CN109824781B - 抗人her 2抗原的特异性嵌合抗原受体、编码基因和表达载体以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗人HER 2抗原的特异性嵌合抗原受体、编码基因和表达载体以及应用。所述抗人HER2嵌合抗原受体包括依次串联的人CD8 leader嵌合受体信号肽、抗人HER2单链抗体、人CD8α铰链区、人CD28胞内跨膜区、人41BB胞内区共刺激因子和人CD3ζ胞内信号传导结构域。本发明还提供了所述抗人HER2的嵌合抗原受体的编码序列、重组表达载体及其构建方法和应用。本发明提供的抗人HER2嵌合抗原受体能够稳定的表达于T淋巴细胞，能够特异性地识别并杀伤HER 2阳性的肿瘤细胞，提高治疗的安全作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。

Description

抗人HER 2抗原的特异性嵌合抗原受体、编码基因和表达载体 以及应用

技术领域

本发明属于生物与医药技术领域，涉及一种抗人HER 2抗原的特异性嵌合抗原受体、编码基因和表达载体以及应用。

背景技术

癌症是当今危害人类健康的主要疾病。2018年2月，国家癌症中心统计数据显示，我国平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症。癌症已成为最急需攻克的难题。

治疗肿瘤的方法主要包括传统和新型的治疗手段，传统的包括手术治疗、放射治疗、化疗，新型的治疗手段-精准治疗包括：单抗药、CAR-T细胞免疫治疗、基因编辑等。其中，细胞免疫疗法是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法，被称为治疗肿瘤的“第五大疗法”，是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗肿瘤。

细胞免疫疗法，2013-2015年，连续三年成为Nature、Science的热点；2015年-2017年，连续成为美国临床肿瘤学会(ASCO)、欧洲癌症大会(ECC)的亮点，嵌合抗原T细胞(CAR-T)疗法在2017年ASCO上被评选为肿瘤领域内最具影响力的技术。2018年10月，肿瘤免疫疗法美国科学家James P.Allison(詹姆斯·艾利森)和日本科学家Tasuku Honjo(本庶佑)获得诺贝尔医学和生理学奖。

嵌合抗原Chimeric antigen receptor(CAR)修饰的T细胞(CAR-T)是将能识别肿瘤特异性抗原的scFv(单链抗体结构域)片段通过基因工程化改造，与T细胞活化基序相结合。修饰后的T细胞以抗原依赖，但非MHC限制方式结合特异识别肿瘤细胞标志物，具有更强的肿瘤靶向和杀伤活性。

在CAR-T免疫疗法中，CAR的作用至关重要。CAR由胞外抗原结合区的单链抗体结构域(scFv)、跨膜结构域、胞内信号结构域依次组成。其中，单链抗体结构域将免疫细胞靶向目标细胞，胞内信号结构域释放胞内信号，启动免疫细胞的杀伤活性。通过将识别肿瘤相关抗原的scFv和胞内信号域免疫受体酪氨酸活化基序在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到T细胞，激活T细胞分泌细胞因子包括穿孔素、颗粒酶、INF-γ、TNF-a等，从而发挥杀伤肿瘤细胞作用。CAR-T细胞是MHC非限制性的，CAR-T细胞将抗体-抗原特异性结合的能力以及T细胞介导的杀伤功能结合于一体，核心在于能够发挥特异性抗原活性的肿瘤相关抗原，其高表达于肿瘤细胞表面，在正常组织中不表达或低表达。

CAR-T疗法中已有两个CD19的CAR T产品在美国、欧洲和加拿大上市。分别是诺华的CLT019产品治疗难治或至少接受二线方案治疗后复发的B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)，及KITE的Yescarta产品治疗其他疗法无效或既往接受过2种方案治疗后复发的特定类型的成人大B细胞淋巴瘤患者，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤。

