞)比对比例2的杀伤效果好。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学第二医院
<120> 一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2497
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctcgagatgg agacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc 60
actggtgact atccatatga tgttccagat tatgctgggg cccagccggc cagatctatg 120
gcggaagcgg gtatcaccgg cacgtggtac aaccagtctg gttctacctt caccgttacc 180
gcgggtgcgg acggtaacct gaccggtcag tacgaaaacc gtgcgcaggg cactggttgc 240
cagcactctc cgtacaccct gaccggtcgt tacaacggta ccaaactgga atggcgtgtt 300
gaatggaaca actctaccga aaactgccac tctcgtaccg aatggcgtgg tcagtaccag 360
ggtggtgcgg aagcgcgtat caacacccag tggaacctga cctacgaagg tggttctggt 420
ccggcgaccg aacagggtca ggacaccttc accaaagtta aaccgtctgc ggcgtctgac 480
tacaaggacg atgacgacaa gggcgcgccg tcattcattg aagttatgta tcctcctcct 540
tacctagaca atgagaagag caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt 600
ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga 660
gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 720
aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 780
acccgcaagc atgaaggtag aggtagtctc ctcacatgtg gcgatgtaga agagaaccct 840
ggtccgatgg aagatgccaa aaacattaag aaaggcccag cgccattcta cccactcgaa 900
gacgggaccg ctggcgagca gaagccatga agcgctacgc cctggtgccc ggcaccatcg 960
cctttaccga cgcacatatc gaggtggaca ttacctacgc cgagtacttc gagatgagcg 1020
ttcggctggc agaagctatg aagcgctatg ggctgaatac aaaccatcgg atcgtggtgt 1080
gtagcgagaa tagcttgcag ttcttcatgc ccgtgttggg tgccctgttc atcggtgtgg 1140
ctgtggcccc agctaacgac atctacaacg agcgcgagct gctgaacagc atgggcatca 1200
gccagcccac cgtcgtattc gtgagcaaga aagggctgca aaagatcctc aacgtgcaaa 1260
agaagctacc gatcatacaa aagatcatca tcatggatag caagaccgac taccagggct 1320
tccaaagcat gtacaccttc gtgacttccc atttgccacc cggcttcaac gagtacgact 1380
tcgtgcccga gagcttcgac cgggacaaaa ccatcgccct gatcatgaac agtagtggca 1440
gtaccggatt gcccaagggc gtagccctac cgcaccgcac cgcttgtgtc cgattcagtc 1500
atgcccgcga ccccatcttc ggcaaccaga tcatccccga caccgctatc ctgagcgtgg 1560
tgccatttca ccacggcttc ggcatgttca ccacgcgggc tacttgatct gcggctttcg 1620
ggtcgtgctc atgtaccgct tcgaggaaga gctattcttg cgcagcttgc aagactataa 1680
gattcaatct gccctgctgg tgcccacact atttagcttc ttcgctaaga gcactctcat 1740
cgacaagtac gacctaagca acttgcacga gatcgccagc ggcggggcgc cgctcagcaa 1800
ggaggtaggt gaggccgtgg ccaaacgctt ccacctacca ggcatccgcc agggctacgg 1860
cctgacagaa acaaccagcg ccattctgat cacccccgaa ggggacgaca agcctggcgc 1920
agtaggcaag gtggtgccct tcttcgaggc taaggtggtg gacttggaca ccggtaagac 1980
actgggtgtg aaccagcgcg gcgagctgtg cgtccgtggc cccatgatca tgagcggcta 2040
cgttaacaac cccgaggcta caaacgctct catcgacaag gacggctggc tgcatagcgg 2100
cgacatcgcc tactgggacg aggacgagca cttcttcatc gtggaccggc tgaagagcct 2160
gatcaaatac aagggctacc aggtagcccc agccgaactg gagagcatcc tgctgcaaca 2220
ccccaacatc ttcgacgccg gggtcgccgg cctgcccgac gacgatgccg gcgagctgcc 2280
cgccgcagtc gtcgtgctgg aacacggtaa aaccatgacc gagaaggaga tcgtggacta 2340