现有CAR-T疗法包括在2018年获得美国FDA上市批准的诺华的CLT019及KITE的Yescarta产品对血液肿瘤治疗临床有效，但对实体肿瘤效果甚微，且具有很严重的临床副作用风险，但实体肿瘤患者人数是血液肿瘤患者人数九倍之多。

原癌基因人上皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，Her-2/neu)又称HER2或C-erbB2基因，为表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR/ERBB)家族的一员，是一种原癌基因，每个人体内的正常细胞膜表面都有少量HER-2蛋白，HER-2在细胞生长因子信号传导途径中起关键作用。HER2在多种肿瘤的发病及临床进程中发挥重要作用，体外与动物实验已明确显示HER2/neu基因扩增、蛋白过度表达在致瘤转化和肿瘤发展中起着关键作用。约20％～30％乳腺癌患者的癌组织中有HER2基因的过度表达，HER2过表达的乳腺癌浸润性强，无病生存期短，预后差。不仅在乳腺癌，在其他类型的肿瘤包括胃癌、食管癌、卵巢癌、输卵管癌、宫颈癌、前列腺癌、口咽癌、子宫内膜癌、肺癌和膀胱癌等约30％以上的肿瘤组织中也有HER2的表达，并与这些癌症的预后相关。

美国FDA在1988年批准了曲妥珠单抗治疗阳性的乳腺癌的药物---赫赛汀。曲妥珠单抗是一种鼠源性的单克隆抗体，可以特异性的识别HER2的胞外段，一旦与HER2结合，曲妥珠单抗可以完全的抑制HER2的活性。然而赫赛汀在单独用药时，仅对少于35％的HER2高表达的乳腺癌患者有治疗效果，对超过5％的病人有严重的副作用(例如心功能障碍)，并且40％的患者在用药后出现其他的不良反应，虽然赫赛汀在临床应用中获得了令人瞩目的临床效果，但是其价格昂贵且具有心脏毒性的副作用和耐药性，限制了临床应用。

前期HER 2特异性的CAR T细胞已经在许多的肿瘤模型中取得成功，包括乳腺癌，卵巢癌，髓母细胞瘤，胶质母细胞瘤和骨肉瘤。但是，Rosenber研究组应用以曲妥珠单抗的scFv为基础合成第三代靶向HER2/neu的CAR T淋巴细胞，在病人体内出现了致死性的并发症。

scFv对于抗原的亲和力决定了CAR T细胞能否激活以及杀伤肿瘤细胞，现有治疗实体瘤的靶点中除因实体瘤屏障难以渗入瘤体外，CAR-T表面ScFv特异性不强，也会影响肿瘤杀伤效果。但是增加CAR的亲和力将可能导致on-target/off-tumor效应引起的严重脱靶效应的风险，并降低连续杀伤靶肿瘤的能力，必须考虑刺激阈值以获得CAR-T细胞活化的最佳特异性，已提高肿瘤杀伤特异性和治疗安全性。

发明内容

为解决以上问题，本发明目的在于提供一种抗人HER 2抗原的特异性嵌合抗原受体、编码基因和表达载体以及应用。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案为：

本发明的第一个技术方案为：一种抗人HER-2嵌合抗原受体，其特征在于，所述其自氨基端至羧基端由抗人HER-2单链抗体scFv、人CD8α的铰链区、人CD28跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区结合结构域依次串联而成；

其中所述抗人HER-2单链抗体scFv的编码序列前还有信号肽的编码序列，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述抗人HER-2单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQID NO.2所示；所述人CD8α的铰链区的氨基酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.3所示；所述人CD28跨膜区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；所述人4-1BB共刺激因子的氨基酸序列如序列中SEQ ID NO.5；所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示。

作为优选，所述抗人HER-2嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中序列如SEQ IDNO.7所示。

进一步地，所述序列7共由490个氨基酸组成，其中SEQ ID NO:7第1-21位氨基酸为所述抗人HER2单链抗体scFv的编码序列前的所述信号肽的编码序列；SEQ ID NO:7第22-264位氨基酸为所述抗人HER-2scFv的氨基酸序列；SEQ ID NO:7第265-309位氨基酸为所述CD8α的铰链区的氨基酸序列；SEQ ID NO:7第310-333位氨基酸为CD28跨膜区的氨基酸序列；SEQ ID NO:7第334-378位氨基酸为所述4-1BB胞内区的氨基酸序列；SEQ ID NO:7第379-490位氨基酸为所述CD3ζ胞内区的氨基酸序列。

本发明的第二个技术方案：一种抗人HER-2嵌合抗原受体的基因，编码所述抗人HER-2单链抗体scFv的编码序列前的所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；编码所述抗HER-2的scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。编码所述人CD8α的铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10；编码所述人CD28跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；编码所述人4-1BB胞内区共刺激信号分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；编码所述人CD3ζ胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

作为优选，编码所述抗人HER-2嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

进一步地，所述序列SEQ ID NO.14共由1470个核苷酸组成，其中SEQ ID NO.14第1-63位核苷酸序列为所述抗人HER-2的scFv的编码序列前的所述信号肽的编码序列。SEQID NO.14第64-792位核苷酸为编码所述抗人HER-2的scFv的编码序列。SEQ ID NO.14第793-927位核苷酸为编码所述人CD8α的铰链区基的编码序列；SEQ ID NO.14第928-999位核苷酸为编码所述人CD28跨膜区的编码序列；SEQ ID NO.14第1000-1134位核苷酸为编码所述人4-1BB共刺激的编码序列；SEQ ID NO.14第1135-1470位核苷酸为编码所述人CD3ζ胞内区的编码序列。

更进一步地，发明人对靶向HER2的CAR亲和力进行了调节，构建的HER2单链抗体(scFv)亲和力为中等亲和力的scFv。

本发明的第三个技术方案为：一种编码抗人HER-2嵌合抗原受体基因的表达载体，所述重组表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒。

作为优选，所述慢病毒表达载体能够表达所述抗人HER2嵌合抗原受体的重组慢病毒表达载体，具体为所述嵌合抗原受体HER2scFv-hinge-CD8α-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ插入到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的多克隆位点XbaI和BamHI之间后得到含有HER2-CAR的重组质粒。

所述含有抗人HER2-CAR或所述的慢病毒载体在制备抗人HER2-CAR的免疫细胞中的应用。

具体的，所述免疫效应细胞可为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、NK细胞，优选的所述免疫细胞为外周血来源的T细胞。所述病毒为慢病毒、孢疹病毒、巨噬细胞病毒等。

本发明第四个技术方案为：一种抗人HER 2嵌合抗原受体的免疫T细胞的制备方法，将能够表达所述抗人HER 2嵌合抗原受体的重组表达质粒与慢病毒的包装质粒pSPAX2质粒和pMD2.G质粒在293T细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达HER 2嵌合抗原受体，获得表达所述抗人HER 2嵌合抗原受体的T细胞。

本发明另一个技术方案为：一种抗人HER2嵌合抗原受体或基因或重组载体或表达盒或重组病毒或重组细胞用于治疗肿瘤的应用。

本发明另一个技术方案为：一种抗人HER2嵌合抗原受体或基因或重组载体或表达盒或重组病毒或重组细胞用于杀伤HER2阳性的肿瘤细胞的应用。

其中所述肿瘤具体为HER2蛋白异常表达(如HER2蛋白高表达)相关的肿瘤。所述肿瘤包括乳腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、输卵管癌、宫颈癌、前列腺癌、口咽癌、子宫内膜癌、肺癌和膀胱癌等实体瘤，以及某些血液肿瘤。