tgtggccagc caggttacaa ccgccaagaa gctgcgcggt ggtgttgtgt tcgtggacga 2400
ggtgcctaaa ggactgaccg gcaagttgga cgcccgcaag atccgcgaga ttctcattaa 2460
ggccaagaag ggcggcaaga tcgccgtcta gggatcc 2497
<210> 2
<211> 2314
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctccgacgac acggccattt actactgcgc gaaaattact attacggtgg cagctacgca 60
atggactact ggggccaggg tacatccgtc acctgagctc aacaactaca ccagcgcccc 120
gcccccctac cccggcaccc acaatcgcca gtcagccact ctccctgaga ccagaagcct 180
gcagacccgc cgccggcgga gctgtccaca cccgaggcct cgatttcgca tgcgacatct 240
atatttgggc tcctctggca ggcacctgtg gggtacttct gctctcactg gttatcaccc 300
tttactgccg gtccaagcgc agtcggctgc ttcactccga ctatatgaac atgaccccaa 360
ggaggcccgg ccccactaga aagcactatc agccttacgc tcccccgaga gacttcgccg 420
cctacagatc caaacggggc agaaagaccc ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc 480
ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag 540
aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc 600
cgcaagcatg aaggtagagg tagtctcctc acatgtggcg atgtagaaga gaaccctggt 660
ccgatggaag atgccaaaaa cattaagaaa ggcccagcgc cattctaccc actcgaagac 720
gggaccgctg gcgagcagaa gccatgaagc gctacgccct ggtgcccggc accatcgcct 780
ttaccgacgc acatatcgag gtggacatta cctacgccga gtacttcgag atgagcgttc 840
ggctggcaga agctatgaag cgctatgggc tgaatacaaa ccatcggatc gtggtgtgta 900
gcgagaatag cttgcagttc ttcatgcccg tgttgggtgc cctgttcatc ggtgtggctg 960
tggccccagc taacgacatc tacaacgagc gcgagctgct gaacagcatg ggcatcagcc 1020
agcccaccgt cgtattcgtg agcaagaaag ggctgcaaaa gatcctcaac gtgcaaaaga 1080
agctaccgat catacaaaag atcatcatca tggatagcaa gaccgactac cagggcttcc 1140
aaagcatgta caccttcgtg acttcccatt tgccacccgg cttcaacgag tacgacttcg 1200
tgcccgagag cttcgaccgg gacaaaacca tcgccctgat catgaacagt agtggcagta 1260
ccggattgcc caagggcgta gccctaccgc accgcaccgc ttgtgtccga ttcagtcatg 1320
cccgcgaccc catcttcggc aaccagatca tccccgacac cgctatcctg agcgtggtgc 1380
catttcacca cggcttcggc atgttcacca cgcgggctac ttgatctgcg gctttcgggt 1440
cgtgctcatg taccgcttcg aggaagagct attcttgcgc agcttgcaag actataagat 1500
tcaatctgcc ctgctggtgc ccacactatt tagcttcttc gctaagagca ctctcatcga 1560
caagtacgac ctaagcaact tgcacgagat cgccagcggc ggggcgccgc tcagcaagga 1620
ggtaggtgag gccgtggcca aacgcttcca cctaccaggc atccgccagg gctacggcct 1680
gacagaaaca accagcgcca ttctgatcac ccccgaaggg gacgacaagc ctggcgcagt 1740
aggcaaggtg gtgcccttct tcgaggctaa ggtggtggac ttggacaccg gtaagacact 1800
gggtgtgaac cagcgcggcg agctgtgcgt ccgtggcccc atgatcatga gcggctacgt 1860
taacaacccc gaggctacaa acgctctcat cgacaaggac ggctggctgc atagcggcga 1920
catcgcctac tgggacgagg acgagcactt cttcatcgtg gaccggctga agagcctgat 1980
caaatacaag ggctaccagg tagccccagc cgaactggag agcatcctgc tgcaacaccc 2040
caacatcttc gacgccgggg tcgccggcct gcccgacgac gatgccggcg agctgcccgc 2100
cgcagtcgtc gtgctggaac acggtaaaac catgaccgag aaggagatcg tggactatgt 2160
ggccagccag gttacaaccg ccaagaagct gcgcggtggt gttgtgttcg tggacgaggt 2220
gcctaaagga ctgaccggca agttggacgc ccgcaagatc cgcgagattc tcattaaggc 2280
caagaagggc ggcaagatcg ccgtctaggg atcc 2314