在本发明中，所述产品具体可为药物。

本发明的优点为：1、本发明提供的抗人HER2嵌合抗原受体，能够稳定地表达于T细胞，对HER2阳性的肿瘤细胞杀伤特异性更强。对HER2低表达或者阴性的细胞不杀伤，能够用于肿瘤的靶向治疗；2、本发明提供的通过改造的HER 2-CAR-T细胞的亲和力，有效增强了对肿瘤细胞的特异性杀伤作用，提高了CAR-T细胞治疗的安全性。

因此本发明所述的抗人HER 2嵌合抗原受体可用于靶向治疗，在肿瘤治疗中得到广泛应用。

附图说明

图1：抗人HER 2嵌合抗原受体的慢病毒表达载体结构图；

图2：荧光显微镜观察慢病毒包装的绿色荧光图；

图3：流式细胞仪检测HER2-CAR在T细胞表面的表达；

图4：ELISA检测各靶细胞与CAR-T细胞、NT-T细胞共培养后上清中细胞因子IFN-γ、IFN-2、TFN-α的水平；

其中，图4A为IFN-γ检测结果；图4B为IL-2检测结果；图4C为TFN-α检测结果；

图5：HER2-CAR-T细胞的体外杀伤作用的测定结果。

具体实施方式：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：抗人HER 2的CAR病毒的构建

1、抗人HER 2嵌合抗原受体的基因序列

合成依次含信号肽(CD8αleader)、抗人HER2抗原的单链抗体scFv(HER2scFv)，人CD8α铰链区(CD8αhinge)、人CD28跨膜区(CD28TM)、共刺激因子4-1BB和胞内信号域CD3ζ，嵌合抗原受体受体结构如图1所示。

其中信号肽是前导肽，其核苷酸序列为SEQ NO.8所示

HER 2单链抗体结构(HER2scFv)是针对HER2阳性肿瘤细胞表面的相关抗原HER 2设计的特异性抗原结合域，其核苷酸序列为SEQ NO.9所示

人CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。人CD28跨膜的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。人4-1BB胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12。人CD3ζ胞内区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

2、抗人HER2嵌合抗原受体表达载体的构建

全基因合成上述“步骤一”中完整的HER2-CAR(SEQ ID NO.14)，克隆到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP(简称pCDH-空载体)(购自普如汀生物技术(北京)有限公司。该质粒能表达GFP，产生绿色荧光)中，获得抗人HER 2-CAR表达质粒(命名为pCDH-CAR质粒)和含有该质粒的DH5α菌液。具体操作如下：

用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切(限制性内切酶NheI和SalI酶切)克隆获得的HER 2-CAR基因序列(“TCTAGA+序列12+GGATCC”)，与经过同样双酶切的慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP相连，得到重组质粒。经将重组质粒送至南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的HER 2-CAR序列比对以证实序列正确。测序引物为pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP载体上的通用引物：Sense和Anti-sense。将经测序证明正确，在慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切位点XbaI和BamHI(NheI和SalI))之间插入序列表中序列SEQ ID NO.14所示DNA片段的重组质粒命名为pCDH-CAR

Sense：5’ctccacgctttgcctgaccctgctt3’

Anti-sense：5’ggtgatgcggcactcgatctccatg3’

实施例2、抗人HER2抗原的嵌合抗原受体修饰T细胞的制备

1、慢病毒的包装

将实施例1构建的pCDH-CAR质粒以及包装质粒pSPAX2和pMD2.G按4:2:1比例用聚乙烯亚胺转染试剂(PEI,来自Sigma公司)转染293T细胞(来自ATCC)，具体方法见PEI转染试剂说明书。

2、慢病毒的纯化

72小时后收取病毒上清，于4℃，3000rpm离心10分钟后经0.45μm滤器过滤后，与PEG8000/NaCl按4:1体积混匀，4℃静置2～3h后高速离心30min。弃上清，沉淀用预冷的PBS重悬溶解，即获得病毒浓缩液，-80℃保存备用。

3、慢病毒滴度测定

病毒感染293T细胞，48h后，在荧光显微镜下可观察到成团状的绿色荧光细胞(图2)，感染72h后于1000r/min条件下离心5min以收集细胞，用QIA amp DNA Blood Mini Kit(购于Qiagen公司)基因组抽提试剂盒抽提基因组。按试剂盒说明书操作。qRT-PCR测定病毒滴度用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度，结果用TU/mL表示。根据公式推算出LV-HER2/CAR的感染滴度约为1.8×10⁸TU/ml。

4、慢病毒感染T细胞

(1)人外周血CD3+T细胞的分离

采用免疫磁珠分离技术获得。

用加有抗凝剂的采血管采集外周血约60ml，分装于50ml离心管各30ml，加入7.5ml羟乙基淀粉稀释；室温(18～25℃)自然沉降约30min，收集上层血浆，离心15min；然后用生理盐水重悬沉淀，按体积比为1:1加到淋巴细胞分离液上，梯度离心，离心20min；离心后，取第二层白色淋巴细胞层，并用生理盐水洗涤2次，生理盐水重悬细胞，加入含有10％FBS的RPMI1640完全培养基培养，得人外周血单核细胞。

(2)T细胞的激活

从全血分离的CD3+T淋巴细胞，在感染前需被激活，按照人类T细胞CD3/CD28免疫激活磁珠说明书激活T细胞即可。

(3)慢病毒载体感染T淋巴细胞

用含10％FBS的RPMI1640完全培养基培养新制备的单个核细胞PBMC，将活化后的T淋巴细胞进行慢病毒感染；分别加入慢病毒载体，未感染的外周血淋巴细胞(PBMC)作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500IU/mL重组人IL-2的RPMI1640完全培养基，IL-2的终浓度为100-IU/ml,在T淋巴细胞培养过程中，保持细胞的密度为0.5×10⁶～1×10⁶/ml。继续培养10-20天。即获得嵌合抗原受体T细胞(HER 2-CAR-T细胞)。

(4)流式细胞仪检测HER 2-CAR在T细胞表面的表达

离心收集感染后96h的待检测细胞及对照组(以pCDH-空载体替代实施例1构建的pCDH-CAR质粒)，PBS洗涤1次后弃上清,按照抗体说明书加入相应检测量的单抗(CD3由APC-anti-human CD3标记，购自ebioscience，CAR由Biotin-anti-humanIgG,F(ab’)2/PE和antihuman-CD8/APC(购自sigma-aldroqin)标记，用于流式细胞仪检测感染后修饰T淋巴细胞表面CAR蛋白的表达情况。检测结果如图图3所示，B图显示表达CAR CD8+T细胞为59.16％，CARCD4+T细胞为28.57％，总的CAR表达率为87.73％，该转染效率能够满足进一步的试验要求。A图为CAR+T细胞的同型对照。

实施例3、抗人HER2嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞的体外杀瘤活性检测

供试细胞系：人乳腺癌细胞株SKBR3，MCF-7和卵巢癌细胞株SKOV3，A2780，以及HER2阴性的肿瘤细胞株MDA-MB-468和人HER2阴性表达的小鼠肺癌细胞TC-1，均购自ATCC。293T细胞购自ATCC。其中SKBR3及SKOV3为HER2高表达的肿瘤细胞；MCF-7和A2780为HER2中度及低度表达的细胞株。

将实施案例2制备的CAR-T细胞与上述细胞系按照20：1效靶比分别共培养4小时后，各取5×10⁵个细胞的细胞悬液。只有T细胞的培养组作为阴性对照组。

1、ELISA检测表达靶向HER 2的嵌合抗原受体的T淋巴细胞因子分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平