Claims (9)

1.一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：
嵌合抗原受体慢病毒质粒的构建；
慢病毒的制备；
原代CD3+T细胞的筛选；
原代CD3+T细胞的感染，感染后即得嵌合抗原受体T细胞；所述感染是将慢病毒与原代CD3+T细胞进行共培养，所述共培养的时间为4～10小时，共培养结束后即得嵌合抗原受体T细胞；
经感染后得到的嵌合抗原受体T细胞直接回输至体内。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体慢病毒质粒是将嵌合抗原受体基因与慢病毒表达载体经双酶切、连接后得到的。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体为pLVX-IRES-Puro质粒或Lenti-EF1-EGFRvIII质粒。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒是将嵌合抗原受体慢病毒质粒与辅助质粒混合后转染293ft细胞培养得到的。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述辅助质粒为psPAX2质粒和pMD2.G质粒。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原代CD3+T细胞是从血液外周血单个核细胞中采用CD3+T细胞分选磁珠筛选得到。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒的MOI值为15～25。
8.一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：
(1)全基因合成靶向CD19的嵌合抗原受体基因，所述靶向CD19的嵌合抗原受体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将靶向CD19的嵌合抗原受体基因与慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro质粒经双酶切、连接后得到靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒质粒；
(2)将步骤(1)的靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒质粒与辅助质粒psPAX2质粒、pMD2.G质粒混合后转染293ft细胞培养得到慢病毒；
(3)从血液样本的外周血单个核细胞中采用CD3+T细胞分选磁珠筛选得到原代CD3+T细胞；
(4)将步骤(2)中的慢病毒与步骤(3)的原代CD3+T细胞进行共培养，所述共培养的时间为4～10小时，共培养结束后即得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞；所得嵌合抗原受体T细胞直接回输至体内。
9.一种靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：
1)全基因合成靶向CD20的嵌合抗原受体基因，所述靶向CD20的嵌合抗原受体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，将靶向CD20的嵌合抗原受体基因与慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro质粒经双酶切、连接后得到靶向CD20的嵌合抗原受体慢病毒质粒；
2)将步骤1)的靶向CD20的嵌合抗原受体慢病毒质粒与辅助质粒psPAX2质粒、pMD2.G质粒混合后转染293ft细胞培养得到慢病毒；
3)从血液样本的外周血单个核细胞中采用CD3+T细胞分选磁珠筛选得到原代CD3+T细胞；
4)将步骤2)中的慢病毒与步骤3)的原代CD3+T细胞进行共培养，所述共培养的时间为4～10小时，共培养结束后即得靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞；所得嵌合抗原受体T细胞直接回输至体内。
CN202010244429.0A 2020-03-31 2020-03-31 一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法 Active CN111378690B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010244429.0A CN111378690B (zh) 2020-03-31 2020-03-31 一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010244429.0A CN111378690B (zh) 2020-03-31 2020-03-31 一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111378690A CN111378690A (zh) 2020-07-07
CN111378690B true CN111378690B (zh) 2022-04-05

Family

ID=71220263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010244429.0A Active CN111378690B (zh) 2020-03-31 2020-03-31 一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111378690B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023240483A1 (zh) * 2022-06-15 2023-12-21 上海恒润达生生物科技股份有限公司 一种快速制备t细胞的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107098981B (zh) * 2017-06-29 2020-05-01 青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞
CN107287164A (zh) * 2017-07-07 2017-10-24 青岛协和华美医学诊断技术有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞、制备方法及应用
CN110526990A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 深圳宾德生物技术有限公司 靶向cd30的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109824781B (zh) * 2019-01-21 2022-07-19 卢英 抗人her 2抗原的特异性嵌合抗原受体、编码基因和表达载体以及应用
CN110129370B (zh) * 2019-05-06 2021-07-20 山东昂科诺生物科技有限公司 一种car-t毒性指示细胞的快速构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111378690A (zh) 2020-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019214290A1 (zh) 一种生产嵌合抗原受体修饰的γδT细胞的方法
CN106636090B (zh) 人源白细胞介素6的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用
CN105624107B (zh) 一种多种淋巴细胞亚群的扩增方法及其应用
CN110172479B (zh) 能同时表达lmp1和cd30双靶点car的质粒、car-t细胞、构建方法及其应用
CN111518773B (zh) 一种抗新型冠状病毒s蛋白的car-t细胞、制备方法及其应用
CN108300697A (zh) 一种滋养细胞刺激nk细胞扩增的方法和用途
WO2009139413A1 (ja) サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法
CN104910278B (zh) 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒
CN111566221A (zh) 用于nk细胞转导的方法
CN109265561B (zh) 抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及应用
CN107354133B (zh) 磁珠偶联多种刺激蛋白的体外扩增nk细胞的方法及应用
CN106279432B (zh) 一种vc-car分子及在清除hiv-1感染细胞中的应用
CN107699591A (zh) 一种敲除pd‑1的t细胞制备方法及其应用
CN114230658A (zh) 新型冠状病毒特异性t细胞受体和其用途
CN111378690B (zh) 一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法
CN109568351B (zh) 溶瘤病毒和car-t联合应用针对实体肿瘤的治疗
CN115505600B (zh) 一种慢病毒高效感染人nk细胞的方法
US20220177839A1 (en) Composition, culture medium and method for inducing and/or amplifying tscm in vitro
CN114921496B (zh) 一种具有nk细胞及adcc能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法及其应用
CN113122579B (zh) 一种慢病毒转染免疫细胞的方法
CN116003622A (zh) 一种用于卵巢癌治疗的嵌合抗原受体及其应用
CN109679917B (zh) 一种lrfft2细胞
CN109796536B (zh) 一种靶向胶质母细胞瘤多种抗原表位的ctl的制备方法
CN106480022B (zh) 干涉片段及其应用
CN116640229B (zh) 一种低pH靶向性CAR-T细胞的构建及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240102

Address after: Building 1-2403, Building 7, Shandong Design and Creative Industry Park (North Zone), No. 868 Tangye West Road, Licheng District, Jinan City, Shandong Province, 250000

Patentee after: Shandong Dahua Kaike Biological Group Co.,Ltd.

Address before: 250033 Shandong Province Flyover District of Ji'nan City Beiyuan Street No. 247

Patentee before: THE SECOND HOSPITAL OF SHANDONG University

TR01 Transfer of patent right