取出已包被抗体(IFN-γ，IL-2，TNF-α均购自Abcam公司)的酶标板，设置TMB空白显色孔，依次加入0.1ml按一定倍数稀释的标准品及用样品稀释液稀释的样品。酶标板加上盖，37℃反应90min。反应后用自动洗板机吸弃酶标板内的液体。分别将生物素化的抗人IFN-γ、TNF-α、IL-2抗体(同上)工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)，37℃反应60min，0.01M PBS洗涤3次。将ABC工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)，37℃反应30min，0.01MPBS洗涤5次。按每孔90μl依次加入TMB显色液，37℃避光反应20-25min，按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，15min内用酶标仪在450nm波长处测定OD值。根据标准曲线计算共培养上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2细胞因子水平。实验重复三次，结果取均值。检测结果如图4所示。

根据图4可知:靶向HER 2-CAR-T细胞可以特异性地识别所有HER2+的肿瘤细胞，并大量分泌IFN-γ(图4中A)、IL-2(图4中B)、TNF-α(图4中C)。但靶向HER 2-CAR-T细胞与HER2阴性的MDA-MB-468和TC1细胞共培养后的细胞培养液上清中只能检测到微量的IFN-γ、TNF-α、IL-2。而在NT-T细胞与HER2+的肿瘤细胞共培养液上清中检测不到IFN-γ、TNF-α、IL-2。结果表明，HER2-CAR-T细胞可以特异性的识别并杀伤HER2+的肿瘤细胞。

2、靶向HER2的嵌合抗原受体T淋巴细胞对HER2+肿瘤细胞的杀伤能力

采用用51Cr释放实验进行评价。

以上述供试细胞系细胞作为靶细胞，按照效应T细胞与靶细胞1：1，3：1，10：1和30：1比例，调整效应细胞CAR-T(实施例2制备)和各组相应的靶细胞密度，分别为1×10⁷/ml和1×10⁶/ml，往96孔板中加入效应细胞悬液和靶细胞悬液，总体积为200μL，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养48h后每孔加入20μLCCK-8(购自MCE)，继续孵育2h后上酶标仪检测，于450nm波长处读取OD值，杀伤率＝[1-(实验组OD值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100％。

实验同时设置以pCDH-空载体替代实施例1构建的pCDH-CAR质粒的对照组(NT-T组)

检测结果如图5所示，HER2-CAR-T细胞特异性的杀伤HER2+的SKOV3和SKBR3肿瘤细胞，但是对于HER2-的MDA-468和TC-1细胞株却没有表现出杀伤作用；而NT T细胞和HER2-CAR-T细胞分别与HER2阳性或者阴性的肿瘤细胞均未有杀伤作用。

综上所述，本发明抗人HER2的嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达HER2的肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。

本发明的内容并不局限在上述的实施例中，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请的保护范围内。

序列表

<110> 卢英（YING LU）

<120> 抗人HER 2抗原的特异性嵌合抗原受体、编码基因和表达载体以及应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 2

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ala Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Glu Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Pro Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

145 150 155 160

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gly Trp Val

165 170 175

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asp Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

180 185 190

Lys Gln Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Tyr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

195 200 205

Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Arg Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 3

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 5

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

35 40 45

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma texanum

<400> 6

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 7

<211> 490

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma texanum

<400> 7

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Asn Ser Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Ala Leu Leu Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Val Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

100 105 110

Tyr Thr Pro Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115 120 125

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

145 150 155 160

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

165 170 175

Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

180 185 190

Gly Leu Gly Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asp Gly Tyr Thr Arg

195 200 205

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gln Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Tyr Ser

210 215 220

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Arg Ala Asp Thr

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met

245 250 255

Asp Tyr Trp Gly Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 9

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgcc gcgcgagcca ggatattaac agctatgtgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggcaaagcgc cggcgctgct gatttatgcg gaaagctttc tgtatagcgg cgtgccggtg 180

cgctttagcg gcagccgcag cggcacccag tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cgacctatta ttgccagcag agctataccc cgccgtttac ctttggccag 300

ggcaccaaag tggaaattaa acgcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 360

ggcggcagcg gcggcggcgg cagcgaagtg cagctggtgg aaagcggcgg cggcctggtg 420

cagccgggcg gcagcctgcg cctgagctgc gcggcgagcg gctttaacat taaagatacc 480

tatattcatt gggtgcgcca ggcgccgggc aaaggcctgg gctgggtggc gcgcatttat 540

ccgaccgatg gctatacccg ctatgcggat agcgtgaaac agcgctttac cattagcgcg 600

gattatagca aaaacaccgc gtatctgcag atgaacagcc tggaacgcgc ggataccgcg 660

gtgtattatt gcagccgctg gggcggcgat ggcttttatg cgatggatta ttggggcacc 720

gtgagcagc 729

<210> 10

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 11

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 12

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactgcggg tgaag 135

<210> 13

<211> 336

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma texanum

<400> 13

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 14

<211> 1470

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma texanum

<400> 14

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggatattc agatgaccca gagcccgagc agcctgagcg cgagcgtggg cgatcgcgtg 120

accattacct gccgcgcgag ccaggatatt aacagctatg tggcgtggta tcagcagaaa 180

ccgggcaaag cgccggcgct gctgatttat gcggaaagct ttctgtatag cggcgtgccg 240

gtgcgcttta gcggcagccg cagcggcacc cagtttaccc tgaccattag cagcctgcag 300

ccggaagatt ttgcgaccta ttattgccag cagagctata ccccgccgtt tacctttggc 360

cagggcacca aagtggaaat taaacgcggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 420

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcgaa gtgcagctgg tggaaagcgg cggcggcctg 480

gtgcagccgg gcggcagcct gcgcctgagc tgcgcggcga gcggctttaa cattaaagat 540

acctatattc attgggtgcg ccaggcgccg ggcaaaggcc tgggctgggt ggcgcgcatt 600

tatccgaccg atggctatac ccgctatgcg gatagcgtga aacagcgctt taccattagc 660

gcggattata gcaaaaacac cgcgtatctg cagatgaaca gcctggaacg cgcggatacc 720

gcggtgtatt attgcagccg ctggggcggc gatggctttt atgcgatgga ttattggggc 780

accgtgagca gcaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 1020

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1080

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgcgggt gaagagagtg 1140

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac 1200

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1470

Claims (5)

1.一种抗人HER-2嵌合抗原受体，其特征在于，其自氨基端至羧基端由抗人HER-2单链抗体scFv、人CD8α的铰链区、人CD28跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区结合结构域依次串联而成；

其中所述抗人HER-2单链抗体scFv的编码序列前还有信号肽的编码序列，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述抗人HER-2单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述人CD8α的铰链区的氨基酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.3所示；所述人CD28跨膜区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；所述人4-1BB共刺激因子的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.6所示。

2.一种权利要求1所述的抗人HER-2嵌合抗原受体的基因，其特征在于，编码所述抗人HER-2单链抗体scFv的编码序列前的所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；编码所述抗HER-2的scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码所述人CD8α的铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；编码所述人CD28跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；编码所述人4-1BB胞内区共刺激信号分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；编码所述人CD3ζ胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

3.一种含有权利要求2所述的编码抗人HER-2嵌合抗原受体基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体能够表达所述抗人HER-2嵌合抗原受体的重组慢病毒表达载体，具体为所述嵌合抗原受体HER-2scFv-hinge-CD8α-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ插入到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的多克隆位点XbaI和BamHI之间后得到含有HER2-CAR的重组质粒。

5.一种权利要求1所述的抗人HER 2嵌合抗原受体的免疫T细胞的制备方法，其特征在于，将能够表达所述抗人HER 2嵌合抗原受体的重组表达质粒与慢病毒的包装质粒pSPAX2质粒和pMD2.G质粒在293T细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达HER 2嵌合抗原受体，获得表达所述抗人HER 2嵌合抗原受体的T细胞。

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